KR20210049119A - Kras 또는 her2 항원을 표적으로 하는 면역요법 - Google Patents
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Abstract
KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원에 특이적인 결합 단백질 및 고친화성 재조합 T 세포 수용체 (TCR)가 본원에서 제공된다. 상기 결합 단백질 및/또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 및/또는 발현하는 조성물 및 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 이 조성물 및 재조합 숙주 세포는 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증을 지닌 대상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 관련 백신, 백신 요법 및 예방 접종 요법도 제공된다.
Description
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 360056_472WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 61.6KB이고 2019년 8월 21일에 생성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
기술 분야
본 개시 내용은 생물 의학 분야, 특히 암과 같은 KRAS 또는 HER2 항원에 의해 특징지워지거나 이와 관련된 질환을 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시 내용의 특정 실시양태는 항원-특이적 결합 단백질을 암호화 및/또는 발현하도록 변형된 면역 세포를 포함하는 세포 면역요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
T 세포는 돌연변이되지 않았거나 돌연변이된 단백질의 처리에서 유래된 펩티드의 인식을 통해 암세포를 제거할 수 있고 세포 표면 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합되도록 제시된다. 돌연변이된 유전자에 의해 암호화된 신생 항원에 특이적인 T 세포는 체크포인트 차단 항체를 받는 환자에서 항종양 면역의 중요한 매개체로 연루되어 왔다 (McGranahan N, et al. Science. 2016;351(6280):1463-69) and adoptive T cell transfer (Lu Y-C, et al. Clinical Cancer Research. 2014;20(13):3401-10 참조). 신생 항원은 자가 항원에 특이적인 T 세포의 빈도와 기능을 제한하는 중추 및 말초 저항 메커니즘의 영향을 받지 않기 때문에 T 세포의 매력적인 표적이다 (Schumacher TN, et al. Science. 2015;348(6230):69-74 참조). 실제로 비-소세포 폐암 (NSCLC) 및 기타 암 유형에 존재하는 체세포 돌연변이의 부담은 면역 체크포인트 저해제에 대한 반응과 관련이 있어 (Rizvi NA, et al. Science. 2015;348(6230):124-8 및 Yatim N, et al. Science. 2015;350(6258):328-34 참조), 내인성 신생 항원 반응성 T 세포의 재생이 효능에 기여함을 시사한다. 종양 침윤 림프구 (TIL)로 치료한 흑색종 및 자궁경부암 환자의 임상 반응은 TIL 산물에서 신생 항원 반응성 T 세포의 존재와도 상관 관계가 있다 (Lu Y-C, et al. Clinical Cancer Research. 2014;20(13):3401-10 참조). 대부분의 신생 항원은 무작위, 환자 특이적 및/또는 종양에서 이질적으로 발현되며, 이는 여러 환자에 걸쳐 조작된 T 세포를 사용한 입양 전이를 위한 표적으로서의 유용성을 제한하며 (Schumacher TN, et al. Science. 2015;348(6230):69-74 참조), NSCLC 진행 동안 면역원성 신생 항원을 잃는 종양 세포의 탈출을 허용할 수 있다 (Anagnostou V, et al. Cancer discovery. 2017;7(3):264-76 참조). 대조적으로, 재발하는 발암성 드라이버 돌연변이는 많은 환자의 암에서 클론적으로 균질하게 발현된다. 불행히도, 아마도 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자형 (Marty R, et al. Cell. 2017 참조) 또는 기능성 분석을 사용하여 이의 단리를 배제하는 비가역적 T 세포 고갈의 발생 (Philip M, et al. Nature. 2017;545(7655):452 참조)에 기반한 면역 선택의 결과로 매우 적은 드라이버 돌연변이에 대한 T 세포 반응이 설명된다.
발암성 돌연변이로부터 발생하는 것을 포함하여 T 세포에 의해 인식되는 신생 항원을 확인하기 위한 노력은 직접적인 세포 독성 기능으로 인해 클래스 I MHC에서 CD8+ T 세포로 제시되는 에피토프에 주로 초점을 맞추고 있다. 인간 항종양 면역에서 CD4+ 클래스 II MHC 제한 T 세포의 역할은 많은 종양에서 클래스 II MHC의 부재에도 불구하고 점점 더 높이 평가되고 있다. CD4+ T 세포는 전문 항원 제시 세포에 의해 제시된 종양 항원을 인식하고 림프 조직에서 CD8+ T 세포의 프라이밍 및 확장과 종양 미세 환경에서 CD8+ T 세포 및 선천 면역 세포의 이펙터 기능을 지원할 수 있다. 마우스 모델에서의 최근 연구는 종양 부위의 CD4+ T 세포가 면역 매개 종양 거부 반응의 중요한 구성 요소이고 (Spitzer MH, et al. Cell. 2017;168(3):487-502. e15 참조), 클래스 II MHC 제한 CD4+ T 세포를 신생 항원으로 증가시키기 위한 백신 접종은 강력한 치료 효과를 가질 수 있음을 제시하였다 (Kreiter S, et al. Nature. 2015;520(7549):692-6 참조). 또한, 신생 항원에 대한 CD4+ T 세포 반응은 흑색종 환자에서 흔하며 (Linnemann C, et al. Nature medicine. 2015;21(1):81 참조), CD8+ T 세포 반응을 유도할 목적으로 의도된 후보 신생 항원 펩티드로 백신 접종된 흑색종 환자에 대한 최근 연구에서는 대신 항종양 활성의 증거와 함께 펩티드의 60%에 대한 CD4+ T 세포 반응으로 이어졌다 (Ott PA, et al. Nature. 2017;547(7662):217 참조). NSCLC에서 개선된 예후와 종양 주변 CD4+ T 세포의 연관성 (Al-Shibli KI, et al. Clinical cancer research. 2008;14(16):5220-7; Hiraoka K, et al. British journal of cancer. 2006;94(2):275; 및 Wakabayashi O, et al. Cancer science. 2003;94(11):1003-9 참조)은 항종양 CD4+ T 세포 반응이 임상적 관련성을 가질 수 있음을 시사한다.
그럼에도 불구하고, 인간 항종양 면역에서 CD4+ 신생 항원 특이적 T 세포의 역할은 거의 알려지지 않았으며 NSCLC에서 신생 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응을 구체적으로 조사한 보고는 거의 없다.
본원에 개시된 실시양태는 첨부 도면과 함께 취해진 다음의 설명 및 후속 청구범위로부터 보다 완전히 명백해질 것이다.
도 1A 내지 1E는 폐암 환자에서 CD4+ 신생 항원 반응성 T 세포의 검출 및 시험을 보여준다. (A) 신생 항원 반응성 T 세포를 검출하기 위한 도식. 5 명의 상이한 폐암 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 돌연변이를 포함하는 펩티드 풀로 자극되었다 (B). IFN-γ 분비 세포는 단일 돌연변이체 또는 야생형 펩티드와 함께 인큐베이션 후 ELISpot에 의해 자극된 배양물에서 정량화되었다. 모든 실험에는 2 내지 3 개의 기술 복제가 포함되었다. (C) 돌연변이 SREK 펩티드와 함께 인큐베이션 후 환자 1490으로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 대표적인 IFN-γ 세포 내 염색. (D) ZNF292 펩티드와 함께 인큐베이션된 환자 1347로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 대표적인 IFN-γ 세포 내 염색. (E) 환자 1490 및 1347의 배양물에서 총 T 세포의 분획으로서 신생 항원 특이적 CD4+ 또는 CD8+ IFN-γ+ 세포의 정량화.
도 2A 내지 2D는 환자 1490으로부터의 종양 침윤 림프구에서의 신생 항원 특이적 CD8 T 세포의 검출 및 시험을 보여준다. 환자 1490의 종양 절제로부터의 종양 침윤 림프구를 PWP2로부터의 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하는 펩티드와 함께 인큐베이션하고, IFN-γ 분비를 인터페론 캡처에 의해 측정하였다 (A). (B) 종양 침윤 림프구 배양 및 TIL 산물의 IFN-γ 캡처 후 비인접 폐 조직 및 종양에서 PWP2-반응성 CD8+ TCR Vβ의 TCR Vβ 클론형 빈도. PWP2-특이적 세포를 포함하는 T 세포주를 제시된 농도의 돌연변이체 (TERWDNLIYY (서열 번호 39)) 또는 야생형 (AERWDNLIYY (서열 번호 40)) 펩티드와 함께 인큐베이션하고 IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다 (C, D).
도 3A 내지 3G는 야생형 펩티드에 대한 돌연변이 펩티드에 특이적인 CD4+ T 세포주를 보여준다. IFN-γ 캡처에 의해 항원 특이적 세포가 강화된 환자 1347 및 1490로부터의 단일 클론 CD4+ T 세포주를 시험관 내에서 확장한 다음 자가 B 세포 및 제시된 농도의 돌연변이 또는 야생형 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다. (A) MP3KP 펩티드에 반응하는 환자 1347로부터의 T 세포 반응성. (B 내지 D) 환자 1490로부터의 T 세포의 SREK1 펩티드에 대한 반응성. (E, F) 환자 1490로부터의 T 세포의 GUCY1A3 펩티드에 대한 반응성. (G) 환자 1490로부터의 T 세포의 AGO2 펩티드에 대한 반응성.
