KR20210073559A - 비-뉴턴 유체의 음향 액적 토출 - Google Patents

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Abstract

음향 액적 토출기에 의해 비-뉴턴 유체를 함유한 액적을 토출하는 방법은, 톤 버스트 패턴에 따라 액적 토출에 영향을 미치는 충분한 진폭으로 비-뉴턴 유체를 함유한 유체 저장조에 집속 음향 에너지의 톤 버스트를 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 톤 버스트 패턴은, 세 개의 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하며, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 세그먼트는 상기 제2 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는다. 톤 버스트 세그먼트의 정확한 지속 시간 및 진폭은 토출 특성에 영향을 미치도록 조정될 수 있다.

Description

비-뉴턴 유체의 음향 액적 토출
많은 생물학적 용액, 중합체 용액 및 중합체 용융물은 케첩, 전분 현탁액, 페인트, 꿀, 혈액, 커스터드 및 샴푸와 같이 흔히 발견되는 많은 물질에서와 같이, 자연에서 비-뉴턴 유체이다. 뉴턴 유체의 경우, 전단 응력과 변형률 사이의 관계는 선형이며, 비례 상수는 점도 계수이다. 점도에 대한 뉴턴의 법칙(1-D 운동량 전달)의 예시는 아래의 식 [1]에 나타나 있다:
Figure pct00001
비-뉴턴 유체의 경우, 전단 응력과 변형률 사이의 관계는 비선형이고 심지어 시간 의존적일 수 있다. 따라서, 일정한 점도 계수를 정의할 수 없다. 따라서, 비-뉴턴 유체는 전단 응력 프로파일(또는 유체 이송 방향에 대한 속도의 미분)에서 비-선형 반응을 갖는 유체로서 정의된다. 비-뉴턴 유체는, 유체가 유체 흐름 방향으로 전단 되는 경우에 달성되는 전단 응력 프로파일에 대하여, 점성 성분 및 탄성 성분 둘 다를 보유하므로 점탄성 유체로도 불린다. 이들 유체는 다음의 식 [2]로 특성화되며, 여기서 겉보기 점도는 비-뉴턴 유체에 대해 일정하지 않다.
Figure pct00002
비-뉴턴 유체는 다양한 유형, 예컨대 Power Law 유체가 있고, 이는 전단 속도가 증가함에 따라 η(겉보기 점도)가 감소하는(전단 속도 박화) 유사 가소성이거나 전단 속도가 증가함에 따라 η가 증가하는(전단 속도 농후) 증점제일 수 있다. 비-뉴턴 유체는, 많은 상이한 흐름 조건, 예컨대 발진 전단 또는 연장 흐름(이는 상이한 장치 또는 점도계를 사용하여 측정됨)에서 응력 및 변형률 텐서와 관련된 몇몇 다른 점성학적 특성(점도를 측정하는 것 이외)을 통해 가장 잘 연구된다. 특성은, 연속 역학 분야에서 흔한 텐서 값의 구성 방정식을 사용하여 더 잘 연구된다.
뉴턴 유체의 신속한 전사는 음향 액적 토출(ADE)에 의한 신속한 전사를 포함하여 다양한 기술을 사용하여 달성될 수 있고, 이는, 예를 들어 미국 특허 제9,908,133호 2018년 3월 6일, R. G. Steams and S. A. Qureshi, "Method for Acoustically Ejecting a Droplet of Fluid from a Reservoir by an Acoustic Fluid Ejection Apparatus" 에 설명되어 있다. 그러나, ADE를 이용하여 중합체 용액과 같은 비-뉴턴 유체를 전사하려는 시도에서 문제가 발생한다. 예를 들어, 문제점은 중합체 사슬의 겉보기 정렬을 포함하며, 이는 연장 흐름에서 중합체 용액의 굳어지는 효과를 생성한다.
문제점은, 용액 중의 중합체의 농도뿐만 아니라 중합체 자체의 크기(사슬 길이)에 기초하여 점탄성 파라미터에 의해 정의된 "이완 시간"을 조사할 수 있는, 지배 체제로 하위 특성화될 수 있다. 중합체 용액의 이론에서, 이들 체제는, 발생하는 상이한 지배적 화학 상호작용을 가지며, 상이한 물리학(예를 들어, 고속 카메라 상에서 보여질 수 있음)으로 나타날 수 있고, 이들 체제는 희석 중합체 용액으로부터 농축 중합체 용액 내지 중합체 용융물까지의 범위를 특징으로 한다. 또한, 용매 시스템은, 중합체 사슬과 용매 유형(양호, 불량, 세타 등) 사이의 상호 작용 및 용액 화학을 지배하는 경우에, 큰 구동력을 갖는다.
특정 응용예에서, DNA 용액은 비-뉴턴 유체로 간주될 수 있다. 예를 들어, DNA를 연구하기 위한 하나의 실험실 접근법은, 비-뉴턴인 중합체-용매 시스템을 형성하는 중합체를 "응축"시키려고 시도하지 않고서 완충 시스템(통상 TE, PBS, 물 등)에 게놈 DNA(gDNA)를 제공하는 것이다. 추가적인 복잡성을 더하면, 유체의 특성은 용액의 농도에 따라 변할 수 있다. 용매 시스템 내의 희석 중합체 용액(예로서, 천연 gDNA)의 경우, 천연 gDNA 사슬 간의 상호 작용이 거의 없어, 이완 시간, 최대 연장 및 제로-전단 점도를 모델링하고 특성화할 수 있는 단순화된 시스템을 생성한다. 천연 gDNA 농도가 높으면, 이러한 중합체-용매 시스템을 모델링하는 것은 더 복잡해진다. 이완 시간은 이제 농도뿐만 아니라 사슬 길이에 따라 달라지게 되고, 지수적으로 커진다. 최대 연장은 gDNA 농도와도 관련이 있지만, 성장은 제한적이다.
요약하면, DNA 분석을 위한 추가 처리 방법이 필요하지만, 비-뉴턴 DNA-함유 용액의 유체 특성을 특성화하는 문제점은, 지금까지는 ADE에서 공지된 기술에 의해 일반적인 DNA-함유 유체 전사를 허용하기에는 너무 복잡하였다. 따라서, 천연 gDNA 및 다른 점탄성 비-뉴턴 유체를 재현 가능하게, 정확하게 그리고 정밀하게 전사할 수 있는, 신규 ADE 공정에 대한 필요성이 존재한다.
본 개시에 따른 다양한 구현예가 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 전력 부족 및 고 전력 상태에서 토출을 수행하는 액적 토출 장치의 고속 이미지 세트를 도시한다.
도 2는 뉴턴 및 비-뉴턴 톤 버스트에 대한 음향 파형을 나타내는 진폭 플롯이다.
도 3a는 제1 음향 톤 버스트를 이용한 물을 사용하는 토출 공정을 보여준다.
도 3b는 제2 톤 버스트를 갖는 인간 천연 gDNA를 함유한 용액의 토출 공정을 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는, gDNA 농도가 증가하는 경우에 물과 인간 천연 gDNA의 혼합물로부터 일련의 음향 신호 파형 패턴을 보여준다.
도 5는, 뉴턴 토출 전력 체제 및 증가된 전력 체제에서, 인간 고유 gDNA의 샘플 전사 효능을 보여주는 이미지이다.
도 6은, 뉴턴 토출 전력 체제 및 증가된 전력 체제에서, 인간 고유 gDNA의 샘플 전사 효능을 보여주는 이미지이다.
도 7은, 토출 전력에 기초한 다양한 인간 고유 DNA 용액에 대한 전사 성공률을 보여주는 도면이다.
도 8a는 뉴턴 토출 전력 체제를 사용하여 ADE 전사된 gDNA 용액으로부터 수득된 인간 천연 gDNA 단편 크기 및 gDNA 농도를 보여준다.
도 8b는 비-뉴턴 토출 전력 체제를 사용하여 ADE 전사된 gDNA 용액으로부터 수득된 인간 천연 gDNA 단편 크기 및 gDNA 농도를 보여준다.
도 9는, 수동 피펫팅과 비교하여 ADE(에코)에 의한 전사의 상대적인 성공을 보여주는, 일련의 DNA 농도에 대한 교차 포인트(Cp)를 보여주는 그래프 도면이다.
도 10a는 BIOLINE® gDNA 샘플에 대한 분석 트레이스이다.
도 10b는 PROMEGA® gDNA 샘플에 대한 분석 트레이스이다.
도 11은 천연 gDNA의 생물학적 및 기술적 복제에 대한 Cp 대 log[DNA]를 보여주는 도면이다.
도 12는 도 11에 나타낸 Cp 곡선의 백분율 CV를 보여주는 도면이다.
도 13은, 큰 단편 크기를 보여주는 인간 gDNA 샘플에 대한 분석 트레이스를 보여준다.
도 14는 일련의 생물학적 gDNA 복제에 대한 Cp 대 log[DNA]를 보여주는 도면이다.
도 15는 도 14에 설명된 일련의 복제에 대한 Cp의 백분율 CV 대 log[DNA]를 보여주는 도면이다.
도 16a는 BIOLINE® DNA 샘플에 대한 분석 트레이스를 보여준다.
도 16b는 PROMEGA® DNA 샘플에 대한 분석 트레이스를 보여준다.
도 16c 내지 도 16f는 제1, 제2, 제3 및 제4 인간 천연 gDNA 샘플에 대한 일련의 분석 트레이스를 보여준다.
도 17은, qPCR 반응의 성공을 평가하기 위한 증폭 곡선 및 용융 연구를 나타낸, 일련의 형광 및 형광 미분 도면이다.
도 18은 인간 gDNA 용액의 경우에 액적 형성의 시간 전개를 보여준다.
도 19는 상이한 인간 gDNA 용액 샘플 및 상이한 크기 척도의 경우에 액적 형성의 시간 전개를 보여준다.
도 20은, 다양한 음향 전력 수준에서 2개의 상이한 톤 버스트 비율로 전사되는 액적을 보여준다.
도 21은 2개의 상이한 톤 버스트 비율에 대한 토출 전력을 증가시키기 위해, 토출 부피를 토출 전력과 비교하는 차트이다.
도 22는, 다양한 토출 전력에서 대형 액적과 소형 액적 모두에서 전사된 측정 부피의 산포도이다.
도 23은 전단 박화 비-뉴턴 유체에 대한 액적 전사 성공을 보여준다. 뉴턴 파라미터의 전사 시도는 ADE 전사를 생성하지 않음에 주목한다.
도 24는 전단 농후 비-뉴턴 유체에 대한 액적 전사 성공을 보여준다. 뉴턴 파라미터의 전사 시도는 ADE 전사를 생성하지 않음에 주목한다.
도 25는, ADE에 의한 DNA 전사의 견고성을 정량적으로 평가하는 데 사용되는 시험 플레이트에 대한 레이아웃 맵을 보여주는 개략도이다.
도 26은, 소형 액적을 사용하여 도 25의 시험 플레이트로부터 전사된 인간 gDNA에 대한 Ct 대 log[DNA]를 보여주는 플롯이다.
도 27은, 대형 액적을 사용하여 도 25의 시험 플레이트로부터 전사된 인간 gDNA에 대한 Ct 대 log[DNA]를 보여주는 플롯이다.
도 28은, 각각의 주어진 시작 농도 및 액적 카운트에 대해 예상 기울기에서 성공적으로 선형성을 달성한 전력 수준을 보여주는 도면이다.
도 29는, 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제1 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 30은, 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제2 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 31은, 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제3 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 32는, 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제4 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 33은, 비-뉴턴 유체를 특성화하고 유체의 동일성을 고정하기 위해, 동적 결합 분석(DMA)을 사용하기 위한 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 34는, 음향 액적 토출을 달성하고 톤 버스트 파라미터를 고정하기 위해 동적 분리 분석(DBA)을 사용하기 위한 예시적인 프로세스를 나타낸다.
도 35는, 음향 액적 토출에 의해 생성된 액적의 부피를 특성화하고 액적 부피를 고정하기 위해 동적 부피 분석을 사용하기 위한 예시적인 프로세스를 나타낸다.
다음의 설명에서, 다양한 구현예가 설명될 것이다. 설명 목적상, 구현예를 완전히 이해시키기 위해 구체적인 구성 및 세부 사항이 제시된다. 그러나, 다른 구성으로, 또는 특정 세부 사항 없이 실시될 수도 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 공지된 특징부는 설명 중인 구현예를 모호하게 하지 않도록 생략되거나 단순화될 수 있다.
본원에 설명된 기술은 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 방식으로 음향 액적 토출(ADE) 기술을 사용하여 비-뉴턴 유체(예컨대, 온전한 천연 게놈 DNA 또는 용액 중의 점탄성 중합체)의 샘플을 전사시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 본원에 설명된 기술은, 음향적으로 적격한 마이크로플레이트 또는 튜브 내의 웰로부터 음향 액적 토출(ADE) 기술을 사용하여, 미처리되고 파편화되지 않고 온전한 천연 게놈 DNA(천연 gDNA로 지칭됨)을 전사시킬 수 있다. 현재, 많은 생물학적 평가 작업 흐름은, 팁 기반 시스템을 사용하는 것과 같이, 미처리되고 파편화되지 않고 온전한 gDNA를 전사하는 전통적인 방법을 더 많이 사용한다. 이 방법론은, 연구 전용 또는 임상 진단 응용을 위해 향후 랩 설정용으로 미숙성되고 비접촉식이고 터치가 없는 액체 전사 프로세스를 제공한다.
본원에 설명된 ADE 기술에 대한 특이적 개선은, 대형 단편(>20 Kb) 및/또는 고농도(> 100 ng/μL) 둘 다를 갖는 천연 gDNA 샘플의 전사를 가능하게 한다. 이전의 ADE 능력은 한계, 및 전사 프로세스가 의도된 응용에 대해 충분히 정확하고 정밀하지 않게 되기 전에 유체가 가질 수 있는 뉴턴 거동으로부터의 편차를 갖는다. 예를 들어, 나노리터-규모의 액적을 형성하는 경우에, gDNA 크기가 길이가 20 Kb를 초과하고 농도가 100 ng/μL를 초과하므로, 음향 액적 형성 공정은 유체의 비-뉴턴 성질에 의해 방해를 받는다. 따라서, 희석물(예, 완충액(트리스-EDTA), 물, 다른 희석제를 이용), 첨가제(예, 염, 계면활성제), 가열, 전단, 단편화(효소, 키트), 축합 시약(예, 이온액, 스페르미딘, 스페르민) 또는 다른 형태와 같이, 단편 크기 또는 물리적 크기 또는 농도를 감소시키기 위한 조작 없이, 천연 gDNA를 전사하는 능력은, 미적정된 gDNA 시료를 전사하는 데 매우 바람직하며, 이러한 시료는 미적정 상태로 저장된다. 이러한 능력을 통해 연구자와 임상의는 생명 과학 및 임상 진단 응용 분야에 제한된(및 소중한) 천연 gDNA 샘플 또는 다른 문제 소지가 있는 생물학적 또는 중합체 물질의 샘플 취급(나노리터 스케일 포함)을 진정으로 소형화시킬 수 있을 것이다. 또한, 이러한 새로운 기능은, 자동화된 플랫폼 작업 흐름에서 더 적은 단계를 허용하고, 상위 단계를 수행하기 위해 다수의 상이한 자동화 액체 처리 플랫폼 또는 장치의 이용에 대한 필요성조차 감소시킨다.
