KR20210071575A - 중쇄 디올을 생산하는 재조합 균주 및 이를 이용한 중쇄 디올의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중쇄 디올을 생산하는 재조합 균주 및 이를 배양하여 중쇄 디올을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 미생물은 ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제, 및/또는 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 제거되고, β-산화 대사 경로 중의 아실-CoA 유전자가 제거되어 지방 알코올의 추가적인 산화 및 β-산화 대사를 방지하고, 또한, 외인성 박테리아 모노옥시게나아제 유전자가 도입되어 과산화 활성을 낮춤으로써 중쇄 디올을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

중쇄 디올을 생산하는 재조합 균주 및 이를 이용한 중쇄 디올의 생산방법{RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING MIDIUM CHAIN DIOL AND METHOD FOR PRODUCING MIDIUM CHAIN DIOL USING THE SAME}

본 발명은 중쇄 디올을 생산하는 재조합 균주 및 이를 배양하여 중쇄 디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

바이오플랫폼 화합물은 바이오매스 유래 원료를 기반으로 하여 생물학적 또는 화학적 전환을 통해 생산된 것으로, 고분자 모노머, 신소재 등의 합성에 사용되고 있다.

바이오플랫폼 화합물 중 α,ω-디올은 폴리에스테르의 단량체로 사용되는 물질로서, 폴리에스테르는 그 뛰어난 성질로부터 섬유용, 필름용, 병용을 비롯해 널리 여러 가지 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 에틸렌글리콜과 테레프탈산의 중축합으로 얻어지는 폴리에틸렌테레프탈레이트는 기계적 강도, 화학 특성 등에 뛰어나서 많은 용도에 사용되고 있고, 의료용(衣料用)으로 가장 적합한 합성 섬유로서 전세계에서 대량 생산되고 있다. 또한, 1,3-프로판디올과 테레프탈산을 원료로 하는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트는 최근 저렴한 1,3-프로판디올 합성법이 개발된 것도 있어서 시장은 증가 경향에 있고, 신장탄성 회복성이 뛰어나고, 영률이 낮은 폴리머 특성을 살린 소프트한 촉감의 의료 용도로서의 전개가 기대된다. 아울러, 최근에는 석유 자원의 고등(高騰)·고갈을 우려하여 바이오매스 자원 유래의 폴리에스테르가 주목받고 있다.

α,ω-디올의 생산은 화학적 합성이나 미생물 발효를 통한 생물학적 방법으로 이루어질 수 있는데, 이러한 생물학적 방법을 이용할 경우에는 대사공학 기술을 이용한 신규 균주 개발 및 발효공정의 최적화가 요구된다.

종래에 α,ω-디올을 생산할 수 있는 균주로는 β-산화 대사 경로와 ω-산화 대사 경로를 함께 갖고 있는 미생물이 이용될 수 있고, 예컨대 크렙실라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙실라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 애어로박터 애어로제네스(Aerobacter aerogenes), 재조합 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 등의 균주들은 2,3-부탄디올을 고수율 및 고생산성으로 생산할 수 있는 것으로 알려져 있다(KRA 2012-0107021, KRA 2012-0128776, KRA 2015-0068581). 그러나, 이들 미생물 중 일부는 병원성 미생물로 분류되고 있어 안전 및 산업화 측면에 제약이 따르고, 또한 현재 산업 규모의 제조는 단쇄 디올 생합성에만 국한되어 있으며, 중쇄 또는 장쇄의 α,ω-디올에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

한편, 대장균(E.coli)에서 알칸 화합물로부터 시토크롬 p450 효소를 이용하여 1, 12-디올을 생산하는 기술이 알려져 있으나(Scheps, D et al, Organic & Biomolecular Chemistry 2011, 9, 6727-6733), 대장균 시스템은 CYP 발현을 위해 고가의 haem 전구체 및 내인성 전자 전달계가 필요하고, 소수성 기질의 흡수가 제한적이라는 점에서 중쇄 디올의 대규모 생산에는 한계가 있다.

따라서, 환경적인 문제를 일으키지 않으면서도, 가격적인 면에서 효율적인 중쇄 디올의 대량 생산 방법에 대한 연구가 여전히 요구되고 있다.

본 발명은 탄화수소의 ω-산화 대사 경로와 β-산화 대사 경로를 모두 가지고 있는 미생물에서, 일부 유전자가 제거 및/또는 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양함으로써, 지방산 유래의 알코올 또는 알칸으로부터 중쇄 디올을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자가 제거되고, 선택적으로 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 제거되며, 또한, β-산화 경로 중의 아실-CoA 옥시다아제 유전자가 제거된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 미생물은 내인성 모노옥시게나아제가 제거된 후에, 외인성 모노옥시게나아제 유전자가 도입된 것 일 수 있다. 상기 외인성 모노옥시게나아제 유전자는 박테리아 유래의 시토크롬 P450 산화효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자 및 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자가 및 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 미생물 내에 존재하는 일부 상동형 유전자가 제거된 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자는 ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ALK8, ALK9, ALK10, ALK11 및 ALK12 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, ADH8 및 FADH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알코올 옥시다아제 유전자는 FAO 유전자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 외인성 모노옥시게나아제 유전자는 CYP153A13, CYP153A33, CYP154, CYP151A 및 CYP140A로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 효모는 야로위아 속, 사카로마이에스 속, 피키아 속 및 캔디다 속으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 미생물에 지방산 알콜 또는 알칸을 기질로 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 탄소수 5 내지 28을 갖는 중쇄 디올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물은 ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제, 및/또는 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 제거되고, β-산화 대사 경로 중의 아실-CoA 유전자가 제거되어 지방 알코올의 추가적인 산화 및 β-산화 대사를 방지하고, 또한, 외인성 박테리아 모노옥시게나아제 유전자가 도입되어 과산화 활성을 낮춤으로써 중쇄 디올을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 ω-산화 및 β-산화 대사 반응과 관련된 생성물 및 관련 효소의 종류를 보여주는 것이다.
도 2는 선별 마커로서 URA3를 통한 상동 재조합 과정을 나타낸 것이다: HR은 상동 영역, RS는 반복 시퀀스.
도 3은 본 발명의 균주 개량을 위한 벡터 pYIGEM을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 형질전환 미생물에서 낙-아웃된 유전자의 종류를 나타낸 것이다. 붉은 색으로 표시된 네모는 해당 유전자가 제거된 것을 의미한다.
도 5는 본 발명의 n-알칸 또는 지방 알코올에서 중쇄 디올을 생산할 수 있는 플랫폼 균주 및 이에 의한 중쇄 디올의 생산 수율을 확인한 결과이다. (a)는 야로위아의 β- 산화 경로에서 β- 알코올 및 β- 알데히드 산화를 차단함으로써 중쇄 디올의 생산을 위한 천연 대사 경로를 조작하였다. (b), (c) 는 재조합 야로위아를 함유하는 진탕 플라스크 배양물에서 n-도데칸 및 1-도데칸올의 1,12-디올로의 변형을 나타낸 것이다(1,12-DDDA, 1,12-도데칸이산; 12-HDA, 12-하이드록시도데칸산; 1,12-DIOL, 1,12-도데칸디올).
도 6은 표준 및 배양액에서 1,12-디올의 GC-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ALK3 및/또는 ALK6 유전자를 결실시킨 재조합 야로위아 균주의 n-알칸으로부터 중쇄 디올의 생산 효과를 나타낸 것이다. (a)는 야로위아 유래의 내인성 모노옥시게나아제의 기질 선호도를 나타낸 것이고, (b)는 ALK3 및/또는 ALK6 유전자를 결실시킨 야로위아 돌연변이체를 나타낸 것이며, (c)는 진탕 플라스크에서 ALK3 및/또는 ALK6 유전자를 결실시킨 야로위아 돌연변이체를 배양시켜 n-도데칸 및 1-도데칸올로부터 1,12-디올의 생체 변환을 확인한 결과이다(1,12-DDDA, 1,12-도데칸이산; 12-HDA, 12-하이드록시도데칸산; 1,12-DIOL, 1,12-도데칸디올).
도 8은 야로위아 균주에 포함된 내인성 모노옥시게나아제 각각의 과산화 활성을 확인한 결과이다. (a)는 야로위아 균주에서 각각의 ALK 유전자의 발현을 나타낸 것이고, (b)는 각각의 ALK 유전자를 발현하는 야로위아 △ALK1-12 돌연변이체를 함유하는 진탕 플라스크 배양에서 n-알칸의 중쇄 디올로의 생체 변형을 나타낸 것이다(1,12-DDDA, 1,12-도데칸이산; 12-HDA, 12-하이드록시도데칸산; 1-DDA, 도데칸산; 1,12-DIOL, 1,12-도데칸디올).
도 9는 야로위아 △ALK1-12 돌연변이체에서 박테리아 CYP15A 유전자의 발현을 나타낸 것이다. (a)는 야로위아 균주에서 박테리아 CYP15A 유전자의 발현을 위한 플라스미드를 나타낸 것이고, (b)는 각각의 박테리아 CYP15A 유전자를 발현하는 △ALK1-12 돌연변이체의 진탕 플라스크 배양 결과를 나타낸 것이며, (c)는 산화된 생성물의 조성을 나타낸 것이다(1,12-DDDA, 1,12-도데칸이산; 12-HDA, 12-하이드록시도데칸산; 1-DDA, 도데칸산; 1-DOL, 1-도데칸올; 1,12-DIOL, 1,12-도데칸디올).
도 10a는 다양한 박테리아 모노옥시게나아제 유전자의 도입에 따른 산화 생성물의 조성을 나타낸 것이다(1,12-DDDA, 1,12-도데칸이산; 12-HDA, 12-하이드록시도데칸산; 1-DDA, 도데칸산; 1-DOL, 1-도데칸올; 1,12-DIOL, 1,12-도데칸디올).
도 10b는 다양한 박테리아 모노옥시게나아제 유전자의 도입에 따른 중쇄 디올의 생산 수율을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은

