KR20210079213A

KR20210079213A - 시누클레인병증 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210079213A
Application number: KR1020200176868A
Authority: KR
Inventors: 박상면; 최유리; 김재봉; 박수진; 소민영; 구희정; 김진한; 송상옥; 윤소정; 김수정
Original assignee: 주식회사 스탠다임; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-06-29
Also published as: WO2021125810A1; US20230013435A1

Abstract

본 발명은 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 세포 간 알파-시누클레인 이동을 저해하고, 세포 내 알파-시누클레인의 응집을 방지하고, 응집된 알파-시누클레인의 전이를 억제하므로, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증과 같은 시누클레인병증을 예방 또는 치료하는 데 유용하다.

Description

시누클레인병증 치료용 조성물{Composition for Treating Synucleinopathies}

본 발명은 네비라핀을 포함하는 시누클레인병증 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 네비라핀의 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해, 세포 내 알파-시누클레인의 응집 방지 및 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제에 의한 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증 등의 시누클레인병증 치료용 조성물에 관한 것이다.

네비라핀, 즉 11-사이클로프로필-5,11-디하이드로-4-메틸-6H-디피리도[3,2-b:2',3'-e][1,4]디아제핀-6-온은 HIV-1(사람 면역결핍 바이러스, 타입 1)에 의한 감염 치료용 시약으로서 공지되어 있는데, HIV-1 역전사효소의 특정한 억제를 통해 작용한다. 정제 형태로 네비라핀을 포함하는 약제인 비라문(Viramune)^® 정제는 HIV-1 감염 치료제로서 미국 F.D.A.(Food and Drug Administration)로부터 승인받아서 시판 중이다.

국제공개특허 WO2006/008118호(특허문헌 1)는 축합 벤조디아제피논계 약물인 피렌제핀(pirenzepine)이 기존에 알려져 있던 M1 무스카린 억제 효과 이외에 폴리(ADP-리보오스)폴리머라제(PARP) 억제제 및 SIR2 조절제로서의 활성을 가짐으로써 세포보호, 특히 신경보호 약물로서 유용함을 개시하고 있다. 상기 문헌에는 그 효과를 실험적으로 확인한 피렌제핀 뿐만 아니라, 네비라핀을 포괄하는 광범위한 축합 디아제핀온 화합물이 신경보호 약물로서 신경학적 질환 및 이와 관련된 염증성 상태, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상성 뇌손상, ALS, 다발성경화증, 편두통 및 만성 통증 증후군 등의 치료에 유용하다고 기재되어 있다. 그러나 네비라핀은 피렌제핀과 달리 M1 무스카린 억제활성, PARP 억제 활성 또는 SIR2 조절활성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 디피리도디아제핀온 화합물로서 벤조디아제핀온 구조를 갖는 피렌제핀과 화학적 기본 구조도 완전히 상이하며, HIV 감염 치료제로 주로 사용된다는 점에서 M1 무스카린 억제 효과에 기초하여 심혈관계 질환, 항정신병약, 암치료 부작용 완화 등에 사용되는 피렌제핀과는 공지된 의약 용도 또한 완전히 상이하다. 따라서 상기 특허문헌을 기초로 네비라핀이 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증 등의 시누클레인병증 치료에 유용함을 인정할 수 있는 근거가 없다.

한편, 알파-시누클레인(α-synuclein)은 파킨슨병 환자에게서 발견되는 세포질 내 루이소체(Lewy body)의 주요 단백질로서, 신경세포의 전시냅스(presynapse) 말단에 주로 분포하며, 뇌조직 전반에서 많은 양이 발현된다고 알려져 있다. 알파-시누클레인은 주로 사이토졸 내에 존재하는 자연적으로 폴딩되지 않은 단백질로서 전시냅스 말단으로부터 전달물질 방출을 증가시킴으로써 시냅스 전달(synaptic transmission) 및 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에서 핵심적인 역할을 수행한다. 알파-시누클레인은 파킨슨병 뿐만 아니라, 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies), 다계통 위축증(Multiple system atrophy) 등의 다른 퇴행성 질환의 병인으로 알려져 있다. 알파-시누클레인의 비정상적인 침착과 관련된 상기 질환들은 모두 시누클레인병증(synucleinopathy)으로 통칭하며, 상기 질환들의 공통된 치료 표적으로서의 알파-시누클레인에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 연구의 일환으로서, 본 발명자들은 SHP-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)의 활성화가 알파-시누클레인의 전이에 관여하며, SHP-1/-2의 활성화가 알파-시누클레인의 수용체인 FCγRIIB(IgG Fc receptor II-B; FcgammaRIIB)에 의해 매개된다는 것을 확인하여 SHP-1/-2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제가 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료에 유용하다는 점을 밝힌 바 있다(특허문헌 2).

시누클레인 병증의 대표 질환인 파킨슨병(parkinson's disease)은 알츠하이머병과 더불어 노년기에 나타나는 대표적인 퇴행성 신경질환의 하나로 65세 인구에서 약 1% 정도가 발병하며 나이가 들수록 그 발병률이 증가하는 것으로 알려져 있다. 파킨슨병은 운동성 장애를 나타내는데, 안정시 떨림증(tremor), 경직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 자세의 불안정(postural instability) 등이 대표적인 증상이다. 또한, 파킨슨병은 미세아교세포증(microgliosis), 성상교세포증(astrogliosis), 도파민성 뉴런의 진행적인 퇴화, 도파민성 뉴런에서 루이소체(Lewy bodies)의 존재, 및 뇌흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에서 알파-시누클레인(α-synuclein)의 축적 등의 특징을 가진다.

