KR20210063935A - 면역활성 증강 조성물 및 이를 포함하는 건강기능식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 천연추출 복합물을 이용한 면역활성 증강 조성물, 이를 이용한 응용 제품인 건강기능식품 등에 관한 것이다.
Description
본 발명은 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 천연추출 복합물을 이용한 면역활성 증강 조성물, 이를 이용한 응용 제품인 건강기능식품, 화장품 등에 관한 것이다.
면역반응은 우리 몸을 보호하기 위한 자기 방어 기작으로 외부로부터 유입된 다양한 감염원과 알레르겐, 체내 불필요한 대사산물들을 제거 또는 무력화하는 과정을 포함하고 항상성을 유지하여 질병의 발생을 억제시키는 역할을 수행한다. 체내 면역반응은 크게 선천성 면역반응과 후천성 면역반응 두 가지로 구분되며, 각기 면역 작용을 나타내는 담당 면역세포가 다른 특징을 가지고 있다. 선천성 면역반응을 매개하는 세포로는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell), 호중구, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포와 같이 탐식작용을 담당하는 세포들이 있으며, 이 중 대식세포와 수지상 세포는 면역반응의 개시자로서 외부로부터 들어오는 항원에 가장 빠르게 대응하여 포식하는 작용을 하며, 사이토카인을 분비해 선천면역세포의 활성을 높이거나 외부로부터 유입된 항원을 면역 T 세포에 전달하여 후천면역계의 활성 유도한다고 보고되고, NK cell은 세포독성 과립을 방출하여 암세포를 직접적으로 살해 할 수 있고, IFN(interferon)-γ 와 같은 사이토카인을 분비하여 대식세포 및 T 세포를 동시에 활성화 할 수 있다. 후천성 면역반응에 관여하는 면역세포로는 T 세포 및 B 세포가 있으며, 선천성 면역반응 후 대식세포 및 수지상세포와 같은 탐식포식세포들이 제시한 특이 항원을 T 세포가 인식하면서 T 세포 및 B 세포의 활성이 일어나고, 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 사이토카인의 작용으로 후천면역반응이 증폭된다.
최근 암세포를 직접적으로 사멸시킬 수 있는 다양한 화학제제 기반의 항암제가 개발되고 있으나, 심각한 독성을 유발시키는 이유로 인하여 체내 면역을 증가시켜 암세포를 억제하는 연구들이 다양하게 수행되고 있다. 다양한 연구들이 천연물에 포함되는 천연성분을 이용하여 면역증강에 관여하는 사이토카인의 함량을 증가시키거나 암세포를 직접적으로 사멸할 수 있는 면역세포의 활성을 증가시켜 항암활성을 나타내며, 이러한 천연물은 비특이적으로 다양한 면역세포들을 자극하여 생체의 항상성을 증가시키고 질병의 유발율을 감소시킨다. 모자반목 모자반과에 속하는 갈조류인 괭생이모자반(Sargassumhorneri)은 아시아-태평양 지역에서 널리 식용으로 사용되고 있는 종으로 최근 들어 추출물 및 이차대사물들이 가지는 여러 가지 건강증진효과로 인해 우리나라에서도 점차 괭생이모자반의 건강기능성에 대한 연구가 활발해지고 있다.
현재까지의 연구에 의하면 괭생이모자반은 골다공증 방지, 항산화 및 항암효과, 헤르페스 바이러스 억제 효과 등을 가지는 것으로 보고되고 있으며, 괭생이모자반을 이용한 새로운 효과 및 응용 제품에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다.
본 발명은 괭생이모자반의 열수, 주정, 초임계 등 추출물에 대한 다양한 연구를 수행했으며, 괭생이모자반 추출물 중 특정 추출물을 특정 중량비로 혼합 사용시 비장세포 등의 세포 증식능 및 사이토카인 분비능 등 면역 증강 효능이 매우 우수함을 알게 되어 본 발명의 면역활성 증강 조성물을 완성하게 되었다.
상술한 과제를 해결하기 위한 본 발명은 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 천연추출 복합물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명 다른 목적은 상기 면역활성 증강 조성물을 포함하는 건강기능식품 등의 응용 제품을 제공하는데 있다.
본 발명의 면역활성 증강 조성물은 비장세포의 세포 증식능 및 사이토카인(IL-2, IFN-γ) 분비능이 우수할 뿐만 아니라, 비장세포의 NK 세포 및/또는 대식세포의NK 세포에 대한 높은 활성능을 갖는 바, 우수한 면역증진 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 실시한 추출 방법별 괭생이모자반 추출물이 비장세포 증식율 측정 결과 그래프이다.
도 2는 실험예 2에서 실시한 추출 방법별 괭생이모자반 추출물에 따른 마우스의 비장세포 증식율 측정 결과 그래프이다.
도 3는 실험예 2에서 실시한 추출 방법별 괭생이모자반 추출물에 따른 마우스의 사이토카인 분비능 측정 결과 그래프이다.