본원에 설명된 기술은, 사용자가 "순수한" 미숙성 형태의 추출 천연 gDNA로부터 작업할 수 있게 하고 작은 부피(수 또는 수십 나노리터)를 음향적으로 전사하여 원하는 하위 생물학적 평가를 가능하게 한다. 복수의 수많은 소형 부피 샘플이 매우 재현 가능하고, 매우 정확하며, 매우 정밀한 모든 것을 전사하는 것에 기인하여 달성되는 바와 같이, 전사된 부피의 범위에 걸쳐 재현 가능하고, 정확하고, 정확하게 신규 음향 액적 전사 공정이 유지되는 사실을 이용하면, 더 큰 부피도 또한 전사될 수 있다. 본 문서에서, 고속 카메라(VISION RESEARCH INC., PHANTOM), 물 흡수지(SYNGENTA)뿐만 아니라 정량적 PCR(qPCR)(ROCHE 및 THERMOFISHER) 실험 결과로부터 수득된 실험 결과는, 본원에 설명된 기술에 따라 전사된 천연 gDNA의 기능, 품질 및 양을 입증한다. 전사된 모든 시료의 재현성, 정확성 및 정밀성은 높고, 이는, 하우스키핑 유전자를 사용하여 설명된 qPCR 평가에 대한 Cp 또는 Ct의 저 변이 계수(CV)에 의해 정량적으로 입증된다. Cp 또는 Ct는 교차 포인트 임계값을 나타내며, 여기서 DNA는 증폭되고, "무릎점"이 증폭 곡선의 흡수 중인 값을 나타낸다. 이는, 평가에 존재한 DNA의 양을 정량적으로 조사하는 분자 생물학자에 있어서는 가치 있는 관심 측정값이다.
또한, 비-뉴턴 음향 전달 공정의 낮은 전단률로 인해, 웰 또는 튜브(여기서 gDNA가 NGS와 같은 하위 공정에서 추가로 사용됨)와 같은 표적 용기로의 전사 후에 gDNA는 온전하게 유지된다.
특정 구현예는 도면을 참조하여 이하에서 상세히 설명된다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예에 따라, 명백하지 않은 토출 전력 범위(도 2 참조)에서 작동하는, 신규 토출 톤 버스트가 개시된다(표 1과 도 1 참조). 일반적으로, 뉴턴 유체에서와 같이, (표준 수성 완충제 뉴턴 톤 버스트와 조합된) 정확한 토출 전력의 결정은 생성된 시그니처(특성 음향 반사)에 의해 결정되고, 예를 들어 미국 특허 제9,908,133호에 설명된 바와 같이 생성된 마운드 이미지 신호 처리(널(null) 공간을 결정)와 상관되며, 이 특허는 본원에 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다. 뉴턴 유체에 대한 MIP(Mound Image Print) 결과는, 전사하기 위한 토출 임계값에 대해 정의된 바와 같이, 1-3 dB의 토출 에너지를 갖는 음향 액적 토출을 위해 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 샘플 전사를 생성한다. 이 공정은, 뉴턴 유체의 웰 또는 튜브와 같은 유체 저장조로부터 액적을 토출하기 위한 전력 요건을 결정하는 데 사용된다. 비-뉴턴 유체의 경우, 유체가 (ADE 공정에서와 같이) 연장 흐름을 받을 경우에 상이한 물리화학적 특성이 상당히 있다. 또한, 신호 처리와 관련된 섭동이 낮은 전단 값에서 일어나기 때문에, MIP 결과는 이들 차이를 구별할 수 없다. 따라서, 신호 처리의 이러한 단계 동안에 MIP에 의존하여, 신호 처리가 뉴턴 유체에 대한 불충분한 차이를 나타낼 시, 에너지를 전달하기 위한 정확한 토출을 나타내고, 일부 경우에, 이는 상승된 음향 출력으로 인해 증가된 전단 속도로 발생하는 더 강한 뉴턴 거동으로부터의 편차를 보상하기 위해 액적 형성에 효과적이지 않은 음향 액적 토출을 위한 1 dB의 토출 전력을 시사한다. 비-뉴턴 유체에 대한 ADE-기반 전사는, 새로운 토출 에너지 체제와 함께 새로운 톤 버스트(일반적으로 토출 임계값보다 ~6-11 dB 정도 높음)를 사용하여 달성될 수 있다. 3가지 유형의 온전한 gDNA 샘플에 대한 결과가, 새로운 톤 버스트와 함께 1 dB(뉴턴 ADE 경우) 내지 6-11 dB(정확하거나 비-뉴턴 ADE 경우)에 대해 아래에 나타나 있다.
도 1은, 전력 부족 조건(좌측 - 102, 104, 106)에서 및 ADE 성공을 초래하는 고 전력 조건(우측 - 108, 110, 112)에서의 액적 토출 장치의 고속 이미지(100) 세트를 나타낸다. 이 도면은 ADE의 목적을 위해 비-뉴턴 유체를 뉴턴 유체로서 처리하는 것의 단점을 나타낸다. 본 발명의 구현예에 따라, ADE에 의해 전사될 유체가 비-뉴턴 유체임을 검출하는 것에 응답하여, ADE 시스템은, 증가된 전력 조건을 사용하여 시험 저장조 내의 용액의 비-뉴턴 성질을 보상한다. 도 1의 경우, 비-뉴턴 gDNA 용액을 사용하였다. 49 μs 노출 시간으로 초당 20,000 프레임으로 이미지를 캡처하였다. 3개의 상이한 천연 gDNA 샘플을 음향 튜브로부터 토출하였다. 위에서 아래로, 샘플은 BIOLINE® (102, 108) 및 PROMEGA® (104, 110)로 상업적으로 획득한 반면에, 인간 샘플은 Roche MagNA Pure® (106, 112)를 사용하여 추출되었다. 모든 샘플은 >20 Kb 및/또는 고농도 > 100 ng/μL이었다.
표 1: 유체 토출을 위한 톤 버스트 특성화
Figure pct00003
표 1은, 성공적인 ADE에 사용된 뉴턴 및 비-뉴턴 유체 교정에 대한 톤 버스트 세그먼트 길이의 비교를 보여준다. 본원에 설명된 바와 같이, 비-뉴턴 샘플 상의 성공적인 ADE는, Labcyte® Echo 음향 액적 토출기를 변형함으로써 수행하였다. 이러한 뉴턴 톤 버스트는, Labcyte Echo 525 액체 핸들러 상에서 (버퍼 또는 수용액에 일반적인) 25 nL의 뉴턴 유체를 강력하게 전사한다. Labcyte Echo 550/555 상에서 > 100 ng/μL의 농도로 긴(> 20 Kb) 천연 gDNA를 전사하기 위해, 비-뉴턴 톤 버스트를 사용하였다. 도 2는, 뉴턴(201) 및 비-뉴턴(202) 톤 버스트에 대한 음향 파형을 보여주는 음향 진폭 플롯(200)을 보여준다.
온전한 천연 gDNA 또는 점탄성 중합체 용액 및 용융물을 포함한 생물학적 유체는, 일반적으로 전단 응력 프로파일에 대한 비선형 반응을 변형률의 함수로서 나타낼 것이고, 이는 ADE와의 작동에 바람직한 비-뉴턴 유체의 잘 알려진 예시이다. 이들 유체 샘플은, MIP를 이용해 연역적으로 특성화하기가 종종 어려운 복잡한 거대분자 용액이다. 실제로, 표준 음향 반향을 사용하여 검사되었을 경우에, 음향적으로 적격한 마이크로플레이트 또는 음향적으로 적격한 튜브와 같은 저장조 내의 뉴턴 및 비-턴 유체 둘 모두는, ADE 공정에 필요한 신호 처리 및 인지된 에너지에서 거의 또는 전혀 차이를 나타내지 않는다. 점탄성 특성은 토출 에너지에서 발현되므로, (적합한 에너지로 마운드로부터 생성된) 액적은 끈 모양으로 끊기지 않는다. 그 결과, 액적은 마운드로 복귀하고, 웰 또는 튜브 내의 샘플의 저장조로 "돌아오기"를 한다. 천연 gDNA의 경우에, 용액은 일부 경우에, 액적 분리 없이 길이가 최대 1 cm(또는 그 이상)까지 "신장"될 수 있다. 인가된 에너지가 높을수록, 중합체 gDNA 사슬이 더 단단히 정렬되어, 액적 분리조차 훨씬 더 어렵게 된다. 이는 유사하게, 고무 밴드를 신장할 시 고무 밴드의 신장과 같고, 중합체 사슬은 더 정렬되고, 신장하는 것이 더욱 어려워진다. 또한, 비-뉴턴 유체의 증가된 점탄성은, 액적 분리 동안에 힘의 균형에 악영향을 미치며, 본원에 설명된 새로운 방법론은 비-뉴턴 유체에 대해 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 음향 액적 토출을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
도 3a는, 650 mV의 음향 톤 버스트 전압과, 톤 버스트 이후에 1400 μs가 지난 다음 광학적으로 스트로빙하여, 물을 이용한 토출 공정을 보여준다. 도 3b는, 다음의 톤 버스트 특징을 이용해 천연 gDNA의 토출 공정의 스트로보스코픽 이미지이다: 톤 버스트 세그먼트 1 길이 = 275 μs, 세그먼트 2 길이 = 130 μs, 세그먼트 3 길이 = 100 μs, 세그먼트 1 CF = 5.85 MHz, 세그먼트 3 CF = 5.15 MHz. 음향 톤 버스트 전압은, 동일한 뉴턴 톤 버스트 세그먼트 길이를 갖는 1100 mV이다. 톤 버스트가 적용된 이후에 ~5000 μs가 지난 다음 이미지를 캡처하였다. 토출 톤 버스트는 저장조로부터 멀리 연장된 선단 로브(301)를 생성하고(도 3a, 3b 참조), 필라멘트(303)에 의해 유체의 나머지와 연결된다. 천연 gDNA의 경우에, DNA 중합체 사슬은, 연장 흐름이 DNA를 "신장" 구성으로 배치하고 더 많은 전력이 인가됨에 따라 계속 신장하는 방식으로 정렬함을 주목하는 것이 유용하다(도 3b 참조). 또한, 더 많은 에너지가 인가됨에 따라, 더 긴 천연 gDNA 나사선이 생성되고(수 mm), 분리된 액적은 없다. 1400 mV의 음향 전력(물 토출 경우보다 약 6 dB 높음)을 이용해도, 여전히 액적 분리는 없다. 또한, 이들 점탄성 유체를 이용한 통상적인 MIP 측정은, 천연 gDNA에 점탄성이 존재하지 않고 사슬이 액적 분리에 근접할 때까지 상당히 정렬되지 않는 경우에, 적합한 예측 토출 전력을 산출함을 또한 주목해야 한다. 따라서, MIP 기반 결과는 점탄성 현상의 완전한 영향을 포착하지 못한다.
유체를 채운 웰 또는 튜브의 정상적인 음향 검사에서, 음향 변환기는 관심 웰 아래에 위치한다. 물 또는 다른 결합 유체는, 마이크로플레이트 밑면 또는 튜브 바닥과 같은 저장조의 바닥과 변환기 사이의 갭을 가교한다. 음향 신호는, 변환기로부터 결합 유체를 통해, 웰 또는 튜브 플라스틱 하단 멤브레인을 통해, 유체 내로 그리고 마지막으로 위의 공기 내로, 전파된다. 음향 신호는, 이들 인터페이스 각각에 반사되고 원래 신호를 방출했던 동일한 변환기에 의해 수집된다. 초기 파형은 반사 신호와 중첩되지 않는다. MIP(Mound Image Print)로 불리는 공정에서, 유체 특성에 대한 정보는 반사 신호로부터 추출된다. (도 4a 내지 도 4d에서 도시된 바와 같이) gDNA 농도를 증가시키는 경우에, MIP 결과는 순수 완충액 조건(1x PBS)과 최대 100 ng/μL의 고유 gDNA 농도까지의 차이를 나타내지 않는다. 구체적으로, 도 4a는 천연 gDNA가 없는 물로부터의 음향 신호 파형 패턴을 나타내는 차트(400a)를 포함하고, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 각각 50 ng/μL (400b), 120 ng/μL (400c), 및 160 ng/μL (400d)의 천연 gDNA를 함유한 물로부터의 음향 신호 파형 패턴을 나타내는 차트를 포함한다. 100 ng/μL의 천연 gDNA 농도 초과에서, 표면 섭동 공명에서 발현하는 모세관 파가 존재하며, 이는 실제로 더 낮은 에너지가 액적 분리에 필요하다는 것을 시사한다.
본 개시에 따라, 대안적인 토출 톤 버스트 또는 음향 파형은, 웰 또는 튜브와 같은 저장조 내에 함유된 천연 gDNA와 같은 비-뉴턴 유체(도2 참조)에 인가된다. 음향 변환기는, 저장조 아래에 위치하고 웰 또는 튜브 내에 포함된 유체의 표면에 집중된다. 유체의 표면에 도달하고, 표면을 섭동시키고, 액적을 분리하는 데 필요한 톤 버스트의 진폭은, 뉴턴 유체(예, 물 또는 1x PBS)와 상당히 상이한 것으로 결정된다. 1-3 V 범위의 진폭을 갖는 토출 톤 버스트가 물 또는 1x PBS를 채운 웰에 인가되는 경우에, 유체 분리가 표면에서 발생하고 액적이 토출된다. 이는, 뉴턴급 유체로 작동하는 ADE 공정에 대해 예측되는 정상 거동이다.
음향 토출의 효능은, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 다양한 전력으로 샘플 액적 시험을 수행하여, Echo 550/555 액체 핸들러를 사용하여 실험적으로 입증될 수 있다. 도 5는, 증가된 전력, +0 dB(좌측) 및 공칭 전력 +2.0 dB(우측)을 사용하여 100 ng/μL에서 150 Kb 천연 gDNA를 전사하기 위한 시각적/정성적 단일 2.5 nL 샘플 액적 시험을 보여 준다. 도 6은, 40 Kb 천연 gDNA의 인간 샘플의 ADE 전사에 대한 시각적 시험을 보여 준다. 물 민감성 종이의 좌측 절반의 전력은 +0.0 dB이었고, 물 민감성 종이의 우측 절반의 전력은 +8.0 dB이었다. 384개의 위치 각각에서, 2.5 nL의 일 회 전사를 시도하였다. 도트의 존재 또는 부재는, 수성 유체가 종이와 접촉하는 경우에 물 민감성 종이가 황색에서 청색으로 변하기 때문에, 성공 또는 실패 액적 분리 이벤트인지 각각 나타낸다.
고 점탄성의 천연 gDNA 용액(도 5의 인간 샘플 및 도 6의 상업적으로 이용 가능한 천연 gDNA 샘플)을 두 개의 모드로 시도하였다. 먼저, 우리는 뉴턴 톤 버스트 및 에너지 전달 프로파일(502, 602 - 도면의 좌측)과 비-뉴턴 톤 버스트 및 에너지 프로파일(504, 604 - 도면의 우측)을 사용하였다. 뉴턴 프로파일을 명확하게 사용하면, 천연 gDNA의 액적은 전사되지 않았고, 비-뉴턴 프로파일의 경우에, 성공적인 전사는 청색 점을 나타낸 물 민감성 종이에 의해 표시된다. 이는 정성적 측정이며, 실패한 전사는 청색 점이 예상되는 곳에 빈 영역을 갖는다. 도 5는 천연 gDNA의 인간 샘플을 보여주고, 도 6은 상업적으로 이용 가능한 BIOLINE® 샘플을 보여준다.
다음으로, 전력이 증가함에 따라, 성공적인 전사의 수 또한 증가하는데(도 7 참조), 이는 "정상" 파라미터 공간이 성공 또는 재현 가능한 성공(나중에 qPCR 결과로 입증될 것임)을 포함하지 않음을 나타낸다. 표준 토출 임계값보다 ~6-11 dB 높은 성공적인 전사 고평부의 증가는, 신규 비-뉴턴 톤 버스트와 함께 비-뉴턴 점탄성 유체에 적합한 새로운 작동 체제를 강조한다. 뉴턴 유체에 사용된 정상 파라미터는 도 7에 강조된 바와 같이 적절하지 않다. 이는, 비-뉴턴 유체에 대한 성공적인 액적 토출을 갖는 데 필요한 최소 에너지를 나타내는 설정이다. 전사 성공률은 BIOLINE® 샘플(702), 인간 gDNA 샘플(704), 및 PROMEGA® 샘플(706)에 대해 전사 백분율로서 나타나 있다.
