KR20210074513A - 전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 누룩과 김치에서 분리한 미생물을 이용하여 인삼을 순차적으로 생물전환 및 발효시킴으로서 홍삼 및 인삼의 유용성분이며 생체 흡수력이 높은 저분자 진세노사이드의 일종인 컴파운드-케이(compound-K)를 생산할 수 있는 전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이다.
이를 위해 본 발명은 김치에서 락토바실러스(Lactobacillus) 속(屬) 균주를 분리하고, 누룩에서 아스페르길루스(Aspergillus) 속(屬) 균주를 분리하는 미생물분리단계; 각각 분리된 락토바실러스 속(屬) 미생물 및 아스페길루스 속(屬) 미생물을 각각 배양하는 미생물배양단계; 수삼형태의 인삼을 갈아 기질을 제조하는 기질제조단계; 및 기질에 락토바실러스 속(屬) 미생물 및 아스페르길루스 속(屬) 미생물을 이용한 발효공정으로 컴파운드 케이를 생성하는 컴파운드케이생성단계를 포함하는, 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.

Description

전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법 {Method for producing compound-K using microorganisms for traditional fermented foods}

본 발명은 전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 누룩과 김치에서 분리한 미생물을 이용하여 인삼을 순차적으로 생물전환 및 발효시킴으로서 홍삼 및 인삼의 유용성분이며 생체 흡수력이 높은 저분자 진세노사이드의 일종인 컴파운드-케이(compound-K)를 생산할 수 있는 전통발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 인삼으로 부터 홍삼, 발효홍삼, 흑삼 등의 다양한 인삼 가공품의 개발과 아울러 이들 의 특정 진세노사이드(ginsenoide)에 대한 각각의 약리적 임상효과가 밝혀짐에 따라 특정 진세노 사이드를 강화하거나 농축한 성분을 포함한 제품들이 속속 개발되고 있으며 식품, 건강식품, 화장품, 의약 분야 등으로 점점 용도법위를 넓혀가고 있다. 인삼의 대표적인 약리성분인 진세노사이드는 인삼에서 24종, 홍삼에서 32종이 함유되었다고 밝혀져 있으며, 인삼과 홍삼의 공통적인 성분으로는 18종의 진세노사이드가 있다. 즉 인삼에서 6종, 홍삼에서 14종이 특이적으로 함유된 진세노사이드이다. 그 중에서도 홍삼 특유의 진세노사이드인 Rg3, Rh2, Rs4, Rh1 등은 찌는 과정 중에서 열처리에 의한 가수분해 반응 등에 의해 생성되며, 홍삼의 높은 약리적 효능이 이 성분에서 기인된다고 밝혀져 있다. 주요 효능으로는 1) 항암작용, 2) 암세포 성장억제 작용, 3) 뇌신경세포 보호 및 학습능력 개선작용, 4) 항비만 효과, 5) lymphocyte 분열 억제효과 등이 있으며 이외의 성분에 대한 연구도 현재 활발히 진행되고 있다.

1965년 일본의 Shibata 등은 TLC를 이용하여 백삼으로부터 13종의 진세노사이드를 분리하였는데 이것을 인삼 사포닌 연구의 시초라고 할 수 있다. 이들은 백삼을 수용성 메탄올로 추출한 후 에테르 가용성분을 제거하고 물 포화 부탄올로 분배 추출하여 얻은 농축물을 실리카 겔 TLC 판에서 n-부탄올 : 에틸아세테이트 : 물 (5:1:4, v/v) 혼합용매의 상층(upper layer)으로 전개시켜 9개의 spot를 관찰하고 Rf 값에 따라 ginsenoside-Ro, -Ra, -Rb, Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg, -Rh 등으로 명명하였고 ginsenoside-Rb 혼합물과 ginsenoside-Rg 혼합물을 다시 실리카 겔 TLC 판에서 클로로포름 : 메탄올 : 물(65:35:10, v/v) 혼합용매의 하층(lower layer)으로 전개시켜 각각 2개의 spot와 3개의 spot를 관찰하고 이를 각각 ginsenoside-Rb1, -Rb2 및 ginsenoside-Rg1, -Rg2, -Rg3로 명명하였다.