도 4의 A는 천연추출 복합물의 열수 추출물과 초임계 추출물 혼합비에 따른 대식세포 세포독성 측정 결과이고, B는 대식세포의 NO 분비능 측정 결과이며, C(TNF-α) 및 D(IL-6)는 대식세포의 사이토카인 분비능 측정 결과이다.
도 5는 실험예 4에서 실시한 천연추출 복합물의 비장세포의 증식능 측정 결과이다.
도 6은 실험예 4에서 실시한 천연추출 복합물의 사이토카인 분비능 측정 결과이다.
도 7은 실험예 4에서 실시한 면역 T세포 활성(CD4+ T 세포의 활성화)에 미치는 영향 평가 결과이다.
도 8은 실험예 4에서 실시한 NK 세포 활성능 측정 결과이다.
도 2는 실험예 2에서 실시한 추출 방법별 괭생이모자반 추출물에 따른 마우스의 비장세포 증식율 측정 결과 그래프이다.
도 3는 실험예 2에서 실시한 추출 방법별 괭생이모자반 추출물에 따른 마우스의 사이토카인 분비능 측정 결과 그래프이다.
도 4의 A는 천연추출 복합물의 열수 추출물과 초임계 추출물 혼합비에 따른 대식세포 세포독성 측정 결과이고, B는 대식세포의 NO 분비능 측정 결과이며, C(TNF-α) 및 D(IL-6)는 대식세포의 사이토카인 분비능 측정 결과이다.
도 5는 실험예 4에서 실시한 천연추출 복합물의 비장세포의 증식능 측정 결과이다.
도 6은 실험예 4에서 실시한 천연추출 복합물의 사이토카인 분비능 측정 결과이다.
도 7은 실험예 4에서 실시한 면역 T세포 활성(CD4+ T 세포의 활성화)에 미치는 영향 평가 결과이다.
도 8은 실험예 4에서 실시한 NK 세포 활성능 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명의 면역활성 증강 조성물은 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 천연추출 복합물을 유효성분으로 포함한다.
그리고, 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물의 혼합비율은 8.5 ~ 9.7 : 0.3 ~ 1.5 중량비, 바람직하게는 8.8 ~ 9.5 : 0.4 ~ 1.2 중량비, 더욱 바람직하게는 9.2 ~ 9.5 : 0.5 ~ 0.8 중량비일 수 있다.
상기 괭생이모자반 열수 추출물은 당업계에서 일반적으로 수행하는 열수 추출물을 수행하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 수분 함량이 10% 이하인 괭생이모자반 원물을 분쇄하여 평균입경 80 ~ 120 mm의 분말을 준비하는 1단계; 상기 분말 및 정제수를 혼합한 후, 열수 추출 공정을 수행하는 2단계; 2단계의 열수 추출물을 여과한 후 고형분 함량 18 ~ 24% 브릭스(brix)가 되도록 농축 공정을 수행하여 농축물을 제조하는 3단계; 및 분무 건조를 수행하여 괭생이모자반 열수추출물을 제조하는 4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 괭생이모자반 열수 추출물을 제조할 수 있다.
2단계의 분말 및 정제수 혼합량은 상기 분말 1 kg 당 정제수 25 ~ 35 L를, 바람직하게는 상기 분말 1 kg 당 정제수 27 ~ 32 L 정도를 혼합하는 것이 좋다.
또한, 2단계의 열수 추출 공정은 80 ~ 95℃ 하에서 3 ~ 6시간 동안, 바람직하게는 85 ~ 95℃ 하에서 3 ~ 6시간 동안 수행하는 것이 좋은데, 이때, 열수 추출 온도가 80℃ 미만이면 추출 수율이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 95℃를 초과하면 추출물의 색 변화 문제가 있을 수 있으므로, 상기 온도 하에서 열수 추출 공정을 수행하는 것이 좋다. 또한, 열수 추출 공정 시간이 3 시간 미만이면 추출 수율이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 6시간을 초과하면 유효 성분의 정제도가 낮아지는 문제가 있을 수 있다.
3단계의 농축 공정의 바람직한 일 실시예를 들면, 2단계에서 수득한 열수 추출물을 50 ~ 60 μm의 백필터(bag filter)로 여과 후, 원심박막농축기 (evaporator, CEP-LABO, Okawahara, Japan)를 이용하여, 고형분 함량 18 ~ 24% 브릭스(brix), 바람직하게는 고형분 함량 18.5 ~ 22.0%인 농축물을 제조할 수 있다.
4단계의 분무 건조는 당업계에 수행하는 일반적인 분무 건조 방법으로 수행할 수 있으며, 그 방법, 조건을 특별하게 한정하지는 않는다.
다음으로, 상기 괭생이모자반 초임계 추출물은 수분 함량이 10% 이하인 괭생이모자반 원물을 분쇄하여 평균입경 5 mm이하의 분말을 준비하는 1단계; 상기 분말을 초임계 추출 공정을 수행하여 초임계 추출물을 수득하는 2단계; 및 상기 초임계 추출물을 감압 농축시켜서 농축물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.