파킨슨병의 정확한 원인은 알려지지 않았지만, 농약 등과 같은 신경독소들에 의한 환경적 요인, 유전적 요인, 미토콘드리아의 이상, 산화 스트레스, 세포 내 단백질 제거 기능의 문제 등이 관련되어 있는 것으로 추정하고 있다. 유전적 요인으로는 알파-시누클레인, 파킨(Parkin), PINK-1, DJ-1, LRRK2 등의 여러 가지 유전자 변이가 원인이 된다고 알려져 있다.

현재 파킨슨병의 증상을 경감시키는 약물이 다수 존재하나, 병의 진행을 막을 수 있는 약물은 아직까지 보고된 바 없으며, 약물의 만성적인 사용은 심신을 약화시키는 부작용을 초래할 위험성이 크다.

파킨슨병의 치료를 위한 약물로는 엘-도파(L-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 모노아민 산화효소 억제제(monoamine oxidase inhibitors, MAOI) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것으로, 지속적인 약물의 복용을 필요로 한다. 이러한 약물들의 장기 투여는 약물 부작용의 문제점을 야기하게 된다. 예를 들어, 항콜린 약제들은 자율 신경계 이상이나 정신기능의 이상 등을 나타낼 수 있어, 고령의 환자들에게 지속적으로 투여하는 것에 한계가 있다. 또한, 엘-도파 제제의 경우, 장기간의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리거나 손, 발이 저절로 움직이는 이상운동이 생기는 등의 부작용이 발생하게 된다.

이와 같이, 파킨슨병은 발병률이 높음에도 불구하고 그 병인이 정확히 알려져 있지 않아서 근본적인 치료보다 주로 증상 개선을 위한 치료방법들이 이용되고 있는 바, 보다 효과적인 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 파킨슨병을 비롯한 시누클레인병증의 효과적 치료제를 선별하기 위해 연구하던 중, 인공지능(Artificial Intelligence; AI) 딥러닝 기술을 통해 선택된 네비라핀이 세포 간 알파-시누클레인 이동을 저해하고, 세포 내 알파-시누클레인의 응집을 방지하며, 응집된 알파-시누클레인의 전이를 억제한다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

1. 국제공개특허 WO2006/008118호 2. 한국등록특허 제1838802호

본 발명의 목적은 네비라핀을 포함하는 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증으로부터 선택된 시누클레인병증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 맥락에서, “네비라핀”은 그 화합물 자체뿐만 아니라, 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물도 포함되는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 네비라핀은 화학명 11-사이클로프로필-5,11-디하이드로-4-메틸-6H-디피리도[3,2-b:2',3'-e][1,4]디아제핀-6-온의 축합 디아제핀온계 약물로서 그의 합성 및 용도가 다수의 문헌에 기술되어 있다. 본 발명의 네비라핀은 공지의 방법으로 제조할 수 있으며 예컨대, 미국 특허 제5,366,972호 및 유럽 특허 제0429987호에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 네비라핀의 염은 약학적으로 허용가능하고 상대적으로 비독성인 무기산 또는 유기산 부가 염을 포함하며, 예컨대, 아세트산염, 질산염, 타르타르산염, 염산염, 황산염, 인산염, 메탄설폰산염, 캠퍼설폰산염, 옥살산염, 말레산염, 숙신산염 또는 시트르산염이 포함된다.

또한 본 발명의 네비라핀은 치료적 투여를 위한 적절한 용매가 결정격자에 혼입된 용매화물을 포함하며, 바람직한 용매의 예는 에탄올 또는 물이다. 물이 용매인 경우 용매화물은 수화물로 지칭된다. 일반적으로, 용매화물은 적절한 용매 중에 화합물을 용해시키고, 이 용매화물을 항용매를 사용하거나 냉각시켜서 단리시킴으로써 형성된다. 용매화물은 전형적으로 대기 조건 하에서 건조되거나 공비혼합물로 된다. 전형적인 용매화물은 1수화물, 2수화물 또는 3수화물 등과 같은 수화물을 포함한다.

