KR20210064987A - 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화장품 원료에 제주무 및 제주무 종자의 단백질 추출물을 첨가하여 항균활성을 강화하여 보존성이 향상되도록 하는 제주제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법에 관한 것으로, 제주무를 수세 및 분쇄한 후 여과지를 통하여 걸러진 여액을 원심분리하여 고형물을 제거하고, 이를 동결건조하여 제주무추출물을 얻는 과정; 및 쌀뜨물에서 분리된 유산균인 Lactobacillus plantarums (DSM 21380) 및 Lactococcus latis (KFCC 11510P)의 현탁액을 혼합하여 배양하여 제조한 화장료 조성물에 보존제로서 상기한 제주무 종자 단백질 추출물을 0.5-2mg/ml의 비율로 첨가하여 상온에서 믹서로 혼합하는 과정으로 이루어진다. 이에 제주무 및 그 종자 단백질 추출물은 강한 항균 활성을 가지고 있는 것으로, 천연물질 유래 화장품에 투입되는 천연물질들에 미생물들이 성장되는 것을 억제하여 화장품의 보존기간을 길어지게 하는 효과가 있다.

Description

제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법{Manufacturing method of natural cosmetics using Jeju radish protein extract}

본 발명은 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화장품 원료에 제주무 및 제주무 종자의 단백질 추출물을 첨가하여 항균활성을 강화하여 보존성이 향상되도록 하는 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법에 관한 것이다.

최근 화장품 산업에서는 화학물질의 유해성으로 인하여 천연물 유래의 기능성 화장품이 많이 개발되고 있으나, 천연 기능성분의 혼합으로 이루어진 기능성 화장품은 미생물의 생육에 좋은 영양원으로 작용하기에 유효 기능성분의 보존에 어려움이 함께 존재한다.

이에 따라 현재 사용되고 있는 미식품의약국(FDA) 승인 화장품 보존제로서는 메틸 파라벤(methyl paraben)을 비롯하여 에틸(ethyl)-, 프로필(propyl)-, 뷰틸 파라벤(butyl paraben)과 이미아졸리디닐 우레아(imidazolidinyl urea), 페녹시에탄올(phenoxyethanol) 등이 있으며, 이들 성분은 대부분 세균 및 곰팡이 등 오염 균주의 세포막을 파괴하는 물질들이다.

하지만 이들 화학합성 보존제의 경우 눈, 호흡기 계통 및 피부의 자극원으로서 피부가 민감한 사람들에게는 피부 트러블 및 알러지 등의 부작용을 유발하는 문제점이 우려되나, 화장품의 장기간 보관을 위해서는 이들의 사용은 불가피한 상황이다.

이를 극복하기 위해 백자단백질, ε-폴리리신(ε-polylysine), 라이소자임(lysozyme), 에탄올, 펙틴 분해물, 포도 종자 추출물, 키토산 등의 사용에 대한 연구가 발표된 바 있으나 (An . B.J 1999, The material of natural anti-bacterial agents for the food preservative , Food Industry and Nutrition ,4, 5-16), 상기 실험적인 연구만으로는 경제적 혹은 기술적인 문제로서 산업적 수준에서의 이용에 한계가 있었다.

화학합성 보존제를 대체하여 천연 추출물로서 맹죽엽(Sasa borealis)<6> 을 화장품에 첨가하는 기술이 개시된 바 있으나, 원료 수급의 문제로 대량생산에 적용되기 어려운 점이 있다.

무는 우리나라에서 배추와 더불어 국내 채소 총생산량의 약 60%를 차지하는 보편적인 작물로서, 여러 가지 소화촉진 효소를 비롯하여 항산화 활성에 유효한 성분이 있는 것으로 알려져 왔다. 이러한 특성을 화장품에 활용하고자 하는 시도가 여러번 이루어졌으나, 화장품 보존제로서의 활용가능성에는 미치지 못하는 실정이다.

실험적인 연구만으로는 경제적 혹은 기술적인 문제로서 산업적 수준에서의 이용에 한계가 있었다.