2단계의 상기 초임계 추출 공정은 350 ~ 450 bar의 압력 조건 및45 ~ 60℃의 온도 조건에서 4 ~ 5시간 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게는 370 ~ 420 bar의 압력 조건 및45 ~ 55℃의 온도 조건에서 4 ~ 5시간 동안 수행할 수 있으며, 이때, 압력 조건이 상기 범위를 벗어나면 유효성분의 함량, 추출물의 색 변화에 문제가 있을 수 있고, 온도 조건이 상기 범위를 벗어나면 추출 수율 및 유효 성분의 함량 변화에 문제가 있을 수 있다.
그리고, 초임계 추출 공정시 용매로는 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 사용하고, 보조용매로는 발효주정을 사용할 수 있으며, 상기 용매는 2.5 ~ 3.5 L/분의 유량으로, 바람직하게는 2.7 ~ 3.2 L/분의 유량으로 공급하고, 상기 보조용매는 0.2 ~ 0.4 L/분의 유량, 바람직하게는 0.25 ~ 0.35 L/분으로 공급하면서 수행하는 것이 좋다.
3단계의 초임계 추출물의 감압 농축은 당업계의 일반적인 감압 농축 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직한 일례를 들면, 회전식 감압농축기 (Rotary evaporator, HS-20SP, Hahnshin S&T, Korea)를 이용, 50°C에서 발효주정이 함유된 추출물을 완전 농축하여 농축물 형태의 최종 괭생이모자반 초임계 추출물을 수득할 수 있다.
이러한, 본 발명의 면역활성 증강 조성물은 비장세포의 세포 증식능 및 사이토카인(IL-2, IFN-γ) 분비능을 향상시키고, 비장세포의 NK 세포 및/또는 대식세포의 NK 세포에 대한 높은 활성능을 갖는 바, 우수한 면역증진 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 면역활성 증강 조성물은 건강기능식품 등으로 적용되어 다양한 응용 제품에 적용될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이며, 하기 실시예에서 의해 본 발명의 권리범위를 한정하여 해석해서는 안 된다.
[실시예]
준비예 1: 괭생이모자반 열수 추출물(HWE)의 제조.
괭생이모자반은 전라남도 완도 일대에서 수거한 후 정수를 이용하여 침지 세척 및 자숙의 탈염과정을 거친 후 건조하여 수분함량이 10% 이하로 1차 가공된 건조 원물을 상온 보관한 것을 사용하였다.
상기 괭생이모자반 원물을 100 mm 수준으로 분쇄한 다음, 시료 1 kg에 원물대비 30배에 상당한 정제수 30 L를 가하여 온도 90℃에서 4시간 동안 추출하였다. 이후 55 μm의 백필터 (bag filter) 여과 후 원심박막농축기 (evaporator, CEP-LABO, Okawahara, Japan)를 이용하여 고형분 함량 20%brix가 되도록 농축하였고, 분무건조 (spray dryer, HKC-100-DJ, Niro, Denmark)한 것을 괭생이모자반 열수추출물 (HWE)를 제조하였다.
준비예 2: 괭생이모자반 주정 추출물(EE)의 제조
괭생이모자반의 주정 추출물을 제조하기 위하여 50% 발효주정을 용매로 하여, 상기 준비예 1의 팽생이 모자반 원물(시료) 1 kg에 용매 20 L를 가하여 4시간 동안 침지시켰다. 침지 후 55 μm의 백필터 (bag filter)여과 후 회전식 감압농축기 (Rotary evaporator, HS-20SP, Hahnshin S&T, Kim-po, Korea)를 이용, 80°C에서 농축물의 부피가 3L가 될 때까지 감압 농축한 후, 영하 80℃ 이하에 동결건조(freeze dryer, OPR-FDT-8650, Operon, Gyeonggi, Korea)하여 괭생이모자반 주정 추출물 (EE)을 제조하였다.
준비예 3: 괭생이모자반 초임계 추출물(SFE)의 제조
괭생이모자반 초임계 추출물을 제조하기 위하여, 용매는 이산화탄소로서 임계압력 73.76 bar과 임계온도 30.95℃ 이상으로 액체와 기체의 확산계수와 점도, 밀도와 같은 물리화학적 특성을 모두 갖춘 초임계 이산화탄소 (supercritical carbon dioxide, Sc-CO2)를 사용하였고 보조용매는 발효주정 (fermentation ethanol)을 사용하였다. 상기 준비예 1의 건조된 괭생이모자반 원물 60 kg을 2 mm의 입자 크기로 분쇄한 후, 400 bar의 압력과 50℃ 온도로 설정하고 추출 보조용매로서 발효주정을 투입하였다. 그리고, 이산화탄소와 보조용매의 공급은 각각 3 L/min과 0.3 L/min의 유량으로 설정하였다.