도 7은 토출 전력에 기초하여 다양한 DNA 용액에 대한 전사 성공률을 결정하는 경험적 접근법을 보여준다. 성공적인 전사는, 액적이 음향적으로 배출되어 목표 플레이트에 도달하는 것 경우로서 정의된다(또는 도 5 및 도 6에서처럼 목표 플레이트에 물 민감성 종이가 부착됨). 성공적인 전사는 MIP 용액에 추가된 전력의 함수로서 도표화된다. MIP 특징부가 켜지고, 이 구현예에서 샘플 충진 높이의 변화를 설명하기 위해 사용된다. 모든 전사는 1.48 MRayl의 고정된 시그니처 또는 임피던스 값을 사용하여 수행된다.
이상적으로는, 생물학적 평가 및 작업 흐름에서, 천연 gDNA가 출발 입력 물질로서 사용된다. 통상적으로, 천연 gDNA는 하위 응용을 위해 조작되거나 제조된다. 예를 들어, 천연 gDNA는 차세대 시퀀싱(NGS) 응용을 위해 짧은 세그먼트로 단편화될 수 있다. 최신 ADE 기술은 최대 100 ng/μL의 농도에서 20 킬로염기(Kb) 이하인 천연 gDNA 단편을 재현 가능하고, 정확하고, 정밀하게 전달할 수 있는데, 더 높은 예측 전력이 인가되는 경우에 저장소로부터 강력한 액적 분리를 초래할, 단지 마운드를 형성함으로써 토출 전력을 정확하게 예측하기에 충분할 정도로 뉴턴 거동으로부터의 편차가 낮기 때문이다. (천연 gDNA 단편의 평균 길이로서 측정된) 천연 gDNA의 크기 및 농도 모두 재현 가능한 ADE에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 잘 알려진 파라미터이고, 이는 둘 모두 개별적으로 및 조합하여 뉴턴 거동으로부터의 편차에 기여하기 때문이다. 다양한 천연 gDNA 샘플에 대한 연구 결과는 도 8에 강조되어 있다. 도 8a는 20 Kb 미만인 천연 gDNA가 음향적으로 재현 가능하고, 정확하며, 정밀하게 전사될 수 있음을 보여준다(톤 버스트 및 토출 에너지에 대한 뉴턴 파라미터를 활용함). 또한, 최대 100 ng/μL의 더 낮은 농도가 뉴턴 파라미터로 성공적으로 전사되었다. 도 8b는, 비-뉴턴 파라미터를 이용해, 더 큰 크기(최대 150 Kb)의 천연 gDNA 및 더 높은 농도(최대 200 ng/μL)의 천연 gDNA가 재현 가능하고, 정확하고, 정밀하게 전사될 수 있고, ADE를 통해 음향적으로 접근할 수 있는 천연 gDNA 크기 및 gDNA 농도의 2-차원 공간에서 인벨로프를 본질적으로 확장할 수 있음을 보여준다.
도 8a 및 도 8b는 gDNA 농도 대 단편 길이를 보여주는 산포도이다. 실패(802), 부분(804), 및 성공(806) 전사가, 전력 부족 조건 및 뉴턴 톤 버스트 전력에서 획득되었다. 성공적인 전사(808)는 고출력 상태에서 비-뉴턴 톤 버스트를 사용하여 균일하게 획득되었다. 음향 전사는 qPCR에 의해 측정된다(이후 추가 분석). 이 도면은 단편 크기 및 천연 gDNA 농도의 2-차원 공간에서 더 큰 인벨로프를 보여주는 역할을 한다.
본원에 설명된 방법은, 20 Kb 초과의 단편 크기 및 100 ng/μL 초과의 벌크 농도를 갖는 천연 gDNA를 음향적으로 검증된 튜브로부터, 매우 재현 가능하고, 매우 정확하며, 매우 정밀하게 전사시킬 수 있다(그러나, 마이크로플레이트, 저장소 등에서 음향적으로 검증된 웰로부터 수행될 수도 있음). 하나의 용기로부터 다른 용기로 물리적인 접촉 없이 이러한 작은 부피(2.5 nL)로 고농축 천연 gDNA의 긴 단편을 전사함으로써, 임상 응용(진단)을 위한 획기적인 능력이 프로세스를 소형화시키고, 사용자로 하여금 전사 장치에 대한 교차 오염이나 결합 또는 시약에 대한 두려움 없이, 보다 적은 작업으로 더 많은 것을 할 수 있게 한다. 이들 방법은 새로운 평가 개발 및 소형화를 위한 작업 흐름을 촉진하여 연구 및 임상 실험실에 기회를 개방할 수 있다. gDNA를 전사하기 위해 음향 튜브 및 다른 저장조를 이용함으로써, 작동 범위는 150 Kb 이상으로 그리고 최대 750 ng/μL 이상으로 실질적으로 증가될 수 있다.
그런 다음, gDNA 전사를 정량적으로 평가하기 위해, 정량적 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)을 이용하여 하우스 키핑의 유전자 베타 액틴(β-액틴)의 발현을 확인하고 검출하였다. qPCR 평가는 β-액틴 정방향 프라이머를 사용하여 수행하였다: AGC CAT GTA CGT TGC TAT CC; β-액틴 역방향 프라이머: CGT AGC ACA GCT TCT CCT TAA T, (IDT). 평가는 Roche LightCycler® 시스템 또는 THERMOFISHER QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. Roche LightCycler® 시스템은, LightCycler® 480 SYBR Green I Master(Roche), LightCycler® 480 Multiwell Plate 384(Roche), LightCycler® 480II Instrument(Roche)를 활용하였다. qPCR 프로그램을 다음과 같이 사용하였다: 단계 1, 95°C에서 60초; 단계 2, 95°C에서 15초; 60°C에서 30초; 72°C에서 60초, 단일 획득(45 사이클); 단계 3, 95°C에서 10초; 60°C에서 60초 및 97°C에서 연속. THERMOFISHER QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템은, PowerUpTM SYBR® Master Mix, THERMOFISHER 384-Well Clear Optical Plate를 활용하였다. qPCR 프로그램을 다음과 같이 사용하였다: 단계 1, 50°C에서 2분; 95°C에서 2분; 단계 2, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 획득(40 사이클); 단계 3, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분 및 95°C에서 15초.
단편화된 gDNA의 ADE에 대한 뉴턴 교정을 사용하고 손으로 피펫팅한 단편화된 gDNA와 비교한, 대조군 데이터.
PROMEGA®로부터 상업적으로 획득된 인간 천연 gDNA(56 Kb)를 초음파 검사기(Covaris Ultrasonicator Technology)를 사용하여 전단해서(8 Kb까지) 단편화하고, 음향 적격 튜브 내로 수동으로 피펫팅하였다. 최고 농도로서 100 ng/μL로 시작하는 8 Kb 단편을 사용하여, 8-포인트 2-폴드 표준 곡선을 생성하였다. 각각의 표준 곡선 포인트에 대해, 32개의 기술적 복제를 아래 설명된 바와 같이 qPCR에 의해 전사하고 평가하였다:
표 2: 상업적으로 이용 가능하고 단편화된 8 Kb gDNA PROMEGA 샘플에 대한 qPCR Cp 결과.
Figure pct00004
각각의 표준 곡선 포인트에 대해, 모든 32개의 복제를 전사했다. 실험 결과는 표로 제시되며 표 2에 도시된 값을 구성한다. DNA의 각 농도에 대해, 평균 교차 포인트(Cp) 값뿐만 아니라 Cp에서의 표준 편차, Cp의 %CV, 최소 및 최대 Cp뿐만 아니라 복제 수도 측정하였다. 이들 결과는, 뉴턴 파라미터 및 손으로 피펫팅한 대조군 실험 능력과의 비교를 갖는, (작은 크기의 단편화된 gDNA에 대한) 음향 전사 공정의 예상되는 변이를 보여주는, 실험의 대조군 세트로서 역할한다.
도 9는, 표준 ADE 기술을 이용하는 전사에 대해 ≥ 0.99의 R2 값, 및 동일한 단편화 gDNA 샘플의 수동 피펫 전달에 대해 ~0.98의 R2 값으로 강조된, 높은 수준의 선형성을 나타내는 전사를 사용하여, 생성된 표준 곡선의 플롯이다. 구체적으로, 도 9는 전단된 8 Kb PROMEGA® 샘플(N=32)의 모든 기술적 복제에 대한 log [DNA] 대 Cp를 보여준다. 백분율 CV로서 나타낸 ADE 전사 정밀도는 2% 미만이었다. 이러한 실험 세트는 "예측" 결과 품질에 대한 기준선으로서 역할한다. 손으로 피펫팅한 대조군 결과는 여전히 허용 가능하지만 ADE 결과보다 낮은 선형성을 가짐을 주목한다.
상업적으로 이용 가능한 소스로부터 미처리되고 미파편화되고 온전한, 천연 gDNA를 사용하고 비-뉴턴 교정을 이용하는 실험 데이터.
다음 단계는, 두 개의 상업적 소스인 BIOLINE® 및 PROMEGA®로부터 각각 40 Kb 및 56 Kb의 단편 크기를 갖는 천연 gDNA를 사용하여, 비-뉴턴 점탄성 유체에 대한 새롭게 결정된 파라미터 공간(톤 버스트 및 토출 에너지 체제)을 시험하는 것이었다. 이들 샘플을, 본원에서 설명된 기술에 따라 전사 준비를 위해 음향적으로 검증된 튜브 내로 수동으로 피펫팅하였다. AATI 단편 분석기(AATI, Ames, IA)를 사용하여 단편 크기를 측정하고 확인하기 위해, 이들 샘플을 분석하였다. 실험 결과는, 샘플의 길이가 실제로 41 Kb 및 56 Kb임을 강조하는 도 10에 나타나 있다. 다음으로, 비-뉴턴 톤 버스트 및 더 높은 에너지 교정을, 천연 gDNA(미성숙) 상에서 Echo 550 액체 핸들러로 ADE 전사에 적용하였다. 소스 튜브에서 각각의 천연 gDNA 샘플의 농도는 200 ng/μL이었다(NanoDrop Instrument(THERMOFISHER)로도 확인되고 결과는 나타나지 않음). 2.5 nL 내지 320 nL(1 액적 내지 최대 128 액적) 범위의 전사 부피를, qPCR 평가용 소스 플레이트로서의 역할도 하는 목표 플레이트 내로 전사한다. 재현성, 정확도 및 정밀도를 각 생물학적 샘플에 대해 다루기 위해, (통계적 유의성을 예시하기 위해) 각 실험 조건에서 32개의 기술적 복제를 전사하였다. 또한, 결과의 타당성을 확인하기 위해, 이들 실험을 여러 날에 걸쳐 반복하였다. 표 3, 도 11 및 도 12는 Cp 값을 나타내고, 비-뉴턴 유체에 대한 이러한 새로운 교정을 사용하여 매우 재현성 있고, 매우 정확하고 매우 정밀한 전사 능력의 유효성을 강조한다. 모든 전사에 대해, 전사된 복제 수는, 전사 부피가 5 nL인 PROMEGA 1일차 및 2일차 그리고 전사 부피가 2.5 nL인 PROMEGA 2일차를 제외하고는, 32개였다. 다른 모든 샘플의 경우, 모든 32개의 복제를 전사했다. 전사를 사용하여 생성된 표준 곡선의 선형성은, 모두 ≥ 0.99의 R2 값을 갖는다. 모든 전사에 대한 백분율 CV는 5% 미만이었다(대부분의 경우 < 3%).
도 10a 및 도 10b는 BIOLINE® (40 Kb) 샘플(도 10a, 차트 1002) 및 PROMEGA®(56 Kb) gDNA 샘플(도 10b, 차트 1004)에 대한 AATI Fragment Analyzer 트레이스를 보여주며 상업적 공급자에 의해 표시된 바와 정말로 같은 크기였음을 강조한다. 이들 샘플에 대한 qPCR Cp 데이터는 아래 표 3에 나타나 있다.
표 3: 천연 BIOLINE® (40 Kb) 및 PROMEGA® (56 Kb) 샘플에 대한 qPCR Cp 데이터.
Figure pct00005
도 11은 천연 gDNA(N=26-32)의 생물학적 및 기술적 복제에 대한 Cp 대 log[DNA]에 의해 측정된 qPCR 데이터를 나타내고, 도 12는 표 3에 설명된 모든 생물학적 및 기술적 복제에 대한 Cp 대 log[DNA]의 백분율 CV를 보여준다. 높은 선형성은, 도 11에서 R2 값 > 0.99로 나타난다. 또한, 높은 정밀도 및 재현성은 도 12에서 실험 실행의 각 농도에서 복제에 대한 낮은 CV 값으로 나타난다.
인간 샘플로부터 미처리되고 미파편화되고 온전한, 천연 gDNA를 사용하고 비-뉴턴 교정을 이용하는 실험 데이터
약 150 Kb의 가장 큰 단편 모집단을 갖는 15 kKb보다 큰 단편 크기를 갖는 전혈에서 추출된 여섯 개의 인간 샘플 유래의 천연 gDNA를, 그 다음 음향적으로 적합한 튜브로부터 전사했다(도 13). 소스 튜브에서 각각의 천연 gDNA 샘플의 농도는 100 ng/μL 내지 175 ng/μL인 것으로 측정되었다(NanoDrop 결과에 의해 검증되며 결과는 안 나타냄). 반응물을 로딩하기 위한 qPCR 소스 웰 내로의 전사 부피는 1개의 액적(2.5 nL) 내지 128개의 액적(320 nL) 범위였다. 정밀도를 다루기 위해, 각각의 생물학적 샘플에 대해, 각 조건 당 10개의 기술적 복제를 전사했다. 제한된 양의 gDNA 샘플을 고려하여, 실험을 한 번만 수행하였지만, 차이가 있을 것으로 예상되지는 않는다. 표 4, 도 14 및 도 15는 Cp 값을 보여주며, 인간 고유 gDNA 샘플 전사의 고정밀도, 고정확도 및 높은 재현성을 다시 한 번 강조한다. 모든 샘플에 대해, 모든 10개의 복제를 빠짐없이 100% 성공률로 전사하였다(0% 드롭아웃 비율). 전사를 사용하여 생성된 표준 곡선의 선형성은, 모두 0.999의 R2 값을 갖는다. 모든 전사에 대한 Cp의 백분율 CV는 < 2.5%이었다.
표 4: 6-인간 천연 gDNA 샘플에 대한 qPCR Cp 데이터
Figure pct00006
Figure pct00007
도 13은 큰 단편 크기를 보여주는 인간 gDNA 샘플에 대한 AATI Fragment Analyzer 트레이스(1300)를 보여준다. gDNA 크기는 도 13에서 평가되었고, 샘플에 대해 큰 단편 크기로 확인되었다. 도 14는, 표 4에 설명된 바와 같이, 모든 생물학적 및 기술적 복제에 대한 Cp 대 Log [DNA] 데이터(1400)에 의해 측정된 qPCR 데이터를 보여준다. 전사 결과는, 인간 gDNA의 6개의 상이한 샘플에 대해 R2 값이 > 0.99인 고매우 재현 가능한 전사 및 매우 선형인 전사를 나타낸다. 도 15는, 표 4에 설명된 바와 같은 모든 인간 샘플에 대한 생물학적 및 기술적 복제에 대한 Cp의 백분율 CV 대 log [DNA] 데이터(1500)를 보여준다. 생물학적 및 기술적 복제의 모든 전사에 대한 Cp의 CV는 3.2% 이하였다.
전사전 및 전사후 분석
게놈 DNA 샘플 무결성은, 많은 생물학적 응용, 작업 흐름, 및 특히 gDNA 저장 및 저장소에 대한 주요 관심사이다. 섹션에서 강조된 데이터는, 새로운 톤 버스트 및 음향 에너지 범위를 갖는 ADE에 의해 전사된 천연 gDNA뿐만 아니라 전사된 gDNA가 qPCR 평가에서 성공적으로 증폭되어 품질을 평가할 수 있음을 확인한다. 전사된 천연 gDNA의 특성을 추가로 평가하기 위해, AATI Fragment Analyzer(AATI)를 사용하여 전사후 샘플을 분석하여 단편 크기를 결정하고 확인하였고, 천연 gDNA는 (최소 전단으로) 그 무결성을 유지하였다. 도 16a 내지 도 16f 및 표 5는, 모두 BIOLINE® 및 PROMEGA®로부터 상업적으로 수득된 인간 천연 gDNA 샘플 및 인간 샘플에 대한 AATI Fragment Analyzer 트레이스를 보여준다.