본 발명에서, “시누클레인병증(synucleinopathy)”은 알파-시누클레인의 비정상적인 침착과 관련된 질환을 총칭하며, 예컨대, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증 또는 알파-시누클레인 병리를 갖는 희귀 질환(예를 들어, 신경축삭퇴행위축 질환들(neuroaxonal dystrophies))을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "치료"에는 시누클레인병증의 원인 또는 이에 의해 유발되는 증상의 치유, 완화, 방지, 예방, 지연 또는 감소가 포함된다. 한편, 본원에서 사용되는 바와 같은, “예방”에는 시누클레인병증의 원인 또는 이에 의해 유발되는 증상의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 시누클레인병증의 치료 또는 예방은 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해, 세포 내 알파-시누클레인의 응집 방지, 및/또는 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제를 통한 시누클레인병증의 임의의 증상의 치유, 완화, 방지, 예방, 지연 또는 감소를 포함한다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파킨슨병 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명에서 “파킨슨병”은 운동 장애 및 비-운동 장애를 야기하는 신경변성 장애로서, 운동 장애는 떨림, 운동저하증(예를 들어, 운동완만, 운동불능, 경직), 자세 불안정, 비정상 보행 또는 연하 장애를 포함한다. 비-운동 장애는 자율적 및 신경정신병학적 장애, 예컨대, 후각상실 또는 수면 이상을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, “파킨슨병”은 상기 징후 중 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

병리학적으로, "파킨슨병"은 흑질 치밀층(substantia nigra pars compacta)에서의 도파민 신경의 소실, 질병의 진행에 따라서 다양한 뇌영역에서 나타나는 루이 소체(Lewy bodies) 및/또는 루이 신경돌기(Lewy neurites)를 특징으로 한다.

1990년대 후반 루이 소체가 대부분 알파-시누클레인이라는 단백질로 구성되어 있고, 알파-시누클레인에서 미스센스 돌연변이(missense mutation)가 파킨슨병을 유발한다는 사실이 밝혀진 이래, 알파-시누클레인은 파킨슨병 치료의 주요 타겟으로서 주목받고 있다. 알파-시누클레인의 이동 저해, 알파-시누클레인의 응집 방지 및/또는 병원성 알파-시누클레인의 전이 억제를 통한 파킨슨병의 예방 및 치료제의 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 예컨대, 알파-시누클레인을 타겟팅하는 면역요법(immunotherapy), 알파-시누클레인의 응집 저해 또는 응집체(aggregates)의 붕괴를 위한 치료제, 알파-시누클레인의 수준을 낮추기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 파킨슨병의 예방 및 치료제로서 연구되고 있다. 알파-시누클레인 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession NP_001139526.1 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 기술, 예컨대, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^th Ed.에 기재된 바에 의해 다양한 형태 및 용량으로 제공될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물은 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물을 다양한 약학적으로 허용할 수 있는 불활성 담체와 조합하여, 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 하드 캔디, 분말, 스프레이, 크림, 연고, 젤리, 겔, 페이스트, 로션, 연고, 수성 현탁액, 주사 용액, 시럽 등의 형태로 제제화할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체에는 고체 희석제 또는 충전재, 무균의 수성 매체 및 다양한 비독성 유기 용매 등이 포함된다. 일반적으로는 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물은 상기 제형 중에 약 5.0 중량％ 내지 약 70 중량％의 범위의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 적절한 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내 투여용으로 제형화될 수 있으며, 바람직하게는 경구투여용으로 제형화될 수 있고, 또는 속방형 (immediate-relase) 또는 서방형(extended-release)으로 제형화될 수도 있다.. 본 발명의 약학적 조성물은 공지된 방법에 따라 투여할 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다. 투여량은 제형의 종류, 질병의 종류 및 심각성, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있으며 일반적으로 네비라핀의 투여량은 성인(60kg)의 경우 1 내지 2000mg/일의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 1000mg/일의 범위, 더욱 바람직하게는 1 내지 500mg/일의 범위, 10 내지 500mg/일의 범위, 50 내지 500mg/일의 범위, 50 내지 400mg/일의 범위, 50 내지 300mg/일의 범위이고, 특히 바람직하게는 100 내지 300mg/일의 범위 또는 150 내지 300mg/일의 범위로 투여되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 기간 및/또는 투여 횟수는 다양한 기간 동안 예를 들어 수 주, 수 개월, 수 년 또는 수십년 동안, 예를 들어, 지속적으로, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 1일 4회 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 일정 기간 투여 후 발진이나 급작스러운 체온 상승 등의 부작용의 발생 여부를 확인하여, 투여 여부, 투여량, 투여 기간 및/또는 투여 횟수를 조절할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 1 내지 500 mg/일의 범위, 10 내지 500mg/일의 범위, 50 내지 500mg/일의 범위, 50 내지 400mg/일의 범위, 50 내지 300mg/일의 범위, 100 내지 300mg/일의 범위 또는 150 내지 300mg/일의 범위로, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 또는 수 주의 투여 기간 동안 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회 또는 그 이상 투여한 후, 부작용의 발생여부를 확인하여, 부작용이 발생하는 경우 투여를 중단할 수 있으며, 부작용이 발생하지 않는다면, 투여량을 늘리거나, 투여 횟수를 늘리거나 또는 투여량 및 투여 횟수를 늘릴 수 있다. 예를 들어, 투여 제형으로 경구 투여용 속방형이 사용되는 경우, 2주간 200mg/일의 범위로 1일 1회 투여한 후, 부작용 여부를 관찰하여 부작용이 발생하지 않는 경우 200mg/12시간의 투여량으로 1일 2회 투여할 수 있거나, 경구 투여용 서방형을 400mg/일의 투여량으로 1일 1회 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 시누클레인병증(synucleinopathy)의 치료에 통상적으로 사용되는 하나 이상의 추가적인 약물과 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 병용투여는 본 발명의 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물과 상기 하나 이상의 추가적인 약물을 하나의 조성물에 포함하여, 또는 각각 별개의 제제로 투여함을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물이 파킨슨병의 치료를 위해 투여되는 경우, 파킨슨병의 치료, 보조적 치료, 또는 운동 장애 등의 증상의 치료 또는 완화를 위해 통상적으로 사용되는 하나 이상의 약물과 병용 투여될 수 있다.