탄화수소의 ω-산화 대사 경로와 β-산화 대사 경로를 모두 가지고 있는 미생물에서, ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 및 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자; 및 β-산화 경로 중의 아실-CoA 옥시다아제 유전자가 제거되고, 또한, 외인성 모노옥시게나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "ω-산화"는 지방산의 메틸기 말단이 산화되어 디카르복시산이 형성되는 대사 과정을 의미하고, "β-산화"는 카르복시기에서 β-자리의 탄소원자가 산화되어 아세틸 CoA를 방출하면서 그때마다 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 되면서 점차 분해되어 가는 대사 과정을 의미한다. 상기 ω-산화 및 β-산화의 개념과 이러한 대사 과정에 관여하고 있는 효소들에 대해서는 생화학 분야의 통상의 기술자에게 있어서 널리 알려져 있다. 예컨대, ω-산화에 있어서, 지방산이 기질로 이용될 경우에는 먼저 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제(reductase)의 작용에 의해 ω-히드록시 지방산이 생성되고, 상기 ω-히드록시 지방산은 지방 알코올 디하이드로게나아제 및 지방 알코올 옥시다아제의 작용에 의해 ω-알데히드 지방산이 생성되며, 상기 ω-알데히드 지방산은 지방 알데히드 디하이드로게나아제의 작용에 의해 디카르복시산이 제조된다. 또한, β-산화에 있어서는 아실-CoA 옥시다아제에 의해 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 생성된다(도 1).

본 발명에서 "모노옥시게나아제"는 시토크롬 P450 산화효소 또는 시토크롬 P450(CYP) 라고도 하며, 산소를 기질에 도입하는 반응을 촉매하는 산소화효소를 의미한다. 본 발명에서는 지방 알코올 또는 알칸을 기질로 사용하여 말단에 수산화기를 도입시키는 역할을 한다. 본 발명에서 "내인성 모노옥시게나아제"는 야생형 미생물에 본래부터 존재하는 산소화효소를 의미하고, "외인성 모노옥시게나아제"는 외부 유전자가 도입되어 발현된 산소화효소를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자는 ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ALK8, ALK9, ALK10, ALK11 및 ALK12로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ALK8, ALK9, ALK10, ALK11 및 ALK12 는 각각 서열번호 1 내지 9의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 내인성 모노옥시게나아제 중 일부를 제거한 재조합 효모를 지방 알코올 또는 알칸을 기질로 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 모노옥시게나아제를 제거하지 않은 재조합 효모 대비 과산화 생성물이 감소되고, 중쇄 디올의 생산성이 향상되었음을 확인하였다(도 7).

본 발명의 일 구현예에서, 상기 외인성 모노옥시게나아제 유전자는 CYP153A13, CYP153A33, nfa22930(CYP154), nfa33510(CYP151A) 및 nfa22290(CYP140A)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 CYP153A13, CYP153A33, nfa22930, nfa33510 및 nfa22290는 각각 서열번호 33 내지 37의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 실시예에서는, 야생형 효모의 내인성 모노옥시게나아제 유전자를 모두 제거한 후 박테리아 유래의 외인성 모노옥시게나아제 유전자를 도입한 재조합 효모를 지방 알코올 또는 알칸을 기질로 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 중쇄 디올의 생산성이 현저하게 향상되었음을 확인하였다(도 9, 도 10a, 도 10b).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거되는 것이 바람직하지만, 경우에 따라 이들 중 일부 유전자가 제거된 재조합 미생물도 본 발명에 있어서 적용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, ADH8 및 FADH로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, ADH8 및 FADH는 각각 서열번호 13 내지 21의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알코올 옥시다아제 유전자는 FAO 유전자일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 FAO 유전자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 FALDH1, FALDH2, FALDH3 및 FALDH4 유전자는 각각 서열번호 23 내지 26의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 ACO1, ACO2, ACO3, ACO4, ACO5 및 ACO6 유전자는 각각 서열번호 27 내지 32의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 기술분야에 공지된 통상의 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 모노옥시게나아제, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 아실-CoA 옥시다아제로부터 선택되는 유전자가 제거된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "제거"란 용어는 해당 유전자의 일부 또는 전부가 물리적으로 제거된 것뿐만 아니라, 해당 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 단백질이 만들어지지 않는 상태 및 해당 유전자로부터 발현된 단백질이 기능을 하지 못하는 상태 등도 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에서 사용될 수 있는 유전자 재조합 기술로는 형질전환(transformation), 형질도입(transduction), 형질주입(transfection), 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation) 등의 방법을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 미생물은 ω-산화 및 β-산화 대사 과정을 모두 갖고 있는 임의의 미생물이 제한없이 사용될 수 있으며, 예컨대 효모를 포함하는 진핵생물 및 대장균을 포함하는 원핵생물 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 효모로는 야로위아 속(Yarrowia sp), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp), 피키아 속(Pichia sp), 캔디다 속(Candida sp) 등의 효모가 제한없이 사용될 수 있고, 이 중에서도 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 캔디다 트로피 칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 알코홀로피아(Pichia alcoholophia), 위커하미엘라 소르보필라(Wickerhamiella sorbophila) 또는 캔디다 마이코더마(Candida mycoderma)를 사용할 수 있다.

상기와 같이, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제 유전자 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자와, 선택적으로 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 제거된 미생물의 경우, 알칸이 기질로 공급되면 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제의 작용에 의해 두 말단 중 어느 한 쪽이 산화되어 1차 알코올이 형성되지만, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자 및 지방 알코올 옥시다아제 유전자가 제거되어 있기 때문에 더 이상의 산화가 일어나지 못하게 된다. 그리고, 상기와 같이 형성된 1차 알코올은 다시 기질이 되어 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제의 작용에 의해 다른 쪽 말단이 산화됨으로써 2차 알코올인 디올이 형성되게 된다. 상기와 같이 알칸을 기질로 이용하게 되면 2차례에 걸친 산화 반응을 통해 디올이 형성되지만, 기질로 알칸이 아닌 알코올을 이용하게 되면 1차례의 산화만으로 디올이 형성된다.

또한, 높은 과산화 활성을 가지는 내인성 모노옥시게나아제 유전자가 일부 제거된 미생물의 경우, 알칸이 기질로 공급되면 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제의 작용에 의해 두 말단 중 어느 한 쪽이 산화되어 1차 알코올이 형성되고, 일부 모노옥시게나아제의 결실 전 대비 1차 알코올의 과산화 생성물은 감소하며, 다른 쪽 말단이 산화되어 형성되는 중쇄 디올의 생성량이 증가하게 된다.