이들 샘플 각각에 대한 AATI 트레이스는, gDNA 크기의 (기술의 실험 오차 내에서) 경미한 증강 또는 전사후 조건에 대한 작은 하향 이동을 보여주며, 이는 가능한 경미한 전단량을 시사한다. 그러나, 모든 경우에, 이들 샘플 중 어느 하나에서의 gDNA 후전사는 20 Kb를 초과하는데, 이는 뉴턴 톤 버스트 및 음향 에너지 전달 능력의 한계였다. AATI 기기는 또한 ±25%의 DNA 정량 정확도 및 20% CV의 DNA 정량 정밀도를 갖는다. 본원에 제시된 모든 데이터는 이들 규격에 부합한다. 본원에 생성된 데이터는 큰 단편 gDNA를 나타내며, 하기 표 5에 나타나 있고, 이는 신규 음향 비-뉴턴 파라미터를 사용하여 사전- 및 사후-전사의 동일한 샘플과 비교하여 수동으로 피펫팅된(대조군) 상업용 및 인간 천연 gDNA 샘플에 대한 단편 크기(Kb)를 보여준다.
표 5: 상업용 및 인간 천연 gDNA 샘플에 대한 단편 크기 (Kb).
Figure pct00008
단편 특성은, gDNA 샘플의 각각 선택된 유형에 대해 수동 피펫팅된(하단 - 1603a 내지 1603f) 사전-전사(중간 - 1602a 내지 1602f) 및 사후-전사(상단 - 1601a 내지 1601f)의 AATI Fragment Analyzer 트레이스(도 16a 내지 도 16f)에 나타나 있다. 도 16a는 BIOLINE gDNA 샘플에 대한 트레이스를 보여준다. 도 16b는 PROMEGA gDNA 샘플에 대한 트레이스를 보여주고, 도 16c 내지 도 16f는 인간 천연 gDNA 샘플인 샘플 1(도 16c), 샘플 2(도 16d), 샘플 3(도 16e), 및 샘플 4(도 16f) 각각에 대한 트레이스를 보여준다.
용융 곡선 분석
성공적인 qPCR 반응은 DNA 증폭뿐만 아니라 용융 곡선 분석에 기초한다. qPCR 반응 동안에 앰플리콘이 생성됨에 따라, 형광 SYBR 녹색 염료가 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 결합하고 이들 복합체는 형광을 나타내 형광 신호 및 특징적인 증폭 곡선을 생성한다. 증폭 곡선은 3개의 단계 - 개시 단계, 지수 단계 및 고평부 단계로 구성된다. 개시 단계는 거의 항상 형광 검출 수준 미만이다. 지수 단계에서, 새로 합성된 dsDNA 사본이 만들어지고, 따라서 SYBR 염료가 dsDNA에 결합함에 따라 형광의 증가로 표시된다. 마지막으로, 고평부 단계는 반응의 종료를 나타내며 안정화 단계라고도 한다.
각각의 특이적 앰플리콘은 특징적인 증폭 곡선을 갖는다. 증폭이 발생함에 따라, qPCR 사이클의 수가 기록되어, 지수 단계에서 사이클 임계값(Ct) 또는 교차 포인트 임계값(Cp)으로 불리는 임계값이, 증폭이 발생하는 수준을 평가하는 데 사용된다(도 17, 플롯 1702 참조). 증폭 곡선은 사이클 임계값(Ct) 또는 사이클 번호로도 알려진 교차 포인트(Cp)의 함수로서 도표화된다. 사이클 수(Ct 또는 Cp)가 낮을수록 DNA의 초기량이 더 높다. 사이클 수(Ct 또는 Cp)가 높을수록, 초기 DNA의 양이 더 적어서, 사이클 당 DNA의 농도가 증가함에 따라 더 많은 사이클이 필요함을 의미한다. qPCR 반응의 특이성을 보장하기 위해, 앰플리콘이 dsDNA로부터 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 해리되는 온도를 측정하기 위한 용융 곡선 분석도 수행하였다. 증폭 후, 이중 가닥 SYBR 녹색 결합 앰플리콘을, 증분 온도 증가에 노출시켰다(플롯 1704). 온도가 프라이머의 용융 온도 이상을 초과하면, 앰플리콘은 해리되고 SYBR 녹색 형광 신호는 감소한다. 그런 다음, 이러한 곡선의 기울기를 온도의 함수로서 도표화하여 당업계에서 대부분의 연구원이 사용하는 분석인 용융 곡선을 생성한다(도 17, 플롯 1706).
본원에 설명된 모든 연구에서, β-액틴 앰플리콘은 266 염기쌍(bp)이고 88±1°C에서 용융 피크 온도를 갖는다. 100 내지 0.78 ng/μL 범위의 양성 대조군 8-포인트 2-폴드 희석 표준 곡선은 각각 20 내지 32 범위의 앰플리콘 Cp/Ct를 나타냈다.
본원에 설명된 기술은 다양한 샘플 유형 및 샘플 전사 프로토콜에 적용될 수 있다. 예를 들어, 많은 연구 및 임상 실험실에서, 게놈 데옥시리보핵산(gDNA)은 박테리아, 바이러스, 식물, 전혈(WB) 및 성분(혈장, 혈청), 조직, 포르말린 고정 파라핀 내포(FFPE) 조직, 세포, 타액(-담관), 소변 및 뇌척수액(CSF)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신선 및 보관 샘플 둘 다로부터 추출된다.
본원에 설명된 기술은, 온전한 천연 gDNA가 하위 응용을 위해 액체 핸들러에 의해 취급되는 것이 바람직한 높은 샘플 무결성(예, 바이오 저장 또는 저장소로부터의 샘플)을 필요로 하는, 임의의 DNA 기술 응용에 유용하다. DNA는 생명의 초석이 되는 구성 요소이므로, 응용 분야는 매우 광범위하며 임상/진단 응용 분야, 의료 연구, 의료 치료, 제약/생명공학 연구 응용 분야, 농업 응용 분야 및 법의학 분야에 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는, 이전에 ADE에 의해 접근할 수 없었던 점탄성 중합체 용융물 및 중합체 용액의 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 음향 액적 토출을 가능하게 한다. 과거에는, 점도를 감소시키고 탄성을 감소시키는 방법론, 예컨대 용매를 이용한 중합체 용융 또는 중합체 용액 샘플의 가열 및 희석이 한계 수준의 성공을 나타냈고, (열 비활성화 또는 용매 구동 열화를 통해) 천연 샘플을 변경하고 잠재적으로 샘플을 손상시키는 것을 포함하였다. 본 발명의 일부 구현예는, 포토레지스트의 증착 또는 중합체 샘플 및 중합체 용융물의 조사를 최소화하는 능력과 같은 반도체 응용을 해결할 수 있는 잠재력을 갖는다. 또한, 약물 전달 응용 분야는 고 투여량의 "시간-방출" 약물로서도 가능할 수 있고, 약물은 폴리머 용액 내에 도핑될 수 있고, 이는 약물을 가장 효율적으로 전달하기 위해 가장 높은 표면적 대 부피 비를 갖는 단일-분산된 구체 형태의 초분산 "적재" 약물 전달 제제를 생성하는 수용기로 전달될 수 있다.
도 18은, 전단-박화 거동을 나타내는 비-뉴턴 액체에 대한 액적 형성의 시간 변화를 보여준다. 유체는 PROMEGA®로부터의 gDNA를 포함한다. 유사한 점도를 갖는 뉴턴 유체와 비교하면, 액적의 방출 전에 요구된 긴 필라멘트 형성 및 긴 시간 스케일을 주목한다. 본 개시는, 필라멘트의 헤드를 강력한 방식으로 액적 내로 파열시킬 수 있으며, 이는 이들 액적의 부피가 일정하다는 것을 의미하고, 필라멘트는 추가 파열 없이(사슬 상의 비드가 재현 가능하게 수축됨) 저장조로 다시 후퇴한다. 이는 2.5 nL 액적(더 높은 주파수, 더 짧은 파장)을 생성하는 Echo 550 및 Echo 555 기기의 변환기를 사용하여 수행하였다. 여기서 액적 크기는 대략 2.5 nL로 추정된다. 이들 방법은, 임의의 적절한 비-뉴턴 유체, 특히 표준 핵산 용리 완충액, 예컨대 물 또는 TE와 함께 적용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 유체 표면(1802)에 음향 에너지를 인가하면, 선단 로브(1806)와 필라멘트(1808)로 추가 발전하는 마운드(1804)를 생성함으로써, 액적 토출을 유도한다. ADE의 기존 방법에서, 음향 에너지는 유체를 유체 표면으로부터 멀리 밀어내는 모멘텀의 슬러그를 제공하지만, 비-뉴턴 유체의 경우에, 이들 방법은 유체 표면(1802)로부터 쉽게 분리되거나 재흡수되는 일시적인 로브를 생성하는 경향이 있다. 비-뉴턴 유체의 액적을 토출하기 위해 본원에 설명된 구현예에 따라, 초기 톤 버스트는 유체 표면(1802)으로부터 상승된 유체의 많은 부분을 함유한 세장형 필라멘트(1808)를 생성한다. 일부 비-뉴턴 유체는, 세장형 필라멘트(1808) 내로 흡인되는 경우에, 또한 필라멘트를 따라 일련의 유체 축적 또는 비드(1810)를 생성하는데, 이는 1, 2, 5, 10, 또는 그 이상의 비드로 구성될 수 있고, 여기서 신장 단계 동안에 생성된 액적의 50%, 75% 또는 90% 미만에서 필라멘트 직경보다 10, 20% 또는 50% 더 두껍게 비드 크기가 변할 수 있다. 종래의 ADE 방법이 뉴턴 유체에 대한 낮은 토출 진폭 또는 표준 토출 진폭으로 비-뉴턴 유체에 적용되는 경우에, 필라멘트(1808)의 유효 탄성은 액적 토출을 방지하는 경향이 있다. 역으로, 전통적인 ADE 방법이 매우 높은 진폭으로 적용되는 경우에, 필라멘트(1808)는 비드(1810) 사이에서 파열되는 경향이 있으며, 이는 더 작은 다수 액적의 예측 불가능한 토출을 야기할 것이다. 이러한 효과는, 액적 토출 부피 제어의 손실뿐만 아니라 세장형 필라멘트(1808)의 갑작스러운 분리가 유체의 DNA 또는 다른 내용물을 전단할 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 대조적으로, 본원에 설명된 방법은 세장형 필라멘트(1810)의 액적(1812)과 나머지(1814) 사이의 깨끗한 분리를 제공한다. 일부 구현예에서, 액적(1812)의 분리는, 필라멘트(1810)가 액적 직경에 비해 매우 길 경우에 발생할 수 있다. 분리는, 2 초과, 5 초과, 또는 10 초과, 또는 20 초과, 또는 50 초과의 필라멘트 길이에 대해, 토출된 액적 직경의 100배를 초과하거나, 일부 구현예에서는 훨씬 더 많이 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 필라멘트를 수축시키는 동안에, 비드는 서로 결합되거나 합쳐져 후퇴하는 나머지(1814) 내로 들어갈 수 있으므로, 비드의 수는 감소하고 병합된 비드의 크기는 메니스커스를 향해 후퇴하면서 성장할 것이다. 일부 구현예에서, 액적(1812)의 부피는 분리 시점에서 필라멘트(1810) 내에 함유된 부피보다 상당히 작을 수 있으며, 예를 들어 유체 필라멘트(1810)의 길이의 10% 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 토출된 액적(1812)에 포함된 부피는 나머지(1814) 부피의 50% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만일 수 있다.
도 19는, 상이한 DNA 용액 및 상이한 크기 규모에 대한 액적 형성의 시간 전개를 보여주는 개략도(1900)이다. 여기서, 유체는 BIOLINE®으로부터 유래되었고, 전사는 Echo 525 기기(Echo 550 또는 Echo 555 기기인 더 낮은 주파수 및 더 큰 파장) 상에서 수행되어 25 nL의 공칭 액적 크기를 만들었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 유체 표면(1902)에 음향 에너지를 인가하면, 선단 로브(1906)와 필라멘트(1908)로 추가 발전하는 마운드(1904)를 생성함으로써, 액적이 또한 토출된다. 초기 톤 버스트는, 유체 표면(1902)으로부터 상승된 유체의 많은 부분을 함유한 세장형 필라멘트(1908)를 생성한다. 추가의 톤 버스트에 응답하여, 액적(1912) 및 세장형 필라멘트(1910)의 나머지(1914)는 임의의 작은 액적을 방출하지 않고 서로 분리된다. 일부 구현예에서, 액적(1912)은 필라멘트(1910)보다 상당히 적을 수 있고, 예를 들어 유체 필라멘트(1910)의 길이의 10% 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 토출된 액적(1912)에 포함된 부피는 나머지(1914) 부피의 50% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만일 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원에 설명된 바와 같이, 톤 버스트는 3개의 세그먼트를 포함한다. 일 구현예에서, 비-뉴턴 유체의 2.5 nL 액적을 제조하기 위해, 세그먼트 1은 가장 길고 세기가 높으며, 이어서 음향 에너지가 생성되지 않는 짧은 세그먼트 2, 및 이어서 중간 지속 시간(여기서는 18 마이크로초)의 최종 세그먼트 3이 이어진다. 다양한 세그먼트의 전력 강도 및 길이의 조절을 통해, 액적 토출이 달성될 수 있다. 톤 버스트 A 및 톤 버스트 B 모두에 대한 전력 레벨은, 도 20 및 도 21에 나타낸 뉴턴 유체에 대한 것 이상의 전력 레벨을 요구하여, 필라멘트가 저장조 내로 다시 강하게 부피 전사되고 재현 가능하게 후퇴하는 것(작은 위성의 생성을 회피함)을 달성한다. 톤 버스트 특성은 아래 표 6에 열거되어 있다.
표 6: 비-뉴턴 유체에 대한 톤 버스트
Figure pct00009
도 20은, 톤 버스트 A(2002) 및 톤 버스트 B(2004)에 대해 다양한 음향 전력 수준(좌에서 우로 dB 증가)에서 이들 톤 버스트로 전달된 동일한 비-뉴턴 유체의 액적을 나타낸다. 낮은 수준에서, 액적은 필라멘트로부터 방출되지 않는다. 높은 수준에서, 액적만 전사되고 배치가 양호하다(각각 8dB 및 10dB). 더 높은 수준에서, 전사 품질은 저하되고 필라멘트는 단일의 원하는 액적 이상으로 파열된다. 임의의 보조 액적 또는 위성은 바람직하지 않다. 톤 버스트 및 전력의 바람직한 구현예는, 도 18 및 도 19의 개요에 나타낸 바와 같이, 원하는 부피의 단일 액적을 형성하고 필라멘트가 저장조 내로 수축하는 것이다.
도 21은 또한, 토출 부피를 토출 전력과 비교한 차트(2100)에서 음향 전력이 증가함에 따라 전사되는 부피가 어떻게 변하는지 보여준다. 일부 구현예에서, 전력 곡선 대비 체적의 더 낮은 기울기가 바람직하며(예를 들어, 톤 버스트 A(2102) 대 톤 버스트 B(2104)에 대한 체적 대 전력 곡선 참조), 전사되는 액적 부피에 대한 전력 민감도를 감소시킨다. 각 세그먼트에 대한 톤 버스트 상대 진폭, 지속 시간, 주파수 내용의 조정은, 액적 부피 특성의 감도 특성을 개선하기 위해 수정될 수 있다. 도 22는, 다양한 토출 전력에서 대형(2202) 및 소형 액적(2204) 모두에 대해 BIOLINE® 유체에 대해 전사된 측정 부피 및 전력 감도와 상관된 이들의 관련 부피의 산포도(2200)를 보여준다.
