KR20210050674A - 종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 - Google Patents

종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법 Download PDF

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Abstract

종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법이 개시된다. 본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스는 메틸렌블루를 이용하여 타겟 유전자의 존재유무 또는 생물시료 내의 세포의 생사여부를 신속하게 판독할 수 있다. 따라서 매우 간단한 방식으로 스크리닝이 가능하다. 또한 샘플의 이동이 각 패드의 폴딩 동작에 의해 이루어지도록 하여 시료 이송을 위한 별도의 복잡한 구성(밸브, 펌프 등)이 요구되지 않을 뿐더러 루프-매개 등온증폭을 기반으로 하므로 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략하게 구성 가능하다. 또한 제1 기재 및 제2 기재를 종이 소재를 이용하여 제작함으로써 사용 후 폐기 또는 처리가 간단해 지므로, 1회용 현장진단 키트로 사용 가능하다.

Description

종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법{PAPER TYPED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MICRODEVICE FOR DETECTION OF PATHOGENS AND METHOD THE SAME}
본 발명은 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종이 타입의 등온 증폭을 위한 마이크로 디바이스 및 이를 이용한 병원균 검출방법에 관한 것이다.
현장진단(point-of-care testing) 기술의 발전은 자원이 부족한 환경에서 전염병 등의 신속한 현장 모니터링을 용이하게 만들고 있다. 특히 현장진단 기술에서 핵산 증폭 검사(NAAT: Nucleic acid amplification testing)는 식품 매개 병원균(foodborne pathogens)의 증가하는 발생률을 통제하고 모니터링하기 위한 방법으로 잘 알려져 있다. 본 기술은 다양한 등온 증폭 기술을 포함하는데, 예컨대 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence-based amplification), 루프-매개 등온 증폭법(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 재조합효소-중합효소 증폭법(RPA: recombinase polymerase amplification), 가닥 치환 증폭법(strand displacement amplification), 롤링 서클 증폭법(rolling circle amplification), 헬리카제-의존형 증폭법(helicase-dependent amplification) 등이 있다.
이 중 LAMP는 비교적 저온에서 수행되는 NASBA와 비교할 때 탁월한 특이성을 나타낼 수 있고, 억제제(inhibitors)에 대한 내성에 높은 민감도를 보인다. 또한 RCA와 같은 추가 과정이 필요하거나 RPA와 같은 여러 효소가 요구되지 않는다. 나아가 타겟 카피(target copy)가 109까지 축적되므로 온-칩 검출을 위한 마이크로유체 디바이스와의 통합에 이상적이라는 장점이 있다. LAMP 기술의 장점을 감안하여 식품 매개 병원균의 검출을 위한 통합 마이크로디바이스들이 연구개발되는 이유다.
한편 최근에는 종이 기반의 통합 마이크로디바이스에 대한 연구개발도 활발히 이루어지고 있다. 종이는 생분해성이라 친환경적이고 비용 효율적일 뿐만 아니라 유연성도 있기 때문이다. 또한 최근 몇몇 국가에서 플라스틱 사용 규제 움직임이 있는데 이러한 측면에서도 종이의 사용은 매력적이다. 나아가 종이 멤브레인의 높은 다공성과 다른 기공 크기와 같은 특성들은 샘플 유체가 불연속 영역으로 이동하는 것을 용이하게 하므로(모세관력), 유체 이동을 위한 기존의 펌프 시스템이 요구되지 않는다는 점에서 효율적이다.
한국공개특허 제10-2017-0078456호(2017.7.7 공개)
본 발명은 LAMP 반응에서 DNA 증폭물 검출을 위하여 메틸렌블루(MB:Methylene Blue) 염료를 이용함으로써 매우 간단한 방식으로 신속하게 병원균의 존재 여부를 육안으로 확인할 수 있고, 종이 타입으로 형성되어 현장진단(POC:point-of-care)에 적합한 마이크로 디바이스를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 중앙에 중앙챔버가 형성되고 주변에는 복수의 주변챔버가 형성되어 중앙챔버와 각 주변챔버가 마이크로채널로 연통되며, 각 주변챔버에는 관통홀이 형성되는 제1 기재; 접힘선에 의해 복수의 영역이 구획되고, 정제 패드, 반응 패드, 검출 패드가 순서대로 각 영역에 일렬로 배치되는 것으로, 각 패드는 접힘선을 따라 내외측으로 폴딩 가능하게 형성되는 제2 기재; 및 제1 기재 및 제2 기재의 정제 패드 하부면에 일체로 부착되어 제1 기재와 제2 기재를 결합시키는 실링 필름을 포함하고, 분석 대상을 포함하는 샘플이 상기 중앙챔버로 도입되면 주변챔버로 이동되고 상기 접힘선에 의한 패드의 폴딩 동작에 의해 상기 샘플이 정제 패드를 거쳐 반응 패드로 이동하여 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)이 수행되며, 검출 패드가 폴딩 동작에 의해 반응 패드에 접촉함으로써 검출 패드를 통해 타겟 유전자의 존재 유무 또는 샘플 내 세포의 생사여부를 검출하는 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상술한 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법이고, a) 제1 기재를 정제 패드 쪽으로 폴딩시키고 샘플을 도입시키는 단계; b) 샘플이 제1 기재를 거쳐 제2 기재의 정제 패드로 이동하여 정제되는 단계; c) 정제 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 샘플을 반응 패드로 이동시킨 후, 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; d) 반응 패드에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 포함하는 용액을 도입시키는 단계; e) 검출 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 검출 패드의 색 변화를 통해 타겟 유전자의 존재 유무 또는 샘플 내 세포의 생사여부를 육안 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; LAMP 생성물에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 첨가하는 단계; 및 메틸렌블루(Methylene Blue)를 첨가하고 변색을 확인하여 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 마이크로 디바이스는 메틸렌블루를 이용하여 타겟 유전자의 존재유무 또는 생물시료 내의 세포의 생사여부를 신속하게 판독할 수 있다. 따라서 매우 간단한 방식으로 스크리닝이 가능하다.