또한, 내인성 모노옥시게나아제 유전자의 전부가 제거되고 외인성 박테리아 모노옥시게나아제가 도입된 미생물의 경우, 알칸이 기질로 공급되면 모노옥시게나아제의 과산화 활성이 현저하게 감소되어 중쇄 디올의 생성량이 월등하게 증가하게 된다.

다른 일 측면에서, 본 발명은

(a) 탄화수소의 ω-산화 대사 경로와 β-산화 대사 경로를 모두 가지고 있는 미생물에서, ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 및 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자; 및 β-산화 경로 중의 아실-CoA 옥시다아제 유전자가 제거되고, 외인성 모노옥시게나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및

(b) 상기 재조합 미생물에 지방산 알콜 또는 알칸을 기질로 처리하여 배양하는 단계;를 포함하는 중쇄 디올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 ω-산화 대사 경로 중의 지방 알코올 디하이드로게나아제 및/또는 지방 알코올 옥시다아제 유전자가 제거되고, 선택적으로 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자가 제거되고; β-산화 대사 경로 중의 아실-CoA 유전자가 제거되며; 또한 외인성 모노옥시게나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 지방 알코올의 추가적인 산화 및 β-산화 대사를 방지함으로써 중쇄 디올을 높은 수율로 생산할 수 있다. 상기 내인성 모노옥시게나아제, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제, 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 β-산화 대사 경로 관련 유전자는 해당 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 것이 바람직하지만, 경우에 따라 이들 중 일부 유전자가 제거된 재조합 미생물도 본 발명에 있어서 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 사용될 수 있는 미생물은 ω-산화 및 β-산화 대사 과정을 모두 갖고 있는 임의의 미생물이 제한없이 사용될 수 있으며, 예컨대 효모를 포함하는 진핵생물 및 대장균을 포함하는 원핵생물 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 미생물은 효모를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 효모로는 야로위아 속, 사카로마이세스 속, 피키아 속, 캔디다 속 등의 효모가 제한없이 사용될 수 있고, 이 중에서도 야로위아 리폴리티카, 사카로마이세스 세레비지애, 위커하미엘라 소르보필라, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 인판티콜라, 피키아 알코홀로피아 또는 캔디다 마이코더마를 사용하는 것이 바람직하며, 야로위아 리폴리티카를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 본 기술분야에 공지된 통상의 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 내인성 모노옥시게나아제, 지방 알코올 디하이드로게나아제, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 지방 알데히드 디하이드로게나아제 및 아실-CoA 옥시다아제로부터 선택되는 유전자가 제거된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 "제거"란 용어는 해당 유전자의 일부 또는 전부가 물리적으로 제거된 것뿐만 아니라, 해당 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 단백질이 만들어지지 않는 상태 및 해당 유전자로부터 발현된 단백질이 기능을 하지 못하는 상태 등도 포괄적으로 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, "디올"은 두 개의 히드록시기(-OH 기)를 포함하고 있는 화합물을 총칭하는 것으로서, "중쇄 디올"은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 탄소수 6 내지 20, 보다 바람직하게는 탄소수 8 내지 16 또는 탄소수 6 내지 14를 갖는 디올 화합물을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 단계 (b)의 기질은 지방산 유래의 알코올 및 알칸으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 지방산 유래의 알코올로는 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 탄소수 6 내지 20, 보다 바람직하게는 탄소수 8 내지 16을 갖는 알코올이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 알칸은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 탄소수 6 내지 20, 보다 바람직하게는 탄소수 8 내지 16을 갖는 알칸이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 알칸은 도데칸일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중쇄 디올은 1,12-도데칸디올일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

1. 재료 및 방법

1-1. 미생물

플라스미드의 증식에는 대장균 (E. coli DH5α)을 사용하였다. 디올 생산 균주는 야생형 효모 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 사용하였으며, 본 발명에서 사용한 야로위아 균주는 하기 표 4에 나타내었다. 상기 야로위아 균주를 25% 글리세롤에서 -70℃로 유지하였고, 스톡 균주를 YPD 한천 배지 (10 g/L yeast extract, 20 g/L Bacto peptone, 20 g/L glucose, and 20 g/L agarose)에 도말하여 30℃에서 밤새 배양하였다.

1-2. 효모의 게놈에서 유전자의 결실

야로위아의 표적 유전자는 URA3 유전자를 선별 마커로 사용하여 상동 재조합을 통해 녹아웃되었다 (도 2). URA3 유전자는 야로위아 균주로부터 증폭되었다; 야로위아의 글루타메이트 생성 유전자 (GLT1) 또는 MATB2 5'-UTR 영역 또는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 (HisG)로부터 부분 서열을 함유하는 반복 서열 (RS)을 pGEM T easy 벡터 (Promega)에 클로닝 하였다. XXX_F / XXX_R (표 1)을 사용하여 PCR에 의해 야로위아 게놈 DNA로부터 각각의 표적 유전자의 5'- 및 3'- 플랭킹 영역 (표 2)을 증폭시켰다.