무는 우리나라에서 배추와 더불어 국내 채소 총생산량의 약 60%를 차지하는 보편적인 작물로서, 여러 가지 소화촉진 효소를 비롯하여 항산화 활성에 유효한 성분이 있는 것으로 알려져 왔다.

이러한 유효한 성분을 화장품 제조시 추가시켜 천연화장품으로서의 품질을 향상시키는 방향으로의 연구개발 요구 하기에 이르렀다.

대한민국 등록특허 제 10-0722674 호 대한민국 공개특허 제 10-2001-50197 호

이와 같은 연구개발의 요구에 부응하여 안출된 것으로, 본 발명은 화장품 원료에 제주무 및 제주무 종자의 단백질 추출물을 첨가하여 항균활성을 강화하여 보존성이 향상되도록 하는 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법을 제공하는데, 그 목적이 있다.

본 발명의 실시예에 따른 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법은, 제주무를 수세 및 분쇄한 후 여과지를 통하여 걸러진 여액을 원심분리하여 고형물을 제거하고, 이를 동결건조하여 제주무추출물을 얻는 과정; 및 쌀뜨물에서 분리된 유산균인 Lactobacillus plantarums (DSM 21380) 및 Lactococcus latis (KFCC 11510P)의 현탁액을 혼합하여 배양하여 제조한 화장료 조성물에 보존제로서 상기한 제주무 종자 단백질 추출물을 0.5-2mg/ml의 비율로 첨가하여 상온에서 믹서로 혼합하는 과정으로 이루어질 수 있다.

본 발명과 관련된 실시예로서, 고사리 열수추출물 발효액에 추가로 동일 비율의 녹차 열수추출물 및 편백 열수추출물을 용매로서 함유할 수 있다.

본 발명과 관련된 실시예로서, 상기 제주무추출물은 제주무종자 단백질 추출물로 대체할 수 있다.

본 발명과 관련된 실시예로서, 제주무종자 단백질 추출물은 백운 제주무 씨앗을 수세 후 10배 부피의 pH 7.5-8.5의 완충액을 첨가한 다음 분쇄하고, 분쇄액을 2-10℃에서 20시간-2일간 침지시킨 다음 걸러서 얻어진 여액을 원심분리하여 상청액만을 분리하는 과정; 여과막을 통과시켜 고형물을 제거한 조단백질 용액을 얻고, 조단백질 용액은 단백질 분해용 음이온 교환제를 이용한 음이온교환 크로마토그래피를 통하여 활성을 나타내는 비흡착 분획을 분리하는 과정; 비흡착 분획을 동결건조를 통하여 재농축 한 뒤, 친수성 겔을 이용한 젤 크로마토그래피를 통하여 활성분획을 분리하는 과정을 통해 획득할 수 있다.

본 발명은 제주무 및 그 종자 단백질 추출물은 강한 항균 활성을 가지고 있는 것으로, 천연물질 유래 화장품에 투입되는 천연물질들에 미생물들이 성장되는 것을 억제하여 화장품의 보존기간을 길어지게 하는 효과가 있다.

또한, 제주무 및 그 종자 단백질 추출물을 피부에 독성이 없는 정도의 양으로 첨가함으로서 피부에 무해한 천연 화장품을 제공할 수 있게 되는 효과가 있다.

본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는, 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.

1. 재료 및 방법

제주무 추출물의 조제

제주무 추출물을 만들기 위하여 포항시 죽장면 일대의 고랭지에서 생산된 김장용 제주무를 구입하였다. 이를 수세 및 분쇄한 후 여과지를 통하여 걸러진 여액을 8000rpm에서 원심분리함으로서 고형물을 제거하였으며 이를 동결건조하여 제주무추출물(Radish Extract : RJ) 시료를 조제하였다.