또한 샘플의 이동이 각 패드의 폴딩 동작에 의해 이루어지도록 하여 시료 이송을 위한 별도의 복잡한 구성(밸브, 펌프 등)이 요구되지 않을 뿐더러 루프-매개 등온증폭을 기반으로 하므로 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략하게 구성 가능하다.
또한 제1 기재 및 제2 기재를 종이 소재를 이용하여 제작함으로써 사용 후 폐기 또는 처리가 간단해 지므로, 1회용 현장진단 키트로 사용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스를 개략적으로 도시한다.
도 2는 도 1의 마이크로 디바이스에서 제1 기재의 제조 과정을 개략적으로 도시한다.
도 3은 도 1의 마이크로 디바이스에서 제2 기재의 제조 과정을 개략적으로 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스에서 메틸렌블루 기반의 DNA 검출 매커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스를 이용하여 DNA 존재 여부를 검출하는 프로세스를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 단일 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 다중 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상은 첨부된 도면에 한정되지 않는다. 또한 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미한다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스(100)를 개략적으로 도시한다. 도 1을 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 제1 기재(110), 제2 기재(120) 및 실링 필름(130)을 포함한다. 제1 기재(110), 제2 기재(120)는 셀룰로오스(cellulose) 종이를 기반으로 제조될 수 있으며, 도 1에서와 같이 필름형의 형태를 가질 수 있다. 셀룰로오스 종이는 비교적 높은 강도를 갖고 액체를 흡수하는 성질을 지니며, 특히 마이크로 스케일의 채널을 형성하는데 적합한 소재다. 예컨대 상품인 Whatman 여과지(filter paper)로 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 제1,2 기재(110,120)로 종이 소재를 사용함으로써, 1회 사용 후 폐기함으로써(태울 수 있음) 환경 친화적인 현장진단 장치를 제조 가능하다.
제1 기재(110)는 단일 영역을 갖도록 형성되고, 제2 기재(120)는 복수 영역을 갖도록 형성된다. 여기에서 '영역'은 제1 기재(110)의 면, 제2 기재(120)의 구획된 각 면을 의미한다. 관련하여 제2 기재(120)는 제1 기재(110)와 유사한 형태의 기재들이 일체형으로 형성되되 접힘선(folding line, 도 1에서 L로 표기)에 의해 복수의 영역이 구획되도록 형성된다. 또한 제2 기재(120)의 각 영역은 접힙선(L)을 따라 내외측으로 폴딩 가능하게 형성된다. 한편 각 영역은 도 1에 도시된 것처럼 정사각형 내지 직사각형으로 형성될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 각 영역의 크기는 예컨대 25mmⅹ25mm의 크기를 가질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
제2 기재(120)에 마련된 각 영역에는 정제 패드(121, purification pad), 반응 패드(122, reaction pad), 검출 패드(123, dye pad), 흡수 패드(124, wicking pad)가 배치된다. 구체적으로 도 1에서와 같이 정제 패드(121), 반응 패드(122), 검출 패드(123)가 순서대로 제2 기재(120)의 각 영역에 일렬로 배치되고, 흡수 패드(124)는 정제 패드(121)의 측부에 마련된 영역에 배치될 수 있다. 또한 각 패드(121~124)는 접힘선(L)을 따라 제2 기재(120)의 내측 또는 외측으로 폴딩될 수 있다.
실링 필름(130)은 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 정제 패드(121) 하부면에 일체로 부착됨으로써 제1 기재(110)와 제2 기재(120)를 결합시킨다. 실링 필름(130)은 밀봉된 필름 형태를 가질 수 있으며, 벤딩(bending) 가능한 소재로 형성될 수 있다. 예를 들어 실링 필름(130)은 PC(폴리카보네이트), PMMA(폴리메틸메타크릴레이트) 또는 PP(폴리프로필렌) 소재를 필름형으로 가공함으로써 형성될 수 있고 제1 기재(110) 및 제2 기재(120)의 정제 패드(121) 하부면에 결합(접착, 점착 등)될 수 있다. 또한 실링 필름(130)에서 제1 기재(110)와 결합되는 부분의 중앙에는 샘플 도입을 위한 홀(미표기)이 형성될 수 있다.