도 4A 내지 4K는 KRAS G12V 펩티드에 특이적인 CD4+ T 세포의 활성 및 시험을 보여준다. (A) 환자 1139로부터의 CD4+ T 세포 클론 3 개 (클론 #3, 5 및 9)를 V12 (돌연변이) 또는 G12 (야생형)와 함께 제시된 농도의 KRAS의 N 말단 26 개 아미노산의 존재하에 인큐베이션하고, IFN-γ 생산을 ELISA로 측정하였다. (B) T 세포 클론을 제시된 클래스 II HLA-차단 항체의 존재하에 KRAS G12V 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. (C) T 세포 클론을 KRAS G12V 펩티드 또는 대조군으로 펄스화하고 환자 1139와 공유하는 개별 클래스 II HLA 대립 유전자 (HLA DQB1-1104/1301 DQB1 0301/0603)를 발현한 B-LCL 세포주와 함께 인큐베이션하였다. (D) HLA DRB1-11:04+ LCL을 KRAS G12V 펩티드와 함께 인큐베이션하거나 야생형 또는 G12V KRAS 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시켰다. (E) T-세포 클론을 KRAS G12V 펩티드 (1 μg/mL)로 펄스화된 HLADRB1*11:04+ LCL과 함께 인큐베이션하거나 야생형 또는 KRAS G12V 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시키고 IFNγ 생산을 ELISA로 측정하였다. (F) 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 T 세포 클론# 3 및 #9로부터의 T 세포 수용체 (TCR) Vα 및 Vβ 유전자를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 다음 KRAS G12V 펩티드로 펄스화된 HLA-DRB1-1104+ LCL 세포를 배양하였다. IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다. (G-K) 내인성 TCRα의 엑손 1의 CRISPR 매개 파괴와 동시에 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 T-세포 클론 #3 (일명 TCR132) 및 #9 (일명 TCR136)로부터의 T-세포 수용체 Vα 및 Vβ 유전자를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고 (J), KRASG12V 펩티드로 펄스화된 HLA-DRB1* 1104+ LCL 세포 (G, H) 또는 돌연변이 또는 야생형 KRAS 서열로 형질감염된 B-LCL 세포를 인큐베이션한 다음 (I), IFNγ 생산을 ELISA로 측정하였다 (G-I, K).
도 5A 내지 5L은 Her2 엑손 20 삽입에 특이적인 CD4+ T 세포를 보여준다 (ERBB2 (Her2) 내부 순차 복제 (ITD)), 본원에서 Her2-ITD라고도 함). (A, B) 환자 1238로부터의 CD4+ T 세포주 (50,000 개 세포)를 제시된 농도의 Her2-ITD (SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG; 서열 번호 22) 또는 상응하는 야생형 펩티드 (SPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLG; 서열 번호 34)의 존재하에 자가 B 세포 (100,000 개 세포)와 공동 배양하고, IFN-γ 생산을 ELISA로 측정하였다. (C, D) 환자 1238로부터의 CD4+ T 세포주를 제시된 클래스 II MHC 차단 항체의 존재하에 Her2-ITD 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. (E, F) CD4+ T 세포주를 Her2-ITD 펩티드로 펄스화된 자가 B 세포와 함께 인큐베이션하거나, 야생형 또는 Her2-ITD 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시켰다. (G) CD4+ T 세포주를 환자 1238과 공유하는 개별 클래스 II HLA 대립 유전자 (HLA-DQB1-1202/1502 DQB1 0301/0501)를 발현하는 Her2-ITD 펩티드 펄스화 B-LCL 세포주와 함께 인큐베이션하였다. (HJ) 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 Her2-ITD 특이적 T 세포에서 얻은 TCR 서열로 형질도입하고, Her2-ITD 펩티드로 펄스화된 B 세포 (H, I) 또는 야생형 또는 돌연변이 Her-2 서열으로 형질감염된 B-LCL 세포와 함께 인큐베이션하고 (J), IFN-γ 생산을 상등액에서 측정하였다. (K) Vβ2 특이 항체로 염색하여 측정한 전이된 TCR의 발현이 내인성 TCRα 불변 영역 유전자 (TRAC)의 CRISPR 매개 결실에 의해 개선되었다. (L) 종양 및 비인접 폐를 딥 TCR Vβ 시퀀싱에 적용하고 Her2-ITD 특이적 Vβ를 Fisher의 정확한 검정에 의해 폐에 대한 종양의 농축에 대해 TCR Vβ 템플릿 p=0.004의 백분율로 정량화하였다.
도 6A 및 6B는 다수의 예시적인 Her2-ITD 반응성 T 세포주가 공통 TCR Vβ 클론형을 공유함을 보여준다. (A) PloS One 12.2 (2017): e0171225에서 채택된 Her2 엑손 20 삽입 (내부 순차 복제 (ITD))의 개략도. (B) 환자 1238로부터 유래된 10 개의 상이한 Her2-ITD-반응성 T 세포주를 TCR Vβ 딥 시퀀싱에 의해 분석하였고 TCR Vβ 템플릿 (y-축)의 백분율이 각 T 세포주에 대해 표시되어 있다.
도 7A 및 7B는 변이체 대립 유전자 빈도 및 mRNA 발현이 발현된 돌연변이의 면역원성과 상관관계가 없음을 보여준다. (A) 이 시리즈에서 5 명의 환자로부터 면역원성 및 비면역원성으로 확인된 돌연변이를 환자 1139, 1238, 1490 및 511에 대해 제거된 분포 상단 및 하단 20%의 폐 선암종에 대한 암 게놈 아틀라스 데이터베이스의 평균 발현 및 환자 1347로부터의 환자 유래 이종이식편에서 측정된 mRNA 발현으로 정의된 TPM에서의 mRNA 발현에 대해 비교하였다 (Mann-Whitney 검정에 의해 p=0.5). (B) 5 명의 환자로부터의 면역원성 및 비면역원성 스크리닝된 돌연변이에 대한 변이체 대립 유전자 시퀀싱 판독값에 대한 분획: Mann-Whitney 검정에 의해 p=0.78.
도 8은 건강한 HLA-DRB1-1104 공여자의 혈액에서 유래된 KRAS G12V 특이적 CD4+ T 세포 클론형을 보여준다.
도 1A 내지 1E는 폐암 환자에서 CD4+ 신생 항원 반응성 T 세포의 검출 및 시험을 보여준다. (A) 신생 항원 반응성 T 세포를 검출하기 위한 도식. 5 명의 상이한 폐암 환자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 돌연변이를 포함하는 펩티드 풀로 자극되었다 (B). IFN-γ 분비 세포는 단일 돌연변이체 또는 야생형 펩티드와 함께 인큐베이션 후 ELISpot에 의해 자극된 배양물에서 정량화되었다. 모든 실험에는 2 내지 3 개의 기술 복제가 포함되었다. (C) 돌연변이 SREK 펩티드와 함께 인큐베이션 후 환자 1490으로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 대표적인 IFN-γ 세포 내 염색. (D) ZNF292 펩티드와 함께 인큐베이션된 환자 1347로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 대표적인 IFN-γ 세포 내 염색. (E) 환자 1490 및 1347의 배양물에서 총 T 세포의 분획으로서 신생 항원 특이적 CD4+ 또는 CD8+ IFN-γ+ 세포의 정량화.
도 2A 내지 2D는 환자 1490으로부터의 종양 침윤 림프구에서의 신생 항원 특이적 CD8 T 세포의 검출 및 시험을 보여준다. 환자 1490의 종양 절제로부터의 종양 침윤 림프구를 PWP2로부터의 돌연변이 또는 야생형 서열을 함유하는 펩티드와 함께 인큐베이션하고, IFN-γ 분비를 인터페론 캡처에 의해 측정하였다 (A). (B) 종양 침윤 림프구 배양 및 TIL 산물의 IFN-γ 캡처 후 비인접 폐 조직 및 종양에서 PWP2-반응성 CD8+ TCR Vβ의 TCR Vβ 클론형 빈도. PWP2-특이적 세포를 포함하는 T 세포주를 제시된 농도의 돌연변이체 (TERWDNLIYY (서열 번호 39)) 또는 야생형 (AERWDNLIYY (서열 번호 40)) 펩티드와 함께 인큐베이션하고 IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다 (C, D).
도 3A 내지 3G는 야생형 펩티드에 대한 돌연변이 펩티드에 특이적인 CD4+ T 세포주를 보여준다. IFN-γ 캡처에 의해 항원 특이적 세포가 강화된 환자 1347 및 1490로부터의 단일 클론 CD4+ T 세포주를 시험관 내에서 확장한 다음 자가 B 세포 및 제시된 농도의 돌연변이 또는 야생형 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다. (A) MP3KP 펩티드에 반응하는 환자 1347로부터의 T 세포 반응성. (B 내지 D) 환자 1490로부터의 T 세포의 SREK1 펩티드에 대한 반응성. (E, F) 환자 1490로부터의 T 세포의 GUCY1A3 펩티드에 대한 반응성. (G) 환자 1490로부터의 T 세포의 AGO2 펩티드에 대한 반응성.