1971년 Nagai 등이 ginsenoside-Rg1의 화학구조를 최초로 보고한 이후10여 년 동안 일본 학자들을 중심으로 진세노사이드의 순수 분리 및 화학구조 구명 연구가 본격적으로 진행되었다. Tanaka 등(1978)은 인삼에 ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1 및 -Rg2(S form)가 함유되어있으며 인삼의 잎과 꽃봉오리에도 ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re 및-Rg1이 함유되어 있다고 보고하였고 Matsuura 등(1985)은 홍삼에 ginsenoside-Ro, -Ra1, -Ra2, -Ra3, Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1, -Rg2(Sform), -Rg2(R form), -Rg3(S form), -Rg3(R form) 등이 함유되어 있다고 보고하였다.

1990년대 중반에 우리나라 학자들도 인삼으로부터 분리한 새로운 진세노사이드에 관한 연구결과를 발표하였다. Ryu 등(1996)은 홍삼의 메탄올 추출물로부터 ginsenoside-Rg6 을 순수 분리하여 그 화학구조를 최초로 구명하였고 Park 등(1998)은 홍삼의 메탄올 추출물로부터 순수 분리한 ginsenoside-Rg5, -Rh4, Rg3(S form) 및 -Rf2의 화학구조를 보고하였다.

2000년 이후에는 우리나라에서 기존의 홍삼, 백삼 이외에 인삼 가공기술이 다양하게 개발됨에 따라 가공 과정에서 생성되는 새로운 진세노사이드에 관한 연구결과가 발표되었다. Kwon 등(2001)은 수삼을 고온에서 증삼 처리하면 ginsenoside-Rg2(S form), -Rg2(R form), -Rg3(S form), -Rg3(Rform), -Rg5, -Rk1 등이 다량 생성되며 ginsenoside-Rg6, -Rh1(S form), -Rh1(R form), -Rh4, -Rk3, -Rs3(S form), -Rs3(R form), -Rs4, -Rs5, -F4 등이 소량 생성된다고 보고하였고, Kang 등(2006)도 수삼을 동일한 방법으로 처리하였을 때 진세노사이드-Rg3(S form), -Rg3(R form), -Rg5 및 -Rk1이 다량 생성되었다고 보고하였다.

또, Mallol 등(2001)은 인삼 모상근에 ginsenoside-Rb1, -Re 및 -Rg1이 다량 함유되어 있으며 소량의 ginsenoside-Rb2와-Rf 및 미량의 ginsenoside-Rc와 -Rd가 함유되어 있음을 보고하였고 Ha 등(2007)은 홍삼을 특정 효소로 처리하면 ginsenoside-Rg3 (S form), -Rg5 및-Rk1이 다량 생성되며 ginsenoside-F4도 소량 생성된다고 보고하였다.

홍삼에는 프로토파낙사디올계 사포닌 17종, 프로토파낙사트리올계 사포닌13종, 올레아난계 사포닌 1종 등 총 31종의 진세노사이드가 함유되어 있으며 이중에서 ginsenoside -Rs1, -Rs2, -Rs3, -Rg3(S form), -Rg5, -Rh2, notoginsenoside-R4 등 프로토파낙사디올계 사포닌 7종과 ginsenoside-Rf2, -Rg2(Rform), -Rg6, -Rh1(R form), -Rh4, 20(E)-ginsenoside-F4 등 프로토파낙사트리올계 사포닌 6종은 홍삼에만 존재하는 것으로 보고되어 있다. 이는 홍삼을 제조하는 과정에서 수삼에 존재하는 ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rg1 등이 가수분해 되어 새로운 진세노사이드로 전환되기 때문이다.

본 발명에 사용된 아스페르질루스 루추엔시스 SK-3209 (Aspergillus luchuensis SK-3209) 균은 한국의 전통 막걸리와 일본의 전통 소주 발효제조에 사용되어온 대표적인 양조용 누룩 팡이인 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchunsis) 는 형태적으로 그리고 생리학적 및 유전학적으로 매우 유사하였는데 이 균주는 최근까지 그 학명이 1949년 발견자인 일본인 카와치의 이름을 따 '아스페르길루수 카와치'(Aspergillus kawachii)로 불려 왔으나 최근 농촌진흥청은 유전자 분석을 통해 이 곰팡이는 1901년 보고된 '아스페르길루스 루추엔시스'(Aspergillus luchuensis)와 동일한 것으로 확인됐다고 보고하였으며, 국제 관례상 먼저 보고된 학명을 사용한다는 원칙에 따라 국내 막걸리용 누룩곰팡이의 학명은 앞으로 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchunsis)로 바뀐다고 농진청은 밝혔다.