도 23 및 도 24는, 비-뉴턴 거동이 음이온성이 아니고 DNA와 같이 뉴클레오티드 중합체로 인한 것이 아닌 유체에 적용된, 본 발명의 다른 특정 구현예를 나타낸다. 일 실시예는 전단 박화 유체로 지칭되는 비-뉴턴 유체 클래스(도 23, 이미지 2300)에 대한 것이고, 다른 하나는 전단 농화 유체에 대한 것(도 24, 이미지 2400)이다. 이미지 2300(도 23)은, 전단 박화인, 아미노산 라이신 용액, 25 부피% 폴리-l-리신 수용액으로 이루어진 양이온성 동종 중합체에 대한 성공적인 액적을 보여준다. 이미지 2400(도 24)은, 콜로이드 현탁액으로 이루어진 전단 농화 또는 증점제인, 5 부피% 옥수수 전분 수용액에 대한 성공적인 액적 전사를 보여준다. 각 유체 유형에 대해 작용하는 파워 윈도우의 존재는, 2302와 2402로 명확하게 나타나 있다. 그러나, 많은 다른 유형의 유체, 용질의 부류 및 비-뉴턴 분류는 본원에 설명된 방법에 따라 ADE에 의해 처리될 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법을 사용하여 전사될 수 있는 적절한 비-뉴토니아 유체는 양이온성, 음이온성, 뉴클레오티딕성, 및 펩티드성 용액, 현탁액, 콜로이드, 증점제, 및 기타 유체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
도 25 내지 도 28은, 다수의 상이한 웰로부터 전사된 DNA를 정량화하고 qPCR에 의해 측정함으로써, 방법의 견고성을 나타내기 위한 또 다른 DNA 함유 유체에 대한 데이터를 나타낸다. 시험 플레이트에 대한 레이아웃 맵은 도 25에 나타나 있고, 각각의 웰에서 수집된 다양한 수의 액적 및 DNA 용액의 농도 범위에 대해 각각 소형 액적과 대형 액적을 만들기 위해 높은 음향 주파수와 낮은 음향 주파수 모두를 사용한다. 도 26 및 도 27은 일부 전력 수준에 대한 응답이 매우 반복 가능하고 선형임을 나타내고, 도 26은 소형 액적에 대한 Ct 데이터(2600)를 나타내고, 도 27은 대형 액적에 대한 Ct 데이터(2700)를 나타낸다. 토출 톤 버스트 진폭은 절반-dB 단계에서 약 6 dB(2601, 2701) 내지 약 11 dB(2602, 2702) 범위였다. Y축은 Ct, DNA를 특정 임계 수준까지 증폭시키기 위해 필요한 qPCR 기기의 사이클 수임을 주목한다. 따라서, 더 낮은 Ct는 더 초기의 시작 DNA 농도에 상응한다. 시작 농도 및 액적 카운트에 대한 예상 기울기에서 선형성을 달성하기 위한 전력 레벨은 도 28의 표에 강조되어 있다. 소형 액적 크기 및 대형 액적(2802, 2804)에 대해 반복 가능하고 선형이며, 결과는 대형 gDNA(68Kb) 및 gDNA 고농도(105 ng/μL)에 대해서도 다양한 전력 수준에 걸쳐 달성 가능하다.
도 29 내지 도 31은, 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한, 예시적인 프로세스를 나타낸다. 공정(2900, 3000, 3100, 및 3200), 및 본원에 설명된 임의의 다른 공정은 본원에 설명된 바와 같은 임의의 적절한 음향 액적 토출 시스템에 의해 수행될 수 있다.
도 29는 동적 결합 분석(DMA) 기술에 따라 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제1 예시적인 프로세스(2900)를 나타내며, 이에 의해 톤 버스트 전력은 적어도 일부 구현예에 따라 점진적으로 증가된다. 먼저, 미지의 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조가 음향 토출 장치에 삽입될 수 있다(단계 2902). 톤 버스트 전력은 증분되고(2904), 그 다음 저장조 내의 유체에 인가된다(2906). 적어도 하나 및 종종 많은 에코 신호가 각각의 톤 버스트 전력에서 수집되고 분석된다(2908). 이들 프로세스는 가능한 최대 전력에 도달할 때까지 루프에서 반복된다(2910). 최대 전력에 도달하는 경우에, 시스템은 각 톤 버스트 설정(예, 톤 버스트 패턴 및 각 톤 버스트 길이, 톤 버스트 진폭, 톤 버스트 주파수 및 주파수 패턴 등)에 대한 에코 신호의 신호 특징부를 추출한다(2912). 최적의 신호 시그니처는 사전 학스뵌 인공 지능 또는 머신 러닝 모델을 사용하여 선택된다(2914). 이 모델은, 수집된 에코 신호에 기초하여 추출된 신호 특징부를, 알려진 톤 버스트 전력 설정과 상관시킨다. 모델은, 시간에 따라 변하는 에코 또는 광 신호의 추세를 찾는다. 신호 특징부는 연속적인 시간 지연에 걸쳐 증가하거나 감소하거나 일정하게 유지될 수 있다. 적어도 하나의 에코 신호가 모델을 훈련하기 위해 필요하다. 그 다음, 시스템은 전술한 방법에 따라 광 신호 시그니처를 선택한(단계 2916) 다음에, 후속 액적을 토출하기 위한 신호 특징부 및 신호 시그니처를 선택할 수 있다.
도 30은 또한 DMA에 따라 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 배출하기 위한 제2 예시적인 프로세스(3000)를 나타내며, 이에 의해 톤 버스트 전력은 점진적으로 증가된다. 전술한 바와 같이, 미지의 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조가 음향 토출 장치에 삽입될 수 있다(3002). 톤 버스트 전력은 증분되고(3004), 그 다음 저장조 내의 유체에 인가된다(3006). 양호한 신호가 수신되는 단계를 결정하기(3010) 위해 연속적인 전력 단계에서 에코 신호가 수집되고 분석되며(3008), 신호 품질은, 예를 들어 충분한 전력, 리턴 신호의 명료성, 또는 다른 파라미터와 같은 하나 이상의 신호 파라미터에 기초한다. 이러한 비교는 신호 품질의 특징을 사전 정의된 임계값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 양호한 에코 신호가 수신되면, 시스템은 전술한 바와 같이 신호 특징부를 추출한(3012) 다음, 목표/용매 농도를 처리하기 위한 모델에 신호 특징부를 공급할 수 있다(3014). 모델은, 얻어진 신호 특징부에 기초하여 목표/용매 농도가 낮은지 또는 높은지 여부의 결정을 출력한다(3016). 저농도의 경우, 시스템은, 용액에 대한 최적의 신호 시그니처를 선택하는 것을 처리하고(3024), 그 다음 후속 액적을 토출하기 위한 신호 특징부 및 시그니처를 선택할 수 있고(3022), 전술한 바와 같다. 고농도의 경우, 시스템은, 최적의 세그먼트 길이(즉, 톤 버스트 패턴을 위한 톤 버스트 길이)를 찾고(3018), 그 다음 신호 특징부를 선택하고 후속적인 액적 토출을 위해 시그니처를 조절하기 전에 톤 버스트 속성을 조절하는(3020) 추가 개입 단계를 취할 수 있다.
도 31은, 동적 분리 분석(DBA)에 따른 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제3 예시적인 프로세스(3100)를 나타낸다. 전술한 바와 같이, 미지의 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조가 음향 토출 장치에 삽입될 수 있다(3102). ADE 시스템에 의해 톤 버스트가 유체 내로 방출되고(3104), 이는 에코를 청취하고(3106) 주파수 필터가 에코 신호에 적용되어(3108) 액적이 분리되었는지 여부를 검출한다(3110). 청취는 각 톤 버스트 반복 사이에 적어도 한 번 이상 그리고 종종 여러 번 발생한다. 액적이 분리되지 않은 경우에, 시스템은 토출 전력을 증가시키고(3112) 조절된 토출 전력에서 다른 톤 버스트를 방출함으로써 공정을 반복한다. 실패하거나 성공적인 액적 분리는, 톤 버스트의 각 변조 사이에서 광학적으로 관찰될 수 있다. 액적 분리가 검출되었을 경우에, 시스템은 마지막 성공한 액적 토출 전력에 기초하여 후속 액적에 대한 토출 파라미터를 설정하고(3114) 원하는 파라미터를 "잠금"할 수 있다.
도 32는, 또한 DBA에 따라 비-뉴턴 유체의 액적 토출 파라미터를 설정하고 액적을 토출하기 위한 제4 예시적인 프로세스(3200)를 나타낸다. 전술한 바와 같이, 미지의 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조가 음향 토출 장치에 삽입될 수 있다(3202). ADE 시스템에 의해 톤 버스트가 유체 내로 방출되고(3204), 이는 에코를 청취하고(3206) 주파수 필터가 에코 신호에 적용되어(3208) 액적이 분리되었는지 여부를 검출한다(3210). 청취는 각 톤 버스트 반복 사이에 적어도 한 번 이상 그리고 종종 여러 번 발생한다. 액적이 분리되지 않은 경우에, 시스템은, 예를 들어 톤 버스트 세그먼트 길이 중 하나 이상을 변경하여 톤 버스트를 조절하고(3212), 변조된 톤 버스트를 사용하여 또 다른 톤 버스트를 방출함으로써 프로세스를 반복한다. 실패하거나 성공적인 액적 분리는, 톤 버스트의 각 변조 사이에서 광학적으로 관찰될 수 있다. 액적 분리가 검출되었을 경우에, 시스템은 마지막 성공한 액적 토출 톤 버스트 특징에 기초하여 후속 액적에 대한 토출 파라미터를 설정하고(3214) 원하는 파라미터를 "잠금"할 수 있다.
프로세스(2900, 3000, 3100, 3200) 중 어느 하나 또는 전부는 서로 함께 사용되거나 위에서 상세히 전술된 기술 중 어느 하나와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 최적화된 액적 토출 특징(예, 톤 버스트 세그먼트 길이, 톤 버스트 토출 전력)을 결정하고 저장하기 위해 DMA 및 DBA 기술 모두를 사용할 수 있거나, 이들 기술의 임의의 적절한 조합을 반복적으로 사용하여 액적 토출 파라미터를 추가로 최적화할 수 있다.
본원에 설명된 시스템 및 방법의 구현예는 또한, 머신 러닝 알고리즘(MLA)을 이용하여 비-뉴턴 유체에 대한 음향 액적 토출(ADE)을 가능하게 하는 정확한 동적 유체 파라미터 정보 콘텐츠를 분류하고, 특징화하고, 이에 따라 결정하는 데 사용될 수 있다. 이는, 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 방식(예컨대, 온전한 천연 게놈 DNA 또는 용액 중의 점탄성 중합체)으로 ADE를 사용하여 비-뉴턴 유체의 샘플을 전사할 수 있고, 다양한 샘플 입력에 대해 qPCR, 형광 기반 평가, 또는 NGS와 같은 표준 실험실 기술을 사용하여 정량화할 수 있다. 전술한 동적 결합 분석(DMA)은, 음향 액적 토출(ADE) 기술을 사용하여 비-뉴턴 유체(예컨대, 온전한 천연 게놈 DNA 또는 용액 중의 점탄성 중합체)의 샘플 농도, 단편 크기 및 제조를 특징화하고 분류시킬 수 있다. 또한, 전술한 동적 분리 분석(DBA)은 ADE 기술을 이용하여 비-뉴턴 유체(예컨대, 온전한 천연 게놈 DNA(gDNA) 또는 용액 중의 점탄성 중합체)의 액적 분리를 위한, 전력, 진폭, 주파수 또는 톤 버스트의 다른 속성의 양을 특징화시킬 수 있다. 추가적인 방법은 qPCR, 형광, NGS 및 기타 게놈 응용과 같은 하위 응용에 ADE를 사용하는 비-뉴턴 유체에 대한 동적 부피 분석(DVA)을 사용하여 액적 부피를 재현 가능하고, 정확하고, 정밀하게 예측시킬 수 있다.
전술한 세 가지 분석 모드(DMA, DBA, DVA) 각각은, 학습 데이터 세트에 기초한 머신 러닝과 함께 다수의 음향 반사를 사용하여, 1) 비-뉴턴 유체의 음향 액적 토출 이전 및 2) 비-뉴턴 유체의 음향 액적 토출 이후의 유체 파라미터 정보를 얻는다.
비-뉴턴 유체의 부류(점탄성 특성을 나타냄)의 경우에, 임피던스 기반 시그니처(및 관련 전력 임계값)의 사용은 음향 액적 토출에 대한 성공적인 특징화 또는 분류를 가능하게 하지 않는다. 샘플 농도, 단편 크기 또는 제조 방법과 같이 잘 이해되는 파라미터의 경우에도, 임피던스 변화는 검출하기에 너무 광범위하다. 뉴턴 완충액에 용질(예, gDNA)을 첨가하면, 유체의 임피던스를 상당히 변화시키지 않으며, 따라서 시그니처 판독에 유의한 영향을 미치지 않으나, 이러한 첨가는 ADE를 가능하게 하기 위해 상당히 상이한 전력 및 교번적 톤 버스트 파라미터를 필요로 하는 비-뉴턴 유체 거동이라는 점탄성 현상을 생성한다.
비-뉴턴 특성은, 유체 표면을 섭동시키기 위해 하나 이상의 서브 토출 에너지 버스트를 사용하고 생성된 마운드로부터 반사된 하나 이상의 음향 신호를 수집하여, 평가될 수 있다. 예를 들어, 동적 결합 분석(DMA)은, 음향 액적 토출(ADE) 기술을 사용하여 비-뉴턴 유체(예컨대, 온전한 천연 게놈 DNA 또는 용액 중의 점탄성 중합체)의 샘플 농도, 단편 크기 및 제조를 특징화하고 분류시킬 수 있다.
다양한 구현예에 따라, 톤 버스트에 의해 섭동된 후에 유체 표면으로부터의 음향 반사를 분석하고 ADE 이벤트를 성공 또는 실패로 분류하는 이진 체계를 사용하는, 모델이 생성될 수 있다. 결과는 성공적인 액적 분리 이벤트가 발생할 때까지 톤 버스트를 반복적으로 조절하는 것으로 해석될 수 있다. 이러한 방법론을 동적 분리 분석(DBA)이라고 하는데, 이는 용기, 웰 플레이트 또는 저장소 내의 비-뉴턴 유체를 조사할 경우에 비-확실한 신호 처리 알고리즘이 널(null) 공간 분석에 비해 바람직하기 때문에, MIP(Mound Image Print) 기반 결과와 상이하다. 중요하게는, MIP 결과는 성공적인 액적 분리 이벤트 --정확하게 결정된 DBA 결과보다 전력이 6-11 dB 더 낮은 경우를 예측한다.
성공적인 ADE 이벤트에 기인하는 액적 부피를 분석하는 대안적인 모델이 생성될 수 있다. 모델은, 액적 토출 이벤트 이전, 도중 및 이후에 유체 표면으로부터의 음향 반사에 대해 학습되고 이를 처리한다. 이러한 동적 부피 분석(DVA)은, 임의의 톤 버스트를 사용하여 생성된 비-뉴턴 유체의 임의의 액적(예, 상이한 농도를 갖는 DNA, 단편 크기 및 제조)에 대한 정확한 액적 부피 예측을 실현한다.
인간 게놈 DNA(gDNA) 샘플은 비-뉴턴 유체에 대한 대리물로서 사용된다. gDNA 샘플은 농도, 단편 크기뿐만 아니라 제조에서 다양할 수 있으며, 이들 인자는 파라미터화하기 어렵다. 이와 같이, 머신 러닝 알고리즘(MLA)과 통합된 학습 세트는 매우 재현 가능하고, 매우 정확하고, 매우 정밀한 ADE를 가능하게 하도록 이용될 수 있다.
도 33 내지 도 35는, 비-뉴턴 유체를 특징화하고, 음향 액적 토출에 적합한 톤 버스트 파라미터를 결정하고, 비-뉴턴 유체의 배출된 액적에 대한 액적 부피를 특징화하기 위한 데이터 수집 및 처리를 위한 예시적인 프로세스를 나타낸다. 공정(3300, 3400, 및 3500), 및 본원에 설명된 임의의 다른 공정은 본원에 설명된 바와 같은 임의의 적절한 음향 액적 토출 시스템에 의해 수행될 수 있다.