제주무 종자 단백질의 경우 50g의 제주무 씨앗을 수세 후 10배 부피의 20mM Tris-HCl(pH 8.0)완충액을 첨가한 다음 분쇄하였다. 이 분쇄액을 4℃에서 1일간 침지시킨 다음 거즈 및 여과지를 통해 1회씩 거른 후 얻어진 여액을 12000rpm에서 원심분리하여 상청액만을 분리한 뒤 0.4㎛ 여과막을 통해 고형물을 제거한 조단백질 용액을 얻었다. 조단백질 용액은 음이온 교환제인 디에틸아미노에타놀-셀룰로오스(DEAE-cellulose) 음이온교환 크로마토그래피를 통하여 활성을 나타내는 비흡착 분획을 분리하였으며, 이를 동결건조를 통하여 재농축 한 뒤 친수성 겔인 세파덱스(sephadex) G-50 젤 크로마토그래피를 통하여 약 6 kDa 크기의 활성분획(Radish seed protein : RSP)을 분리하여 사용한다.

화장품 제조

상기한 제주무 출출물(RJ) 및 제주무 종자 단백질 추출물(RSP)을 화장원료에 대하여 RJ는 10mg/ml, RSP는 1mg/ml 첨가하여 상온에서 믹서를 이용하여 혼합한다.

2. 보존성 실험

유전독성 및 항유전독성 측정

RJ와 RSP의 첨가제로서 안전성 및 효용성을 모색하기 위해 실험관(in vitro) 상에서의 유전독성 및 항유전독성분석을 Choi(Choi, J. W., J.H.Park, S.T.JI,O,B.Choi,H.K.Shin.1999.Antktenotoxic effect of dominant bacteria isolates from Kimchi in vitro. Korean J.Food Sci.Technol., 31, 1071-1076)의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 수행하였다.

RJ 및 RSP가 강한 항균활성을 나타내는 농도가 되도록 HBSS(Hank's balanced salt solution) 완충용액에 RJ는 10mg/ml, RSP는 1mg/ml 녹인 후, 각각 10㎕씩 세포 주에 처리하여 유전 독성을 검색하였으며, 여기에 최종농도가 1㎍/ml가 되도록 직접 발암원인 MNNG(N-methyl-N'-intro-N-nitrosoguanidine)(Fluka, Germany)를 첨가한 후 세포주에 투여함으로서 항 유전독성을 검토해 보았다. 음성대조구로서는 HBSS 완충액만을, 양성대조구로서는 MNNG만이 HBSS 완충액에 1㎍/㎖첨가된 것을 사용하였다.

본 실험의 세포주로 사용된 비종양성 3T3 세포주(ATCC CCL No. 163)는 매 세포 계대시에 직경 3cm 의 둥근 조직배양 접시에 1.0 ×105 cells/plate 로 분주하여 24시간 배양한 후 PBS(phosphate buffered saline)완충액으로 2회 세척한 다음 상기 시료를 가한 뒤 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 30분간 반응시켰다.

반응이 종료된 세포는 PBS 완충액으로 세척하고 0.125 mg/ml 농도의 프로테이나제 K(proteinase K)(Amnesco, USA) 100㎕를 처리후 1ml의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지(FBS free)를 첨가하여 세포를 현탁시켰으며 이를 1000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상청액을 제거하였다.

원심분리된 처리구별 3T3 세포주는 육안으로 관찰하여 침전된 세포의 양에 따라 150~200㎕의 DMEM배지(FBS free)를 첨가하여 현탁한 후, 이 중 10㎕를 40℃의 1% low melting point agarose(LMA, in PBS) 75㎕와 섞어서 사전에 0.5% normal melting point agarose(NMA, in PBS)로 코팅(coating)된 슬라이드(slide) 위에 올리고 그 위에 커버 글래스(cover glass)를 덮어 세포 및 LMA 현탁액이 고르게 분산되도록 한 뒤, 동조(ice bath)위에 5분간 두어 젤을 굳혔다.

여기에 커버 글래스(cover glass) 제거 후 다시 40℃의 1% LMA 75㎕를 올려서 탑 레이어(top layer)를 만든 다음 앞에서와 마찬가지로 커버 글래스로 덮어 젤을 굳혔다. 그 이후의 세포 용해, 전기영동, 핵 염색 및 분석은 전술한 Choi 등의 방법과 동일하게 수행하였다.