예컨대, 본 발명의 파킨슨병 치료용 약학적 조성물은 도파민 전구체(예컨대, 레보도파, 메레보도파), 도파민 수용체 작용제(예컨대, 탈리펙솔, 피리베딜, 로티고틴, 브로모크립틴, 페르골리드, 카베르골린, 리수리드, 프라미펙솔, 로피니롤 또는 아포모르핀), 도파민-대사 효소의 억제제(예컨대, 모노아민 산화효소 억제제, 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 억제제), 또는 항콜린제 (anticholinergics)와 병용 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 네비라핀이 세포 간 알파-시누클레인 이동을 저해하고, 세포 내 알파-시누클레인의 응집을 방지하며, 응집된 알파-시누클레인의 전이를 억제한다는 점을 기초로, 네비라핀, 이의 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증과 같은 시누클레인병증(synucleinopathy)의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

도 1은 네비라핀과 피렌제핀의 농도별 세포생존률을 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 네비라핀과 피렌제핀의 알파-시누클레인의 세포 간 이동 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 네비라핀 및 피렌제핀 처리 후 알파-시누클레인의 분포도 변화 및 응집된 알파-시누클레인의 비율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 네비라핀의 인비보(in vivo) 효과를 확인하기 위한 실험 동물 모델 제작시 A53T 과발현 마우스에서 알파-시누클레인의 주입 부위를 나타낸다. 도 4에서 Cg는 대상 피질(cingulate cortex), M1은 일차 운동 피질(primary motor cortex), M2는 이차 운동 피질(secondary motor cortex), S1은 일차 체성감각 피질(primary somatosensory cortex), S2는 이차 체성감각 피질(secondary somatosensory cortex), Ins는 섬 피질(insular cortex), Pir는 조롱박 피질(piriform cortex), LS는 측면 중격(Lateral septum), Acb는 중격핵(Nucleus accumbens), MS는 내측 중격(Medial septum), Str은 선조체(Striatum)를 나타낸다.
도 5는 알파-시누클레인의 전이 억제 효과를 확인하기 위한 인비보(in vivo) 실험 계획의 모식도이다.
도 6은 네비라핀 투여시 신경 조직에서 응집된 알파-시누클레인의 현저한 감소를 보여주는 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. 도 6에서 Cortex는 피질의 장벽(Barrier of Cortex), Str은 선조체(Striatum), SN은 흑질(Substantia nigra)을 나타낸다. 또한, Ipsilateral은 응집된 알파-시누클레인을 주입한 곳과 동측을 의미하고, Contralateral은 응집된 알파-시누클레인을 주입한 곳의 반대측을 의미한다.
도 7은 대조군과 네비라핀 투여군에서 알파-시누클레인이 전이된 정도를 뇌조직의 구역별로 표시한 것이다. 도 7에 도시된 약어의 정의는, 전방 대뇌피질 이미지(+0.98mm from Bregma)는 도 4에서와 동일하며, 후방 대뇌피질 이미지(+0.14mm from Bregma)에서 BST는 분계선조 침대핵(Bed nucleus of the striata terminalis), aca는 전측 교련의 전측부(anterior commissure, anterior part), SI는 무명질(Substantia innominate), Hy는 시상하부(Hypothalamus)를 나타내며, 해마 이미지(-1.58mm from Bregma)에서 RS는 후뇌량팽대 피질(retrosplenial cortex), PtA는 두정부 연합 피질(parietal association cortex), Ect는 외후각 피질(ectorhinal cortex), PRh는 후각주위 피질(perirhinal cortex), Thalamic nuclei는 시상핵(Thalamus nucleus), LA는 측면 편도핵(Lateral amygdaloid nucleus), BLA는 기저외측 편도핵 전측부(Basolateral amygdaloid nucleus, anterior part), BMA는 기저내측 편도핵 전측부(Basomedial amygdaloid nucleus, anterior part), Ce는 중심측 편도핵(Central amygdaloid nucleus), Me는 내측 편도핵(Medial amygdaloid nucleus), Co는 외피 편도핵(Cortical amygdaloid nucleus)을 나타내며, 중뇌 이미지(-3.08mm from Bregma)에서 V1은 일차 시각 피질(primary visual cortex), V2는 이차 시각 피질(secondary visual cortex), V2L은 이차 시각 피질 외측 영역(secondary visual cortex lateral area), Au는 청각 피질(auditory cortex), TeA는 측두 연합 피질(temporal association cortex), Ent는 내후각피질(entorhinal cortex), SC는 상구(superior colliculus), PAG는 뇌수관 회백질(periaqueductal gray), MRN은 중뇌망상핵(midbrain reticular nucleus), Geniculate Thalamus는 시상의 슬상핵(Geniculate nucleus of Thalamus), VTA는 복측피개영역(ventral tegmental area), SN은 흑질(substantia nigra)을 나타낸다. 또한, Ipsil은 응집된 알파-시누클레인을 주입한 곳과 동측(ipsilateral)을 의미하고, Contra는 응집된 알파-시누클레인을 주입한 곳의 반대측(contralateral)을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포독성 확인

본 발명자들은 인공지능(AI) 딥러닝 기술을 이용한 스크리닝 방법을 통해 알파-시누클레인 관련 질환(파킨슨병)에 치료 효과가 있을 것으로 예상되는 물질로 네비라핀을 선택하였다.