이하, 제1 기재(110, Splitting pad)에 대해 설명한다. 관련하여 도 2는 도 1의 마이크로 디바이스(100)에서 제1 기재(110)의 제조 과정을 개략적으로 도시한다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 제1 기재(110)는 중앙에 중앙챔버(111)가 형성되고, 중앙챔버(111)의 주변에는 복수의 주변챔버(112)가 형성될 수 있다. 그리고 중앙챔버(111)와 각 주변챔버(112)를 연통시키는 마이크로채널(111a)이 형성될 수 있다. 중앙챔버(111), 주변챔버(112), 마이크로채널(111a)은 CNC 밀링머신으로 음각된 몰드(도 2의 부호 M1)를 이용하여 형성할 수 있다. 예를 들어 제1 기재(110)를 이루는 셀룰로오스 종이를 한 쌍의 몰드(M1) 사이에 위치시키고 프레스하여 종이면에 중앙챔버(111), 마이크로채널(111a) 및 주변챔버(112)를 형성할 수 있다.
주변챔버(112)의 수는 특정되지 않으나, 설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 첨부된 도면에서와 같이 주변챔버(112)가 4개 형성된 경우를 중심으로 설명하도록 한다. 일 구체예에 있어서 중앙챔버(111)는 5mm 가량의 직경을 갖도록 형성될 수 있고, 주변챔버(112)는 각각 5mm 가량의 직경을 갖도록 형성될 수 있고, 각 채널(111a)의 길이는 5mm 가량일 수 있다.
중앙챔버(111)에는 분석 대상을 포함하는 샘플이 도입될 수 있다. 여기에서 분석 대상은 표적 미생물일 수 있다. 표적 미생물의 예로는 바이러스, 세균, 원생동물, 효모, 곰팡이, 버섯, 조류, 리케차, 동식물의 분화되지 않은 세포, 조직 배양물 등을 포함한다. 보다 구체적으로 표적 미생물은 식중독을 유발할 수 있는 다양한 종류의 식품매개 병원균(foodborne pathogens)을 포함할 수 있다. 식품매개 병원균의 대표적인 예로는 대장균(E.coli: Escherichia coli), 살모넬라 종(Salmonella spp.) 등이 있다. 샘플은 분석 대상을 포함하는 유체(fluid)일 수 있다. 샘플의 예로는 혈액, 전혈과 같은 바이오 샘플, 또는 우유, 주스와 같은 음료 액적 등이 있다.
중앙챔버(111)에 도입된 샘플은 채널(111a)을 따라 주변챔버(112)로 이동된다. 각 주변챔버(112)에는 관통홀(through-hole, 113) 이 형성되며, 이는 펀칭 공정 등을 통해 이루어질 수 있다. 한편 제1 기재(110)의 표면은 샘플 유체의 가이드로 기능하는 소수성 배리어(hydrophobic barrier) 형성을 위하여 소수성으로 개질될 수 있다. 여기에서 표면의 소수성 개질은 제1 기재(110)에서 샘플 유체의 이동을 위한 채널(111a)을 제외한 제1 기재(110)의 표면을 의미한다. 일 구체예에 있어서, 제1 기재(110)에 중앙챔버(111), 마이크로채널(111a) 및 주변챔버(112)를 형성한 후, 제1 기재(110)를 PDMS(폴리디메틸실록산: Polydimethylsiloxane)와 경화제가 10:1(w/w)로 혼합된 혼합물에 담그고 과량의 PDMS 용액을 제거한다. 다음으로 제1 기재(110) 상부에 PDMS 배리어층(114)을 부착함으로써(PDMS 배리어층의 부착 후에 오븐에서 가열하여 접합시킴) 제1 기재(110)의 표면을 소수성으로 개질할 수 있다. 이 때, PDMS 배리어층(114)의 중앙, 즉 중앙챔버(111)와 상응하는 부분에는 샘플의 도입을 위한 인렛홀(114a)이 형성될 수 있다.
상술한 것과 같이 제조된 제1 기재(110)는 PDMS 배리어층(114)이 아래쪽에 오도록 실링 필름(130)의 상부에 접합되면, 실링 필름(130)에 형성된 홀(미표기)과 PDMS 배리어층(114)에 형성된 인렛홀(114a)이 연통되므로 샘플이 중앙챔버(111)로 도입될 수 있다. 나아가 상기 샘플이 중앙챔버(111)로부터 주변챔버(112)로 이동한 후, 주변챔버(112)에 형성된 관통홀(113)을 통해 배출될 수 있다.
이하, 제2 기재(120)에 대해 설명한다. 관련하여 도 3은 도 1의 마이크로 디바이스(100)에서 제2 기재(120)의 제조 과정을 개략적으로 도시한다.
도 1 및 도 3을 참조하면, 앞서 설명한 것처럼 제2 기재(120)는 접힘선(L)에 의해 구획된 각 영역에 정제 패드(121, purification pad), 반응 패드(122, reaction pad), 검출 패드(123, dye pad), 흡수 패드(124, wicking pad)가 배치될 수 있다.
정제 패드(121)에는 복수의 정제 챔버(121a)가 형성될 수 있다. 이 때 각 정제 챔버(121a)는 제1 기재(110)를 정제 패드(121) 쪽으로 폴딩하였을 때 주변챔버(112)와 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 따라서 제1 기재(110)를 정제 패드(121)와 포개지도록 폴딩시킨 상태에서, 제1 기재(110)로 도입된 샘플은 관통홀(113)을 통해 정제 챔버(121a)로 이동할 수 있다. 정제 챔버(121a)의 형성은 정제 패드(121)에 관통홀을 형성하는 방식으로 이루어질 수 있다. 정제 패드(121)의 하부는 실링 필름(130)에 의해 밀봉되므로 챔버가 형성될 수 있다.