발효주정 주입 완료 후 120분 동안 이산화탄소만을 공급하여 400 bar의 압력을 일정하게 유지하여 총 4시간 30분 동안의 초임계 추출 공정을 통해 추출물을 수득하였다. 이후 회전식 감압농축기 (Rotary evaporator, HS-20SP, Hahnshin S&T, Korea)를 이용, 50℃에서 발효주정이 함유된 추출물을 완전 농축하여 최종 괭생이모자반 초임계 추출물 (SFE)로 사용하였다.
이하에서 실험예 1 ~ 4에서 실시된 비장세포 증식율, 사이토카인 분비능 측정은 하기 방법에 의해 측정하였다.
(1) 비장세포 분리
경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 10%의 소태아혈청과 항생제 페니실린과 스트렙토마이신 (100 unit/mL, 100 μg/mL)을 함유한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 배지로 3회 세척한 후 조직균질기 (tissue grinder, Corning Costar, Corning, NY, USA)로 균질화하여 비장세포를 유리시켰다. 세포현탁액에 적혈구를 제거하기 위하여 RBC 용해 버퍼((red blood cell lysis buffer, Invitrogen Co., USA)를 첨가하여 적혈구를 제거하였고, 혈구계수기를 이용하여 비장세포를 계수하였다.
(2) 비장세포 증식능 측정
96 well plate에 well당 1×106 개의 비장세포를 분주한 후, 미토겐(mitogen)을 처리 또는 무처리한 그룹으로 나누어, 미토겐(mitogen) 무처리구에는 PBS를 처리하였고, mitogen 처리구에는 CON A(concanavalin A) 또는 LPS(lipopolysaccharide)를 1 μg/mL의 농도로 처리하였고 24 시간 후, WST-1 (Daeil Lap Science, Seoul, Korea) 용액을 각각의 well에 10 μL씩 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 세포 증식능을 평가하였다. 세포 증식능의 평가는 시료 대신 PBS(phosphate buffered saline, Invitrogen Co., USA)를 투여한 대조구 대비 %로 증감을 나타내었다.
(3) 실험동물 및 시료투여
암컷 BALB/c 마우스(6주령, 체중 15∼18 g)를 오리엔트바이오 (Seoul, Korea)로부터 구입하여 7일간 순화시킨 후, 사육실의 온도는 23±2℃, 상대습도 50±5%, 명암주기는 12시간으로 일정하게 유지하였다. 본 연구에 사용된 동물실험은 경기도 경제과학진흥원 내 경기바이오센터 동물실험윤리위원회의 승인(GBSA 2018-05-004) 후 수행하였다.
1주간의 순화를 마친 BALB/C 마우스를 7마리씩 총 7군으로 나누어, 대조구에는 PBS를 투여하였고, HWE군은 괭생이모자반 열수추출물을 50, 100 mg/kg body weight(BW)의 농도로 투여하였고, EE군은 괭생이모자반 주정 추출물을 50, 100 mg/kg BW의 농도로 투여하였고, SFE군은 괭생이모자반 초임 계추출물을 50, 100 mg/kg BW의 농도로 투여하였다. 모든 실험구의 시료투여는 1일 1회 동일 시간에 반복적으로 14일 동안 진행되었다. 마지막 투여 후 모든 그룹을 12시간 동안 절식시키고, 비장적출을 실시하였다. 적출된 비장으로부터 비장세포를 유리하여, 비장세포 증식능과 사이토카인 분비능을 분석하였다.
(4) 활성화된 CD4
+
T 세포 분석
CD4+ T 세포의 활성도를 측정하기 위하여 분리된 비장세포에 PerCP-Cy5.5-conjugated anti-mouse CD4, PE-Cy7-conjugated anti-CD25 (BD Bioscience)를 tube 당 1 μg의 농도로 처리하였고, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 1 mL의 PBS를 넣어 3회 세척한 후, 유세포 분석기(flow cytometry, Cytomics FC500, Beckman, Miamin, FL, USA)로 CD4+ T 세포의 활성도를 측정하였다.
(5) NK(Natural killer) 세포 활성 측정
분리된 비장세포 내 NK 세포를 분리하기 위하여 MACS(Magnetic activated cell sorting, Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)을 이용하여 MS column을 통과하는 세포를 negative selection 하였으며, 분리된 NK 세포를 유세포 분석기 (Novios, Beckman Coulter, Miami, FL)를 이용하여 CD3- NK1.1+세포의 분포가 80%이상임을 확인하였다. 분리된 NK 세포를 이용하여 세포용해 활성도 분석용 YAC-1의 세포와 함께 작동세포(effector cell):표적세포(target cell) (E:T)의 비율을 20:1, 10:1, 5:1, 1:1로 96 well plate에 18시간 동안 함께 반응 시킨 후 EZ-LDH kit(Daeil Lap Science, Korea)를 이용하여 세포의 용해능을 450 nm 파장에서 측정하였으며, 실험에 사용한 target cell의 세포수는 4.5×104로 고정하여 실험을 진행하였다.
(6) 통계처리
이하 실험에서 얻어진 결과는 SPSS(Statistical package for social sciences, 10.0, IBM, Chicago, IL, USA) 소프트웨어(software)를 이용하여 평균(mean)±표준편차 (SD)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계적 유의성은 Student's two tailed t-test 로 *p < 0.05, **p<0.01및 ***p < 0.001 수준에서 비교하였다.