네비라핀의 세포독성을 확인하기 위하여 SH-SY5Y 세포주(ATCC)를 사용하였다.

SH-SY5Y 세포주를 96-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고 배양한 후, 네비라핀을 농도별(0, 10, 100μM)로 처리하고 24시간 동안 항온처리하였다. 이후, MTT 검정법을 이용하여 세포 생존률을 측정하였다. 대조군으로 0μM의 네비라핀을 처리한 세포를 사용하였다. *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.

그 결과, 대조군과 비교하여, 10μM의 네비라핀을 처리한 세포는 세포 생존률 변화가 관찰되지 않았으나, 100μM의 네비라핀을 처리한 세포에서는 약 70%의 세포 생존률 감소가 관찰되었다(도 1a). 따라서, 이후의 실험에서는 세포독성이 나타나지 않은 10μM의 네비라핀을 사용하였다.

또한, 이후의 실험에서 대조약으로서 사용할 피렌제핀의 세포독성을 상기 네비라핀의 세포독성 실험과 동일한 방법으로 실험하였다. 피렌제핀의 농도는 0, 0.5, 10μM로 처리하였으며, 대조군으로 0μM의 피렌제핀을 처리한 세포를 사용하였다. * P < 0.05는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.

그 결과, 대조군과 비교하여, 0.5μM을 처리한 세포는 세포 생존률이 약간 감소하며, 10μM을 처리한 세포는 세포 생존률이 약 60% 감소함을 관찰하였다(도 1b). 이러한 결과를 토대로 하기 실험에서는 0.5μM의 피렌제핀을 사용하여 실험하였다.

실시예 2: 인비트로(in-vitro)에서의 네비라핀의 효과 확인

네비라핀의 알파-시누클레인 세포 간 이동(cell-to-cell transmission) 저해 효과 및 알파-시누클레인 응집 방지 효과를 확인하기 위하여, 이중 챔버 검정(dual chamber assay) 및 공동배양 검정(coculture assay)을 수행하였다.

2-1: 이중 챔버 검정을 이용한 네비라핀의 알파-시누클레인 세포 간 이동 저해 효과 확인

네비라핀의 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해 효과를 확인하기 위하여, 인서트 웰(insert well)을 apical chamber로 사용하고, 플레이트를 basal chamber로 사용하는 이중 챔버 시스템을 이용하여 실험하였다. 상기 플레이트 내에는 세포 배양 후 염색을 위한 슬라이드 글라스가 포함되어 있다.

12-웰의 인서트 웰에 알파-시누클레인이 과발현한 SH-SY5Y 세포주를 4 x 10⁴ cell/well로 씨딩하고, 12-웰 플레이트에는 알파-시누클레인이 과발현하지 않은 SH-SY5Y 세포주를 4 x 10⁴ cell/well로 씨딩하여, 항온처리하였다. 다음날 인서트 웰을 12-웰 플레이트가 있는 곳으로 옮겨 공동배양 챔버를 만든 후, 상기 챔버에 DMSO 또는 10μM 네비라핀을 처리하고 12시간 동안 항온처리하였다. 상기 챔버에 DMSO를 처리한 플레이트의 SH-SY5Y 세포를 대조군으로 사용하였다. 이후, 플레이트의 SH-SY5Y 세포에 면역염색을 수행하고 공초점 현미경으로 관찰하였다. 면역염색 시, 알파-시누클레인은 붉은색으로 염색되고, 핵은 푸른색으로 염색된다. 또한, 대조군과 네비라핀을 처리한 세포에서의 알파-시누클레인의 형광 세기를 비교하였다. 스케일바는 20μm를 나타내고, *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.

그 결과, 도 2a의 형광 사진에 도시된 바와 같이, DMSO 대조군 세포에서 알파-시누클레인의 세포 간 이동이 활발함을 관찰하였으나, 네비라핀을 처리한 세포에서는 알파-시누클레인의 세포 간 이동이 대조군에 비해 월등히 감소함을 관찰하였다. 또한, 면역염색된 알파-시누클레인의 형광 세기를 비교한 결과, 대조군에 비해 네비라핀을 처리한 세포에서의 형광 세기가 약 90% 감소함을 관찰하였다(도 2a).

따라서, 네비라핀이 세포 간 알파-시누클레인의 이동을 현저히 감소시킴을 확인하였다.

한편, 피렌제핀의 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해 효과를 확인하기 위하여, 상기 네비라핀의 이중 챔버 검정과 동일한 방법으로 0.5μM 피렌제핀을 처리하여 실험하였다. 스케일바는 20μm를 나타내고, *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.

