KR20210065408A - D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 d-알룰로오스로부터 d-알로스를 생산하는 방법 - Google Patents

D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 d-알룰로오스로부터 d-알로스를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법에 관한 것으로, D-글루코오스 이성질화 효소의 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 7.5~8.5인 조건에서, D-글루코오스 이성질화 효소를 고정시킨 생물반응기를 이용하여 400~600g/ℓ의 D-알룰로오스로부터 150g/L의 D-알로스를 20일 동안 연속적으로 얻을 수 있다.

Description

D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법{Method for producing D-allose from D-allulose using D-glucose isomerase}
본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
비만의 원인으로 지목되고 있는 설탕 및 과당을 대신 사용하기 위한 대체 감미료 시장이 최근 지속적으로 성장하고 있다. 그러나, 기존의 대체 감미료(올리고당, 당알코올, 유사 감미료 등)는 설탕 및 과당의 맛 및 물성과는 차이가 있어, 제한적으로 활용되고 있는 실정이다.
한편, 일본에서는 희소당이 포함된(약 15%) 시럽이 선풍적인 인기를 끌면서 대기업을 중심으로 시럽, 음료, 제과, 제빵, 간장 등의 분야에서, 설탕을 대체할 수 있는 당질 감미료가 폭넓게 사용되고 있다. 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psocose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있는 D-알로스(D-allose)는 자연계에 극소량 존재하는 희소성 천연 당질 중 하나이며, 감미는 보유하고 있지만 칼로리는 설탕과 비교하여 매우 낮은 당질로서 향후 대체감미료로서 매우 높은 주목을 받을 수 있는 소재로 예상된다. 또한, 알로스는 암세포의 증식을 저해하는 특성이 있기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 그리고, 알로스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있어, 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다. 이와 같은 높은 이용 가치가 있음에도, 알로스는 자연계에는 극히 미량만이 존재하기 때문에 효과적으로 의약적 응용 분야에 공급되기 위해서는 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다. 또한 지금까지 알로스는 주로 화학적인 합성 방법에 의해서만 생산되어 왔다. 그러나 알로스의 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경 상의 위험성, 화학적 반응 후 부가적인 당류의 생성, 이로 인한 복잡한 알로스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다. 따라서 알로스이 효율적인 생산방법의 개발은 절실하게 필요한 상황이다.
한편, 글루코오스 이성질화 효소는 식품산업에서 포도당(glucose)을 과당(fructose)으로 전환시켜, 포도당과 과당이 혼합된 고농도의 과당시럽(high fructose syrup, HFS)을 생산하는데 사용된다. 고농도의 과당시럽은 높은 감미도와 결정화가 잘 되지 않는 특성으로 인하여, 과일통조림, 아이스크림, 제과의 잼과 젤리를 생산하는 데에 많이 사용되고 있는 설탕(sucrose)과 전환당(invert syrup)을 대체하여 식품산업에서 널리 사용되고 있다.
알로스의 생산방법 관련 기술로는 한국등록특허 제1998477호에 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 알룰로스로부터 알로스의 생산방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0896968호에 라이보스 5-인산 이성화효소를 이용한 알로스의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법을 제공하고, 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 7.5~8.5인 조건에서 효과적으로 D-알로스를 생산할 수 있고,, D-글루코오스 이성질화 효소를 고정시킨 생물반응기를 이용하여 500g/ℓ의 D-알룰로오스로부터 150g/ℓ의 D-알로스를 20일 동안 연속적으로 얻을 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)를 포함하는 D-알로스(D-allose) 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 D-알룰로스(D-allulose)를 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)와 반응시키는 단계;를 포함하는 D-알로스(D-allose)의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 D-알로스를 생산하는 방법은 D-글루코오스 이성질화 효소의 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 7.5~8.5인 조건에서 효과적으로 D-알로스를 생산할 수 있고, D-글루코오스 이성질화 효소를 고정시킨 생물반응기를 이용하여 500g/ℓ의 D-알룰로오스로부터 150g/ℓ의 D-알로스를 20일 동안 연속적으로 얻을 수 있는 방법이다.
도 1은 D-알로스의 생산에 있어서, pH에 따른 D-글루코오스 이성질화 효소의 활성을 비교한 결과이다.
도 2는 D-알로스의 생산에 있어서, 온도에 따른 D-글루코오스 이성질화 효소의 활성을 비교한 결과이다.
도 3은 D-알로스의 생산에 있어서, D-글루코오스 이성질화 효소의 온도 안정성을 확인한 결과이다.
도 4는 D-알룰로오스의 농도가 D-글루코오스 이성질화 효소에 의한 D-알로스의 생산에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 5는 고정화 D-알로스의 생산에 있어서, 고정화 D-글루코오스 이성질화 효소의 생물 반응기의 희석율(dilution rate)에 의한 D-알로스 생산에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 고정화 D-글루코오스 이성질화 효소를 이용한 생물반응기에서 D-알룰로오스로부터 D-알로스의 연속생산에 대한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)를 포함하는 D-알로스(D-allose) 생산용 조성물에 관한 것이다.