이름	프라이머	염기서열 (5'-> 3')	서열번호
pop-out vector cloning	HisG1-BglII F	aattgggcccagatctcagaccggttcagacaggat	38
	HisG1-EcoRI R	tctctgggcggaattcggaggtgcggatatgaggta	39
	HisG1-NotI F	tgtttctcggcggccgccagaccggttcagacaggat	40
	HisG1-BamHI R	tccaacgcgtggatccggaggtgcggatatgaggta	41
	HisG2-BglII F	aattgggcccagatctaacgctacctcgaccagaaa	42
	HisG2-EcoRI R	tctctgggcggaattctcttctcgatcggcagtacc	43
	HisG2-NotI F	tgtttctcggcggccgcaacgctacctcgaccagaaa	44
	HisG2-BamHI R	tccaacgcgtggatcctcttctcgatcggcagtacc	45
	HisG3-BglII F	aattgggcccagatctgtgatctgacgcctgatgg	46
	HisG3-EcoRI R	tctctgggcggaattctcagggtattgaagctcatgg	47
	HisG3-NotI F	tgtttctcggcggccgcgtgatctgacgcctgatgg	48
	HisG3-BamHI R	tccaacgcgtggatcctcagggtattgaagctcatgg	49
	glt1-BglII F	aattgggcccagatcttcagaacttgcgccgataaa	50
	glt1-EcoRI R	tctctgggcggaattcctttgccagctagaccatagag	51
	glt1-NotI F	tgtttctcggcggccgctcagaacttgcgccgataaa	52
	glt1-BamHI R	tccaacgcgtggatccctttgccagctagaccatagag	53
	glt2-BglII F	aattgggcccagatctattggcgggttcgttactt	54
	glt2-EcoRI R	tctctgggcggaattccctggaagaaggccgtattatc	55
	glt2-NotI F	tgtttctcggcggccgcattggcgggttcgttactt	56
	glt2-BamHI R	tccaacgcgtggatcccctggaagaaggccgtattatc	57
ACO1 deletion	POX1-F1	ttcctcaatggtggagaaga	58
	POX1-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctggtaccatagtccttgccatgc	59
	POX1-F2	atcgctacctcatatccgcacctcccttctgtcccccgagtttct	60
	POX1-R2	aagaagggcttgagagtcg	61
ACO2 deletion	POX2-F1	cccaacaacactggcac	62
	POX2-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgctcctcatcgtagatggc	63
	POX2-F2	atcgctacctcatatccgcacctccgacaagacccgacaggc	64
	POX2-R2	agaccagagtcctcttcg	65
ACO3 deletion	POX3-F1	accttcacagagccaccca	66
	POX3-R1	atggctctctgggcggtgttgggggtgttgatgatg	67
	POX3-F2	ttgttgtgtttctcgcaaggttctcatcgaggcctg	68
	POX3-R2	aggaaaggtcgaagagtgctct	69
ACO4 deletion	POX4-F1	actgcgagagcgatctg	70
	POX4-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgttcatgagcatgtagtttcg	71
	POX4-F2	atcgctacctcatatccgcacctccgaggacgacaaagccggag	72
	POX4-R2	agagcagagtcctcctcaa	73
ACO5 deletion	POX5-F1	aacttcctcacaggcagcgagc	74
	POX5-R1	atggctctctgggcggagtagagagtgggagttgaggtc	75
	POX5-F2	ttgttgtgtttctcgccccgtcaaggacgctgag	76
	POX5-R2	acagtaaggtggggcttgactc	77
ACO6 deletion	POX6-F1	agtccctcaacacgtttaccg	78
	POX6-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgccatttagtggcagcaacgtt	79
	POX6-F2	atcgctacctcatatccgcacctccgagctctgatcaaccgaacc	80
	POX6-R2	aggaagggtctaatgacaga	81
FALDH1 deletion	FALDH1-F1	aatcactcctcctacgc	82
	FALDH1-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgtggtctcggggacacctc	83
	FALDH1-F2	atcgctacctcatatccgcacctccccatcatcaagccccgaa	84
	FALDH1-R2	accgacataatctgagcaat	85
FALDH2 deletion	FALDH2-F1	accactaggtgagatcgag	86
	FALDH2-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgctccgacactaccggaacgc	87
	FALDH2-F2	atcgctacctcatatccgcacctcccttgctcccacagttgtt	88
	FALDH2-R2	gatcacccagaaccatagc	89
FALDH3 deletion	FALDH3-F1	gtgacccccaccacgtcac	90
	FALDH3-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgttctgacattttcagcgccac	91
	FALDH3-F2	atcgctacctcatatccgcacctccccattacgagcgtttgacgg	92
	FALDH3-R2	cagggctggggaccacc	93
FALDH4 deletion	FALDH4-F1	taccgactggaccagattc	94
	FALDH4-R1	tctttatcctgtctgaaccggtctgcggcagtggcaatgatcttac	95
	FALDH4-F2	atcgctacctcatatccgcacctccgactcgattcatcgctcctac	96
	FALDH4-R2	caaatctttcggaagattcgg	97
FAO deletion	FAO-F1	atcattgtcggtggaggaac	98
	FAO-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttgcgtagtcgtaaggctggac	99
	FAO-F2	attctggtactgccgatcgagaagaccgtcatcggtgagattctt	100
	FAO-R2	attcgaggtcggagatcctt	101
ADH1 deletion	ADH1-F1	cccagaaggctgtcattttc	102
	ADH1-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgtttcgcagttcttggggatatg	103
	ADH1-F2	attctggtactgccgatcgagaagagccgacaaggagaagatgtg	104
	ADH1-R2	caatcttgccctcctccat	105
ADH2 deletion	ADH2-F1	ccagaagggtgtcatcttcg	106
	ADH2-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttatcgcagttcttgggaatgt	107
	ADH2-F2	attctggtactgccgatcgagaagaccgacaaggagaagatgtgc	108
	ADH2-R2	caatcttgccctcctccata	109
ADH3 deletion	ADH3-F1	agaaagccgtcatcttcgag	110
	ADH3-R1	ttgcacaagtaacgaacccgccaattcacagttcttggggatgtg	111
	ADH3-F2	ggagataatacggccttcttccagggctgacaaggagaagatgtgc	112
	ADH3-R2	acttggagcagtccagaacg	113
ADH4 deletion	ADH4-F1	gtcaaaacgtcgacgaacct	114
	ADH4-R1	aggtatttatcggcgcaagttctgaggcttgaggtcaatgtcgat	115
	ADH4-F2	ctcctctatggtctagctggcaaaggacatggaggcccactctaa	116
	ADH4-R2	agtactcccaagcgtcctca	117
ADH5 deletion	ADH5-F1	gagagccgctttcaccac	118
	ADH5-R1	aggtatttatcggcgcaagttctgaagagcctggtaggcagtgag	119
	ADH5-F2	ctcctctatggtctagctggcaaagttccaggacgtgatcaagga	120
	ADH5-R2	taaggatgatcttgccggtag	121
ADH6 deletion	ADH6-F1	gacccagaaagccattgtgt	122
	ADH6-R1	aggtatttatcggcgcaagttctgaagccacctgagaaaggtctg	123
	ADH6-F2	ctcctctatggtctagctggcaaagcaccgaggagaaggagaaga	124
	ADH6-R2	tccctcctccatcaaggtaa	125
ADH7 deletion	ADH7-F1	gacgttcccaagacacaaaag	126
	ADH7-R1	aggtatttatcggcgcaagttctgaaggcgtactgctggaaagag	127
	ADH7-F2	ctcctctatggtctagctggcaaagacccacaccaaggagctg	128
	ADH7-R2	caacgacacgaccaacaatc	129
ADH8 deletion	ADH8-F1	atcgcgccaacttgtttaat	130
	ADH8-R1	aggtatttatcggcgcaagttctgacaccttctctcgtgggatgt	131
	ADH8-F2	ctcctctatggtctagctggcaaagtgtgttgagtctggcaaagc	132
	ADH8-R2	tcaagtccatggcatcaaac	133
FADH deletion	FADH-F1	ccgaaggaaagaccatcact	134
	FADH-R1	ttgcacaagtaacgaacccgccaatagaaggaagagcagcccata	135
	FADH-F2	ggagataatacggccttcttccagggcttgggcttacaagtttgg	136
	FADH-R2	tcggtgaaggcagagttgat	137
ALK1 deletion	ALK1-F1	gtctttctgctagcctac	138
	ALK1-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttgaagagctcttgggcatcaaag	139
	ALK1-F2	attctggtactgccgatcgagaagactacctgcgatacgttc	140
	ALK1-R2	gagccttggtggtcttg	141
ALK2 deletion	ALK2-F1	cgttttggccgttgc	142
	ALK2-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttgttgttgggaattcgc	143
	ALK2-F2	attctggtactgccgatcgagaagagcgagtacctgcgatttg	144
	ALK2-R2	gcgttaatgagcttctcg	145
ALK3 deletion	ALK3-F1	gctcgaaatactgattggag	146
	ALK3-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttcgcccttgaagttgtctacac	147
	ALK3-F2	attctggtactgccgatcgagaagagcagtgtgagtacctgcgttatg	148
	ALK3-R2	tcaactaactactgtaccctc	149
ALK4 deletion	ALK4-F1	gaccaatcttacgatcgtgc	150
	ALK4-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttctgcatgagtctttcg	151
	ALK4-F2	attctggtactgccgatcgagaagactcaagaagctgcgagctg	152
	ALK4-R2	cttcatcgacacccaaac	153
ALK5 deletion	ALK5-F1	caactctttggcgtcc	154
	ALK5-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttgagtgagtcgagtcgag	155
	ALK5-F2	attctggtactgccgatcgagaagagctccgaagtgctattc	156
	ALK5-R2	catcttgacccaaacacc	157
ALK6 deletion	ALK6-F1	cttggccttggccattc	158
	ALK6-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttccttcttgatggtcttgaaaag	159
	ALK6-F2	attctggtactgccgatcgagaagaggtgatactcccgacgaattg	160
	ALK6-R2	ctactccatcttcaaccaaac	161
ALK7 deletion	ALK7-F1	cgatactggtgctggctttc	162
	ALK7-R1	acgcctttctggtcgaggtagcgttctcttgcaaactgaggacg	163
	ALK7-F2	attctggtactgccgatcgagaagacgactacctgcgatacgtg	164
	ALK7-R2	ctcctggtgacacagagtc	165
ALK8 deletion	ALK8-F1	ctgatcatccccattacgctc	166
	ALK8-R1	cagcgccatcaggcgtcagatcacgtttcaagggaagacaaggg	167
	ALK8-F2	gaccatgagcttcaataccctgactgactttgggaccagcac	168
	ALK8-R2	gactcatggtgatatggg	169
ALK9 deletion	ALK9-F1	cagcttccatcttccccggttc	170
	ALK9-R1	cagcgccatcaggcgtcagatcacgctcgagagtgttgccatc	171
ALK9 amplification	ALK9-F	agcaataggaaagcttatgctgggaagaactctc	172
	ALK9-R	ggatccgcaattaacactagttcttcttgtacaac	173
ALK10 amplification	ALK10-F	agcaataggaaagcttatgattctactctacgtcc	174
	ALK10-R	ggatccgcaattaacatcacggtaagttatttgtgc	175
ALK11 amplification	ALK11-F	agcaataggaaagcttatgctcttaccactgcttt	176
	ALK11-R	ggatccgcaattaacatcacttgacccgaatcctc	177
ALK12 amplification	ALK12-F	agcaataggaaagcttatgctcgaaatactgattg	178
	ALK12-R	ggatccgcaattaacatcaactaactactgtaccc	179