64년 만에 제 학명을 찾은 '아스페르길루스 루추엔시스'(Aspergillus luchuensis) 는 농진청 추가 연구 결과에서도 전분 분해력이 뛰어나고 발효 때 잡균의 오염을 막아주지만, 인체에 유해한 어떤 독소도 만들지 않는 안전한 곰팡이로 확인된바 있다. (2013. 6/2 연합뉴스).

또한, 일본 청주인 사케(sake)로 유명한 일본 동북지역에서 양조용으로 널리 사용되는 황국군(yellow koji mold)인 아스페르길루스 오라이제 (Aspergillus orizae)와 함께 흑국균(black koji mold)인 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 와 그의 알비노(albino) 돌연변이인 아스페르길루수 카와치 (Aspergillus kawachii = 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) 는 구연산(citric acid) 등의 유기산 생성능이 우수하여 상대적으로 기온이 높은 큐슈 등 일본의 남서부지역에서 박테리아의 오염을 예방하는 효과가 있어 소주 제조용 국균으로 선택되어 널리 사용되어 왔다. (Eukaryotic Cell, Nov. 2011, p. 1586~1587)

아울러 아스페르길루수 카와치 (Aspergillus kawachii)는 소주 제조용 백국균(white koji mold)으로서 뿐만 아니라 알파-아밀라제(α-amylase)와 글루코아밀라제(glucoamylase) 뿐만 아니라, 자일라제즈(xylase), 펙티나제(pectinase), 셀룰라아제(cellulase) 등을 생산하는 것으로 알려져 있다. (Journal of Bioscience and Bioengineering vol.88, No. 1, 48-52. 1999)

본 발명에 사용된 또 다른 균주인 락토바실러스 속 YM-66 (Lactobacillus sp. YM-66) 는 분류학적 동정 결과 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus)와 매우 유사하였는데 이 균은 김치유산균의 일종으로 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)의 활성이 우수하고 진세노사이드-Rd (ginsenoside Rd)를 F2와 컴파운드-K로 전환하는 능력이 있음이 이미 보고된 바 있다. (J. Ginseng Res. Vol. 34, No.4, 2010)

한편, 지금까지 선행기술들에서는 저분자 유용 사포닌인 컴파운드-케이를 생산하기 위한 방법으로서 인삼이나 홍삼으로부터 순수한 진세노사이드를 추출하고 정제한 후, 이미 상업적으로 시판되고 있는 효소를 2종 이상 복합적으로 사용하거나 특정 미생물을 발효하여 생산된 펙티나제, 나린지나제, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 등 효소를 정제하여 사용하는 방법, 그리고 홍삼 추출물이나 농축액에 단순히 유산균이나 바실러스균, 황국균등 미생물을 첨가하고 발효시켜 생산하는 방법 등이 주로 사용되어져 왔다.

그러나 효소를 사용한 방법들에서는 고가의 상업용 효소를 2~3종 사용하여야 하기 때문에 생산된 컴파운드-케이의 가격이 상당히 고가이며, 사용되는 이들 효소는 대부분 유전자 재조합 미생물(GMO)로부터 만들어 진다는 문제점이 있으며, 아울러 기존의 유산균이나 바실러스균, 황국균등 발효 미생물을 홍삼에 접종하여 생산하는 기술들은 비교적 간단하지만 먼저 홍삼을 농축액으로 만들어야하고 원료로 사용되는 홍삼이 인삼에 비해 단가가 5~10배 높으며 생산되는 컴파운드-케이의 농도도 높지 않은 문제점이 있다.

선행기술문헌 : KR등록특허공보 제10-1404915호(2014.06.13. 공고)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 안전성이 확보된 미생물을 이용하여, 원료가 되는 사포닌을 별도로 추출하고 정제 할 필요없이, 유전자 재조합(GMO) 효소를 사용하지 않으면서도 컴파운드-케이를 높은 효율로 전환가능하며, 복잡한 전처리 공정과 설비 등이 필요없는 인삼을 직접 원료로 사용하여 단순하고 효율적이면서 경제적인 방법으로 컴파운드 케이를 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 안출된 본 발명에 따른 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법은 김치에서 락토바실러스(Lactobacillus) 속(屬) 균주를 분리하고, 누룩에서 아스페르길루스(Aspergillus) 속(屬) 균주를 분리하는 미생물분리단계; 각각 분리된 락토바실러스 속(屬) 미생물 및 아스페길루스 속(屬) 미생물을 각각 배양하는 미생물배양단계; 수삼형태의 인삼을 갈아 기질을 제조하는 기질제조단계; 및 기질에 락토바실러스 속(屬) 미생물 및 아스페르길루스 속(屬) 미생물을 이용한 발효공정으로 컴파운드 케이를 생성하는 컴파운드케이생성단계를 포함한다.