도 4A 내지 4K는 KRAS G12V 펩티드에 특이적인 CD4+ T 세포의 활성 및 시험을 보여준다. (A) 환자 1139로부터의 CD4+ T 세포 클론 3 개 (클론 #3, 5 및 9)를 V12 (돌연변이) 또는 G12 (야생형)와 함께 제시된 농도의 KRAS의 N 말단 26 개 아미노산의 존재하에 인큐베이션하고, IFN-γ 생산을 ELISA로 측정하였다. (B) T 세포 클론을 제시된 클래스 II HLA-차단 항체의 존재하에 KRAS G12V 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. (C) T 세포 클론을 KRAS G12V 펩티드 또는 대조군으로 펄스화하고 환자 1139와 공유하는 개별 클래스 II HLA 대립 유전자 (HLA DQB1-1104/1301 DQB1 0301/0603)를 발현한 B-LCL 세포주와 함께 인큐베이션하였다. (D) HLA DRB1-11:04+ LCL을 KRAS G12V 펩티드와 함께 인큐베이션하거나 야생형 또는 G12V KRAS 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시켰다. (E) T-세포 클론을 KRAS G12V 펩티드 (1 μg/mL)로 펄스화된 HLADRB1*11:04+ LCL과 함께 인큐베이션하거나 야생형 또는 KRAS G12V 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시키고 IFNγ 생산을 ELISA로 측정하였다. (F) 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 T 세포 클론# 3 및 #9로부터의 T 세포 수용체 (TCR) Vα 및 Vβ 유전자를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 다음 KRAS G12V 펩티드로 펄스화된 HLA-DRB1-1104+ LCL 세포를 배양하였다. IFN-γ 분비를 ELISA로 측정하였다. (G-K) 내인성 TCRα의 엑손 1의 CRISPR 매개 파괴와 동시에 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 T-세포 클론 #3 (일명 TCR132) 및 #9 (일명 TCR136)로부터의 T-세포 수용체 Vα 및 Vβ 유전자를 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고 (J), KRASG12V 펩티드로 펄스화된 HLA-DRB1* 1104+ LCL 세포 (G, H) 또는 돌연변이 또는 야생형 KRAS 서열로 형질감염된 B-LCL 세포를 인큐베이션한 다음 (I), IFNγ 생산을 ELISA로 측정하였다 (G-I, K).
도 5A 내지 5L은 Her2 엑손 20 삽입에 특이적인 CD4+ T 세포를 보여준다 (ERBB2 (Her2) 내부 순차 복제 (ITD)), 본원에서 Her2-ITD라고도 함). (A, B) 환자 1238로부터의 CD4+ T 세포주 (50,000 개 세포)를 제시된 농도의 Her2-ITD (SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG; 서열 번호 22) 또는 상응하는 야생형 펩티드 (SPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLG; 서열 번호 34)의 존재하에 자가 B 세포 (100,000 개 세포)와 공동 배양하고, IFN-γ 생산을 ELISA로 측정하였다. (C, D) 환자 1238로부터의 CD4+ T 세포주를 제시된 클래스 II MHC 차단 항체의 존재하에 Her2-ITD 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. (E, F) CD4+ T 세포주를 Her2-ITD 펩티드로 펄스화된 자가 B 세포와 함께 인큐베이션하거나, 야생형 또는 Her2-ITD 서열을 암호화하는 RNA로 형질감염시켰다. (G) CD4+ T 세포주를 환자 1238과 공유하는 개별 클래스 II HLA 대립 유전자 (HLA-DQB1-1202/1502 DQB1 0301/0501)를 발현하는 Her2-ITD 펩티드 펄스화 B-LCL 세포주와 함께 인큐베이션하였다. (HJ) 2 명의 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포를 Her2-ITD 특이적 T 세포에서 얻은 TCR 서열로 형질도입하고, Her2-ITD 펩티드로 펄스화된 B 세포 (H, I) 또는 야생형 또는 돌연변이 Her-2 서열으로 형질감염된 B-LCL 세포와 함께 인큐베이션하고 (J), IFN-γ 생산을 상등액에서 측정하였다. (K) Vβ2 특이 항체로 염색하여 측정한 전이된 TCR의 발현이 내인성 TCRα 불변 영역 유전자 (TRAC)의 CRISPR 매개 결실에 의해 개선되었다. (L) 종양 및 비인접 폐를 딥 TCR Vβ 시퀀싱에 적용하고 Her2-ITD 특이적 Vβ를 Fisher의 정확한 검정에 의해 폐에 대한 종양의 농축에 대해 TCR Vβ 템플릿 p=0.004의 백분율로 정량화하였다.
도 6A 및 6B는 다수의 예시적인 Her2-ITD 반응성 T 세포주가 공통 TCR Vβ 클론형을 공유함을 보여준다. (A) PloS One 12.2 (2017): e0171225에서 채택된 Her2 엑손 20 삽입 (내부 순차 복제 (ITD))의 개략도. (B) 환자 1238로부터 유래된 10 개의 상이한 Her2-ITD-반응성 T 세포주를 TCR Vβ 딥 시퀀싱에 의해 분석하였고 TCR Vβ 템플릿 (y-축)의 백분율이 각 T 세포주에 대해 표시되어 있다.
도 7A 및 7B는 변이체 대립 유전자 빈도 및 mRNA 발현이 발현된 돌연변이의 면역원성과 상관관계가 없음을 보여준다. (A) 이 시리즈에서 5 명의 환자로부터 면역원성 및 비면역원성으로 확인된 돌연변이를 환자 1139, 1238, 1490 및 511에 대해 제거된 분포 상단 및 하단 20%의 폐 선암종에 대한 암 게놈 아틀라스 데이터베이스의 평균 발현 및 환자 1347로부터의 환자 유래 이종이식편에서 측정된 mRNA 발현으로 정의된 TPM에서의 mRNA 발현에 대해 비교하였다 (Mann-Whitney 검정에 의해 p=0.5). (B) 5 명의 환자로부터의 면역원성 및 비면역원성 스크리닝된 돌연변이에 대한 변이체 대립 유전자 시퀀싱 판독값에 대한 분획: Mann-Whitney 검정에 의해 p=0.78.
도 8은 건강한 HLA-DRB1-1104 공여자의 혈액에서 유래된 KRAS G12V 특이적 CD4+ T 세포 클론형을 보여준다.
상세한 설명
일부 측면에서, 본 개시 내용은 KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원에 대한 결합 단백질 및/또는 고친화성 재조합 TCR을 제공한다. 결합 단백질 및/또는 고친화성 재조합 TCR을 포함하는 (즉, 암호화 및/또는 발현하는) 조성물 및 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 개시 내용에 따른 조성물 및 재조합 숙주 세포는 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 기타 징후 (본원에서 질환 또는 장애라고도 함) 및 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 징후를 갖는 대상을 치료하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, KRAS G12V 신생 항원에 대해 특이성을 갖는 조성물 및 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 본원에 개시된 KRAS G12V-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 및/또는 발현하도록 변형된 면역 세포, 예컨대 T 세포)는 담도암을 지닌 대상을 치료하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, Her2-ITD 신생 항원에 대해 특이성을 갖는 조성물 및 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 본원에 개시된 Her2-ITD-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 및/또는 발현하도록 변형된 면역 세포, 예컨대 T 세포)는 Her2-ITD 신생 항원과 관련된 질환 또는 장애, 예를 들어 난소암 또는 유방암을 지닌 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 백신과 같은 면역원성 조성물뿐 아니라 관련 용도가 또한 제공된다.
본원에 일반적으로 설명된 실시양태는 예시적이라는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 다양한 실시양태에 대한 다음의 설명은 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니라 단지 다양한 실시양태를 대표하는 것이다. 더욱이, 본원에 개시된 특정 방법의 단계 또는 동작의 순서는 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 변경될 수 있다. 즉, 실시양태의 적절한 동작을 위해 특정 단계 또는 동작의 순서가 요구되지 않는 한, 특정 단계 또는 동작의 순서 또는 사용은 변경될 수 있다.
본 개시 내용을 보다 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 추가적인 정의는 본 개시 전체에 설명되어 있다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술적 용어는 당 업계에서 이해되는 일반적인 의미를 갖는다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값 및 적절한 경우 이의 분수 (예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 중합체 소단위, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 임의의 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 표시되지 않는 한, 특정 또는 표시된 값, 범위 또는 구조로부터 ±20%, ±10%, ±5%, ±1% 또는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "하나"는 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "포함하다"는 동의적으로 사용되고, 이의 용어 및 변형체는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
"임의적" 또는 "임의로"는 이후에 설명되는 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 설명은 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
또한, 본원에 기술된 구조 및 서브유닛의 다양한 조합으로부터 유래된 개별 작제물 또는 작제물 그룹은 각각의 작제물 또는 작제물 그룹이 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 출원에 개시되어 있는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 서브유닛의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하지 않고, 청구항의 명시된 물질 또는 단계, 또는 청구 대상의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈 (예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는 (하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20% (예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성도 (예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 (즉, 50%를 초과하여 활성도를 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다".
본원에 사용된 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기와 결합한 α-탄소를 가지는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다른 구조를 가지지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용된 "단백질" 또는 "폴리펩티드는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 단백질은 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산 및 비자연 발생 아미노산 중합체의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다.