동적 결합 분석
도 33은, 비-뉴턴 유체를 특성화하고 유체의 동일성을 고정하기 위해, 동적 결합 분석을 사용하기 위한 예시적인 프로세스(3300)를 나타낸다. 다양한 구현예에 따라, 알려지지 않은 특성을 갖는 유체가 유체 저장조에 함유된다(3302). 이 유체의 식별 또는 특성화는 동적 결합 분석(DMA)을 사용하여 수행된다. 먼저, 일련의 음향 신호가 생성되고 유체의 표면에 집중된다(3304). 이들 신호는 표면을 섭동하지만, 벌크로부터 유체의 임의의 액적이 분리되는 것을 방지하기에 충분히 낮게 유지된다. 각각의 섭동 후에, 일련의 조사 핑 또는 조사 톤 버스트가 방출되어 유체의 표면에 집중되고(3306), 그 후 최대 대기 시간에 도달할(3310) 때까지 유체 표면으로부터 음향 반사(또는 에코 신호)가 수집된다(3308). 이들 반사의 집합을 처리하여(3312) 유체의 비-뉴턴 거동을 결정한다.
다수의 미지의 유체의 분석은 상대적일 수 있고, 비-뉴턴 유체 파라미터의 정도의 순위인 결과를 제공한다. 이러한 질적 순위는 간단하며 신호 수집을 조사함으로써 달성된다. 그 다음, 알려진 농도, 단편 크기 및 제조 방법의 샘플을 사용하여, 학습되고 검증된 합성 신경망(CNN)을 사용하여 이들 유체의 정량적 분류가 다음에 달성된다(3314). 이는, 재현성, 정확성 및 정밀성으로 ADE를 수행하는 데 사용되는 유체 분류 모델을 생성하기 위해 일반 기술을 비분명한 분류에 적용하는 것이다. 데이터 세트는, 다양한 서브 토출 전력 수준에서 생성된 유체 마운드로부터 수집되는 반사 음향 신호로 구성된다. 반사 시간 도메인 신호의 수집은, 필터링되지 않은 상태로 사용되어 모델을 학습시킬 수 있다. 대안적으로, 반사의 수집은 모델을 학습하기 전에 패스트 푸리에 변환(FFT)을 사용하여 처리될 수 있다.
15개의 고유 샘플로부터의 FFT 신호에 기초하여 학습된 하나의 CNN 모델에 따라, 99%의 샘플을 정확하게 특성화하여, ADE에 의한 성공적인 gDNA 전사를 가능하게 하였다. 샘플은, gDNA 농도, 단편 크기 및 제조 방법의 조합에 기초하여 고유하다. 이들 고유한 특성은 아래 표 1에 요약되어 있다.
표 7: DMA, DBA 및 DVA 모델을 학습하고 검증하는 데 사용된 gDNA 샘플.
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동적 분리 분석 (DBA)
도 34는, 음향 액적 토출을 달성하고 톤 버스트 파라미터를 잠그기 위해, 즉 gDNA와 같으나 이에 제한되지 않는 비-뉴턴 유체에 대한 ADE의 정확한 에너지 수준을 선택하기 위해, 동적 분리 분석(DBA)을 사용하기 위한 예시적인 프로세스(3400)를 나타낸다. 다양한 구현예에 따라, 특성화된 비-뉴턴 유체가 유체 저장조에 함유된다(3402). 고 에너지 음향 신호 또는 톤 버스트는, 저장조 내에 함유된 유체에 집중되고 이를 겨냥한다(3404). 일련의 조사 톤 버스트가 저장조 내의 유체에 인가될 수 있고(3406), 그 후에 최대 대기 시간에 도달할(3410) 때까지 음향 반사 또는 에코 신호가 수집된다(3408). 토출 톤 버스트의 성공 또는 실패는, 예를 들어 액적의 통과를 위해 저장조 위의 영역을 스캐닝하는 것과 같은 광학 방법, 예를 들어 수집된 에코 신호의 분석에 기초한 음향 방법, 또는 다른 적절한 방법에 의해 확인될 수 있다(3410).
각 액적 토출 시도의 결과는 성공, 실패, 또는 일관되지 않음으로 분류될 수 있다. 유체 표면의 섭동 및 액적 파열 또는 분리가 없는 것은 실패한 시도로서 정의된다. 일관성이 없는 분류는, 간헐적으로 발생하거나, 매우 재현 가능하지 않거나, 매우 정확하지 않거나, 매우 정밀하지 않는 일관성이 없는 액적 부피를 생성하는 액적 분리 이벤트를 기술한다. 마지막으로, 성공적인 이벤트는, 매우 재현 가능하고, 매우 정확하며, 매우 정밀한 비-뉴턴 유체의 액적을 소스 저장조로부터 전사하는 액적 분리 이벤트로서 정의된다. 성공적인 ADE 이벤트가 발생할(3414) 때까지 톤 버스트 에너지의 반복 증가(3412) 및 DBA 분석을 수행할 수 있다. 그 시점에서, 파라미터(즉, 톤 버스트 패턴 및 에너지)는 후속 토출을 수행하기 위해 "잠금"될 수 있다(3416). 톤 버스트 이벤트 후의 음향 반사가 실패 이벤트로서 등록되는 경우에, 에너지 수준이 증가될 수 있고, 후속 음향 반사가 분석된다. 최적의 성능을 위해, 성공적인 이벤트가 "잠금"될 때까지 토출 에너지를 점진적으로 증가시킬 수 있다.
동적 부피 분석 (DVA)
도 35는, 음향 액적 토출에 의해 생성된 액적의 부피를 특성화하고 액적 부피를 고정하기 위해 동적 부피 분석을 사용하기 위한 예시적인 프로세스를 나타낸다. 다양한 구현예에 따라, 비-뉴턴 유체가 유체 저장조에 함유된다(3502). 음향 액적 토출은, 저장조 내의 유체 표면에서 집속된 음향 톤 버스트를 겨냥함으로써 트리거된다(3504). 동적 유체 표면은, 최대 대기 시간에 도달할 때까지(3510) 일련의 조사 핑을 사용하여(3506) 후속 조사된다. 그 다음, 음향 반사 또는 에코 신호를 분석하여 액적 부피를 예측하고(3512), 측정된 액적 부피 데이터와 비교하여 형성된 액적의 부피를 특성화할 수 있다(3512). 공정은, 모델의 파라미터를 변화시킴으로써 액적 부피)를 잠그기(3516) 위해 반복 수행될 수 있다.
액적 부피를 결정하는 한 가지 방법은, 각각의 음향 액적 토출에 대한 일련의 음향 반사를 획득하는 것이다. 미가공된 시간 도메인 신호는 Hilbert 변환을 통해 처리될 수 있고, 선택적인 추가 처리는 임계 그레이스케일 값 아래의 픽셀을 임계화하고 블랭킹함으로써 특징부 추출을 단순화하고 노이즈를 감쇠시킨다. 음향 반사 이미지로부터 추출될 수 있는 주요 특징부는, 예를 들어 (신호 진폭의 밀도 및 진폭으로부터 유도되는) 질량 중심, 각각의 필터링된 반사의 선단 에지, 및 피크 특징부를 포함한다. 이들 추출 특징부는 액적을 생성하는 데 사용되는 톤 버스트의 속성과 결합되고, 액적 부피를 예측하기 위해 모델을 학습하는 데 총 특징부 세트가 사용된다. 신경망 모델을 학습하고 검증하는 것은, 도 9에 나타낸 바와 같이 높은 정확성, 높은 정밀도 및 높은 재현성을 갖는 액적 부피의 특성화를 초래한다. 각각의 포인트는 그의 특징적인 DVA 신호 특징부와 연관되어 알려지거나 예상되는 액적 부피를 갖는다.
샘플 무결성 및 비-편향된 전사를 평가하기 위한 게놈 확인
gDNA의 ADE에 대한 비-DMA 교정 및 DMA를 사용하는 대조군 실험을 gDNA 전사를 정량적으로 평가하기 위해, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 사용해 하우스 키핑 유전자 베타 액틴(~액틴)의 발현을 확인하고 검출하였다. ~-액틴 정방향 프라이머를 사용하여 qPCR 평가를 수행하였다: AGC CAT GT A CGT TGC TAT CC; ~-액틴 역방향 프라이머: CGT AGC ACA GCT TCT CCT TAA T, (IDT). 모든 프라이머는 1 μM의 최종 농도였다. qPCR 반응 평가는 PowerUpTM SYBR® Master Mix 및 THERMOFISHER 384-Well Clear Optical Plate를 사용하는 THERMOFISHER QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템에서 수행하였다.
qPCR 프로그램을 다음과 같이 사용하였다: 단계 1, 50°C에서 2분; 95°C에서 2분; 단계 2, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 획득(40 사이클); 단계 3, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분 및 95°C에서 15초. 인간 천연 gDNA를 BIOLINE (45 Kb), NOVAGEN (68 Kb), 및 PROMEGA (55 Kb)로부터 수득하였다. 각각의 벤더는 상이한 제조 방법을 나타내며, 모든 샘플은 트리스-EDTA(TE) 완충액 pH 8.0에서 최종 원하는 농도로 수용되거나 희석된 것으로 사용되었다. 1, 2, 4, 8, 16 및 32 액적의 gDNA 용액을 음향적으로 전사함으로써 6-포인트 2-폴드 표준 곡선을 생성하였다. gDNA의 각 농도에 대해, 여덟 개(n=8)의 기술적 복제를 수행하였다.
비교를 위해, 비-DMA 교정을 사용하여 gDNA 용액의 전사를 위한 qPCR 결과의 대조군 세트를 수득하였다. 비-DMA 교정을 위한 CV는 높은 분산을 나타냈고, 많은 포인트가 5% CV를 초과하였다. 또한, 150 ng/μL 및 200 ng/μL에서의 BIOLINE, NOVAGEN 80 및 105 ng/μL, 및 PROMEGA 100, 150 및 200 ng/μL의 경우, R^2 값은 <0.51이다. 이는 재현 가능하지 않고, 정확하지 않으며, 정밀하지 않다. 또한, 비-DMA 교정은 다수의 전사 실패를 초래하거나 표적 웰에서 증폭을 초래하지 않았다.
대조적으로, DMA 교정을 사용하여 수득된 전사는 gDNA 용액을 견고하고 재현 가능하게 전사하였다. 각각의 제조 방법에 대해, CV는 일반적으로 <4%이고, R^2 값은 BIOLINE 및 NOVAGEN에 대해 >0.9이다. PROMEGA 100, 150 및 200 ng/μL의 경우, R^2 값은 비-DMA 교정을 사용한 <0.51과 비교하면 >0.8로 훨씬 더 높다.
형광 및 qPCR 평가를 사용하여 DV A에 대한 부피 검증
DVA 모델은 또한, 부피 정확도 및 정밀도 확인을 위한 형광 기반 평가를 사용하여 수집된 액적 부피 데이터를 사용하여 학습되었다. 다양한 농도의 gDNA를 갖는 용액을 0.0375 mM 플루오레세인 나트륨으로 제조하였다. 용액을 비-뉴턴 ADE를 사용하여 평가 플레이트로 옮겼다. 평가 플레이트(1536 LDV, LABCYTE)를, ??칭 용액으로서 10 mM NaOH의 용액으로 사전 충진하였다. 0.0375 mM 용액의 벌크 희석액을 사용하고 5 μL를 평가 플레이트에 피펫팅하여 6-포인트 2-폴드 표준 곡선을 만들었다. 이들 플레이트를 원심분리하였다(3,000 rpm, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 형광 판독기(BMG PHERASTAR) 상에서 판독함).
DVA에 의해 예측된 액적 부피와 형광 기반 평가를 사용하여 측정된 값 사이의 상관 관계를 생성하였다. 완벽한 상관관계는 R^2 =1.0이다. 이들 경우에, 다양한 톤 버스트 주파수를 사용하여, 회귀 기울기는 0.98을 초과하는 R^2 값과 높은 상관 관계를 나타냈다. 또한, R^2 값이 0.95를 초과하는 qPCR 평가를 사용하여 DVA 성능을 성공적으로 검증하였다.
상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 미처리되고, 조각화되지 않은, 온전한 천연 gDNA를 사용하고 NGS에 대한 머신 러닝 알고리즘으로 비-뉴턴 교정을 사용하여, 실험 데이터를 획득하였다. 전술한 음향 파라미터를 사용하여 gDNA 전사를 정량적으로 평가하기 위해, 차세대 라이브러리 제조(NGP) 및 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여, 우선적인 전사(예, 크기 또는 단일 대 이중 가닥 DNA)이 없거나 샘플 무결성을 유지하는 DNA 서열에 손상(예, 의도치 않은 gDNA 전단)이 발생하지 않았음을 확인하였다.
NEXTERATM DNA Flex Kit (Illumina)를 NGP에 사용하였고, NGS는 MiSeq Instrument (Illumina)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은, Illumina의 BaseSpace FastQC 및 BW A 얼라이너 시퀀싱 도구를 사용하여 수행하였다. BIOLINE 및 MILLIPORE SIGMA(구 NOVAGEN)로부터 상업적으로 수득한 고 농도(> l00 ng/μL), 대형 단편(> 20 Kb) gDNA를 라이브러리 제조용 384-destination qPCR 플레이트 안으로 음향적으로 또는 피펫 전사되었다(대조군). 총 140 ng의 각 gDNA 샘플을 세 번 반복 복제로 전사했다. 모든 라이브러리 제조 프로토콜은 3-폴드로 소형화되어 384 웰 플레이트에 음향 전사 가능하게 하였으며, 태그 부착, 태그 부착후 클린업 및 증폭과 같은 모든 공정이 종착지 PCR 기기로서 사용되도록 조정된 THERMOFISHER QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System 상에서 수행되었다. gDNA 샘플 정보는 아래 표 8에 나타나 있다.
표 8: NEXTERA DNA Flex 라이브러리 제조에 사용된 gDNA 샘플
Figure pct00011
라이브러리를 MI SEQ® Reagent Kit v3 (150 사이클) 상에서 시퀀싱하였다. 각각의 뉴클레오티드에 대한 실행 전체에 걸쳐 심지어 세기가 검출되었고, 이는 모든 4개의 염기의 검출이 균일함을 나타낸다. 또한, QScore 히트 맵을 얻었고, 이는 91.5%를 초과하는 염기 검출 정확도를 나타내며, 부정확한 염기 검출 확률은 1,000분의 1이었다. 음향 전사 및 피펫 전사에 대한 염기 당 서열 데이터 품질은 일치하고 고품질이었으며, 이는 음향 전사 및 피펫 전사에 대한 염기 당 서열 콘텐츠가 서열 실행의 네 개의 상이한 염기 사이에 차이가 없음을 나타낸다.
아래 표 9A 내지 표 9D는 다수의 기술적 복제에 걸친 두 gDNA 샘플에 대한 시퀀싱 파라미터를 보여준다. 적절하게 페어링된 판독값은 모든 샘플에 대해 >98%이며, 리드의 짝 모두가 적절한 배향이고 게놈과 정렬된 특정 삽입 크기를 갖는다는 것을 나타낸다. 모든 샘플에 대해, 삽입 서열의 >99%가 기준 게놈과 정렬되고, 이는 음향적으로 전사되거나 피펫 전사로부터 생성된 라이브러리가 견줄만 하고 편향 ADE가 일어나지 않거나 gDNA에 대한 손상이 발생하지 않음을 나타낸다.