각 정제 챔버(121a)에는 제1 기재(110)로부터 도입되는 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시켜 정제시키는 제1 여과지(121b)가 배치된다. 일 구체예에 있어서 제1 여과지(121b)는 셀룰로오스 페이퍼(셀룰로오스 멤브레인 필터)일 수 있고, 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다. 제1 여과지(121b)는 키토산(chitosan)으로 코팅된 디스크(disc) 형태를 가질 수 있다. 샘플의 pH는 대략 5 정도이고, 제1 여과지(121b)에 코팅된 키토산은 정전기적 인력에 의해 샘플 내 DNA를 포획할 수 있다. 따라서 샘플이 정제 챔버(121a)로 도입되는 경우 제1 여과지(121b)에 샘플의 DNA가 포획되는 바, 추가적인 용리 단계(elution step)가 필요 없이 증폭 가능한 상태가 된다.
반응 패드(122)에는 복수의 반응 챔버(미표기)가 형성될 수 있다. 이 때 각 반응 챔버는 정제 패드(121)를 반응 패드(122) 쪽으로 폴딩하였을 때 정제 챔버(121a)와 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 따라서 정제 패드(121)를 반응 패드(122)와 포개지도록 폴딩시킨 상태에서, 정제 패드(121)에 포획된 DNA가 반응 챔버로 이동할 수 있다. 반응 챔버는 CNC 밀링머신으로 음각된 몰드(도 3의 부호 M2)를 이용하여 형성할 수 있다. 예를 들어 제2 기재(120)의 반응 패드(122) 영역 부분을 한 쌍의 몰드(M2) 사이에 위치시키고 프레스하면 반응 패드(122) 영역에 반응 챔버가 형성될 수 있다. 예컨대 반응 챔버는 직경 6mm, 깊이 0.6mm의 치수를 갖도록 형성될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)에서는 기재(110, 120)의 폴딩을 통해 샘플이 제1 기재(110)에서 정제 챔버(121a)로, 다시 정제 챔버(121a)에서 반응 챔버)로 이동할 수 있다. 따라서 종전 마이크로 디바이스에서 샘플(시료) 이송을 위해 요구되는 밸브 구성, 펌프 구성 등이 필요하지 않고, 보다 간단하며 현장진단에 적합한 마이크로 디바이스를 제공할 수 있는 장점이 있다.
반응 챔버에서는 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 방법에 의해 타겟 유전자가 증폭될 수 있다. 루프-매개 등온증폭 방법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 이루어지는 핵산 증폭법의 한 종류다. 루프-매개 등온증폭 방법의 개념 및 원리 등은 당업계에 알려져 있으므로 구체적인 설명은 생략하도록 한다.
한편, 각 반응 챔버에는 루프-매개 등온증폭 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제2 여과지(122a)가 배치될 수 있다. 일 구체예에 있어서 제2 여과지(122a)는 셀룰로오스 페이퍼(셀룰로오스 멤브레인 필터)일 수 있고, 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다. 제2 여과지(122a)는 루프-매개 등온 증폭 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 포함하는 용액에 담궈져 상기 용액을 흡수한 후에 상온에서 건조 처리한 디스크(disc) 형태를 가질 수 있다. 이 때, 루프-매개 등온증폭 시약은 Bst DNA 폴리머라제(중합효소), 등온 증폭 버퍼(10x), dNTPs, 100 mM MgSO4 등을 포함할 수 있다. 이러한 루프-매개 등온증폭 시약은 통상의 방법을 통해 입수 가능하다. 프라이머는 샘플에 포함되는 분석 대상, 즉 표적 미생물의 유전자에 특이적으로 혼성화 된다. 프라이머는 자유 3' 말단 하이드록시기를 포함하는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 표적 미생물의 타겟 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 표적 미생물의 존부를 판단할 수 있도록 표적 미생물의 특징적인 유전자에 혼성화되도록 제조될 수 있으며, 샘플 내에 목적하는 미생물이 존재하는 경우 루프-매개 등온증폭 반응에 의해 상기 특징적인 유전자의 염기서열이 증폭된다. 따라서 반응 후 앰플리콘(amplicon)을 검출함으로써 표적 미생물의 존부를 확인할 수 있다. 이러한 프라이머는 증폭하고자 하는 타겟 유전자의 종류에 따라 설계될 수 있으며, 본 발명에서는 각 표적 미생물의 타겟 유전자에 따라 알려진 방법에 의해 설계된 프라이머를 사용할 수 있다. 나아가 제2 여과지(122a)는 각 반응 챔버마다 배치되며, 이 때 각 제2 여과지(122a)에 함유되는 프라이머들은 서로 다른 타겟 유전자에 특이적으로 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이 경우 반응 챔버(131) 및 제2 여과지(122a)의 수가 늘어날수록 마이크로 디바이스(100)에서 한 번의 샘플 도입을 통해 검출할 수 있는 표적 미생물의 수가 늘어날 수 있다. 즉 마이크로 디바이스(100)에서 다중 검출이 가능하다.