또한, 미생물배양단계에서 탄소원으로 전분을 사용하고, 질소원으로 대두분말을 사용한 배지에서 배양하는 것을 포함한다.

또한, 기질제조단계에서 제조된 기질에 아스페길루스 속 균주를 이용하여 1차 생물 전환 시킨후, 락토바실러스 속 균주를 접종하여 배양온도 30℃ 내지 40℃에서 배양기간 3일 내지 5일간 2차 발효시킴으로써 컴파운드 케이를 생성하는 것을 포함한다.

본 발명에 의하면 인삼을 직접 원료로 사용하여 전통 발효식품에서 분리한 미생물을 이용하여 단순하고 효율적이면서 경제적으로 컴파운드 케이를 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법의 전체공정을 도시한 도면,
도 2는 세부공정을 포함한 전체공정을 도시한 도면,
도 3는 아스페길루스 sp SK-3209의 담즙 에스큘린 한천 선별배지를 사용하여 분리한 결과를 도시한 도면,
도 4은 락토바실러스 sp YM-66 의 담즙 에스큘린 한천 선별배지를 사용하여 분리한 결과를 도한 도면,
도 5은 배양체인 종국을 제조한 결과를 도시한 도면,
도 6은 아스페길루스 sp SK-3209의 백국을 이용한 홍삼액으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면,
도 7는 아스페길루스 sp SK-3209의 플라스크 배양액을 이용한 인삼으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면,
도 8은 락토바실러스 sp YM-66 배양액을 이용한 인삼으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면,
도 9은 아스페길루스 sp SK-3209와 락토바실러스 sp YM-66의 생물전환과 발효반응에 의한 컴파운트 케이 제조 결과를 도시한 도면,
도 10는 아스페길루스 sp SK-3209와 락토바실러스 sp YM-66의 생물전환과 발효반응에 의해 생산된 컴파운드 케이의 HPLC 분석결과를 도시한 도면.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법의 전체공정을 도시한 도면, 도 2는 세부공정을 포함한 전체공정을 도시한 도면, 도 3는 아스페길루스 sp SK-3209의 담즙 에스큘린 한천 선별배지를 사용하여 분리한 결과를 도시한 도면, 도 4은 락토바실러스 sp YM-66 의 담즙 에스큘린 한천 선별배지를 사용하여 분리한 결과를 도한 도면, 도 5은 배양체인 종국을 제조한 결과를 도시한 도면, 도 6은 아스페길루스 sp SK-3209의 백국을 이용한 홍삼액으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면, 도 7는 아스페길루스 sp SK-3209의 플라스크 배양액을 이용한 인삼으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면, 도 8은 락토바실러스 sp YM-66 배양액을 이용한 인삼으로부터 컴파운드 케이 제조 결과를 도시한 도면, 도 9은 아스페길루스 sp SK-3209와 락토바실러스 sp YM-66의 생물전환과 발효반응에 의한 컴파운트 케이 제조 결과를 도시한 도면, 도 10는 아스페길루스 sp SK-3209와 락토바실러스 sp YM-66의 생물전환과 발효반응에 의해 생산된 컴파운드 케이의 HPLC 분석결과를 도시한 도면이다.

본 발명은 양조용 누룩으로부터 분리한 아스페르길루스 속 미생물과 김치로부터 분리된 락토바실러스 속 미생물을 이용하여 인삼을 순차적으로 생물전환 및 발효시킴으로서 홍삼 및 인산의 유용성분이며 생체 흡수력이 높은 저분자 진세노사이드의 일종인 컴파운드 케이(compound-K)를 생상하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 인삼이나 홍삼으로부터 진세노사이드를 추출정제하는 과정이 필요 없으며, 홍삼농축액이나 추출물 등을 원료로 사용하지 않고, 수삼형태의 인삼을 세척, 건조하거나 단순한 열처리를 거친후 믹서로 갈아 기질을 제조한 후, 생물전환 및 발효공정을 이용하여 컴파운드 케이를 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따른 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법은, 도 1 내지 도 2를 참조하면, 미생물분리단계(S100), 미생물배양단계(S200), 기질제조단계(S300), 컴파운드케이생성단계(S400)를 포함하여 이루어진다.

미생물분리단계(S100)에서 김치에서 락토바실러스 속 미생물을 분리하고 누룩에서 아스페길루스 속 미생물을 분리한다.