표 9A: 음향 및 피펫 gDNA 전사의 비교용 시퀀스 파라미터
Figure pct00012
표 9B: 음향 및 피펫 gDNA 전사의 비교용 시퀀스 파라미터
Figure pct00013
표 9C: 음향 및 피펫 gDNA 전사의 비교용 시퀀스 파라미터
Figure pct00014
표 9D: 음향 및 피펫 gDNA 전사의 비교용 시퀀스 파라미터
Figure pct00015
전술한 다양한 연산 방법은, 하드웨어, 소프트웨어, 및/또는 펌웨어를 갖는 컴퓨터 또는 다른 프로세서와 함께 또는 이를 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 방법 단계는 모듈에 의해 수행될 수 있고, 모듈은, 본원에서 설명하는 방법 단계를 수행하도록 배열된 매우 다양한 디지털 및/또는 아날로그 데이터 처리 하드웨어 및/또는 소프트웨어 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 모듈은 이들 단계 중 하나 이상을 수행하도록 조정된 데이터 처리 하드웨어를 선택적으로 포함하고 이와 연관된 적절한 기계 프로그래밍 코드로 수행하고, 두 개 이상의 단계(또는 두 개 이상의 단계 중 일부)에 대한 모듈은 단일 프로세서 보드에 통합되거나, 매우 다양한 통합 및/또는 분산된 처리 아키텍처 중 임의의 곳에서 상이한 프로세서 보드로 분리된다. 이들 방법 및 시스템은 유형의 매체를 자주 사용하며, 이는 종종 전술한 방법 단계를 수행하기 위한 명령어를 갖는 기계 판독 가능 코드를 구체화한다. 유형의 적절한 매체는 메모리(휘발성 메모리 및/또는 비휘발성 메모리 포함), 저장 매체(플로피 디스크, 하드 디스크, 테이프 등의 자기 기록; CD, CD-R/W, CD-ROM, DVD 등과 같은 광 메모리; 또는 임의의 다른 디지털 또는 아날로그 저장 매체) 등을 포함할 수 있다.
본원에 나타낸 구체적인 내용은 예시로서 그리고 본 개시의 바람직한 구현예에 대한 예시적인 설명의 목적으로만 사용되고, 본 발명의 다양한 구현예의 원리 및 개념적 양태의 가장 유용하고 쉽게 이해되는 설명으로 여겨지는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적 상세를 나타내려는 시도는 이루어지지 않고, 도면 및/또는 실시예와 함께 취해진 설명은 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실시해서 구현될 수 있는지 당업자에게 명백히 나타낸다.
다음의 실시예에서 명확하고 분명하게 변형되지 않는다면, 또는 의미의 적용이 임의의 구성을 의미 없이 또는 본질적으로 의미 없이 하는 경우에, 다음의 정의와 설명은 장래 구성 일체를 조절하기 위한 것으로 의미가 부여되고 그렇게 의도된다. 용어의 구성이 의미가 없거나 본질적으로 의미가 없는 경우, 그 정의를 Webster's Dictionary, 3rd Edition 또는 당업자에게 공지된 사전, 예컨대 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)로부터 취해야 한다.
문맥이 명백히 달리 요구하지 않는 한, 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 '포함하다', '포함하는' 등은, 배타적이거나 완전한 의미와 반대인, 포괄적인 의미로 해석되어야 한다; 즉 "포함하나 이에 제한되지 않는" 이라는 의미이다. 단수 또는 복수를 사용하는 단어는 각각 복수와 단수를 포함한다. 또한, 본 출원에서 사용되는 경우, 단어 "본원", "상기", "이하" 및 이와 유사한 단어는, 본 출원을 전체로서 지칭하고 본 출원의 임의 특정 부분을 지칭하는 것은 아니다.
본 개시의 구현예의 설명을 완전하게 하거나 개시된 정확한 형태로 본 개시를 제한하고자 의도되지 않는다. 본 개시의 특정 구현예 및 이에 대한 실시예는 예시적인 목적을 위해 본원에 설명되나, 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 개시의 범주 내에서 동등한 변형예가 다양하게 가능하다.
특허 파일(특허, 특허 출원, 및 특허 공개를 포함함), 과학 저널, 책, 논문, 기술 참조 문헌, 그리고 본 출원에서 논의된 기타 간행물 및 자료를 포함한 모든 참조 문헌은, 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 개시의 양태는, 필요한 경우 상기 참조 문헌 및 출원의 시스템, 기능 및 개념을 채용하여 본 개시의 또 다른 추가 구현예를 제공하도록 변형될 수 있다. 이들 및 다른 변화는 상세한 설명을 고려하여 본 개시에 적용될 수 있다.
전술한 구현예의 특정 요소는 다른 구현예에서의 요소를 조합하거나 대체할 수 있다. 또한, 본 개시의 특정 구현예와 관련된 장점은 이들 구현예의 맥락에서 설명되었지만, 다른 구현예도 이러한 장점을 나타낼 수 있고, 모든 구현예가 본 개시의 범주 내에 속하는 이러한 장점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
상기 내용은 본 발명의 예시적인 구현예에 대해 전체적으로 완전한 개시를 제공하지만, 다양한 변형물, 대안적인 구성물 및 균등물을 원하는 대로 사용할 수 있다. 결과적으로, 구현예가 일부 상세하게 설명되었지만, 예시로서 그리고 이해의 명확성을 위해, 당업자에게 다양한 변형, 변경 및 적응이 명백할 것이다. 따라서, 상기 설명 및 예시는 본 발명을 제한하는 것으로 유추되어서는 안되고, 이는 첨부된 청구범위에 의해 정의될 수 있다.
다른 변형예도 본 개시의 사상에 있다. 따라서, 개시된 기술은 다양한 변형 및 대안적인 구성을 수용하나, 이의 특정 예시 구현예가 도면에 나타나 있고 상세히 전술되었다. 그러나, 개시된 특정 형태(들)로 본 발명을 제한하려는 의도는 없고, 오히려 반대로 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이, 본 개시의 사상 및 범주 내에 속하는 모든 변형물, 대안적인 구성물 및 균등물을 포함하려는 의도가 있음을 이해해야 한다.
개시된 구현예를 설명하는 문맥에서(특히 다음 청구범위의 문맥에서), 용어 "일" 및 "하나" 및 "특정한 하나" 및 유사한 지시 대상을 사용하는 것은, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 모두를 포함하는 것으로 유추되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함한", 및 "함유하는"은, 달리 언급하지 않는 한, 개방 종결형 용어로서 유추되어야 한다(즉, "포함하나 이에 제한되지 않음"을 의미함). 용어 "연결된"은, 비록 무언가 개재되는 것이 있더라도, 부분적으로 또는 전체적으로 그 안에 포함되거나, 부착되거나, 함께 결합되는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 설명은, 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 참조하는 약칭 방법으로서 역할을 하도록 의도된 것뿐이며, 각각의 별도 값은 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 부정되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 그리고 모든 예시, 또는 예시적인 언어(예, "예컨대")의 사용은, 단지 본 개시의 구현예를 단지 더 잘 나타내기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 대한 제한을 주지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도, 임의의 청구되지 않은 요소를 본 개시의 실시에 필수적인 것으로서 나타내는 것으로 유추되어서 안된다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 문구 "X, Y 또는 Z 중 적어도 하나"와 같은 이접형 언어는, 항목, 용어 등이 X, Y, Z 중 하나 또는 이들의 임의의 조합(예, X, Y, 및/또는 Z)일 수 있는 것으로 일반적으로 사용되는 문맥에서 이해하도록 의도된다. 따라서, 이러한 이접형 언어는, 특정 구현예가 적어도 하나의 X, 적어도 하나의 Y, 적어도 하나의 Z가 각각 존재해야 함을 요구하는 것을 일반적으로 의미하고자 하는 것도 아니고 의미해서도 안된다.
본 개시의 바람직한 구현예가 본원에 설명되고, 본 개시를 수행하기 위해 발명자에게 알려진 최상의 모드를 포함한다. 이들 바람직한 구현예의 변형은, 전술한 설명을 읽을 시 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 기대하고 본 발명자는 본원에 특정적으로 설명된 것보다 달리 본 개시가 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 개시는, 적용 가능한 법에 따라, 본원에 첨부된 청구 범위에 인용된 주제의 모든 변형물 및 균등물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 달리 명확히 부정되지 않는 한, 이들의 모든 가능한 변형물에서 전술한 요소의 임의의 조합이 본 개시에 포함된다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함한 모든 참조 문헌은, 각각의 참조 문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참조 문헌으로 통합되는 것으로 표시되고 본원에 그 전체가 기재된 것처럼, 동일한 정도로 참조 포함된다.
이하에서, 본 발명의 이해를 용이하게 하도록 추가 실시예를 설명한다.
실시예 1. 음향 액적 토출기에 의해 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조로부터 액적을 토출하는 방법으로서, 상기 방법은,
제1 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 제1 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가하여, 상기 유체 표면으로부터 선단 로브와 필라멘트를 생성하되 상기 필라멘트를 상기 선단 로브 또는 상기 유체 표면으로부터 분리 없이 하는 단계; 및
제2 톤 버스트 세그먼트와 제3 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 제2 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 선단 로브에 인가하여, 상기 선단 로브를 상기 필라멘트로부터 분리하여 액적을 형성함으로써 상기 액적을 토출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예 2. 실시예 1에 있어서,
상기 제1 톤 버스트 세그먼트는, 상기 유체 표면으로부터 상기 선단 로브와 상기 필라멘트를 상승시키기에 충분한 진폭 및 지속 시간을 갖고,
상기 제2 패턴은, 상기 액적을 상기 필라멘트로부터 분리하도록 구성된 제2 톤 버스트 세그먼트와 제3 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 적어도 두 개의 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하는, 방법.
실시예 3. 실시예 2에 있어서, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 각각보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 세그먼트는 상기 제2 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
실시예 4. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 필라멘트는 유체의 적어도 하나의 비드를 포함하고, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 상기 유체의 적어도 하나의 비드가 하나 이상의 추가 액적으로 파열되는 것을 방지하는, 방법.
실시예 5. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 액적은 상기 유체 필라멘트 길이의 70% 미만, 30% 미만, 또는 10% 미만의 직경을 갖는, 방법.
실시예 6. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 액적은 상기 유체 필라멘트의 나머지의 총 부피의 80% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 액적 부피를 갖는, 방법.
실시예 7. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 진폭은 뉴턴 유체로부터 대안적인 액적을 토출하는 것과 연관된 대안적인 진폭을 초과하는, 방법.
실시예 8. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 톤 버스트의 진폭은 상기 제1 및 제2 또는 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 사이에서 변하는, 방법.
실시예 9. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서,
상기 집속 음향 에너지에 의해 상기 저장조로부터 생성된 상기 비-뉴턴 유체의 필라멘트는, 상기 비-뉴턴 유체의 0, 1, 2 또는 2개 초과의 비드를 함유하는 사슬을 포함하고,
상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 상기 사슬로부터 액적 분리를 유도하는, 방법.
실시예 10. 실시예 9에 있어서, 상기 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 5, 10 또는 10개 미만의 비드를 포함하는, 방법.
실시예 11. 실시예 9에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는 상기 필라멘트의 직경을 초과하는 두께를 상기 필라멘트 직경의 10%, 20%, 50%, 또는 50% 미만만큼 갖는, 방법.
실시예 12. 실시예 9에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는, 생성된 액적 직경의 50%, 75%, 또는 90% 이하의 두께를 갖는, 방법.
실시예 13. 실시예 9에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은, 위성 액적을 생성하지 않고서 액적 토출에 영향을 미치도록 구성되는, 방법.
실시예 14. 실시예 9에 있어서, 상기 사슬 상의 비드는, 액적 분리 이전 또는 이후에 서로 또는 상기 저장조 내의 유체와 합쳐지는, 방법.
실시예 15. 실시예 9에 있어서, 상기 액적 분리가 성공적인지 또는 실패인지 여부를 평가하기 위해 상기 필라멘트를 광학적으로 또는 전자적으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 16. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 저장조 내에 형성된 유체 마운드로부터의 광학 또는 전기 신호에 기초하여 액적 분리를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 17. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체는 유전 물질을 함유한 용액을 포함하는, 방법.
실시예 18. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서,
상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
상기 유체 표면으로부터 상승된 유체의 양으로 필라멘트의 형성을 검출하거나 상기 유체 표면으로부터 교정 액적의 토출을 검출하는 단계; 및
상기 필라멘트의 검출 또는 상기 교정 액적의 토출에 기초하여, 상기 집속 음향 에너지의 제1 패턴 및/또는 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 19. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 위성 액적을 생성하지 않고서 액적 토출에 영향을 미치도록 구성되는, 방법.
실시예 20. 실시예 1 내지 실시예 3 중 어느 한 예에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 위성 액적의 형성을 억제하도록 구성되는, 방법.
실시예 21. 저장조 내의 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하도록 구성된 액적 토출 시스템으로서,
음향 토출기(상기 음향 토출기는,
제1 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가하여, 상기 유체 표면으로부터 선단 로브와 필라멘트를 생성하되 상기 필라멘트를 상기 선단 로브 또는 상기 유체 표면으로부터 분리하지 않게 하고,
제2 패턴으로, 집속 음향 에너지를 선단 로브에 인가하여, 위성 액적을 토출하지 않고서 상기 필라멘트로부터 상기 선단 로브를 분리하여 상기 필라멘트가 상기 유체 표면 내로 후퇴하도록 구성됨); 및
실행 가능 명령어를 저장하는 프로세서 및 메모리 장치를 포함하며, 상기 프로세서에 의해 상기 실행 가능 명령어가 실행되는 경우에 상기 음향 토출기로 하여금 상기 제1 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가시키고, 상기 제2 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 상기 선단 로브에 인가시키는, 시스템.
실시예 22. 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하기 위한 톤 버스트 패턴의 파라미터를 설정하는 방법으로서,
상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
상기 일련의 교정 톤 버스트에 대응하는 일련의 에코 신호를 수집하는 단계; 및
상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 상기 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조로부터 액적을 토출하도록 구성된, 집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트 세그먼트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 포함하되, 상기 톤 버스트 패턴은 적어도,
제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
제3 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하며, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 세그먼트는 상기 제2 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
실시예 23. 실시예 22에 있어서,
상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 액적 토출에 대응하는 최소 톤 버스트 전력을 결정하는 단계; 및
상기 최소 톤 버스트 전력에 적어도 부분적으로 기초하여 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 24. 실시예 22에 있어서,
상기 톤 버스트 패턴에 따라 상기 저장조에 집속 음향 에너지를 인가함으로써, 상기 저장조로부터 액적을 토출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 25. 실시예 24에 있어서,
광학 센서를 통해 상기 액적의 토출을 감지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 26. 실시예 24 또는 실시예 25에 있어서,
액적 토출이 검출될 때까지 상기 하나 이상의 톤 버스트 세그먼트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 반복적으로 변경하는 단계; 및
상기 검출된 액적 토출에 대응하는 하나 이상의 값으로 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간을 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 27. 실시예 24 또는 실시예 25에 있어서,
알려진 특성을 갖는 복수의 비-뉴턴 유체 각각에 대응하는 복수의 반사 음향 신호를 포함한 비교 데이터 세트에 기초하여, 학습된 합성 신경망에 의해 상기 일련의 에코 신호를 처리함으로써, 상기 토출된 액적과 연관된 액적 부피를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 28. 실시예 27에 있어서,
상기 토출된 액적과 연관된 실제 액적 부피를 결정하는 단계;
상기 실제 액적 부피를 상기 예측 액적 부피와 비교하는 단계; 및
상기 비교에 기초하여 상기 합성 신경망을 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 29. 실시예 24 또는 실시예 25에 있어서,
상기 토출된 액적과 연관된 액적 부피를 결정하는 단계;
상기 액적 부피를 예측 액적 부피와 비교하는 단계; 및
상기 비교에 기초하여 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간을 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 30. 실시예 22 내지 실시예 25 중 어느 한 예에 있어서,
상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 상기 비-뉴턴 유체의 특성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 31. 실시예 22 내지 실시예 25 중 어느 한 예에 있어서,
상기 일련의 에코 신호를, 비-뉴턴 유체의 알려진 집합과 상관 관계가 있고 사전에 수신된 에코의 집합을 포함하는 저장 에코 데이터와 비교하는 단계; 및
상기 비교에 적어도 부분적으로 기초하여 상기 전력, 파장 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 32. 실시예 22 내지 실시예 25 중 어느 한 예에 있어서,
알려진 특성을 갖는 복수의 비-뉴턴 유체 각각에 대응하는 복수의 반사 음향 신호를 포함한 비교 데이터 세트에 기초하여, 학습된 합성 신경망에 의해 상기 하나 이상의 에코를 처리함으로써, 상기 비-뉴턴 유체의 특성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 33. 유체 저장조로부터 비-뉴턴 유체를 함유한 액적을 토출하는 방법으로서, 상기 방법은,
비-뉴턴 유체를 함유한 유체 저장조에 집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴을 인가하는 단계를 포함하며, 상기 유체 저장조로 상기 톤 버스트 패턴을 인가하면 상기 유체 저장조로부터 상기 비-뉴턴 유체의 액적을 토출시키되, 상기 톤 버스트 패턴은,
제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
상기 제1 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
상기 제2 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제3 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하는, 방법.