경로	효소	유전자	GenBank accession No.	서열번호
ω-Oxidation pathway	Cytochrome P450	ALK1	YALI0E25982g	1
		ALK2	YALI0F01320g	2
		ALK3	YALI0A20130g	3
		ALK4	YALI0B13816g	4
		ALK5	YALI0B13838g	5
		ALK6	YALI0B01848g	6
		ALK7	YALI0A15488g	7
		ALK8	YALI0C12122g	8
		ALK9	YALI0B06248g	9
		ALK10	YALI0B20702g	10
		ALK11	YALI0C10054g	11
		ALK12	YALI0A20130g	12
	Alcohol dehydrogenase	ADH1	YALI0D25630g	13
		ADH2	YALI0E17787g	14
		ADH3	YALI0A16379g	15
		ADH4	YALI0E15818g	16
		ADH5	YALI0D02167g	17
		ADH6	YALI0A15147g	18
		ADH7	YALI0E07766g	19
		ADH8	YALI0C12595g	20
		FADH	YALI0F09603g	21
	Fatty-alcohol oxidase	FAO	YALI0B14014g	22
	Fatty aldehyde dehydrogenase	FALDH1	YALI0A17875g	23
		FALDH2	YALI0E15400g	24
		FALDH3	YALI0B01298g	25
		FALDH4	YALI0F23793g	26
β-Oxidation pathway	Acyl-CoA oxidase	ACO1	YALI0E32835g	27
		ACO2	YALI0F10857g	28
		ACO3	YALI0D24750g	29
		ACO4	YALI0E27654g	30
		ACO5	YALI0C23859g	31
		ACO6	YALI0E06567g	32

결실 및 팝-아웃 카세트에 대한 상동성 영역을 PCR 중첩에 의해 수득하고, 이 분절 단편을 효모 세포로 형질 전환시켰다. 이어서, Boeke et al. (1984)의 방법에 따라 5- 플루오로 오로틱산 (5-FOA) 선택 및 우라실 마커 구출을 수행 하였다. 유전자의 성공적인 파괴는 게놈 DNA로부터 프라이머 XXX_F1 / XXX_R1 및 XXX_F2 / XXX_R2를 사용하여 PCR에 의해 확인되었다. 유전자 DNA 추출 키트 (Gene all biotechnology, Korea)를 이용하여 게놈 DNA를 얻었다. Prime star DNA 중합 효소 (Takara, Japan)를 갖는 Biometra T3000 열 순환기를 PCR 증폭에 사용 하였다. 증폭된 단편을 QIAgen 정제 키트 (Qiagen, Germany)로 정제하고, DNA 단편을 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen, Germany)를 사용하여 아가로스겔로부터 회수 하였다.

1-3. 모노옥시게나아제 발현 벡터의 구축

플라스미드 pGEM-T-easy 벡터 (Promega, USA)를 야로위아에서 발현 벡터의 골격으로 사용 하였다. 선별 마커로서 사용된 URA3 유전자를 프라이머 세트 YlURA3 1F Kpn 및 YlURA3 2B Spe를 사용하여 PCR에 의해 Y. lipolytica Po1g 균주의 게놈 DNA (gDNA)로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 KpnI / SpeI로 분해하고 KpnI 및 SpeI 분해된 pGEM-T-easy 벡터에 삽입 하였다. 생성된 플라스미드를 pYIGEM_URA3으로 지정하였다. TEF 프로모터 및 자율 복제 서열 (GenBank no. X68252) 모두 프라이머 세트 Y1TEFp sph 1F / YlTEFp Nde Hind 2R 및 Y1ARS1 1K Kpn Hind / YlARS1 2R Nco를 사용하여 Y. lipolytica Po1g 균주의 gDNA로부터 증폭시켰다. 각기　수득된 PCR 생성물을 TEF 프로모터의 경우 SphI / HindIII, ARS의 경우 HindIII / NcoI로 분해시켰다; 2 개의 분해된 단편을 SphI / NcoI 분해된 pYIGEM_URA3으로 라이게이션 하였다. 생성된 플라스미드를 pYIGEM로 지정하였다(도 3). 야로위아에서 각각의 ALK 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 ALKX_AF1 / ALKX_AR1 및 ALKX_AF2 / ALKX_AR2 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 야로위아의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다 (표 2). 각 ALK의 증폭된 단편을 HindIII 및 BamHI로 분해하고, 분해된 단편을 pYIGEM의 HindIII 및 BamHI 사이에 삽입 하였다. 각각의 결과 발현 벡터를 pYIGEM_ALK_X (표 3)로 지정 하였다.

야로위아에서 박테리아 CYP153A 모노옥시게나아제에 대한 발현 벡터를 구축하기 위해, ALK1의 ER 막 고정을 위한 서열 (atgtccaacgccctcaacctgtcgctggcgctcggcgtctttctgctagcctactatggcttctccgtgatccagtaccgcatcaaaacccgcaagctcgaaaagaagtggaagtgtggtaagcccaaggatatttcacgattc: 서열번호 180)을 정렬(align) PCR에 의해 박테리아 CYP153A 모노옥시게나아제의 N-말단에 융합시켰다. 융합된 유전자를 HindIII 및 BamHI로 분해하고, 분해된 단편을 pYIGEM의 HindIII 및 BamHI 사이에 삽입 하였다. 각각의 결과 발현 벡터를 pYIGEM_CYP153_X (표 3)로 지정 하였다.

발현 벡터	설명
pYUHisG1	pGEM T easy derivative, URA3 [a] maker, HisG1 [b] pop-out cassette
pYUHisG2	pGEM T easy derivative, URA3 maker, HisG2 [b] pop-out cassette
pYUGlt2	pGEM T easy derivative, URA3 maker, Glt2 [c] pop-out cassette
pYUGlt3	pGEM T easy derivative, URA3 maker, Glt3 [c] pop-out cassette
pYIGEM	pGEM T easy derivative, TEF [d] promoter, URA3 maker, ARS [e]
pYIALK_1	pYIEGM derivative, ALK1
pYIALK_2	pYIEGM derivative, ALK2
pYIALK_3	pYIEGM derivative, ALK3
pYIALK_4	pYIEGM derivative, ALK4
pYIALK_5	pYIEGM derivative, ALK5
pYIALK_6	pYIEGM derivative, ALK6
pYIALK_7	pYIEGM derivative, ALK7
pYIALK_8	pYIEGM derivative, ALK8
pYIALK_9	pYIEGM derivative, ALK9
pYIALK_10	pYIEGM derivative, ALK10
pYIALK_11	pYIEGM derivative, ALK11
pYIALK_12	pYIEGM derivative, ALK12
pYICYP153_13	pYIEGM derivative, Actinobacter sp.-derived CYP153A13 [f]
pYICYP153_33	pYIEGM derivative, Marinobacter aquaeolei VT8-derived CYP153A33 [f]

1-4. 재조합 균주의 배양

배양 테스트할 균주를 전날 3 ㎖ YPD 배지(Bacto Laboratories, Yeast extract 10g/L, Bacto peptone 20g/L, glucose 20g/L)에 접종하여 30℃에서 200rpm으로 하루 동안 키웠다. 이어서, 전배양한 배양액 1 mL를 100mL의 성장기 배지(50 g/L glucose, 10 g/L yeast extract, 6.7 g/L yeast nitrogen base w/o amino acids (YNB), 5 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.05 g/L uracil, and 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.0) 를 함유하는 1L baffled 플라스크에 넣고, 플레이트 교반기에서 30℃ 200 rpm으로 하루 동안 배양하였다. 600 nm에서 세포 밀도가 대략 40에 도달 할 때 (OD 600), 성장기 배지에서 배양한 배양액 50 mL를 전환기 배지(30 g/L glucose, 3 g/L yeast extract, 6.7 g/L YNB w/o amino acids, 5 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.05 g/L uracil, 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.6) 50 mL를 함유하는 250mL baffled 플라스크에 넣어, 30℃에서 200 rpm으로 하루 또는 이틀 동안 배양하였다. 이때, 기질로는 0.05% tween 80에 용해된 n-알칸 또는 1-알칸올 1~ 10 g/L를 사용하였다.