도 3 내지 도 4를 참조하면, 락토바실러스 속 미생물 및 아스페길루스속 미생물은 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성을 측정하는 에스큘린 아가(Esculin agar) 선별배지 방법을 이용하여 분리한다.

보다 구체적으로는, 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)는 사포닌 구조에 결합된 포도당 잔기를 분해하여 인체 흡수가 가능한 F2, 컴파운드 케이 등의 구조로 전환시키는 활성을 가지고 있다. 에스큘린 아가(Esculin agar) 선별배지 방법은 미생물이 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 생산하는지 여부를 쉽게 확인하는 방법으로 특정 미생물이 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 분비하게 되면 에스큘린(Esculin)에 베타(β) 결합된 포도당 잔기가 분해되어 에스큘레틴(Esculetin)이 생성되고, 이 물질이 배지중의 철 이온(Ferric ions)과 결합하여 배지 주변에 검정생의 콤플렉스(black complex)를 생성하게 된다.

담즙 에스큘린 한천(Bile esculin agar)선택배지의 화학반응을 단계적으로 보면 아래와 같다.

① 에스큘린(Esculin) + 미생물 (β-glucosidase 활성) → 베타-D-글루코스(β-glucose) + 에스큘레틴(Esculetin)

② 에스큘레틴(Esculetin) + 철 이온(Ferric ions) → 적갈색(Daek brown color)

누룩으로부터 분리된 곰팡이의 부분 동정(同定, identification)을 위하여 18S rDNA 및 ITS 염기 서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 분리균은 기존에 한국과 일본데서 양조용 및 종국용으로 널리 사용되는 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis)로 동정되었다.

또한, 김치로부터 분리한 락토바실러스 속 미생물은 분리 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였고 결과는 아래와 같다.

<락토바실러스 균주 - 6S rRNA gene 염기서열>

AAGTCGAGCGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCATTCGGGGACATGGATACAGTGGTGCATGGTNGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCNTATNATCAGNGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCNNGANAANNNANNNNNGGGGGNTGACGTNNATCATCATGCCCCTATGACCTGG

상기 결과를 Blast를 이용하여 서열 비교를 실시한 결과, Lactobacillus pentosus 와 97% 상동성을 보여 주었다.

미생물배양단계(S200)에서는 미생물분리단계에서 각각 분리된 락토바실러스 속 균주 및 아스페길루스 속 균주를 배양한다. 미생물배양단계(S200)에서 배지는 탄소원으로 전분을 사용하고, 질소원으로 효모엑기스를 사용한 배지를 이용할 수 있다.

이하에서 락토바실러스 속 균주 및 아스페길루스 속 균주의 배양방법에 대하여 상세하게 설명한다.

아스페길루스 속 균주의 배양단계는 배양체제조단계(S210a), 백국균제조단계(S220a), 배양액제조단계(S230a), 진탕배양단계(S240a), 균사체제거단계(S250a), PH조정단계를 포함하여 이루어 진다.

배양체제조단계(S210a)에서는 아스페길루스 속 균주의 배양을 위하여 효소 활성이 높은 고체 배양체인 종국을 제조한다.

종국의 제조는 잘 씻은 쌀을 2시간 이상 물에 불리고 30분간 물기를 뺀 후, 찜기를 이용하여 30~40분간 수증기를 이용하여 증자하고 40~50℃ 이하로 식힌 후, PDA 배지에서 5~10일간 배양된 아스페르길루스 속 균주를 잘 섞어준다.

백국균제조단계(S220a)에서는 도 7을 참조하면, 멸균된 배양용 플레이트(plate)에 0.5~2cm 두께로 깔고 30℃에서 5~10일간 갈색 포자가 형성 될 때까지 배양하여 백국을 제조한다.

배양액제조단계(S230a)에서는 250ml 진탕 플라스크에 액체 배양용 배지(전분-20g/L, 효모엑기스- 5g/L, 황산암모늄-2g/L, 일인산칼륨-1g/L, 황산마그네슘-0.2g/L, 염화칼륨-0.1g/L, 황산철-0.1g/L)를 50ml씩 분주하고, pH를 5~7사이로 조절하고 121℃에서 15분간 멸균 후, PDA 배지에서 배양한 아스페르길루스 루추엔시스 SK-3209 (Aspergillus luchuensis SK-3209) 균사체를 각각 일정한 크기로 잘라내 접종한다.