본원에서 사용된 "융합 단백질"은 단일 사슬에 적어도 2개의 별개의 도메인을 가지며, 여기서 도메인은 단백질에서 함께 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 PCR, 재조합적으로 조작된 것 등을 사용하여 작제될 수 있거나 또는 이러한 융합 단백질은 합성될 수 있다. 융합 단백질은 태그, 링커 또는 형질도입 마커와 같은 다른 성분을 추가로 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)에 의해 발현되거나 생성된 융합 단백질은 세포 표면에 위치하고, 이 경우 융합 단백질은 (예를 들어, 막관통 도메인을 통해) 세포막에 고정되고 세포 외 부분 (예를 들어, 결합 도메인 포함) 및 세포 내 부분 (예를 들어, 신호 도메인, 이펙터 도메인, 공동 자극 도메인 또는 이들의 조합 포함)을 포함한다.
"접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 2 개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이, 예를 들어 결합 도메인과 인접한 불변 도메인 사이 또는 TCR 사슬과 인접한 자가 절단 펩티드 사이의 하나 이상의 (예를 들어, 약 2-10) 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계 (예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로 인한 아미노산 잔기)에서 발생할 수 있다.
"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 천연 서브유닛 (예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비천연 서브유닛 (예를 들어, 모르폴린 고리)로 구성될 수 있는 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 중합 화합물을 지칭한다. 퓨린 염기는 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴 및 잔틴을 포함하고, 피리미딘 염기는 우라실, 티민 및 시토신을 포함한다. 핵산 분자는 폴리리보핵산 (RNA), cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 폴리데옥시리보핵산 (DNA)을 포함하며, 이들은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥일 경우, 핵산 분자는 암호화 가닥 또는 비-암호화 가닥 (안티-센스 가닥)일 수 있다. 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 일부 버전은 또한 인트론(들)이 동시 또는 사후 전사 메카니즘을 통해 제거될 정도로 인트론(들)을 포함할 수 있다. 다른 말로 하면, 상이한 뉴클레오티드 서열은 스플라이싱 (splicing)에 의해, 또는 유전 코드의 중복 또는 축퇴의 결과로 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
본원에 사용된 "돌연변이"는 각각 참조 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자와 비교하여 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자의 서열에서의 변화를 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하여 몇 가지 상이한 유형의 서열 변화를 야기할 수 있다.
"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특성에 유의적으로 영향을 주지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환은 다음 그룹 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌 (Arg 또는 R), 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 그룹 5: 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W). 부가적으로 또는 대안으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학적 구조 또는 조성 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 의해 보존적 치환기 그룹들로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹은 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환 그룹은 다음을 포함한다: 황 함유: Met 및 시스테인 (Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 추가 정보는 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾을 수 있다. 특정 실시양태에서, 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 류신, 발린, 이소류신 및 알라닌)과 특정 특성을 공유한다. 특정 상황에서, 글루탐산을 글루타민으로, 아스파라긴산을 아스파르트산으로 치환하는 것은 글루타민과 아스파라긴이 각각 글루탐산과 아스파르트산의 아미드 유도체라는 점에서 유사한 치환으로 간주될 수 있다. 본 개시 내용의 변이체 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 및 아미노산 서열은 특정 실시양태에서 참조 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.
당 업계에서 이해되는 바와 같이, 2 개의 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그에 보존된 아미노산 치환물을 제 2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 (예를 들어, GENEWORKS™, Align, ClustalTM, BLAST 알고리즘 등을 사용) 결정된다.
본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변이체가 또한 고려된다. 변이체 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 경우 약 65-68 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 또는 약 42 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건하에서 폴리뉴클레오티드로 혼성화되거나, 본원에 기술된 정의된 또는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 (각각)와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하다. 핵산 분자 변이체는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것과 같이, 본원에 기술된 기능성을 갖는 융합 단백질 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 능력을 보유한다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 자세한 내용과 설명은 Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Moreover, the person skilled in the art may follow the instructions given in the manual Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany and in Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., 및 Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260의 혼성화 수단에 의한 DNA 서열 결정 방법이 참조된다.
변이체는 또한 정의된 또는 참조 서열의 단편 (예를 들어, 절두, 절단 등으로 인한 부분)을 지칭할 수 있고, 단편은 정의된 또는 참조 서열의 길이보다 짧은 임의의 길이일 수 있다.
본원에서 사용된 "기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 모체 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편만을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드는 모체 또는 참조 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련된 활성을 적어도 50%, 바람직하게는 모 폴리펩티드 활성 수준의 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하거나, 또는 생물학적 혜택 (예를 들어, 이펙터 기능)을 제공한다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드의 "기능성 부분" 또는 "활성 부분" 또는 "기능성 단편" 또는 "활성 단편"은 기능성 부분 또는 단편이 선택된 분석, 예컨대 결합 친화성 또는 이펙터 기능을 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 사이토카인 방출)에서 모체 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하 (바람직하게는 20% 이하 또는 10% 이하, 또는 친화성에 대해 모체 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 로그 차이 이하)의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기능성 부분은 이펙터 분자, 이펙터 도메인, 공동 자극 분자 또는 공동 자극 도메인의 "신호 전달 부분"을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 변이체 결합 단백질 또는 이의 일부 또는 단편 (예를 들어, 결합 도메인)은 모체 또는 참조 결합 단백질 또는 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 모체 또는 참조 결합 도메인 또는 단백질에서 잠재적인 원치 않는 특징 또는 특성 (있는 경우) 예를 들어, 잠재적으로 면역원성인 아미노산 서열, 또는 원치 않는 글리코실화 부위, 원치 않는 탈아미드화 부위, 원치 않는 산화 부위, 원치 않는 이성질화 부위, 또는 열역학적 안정성의 감소를 제공할 수 있거나, 결합 단백질에서 잘못된 짝짓기 또는 잘못된 접힘 (예를 들어, 근접하여 짝을 이루지 않은 시스테인 잔기)으로 이어질 수 있는 아미노산 서열을 제거, 변경 또는 약화시킬 수 있다. 원치 않는 특징 또는 특성을 제공할 수 있는 아미노산 서열, 패턴 및 모티프는 알려져 있다 (예를 들어, Seeliger et al., mAbs 7(3): 505-515 (2015) 참조).
특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 예를 들어 생식선-암호화 아미노산으로의 복귀와 같이 체세포 돌연변이를 제거하기 위한 치환을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 참조 CDR 아미노산 서열, 또는 TCR 가변 도메인 서열 또는 TCR 불변 영역 서열의 변이체는 잠재적인 바람직하지 않은 특징 또는 특성을 제거하거나 약화시키기 위한 치환을 포함한다. 이러한 변이체는 원하는 기능 (예를 들어, 펩티드 항원:HLA 복합체에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성)을 손상시키거나 실질적으로 손상시키지 않도록 선택되는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 "서열 동일성" 또는 "서열 동일성 백분율"은 필요한 경우, 바람직한 방법에서 최대 서열 퍼센트 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭을 도입할 수 있음), 임의의 보존적 치환을 서열 동일성 부분으로 고려하지 않고 다른 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 한 서열의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 추가로, 비-상동성 서열은 비교 목적상 무시될 수 있다. 본원에서 언급된 서열 동일성 백분율은 달리 지시되지 않는 한 참조 서열의 길이에 걸쳐 계산된다. 본 개시 내용의 맥락에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석 결과는 참조된 프로그램의 "디폴트값"에 기초한다는 것이 이해될 것이다. "디폴트값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어와 함께 원래 로드되는 값 또는 매개 변수 세트를 의미한다. 예를 들어, Altschul 등 (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402이 정의한 NCBI BLAST 2.0 소프트웨어를 사용하여 매개 변수를 디폴트값으로 설정하여 퍼센트 서열 동일성 값을 생성할 수 있다. 서열 정렬 및 동일성 백분율을 결정하거나 계산하기 위한 다른 프로그램에는 예를 들어 BLASTP, BLASTN 및 BLASTX가 포함된다.