1-5. 시료의 분석 방법

600 nm의 흡광도에서 UV 분광 광도계 (Uvikon XL, France Secomam)를 사용하여 바이오 매스를 측정하였다. 기판 및 생성물은 70eV에서 작동되는 4 중 극자 전자 선택 이온화 검출기 (EI)가 장착된 가스 크로마토그래피-질량 분석 시스템 (GC-MS)에 의해 식별되고 정량화되었다. Agilent HP-5MS 컬럼 (길이 30m, 내경 0.25mm 및 필름 두께 0.25μm)을 10: 1 분할 비율로 사용하였다. 캐리어 가스로서 헬륨을 사용하였고, 오븐 온도는 150 ℃ 내지 172 ℃ 범위였다. 산-처리 배양 배지 및 동등한 부피의 클로로포름을 사용하여 GC-MS 분석을 위한 기질 및 생성물의 추출을 수행 하였다. 시알릴화를 위해, N, O- 비스 (트리메틸 실릴) 트리 플루오로 아세트 아미드 (BSTFA)를 추출 된 샘플 (1: 2, v/v)에 첨가하고, 혼합물을 60 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 내부 표준으로서 테트라 데칸이 사용되었다.

2. 실험 결과 및 고찰

2-1. 낙-아웃 균주의 제작

ω-산화 및 β-산화의 각 단계에는 여러 유전자가 관여한다.　따라서, 소수성 기질로부터 α,ω-디올의 생산에 적합한 야로위아 균주를 조작하는 것은 게놈 전체 변형을 수반 하였다. 야로위아에서, 비 동종 말단 결합 (NHEJ)은 DNA에서 이중 가닥 파괴를 복구하기 위해 상동 재조합 (HR)보다 많이 사용된다. HR 효율성을 개선하기 위해 NHEJ 기반 이중 가닥 파손 (DSB) 복구를 담당하는 KU70 유전자를 파괴한 다음 선별 마커로 사용되는 URA3 유전자와 함께 2 분자 PCR 기반 유전자 표적화 방법을 사용했다. 표적 유전자를 제거하기 위해 사용된 2 분자 결실 카세트를 URA3 스플릿 마커 재조합을 통해 게놈에 부위 특이적으로 삽입 하였다. 삽입 부위는 PCR에 의해 확인되었다; 이어서 5'-FOA 플레이트의 선택을 통한 URA3의 팝-아웃이 이어졌다. 이 전략은 무한한 수의 유전자를 삭제하고 ω- / β- 산화 경로를 유발하는 다양한 균주의 구성을 가능하게했다 (도 4).

그 결과, 야생형 효모(Yarrowia lipolytica) 균주에 존재하는 시토크롬 p450 모노옥시게나아제 유전자 (ALK1~12), 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자 (ADH1~8, FADH), 지방 알코올 옥시다아제 유전자 (FAO), 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자 (FALDH1~4), 산화 대사 경로 관련 유전자 (아실-CoA 옥시다아제 유전자; ACO1~6)의 일부 또는 전부가 제거된 총 9종의 낙-아웃 균주를 제작하였다(표 4 및 도 4).

개발균주	특징
YID01	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6::URA3
YID02	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4::URA3
YID03	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao::URA3
YID04	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8::URA3
YID05	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8△fadh::URA3
YID06	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8△fadh△alk3::URA3
YID07	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8△fadh△alk6::URA3
YID08	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8△fadh△alk3△alk6::URA3
YID09	MatA, leu2-270, ura3-302::△ura3△ku70△aco1-6△faldh1-4△fao△adh1-8△fadh△alk1-12::URA3

2-2. 효모 기반의 중쇄-디올 생합성 플랫폼의 개발

먼저, ω- 산화를 통해 합성된 대사 산물의 분해를 막기 위해, 아실-CoA 산화 효소를 암호화하는 6 개의 유전자 (ACO1-6)를 삭제함으로써 야로위아에서 ω- 산화 경로를 차단했다. 생성된 균주 YID001은, bi- 이작용성 화학 물질과 소수성 기질을 유일한 탄소원으로 이용할 수 없었다. 이러한 특성 덕분에 YID001을 α,ω-디올의 생산을 위한 스타터 변형으로 사용할 수 있었다.

배양 배지에서 α,ω-디올을 축적 할 수 있는 균주를 개발하기 위해, 본 발명자들은 ω- 산화 경로를 통해 알데히드기를 카르복실기로 산화시키는 4 개의 지방 알데히드 탈수소효소 (FALDH1-4)를 암호화하는 유전자를 제거함으로써 YID001의 게놈을 변형시킴으로써, 돌연변이체 YID002를 생성했다.

다음으로, YID002의 게놈에서 1 개의 알코올 산화효소 (FAO1), 4 개의 지방 알코올 탈수소효소 (FADH1-4) 및 8 개의 알코올 탈수소효소 (ADH1-8)를 암호화하는 유전자를 제거했다(도 5a). 조작된 균주 YID003, YID004 및 YID005는 n- 알칸 또는 지방 알코올로부터 각각 1,12-디올을 생산하였으며 (도 5b 및 5c), 이는 GC-MS를 통해 확인되었다 (도 6: n-도데칸은 4.47±0.38, 10.91±1.13, 및 11.1±1.33, 1-도데칸올은 3.10±0.58, 6.14±0.73, 및 9.62±0.98 mg/L). 흥미롭게도, FAO1 결실된 균주 만이 1,12-디올을 생산하였으며, 이는 FAO1이 알코올 기의 분해에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

한편, ACO1-6, FAO, FADH1-4 및 ADH1-8을 결실시켰음에도 불구하고, 1,12-도데칸이산 및 ω- 하이드록시 도데칸산을 포함하는 과산화 생성물의 형성은 총 산화된 생성물의 90 % 이상이었다 (도 5b). 이 결과는 야로위아가 n- 알칸이 CYP에 의해 말단 하이드록실화 된 후에 산화 과정을 계속할 수 있는 다른 효소(들)를 보유하고 있음을 시사한다.

2-3. 효모의 내인성 모노옥시게나아제 유전자의 결실

야로위아는 CYP52 계열에 속하는 12 개의 CYP 유전자 (ALK1-12)를 보유하고 있다. 먼저, Alk3p 및 Alk6p와 같은 주요 ALK가 과산화 부산물 형성을 담당한다고 가정하였다. Alk3p 및 Alk6p는 n-알칸의 지방산으로의 히드록실화에 매우 관여하기 때문에 선택되었다(도 7a). ALK3 및 ALK6의 결실이 부산물의 형성에 어떻게 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 ALK3 및 ALK6의 결실을 갖는 균주 YID005의 돌연변이체를 생성하였다; 이들 돌연변이체를 각각 △alk3 또는 △alk6로 지정 하였다 (도 7b).

그 결과 도 7c에 나타낸 바와 같이, Alk3p 및/또는 Alk6p가 결실된 돌연변이체 (YID006-8)는 n-도데칸으로부터 1,12-디올의 생산량을 증가시키는 것을 확인하였다. △aralk3△aralk6 돌연변이체(YID008)를 함유하는 플라스크에서 1,12-도데칸이산의 양은 약 28 % 감소 된 반면, n-도데칸으로부터 생성된 1,12-디올의 양은 약 60 % 증가되었다. 그러나, 과산화 부산물은 여전히 총 산화 생성물의 90 %를 초과하여 형성되었고, 1,12-디올은 총계의 7 % 미만으로 생성되었다.

2-4. 내인성 모노옥시게나아제 유전자의 종류에 따른 과산화 활성 확인

중쇄 디올의 생산성을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 초기에 과산화 및 낮은 알카리에 대한 높은 말단 히드록실화 활성을 갖는 12 개의 내인성 Alkp들을 스크리닝 하였다.

구체적으로, n-알칸으로부터 α,ω-디올의 생산에 적합한 Alkps를 얻기 위해, 본 발명자들은 CYP 배경에서 생성되지 않은 균주에서 Alkp를 평가하고 지방 알코올 또는 지방 알데히드의 다운스트림 산화 능력이 부족한 것으로 평가 하였다.이러한 이유로, 본 발명자들은 ω-알코올 및 ω- 알데히드 산화가 미리 차단된 균주 YID005로부터 모든 ALK 유전자들을 결실시켰다 (도 8a). 각각의 Alkp를 발현시키기 위해, 각각의 ALK 유전자가 구성 적 TEF1 프로모터에 의해 제어되는 발현 벡터를 구축 하였다. 각각의 ALK 유전자를 개별적으로 발현하는 균주는 플라스크 배양에서 n-도데 칸과 함께 배양되었다.