검출 패드(123)에는 복수의 제3 여과지(123a)가 배치될 수 있다. 일 구체예에 있어서 제3 여과지(123a)는 셀룰로오스 페이퍼(셀룰로오스 멤브레인 필터)일 수 있고, 포어사이즈(pore size)는 0.1㎛~0.3㎛, 보다 구체적으로는 0.2㎛일 수 있다. 제3 여과지(123a)는 메틸렌블루(Methylene Blue, MB)를 포함하는 검출 용액에 적셔진 디스크(disc) 형태를 가질 수 있다. 각 제3 여과지(123a)는 검출 패드(123)를 반응 패드(122) 쪽으로 폴딩하였을 때 반응챔버와 상응하는 위치에 형성될 수 있다. 따라서 검출 패드(123)를 반응 패드(122)와 포개지도록 폴딩시킨 상태에서, 제3 여과지(123a)의 메틸렌블루가 반응챔버와 접촉할 수 있고, 반응 후 앰플리콘(amplicon) 검출에 이용될 수 있다. 이에 대해서는 구체적으로 후술하기로 한다. 또한 검출 패드(123)가 반응 패드(122)와 포개지기 이전, 루프-매개 등온증폭의 수행 이후에 반응 챔버에는 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 포함하는 용액이 도입될 수 있다. 상기 용액은 검출 민감도 향상을 위하여 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 더 포함할 수 있다.
흡수 패드(124)는 정제 패드(121)의 측부에 마련된 영역에 배치된다. 흡수 패드(124)는 제2 기재(120)의 종이 성질을 이용하여 과량의 유체를 흡수하는 기능을 한다. 흡수 패드(124)의 하부면에는 추가적으로 통상의 흡수지(absorbent paper)가 부착될 수 있다.
상술한 것과 같이 제조된 제2 기재(120)의 표면은 샘플 유체의 가이드로 기능하는 소수성 배리어 형성을 위하여 소수성으로 개질될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 제2 기재(120)의 각 영역에 각 패드들을 형성한 후, 전체 제2 기재(120)를 PDMS 용액에 침지시킨 후에 소정 온도(예컨대 80℃)에서 인큐베이팅함으로써 제2 기재(120)의 표면을 소수성으로 개질할 수 있다.
한편 마이크로 디바이스(100)는 루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 가열부는 특정 종류로 제한되지 않는다. 예를 들어 가열부는 구리 가열 블록, 박막 히터, 고무 히터, 적외선 히터, 할로겐 히터, 마이크로웨이브, 유도 가열 장치 등 다양한 장치를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 기존 DNA의 전기화학적 검출 용도로만 사용되었던 메틸렌블루(MB)를 루프-매개 등온증폭 반응에 있어 타겟 엠플리콘(타겟 유전자)의 존재 유무를 육안으로 판독하기 위하여 사용하였다는 점에 일 특징이 있다. 관련하여 도 4는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)에서 메틸렌블루(MB) 기반의 DNA 검출 매커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 4를 참조하면, 메틸렌블루(MB)는 용액 내에서 파란 색을 갖는 양이온성 염료이며, 페노티아진 계열(phenothiazine family)에 속한다. 메틸렌블루는 정전기적 인력과 염기-스태킹(base-stacking)에 기반하여 DNA와 결합하여 MB-DNA 복합체를 형성할 수 있다(도 4의 윗 그림 참조). 분자 레벨에서, 메틸렌블루의 파란색은 공액 시스템에서의 페노티아지움 발색단(phenothiazinium chromophore)에서 유래한다. 따라서 임의의 화학 물질이 메틸렌블루의 이러한 발색단을 공격하면 공액 시스템이 손실되어 메틸렌블루가 탈색된다. 따라서 본 발명에서는 이러한 메틸렌블루의 원리를 DNA의 존재를 육안 검출하기 위한 수단으로 활용하게 되었다. 예를 들어 메틸렌블루는 샘플 내에 증폭된 앰플리콘이 없는 경우, 첨가되는 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)와 반응하여 동적 평형 상태(dynamic equilibrium)에서 무색의 LMB(leuco-methyleneblue)를 생성하는 특성이 있다. 반대로 샘플 내에 증폭된 앰플리콘이 있는 경우, LAMP 앰플리콘의 존재는 양이온성 메틸렌블루 염료를 끌어당김으로써 LMB가 형성되는 것을 방지하기 때문이다. 이는 음으로 하전된 DNA의 포스페이트 기(phosphate groups)와 양으로 하전된 메틸렌블루의 페노티아진 일부의 정전기적 인력과 염기-스태킹에 의한 것이다. 따라서 본 발명의 발명자들은 이와 같은 메틸렌블루의 특성에 착안하여 샘플 내에 타겟 DNA가 존재하는지 여부를 빠르게 스크리닝 할 수 있는 마이크로 디바이스를 개발하게 되었으며, 본 발명에 따른 마이크로 디바이스에서는 별도의 판독 장치(광검출기 등)를 적용하지 않아도 육안으로 메틸렌블루의 탈색 여부를 관찰함으로써 검출 결과를 확인할 수 있다.