그 결과, 도 2b의 형광 사진에 도시된 바와 같이, PBS 대조군 세포에서 알파-시누클레인의 세포 간 이동을 관찰하였으며, 피렌제핀을 처리한 세포에서 대조군에 비해 오히려 알파-시누클레인의 세포 간 이동이 현저하게 증가함을 관찰하였다. 또한, 면역염색된 알파-시누클레인의 형광 세기를 비교한 결과, 대조군에 비해 피렌제핀을 처리한 세포에서의 형광 세기가 약 100% 증가함을 관찰하였다(도 2b).

따라서, 피렌제핀은 세포 간 알파-시누클레인의 이동을 오히려 증가시킴을 확인하였다.

2-2: 공동배양(co-culture) 검정을 이용한 네비라핀의 알파-시누클레인 응집 방지 효과 확인

단량체 알파-시누클레인이 응집체가 되는 변성과정이 파킨슨병의 주된 원인이 될 수 있다. 따라서, SH-SY5Y 세포주에서 단량체 A53T 알파-시누클레인을 과발현시키고, 상기 과발현된 단량체 A53T 알파-시누클레인이 옆세포로 이동하여 응집체로 변형되는 과정에 네비라핀이 관여하는지를 확인하였다.

이를 위하여, EGFP로 표지된 A53T 알파-시누클레인이 과발현된 SH-SY5Y 세포주(A53T EGFP 세포) 및 mcherry로 표지된 A53T 알파-시누클레인이 과발현된 SH-SY5Y 세포주(A53T mcherry 세포)를 렌티바이러스를 이용하여 각각 제작하였다. 그 다음, A53T EGFP 세포 및 A53T mcherry 세포를 섞어서 공배양 세포를 제작하였다. 이후, 상기 공배양 세포에 DMSO 또는 10μM 네비라핀을 처리하고 50μM 레티노이드 산(Retinoic acid, RA)으로 5일 동안 분화시켜 각각 공동배양하였다. DMSO를 처리한 공배양 세포를 대조군으로 사용하였다. 공동배양을 수행한지 5일째에 공초점 현미경을 이용하여 응집된 알파-시누클레인(봉입체 양성 세포)을 확인하였다(도 3a의 형광 사진 중 가장 오른쪽 사진). 또한 A53T EGFP 세포 안에서의 EGFP와 mcherry가 합쳐진 분포도와 A53T mcherry 세포 안에서의 mcherry와 EGFP가 합쳐진 분포도를 각각 확인하였다. 도 3a는 가장 왼쪽 형광사진부터 순서대로, EGFP, mcherry 및 DAPI의 형광을 측정한 결과, EGFP의 형광을 측정한 결과, mcherry의 형광을 측정한 결과, mcherry 및 EGFP의 형광을 측정한 결과를 나타낸다. 도 3a의 형광 사진 중 가장 오른쪽 사진에서, 노란색으로 표시된 dot가 세포 안에서 mcherry 및 EGFP 신호가 합쳐진 것을 나타낸다. 도 3a의 형광사진 중 가장 오른쪽 사진(EGFP+mcherry 신호를 합친 도면)에서 노란색으로 표시된 dotting을 카운팅하여 전체 세포에 대한 비율을 계산하여 막대그래프로 나타내었다. 스케일바는 20μm를 나타내고, *** P < 0.001는 대조군과 비교한 결과를 나타낸다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, DMSO를 처리한 대조군 세포에 비해, 네비라핀을 처리한 세포에서는 응집된 알파-시누클레인이 현저하게 감소함을 관찰하였다. 또한, DMSO를 처리한 대조군 세포에 비해, 네비라핀을 처리한 세포에서는 알파-시누클레인의 분포도가 현저하게 감소함을 관찰하였다(도 3a). 따라서, 네비라핀이 세포 간 알파-시누클레인의 이동 및 세포 내 알파-시누클레인의 응집을 저해함을 확인하였다.

또한, 과발현된 단량체 A53T 알파-시누클레인이 옆세포로 이동하여 응집체로 변형되는 과정에 피렌제핀이 관여하는 지를 확인하기 위하여, 상기 네비라핀의 실험과 동일한 방법으로 0.5μM 피렌제핀을 처리하여 실험하였다. 스케일바는 20μm를 나타낸다.

그 결과, 도 3b의 형광 사진에 도시된 바와 같이, PBS를 처리한 대조군 세포에 비해, 피렌제핀을 처리한 세포에서 알파-시누클레인의 분포도 및 응집된 알파-시누클레인의 양이 증가한 것처럼 보이나 통계적 유의성은 없었다(도 3b).

따라서, 피렌제핀은 세포 간 알파-시누클레인의 이동 및 세포 내 알파-시누클레인의 응집 감소에 유의한 효과를 나타내지 않음을 확인하였다.

그러므로, 네비라핀은 알파-시누클레인의 세포 간 이동을 감소시키고, 세포 내 알파-시누클레인의 응집을 억제시키는 효과가 있어, 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해 및 세포 내 알파-시누클레인의 응집 방지를 통해 알파-시누클레인 관련 질환(파킨슨병)에 유의한 치료 효과 있음을 알 수 있다. 그러나, 피렌제핀은 알파-시누클레인의 세포 간 이동 및 세포 내 알파-시누클레인의 응집 감소에 유의한 효과를 나타내지 않으므로, 파킨슨병에 치료 효과를 나타내지 않음을 알 수 있다.