진탕배양단계(S240a)에서는 진탕 배양기를 이용하여 25~30℃에서 5~10일간 배양한다. 균사체제거단계(S250a)에서는 진탕배양단계에서 배양한 미생물을 와트만 필터페이퍼(whatman No-1)로 균사체를 제거한다.

PH조정단계(S260a)에서는 인삼염 완충액으로 pH를 5~7로 조정 후 생물전환용으로 사용하였다.

락토바실러스 속 균주의 배양은 MRS배지희석단계(S210b), 정치배양단계(S220b), 균체농축단계(S230b), 농도희석단계(S240b)를 포함하여 이루어진다.

MSR배지희석단계(S210b) 및 정치배양단계(S220b)에서는 락토바실러스 속 균주의 배양을 위하여 김치로부터 분리된 70여종의 균주중에서 (β-glucosidase)의 활성이 우수한 유산균인 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus)을 배양온도 30~40℃, pH 4~7로 MRS 배지를 2배 희석한 별도의 배지에서 24~72시간 정치배양 한다.

균체농축단계(S230b) 및 농도희석단계(S240b)에서는 정치배양단계에서 배양한 배양액을 5000rpm으로 원심분리하여 균체를 농축 후, 멸균 식염수에 일정 농도로 희석하여 발효를 위한 종균으로 사용한다.

기질제조단계(S300)는 세척단계(S310), 분쇄단계(S320), 열처리단계(S330)을 포함하여 이루어진다.

기질제조단계(S300)에서는 수삼형태의 인삼을 갈아 기질을 제조한다.

구체적으로는 세척단계(S310)에서 4년근 인삼을 세척하고, 분쇄단계(S320)에서는 수삼형태의 인삼을 습식 믹서고 50mesh 이하로 갈아준다. 인삼은 4년근의 수삼을 사용한다. 4년근 인삼은 통상적으로 사용되는 6년근 인삼에 비해 사포닌의 함량이 차이가 없거나 오히려 사포닌의 함량이 높다고 널리 알려져 있다. 본 발명에서는 효율성과 경제성을 높이기 위하여 4년근 인삼을 원료로 사용한다. 4년근 수삼을 세척한 뒤 습식믹서로 50mesh 이하로 갈아주고 냉동보관 하면서 기질로 사용시 필요에 따라 증숙 또는 90℃ 내지 120℃로 열처리단계(S330)을 거쳐 사용한다.

컴파운드케이생성단계(S400)는 생물전환단계(S410), 발효반응단계(S420), 추출단계(S430), 여과단계(S440), 농축단계(S450)을 포함하여 이루어진다.

컴파운드케이생성단계(S400)에서는 기질제조단계(S300)에서 제조한 기질에 락토바실러스 속 균주 및 아스페길루스 속 균주를 이용한 생물전환 및 발효반응으로 컴파운드 케이를 생성한다.

생물전환단계(S410)에서는 기질제조단계(S300)에서 제조된 기질에 펙티나아제(pectinase), 셀룰라제(cellulase) 및 헤미셀룰라제(hemicellulase) 활성 및 베타-1,2 글루코시데이즈 (β-1,2 glucosidase) 활성이 높은 아스페르길루스 루추엔시스 SK-3209 (Aspergillus luchuensis SK-3209) 균주를 이용하여 탄소원으로 전분, 질소원으로 효모 엑기스을 사용한 배지에서 배양온도 25~35℃, 배양기간 5~10일간 진탕 배양한 후 얻어진 배양여액을 사용하여 생물 전환시킨다.

발효반응단계(S420)에서는 베타-1,6 글루코시데이즈 (β-1,6 glucosidase) 활성이 높은 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus) 균주를 접종하여 배양온도 30~40℃에서 배양기간 3~5일간 발효시킨다.

추출단계(S430)에서는 수포화부탄올을 1ml 내지 2ml씩 첨가하여 강하게 섞어준 후, 50℃ 내지 60℃의 항온조에서 컴파운드 케이를 추출한다.

농축단계(S450)에서는 추출단계에서 추출한 컴파운드 케이를 80℃ 온도에서 진공농축시킨다.

컴파운드 케이가 생성되었는지 확인하기 위하여 수삼 또는 증숙한 수삼에 아스퍼질러스 sp. SK-3209 조효소액을 이용하여 일정시간 좋기로는 5~10일간 생물전환 한 후, 반응액을 부탄올 추출하고 silica gel 60 254 TLC plate에 점적한 후, 제조된 (클로로포름:메탄올:물 = 13:7:2 v/v/v) 전개액의 하층부를 취하여 40~60분간 전개시키고 말린 후, 황산용액 10%를 분무하여 110~130℃ 에서 발색시켜 확인한다.