정리하자면 샘플에 단일 또는 다중 타겟이 존재하는 경우 메틸렌블루 및 아황산 나트륨을 첨가하면 푸른 색을 띤다. 그러나 샘플에 타겟이 존재하지 않는 경우 메틸렌블루 및 아황산 나트륨을 첨가하면 탈색되어 무색으로 변한다. 따라서 메틸렌블루가 푸른 색을 띠는지 탈색되는지를 육안으로 관찰하여 타겟 DNA의 존재 여부를 확인할 수 있게 된다.
이와 같은 메틸렌블루의 원리는 특히 환경시료 중에 존재하는 박테리아와 같은 생물시료가 살아있는지 또는 죽었는지를 확인하는데에 유용하다. 이를테면 선박 평형수 속 박테리아의 생사여부를 측정하는 경우가 있다. 관련하여 박테리아의 생사여부를 확인하는 방법으로 프로피듐 모노아지드(PMA: propodium monoazide)가 이용되는데, 죽은 세포의 경우에는 세포막이 파괴되므로 PMA로 처리하면 PMA가 세포막을 뚫고 세포의 내부로 용이하게 침투하여 DNA와 결합함으로써 DNA 증폭을 방해한다. 따라서 생물시료 등의 경우 마이크로 디바이스(100)에 도입하기 전에 PMA로 처리하면, 죽은 세포의 경우에는 DNA 증폭이 일어나지 않아 메틸렌블루가 탈색되며, 생존 세포의 경우에는 DNA가 증폭하여 메틸렌블루의 푸른색이 유지될 수 있다.
이하에서는 마이크로 디바이스(100)의 사용 방법 및 동작에 대하여 설명한다.
도 5는 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)를 이용하여 DNA 존재 여부를 검출하는 프로세스를 설명하기 위한 도면이다. 도 5를 참조하면, 우선 마이크로 디바이스(100)에서 제1 기재(110)를 정제 패드(121) 쪽으로 폴딩시키고, 흡수 패드(124)는 외측으로 폴딩시켜 정제 패드(121)의 하부에 포개지도록 한다(도 5a). 다음으로 PMA로 처리된 샘플(박테리아 용액)을 인렛홀(114a)에 도입하면, 샘플이 제1 기재(110)의 중앙챔버(111), 마이크로채널(111a)을 거쳐 주변챔버(112)로 분배되고, 관통홀(113)을 통해 정제 패드(121)의 정제 챔버(121a)로 이동할 수 있다(도 5b). 정제 챔버(121a)에는 키토산으로 코팅된 제1 여과지(121b)가 배치되어 있으며, 제1 여과지(121b)에 DNA가 포획될 수 있다(도 5c). 다음으로 제1 기재(110)를 다시 펼치고, 반응 패드(122)의 각 반응 챔버에 타겟 유전자를 증폭시키는 프라이머 등이 포함되는 LAMP 시약을 투입하고, 정제 패드(121)를 반응 패드(122)쪽으로 폴딩시키면 정제 패드(121)에 위치한 DNA가 반응 챔버로 이동한다(도 5d). 다음으로 반응 패드(122)를 가열부(예컨대 핫 플레이트) 상에 배치하고 가열하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 일 구체예에 있어서 LAMP 반응은 65℃에서 30분간 수행될 수 있다(도 5e). LAMP 반응 수행 후, 반응 패드(122)의 반응 챔버 내에는 LAMP 생성물이 잔존한다(도 5f). 다음으로 용이한 육안 검출을 위해 아황산 나트륨, EDTA(민감도 향상을 위함) 등이 포함된 용액을 반응 챔버에 도입시키고, 검출 패드(123)를 반응 패드(122) 쪽으로 폴딩시켜, 검출 패드(123)에 배치된 제3 여과지(123a)를 반응 챔버와 접촉시킨다(도 5g). 이후 소정 시간 경과한 후(도 5h), 검출 패드(123)를 다시 펼쳐 제3 여과지(123a)의 탈색 여부 확인을 통해 타겟 DNA의 존재 여부, 생물시료의 경우 박테리아의 생사 여부를 육안으로 확인할 수 있게 된다(도 5g).
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 마이크로 디바이스(100)는 메틸렌블루를 이용하여 타겟 유전자의 존재유무 또는 생물시료 내의 세포의 생사여부를 신속하게 판독할 수 있다. 따라서 매우 간단한 방식으로 스크리닝이 가능하다. 또한 샘플의 이동이 각 패드의 폴딩 동작에 의해 이루어지도록 하여 시료 이송을 위한 별도의 복잡한 구성(밸브, 펌프 등)이 요구되지 않을 뿐더러 루프-매개 등온증폭을 기반으로 하므로 복잡한 가열 장치도 요구되지 않아 전체 마이크로 디바이스를 간략하게 구성 가능하다. 또한 제1 기재 및 제2 기재를 종이 소재를 이용하여 제작함으로써 사용 후 폐기 또는 처리가 간단해 지므로, 1회용 현장진단 키트로 사용 가능하다.