DNA 손상에 의해 생성되는 'comet' tail의 길이에 따라 5단계(0~4)로 임의적 분류를 하였는데, 0단계는 5% 미만의 비손상, 1단계는 5 ~ 20%의 낮은 수준의 손상, 2단계는 20 ~ 40%의 보통 수준의 손상, 3단계는 40 ~ 90%의 높은 DNA 손상을 의미하며 마지막으로 4단계는 90% 이상의 매우 높은 수준의 DNA 손상단계를 의미한다. 각 시료당 100개 이상의 세포를 관찰하고 전술한 손상단계로 세포를 분류한 후 시료당 손상 지수를 관찰하였다. 각 시료에 대한 유의성을 관찰하기 위해 3회 반복 실험하였다.

In vitro 세포독성 측정

RSP 및 RJ의 3T3 세포주에 대한 안전성을 검토하기 위하여 세포독성의 유무를 확인하였다. 세포독성을 확인하기 위해서 CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit(Promega, U.S.A)을 사용하였으며 제조사의 매뉴얼과 같이 실험하였다. RSP 및 RJ가 강한 항유전 독성을 보이는 농도의 10배 농도(RSP : 10 mg/ml, RJ : 100mg/ml)가 되도록 DMEM 배지에 녹인 후 0.22㎛ 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였고, 이를 4배씩 희석하여 시료를 준비하였다.

1.0 ×105 cells/well 로 96 well plate 상에 3T3 세포주를 분주한 후 6시간 동안 배양한 뒤 배양상청액을 제거하고 50㎕의 DMEM (5% FBS)을 첨가하였다. 각 시료를 웰(well)당 50㎕씩 첨가한 후 37℃, 5% CO2 하에서 1시간 동안 반응시킨 다음 1000 rpm, 3분간 원심분리한 뒤 각 웰(well)의 상청액 50㎕를 새플레이트(plate)에 옮겼다. 이후, 50 ㎕의 substrate mix를 첨가한 뒤 실온, 암실에서 15분간 반응시킨 다음 50㎕의 reaction stop buffer를 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤 492nm 하에서 흡광도를 측정하였다.

항균활성 측정

기능성 한방화장품 생산업체인 소리소 뷰티아카데미 (대구시 수성구)로부터 제공받은 화장품 시료 4종 C1 ~C4을 2~4주간 4℃에서 냉장 보관한 다음 화장품시료 100㎕를 멸균증류수에 10배씩 희석하여 LB agar 배지에 도말한 후 37℃에 하룻밤 배양하여 오염되어있는 미생물의 수를 측정하였다. 또한 RJ 및 RSP를 화장품 시료에 동량 첨가한 후 1시간동안 실온에 방치한 후 이를 도말하여 균의 수를 계수함으로서 오염균에 대한 시료의 저해활성을 측정하였다. 음성대조구로서는 화장품에 멸균 증류수를 첨가한 것을 사용하였으며, 양성 대조구로는 화장품 보존제인 0.1 M methyl paraben (methyl 4-hydroxybenzonate, in ethanol, Sigma, USA)을 화장품에 첨가한 것을 사용하였다. 저해활성은 음성대조구에서 관찰되는 미생물의 수를 100% 로 하여 첨가물에 따른 미생물의 수를 계수한 다음 백분율로 환산하였다.

통계처리

시료의 항유전 독성 효과 및 세포독성에 미치는 영향을 유의성 검증을 위해 Microsoft Excel (Microsoft U.S.A.)의 t-test를 이용하였다.

3. 실험 결과

시료의 유전독성, 항 유전독성과 세포독성

3T3 세포 주에 직접발암원인 MNNG를 처리하였을 때인 양성대조구(PC)의 WDI(weighted damage index)가 평균 204로 관찰되었고 이를 100% 손상으로 계산하여 다른 시료처리구와 비교하여 손상 정도를 환산한 결과 표 1과 같이 RJ 및 RSP의 경우 음성대조구(NC)와 거의 같은 수준의 손상효과가 관찰되어 유전독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 한편 제주무는 강한 항산화활성을 가진 것으로 보고되어 있어 항유전독성을 검토한 결과 MNNG에 RSP를 첨가한 RSM의 경우 유전독성이 100%에서 70%로 감소되는 결과를 관찰할 수 있었으며, MNNG에 RJ를 첨가한 시료 RJM의 경우 무려 43% 가량의 매우 강력한 항 유전독성을 관찰할 수 있었다. 따라서 RSP 와 RJ는 보존제 뿐 아니라 유효활성을 갖는 기능성 첨가제로서의 기능을 하는 것으로 판단된다.