그 결과, 도 8b는 1,12-도데칸디온산, 12-하이드록시도데칸산, 1-도데칸올 및 도데칸산을 포함하는 산화 생성물의 생성을 평가함으로써 결정된 균주의 산화 활성을 보여준다. 다른 Alks와 비교하여, Alk8p, Alk11p 및 Alk12p는 n-도데칸에 대한 비교적 약한 말단 산화 활성을 나타냈다. 모든 Alkp는 총 생성물의 80 % 이상을 나타내는 과산화 된 생성물의 형성을 촉매하여, 모든 Alkp가 n-도데칸의 대사 동안 1- 도데칸올 및 도데칸산 알데히드의 산화에 관여했음을 나타낸다. Alk1p 및 Alk2p에 의해 촉매된 1,12-도데칸디 온산의 형성은 총 생성물의 70 % 인 반면, Alk3p, Alk6p, Alk9p 및 Alk10p에 의한 촉매는 전체 생성물의 45-60 %의 범위에 있었다. Alk4p 및 Alk7p는 각각 47.4 및 44.2 %의 12-하이드록시도데칸산; 및 32.3 및 10.81 %의 12-도데칸산의 생산을 촉매 하였다. Alkps 중 어느 것도 1,12-디올의 생산을 촉매 할 수 없었지만, 1-도데 카놀의 생산은 전체의 4 %에 불과했다. 일단 Alkps에 의해 1-DO가 생성되면, 과산화 산화에 의한 1-DO의 1-DDA 로의 연속 산화 활성이 반대쪽 말단의 β-탄소에서의 산화 활성보다 더 높은 것으로 보였다.

이로부터, 이들 Alkps는 n-도데칸으로부터 1,12-디올을 높은 수율로 생산하기에는 어느 정도 한계가 있음을 알 수 있다.

2-5. 효모에 외인성 박테리아 모노옥시게나아제의 도입

박테리아 클래스 I P450에 속하는 CYP153A 모노옥시게나아제는 포화 및 불포화 지방산 및 알칸의 ω- 하이드록실화를 촉매한다. Y. lipolytica에 의한 n-알칸으로부터 α,ω- 디올의 생산에 대한 CYP153A의 효과를 확인하기 위하여, n-알칸의 α,ω- 말단 활성을 보여주는 CYP153A13_A.sp 및 CYP153A33_M.aq에 대한 발현 벡터를 구축했다. 구축된 벡터에서, CYP153A13_A.sp 및 CYP153A33_M.aq 모노옥시게나아제를 암호화하는 유전자는 ER 막 고정 Alk1p의 서열에 융합되었다; 융합된 유전자는 구성적 TEF1 프로모터에 의해 제어되었다. 발현 벡터를 돌연변이 균주 YID009에 도입하고 (도 9a), 형질전환체를 플라스크에서 n-도데칸과 함께 배양하였다. 야로위아의 내인성 CPRb는 CYP153A13_A.sp와 CYP153A33_M.aq의 환원 효소 파트너로 사용되었다.

그 결과, 도 9b 및 9c는 플라스크 배양에서 이들 균주에 의해 생성된 생성물의 분포를 보여준다. 이들 생성물 중에서, 1-도데칸올, 12-하이드록시도데칸산, 1,12-도데칸이산 및 1,12-디올을 확인 하였다. CYP153A13_A.sp와 비교하여, CYP153A33_M.aq는 과산화 활성이 낮았다. 이는 CYP153A33_M.aq가 CYP153A13_A.sp (전체 제품의 11.8 %)를 사용하여 생산된 것보다 알칸에서 1,12-디올 (전체 제품의 41.8 %)의 높은 퍼센트를 생산했음을 나타낸다. 결과적으로, 균주 YID005 (11.1 mg/L)에 의해 생성된 양과 비교하여, CYP153A33_M.aq를 함유하는 균주는 1.76 g/L에서 더 높은 수준의 1,12-디올을 생성 하였다 (도 9b 및 9c).

2-6. 효모에 다양한 박테리아 모노옥시게나아제의 도입

다른 종류의 박테리아의 모노옥시게나아제를 사용하였을 때에도 n-알칸으로부터 중쇄 디올을 높은 수준으로 생산할 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, CYP153A13_A.sp, CYP153A33_M.aq, nfa22290, nfa22930과 nfa33510에 대한 발현 벡터를 구축한 후, 각 발현 벡터를 돌연변이 균주 YID009(내인성 ALK 결실 균주)에 도입한 후 형질전환체를 n-dodecane과 함께 배양하였다.

효소	유전자	박테리아 균주	서열번호
Cytochrome P450 monooxygenase	CYP153A13	M.aquaeolei	33
	CYP153A33	Alcanivorax borkumensis	34
	nfa22930 (CYP154)	Nocardia farcinica	35
	nfa33510 (CYP151A)	Nocardia farcinica	36
	nfa22290 (CYP140A)	Nocardia farcinica	37