실시예 3: 인비보(in-vivo)에서의 네비라핀의 효과 확인

3-1: 실험 동물 모델의 제작

알파-시누클레인 돌연변이 마우스에서 응집된 알파-시누클레인 주입에 의해 응집된 알파-시누클레인의 전이가 일어난다. 따라서, 응집된 알파-시누클레인의 전이에 대한 네비라핀의 효과를 관찰하기 위하여, 알파-시누클레인 돌연변이 마우스에 응집된 알파-시누클레인을 주입한 실험 동물 모델을 제작하였다.

응집된 알파-시누클레인을 준비하기 위해, 재조합 알파-시누클레인을 대장균주 BL21(DE3)에서 과발현시키고, 상기 재조합 단백질을 공지된 방법으로 정제하였다(Lee, S.B., et al., 2009. Biochem Biophys Res Commun. 381, 39-43). 정제한 알파-시누클레인 단백질을 단량체 알파-시누클레인으로 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 5 mg/ml의 단량체 알파-시누클레인을 37℃에서 1,000 rpm으로 연속적인 교반을 하면서 1주 동안 배양하였고, 간단하게 초음파 처리하여 분해한 후, 응집된 알파-시누클레인으로 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

실험 동물은 인간에서 발현하는 알파-시누클레인의 돌연변이 중 하나인 A53T를 과발현시킨 마우스(B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J, M83;, Jackson Laboratory) 8주령에서 12주령 사이를 사용하였다. 상기 마우스에 에버틴(Avertin)을 체중 20g당, 200μl의 용량으로 복강투여하여 마취시킨 후, 정위(stereotaxic) 수술 기구에 고정을 시키고, 마우스의 정수리점(Bregma)을 기준으로 전방(AP) 1.0mm, 우측(ML) 1.8mm, 깊이(DV) 3.2mm의 좌표(도 4)에, 해밀턴 시린지(Hamilton syringe)를 사용하여, 응집된 알파-시누클레인을 10μg의 용량으로 마우스의 선조체(Striatum)에 주입하여 실험 동물 모델을 제작하였다.

3-2: 면역조직화학염색을 이용한 네비라핀의 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제 효과 확인

네비라핀의 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제 효과를 확인하기 위하여, 루이소체(알파-시누클레인 응집체)에 대량 포함되어 있어 루이소체(알파-시누클레인 응집체)의 마커로 사용되는 알파-시누클레인의 변형체인 pSer129 α-Syn을 타겟으로 하는 면역조직화학염색법을 이용하였다.

먼저, 상기한 바와 같이 실험 동물 모델에 응집된 알파-시누클레인을 주입한 후, 1일 정도 간호 후에 PBS 용액 (PBS + 0.5% hypromellose + 0.1% Tween80) 또는 네비라핀을 40mg/kg의 투여량으로 매일 1회씩, 총 4주 동안 복강주사하였다(도 5). 그 다음, 마우스에 우레탄(Urethane)을 체중 20g당, 200μl의 용량으로 투여하여 마취시킨 후, 흉부를 절개하여 심장의 좌심실을 통해 관류액을 3분 동안 흐르게 하여 관류(perfusion)시켰다. 이 후, 우심방을 절단하여 혈액을 제거하고 3분 동안 4%의 파라포름알데히드를 흘려보내 마우스의 조직을 고정(fixation)시켰다. 그 다음, 뇌를 추출해서 4% 파라포름알데히드 고정액에 하루 동안 담근 후, 30% 수크로스 용액에서 바닥까지 가라앉을 때까지 탈수과정을 진행하였다. 이후 바닥에 가라앉은 것이 확인되면, 고정판에 뇌를 올려놓고, 오씨티 컴파운드(O.C.T Compound)로 -20℃에서 컴파운드를 얼린 후, 다시 -80℃에서 30분간 냉동하여 35μm의 두께로 뇌절편을 만들었다. 뇌절편은 조직보관액에 보관하였다.

면역조직화학염색을 위해, 뇌절편을 조직보관액으로부터 꺼내어 PBS로 10분씩 3회 세척 후(이하 각 특정 용액에 반응 후, 무조건 3회 세척을 수행함)에, 3% 과산화수소수를 첨가하고 5분 동안 반응시켜 조직 내의 과산화 효소를 제거하였다. 세척 후에 블로킹 용액(1% BSA, 0.2% Triton X-100)을 첨가하여 1시간 동안 블로킹을 진행한 뒤, 응집된 알파-시누클레인을 표적으로 하는 pSyn#64 1차 항체(wako #01525191)를 1:5,000의 농도 및 2차 항체(Biotinylated Anti-mouse antibody, Vector)를 1:5,000의 농도로 반응시키고, 조직에 반응하여 붙어있는 항체들을 ABC 콤플렉스로 반응시키고, 3,3'-다이아미노벤지딘으로 발색반응을 수행하였다. 그 다음, 조직을 마이크로 글라스에 부착시켜 건조시키고 70% 에탄올을 시작으로 80, 90, 100% 에탄올으로 순차적으로 탈수반응을 진행시켰다. 이후 자일렌(Xylene)에 하루 정도 반응시킨 뒤, 이를 꺼내서 글라스 위에 마운트 용액을 떨어뜨린 후 커버글라스로 덮고, 해부현미경을 사용해서 배율 400x로 분석하였다. 스케일바는 50μm를 나타낸다. 알파-시누클레인만을 주입한 실험동물 모델을 대조군으로 사용하여(도 6에서 Control로 표시함), 알파-시누클레인을 주입한 후 네비라핀을 처리한 실험군과 비교하였다.