샘플명	유전독성	항유전독성	항유전독성 측정
PC	100%	100%	MNNG를 PC 농도와 같이 첨가 후 RJ 첨가 MNNG를 PC 농도와 같이 첨가 후 RSP 첨가
NC	5%	5%
RJ.RJM	5% (RJ)	50% (RJM)
RSP, RSM	7%(RSP)	70%(RSM)

표 1에서 RJM은 MNNG를 PC농도와 같이 첨가한 후 RJ를 첨가한 것이고, RSM은 MNNG를 PC농도와 같이 첨가한 후 RSP를 첨가한 것이다.

또한 시료의 세포 독성 즉, 세포에 대한 안전성을 검토하기 위해 3T3 세포 주에 각각의 시료를 첨가시킨 후 세포가 괴사할 때 방출되는 LDH를 측정한 결과 도 1에서 모식한 것과 같이 10mg/ml RSP의 경우 15% 미만의 세포 독성을, 100mg/ml RJ의 경우 22% 미만의 세포독성이 관찰되었으며 그 이상의 농도에서도 ED50 값은 관찰되지 않았다. 또한 2mg/ml RSP 및 20mg/ml RJ이하에서는 세포독성이 거의 관찰되지 않았고, 0.5mg/ml RSP 및 5mg/ml RJ 이하의 농도에서는 세포독성은 관찰되지 않았고 시료와 세포를 6시간 및 12시간 반응시킨 결과 또한 위의 결과와 뚜렷한 차이가 관찰되지 않음을 확인하였다.

시료의 오염미생물에 대한 항균활성

항균활성 검증에 앞서 기능성 한방 화장품의 오염정도를 측정한 결과, 저온 (4℃)임에도 불구하고 2~4주가 지나면 표 2에 나타내는 바와 같이 많은 수의 미생물 집락이 관찰되었다.

Cosmetic sample	Storage penod	Microtial cells(cfu)/1ml of sample	Notes
C1	4 weeks	3.6×103	Bacterial containmation
C2	4 weeks	2.6×103	Bacterial containmation
C3	2 weeks	2.4×103	fungal containmation
C4	2 weeks	2.0×103	fungal containmation

4주간 보관한 화장품시료(C1, C2)의 경우 시료 1ml 당 105개 이상의 오염미생물이 검출되었으며 주로 세균집락이 관찰되었다. 또한 2주간 보관된 시료(C3, C4)의 경 우에는 주로 균사를 형성하는 진균성 집락이었으며 시료 1 ml 당 103개 이상의 오염미생물이 관찰되었다.

이에 따라 비교적 오염정도가 심한 시료 C1과 C4를 선정하여 이에 대한 RJ 및 RSP의 오염저해활성을 관찰한 결과 표 3에 나타내는 바와 같이 RJ의 경우 10 mg/ml 농도로 하여 시료와 동량 혼합하였을 때 C1에서는 저해활성이 거의 관찰되지 않았으나, C4의 경우 약 76% 가량의 항균활성을 보였다. 또한 RSP의 경우 1 mg/ml농도로서 시료와 혼합하였을 때 C1에서는 약 85% 가량의 오염균 억제효과가 있었으며 또한 C4에서도 79% 가량의 항균활성을 확인할 수 있었다.

한편 양성대조구(PC)로 사용한 메틸 파라벤(methyl paraben)의 경우에는 C1에 대해서는 약 95%, C4에는 약89% 가량의 항균활성을 보였다. RJ의 경우 항 진균활성이 강하게 관찰되었기 때문에 세균성오염이 심한 C1 시료에 활성을 보이지 못한 것으로 판단된다. 한편 RSP의 경우 그람양성인 바실러스균과 그람음성인 대장균을 지표균으로 하여 사전실험을 한 결과 별다른 활성을 보이지 않았으나, 세균성 오염이 심한 C1시료에 강한 저해 활성을 보였다.