"기능성 변이체"는 본 개시의 모체 또는 참조 화합물과 구조적으로 유사하거나, 실질적으로 구조적으로 유사하지만, 조성이 약간 상이해 (예를 들어, 하나의 염기, 원자 또는 작용기가 상이하거나, 첨가되거나, 제거된) 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드가 적어도 50% 효율, 바람직하게는 모 폴리펩티드의 활성 수준의 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100%로 암호화된 모 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 달리 말하면, 본 개시의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드의 기능성 변이체는 기능성 변이체가 선택된 분석, 예컨대 결합 친화성을 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 결합 (Ka) 또는 해리 (KD) 상수를 측정하는 Biacore® 또는 테트라머 염색); 또는 본원에 기술된 분석을 포함하여, 예를 들어 Lck, ZAP70, Fyn 등과 같은 면역 세포 단백질의 인산화 또는 활성화를 측정하는 분석법에서 또는 면역 세포 단백질에 의해 모체 또는 참조 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합", "유사한 친화성" 또는 "유사한 활성"을 갖는다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드 (또는 이의 기능성 변이체)가 세포 신호전달 이벤트 또는 이벤트들 (예를 들어, 항원 결합에 대한 반응으로 T 세포 신호 전달)을 개시, 계속, 참여, 전파 또는 증폭시키는 능력은 변이체 폴리펩티드와 그와 직접 작용 (예를 들면, 결합)하는 면역 세포 단백질의 활성, 구조, 화학적 상태 (예를 들면, 인산화), 또는 그 사이의 상호 작용을 조사하거나, 또는 세포 신호 전달 이벤트 또는 이벤트들에 관여하거나 그에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있거나 생각되는 다른 생체 분자의 활성, 국소화, 구조, 발현, 분비, 화학적 상태 (예를 들면, 인산화), 또는 그 사이의 상호 작용을 조사하여 결정될 수 있다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드 (또는 이의 기능성 변이체)가 세포 신호 전달 이벤트 또는 이벤트들을 개시, 계속, 참여, 전파 또는 증폭하는 능력은 또한 숙주 세포가 사이토카인을 방출하거나, 증식하거나, 표적 세포를 선택적으로 사멸시키는 능력을 측정하거나, 본 개시 내용의 결합 단백질에 의해 결합된 항원을 발현하거나 그렇지 않으면 이와 연관된 질환 또는 상태를 갖는 대상을 치료하기 위한 능력을 측정하기 위한 본원에 기재된 것들을 포함하여, 숙주 세포 활성의 기능성 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
본 개시 내용의 변이체 폴리펩티드는 특정 실시양태에서 화학적 변형, 예를 들어 동위 원소 표지 또는 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 탈카복실화, 시트룰린화, 하이드록실화 등과 같은 공유적 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 변형은 변이체의 원하는 생물학적 활성을 폐지하거나 실질적으로 손상시키지 않도록 설계된다.
"변경된 도메인" 또는 "변경된 단백질"은 야생형 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들면, 야생형 TCRα 사슬, TCRβ 사슬, TCRα 불변 도메인 또는 TCRβ 불변 도메인)에 대해 적어도 85% (예컨대, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%) 비동일 서열 동일성을 가지는 모티프, 영역, 도메인, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질 또는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 "이종", "비내인성" 및 "외인성"은 조작 (예를 들어, 유전자 조작)을 통해 도입되는 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 이종성, 비내인성 또는 외인성 분자 (예를 들어, 수용체, 리간드 등)는 숙주 세포 또는 대상에 내인성이 아닐 수 있지만, 대신 이러한 분자를 암호화하는 핵산이 접합, 형질전환, 형질감염, 형질도입, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있으며, 여기서 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있거나 염색체 외 유전 물질 (예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터로서)로 존재할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 이로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종성, 비내인성 또는 외인성 분자 또는 분자를 암호화하는 유전자는 각각 분자를 암호화하는 천연 숙주 또는 숙주 세포 분자 또는 유전자와 상동성일 수 있지만, 변경된 구조, 서열, 발현 수준, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 비내인성 분자는 동일한 종, 다른 종, 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 유전자와 같은 핵산 분자의 암호화 서열에 기초하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 지칭한다. 이 과정은 전사, 전사 후 조절, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 조절, 번역 후 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 발현된 핵산 분자는 전형적으로 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편상에서의 2 개 이상의 핵산 분자의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우 암호화 서열과 작동 가능하게 연결된다 (즉, 암호화 서열은 프로모터의 전사 제어하에 있음). "연결되지 않은"은 서로 밀접하게 연관되어 있지 않고 하나의 기능이 다른 하나에 영향을 미치지 않는 유전적 요소를 의미한다.
용어 "작제물"은 재조합 핵산 분자를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 작제물은 벡터 (예를 들어, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터) 내에 존재할 수 있거나 또는 게놈 내에 통합될 수 있다. "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비염색체, 반합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터 또는 선형 또는 환형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 예시적인 벡터는 자기 복제가 가능한 것 (에피솜 벡터) 또는 연결되는 핵산 분자의 발현이 가능한 것 (발현 벡터)일 수 있다.
본원에서 사용되는, "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 수행할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 제어 서열은 전사를 달성하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환된다면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 작용할 수 있거나, 또는 일부 경우, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 상호 호환 가능하게 사용된다.
세포 내로 핵산 분자를 삽입하는 것과 관련하여 용어 "도입된"은 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하며, 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자의 혼입에 대한 언급을 포함하되, 핵산 분자는 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입되거나, 자율 복제로 전환되거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다 (예를 들어, 형질감염된 mRNA). 본원에서 사용된 용어 "조작된", "재조합" 또는 "비-천연"은 적어도 하나의 유전자 변경을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하며, 여기서 변경 또는 변형은 유전 공학 (즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변형은 예를 들어, 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 암호화하는 발현가능한 핵산 분자, 또는 세포의 유전 물질의 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환 또는 다른 기능성 파괴를 도입하는 변형을 포함한다. 추가의 변형은 예를 들어 변형이 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-암호화 조절 영역을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 복수의 이종, 내인성 또는 외인상 핵산 분자는 분리된 핵산 분자로서, 복수의 개별적으로 제어되는 유전자로서, 다시스트론성 핵산 분자로서, 융합 단백질을 암호화하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이들의 임의의 조합으로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원 펩티드 (예를 들어, TCRα 및 TCRβ)에 특이적인 원하는 TCR을 암호화하는 2 개 이상의 이종성, 비내인성 또는 외인성 핵산 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 2종 이상의 이종 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 2종 이상의 외인성 핵산 분자가 (예를 들어, 단일 벡터 상의) 단일 핵산 분자로서, 단일 부위 또는 다수의 부위 또는 이들의 임의의 조합에서 숙주 염색체 내에 통합된, 분리된 벡터 상에 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 언급된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성은 숙주 세포 내에 도입된 분리된 핵산 분자의 수가 아닌, 암호화 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성 수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "숙주" 또는 "숙주 세포"는 관심 대상의 폴리펩티드 (예를 들면, KRAS G12V 또는 Her2-ITD-특이적 결합 단백질)를 생산하기 위해 이종 또는 외인성 핵산 분자로 유전자 변형에 대해 표적화된 세포 (예를 들어, T 세포와 같은 면역계 세포) 또는 미생물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 임의로 이종 또는 외인성 단백질의 생합성과 관련된 또는 관련없는 목적하는 특성을 부여하는 다른 유전적 변형 (예를 들어, 검출 가능한 마커; 결실, 변경 또는 절두된 내인성 TCR; 증가된 공동 자극 인자 발현의 포함)을 이미 갖거나 또는 이들을 포함하도록 변형될 수 있다. 숙주 세포로서 사용하기에 적합한 예시적인 숙주 세포 및 세포 유형이 본원에서 추가로 기술된다.
"T 세포 수용체" (TCR)는 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원을 지칭한다 (가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 가짐; 예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed, Current Biology Publications, p 433, 1997] 참고). TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있으며, 일반적으로 α 사슬 및 β 사슬 (또한 각각 TCRα 및 TCRβ로 알려짐) 또는 γ 및 δ 사슬 (또한 각각 TCRγ와 TCRδ로 알려짐)을 가지는 이종이량체로 구성된다. 다른 면역글로불린과 마찬가지로, TCR 사슬 (예를 들어, α-사슬, β-사슬)의 세포 외 부분은 N-말단에 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, α-사슬 가변 도메인 또는 Vα, β-사슬 가변 도메인 또는 Vβ; 전형적으로 카밧 넘버링 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed)에 기초해 아미노산 1 내지 116개), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카밧에 기초해 아미노산 117 내지 259개, β-사슬 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 카밧에 기초해 아미노산 117 내지 295개)을 함유한다. 또한, 다른 면역글로불린과 마찬가지로, 가변 도메인은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다 (예를 들어, Jores et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27:55, 2003 참조). 특정 실시양태에서, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고 CD3 복합체와 회합된다. 본 개시에 사용된 TCR의 공급원은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유동물로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, TCR 복합체는 TCR 또는 이의 기능성 부분; 2 개의 CD3ζ 사슬, 또는 이의 기능성 부분 또는 변이체를 포함하는 이량체; CD3δ 사슬 및 CDε 사슬, 또는 이의 기능성 부분 또는 변이체를 포함하는 이량체; 및 CD3γ 사슬 및 CDε 사슬을 포함하는 이량체를 포함하고, 이들 중 어느 하나 이상은 T 세포에 내인성이거나 이종성일 수 있다.
"CD3"은 6개 사슬의 다중-단백질 복합체로 알려져 있다 (Borst J, et al., J Biol Chem, 258(8):5135-41, 1983 및 Janeway, et al., p. 172 and 178, 1999 supra 참조). 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬 및 CD3ζ 사슬의 동종이량체를 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 막관통 영역은 음으로 하전되는데, 이로 이들 사슬이 TCR 사슬의 양으로 하전된 영역과 회합될 수 있을 것으로 생각된다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 사슬은 3개의 ITAM을 가진다. 이론에 구애없이, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 중요한 것으로 여겨진다. 본 개시에서 사용되는 바와 같은 CD3은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물를 포함하는 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 "TCR 복합체"는 TCR과 CD3의 회합에 의해 형성되는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이량체, TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬로 구성될 수 있다. 대안적으로, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이량체, TCRγ 사슬, 및 TCRδ 사슬로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "TCR 복합체의 성분"은 TCR 사슬 (즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 사슬 (즉, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2 이상의 TCR 사슬 또는 CD3 사슬에 의해 형성된 복합체 (예를 들어, TCRα와 TCRβ의 복합체, TCRγ와 TCRδ의 복합체, CD3ε과 CD3δ의 복합체, CD3γ과 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, 및 2개의 CD3ε 사슬의 서브-TCR 복합체)를 지칭한다.