루이소체의 감소 효과를 확인하기 위해 루이소체의 마커(pSer129 a-Syn)를 신경 조직에서 확인하였으며, 그 결과, 동물 모델에 네비라핀을 투여 시, 신경 조직들에 존재하는 응집된 알파-시누클레인이 현저하게 감소함을 관찰하였다(도 6).

또한, 상기 알파-시누클레인 돌연변이 A53T의 유전자 변형 마우스 8주령에서 12주령 사이에 10μg의 응집된 알파-시누클레인을 주입하고 4주 동안 PBS 용액 (PBS + 0.5% hypromellose + 0.1% Tween80)을 매일 200ul씩 복강주사한 군(대조군) 및 10μg의 응집된 알파-시누클레인을 주입하고 4주 동안 네비라핀을 40mg/kg으로 매일 복강주사한 군의 뇌조직을 수득하였다. 상기 뇌조직은 상기 마우스의 뇌를 마우스의 정수리점으로부터 전방 0.98mm, 전방 0.14mm, 후방 1.58mm, 후방 3.08mm에서 절단하여 수득하였다(각각 도 7의 “+0.98mm from Bregma” “+0.14mm from Bregma” “-1.58mm from Bregma” 및 “-3.08mm from Bregma”). 상기 조직을 DAB 염색법으로 루이소체(응집된 알파-시누클레인)를 염색하여, 각 뇌조직의 구역별로 응집된 알파-시누클레인의 전이 여부를 확인하였다. 각 뇌조직의 세부적인 해부학적 구조물에 위치한 루이소체의 개수를 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비해, 네비라핀을 투여한 동물 모델의 뇌조직에서는 루이소체(응집된 알파-시누클레인)의 전이가 현저하게 감소함을 관찰하였다(도 7). 또한, 네비라핀을 투여한 동물 모델의 뇌조직 구역들에서 루이소체가 발견되는 세포의 수(pSyn positive cell number)를 세어 대조군과 비교하여, 네비라핀의 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제 효과를 직접 비교하였다. 전방 피질(Anterior Cortex) 및 후방 피질(Posterior Cortex)에 있어서, 대상 피질(Cg), 일차 운동 피질(M1), 이차 운동 피질(M2), 일차 체성감각 피질(S1), 이차 체성감각 피질(S2), 섬 피질(Ins) 및 조롱박 피질(Pir)에서 루이소체가 발견되는 세포의 수를 합산하였으며, 응집된 알파-시누클레인을 주입한 곳과 동측(Ipsil) 및 반대측(Contra) 모두에서 네비라핀을 투여한 경우를 대조군과 비교한 결과, 유의한 응집된 알파-시누클레인 전이 억제 효과를 보임을 확인하였다(도 7의 “Anterior Cortex(Ipsil)”, “Anterior Cortex(Contra)”, “Posterior Cortex(Ipsil)” 및 “Posterior Cortex(Contra)”). 이는 후방 대뇌피질(+0.14mm from Bregma)의 선조체(Str)에서도 동일하였으며(도 7의 “Striatum (Posterior, Ipsil)” 및 “Striatum (Posterior, Contra)”), 중뇌(-3.08mm from Bregma)의 흑질(SN)에서도 동일하였다(도 7의 “SN(Ipsil)” 및 “SN(Contra)”). * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001은 대조군과 비교한 결과를 나타내며, 각 점은 알파-시누클레인 돌연변이 A53T의 유전자 변형 마우스 1 개체를 의미한다.

그러므로, 상기 결과들을 통하여, 네비라핀이 세포 간 알파-시누클레인 이동 저해, 세포 내 알파-시누클레인의 응집 방지 및 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제 효과를 나타내므로, 파킨슨병을 비롯한 시누클레인병증을 예방 및 치료하는 데에 유의한 효과가 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

네비라핀, 이의 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증으로부터 선택되는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병인 조성물.
제1항에 있어서, 세포 간 알파-시누클레인의 이동 저해, 세포 내 알파-시누클레인의 응집 방지 및/또는 응집된 알파-시누클레인의 전이 억제를 나타내는 조성물.
제1항에 있어서, 도파민 전구체, 도파민 수용체 작용제, 도파민-대사 효소의 억제제 또는 항콜린제와 병용 투여되는, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 도파민 전구체는 레보도파 또는 메레보도파이고, 상기 도파민 수용체 작용제는 탈리펙솔, 피리베딜, 로티고틴, 브로모크립틴, 페르골리드, 카베르골린, 리수리드, 프라미펙솔, 로피니롤 또는 아포모르핀이고, 도파민-대사 효소의 억제제는 모노아민 산화효소 억제제 또는 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 억제제인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내 투여될 수 있는, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여될 수 있는, 조성물.