실험예 1 : 추출 방법별 괭생이모자반 추출물이 비장세포 증식율 및 사이토카인 분비능에 미치는 영향 평가
체내에서 비장(spleen)은 혈액에서 유래되는 항원에 대한 주된 보호 면역 반응을 담당하는 장기로 B 및 T 림프구의 성숙과 항원의 자극에 의한 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림프 기관이다. 따라서 비장세포의 증식은 면역시스템에서 매우 중요한 의미를 갖는다22. 특히 비장 세포는 면역 반응과 밀접한 관련을 나타내며, 그 크기나 수가 직접적인 지표로 이용될 수 있어 대표적인 면역지표로 사용된다. 따라서, 괭생이모자반 추출방법별 추출물의 비장세포 증식율 및 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 BALB/C 마우스로부터 비장을 적출하고 유리된 비장세포에 준비예 1의 괭생이모자반 열수 추출물(HWE), 준비예 2의 괭생이모자반 주정 추출물(EE), 준비예 3의 괭생이모자반 초임계 추출물(SFE)를 각각 처리하여 비장세포 증식율 및 사이토카인 분비능을 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
추출 방법별 괭생이모자반 추출물을 농도(3.125 μg/ml, 6.25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 25 μg/ml 및 50 μg/ml)별로 처리한 결과, 모든 추출물 처리구에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, HWE(준비예 1) 및 EE(준비예 2) 처리구에서 비장세포의 증식능이 유의적으로(P < 0.05) 증가하는 것으로 나타났다(도 1의 A 참조).
또한, 사이토카인(IL-2 및 IFN-γ) 분비능에 관하여 관찰한 결과, 비장세포 증식능의 결과와 유사하게 HWE 및 EE 처리구에서 IL-2 및 IFN-γ의 분비능이 처리 농도 의존적으로 유의적으로(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001) 증가하는 것으로 나타났다(도 1의 B, C 참조).
반면, SFE 처리구의 비장세포 증식능 및 사이토카인 분비 유도능이 관찰되지 않았다.
실험예 2 : 추출 방법별 괭생이모자반 추출물 섭취 마우스의 비장세포 증식율 및 사이토카인 분비능
추출 방법별 괭생이모자반 추출물의 투여가 마우스의 면역활성에 미치는 영향에 관하여 관찰하기 위하여, 추출방법 (HWE, EE, SFE)별 추출물을 50, 100 mg/kg BW로 1일 1회 14일간 투여하고, 투여된 마우스의 비장을 적출하여 비장에서 유래된 비장세포의 증식능 및 사이토카인 분비능에 관하여 관찰하였다.
미토겐(Mitogen)은 특정 면역세포를 자극하여 면역세포를 활성을 촉진 시켜주는 물질을 총칭하고, 이러한 mitogen은 세포의 종류에 따라 다양하게 존재한다. 비장세포 실험에서 대표적으로 사용하는 mitogen으로써 CON A(concanavalin A)와 LPS(lipopolysaccharide)를 들 수 있는데, CON A는 T 세포를 자극하여 세포증식을 유도하고 사이토카인의 분비를 증가시키며, LPS는 B 세포를 자극하여 세포활성을 유도시킨다. 따라서 이러한 mitogen의 병용처리는 시료처리에 대한 세포의 민감성을 증가시켜 세포활성 여부의 판단을 용이하게 해 줄 수 있다.
괭생이모자반 투여 마우스로부터 분리된 비장세포의 증식능에 관하여 알아본 결과, mitogen 무처리구, mitogen CON A 처리구, mitogen LPS 처리구에서 HWE 및 SFE 처리구에서 비장세포 증식능이 유의적으로 증가되는 것으로 나타났으며, EE 처리구에서는 비장세포 증식능의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다(도 2 참조).
또한, 비장세포 배양 상등액에서 사이토카인의 분비능에 관하여 관찰한 결과, 비장세포의 증식능 결과와 유사하게 mitogen 무처리구와 mitogen CON A 처리구에서 HWE 및 SFE 처리구에서 IL-2와 IFN-γ의 분비가 유의적으로 증가되는 것으로 나타났으며, EE 처리구에서는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(도 3).
이상의 결과로 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 괭생이모자반 추출물인 준비예 1의 열수 추출물(HWE) 및 준비예 3의 초임계 추출물(SFE)이 면역증강 효과에 있는 것으로 확인하였다.
실시예 1 ~ 4 : 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물의 천연추출 복합물의 제조
준비예 1의 열수 추출물(HWE) 및 준비예 3의 초임계 추출물(SFE)을 혼합하여 천연추출 복합물을 제조하되, HWE 및 SFE를 9.5 : 0.5 중량비(실시예 1), 9 : 1 중량비(실시예 2), 8.5 : 1.5 중량비(실시예 3) 및 8 : 2 중량비(실시예 4)로 각각 혼합하여 천연추출 복합물을 각각 제조하였다.