표 3에서 NC는 음성대조구이다.

샘플명	세균 오염된 C1 화장품에서 항 미생물활성	곰팡이가 오염된 C4 화장품에서 항 미생물활성
PC	95%	80%
NC	0%	0%
RJ	5%	76%
RSP	55%	79%

첨가물에 있어서 천연 보존제는 그 부가가치가 큰 유효성분들로서 그 특성상 생물공학적 기법이 적용되기 좋은 기능성 신소재이다. 한국산 제주무 및 그 종자 유래 단백질 추출물의 보존제로서의 가능성을 조사한 결과 유효한 항균활성 및 항산화활성에 기인한 강력한 항유전독성을 관찰할 수 있었다.

또한, 세포독성이 거의 없는 것으로 관찰되어 첨가물로서의 안전성 또한 확인할 수 있었다.

이상의 실험 결과를 요약해보면, 3T3 세포 주에 직접발암원인 100 ㎍/ml MNNG를 10 ㎕씩 투여한 후 10 mg/ml 의 제주무추출물(RJ)과 1mg/ml의 종자단백질(RSP)을 10 ㎕ 씩 투여하였을 때, 각각 43% 와 30%의 항유전독성을 보였다. 또한 락토스 디하이드로나아제(lactose dehydrogenase)(LDH) 정량 분석을 이용하여, 3T3 세포주에 대한 다양한 농도의 RJ 및 RSP를 투여한 후 세포독성을 관찰 한 결과 세포독성은 관찰되지 않았다. 한편 이미 오염된 화장품에 대해 10 mg/ml의 RJ와 1 mg/ml의 RSP를 투여하였을 때, 세균성오염화장품 시료(C1)에 대해서 RSP가 85%의 항균활성을 보였으며 진균성오염화장품 시료(C4)에 대해서 RSP는 79%, RJ는 76%의 항균활성을 보였다.

고사리 열수추출물 발효액 제조

<1-1> 고사리 열수추출물 제조

본 발명자들은 고사리 열수추출물을 제조하였다.

구체적으로, 4~5월에 채취된 어린 고사리(재배: 제주시 표선)를 물 1.0 L당 고사리 1.0 kg의 비율로, 90 ℃의 물에 넣어 15분 동안 끓였다. 끓인 고사리는 건조되어 가공품으로 사용되고, 이 외에 폐부산물로 남은 고사리 열수추출액을 준비하였다. 준비된 추출액을 90 ℃로 유지하고 상기와 동일한 양의 고사리를 다시 넣어 동일하게 끓인 후, 고사리를 분리하였다. 90 ℃의 끓는 물에 고사리를 총 4회 넣었으며, 4회째 고사리를 분리한 후 최종 고사리 열수추출액을 수집하였다. 수집한 추출물을 밀폐용기에 담아 -20 ℃의 냉동실에서 보관하면서 사용하였다.또한, 고사리 열수추출물을 동결건조기(PVTFD10A, (주)일신랩, Korea)로 -70 ℃[0060] 에서 24시간 동안 냉동시키고 72시간 동안 건조시켜 분말화하였다. 평균 분말의 수율은 4.85%(취득분말무게/채취시료무게)이다. 분말화된 시료를 밀폐용기에 담아 냉동실에서 보관하면서 사용하였다.

<1-2> 발효균 선발 및 동정

본 발명자들은 쌀뜨물에서 고사리 열수추출물을 발효하기 위한 발효균을 선발 및 동정하였다.