"주요 조직 적합성 복합체" (MHC)는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 막 스패닝 (spanning) α 사슬 (3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는 이형이량체이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질, 즉, α와 β로 구성되는데, 이들 둘 다 막에 걸쳐있다. 각각의 사슬은 2개의 도메인을 가진다. MHC 클래스 I 분자는 시토졸에서 유래하는 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래된 펩티드를 세포 표면으로 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 인간 MHC는 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 지칭된다.
"CD4"는 항원-제시 세포와 소통하는 데 있어서 TCR을 보조하는 면역글로불린 공동수용체 당단백질이다 (Campbell & Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, Sixth Ed., 2002); uniProtKB P01730 참조). CD4는 면역 세포, 예컨대, T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면 상에서 발견되며, 세포 표면에서 발현되는 4개의 면역글로불린 도메인 (D1 내지 D4)을 포함한다. 항원 제시 동안, CD4는 TCR 복합체와 함께 모집되어 MHCII 분자의 상이한 영역에 결합한다 (CD4는 MHCII β2에 결합하는 반면, TCR 복합체는 MHCII α1/β1에 결합함).
본원에서 사용되는 용어 "CD8 공동수용체" 또는 "CD8"은 알파-알파 동종이량체 또는 알파-베타 이종이량체로서의 세포 표면 당단백질 CD8을 의미한다. CD8 공동수용체는 세포독성 T 세포 (CD8+)의 기능을 보조하고, 이의 세포질 티로신 포스포릴화 경로를 통한 신호전달을 통해서 기능한다 (Gao and Jakobsen, Immunol. Today 21:630-636, 2000; Cole and Gao, Cell. Mol. Immunol. 1:81-88, 2004). 인간에는 다섯 (5) 종의 상이한 CD8 베타 사슬 (UniProtKB 식별인자 P10966 참조) 및 단일 CD8 알파 사슬 (UniProtKB 식별인자 P01732 참조)가 존재한다.
"키메라 항원 수용체" (CAR)는 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2 개 이상의 자연 발생 아미노산 서열을 포함하도록 조작된 융합 단백질을 의미하며, 이러한 융합 단백질은 세포 표면에 존재할 때 수용체 역할을 할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포 내 신호 전달 도메인 (임의로 공동-자극 도메인(들)을 함유함)에 연결된 항원 결합 도메인을 포함하는 세포 외 부분 (즉,면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대 암 항원에 특이적인 항체 또는 TCR에서 유래된 scFv 또는 scTCR로부터 수득 또는 유래되거나, 또는 NK 세포로부터의 살해 면역수용체로부터 수득 또는 유래된 항원-결합 도메인)을 포함하는 융합 단백질이다 (예를 들어, Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013); Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014) 참조). 특정 실시양태에서, 결합 단백질은 항원-특이적 TCR 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다 (예를 들어, WWalseng et al., Scientific Reports 7:10713, 2017 참조; TCR CAR 작제물 및 그 방법이 전체적으로 본원에 참조로 포함됨).
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 결합에 관여하는 TCR α-사슬 또는 β-사슬 (또는 γδ TCR의 경우 γ-사슬 및 δ-사슬)의 도메인을 의미한다. 천연 TCR의 α-사슬 및 β-사슬의 가변 도메인 (각각 Vα 및 Vβ)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 일반적으로 보존된 골격 영역 (FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. 항체 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인은 각각 일반적으로 4 개의 일반적으로 보존된 프레임 워크 영역 (FR) 및 3 개의 CDR을 포함한다. 일부 경우, TCR α-사슬 또는 β-사슬 (또는 γδ TCR의 경우 γ-사슬 및 δ-사슬) 또는 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인이 결합에 관여한다. 일부 경우, TCR α-사슬 또는 β-사슬 (또는 γδ TCR의 경우 γ-사슬 및 δ-사슬) 중 하나 또는 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인이 결합에 관여한다.
용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이고, 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여하고 프레임워크 아미노산에 의해 서로 1 차 서열에서 분리된 TCR 또는 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 당 업계에 공지되어 있다. 일반적으로 각 가변 영역에는 3 개의 CDR이 있다 (즉, TCRα-사슬 및 β-사슬 가변 영역 각각에 3 개의 CDR; 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각에 3 개의 CDR). TCR의 경우 CDR3이 처리된 항원을 인식하는 데 관여하는 주요 CDR로 간주된다. 일반적으로 CDR1 및 CDR2는 주로 또는 일부 경우 독점적으로 MHC와 상호 작용한다. 가변 도메인 서열은 넘버링 체계 (예를 들면, Kabat, EU, IMGT (International Immunogenetics Information System), Contact 및 Aho)로 정렬될 수 있으며, 이는 등가 잔기 위치에 주석을 달고 ANARCI (Antigen Numbering And Receptor Classification) 소프트웨어 도구 (2016, Bioinformatics 15: 298-300)를 사용하여 서로 다른 분자들을 비교할 수 있게 한다. 본 개시 내용의 특정 실시양태에서, CDR은 IMGT 넘버링을 사용하여 결정된다. TCR 서열로부터 CDR의 IMGT 결정은 예를 들어 IMGT V-Quest (imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php)를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, TCR Vα 또는 Vβ 영역 또는 도메인의 CDR은 특정 넘버링 체계에 따라 특정 서열을 가질 수 있으며, 다른 넘버링 체계에 의해 더 짧거나, 더 길거나 또는 이동된 (예를 들어, 부분적으로 겹치는) 서열을 가질 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 면역원성 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 특정 면역 적격 세포 (예를 들면, T 세포)의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 항원 (면역원성 분자)은 예를 들어, 펩티드, 당펩티드, 폴리펩티드, 당폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지질 등일 수 있다. 항원이 합성되거나, 재조합적으로 생성되거나, 생물학적 샘플에서 유래될 수 있다는 것은 자명하다. 하나 이상의 항원을 함유할 수 있는 예시적인 생물학적 샘플에는 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 생물학적 유체 또는 이들의 조합이 포함된다. 항원은 항원을 발현하도록 변형되거나 유전적으로 조작된 세포에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 "신생 항원"은 대상의 게놈 (즉, 대상의 건강한 조직 샘플)에서 이전에 관찰되지 않은 새로운 항원 또는 항원성 에피토프를 생성하거나, (a) 세포의 항원 처리 및 수송 메커니즘에 의해 처리될 수 있고 MHC (예를 들어, HLA) 분자와 관련하여 세포 표면에 제시될 수 있고; (b) 면역 반응 (예를 들면, 세포 (T 세포) 반응)을 유도할 수 있는 숙주의 면역 시스템에 의해 "인지" 또는 인식되는 구조적 변화, 변경 또는 돌연변이를 포함하는 숙주 세포 산물을 지칭한다. 신생 항원은 예를 들어, 변형되거나 돌연변이된 산물을 초래하는 변경 (치환, 추가, 결실)이 있는 암호화 폴리뉴클레오티드, 또는 외인성 핵산 분자 또는 단백질을 세포에 삽입하거나 유전적 변화를 초래하는 환경 요인에 대한 노출 (예를 들면, 화학적, 방사선학적)로부터 유래할 수 있다. 신생 항원은 종양 항원과 별도로 발생하거나 종양 항원에서 발생하거나 이와 연관될 수 있다. "종양 신생 항원" (또는 "종양 특이적 신생 항원")은 종양 내의 종양 세포 또는 복수의 세포와 연관되거나, 이로부터 발생하거나, 그 안에서 발생하는 신생 항원 결정 인자를 포함하는 단백질을 지칭한다. 종양 신생 항원 결정 인자는 예를 들어, 종양 세포의 DNA에 의해 암호화된 하나 이상의 체세포 돌연변이 또는 염색체 재배열을 포함하는 항원성 종양 단백질 또는 펩티드뿐만 아니라 바이러스 관련 종양 (예를 들면, 자궁경부암, 일부 두경부암)과 관련된 바이러스 개방 판독 프레임으로부터의 단백질 또는 펩티드에서 발견된다. 용어 "항원" 및 "신생 항원"은 본원에 개시된 바와 같은 돌연변이 (예를 들어, G12V)을 포함하는 KRAS 항원 또는 HER2-ITD 항원을 지칭할 때 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "에피토프" 또는 "항원성 에피토프"는 면역글로불린, T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체, 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질과 같이 동족 결합 분자에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하며 특정 3 차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 연속 아미노산 (예를 들면, 선형 에피토프), 또는 단백질 접힘에 의해 근접하게 되는 단백질의 상이한 부분의 아미노산 (예를 들면, 불연속적 또는 형태적 에피토프), 또는 단백질 접힘 및/또는 세포 면역계에 의한 처리와 관계없이 매우 근접한 비연속적 아미노산으로 구성될 수 있다.