실험예 3: 천연추출 복합물의 대식세포 세포독성 및 NO 분비능과 사이토카인 분비능 평가 실험
실시예 1 ~ 4에서 제조한 천연추출 복합물의 대식세포 활성 및 NO 분비능에 관하여 관찰하였으며, 사용된 대식세포 및 방법은 하기와 같다.
(1) 대식세포 배양
한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 RAW264.7 마우스 대식세포를 분양 받아 100 unit/mL 의 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin), 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium ; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양한 후, 이를 사용하였다.
.
(2) 대식세포 세포독성 측정 방법 및 측정 결과
96 well plate에 RAW264.7 세포를 2×104 cell/well로 분주한 후, 37oC,5% CO2 배양기(incubator)에 12시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착시키고, PBS에 희석된 HWE + SFE(5, 10, 15 및 20 중량%) 추출물(실시예 1 ~ 4)을 각각 6.25μg/mL, 12.5μg/mL, 25 μg/mL및 50 μg/mL의 농도로 처리하였고, 양성대조군인 LPS (Sigma-Aldrich) 또한 1 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, Well당 20 μL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide; thiazolyl blue (MTT; Sigma-Aldrich) MTT 용액 (1 mg/mL)을 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다.
MTT 시약의 첨가로 생긴 포르마잔(formazan)을 녹이기 위해서 DMSO (Sigma-Aldrich)를 100 μL씩 첨가하고, 1시간 후 micro-plate reader (Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Control (PBS only)의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
RAW264.7 대식세포에서 각각 혼합 비율별 세포독성을 농도(6.25, 12.5, 25 및 50 μg/mL)별 평가한 결과, 모든 처리구에서 세포독성은 나타나지 않았으며, HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%로 혼합한 추출물 처리구(실시예 1, 실시예 2, 실시예 3)에서 세포 증식능이 처리농도 의존적으로 증가되는 것으로 관찰되었다(도 4의 A). 반면 HWE에 SFE를 20 중량% 혼합한 추출물 처리구(실시예 4)에서는 증식능의 유의적인 증가가 관찰되지 않았다.
(3) 대식세포 NO 및 사이토카인 분비능 측정 방법 및 측정 결과
48 well plate에 RAW264.7 대식세포를 5×104 cell/well로 분주한 후, HWE와 SFE 혼합물(실시예 1 ~ 4)을 처리하였고, 24시간 배양 후 분리된 배양 상등액 100 μL에 동량의 그리스(Griess, Sigma-Aldrich) 시약을 처리하여 10분 동안 암실에서 반응시킨 후, micro-plate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NO의 농도는 NaNO2(sodium nitrite, Sigma-Aldrich)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.
또한, 배양 상등액 내 사이토카인 (TNF-α 및 IL-6)의 함량은 ELISA kit (eBioscience Co., San Diege, CA, USA)을 사용하여 측정하였으며, 이때 사이토카인의 농도는 키트(kit)에 포함되어 있는 표준용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.
천연추출 복합물에 대한 대식세포의 NO 분비능에 관하여 관찰한 결과, 모든 천연추출 복합물 처리구에서 처리 농도 의존적으로 NO 분비능이 증가하는 것으로 관찰되었으며, HWE에 SFE를 20 중량% 혼합한 추출물 처리구(실시예 4)에서는 그 증가폭이 감소하는 것으로 나타났다(도 4의 B).
또한, HWE와 SFE추출물을 혼합 비율별 6.25, 12.5, 25 및 50 μg/mL의 농도로 처리하여 TNF-α 및 IL-6의 분비량에 관하여 관찰한 결과, 모든 처리구에서 TNF-α의 분비량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 HWE에 SFE를 5 중량%, 10% 혼합한 추출물 처리구(실시예 1, 실시예 2)에서 증가폭이 가장 높게 나타나는 것으로 관찰되었다(도 4의 C).
그리고, IL-6 결과 또한 TNF-α의 분비량과 유사하게 HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량% 혼합한 추출물 처리구(실시예 1, 실시예 2)에서 가장 높은 분비량이 관찰되었다(도 4의 D).
종합적으로, HWE에 SFE를 5 중량%와 10 중량% 혼합한 추출물 처리구(실시예 1, 실시예 2)가 대식세포 활성화 효과가 가장 높은 것으로 관찰되어 최적 혼합비율로 판단되었으며, 이를 증명하기 위하여 동물실험을 수행하였다.
실험예 4 : 천연추출 복합물의 최적 배합비 투여가 면역활성에 미치는 영향
HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%로 혼합한 천연추출 복합물을 100 mg/kg BW로 1일 1회 14일간 투여하고, 투여된 마우스의 비장을 적출하여 비장에서 유래된 비장세포의 증식능 및 사이토카인 분비능에 관하여 관찰하였다.