한편, 본 발명은 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병원균 검출 방법은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; LAMP 생성물에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 첨가하는 단계; 및 메틸렌블루(Methylene Blue)를 첨가하고 변색을 확인하여 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략한다. 한편 상술한 병원균 검출 방법에서 샘플이 생물시료이고 생물시료 내 세포의 생사여부를 판독할 수도 있는데, 이 경우 샘플은 루프-매개 등온증폭 반응 수행 전에 프로피듐 모노아지드(PMA: propodium monoazide)로 처리될 수 있다.
나아가 본 발명은 앞에서 설명한 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법을 추가적으로 제공할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 병원균 검출 방법은 a) 제1 기재를 정제 패드 쪽으로 폴딩시키고 샘플을 도입시키는 단계; b) 샘플이 제1 기재를 거쳐 제2 기재의 정제 패드로 이동하여 정제되는 단계; c) 정제 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 샘플을 반응 패드로 이동시킨 후, 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계; d) 반응 패드에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 포함하는 용액을 도입시키는 단계; e) 검출 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 검출 패드의 색 변화를 통해 타겟 유전자의 존재 유무 또는 샘플 내 세포의 생사여부를 육안 검출하는 단계를 포함한다. 각 단계의 구체적인 내용은 앞에서 설명한 것과 동일하므로 중복 설명은 생략하도록 한다.
이하 본 발명의 시험예들에 대해 설명한다. 다만 본 발명이 하기 시험예들에 의해 제한되지 않음을 밝혀둔다.
온-칩 단일 병원균 생사여부 검출 시험
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 단일 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다. 도 6을 참조하면, 앞에서 설명한 본 발명에 따른 마이크로 디바이스를 시험적으로 제조하였다. 대장균(Escherichia coli) O157:H7 및 살모넬라 종(Salmonella spp.) 박테리아 세포를 16시간 동안 배양하고, 살아 있는 세포와 죽은 세포를 다른 비율로 타겟하여 혼합하였다. 구체적으로 죽은 세포의 수와 대비하여 각각 0%, 50%, 100%의 살아 있는 세포를 함유하는 박테리아 용액 샘플을 제조하였다. 이후 상기 박테리아 용액은 PMA로 처리되었다. PMA 처리된 박테리아 용액을 마이크로 디바이스에 도입하기에 앞서, BSA 용액(2mg/mL)을 먼저 도입함으로써 표면이 LAMP 시약 및 표적의 비특이적 흡착에 덜 민감하도록 처리하였다. 건조 후, 상술한 것과 같이 제조된 박테리아 용액이 마이크로 디바이스의 제1 기재를 통해 정제 패드로 도입되었다. 온-칩 LAMP 반응은 65
Figure pat00001
에서 30분간 수행되었다. 결과물은 Image J S/W를 이용하여 평균 그레이 강도(mean gray intensities)를 측정하였다. 관련하여 도 6에서 마이크로 디바이스의 검출 패드에서 1,2로 표시된 것은 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트를 함유하는 챔버에 접촉하는 부분을 나타내고, 3,4로 표시된 것은 프라이머 세트를 함유하지 않는 챔버에 접촉하는 부분을 나타낸다. 한편 도 6A~6D는 대장균(Escherichia coli) O157:H7에 대해 시험한 결과이고, 도 6E~6H는 살모넬라 종(Salmonella spp.)에 대해 시험한 결과를 나타낸다. 검출 패드에서 푸른 색을 띠는 것은 목적하는 살아 있는 세포(병원체)가 있음을 나타낸다. 도 6의 A(살아 있는 세포 100%), B(살아 있는 세포 50%: 죽은 세포 50%), C(살아 있는 세포 0%: 죽은 세포 100%)를 비교하면 도 6의 A에서 푸른색이 가장 짙고, 다음으로 B에서도 옅은 푸른색이 나타남을 확인할 수 있으나 C에서는 무색임을 확인할 수 있다. 도 6E~6G도 마찬가지다. 한편, 도 6D 및 6H에서와 같이 Image S/W를 사용하여 평균 그레이 강도(Mean grey intensity)를 획득한 결과, 1로 표시된 디스크의 경우 다른 디스크에 비해 더 강한 강도를 나타냈다. 이와 같은 시험 결과에 따라 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 병원균의 생사여부를 검출하는데 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
온-칩 다중 병원균 생사여부 검출 시험
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 마이크로 디바이스에서의 온-칩 다중 병원균 검출 시험의 결과를 나타낸다. 본 시험에서도 앞서 설명한 단일 병원균 생사여부 검출 시험에서와 유사한 과정을 거쳐 이루어졌다. 대장균(Escherichia coli) O157:H7 및 살모넬라 종(Salmonella spp.) 박테리아 세포를 16시간 동안 배양하고, 살아 있는 세포 샘플과 죽은 세포 샘플을 각각 제조하되 대장균과 살모넬라 종을 동일 비율로 혼합하여 박테리아 용액 샘플을 제조하였다. 이후 상기 박테리아 용액은 PMA로 처리되었다. 이후 앞선 시험에서와 마찬가지 과정을 거쳐 결과를 확인하였다. 관련하여 도 7에서 마이크로 디바이스의 검출 패드에서 1,5로 표시된 것은 대장균 프라이머 세트를 함유하는 챔버에 접촉하는 부분을 나타내고, 2,6으로 표시된 것은 살모넬라 종 세트를 함유하는 챔버에 접촉하는 부분을 나타낸다. 나머지 3,4,7,8에는 프라이머를 함유하지 않았다. 도 7A에서 확인되듯이 살아 있는 세포 샘플을 검출한 경우 1,2에서 푸른색이 나타나 세포가 살아 있음을 확인할 수 있었고(도 7A의 좌측 사진), 죽은 세포 샘플을 검출한 경우에는 모든 패드가 무색으로 세포가 살아 있지 않음을 확인하였다. 또한 도 7B에서 확인되듯 평균 그레이 강도를 획득한 결과, 1,2로 표시된 디스크의 경우 다른 디스크에 비해 더 강한 강도를 나타냈다. 이와 같은 시험 결과에 따라 본 발명에 따른 마이크로 디바이스가 다중 병원균의 생사여부를 검출하는데에도 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