본원에 사용된 "결합 도메인" ("결합 영역" 또는 "결합 모이어티"라고도 함)은 표적 분자 (예를 들어, KRAS G12V 펩티드 (서열 번호 1, 또는 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 이의 면역원성 단편); KRAS G12V 펩티드:MHC 복합체 (여기서 MHC 대립 유전자는 DRB1-1101 또는 DRB1-1104, Her2-ITD (서열 번호 22; 또는 서열 번호 22의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 이의 면역원성 단편)일 수 있음), 또는 Her2-ITD 펩티드:MHC 복합체 (여기서 MHC 대립 유전자는 DQB1-05:01 또는 DQB1-05:02일 수 있음)와 특이적으로 및 비공유적으로 회합, 연합 또는 결합하는 능력을 가지는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 분자를 의미한다. 결합 도메인은 생물학적 분자 또는 기타 관심 표적에 대해 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 항체 또는 TCR 또는 기능성 결합 도메인 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 항원 결합 도메인이다. 예시적인 결합 도메인은 단일 사슬 항체 가변 영역 (예를 들면, 단일 도메인 항체, sFv, scFv 및 Fab), 수용체 엑토도메인 (예를 들면, TNF-α), 리간드 (예를 들면, 사이토카인 및 케모카인), TCR의 항원 결합 영역, 예를 들어, 단일 사슬 TCR (scTCR), 생물학적 분자, 압타머 또는 단일 도메인 항체 (예를 들면, 낙타류 또는 어류 유래 단일 도메인 항체)에 결합하는 특이적 능력을 위해 선택된 합성 폴리펩티드를 포함한다 (예를 들어, Arbabi-Ghahroudi M (2017) Front. Immunol. 8:1589 참조).
"링커"는 2 개의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하는 아미노산 서열을 지칭하며, 얻어진 폴리펩티드가 표적 분자에 대해 특이적 결합 친화성 (예를 들어, scTCR)를 보유하거나 또는 신호전달 활성 (예를 들어, TCR 복합체)을 보유하도록 2 개의 하위-결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 약 2 개 내지 약 35 개 아미노산, 약 4 개 내지 약 20 개 아미노산, 약 8 개 내지 약 15 개 아미노산, 약 15 개 내지 약 25 개 아미노산, 또는 다른 적합한 수의 아미노산으로 구성된다. 예시적인 링커는 글리신-세린 링커를 포함하며, 여기서 하나 이상의 연속적인 글리신은 세린이 뒤따르고, 이 순서는 2, 3, 4 회 또는 그 이상 반복될 수 있다.
본 개시 내용의 임의의 결합 도메인은 제 1 도메인의 C-말단이 짧은 펩티드 서열에 의해 제 2 도메인의 N-말단에 연결되거나 그 반대로 연결되도록 단일 사슬 형식으로 조작될 수 있다. (예를 들어, scTCR의 경우, (N)Vβ(C)-링커-(N)Vα(C) 또는 (N)Vα(C)-링커-(N)Vβ(C)). 특정 실시양태에서, 결합 도메인은 키메라, 인간 또는 인간화이다.
본원에서 사용되는 용어 "KRAS G12V-특이적 결합 단백질"은 KRAS G12V 신생 항원에 특이적으로 결합하고/거나 이에 특이적인 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 배경으로, KRAS (CK-RAS, CFC2, K-RAS2A, K-RAS2B, K-RAS4A, K-RAS4B, KI-RAS, KRAS1, KRAS2, NS, NS3, RALD, RASK2, K-ras, KRAS 원발암유전자, GTPase 및 c-Ki-ras2라고도 함)는 세포 증식의 신호 전달에 관여하는 p21 GTPase이다. 음성 성장 신호를 방해하는 KRAS의 돌연변이는 세포의 지속적인 증식을 초래할 수 있다. KRAS G12V 돌연변이는 NSCLC의 4%, 결장직장암의 10%, 췌장암의 30%, 난소암의 8%에서 발견되는 것으로 보고되었다 (Forbes S, et al. Current protocols in human genetics. 2016:10.1. 1-.1. 37 참조).
일부 실시양태에서, 결합 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어 세포 표면에서 특정 친화성 또는 적어도 대략적인 특정 친화성으로 MHC 또는 HLA 분자와 복합체화된 KRAS G12V 펩티드와 같은 KRAS G12V에 결합한다. KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 KRAS G12V 신생 항원, 이의 변이체 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 결합할 수 있으며, 여기서 서열 번호 1의 잔기 12에 상응하는 잔기는 발린 (V)이다. 특정 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 동일한 분석법에 의해 측정되어, 본원에 제공된 임의의 KRAS G12V 특이적 TCR과 같이 본원에 제공된 예시적인 KRAS G12V 특이적 결합 단백질에 의해 나타나는 것과 거의 동일하거나, 적어도 거의 동일하거나, 그 보다 크거나, 이의 대략적인 값보다 큰 친화성으로 KRAS G12V-유래 펩티드:HLA 복합체 (또는 KRAS G12V-유래 펩티드:MHC 복합체)와 결합한다. KRAS G12V-특이적 결합 단백질의 친화성을 평가하기 위해 Kd가 측정될 수 있다.
용어 "Her2-ITD-특이적 결합 단백질"은 Her2-ITD 신생 항원에 특이적으로 결합하고/거나 이에 특이적인 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 표면에서, MHC 또는 HLA 분자와 복합체를 형성할 때, 특정 친화성 또는 적어도 대략적인 특정 친화성으로 Her2-ITD 항원, 예컨대 Her2-ITD 신생 항원 펩티드에 결합한다. Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 Her2-ITD 신생 항원, 이의 변이체 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들어, Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 서열 또는 서열 번호 22과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 예를 들어 동일한 분석법에 의해 측정되어, 본원에 제공된 임의의 Her2-ITD 특이적 TCR과 같이 본원에 제공된 예시적인 Her2-ITD 특이적 결합 단백질에 의해 나타나는 것과 거의 동일하거나, 적어도 거의 동일하거나, 그 보다 크거나, 이의 대략적인 값보다 큰 친화성으로 Her2-ITD- 유래 펩티드:HLA 복합체 (또는 Her2-ITD-유래 펩티드:MHC 복합체)에 결합한다. Her2-ITD-특이적 결합 단백질의 친화성를 평가하기 위해 Kd가 측정될 수 있다.
친화성 또는 겉보기 친화성 또는 상대적 친화성을 평가하기 위한 분석법은 알려져 있다. 예를 들어, 항원:HLA에 대한 TCR의 겉보기 친화성은 예를 들어 표지된 사량체를 사용하는 유세포 분석법에 의해 다양한 농도의 사량체에 대한 결합을 평가하여 측정할 수 있다. 일부 예에서, TCR의 겉보기 Kd는 일정 농도 범위에서 표지된 사량체의 2 배 희석을 사용하여 비선형 회귀에 의한 결합 곡선의 결정으로 측정되는데, 겉보기 Kd는 최대 결합 절반을 생성한 리간드의 농도로서 결정된다. 특정 실시양태에서, KRAS G12V- 또는 Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 각각 KRAS G12V- 또는 Her2-ITD-특이적 면역글로불린 수퍼패밀리 결합 단백질 또는 이의 결합 부분을 포함한다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 성분과 유의하게 회합 또는 통합되지 않고, 105M-1 이상의 친화성 또는 Ka (즉, 1/M을 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 회합 상수)로 표적 분자에 결합 단백질 (예를 들어, TCR 수용체 세포 또는 키메라 항원 수용체) 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)이 회합 또는 통합하는 것을 지칭한다. 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)은 "고 친화성" 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질) 또는 "저 친화성" 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)으로 분류될 수 있다. "고 친화성" 결합 도메인은 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 1012M-1, 또는 적어도 1013M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. "저 친화성" 결합 도메인은 최대 107M-1, 최대 106M-1, 최대 105M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화성은 M (예를 들어, 10-5M 내지 10-13M) 단위로 특정 결합 상호작용의 평형 해리 불변 (Kd)로서 정의될 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합 도메인은 야생형 (또는 모체) 결합 도메인보다 표적 항원에 대해서 더 강한 결합을 갖는 선택 또는 조작된 결합 도메인을 지칭하는 "강화된 친화성"를 가질 수 있다. 예를 들어, 강화된 친화성은 야생형 결합 도메인보다 더 높은 표적 항원에 대한 Ka (평행 회합 상수)로 인한 것이거나, 야생형 결합 도메인의 것보다 낮은 표적 항원에 대한 Kd (해리 상수)로 인한 것이거나, 야생형 결합 도메인의 것보다 낮은 표적 항원에 대한 오프-레이트 (koff)로 인한 것일 수 있다. 결합 도메인 또는 융합 단백질 친화성을 결정하는 것뿐만 아니라 특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시의 결합 도메인을 식별하기 위한 다양한 검정, 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA 및 BIACORE® 분석이 공지되어 있다 (예를 들어, Scatchard, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 57:660, 1949; 및 미국 특허 제5,283,173호, 5,468,614호, 또는 등가물 참조).