1주간의 순화를 마친 BALB/C 마우스를 7마리씩 총 7군으로 나누어, 대조구에는 PBS를 투여하였고, HWE에 SFE 추출물이 5 중량%(HWE:SFE=9.5:0.5 중량비), 10 중량%(HWE:SFE=9.0:1.0 중량비), 20 중량%(HWE:SFE=8.0:2.0 중량비)로 혼합된 천연추출 복합물을 50 mg/kg, 100 mg/kg BW의 농도로 투여하였다. 모든 실험구의 시료투여는 1일 1회 동일 시간에 반복적으로 14일 동안 진행하였다. 마지막 투여 후 모든 그룹을 12시간 동안 절식시키고, 비장적출을 실시하였다.
그리고, 적출된 비장으로부터 비장세포를 유리하여, 비장세포 증식능, 사이토카인 분비능 및 CD4+ T의 활성도 분석을 실시하였다.
또한, HWE, SFE의 최적 혼합비가 NK세포 활성능에 미치는 영향에 관하여 알아보기 위하여, 1주간의 순화를 마친 BALB/C 마우스를 7마리씩 총 2군으로 나누어 대조구에는 PBS를 투여하였고, 실험구에는 HWE:SFE=9.5:0.5 (SFE 5%)로 혼합된 시료를 100 mg/kg BW로 2주간 경구 투여 투여하였다. 모든 실험구의 시료투여는 1일 1회 동일 시간에 반복적으로 14일 동안 진행되었다. 마지막 투여 후 모든 그룹을 12시간 동안 절식시키고, 비장적출을 실시하였다. 적출된 비장으로부터 성숙한 NK 세포를 분리하였고, NK세포 활성능 평가에 이용하였다.
(1) 비장세포의 증식능 측정 결과
HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%로 혼합한 천연추출 복합물을 투여한 마우스의 비장에서 분리된 비장세포의 증식능에 관하여 평가한 결과, mitogen 무처리구, mitogen CON A 처리구, mitogen LPS 처리구에서 HWE에 SFE를 5 중량% 및 10 중량%로 혼합한 천연추출 복합물 투여 시 유의적으로 가장 높은 비장세포 증식능이 관찰되었으며, HWE에 SFE가 20 중량%로 혼합된 천연추출 복합물 투여구에서는 5 중량%, 10 중량% 첨가구와 비교하였을 때 감소하는 경향을 나타내었다 (도 5).
(2) 사이토카인(IL-2, IFN-γ) 분비능 측정 결과
비장 세포 배양 상등액에서 사이토카인(IL-2, IFN-γ)의 분비량에 관하여 관찰한 결과, mitogen 무처리구에서 HWE 투여군, HWE에 SFE를 5% 및 10%로 혼합한 추출혼합물 투여 시 유의적으로 높은 IL-2와 IFN-γ의 분비량이 관찰되었다 (도 6).
Mitogen CON A 처리구에서는 mitogen 처리에 의해 IL-2와 IFN-γ의 분비량이 전반적으로 높아지는 것으로 관찰되었고, 투여군간의 비교에서 대조구(CTRL)에 비해 HWE 투여군, HWE에 SFE를 5% 및 10% 혼합한 투여구에서 IL-2와 IFN-γ의 분비량이 증가되는 것으로 관찰되었으며 HWE에 SFE를 5 중량%로 혼합한 천연추출 복합물 투여구에서 가장 높게 증가 되는 것으로 관찰되었다.
(3) 면역 T 세포의 활성에 미치는 영향 평가
다양한 면역세포구들은 세포 표면에 가지고 있는 표면 분자구조에 따라 서로를 구분하며, 이러한 구분은 분화집단 (CD)이라는 표현형을 사용한다. CD는 활성화된 T 세포의 분열을 촉진시키는 항원제시 세포로서의 역할시 필수적으로 요구되는 세포막 단백질로 세포의 활성화와 관련하여 중요한 지표로 이용된다. 일반적으로 T 세포의 분화집단은 CD3로 표현되며, 주로 사이토카인을 생산하는 역할을 하는 CD4와 세포독성 T세포인 CD8으로 분류된다. T 세포 각각의 분화집단들의 활성화 여부는, 분화와 관련된 사이토카인인 IL-2의 CD25(receptor alpha chain)의 발현으로 확인할 수 있다.
상기 괭생이모자반 추출물의 최적 배합비 투여 결과에서 비장세포의 사이토카인 분비를 증가시키는 것으로 관찰되어, 추출물의 투여가 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포의 활성화에 미치는 영향에 관하여 관찰하였다.
HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%로 혼합한 천연추출 복합물을 투여한 마우스의 비장에서 분리된 비장세포의 CD4 T 세포의 활성화에 관하여 평가한 결과, 대조구와 비교하여 HWE 처리구 및 HWE/SFE 혼합 처리구에서 CD4+/CD25+의 발현이 높게 나타나는 것으로 관찰되었고, HWE와 HWE에 SFE를 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량% 혼합하여 제조한 추출물 처리구를 비교하였을 때, HWE 단독구에 비해 HWE에 SFE를 5 중량% 혼합하여 제조한 추출물 처리구(실시예 1)에서 유의적으로 발현이 증가되는 것으로 관찰되었다 (도 7).