그 결과, 내인성 모노옥시게나아제를 가지는 재조합 효모(YID05) 대비 외인성 모노옥시게나아제 유전자를 도입한 모든 돌연변이체에서 과산화 활성이 낮았으며(도 10a), 1,12-디올을 더 높은 수준으로 생성함을 확인하였다(도 10b). 특히, 내인성 모노옥시게나아제를 제거하고 및 외인성 CYP153A_M.aq 유전자가 도입된 균주 (1.76 mg/L)는 내인성 모노옥시게나제를 포함하는 YID05 균주 (0.011 mg/L) 대비 중쇄 디올을 160배 더 많이 생산하는 것을 확인하였다(도 10b).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING MIDIUM CHAIN DIOL AND METHOD FOR PRODUCING MIDIUM CHAIN DIOL USING THE SAME <130> 2019-DPA-3498 <160> 180 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1 <400> 1 atgtccaacg ccctcaacct gtcgctggcg ctcggcgtct ttctgctagc ctactatggc 60 ttctccgtga tccagtacca catcaaaacc cgcaagctcg aaaagaagtg gaagtgtggt 120 aagcccaagg atatttcacg attccccttt tcagcctcct tcttcatccc cttcctggtt 180 gagtccaaga agaaccgact gctcgagttt gttcagtgga tgtttgagtc ccaggtctac 240 cccggttaca cctgcaagac caccgtgttc ggcgttgaca tgtaccacac tgtcgaccct 300 gagaacctca aggctgttct agccacccag ttcaaggact tttgtctcgg tgagcgacac 360 gctcagttcc tccccgttct tggcaacggt atctttactc ttgacggcca gggatggcag 420 cattctcgag ccatgctgcg accccagttt gctcgagatc aggtttccga cgttgagatg 480 atcgaggagc acatccagta catgacctct cgaatcccca aggatggctc tgcctttgat 540 gcccaagagc tcttcttcaa cctgactctt gacactgcca ccgagttcct 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<210> 112 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH3-F2 <400> 112 ggagataata cggccttctt ccagggctga caaggagaag atgtgc 46 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH3-R2 <400> 113 acttggagca gtccagaacg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH4-F1 <400> 114 gtcaaaacgt cgacgaacct 20 <210> 115 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH4-R1 <400> 115 aggtatttat cggcgcaagt tctgaggctt gaggtcaatg tcgat 45 <210> 116 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH4-F2 <400> 116 ctcctctatg gtctagctgg caaaggacat ggaggcccac tctaa 45 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH4-R2 <400> 117 agtactccca agcgtcctca 20 <210> 118 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5-F1 <400> 118 gagagccgct ttcaccac 18 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5-R1 <400> 119 aggtatttat cggcgcaagt tctgaagagc ctggtaggca gtgag 45 <210> 120 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5-F2 <400> 120 ctcctctatg gtctagctgg caaagttcca ggacgtgatc aagga 45 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH5-R2 <400> 121 taaggatgat cttgccggta g 21 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH6-F1 <400> 122 gacccagaaa gccattgtgt 20 <210> 123 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH6-R1 <400> 123 aggtatttat cggcgcaagt tctgaagcca cctgagaaag gtctg 45 <210> 124 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH6-F2 <400> 124 ctcctctatg gtctagctgg caaagcaccg aggagaagga gaaga 45 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH6-R2 <400> 125 tccctcctcc atcaaggtaa 20 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH7-F1 <400> 126 gacgttccca agacacaaaa g 21 <210> 127 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH7-R1 <400> 127 aggtatttat cggcgcaagt tctgaaggcg tactgctgga aagag 45 <210> 128 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH7-F2 <400> 128 ctcctctatg gtctagctgg caaagaccca caccaaggag ctg 43 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH7-R2 <400> 129 caacgacacg accaacaatc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH8-F1 <400> 130 atcgcgccaa cttgtttaat 20 <210> 131 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH8-R1 <400> 131 aggtatttat cggcgcaagt tctgacacct tctctcgtgg gatgt 45 <210> 132 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH8-F2 <400> 132 ctcctctatg gtctagctgg caaagtgtgt tgagtctggc aaagc 45 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH8-R2 <400> 133 tcaagtccat ggcatcaaac 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FADH-F1 <400> 134 ccgaaggaaa gaccatcact 20 <210> 135 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FADH-R1 <400> 135 ttgcacaagt aacgaacccg ccaatagaag gaagagcagc ccata 45 <210> 136 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FADH-F2 <400> 136 ggagataata cggccttctt ccagggcttg ggcttacaag tttgg 45 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FADH-R2 <400> 137 tcggtgaagg cagagttgat 20 <210> 138 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-F1 <400> 138 gtctttctgc tagcctac 18 <210> 139 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-R1 <400> 139 acgcctttct ggtcgaggta gcgttgaaga gctcttgggc atcaaag 47 <210> 140 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-F2 <400> 140 attctggtac tgccgatcga gaagactacc tgcgatacgt tc 42 <210> 141 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK1-R2 <400> 141 gagccttggt ggtcttg 17 <210> 142 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK2-F1 <400> 142 cgttttggcc gttgc 15 <210> 143 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK2-R1 <400> 143 acgcctttct ggtcgaggta gcgttgttgt tgggaattcg c 41 <210> 144 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK2-F2 <400> 144 attctggtac tgccgatcga gaagagcgag tacctgcgat ttg 43 <210> 145 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK2-R2 <400> 145 gcgttaatga gcttctcg 18 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK3-F1 <400> 146 gctcgaaata ctgattggag 20 <210> 147 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK3-R1 <400> 147 acgcctttct ggtcgaggta gcgttcgccc ttgaagttgt ctacac 46 <210> 148 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK3-F2 <400> 148 attctggtac tgccgatcga gaagagcagt gtgagtacct gcgttatg 48 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK3-R2 <400> 149 tcaactaact actgtaccct c 21 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK4-F1 <400> 150 gaccaatctt acgatcgtgc 20 <210> 151 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK4-R1 <400> 151 acgcctttct ggtcgaggta gcgttctgca tgagtctttc g 41 <210> 152 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK4-F2 <400> 152 attctggtac tgccgatcga gaagactcaa gaagctgcga gctg 44 <210> 153 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK4-R2 <400> 153 cttcatcgac acccaaac 18 <210> 154 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK5-F1 <400> 154 caactctttg gcgtcc 16 <210> 155 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK5-R1 <400> 155 acgcctttct ggtcgaggta gcgttgagtg agtcgagtcg ag 42 <210> 156 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK5-F2 <400> 156 attctggtac tgccgatcga gaagagctcc gaagtgctat tc 42 <210> 157 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK5-R2 <400> 157 catcttgacc caaacacc 18 <210> 158 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK6-F1 <400> 158 cttggccttg gccattc 17 <210> 159 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK6-R1 <400> 159 acgcctttct ggtcgaggta gcgttccttc ttgatggtct tgaaaag 47 <210> 160 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK6-F2 <400> 160 attctggtac tgccgatcga gaagaggtga tactcccgac gaattg 46 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK6-R2 <400> 161 ctactccatc ttcaaccaaa c 21 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK7-F1 <400> 162 cgatactggt gctggctttc 20 <210> 163 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK7-R1 <400> 163 acgcctttct ggtcgaggta gcgttctctt gcaaactgag gacg 44 <210> 164 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK7-F2 <400> 164 attctggtac tgccgatcga gaagacgact acctgcgata cgtg 44 <210> 165 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK7-R2 <400> 165 ctcctggtga cacagagtc 19 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK8-F1 <400> 166 ctgatcatcc ccattacgct c 21 <210> 167 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK8-R1 <400> 167 cagcgccatc aggcgtcaga tcacgtttca agggaagaca aggg 44 <210> 168 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK8-F2 <400> 168 gaccatgagc ttcaataccc tgactgactt tgggaccagc ac 42 <210> 169 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK8-R2 <400> 169 gactcatggt gatatggg 18 <210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK9-F1 <400> 170 cagcttccat cttccccggt tc 22 <210> 171 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK9-R1 <400> 171 cagcgccatc aggcgtcaga tcacgctcga gagtgttgcc atc 43 <210> 172 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK9-F <400> 172 agcaatagga aagcttatgc tgggaagaac tctc 34 <210> 173 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK9-R <400> 173 ggatccgcaa ttaacactag ttcttcttgt acaac 35 <210> 174 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK10-F <400> 174 agcaatagga aagcttatga ttctactcta cgtcc 35 <210> 175 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK10-R <400> 175 ggatccgcaa ttaacatcac ggtaagttat ttgtgc 36 <210> 176 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK11-F <400> 176 agcaatagga aagcttatgc tcttaccact gcttt 35 <210> 177 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK11-R <400> 177 ggatccgcaa ttaacatcac ttgacccgaa tcctc 35 <210> 178 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK12-F <400> 178 agcaatagga aagcttatgc tcgaaatact gattg 35 <210> 179 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALK12-R <400> 179 ggatccgcaa ttaacatcaa ctaactactg taccc 35 <210> 180 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER membrane fixing <400> 180 atgtccaacg ccctcaacct gtcgctggcg ctcggcgtct ttctgctagc ctactatggc 60 ttctccgtga tccagtaccg catcaaaacc cgcaagctcg aaaagaagtg gaagtgtggt 120 aagcccaagg atatttcacg attc 144

Claims (13)

1. 탄화수소의 ω-산화 대사 경로와 β-산화 대사 경로를 모두 가지고 있는 미생물에서, ω-산화 대사 경로 중의 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자, 및 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자; 및 β-산화 경로 중의 아실-CoA 옥시다아제 유전자가 제거되고, 또한, 외인성 모노옥시게나아제 유전자가 도입된 재조합 미생물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 외인성 모노옥시게나아제 유전자는 박테리아 유래의 시토크롬 P450 산화효소인, 재조합 미생물.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK1, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK2, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK3, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK4, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK5, 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK6, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK7, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK8, 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK9, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK10, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK11, 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ALK12 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 재조합 미생물.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 외인성 모노옥시게나아제 유전자는 서열번호 33의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CYP153A13, 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CYP153A33, 서열번호 35의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 nfa22930, 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 nfa33510및 서열번호 37의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 nfa22290으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 재조합 미생물.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH1, 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH2, 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH3, 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH4, 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH5, 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH6, 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH7, 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ADH8 및 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FADH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 재조합 미생물.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 지방 알코올 옥시다아제 유전자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FAO 유전자인 재조합 미생물.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 지방 알데히드 디하이드로게나아제 유전자는 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FALDH1, 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FALDH2, 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FALDH3, 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 FALDH4 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 재조합 미생물.
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 아실-CoA 옥시다아제 유전자는 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO1, 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO2, 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO3, 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO4, 서열번호 31의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO5 및 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ACO6로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 재조합 미생물.
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자 및 아실-CoA 옥시다아제 유전자의 미생물 내에 존재하는 모든 상동형 유전자가 제거된 재조합 미생물.
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 내인성 모노옥시게나아제 유전자, 지방 알코올 디하이드로게나아제 유전자, 지방 알코올 옥시다아제 유전자가 및 아실-CoA 옥시다아제 유전자의 미생물 내에 존재하는 일부 상동형 유전자가 제거된 재조합 미생물.
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 미생물은 효모인 재조합 미생물.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 효모는 야로위아 속, 사카로마이에스 속, 피키아 속 및 캔디다 속으로 이루어진 군에서 선택되는 효모인 재조합 미생물.
13. 청구항 1의 재조합 미생물을 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 미생물에 지방 알코올 또는 알칸을 기질로 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 탄소수 5 내지 28을 갖는 중쇄 디올의 생산 방법.

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