상기 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)의 기질은 D-알룰로오스(D-allulose)인 것이 특징이다.
또한, 본 발명은 D-알룰로스(D-allulose)를 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase) 또는 상기 D-글루코오스 이성질화 효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 D-알로스(D-allose)의 생산방법에 관한 것이다.
상기 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 7.5~8.5인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)를 생물반응기에 고정화시킨 후, 400~600g/ℓ의 D-알룰로오스를 0.1~0.3ℓ/hr의 유속으로 지속적으로 20일 동안 첨가하여, D-알로스를 연속생산하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것을 아니다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 장치]
D-글루코오스 이성질화 효소(D-Glucose isomerase)는 시그마 알드리치(code: G4166)로부터 구입하여 사용하였다.
Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6×250mm) 컬럼(Showa Denko, Tokyo, Japna)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(Shimadzu SCL-10A, Kyoto, Japan)를 이용하여 D-알룰로오스로부터 D-알로스를 생산하는 D-글루코오스 이성질화 효소의 활성을 측정하였다.
실시예 1. 최적 pH 및 온도 조건 확인
D-allulose로부터 D-allose 생산을 위한 D-글루코오스 이성질화 효소의 최적 활성을 확인하기 위하여, pH 및 온도 조건에 따른 활성의 변화를 측정하였다. 본 실시예 1에서 사용한 D-글루코오스 이성질화 효소량은 100mg/㎖이고, pH 6~7.5는 PIPES(piperazin-N-N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 완충용액으로, pH 7.5~9.0는 EPPS 완충용액으로 적정하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 pH7.5~8.5에서 D-글루코오스 이성질화 효소의 활성이 우수하였다.
한편, 최적의 활성을 나타내는 온도를 확인하기 위하여 45~90℃에서 D-글루코오스 이성질화 효소활성을 측정하였는데, 도 2에 개시한 바와 같이 가장 최적온도는 70℃인 것으로 나타났다.
실시예 2. D-글루코오스 이성질화 효소의 온도 안정성 평가
본 발명의 D-글루코오스 이성질화 효소가 장시간 반응할 때, 효소활성을 유지할 수 있는 온도범위를 확인하기 위하여, 50~90℃에서 온도 안정성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 50~70℃에서는 매우 높은 온도 안정성을 유지하였으나, 80℃부터는 급격히 온도 안정성이 감소하는 특성을 보였다.
따라서 상기 실시예 1에서 확인한 온도에 따른 효소활성과 온도 안정성 평가 결과를 기반으로, 알룰로오스로부터 알로스를 생산하는 D-글루코오스 이성질화 효소 반응은 60~75℃에서 수행하는 것이 바람직한 것으로 판단하였다.
실시예 3. D-글루코오스 이성질화 효소에 의한 D- 알룰로오스로부터 D- 알로스 생산에서, 기질농도 및 생물반응기 유속이 미치는 영향
(1) 기질 농도의 영향
D-글루코오스 이성질화 효소에 의한 D-알룰로오스로부터 D-알로스 생산에서, 기질인 D-알룰로오스의 농도에 따른 D-알로스 생산량을 확인한 결과 기질 농도가 상승함에 따라 지속적으로 D-알로스 생산량이 증가하고 D-알로스의 전환율도 28-30%를 유지하다가 D-알룰로오스의 농도가 600g/ℓ부터는 전환율이 감소하는 것으로 나타났다(도 4).
이와 같은 결과로부터 D-알로스 생산은 400~500g/ℓ의 D-알룰로오스를 기질로 사용하는 것이 바람직한 것으로 판단하였다.
(2) 생물반응기 유속의 영향
300㎖의 D-글루코오스 이성질화 효소를 고정시킨 생물반응기를 구축한 후, 상기 생물반응기의 유속에 따른 D-알로스의 생산성을 확인하였다.
그 결과 도 5에 개시한 바와 같이, 0.1~0.3h-1의 희석율(dilution rate)에서 D-알로스의 생산량이 현저하다는 것을 확인하였다.
실시예 4. D-글루코오스 이성질화 효소가 고정된 생물반응기를 이용한 D- 알로스의 연속생산
직경 26mm, 높이 1000mm인 컬럼에, 본 발명의 D-글루코오스 이성질화 효소를 패킹하고, 500g/ℓ의 D-알룰로오스를 첨가하여, 상기 실시예 1~3에서 확립한 D-글루코오스 이성질화 효소 반응 조건(pH8.0, 컬럼 온도: 70℃, 유속(Flow rate): 0.35ℓ/hr)으로, 20일 동안 150g/ℓ의 D-알로스를 연속생산하였다(도 6).

Claims (5)

  1. D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)를 포함하는 D-알로스(D-allose) 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)의 기질은 D-알룰로오스(D-allulose)인 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
  3. D-알룰로스(D-allulose)를 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)와 반응시키는 단계;를 포함하는 D-알로스(D-allose)의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 반응 온도는 60~75℃이고, 반응 pH는 7.5~8.5인 것을 특징으로 하는 D-알로스(D-allose)의 생산방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 D-글루코오스 이성질화 효소(D-glucose isomerase)를 생물반응기에 고정화시킨 후, 400~600g/ℓ의 D-알룰로오스를 0.1~0.3ℓ/hr의 유속으로 지속적으로 20일 동안 첨가하여, D-알로스를 연속생산하는 것을 특징으로 하는 D-알로스(D-allose)의 생산방법.
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