따라서 HWE 처리구 및 HWE/SFE 혼합처리구의 투여는 비장세포의 CD4 T세포를 활성화시켜 사이토카인의 분비를 유도 시키는 것으로 사료되며, 사이토카인 분비 유도에 관여하는 천연추출 복합물의 최적 배합비는 HWE에 SFE를 5%를 첨가한 것이 가장 우수한 결과를 보였다.
(4) NK 세포 활성에 미치는 영향 평가
비장세포 증식능, 사이토카인 분비능 및 CD4 T 세포 활성능을 통하여 결정된 천연추출 복합물의 최적비(HWE에 SFE를 5 중량%를 첨가한 것, HWE:SFE=9.5:0.5 중량비)의 NK세포 활성능을 평가하기 위하여, HWE에 SFE를 5 중량%로 혼합한 실시예 1의 천연추출 복합물을 100 mg/kg BW로 1일 1회 14일간 투여하고, 투여된 마우스의 비장을 적출하여 비장세포 내 성숙한 NK 세포를 분리하였고, 분리된 NK 세포(Effector cell)에 암세포(Target cell; Yac-1)를 혼합하여 NK 세포 활성을 평가하였다.
비장에서 분리된 NK 세포에 암세포를 비율(1:1, 5:1, 10:1, 20:1)별로 처리하여 암세포를 사멸하는 NK 세포의 활성능을 측정한 결과, effector cell의 농도 의존적으로 NK 세포 활성능이 증가하는 것으로 나타났다(도 8). 가장 높은 NK 세포 활성능은 Effector cell:Target의 비율이 20:1에서 나타났으며, 대조구와 괭생이모자반 최적 배합비 투여군 간의 효능을 비교하였을 때 모든 비율 처리구 (1:1, 5:1, 10:1, 20:1)에서 괭생이모자반 추출물의 NK 세포 활성능이 유의적으로 높게 나타나는 것으로 관찰되었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 천연추출 복합물의 면역활성 증가 효과가 우수함을 확인할 수 있었으며, 이러한 본 발명의 천연추출 복합물을 건강기능식품 등 다양한 응용 제품을 제조할 수 있다.
Claims (6)
- 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 혼합한 괭생이모자반 천연추출 복합물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 괭생이모자반 천연추출 복합물은 괭생이모자반 열수 추출물 및 괭생이모자반 초임계 추출물을 8.5 ~ 9.7 : 0.3 ~ 1.5 중량비를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 괭생이모자반 열수 추출물은
수분함량이 10% 이하인 괭생이모자반 원물을 분쇄하여 평균입경 80 ~ 120 mm의 분말을 준비하는 1단계;
상기 분말 1 kg 당 정제수25 ~ 35 L를 혼합한 후, 80 ~ 95℃ 하에서 3 ~ 6시간 동안 열수 추출 공정을 수행하는 2단계;
2단계의 열수 추출물을 여과한 후 고형분 함량 18 ~ 24% 브릭스(brix)가 되도록 농축 공정을 수행하여 농축물을 제조하는 3단계; 및
분무건조를 수행하여 괭생이모자반 열수추출물을 제조하는 4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 면역활성 증강 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 괭생이모자반 초임계 추출물은
수분 함량이 10% 이하인 괭생이모자반 원물을 분쇄하여 평균입경 5 mm이하의 분말을 준비하는 1단계;
상기 분말을 초임계 추출 공정을 수행하여 초임계 추출물을 수득하는 2단계; 및
상기 초임계 추출물을 감압 농축시켜서 농축물을 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것이며,
상기 초임계 추출 공정은 350 ~ 450 bar의 압력 조건 및45 ~ 60℃의 온도 조건에서 4 ~ 5시간 동안 수행하고, 용매로는 초임계 이산화탄소(supercritical carbon dioxide)를 사용하고, 보조용매로는 발효 주정을 사용하며, 상기 용매는 2.5 ~ 3.5 L/분의 유량으로 공급하고, 상기 보조용매는 0.2 ~ 0.4 L/분의 유량으로 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 비장세포의 증식능 및 비장세포의 사이토카인 분비능 및 NK 세포 활성능을 증대시키는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중에서 선택된 어느 한 항의 면역활성 증강 조성물을 포함하는 건강기능식품.
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| KR20190043317A (ko) | 2017-10-18 | 2019-04-26 | 전남대학교산학협력단 | 괭생이모자반 추출물을 이용한 아토피 피부염 개선용 조성물 |
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2019
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20190043317A (ko) | 2017-10-18 | 2019-04-26 | 전남대학교산학협력단 | 괭생이모자반 추출물을 이용한 아토피 피부염 개선용 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kalahe Hewage Iresha Nadeeka Madushani Herath, et al., Biomed Pharmacother. 2019 Feb* * |
| 김동섭, et al., J Nutr Health. 2018 Dec* * |
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| KR102302936B1 (ko) | 2021-09-16 |
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