100: 마이크로 디바이스 110: 제1 기재
111: 중간챔버 112: 주변챔버
113: 관통홀 114: 배리어층
120: 제2 기재 121: 정제 패드
122: 반응 패드 123: 검출 패드
124: 흡수 패드 130: 실링 필름

Claims (11)

  1. 중앙에 중앙챔버가 형성되고 주변에는 복수의 주변챔버가 형성되어 중앙챔버와 각 주변챔버가 마이크로채널로 연통되며, 각 주변챔버에는 관통홀이 형성되는 제1 기재;
    접힘선에 의해 복수의 영역이 구획되고, 정제 패드, 반응 패드, 검출 패드가 순서대로 각 영역에 일렬로 배치되는 것으로, 각 패드는 접힘선을 따라 내외측으로 폴딩 가능하게 형성되는 제2 기재; 및
    제1 기재 및 제2 기재의 정제 패드 하부면에 일체로 부착되어 제1 기재와 제2 기재를 결합시키는 실링 필름을 포함하고,
    분석 대상을 포함하는 샘플이 상기 중앙챔버로 도입되면 주변챔버로 이동되고 상기 접힘선에 의한 패드의 폴딩 동작에 의해 상기 샘플이 정제 패드를 거쳐 반응 패드로 이동하여 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)이 수행되며, 검출 패드가 폴딩 동작에 의해 반응 패드에 접촉함으로써 검출 패드를 통해 타겟 유전자의 존재 유무 또는 샘플 내 세포의 생사여부를 검출하는 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 정제 패드에는 복수의 정제 챔버가 형성되되, 상기 정제 챔버는 제1 기재를 정제 패드 쪽으로 폴딩하였을 때 주변챔버와 상응하도록 위치되며,
    상기 정제 챔버에는 제1 기재로부터 이동되는 상기 샘플로부터 타겟 유전자만을 통과시켜 정제시키는 제1 여과지가 배치되는 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 반응 패드에는 복수의 반응챔버가 형성되되 상기 반응챔버는 정제 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩하였을 때 정제 챔버와 상응하도록 위치되며,
    상기 반응챔버에는 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification) 시약과 샘플 내의 타겟 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 함유하는 제2 여과지가 배치되는 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 3에 있어서,
    루프-매개 등온증폭을 위한 열원을 제공하는 가열부를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 검출 패드에는 복수의 제3 여과지가 배치되되 상기 제3 여과지는 검출 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩하였을 때 반응챔버와 상응하도록 위치되며,
    상기 제3 여과지는 메틸렌블루(Methylene Blue)에 적셔진 상태인 마이크로 디바이스.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 검출 패드가 반응 패드에 접촉하기 이전에, 루프-매개 등온증폭이 수행된 반응 챔버 내로 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 포함하는 용액이 도입되는 마이크로 디바이스.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 용액은 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 더 포함하는 마이크로 디바이스.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 샘플은 생물시료이고, 프로피듐 모노아지드(PMA: propodium monoazide)로 처리된 마이크로 디바이스.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 마이크로 디바이스를 이용한 병원균 검출 방법이고,
    a) 제1 기재를 정제 패드 쪽으로 폴딩시키고 샘플을 도입시키는 단계;
    b) 샘플이 제1 기재를 거쳐 제2 기재의 정제 패드로 이동하여 정제되는 단계;
    c) 정제 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 샘플을 반응 패드로 이동시킨 후, 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계;
    d) 반응 패드에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 포함하는 용액을 도입시키는 단계;
    e) 검출 패드를 반응 패드 쪽으로 폴딩시켜 검출 패드의 색 변화를 통해 타겟 유전자의 존재 유무 또는 샘플 내 세포의 생사여부를 육안 검출하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
  10. 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 샘플에 대해 루프-매개 등온증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)을 수행하는 단계;
    LAMP 생성물에 아황산 나트륨(Na2SO3; Sodium Sulfite)을 첨가하는 단계; 및
    메틸렌블루(Methylene Blue)를 첨가하고 변색을 확인하여 타겟 유전자의 존재유무를 판독하는 단계를 포함하는 병원균 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 샘플은 생물시료이고, 루프-매개 등온증폭 수행 전에 프로피듐 모노아지드(PMA: propodium monoazide)로 처리되는 단계;를 더 포함하고,
    메틸렌블루를 첨가하고 변색을 확인하여 상기 생물시료 내의 세포의 생사여부를 판독하는 병원균 검출 방법.
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