HPLC 분석을 통한 정량분석은 아래표의 조건으로 실시한다.

Column	Sunfire C18, 3.5μm 4.6 x 150mm
Detector	UV 203nm
Instrument	WATERS 2998 Photodiode Array Detector, WATERS 1525 Binary HPLC Pump, WATERS 2707 Auto sampler
Eluent	A: DW, B: Acetonitrile
Flow rate	1ml/min
Injection volumn	20μl

기질제조단계(S300)에서 제조된 50mesh 이하로 잘 갈려진 냉동보관 수삼을 1g씩 취하여 cap-tube에 나누어 담고, 미생물분리단계(S100)에서 분리된 균주들을 250ml 플라스크에서 액체 배양한 후, 배양액을 Whatman-No.1 여과지로 여과한 배양여액 5ml 씩을 취하여 첨가한 후, 30℃ 조건으로 5~12일간 반응 시킨 후, 수포화 부탄올 1ml 씩을 참가하고 강하게 섞어준 후, 50~60℃의 항온조에서 컴파운드-케이를 추출하고 TLC로 확인하였다.

도 7은 아스페길루스 루추엔시스의 배양액을 이용하여 수삼형태의 인삼으로 부터 컴파운드 케이가 추출되는지 확인하기 위한 실험 결과이며, K-1이 아스페길루스 루추엔시스의 배양액을 이용한 결과이다.

도 7을 참조하면, 수삼형태의 인삼으로 부터 아스페길루스 루추엔시스를 이용하면 컴파운드 케이가 추출되는 것을 확인할 수 있다.

수삼형태의 인삼뿐만 아니라 홍삼추출액을 이용하여 컴파운드 케이를 제조할 수 있다.

홍삼 추출액 2ml 씩을 각각 cap-tube에 나누어 담고 대조군으로서는 증류수(1ml)을 첨가하고, 종국으로부터 분리된 4종의 균주들로 각각 제조된 쌀 종국 1g 씩을 취하여 인삼염 완충액(pH-7.0) 5ml 가하여 강하게 교반 추출한 조효소액 (1~2ml) 씩을 각각 첨가하여 30℃ 조건으로 5~12일간 반응 시킨 후, 수포화 부탄올 1ml 씩을 참가하고 강하게 섞어준 후, 50~60℃의 항온조에서 컴파운드-케이를 추출하고 TLC로 확인하였다.

도 6을 참조하면, 2번이 아스페길루스 루추엔시스를 이용한 결과이며, 아스페길루스 루추엔시스를 이용하여 컴파운드 케이를 추출할 수 있으며, 다른 미생물에 비하여 활성이 더 높은 것을 확인할 수 있다.

또한, 수삼형태의 인삼 기질에 유산균을 이용하여 컴파운드 케이를 제조할 수 있다.

50mesh 이하로 잘 갈려진 냉동보관 수삼을 1g씩 취하여 cap-tube에 나누어 담고, 김치로부터 분리된 유산균 균주들을 선별하여 MRS 배지를 1/2로 희석한 배지에서 3일간 배양한 후, 배양액 5ml 씩을 취하여 첨가한 후, 30℃ 조건으로 3~7일간 반응 시킨 후, 수포화 부탄올 1ml 씩을 참가하고 강하게 섞어준 후, 50~60℃의 항온조에서 컴파운드-케이를 추출하고 TLC로 확인하였다.

도 8을 참조하면, 3번이 락토바실러스 펜토수스을 이용한 결과이며, 락토바실러스 펜토수스를 이용하여 수삼형태의 인삼으로부터 컴파운드 케이가 추출되는 것을 확인 할 수 있다.

아스페길루스 루추엔시스와 락토바실러스 펜토수스을 이용하여 컴파운드 케이를 제조하는 경우, 50mesh 이하로 잘 갈려진 냉동보관 수삼을 1g씩 취하여 cap-tube에 나누어 담고, 실시예-1과 실시예-2 에서 효능이 확인된 아스퍼질러스 루추엔시스 SK-3209 조효소액을 5ml 첨가하여 25~45℃ 로 5~10일간 1차 반응한 후, 실시예-3에서 효능이 확인된 락토바실러스 sp. YM-66 배양액 3ml 을 첨가하고 다시 30~40℃ 조건으로 3~5일간 2차 반응 시킨 후, 수포화 부탄올 1ml 씩을 참가하고 강하게 섞어준 후, 50~60℃의 항온조에서 컴파운드-케이를 추출하고 TLC와 HPLC로 확인하였다.