구체적으로, 500 g의 무농약 재배 쌀(생토미, 경북울진군, 제12-3-117)을 1000 ml의 멸균수를 넣어 2회의 쌀 씻는 과정을 통해 쌀뜨물을 준비하였다. 상기 쌀뜨물을 멸균된 병에 넣고 10%의 설탕(sugar)를 첨가하여 혼합한 다음 28 ℃의 항온기에서 1000 rpm으로 7일 동안 배양하여 발효한 쌀뜨물을 제조하였다. 쌀뜨물의 발효 전 및 후의 미생물 분포를 확인하기 위해 상기 쌀뜨물 및 발효한 쌀뜨물을 TSA 배지에 도말하였으며, 그 결과, 쌀뜨물 발효 전·후에 미생물 분포가 다른 양상을 보이는 것을 확인하였다. 그 후, 상기 발효한 쌀뜨물에서, 미생물을 분리하기 위하여, 발효 쌀뜨물을 멸균수가 9 ml씩 들어간 테스트 튜브에 넣어 10^-1 내지 10^-5로 희석하였으며, 상기 희석액 중 10^-3, 10^-4, 10^-5의 희석액을 100㎕씩 추출하여 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지에 도말하여 28 ℃의 항온기에서 48시간 동안 배양하였다. TSA 배지에 자란 쌀뜨물 유래 미생물 중 육안으로 서로 다른 모양 및 색깔로 자란 콜로니를 구분한 뒤, 새로운 TSA 배지에 분주하여 단세포 분리함으로써 총 12 종류의 미생물을 분리하였다. 분리된 미생물을 PDA(potato dextros agar) 배지에서 Korea Agricultural culture Collection(KACC)에서 분양받은 잔디병원균 Pythium graminicola, Pythium ㎕timum, Rhizoctonia cerealis, Rhizoctonia solani AG-1(1A), Rhizoctonia solani AG-1(1B) 및 Rhizoctonia solani AG-2-2에 대해 대치 배양하였다.

그 결과, 항진균 효과를 보이는 세균 2종을 선발하였으며 (도 2 및 3), 상기 분리 세균의 DNA를 Ausubel 등 (1987)에 제시된 방법에 따라 추출하고 총 DNA에서 rDNA의 ITS(internal transcribe spaces) 염기서열을 universal 프라이머 38r: 5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’ 및 72f: 5’-TGC GGC TGG ATC TCC TT-3’(Gurtler and Stanisich, 2001)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 잔디병원균에 대해 항진균 효과를 나타낸 세균들은 Lactobacillus plantarums (DSM 21380) 및 Lactococcus latis (KFCC 11510P)로 동정되었다.

<1-3> 고사리 열수추출물의 발효

본 발명자들은 쌀뜨물에서 분리된 발효균 및 쌀뜨물을 이용하여 고사리 열수추출물 발효액을 제조하였다.

구체적으로, 1 내지 10%의 설탕이 함유된 고사리 열수추출물 2.0L에 쌀뜨물 500 ml을 첨가한 후, 분리한 쌀뜨물 유래 미생물 Lactobacillus plantarums 및 Lactococcus latis의 현탁액을 첨가하여 20 ℃에서 40일 동안 배양하였다. 그 결과 만들어진 고사리 열수추출물 발효액을 -70 ℃에서 24시간 동안 냉동시키고 72시간 동안 동결건조기(PVTFD10A, (주)일신랩, Korea)로 건조시켜 분말화한 뒤, 밀폐용기에 담아 냉동실에서 보관하였다.

전술한 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (2)

1. 제주무를 수세 및 분쇄한 후 여과지를 통하여 걸러진 여액을 원심분리하여 고형물을 제거하고, 이를 동결건조하여 제주무추출물을 얻는 과정; 및
   쌀뜨물에서 분리된 유산균인 Lactobacillus plantarums (DSM 21380) 및 Lactococcus latis (KFCC 11510P)의 현탁액을 혼합하여 배양하여 제조한 화장료 조성물에 보존제로서 상기한 제주무 종자 단백질 추출물을 0.5-2mg/ml의 비율로 첨가하여 상온에서 믹서로 혼합하는 과정;
   으로 이루어진 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법.
   
2. 고사리 열수추출물 발효액에 추가로 동일 비율의 녹차 열수추출물 및 편백 열수추출물을 용매로서 함유하는 것을 특징으로 하는 제주무 단백질 추출물을 이용한 천연 화장품 제조방법.