실시예 34. 실시예 33에 있어서, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 세그먼트는 상기 제2 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
실시예 35. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서,
상기 제1 별개 톤 버스트에 의해 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면으로부터 선단 로브 및 필라멘트를 상승시키는 단계; 및
상기 제2 및 제3 별개 톤 버스트에 의해 상기 필라멘트로부터 상기 선단 로브를 분리함으로써 액적 토출에 영향을 미치는 단계를 포함하는, 방법.
실시예 36. 실시예 35에 있어서, 상기 필라멘트는 유체의 적어도 하나의 비드를 포함하고, 상기 톤 버스트 패턴은 상기 유체의 적어도 하나의 비드가 하나 이상의 추가 액적으로 파열되는 것을 방지하는, 방법.
실시예 37. 실시예 35에 있어서,
상기 집속 음향 에너지에 의해 상기 저장조로부터 생성된 상기 비-뉴턴 유체의 필라멘트는, 상기 비-뉴턴 유체의 적어도 하나의 비드를 함유한 사슬을 포함하는, 방법.
실시예 38. 실시예 37에 있어서, 상기 톤 버스트 패턴은 상기 사슬로부터 액적 분리를 유도하는, 방법.
실시예 39. 실시예 37에 있어서, 상기 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 1, 2 또는 2개 초과의 비드를 포함하는, 방법.
실시예 40. 실시예 37에 있어서, 상기 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 5, 10 또는 10개 초과의 비드를 포함하는, 방법.
실시예 41. 실시예 37에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는 상기 필라멘트의 직경을 초과하는 두께를 상기 필라멘트 직경의 10%, 20%, 50%, 또는 50% 미만만큼 갖는, 방법.
실시예 42. 실시예 37에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는, 생성된 액적 직경의 50%, 75%, 또는 90% 이하의 두께를 갖는, 방법.
실시예 43. 실시예 37에 있어서, 상기 사슬 상의 비드는, 액적 분리 이전 또는 이후에 서로 또는 상기 저장조 내의 유체와 합쳐지는, 방법.
실시예 44. 실시예 37에 있어서, 상기 토출된 액적의 액적 부피는, 액적 토출 동안에 상기 필라멘트의 나머지 부피의 80% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만인, 방법.
실시예 45. 실시예 37에 있어서, 상기 액적의 토출은, 상기 필라멘트가 적어도 5개의 액적 직경, 10개의 액적 직경, 20개의 액적 직경, 50개의 액적 직경, 또는 100개의 액적 직경의 길이를 갖는 경우에 발생하는, 방법.
실시예 46. 실시예 37에 있어서, 상기 액적 분리가 성공적인지 또는 실패인지 여부를 평가하기 위해 상기 필라멘트를 광학적으로 또는 전자적으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 47. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 액적은 상기 유체 필라멘트 길이의 70% 미만, 30% 미만, 또는 10% 미만의 직경을 갖는, 방법.
실시예 48. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 액적은 상기 유체 필라멘트의 나머지의 총 부피의 50% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 액적 부피를 갖는, 방법.
실시예 49. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 톤 버스트의 진폭은 뉴턴 유체로부터 대안적인 액적을 토출하는 것과 연관된 대안적인 진폭을 초과하는, 방법.
실시예 50. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 톤 버스트의 진폭은 상기 제1 및 제2 또는 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 사이에서 변하는, 방법.
실시예 51. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 저장조 내에 형성된 유체 마운드로부터의 광학 또는 전기 신호에 기초하여 액적 분리를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 52. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체는 유전 물질을 함유한 용액을 포함하는, 방법.
실시예 53. 실시예 33 또는 실시예 34에 있어서,
상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
상기 유체 표면으로부터 상승된 상기 유체의 양으로 필라멘트의 형성을 검출하는 단계; 및
상기 필라멘트의 검출에 기초하여 상기 톤 버스트 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트 세그먼트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예 54. 저장조 내의 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하도록 구성된 액적 토출 시스템으로서,
집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴을 상기 저장조에 인가하여, 상기 집속 음향 에너지가 상기 저장조로부터 상기 비-뉴턴 유체의 액적을 토출하도록 구성되는 음향 토출기; 및
실행 가능 명령어를 저장하는 프로세서 및 메모리 장치를 포함하며, 상기 프로세서에 의해 상기 명령어가 실행되는 경우에 상기 음향 토출기로 하여금 다음 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 인가시키고, 상기 패턴은,
제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
상기 제1 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
상기 제2 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제3 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하는, 방법.

Claims (48)

  1. 음향 액적 토출기에 의해 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조로부터 액적을 토출하는 방법으로서, 상기 방법은,
    제1 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 제1 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가하여, 상기 유체 표면으로부터 선단 로브와 필라멘트를 생성하되 상기 필라멘트를 상기 선단 로브 또는 상기 유체 표면으로부터 분리 없이 하는 단계; 및
    제2 톤 버스트 세그먼트와 제3 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 제2 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 선단 로브에 인가하여, 상기 선단 로브를 상기 필라멘트로부터 분리하여 액적을 형성함으로써 상기 액적을 토출하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 톤 버스트 세그먼트는, 상기 유체 표면으로부터 상기 선단 로브와 상기 필라멘트를 상승시키기에 충분한 진폭 및 지속 시간을 갖고,
    상기 제2 패턴은, 상기 액적을 상기 필라멘트로부터 분리하도록 구성된 제2 톤 버스트 세그먼트와 제3 톤 버스트 세그먼트를 포함하는 적어도 두 개의 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 각각보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 톤 버스트 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필라멘트는 유체의 적어도 하나의 비드를 포함하고, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 상기 유체의 적어도 하나의 비드가 하나 이상의 추가 액적으로 파열되는 것을 방지하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적은 상기 필라멘트 길이의 70% 미만, 30% 미만, 또는 10% 미만의 직경을 갖거나, 상기 액적은 상기 필라멘트의 나머지 총 부피의 80% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 액적 부피를 갖는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 위성 액적을 생성하지 않고서 액적 토출에 영향을 미치도록 구성되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 진폭은 뉴턴 유체로부터 대안적인 액적을 토출하는 것과 연관된 대안적인 진폭을 초과하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집속 음향 에너지의 진폭은 상기 제1 및 제2 또는 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 사이에서 변하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집속 음향 에너지에 의해 상기 저장조로부터 생성된 상기 비-뉴턴 유체의 필라멘트는, 상기 비-뉴턴 유체의 0, 1, 2 또는 2개 초과의 비드를 함유하는 사슬을 포함하고,
    상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴은 상기 사슬로부터 액적 분리를 유도하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 사슬 상의 비드는, 액적 분리 이전 또는 이후에 서로 또는 상기 저장조 내의 비-뉴턴 유체와 합쳐지는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 액적 분리가 성공적인지 또는 실패인지 여부를 평가하기 위해 상기 필라멘트를 광학적으로 또는 전자적으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저장조 내에 형성된 유체 마운드로부터의 광학 또는 전기 신호에 기초하여 액적 분리를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체는 유전 물질을 함유한 용액을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
    상기 유체 표면으로부터 상승된 유체의 양으로 필라멘트의 형성을 검출하거나 상기 유체 표면으로부터 교정 액적의 토출을 검출하는 단계; 및
    상기 필라멘트의 검출 또는 상기 교정 액적의 토출에 기초하여, 상기 집속 음향 에너지의 제1 패턴 및/또는 상기 집속 음향 에너지의 제2 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 저장조 내의 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하도록 구성된 액적 토출 시스템으로서,
    음향 토출기(상기 음향 토출기는,
    제1 패턴으로, 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가하여, 상기 유체 표면으로부터 선단 로브와 필라멘트를 생성하되 상기 필라멘트를 상기 선단 로브 또는 상기 유체 표면으로부터 분리하지 않게 하고,
    제2 패턴으로, 집속 음향 에너지를 선단 로브에 인가하여, 위성 액적을 토출하지 않고서 상기 필라멘트로부터 상기 선단 로브를 분리하여 상기 필라멘트가 상기 유체 표면 내로 후퇴하도록 구성됨); 및
    실행 가능 명령어를 저장하는 프로세서 및 메모리 장치를 포함하며, 상기 프로세서에 의해 상기 실행 가능 명령어가 실행되는 경우에 상기 음향 토출기로 하여금 상기 제1 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면에 인가시키고, 상기 제2 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 상기 선단 로브에 인가시키는, 시스템.
  16. 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하기 위한 톤 버스트 패턴의 파라미터를 설정하는 방법으로서,
    상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
    상기 일련의 교정 톤 버스트에 대응하는 일련의 에코 신호를 수집하는 단계; 및
    상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 상기 비-뉴턴 유체를 함유한 저장조로부터 액적을 토출하도록 구성된, 집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트 세그먼트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 포함하되, 상기 톤 버스트 패턴은 적어도,
    제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
    제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
    제3 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하며, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 톤 버스트 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 액적 토출에 대응하는 최소 톤 버스트 전력을 결정하는 단계; 및
    상기 최소 톤 버스트 전력에 적어도 부분적으로 기초하여 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 톤 버스트 패턴에 따라 상기 저장조에 집속 음향 에너지를 인가함으로써, 상기 저장조로부터 액적을 토출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    광학 센서를 통해 상기 액적의 토출을 감지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    액적 토출이 검출될 때까지 상기 제1, 제2, 또는 제3 톤 버스트 세그먼트 중 하나 이상의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 반복적으로 변경하는 단계; 및
    상기 액적 토출의 검출에 기초하여 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간을 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    알려진 특성을 갖는 복수의 비-뉴턴 유체 각각에 대응하는 복수의 반사 음향 신호를 포함한 비교 데이터 세트에 기초하여, 학습된 합성 신경망에 의해 상기 일련의 에코 신호를 처리함으로써, 상기 토출된 액적과 연관된 액적 부피를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 토출된 액적과 연관된 실제 액적 부피를 결정하는 단계;
    상기 실제 액적 부피를 상기 예측 액적 부피와 비교하는 단계; 및
    상기 비교에 기초하여 상기 합성 신경망을 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 토출된 액적과 연관된 액적 부피를 결정하는 단계;
    상기 액적 부피를 예측 액적 부피와 비교하는 단계; 및
    상기 비교에 기초하여 상기 전력, 파장, 또는 지속 시간을 조절하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수집된 일련의 에코 신호에 기초하여 상기 비-뉴턴 유체의 특성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일련의 에코 신호를, 비-뉴턴 유체의 알려진 집합과 상관 관계가 있고 사전에 수신된 에코의 집합을 포함하는 저장 에코 데이터와 비교하는 단계; 및
    상기 비교에 적어도 부분적으로 기초하여 상기 전력, 파장 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    알려진 특성을 갖는 복수의 비-뉴턴 유체 각각에 대응하는 복수의 반사 음향 신호를 포함한 비교 데이터 세트에 기초하여, 학습된 합성 신경망에 의해 상기 하나 이상의 에코 신호를 처리함으로써, 상기 비-뉴턴 유체의 특성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 유체 저장조로부터 비-뉴턴 유체를 함유한 액적을 토출하는 방법으로서, 상기 방법은,
    비-뉴턴 유체를 함유한 유체 저장조에 집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴을 인가하는 단계를 포함하며, 상기 유체 저장조로의 상기 톤 버스트 패턴의 인가는 상기 유체 저장조로부터 상기 비-뉴턴 유체의 액적을 토출시키되, 상기 톤 버스트 패턴은,
    제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
    상기 제1 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
    상기 제2 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제3 별개 톤 버스트 세그먼트를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제1 톤 버스트 세그먼트는 상기 제2 및 제3 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖고, 상기 제3 세그먼트는 상기 제2 세그먼트보다 긴 지속 시간을 갖는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 제1 별개 톤 버스트에 의해 상기 비-뉴턴 유체의 유체 표면으로부터 선단 로브 및 필라멘트를 상승시키는 단계; 및
    상기 제2 및 제3 별개 톤 버스트에 의해 상기 필라멘트로부터 상기 선단 로브를 분리함으로써 액적 토출에 영향을 미치는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 필라멘트는 유체의 적어도 하나의 비드를 포함하고, 상기 톤 버스트 패턴은 상기 유체의 적어도 하나의 비드가 하나 이상의 추가 액적으로 파열되는 것을 방지하는, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 하나 이상의 비드를 함유한 사슬을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 톤 버스트 패턴은 상기 사슬로부터 액적 분리를 유도하는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 1, 2 또는 2개 초과의 비드를 포함하는, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 필라멘트는 상기 비-뉴턴 유체의 5, 10 또는 10개 초과의 비드를 포함하는, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는 상기 필라멘트의 직경을 초과하는 두께를 상기 필라멘트 직경의 10%, 20%, 50%, 또는 50% 미만만큼 갖는, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체의 비드는, 생성된 액적 직경의 50%, 75%, 또는 90% 이하의 두께를 갖는, 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 사슬 상의 비드는, 액적 분리 이전 또는 이후에 서로 또는 상기 저장조 내의 비-뉴턴 유체와 합쳐지는, 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 토출된 액적의 액적 부피는, 액적 토출 동안에 상기 필라멘트의 나머지 부피의 80% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만인, 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 액적의 토출은, 상기 필라멘트가 적어도 5개의 액적 직경, 10개의 액적 직경, 20개의 액적 직경, 50개의 액적 직경, 또는 100개의 액적 직경의 길이를 갖는 경우에 발생하는, 방법.
  40. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 액적은 필라멘트 길이의 70% 미만, 30% 미만, 또는 10% 미만의 직경을 갖는, 방법.
  41. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 액적은 액적 토출 동안에 필라멘트의 나머지 부피의 80% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 액적 부피를 갖는, 방법.
  42. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 톤 버스트의 진폭은 뉴턴 유체로부터 대안적인 액적을 토출하는 것과 연관된 대안적인 진폭을 초과하는, 방법.
  43. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 톤 버스트의 진폭은 상기 제1 및 제2 또는 제2 및 제3 톤 버스트 세그먼트 사이에서 변하는, 방법.
  44. 제31항에 있어서, 상기 액적 분리가 성공적인지 또는 실패인지 여부를 평가하기 위해 상기 필라멘트를 광학적으로 또는 전자적으로 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 저장조 내에 형성된 유체 마운드로부터의 광학 또는 전기 신호에 기초하여 액적 분리를 예측하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 비-뉴턴 유체는 유전 물질을 함유한 용액을 포함하는, 방법.
  47. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 유체 표면으로부터 유체의 양을 상승시키도록 구성된 일련의 교정 톤 버스트를 상기 유체 표면에 인가하는 단계;
    상기 유체 표면으로부터 상승된 상기 유체의 양으로 필라멘트의 형성을 검출하는 단계; 및
    상기 필라멘트의 검출에 기초하여 상기 톤 버스트 패턴 중 하나 이상의 톤 버스트 세그먼트의 전력, 파장, 또는 지속 시간 중 하나를 설정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 저장조 내의 비-뉴턴 유체로부터 액적을 토출하도록 구성된 액적 토출 시스템으로서,
    집속 음향 에너지의 톤 버스트 패턴을 상기 저장조에 인가하여, 상기 집속 음향 에너지가 상기 저장조로부터 상기 비-뉴턴 유체의 액적을 토출하도록 구성되는 음향 토출기; 및
    실행 가능 명령어를 저장하는 프로세서 및 메모리 장치를 포함하며, 상기 프로세서에 의해 상기 명령어가 실행되는 경우에 상기 음향 토출기로 하여금 다음 패턴으로 상기 집속 음향 에너지를 인가시키고, 상기 패턴은,
    제1 별개 톤 버스트 세그먼트;
    상기 제1 별개 톤 버스트 세그먼트에 이어서 인가된 제2 별개 톤 버스트 세그먼트; 및
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