도 9 및 도 10를 참조하면 수삼형태의 인삼에 아스페길루스 루추엔시스와 락토바실러스 펜토수스을 이용하여 컴파운드 케이가 제조되는 것을 확인할 수 있다.

도면 9의 STD가 컴파운드 케이의 표준품이며 K-1이 본 발명에 따른 아스페길루스 루추엔시스와 락토바실러스 펜토수스의 생물전환과 발효에 의한 결과이다.

본 발명에서는 인삼이나 홍삼으로부터 진세노사이드를 추출, 정제하는 과정 또는, 홍삼 농축액이나 추출물 등을 원료로 사용하지 않으며 인삼의 수삼형태를 세척, 건조하거나 단순한 열처리를 거친 후, 믹서로 50mesh 이하로 곱게 갈아준 후, 냉동보관 하였다가 여기에 발효용 백국균을 20~40℃, 좋기로는 25~35℃, pH 4~8, 좋기로는 pH 5~7 조건에서 5일에서 15일간 좋기로는 7~12일간 배양한 후, 여과를 통해 배양 여액만을 회수하여 인삼염 완충액을 사용하여 조효소액을 조제하고 냉동중인 인삼 믹서를 5~50% (중량/볼룸), 좋기로는 10~50%를 첨가하여 25~45℃, 조건에서 1차 효소 전환반응을 실시하고, 여기에 2차로 25~45℃, 좋기로는 30~40℃, pH 4~8, 좋기로는 pH 5~6에서 배양한 김치 유산균 배양액을 1차 배양액 대비 10~30% 첨가하여 2~10일간 좋기로는 3~7일간 2차로 발효시킴으로서 인삼으로부터 컴파운드-케이를 직접 생산하는 방법을 제공한다.

이러한 방법은 인삼으로부터 진세노사이드를 추출하기 위한 별도의 설비나 공정이 필요 없고 홍삼이나 홍삼 추출물 및 농축액과 같은 고가의 원료를 사용하지 않고 인삼을 직접 원료로 사용하기 때문에 기존의 선행기술들에 비하여 비교적 간단하고 경제적인 방법으로 컴파운드-케이를 생산할 수 있다는 장점이 있다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

S100 - 미생물분리단계 S200 - 미생물배양단계
S300 - 기질제조단계 S310 - 세척단계
S320 - 분쇄단계 S330 - 열처리단계
S400 - 컴파운드케이생성단계 S410 - 생물전환단계
S420 - 발효반응단계 S430 - 추출단계
S440 - 여과단계 S450 - 농축단계

Claims (3)

1. 김치에서 락토바실러스 속(屬) 균주를 분리하고, 누룩에서 아스페르길루스(Aspergillus) 속(屬) 균주를 분리하는 미생물분리단계;
   각각 분리된 락토바실러스 속(屬) 균주 및 아스페길루스 속(屬) 균주를 각각 배양하는 미생물배양단계;
   수삼형태의 인삼을 세척 및 분쇄하여 기질을 제조하는 기질제조단계; 및
   기질에 락토바실러스 속(屬) 균주 및 아스페르길루스 속(屬) 균주를 이용한 발효공정으로 컴파운드 케이를 생성하는 컴파운드케이생성단계
   를 포함하는, 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   락토바실러스 속(屬) 균주로 락토바실러스 펜투수스를 사용하고, 아스페르길루스(Aspergillus) 속(屬) 균주는 아스페길루스 루추엔시스를 사용하는 것; 및
   미생물배양단계에서
   락토바실러스 펜투수스는 배양온도 30℃ 내지 40℃ 및 ph 4 내지 7의 조건에서 24시간 내지 72시간 정치배양하고,
   아스페르길루스 루추엔시스는 배양온도 25℃ 내지 30℃ 및 ph 5 내지 7의 조건에서 5일 내지 10일간 진탕배양하는 것
   을 포함하는, 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   기질제조단계에서 제조된 기질에 아스페길루스 속 균주의 배양액을 이용하여 1차 생물 전환 시킨 후, 연속적으로 락토바실러스 속 균주를 접종하여 배양온도 30℃ 내지 40℃에서 배양기간 3일 내지 5일간 2차 발효시킴으로써 컴파운드 케이를 생성하는 것
   을 포함하는, 전통 발효식품용 미생물을 이용한 컴파운드 케이의 제조방법.

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