본원에 기술된 바와 같은 KRAS G12V 신생 항원 또는 Her2-ITD 신생 항원 특이적 결합 단백질, TCR 또는 도메인 및 이의 변이체는, 숙주 세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원 특이적인 숙주 세포 반응의 결정을 포함하는 숙주 세포 활성을 분석하기 위한 다수의 당 업계에서 허용되는 방법론 중 임의의 것에 따라 기능성으로 특성화될 수 있다. 예는 숙주 세포 증식, 숙주 세포 사이토카인 방출, 항원 특이적 숙주 세포 자극, MHC 제한 숙주 세포 자극, 세포 독성 T 림프구 (CTL) 활성의 결정 (예를 들면, 사전 부하된 표적 세포로부터 51Cr 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T 세포 기능의 기타 측정을 포함한다. 이들 및 유사한 분석법을 수행하는 절차는 예를 들어 Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); 및 Green and Reed, Science 281:1309 (1998) 및 여기에 인용된 참고 문헌 참조)에서 찾을 수 있다.
추가의 예시로서, 본 개시 내용의 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포의 경우, 항원에 대한 숙주 세포의 결합력은 예를 들어 숙주 세포를 펩티드 또는 펩티드:HLA 복합체 (예를 들면, 사량체 또는 다른 다량체로 조직됨), 또는 임의로 펩티드:HLA 복합체에서 펩티드를 숙주 세포에 제시하는 항원 제시 세포 (APC)에 노출시킨 다음, 숙주 세포의 활성, 예를 들어 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ; TNFα)의 생산 또는 분비; 숙주 세포 신호 전달 또는 활성화 성분 (예를 들면, CD137 (4-1BB)의 발현 증가; 숙주 세포의 증식; 또는 APC의 사멸 (예를 들어, 표지된 크롬 방출 분석 사용)을 측정함으로써 결정될 수 있다.
"MHC-펩티드 사량체 염색"은 TCR 가변 도메인 또는 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질을 발현하는 항원-특이적 세포를 검출하는 데 사용되는 검정을 지칭하며, 이 검정은 각각 적어도 하나의 신생 항원 (예를 들어, KRAS G12V 또는 Her2-ITD)인 동족 (예를 들어, 동일하거나 이와 관련된) 아미노산 서열을 갖는 동일한 펩티드를 포함 (제시)하는 MHC 분자의 사량체를 포함하며, 여기서 복합체는 동족 신생 항원에 특이적인 TCR과 결합할 수 있다. 각각의 MHC 분자는 비오틴 분자로 태그될 수 있다. 비오틴화된 MHC/펩티드 복합체는 일부 실시양태에서 형광 표지될 수 있는 스트렙타비딘의 첨가에 의해 다량체화 (예를 들어, 사량체화)될 수 있다. 사량체는 형광 라벨을 통해 유세포 분석에 의해 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, MHC-펩티드 사량체 검정이 본 개시 내용의 결합 단백질 또는 TCR을 검출하거나 선택하기 위해 사용된다. 사이토카인의 수준은 예를 들어, ELISA, ELISpot, 세포 내 사이토카인 염색 및 유세포 분석 및 이들의 조합 (예를 들어, 세포 내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 비롯해 본원에 기술되고 당 업계에서 실시되는 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 반응의 항원 특이적 유도 또는 자극으로 인한 면역 세포 증식 및 클론 확장은 말초 혈액 세포 또는 림프절 유래 세포의 샘플의 순환 림프구와 같은 림프구를 단리하고, 항원으로 세포를 자극하고, 예를 들어 삼중 수소화된 티미딘의 도입에 의하거나, 비방사성 분석, 예컨대 MTT 분석 등으로 사이토카인 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존력를 측정하여 결정할 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이의 균형에 대한 본원에 기술된 면역원의 효과는 예를 들어 IFN-γ, IL-12, IL-2 및 TNF-β와 같은 Th1 사이토카인 및 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13과 같은 2 형 사이토카인의 수준을 결정함으로써 조사할 수 있다.
본 개시 내용의 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 표적 분자는 관심 세포 ("표적 세포") 상에서 또는 이와 관련하여 관찰될 수 있다. 예시적인 표적 세포는 예를 들어, 암 세포, 자가 면역 질환 또는 장애 또는 염증성 질환 또는 장애와 관련된 세포 및 감염성 유기체 또는 세포 (예를 들면, 박테리아, 바이러스 또는 바이러스 감염 세포)와 같이 본 개시 내용의 항원 (KRAS G12V; HER2 ITD)을 발현하는, 대상 또는 대상으로부터의 샘플에서의 임의의 원치 않는 세포, 또는 연구 목적을 위한 세포를 포함한다. 포유동물 기생충과 같은 감염성 유기체의 세포도 또한 표적 세포로 고려된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 임의의 숙주 세포 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 이종 결합 단백질을 발현 및/또는 암호화하는 재조합 숙주 세포)는 면역계 세포일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "면역계 세포" 및 "면역 세포"는 (단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵세포 및 과립구와 같은 골수 세포 초래) 골수 전구 세포 및 (T 세포, B 세포 및 자연 살해 T (NK-T) 세포를 포함한 자연 살해 (NK) 세포와 같은 림프계 세포 초래) 림프계 전구 세포의 두 가지 주요 계통에서 발생하는 골수 내 조혈 줄기세포로부터 기원한 면역계의 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, 줄기 기억 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 펩티드와 복합체화된 APC 표면 상의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 수용체가 T 세포 표면 상의 TCR과 상호작용하는 경우 T 세포를 활성화시킬 수 있는 특수화 세포인 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로 지칭될 수 있다.
"T 세포"는 흉선에서 성숙하고 TCR)을 생산하는 면역계 세포이다. T 세포는 나이브 (항원에 노출되지 않음; TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 증가된 발현, 및 CD45RO의 감소된 발현), 기억 T 세포 (TM) (항원-경험 및 장기간 생존), 및 이펙터 세포 (항원-경험, 세포독성)일 수 있다. TM은 중추 기억 T 세포 (TCM, 나이브 T 세포에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 증가된 발현, 및 CD54RA의 감소된 발현) 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM, 나이브 T 세포 또는 TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA의 감소된 발현, 및 CD127의 증가된 발현)의 서브세트로 추가로 분화될 수 있다. 이펙터 T 세포 (TE)는 TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28의 발현이 감소되고, 그랜자임 및 퍼포린에 대해 양성인 항원-경험 CD8+ 세포독성 T 림프구를 지칭한다. 다른 예시적인 T 세포는 조절 T 세포, 예컨대 CD4+ CD25+ (Foxp3+) 조절 T 세포 및 Treg17 세포뿐만 아니라 Tr1, Th3, CD8+ CD28- 및 Qa-11 제한 T 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 조혈 전구 세포이다. "조혈 전구 세포"는 성숙한 세포 유형 (예를 들어, T 세포 계통의 세포)으로 추가 분화할 수 있는 조혈 줄기 세포 (HSC) 또는 태아 조직으로부터 유래된 세포이다. 특정 실시양태에서, CD24lo Lin- CD117+ 조혈 전구 세포가 유용하다. 본원에 정의된 바와 같이, 조혈 전구 세포는 T 세포 계통의 세포로 추가로 분화할 수 있는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다. 조혈 전구 세포는 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물를 포함한 다양한 동물 종에서 유래할 수 있다. "흉선 세포 전구 세포" 또는 "흉선 세포"는 흉선에 존재하는 조혈 전구 세포이다.
"조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 생체 내에서 자가 재생, 본질적으로 시험관 내에서 무제한 증식이 가능하고 T 세포 계통의 세포를 포함하는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있는 미분화 조혈 세포를 지칭한다. HSC는 예를 들어 태아 간, 골수 및 제대혈로부터 단리될 수 있지만 이에 국한되지 않는다.
"배아 줄기 세포", "ES 세포" 또는 "ESC"는 발달중인 배아의 생식선에 통합되고 그 일부가 되는 능력을 갖는 미분화 배아 줄기 세포를 지칭한다. 배아 줄기 세포는 조혈 전구 세포와 모든 조직 또는 기관으로 분화할 수 있다. 본원에서 사용하기에 적합한 배아 줄기 세포는 J1 ES 세포주, 129J ES 세포주, 뮤린 줄기 세포주 D3 (American Type Culture Collection), 129/Sv 마우스에서 유래된 R1 또는 E14K 세포주, Balb/c 및 C57B1/6 마우스에서 유래된 세포주 및 인간 배아 줄기 세포를 포함한다 (예를 들면, 위스콘신 소재 WICELL® Research Institute 제 또는 호주 멜버른 소재 ES cell International 제).
"T 세포 계통의 세포"는 다른 림프 세포와 세포를 구별하는 T 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 T 세포 (예를 들어, CD3+, CD4+ 및 CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현, 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능성 또는 면역학적 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 수임된 전구 세포 또는 전구체 세포일 수 있으며; CD25+ 미성숙 및 불활성화 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 투입을 받은 세포; CD4+ CD8+ 이중 양성인 흉선 세포 전구 세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙하고 기능성이거나 활성화된 T 세포일 수 있다.
용어 "단리된"은 물질이 이의 본래의 환경 (예를 들어, 천연 유래라면 천연 환경)으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 천연 유래 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 천연 시스템에서 공동 존재하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물 (예를 들어, 세포 용해물)의 부분일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 천연 환경의 부분이 아니도록 여전히 단리된다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생산하는 데 수반되는 DNA 세그먼트를 의미하며; 이는 암호화 영역 앞과 뒤의 영역 ("리더 및 트레일러 (trailer)")뿐만 아니라 개개 암호화 세그먼트 사이의 개재 서열 (엑손)을 포함한다.
세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 설명하기 위해 본원에서 사용되는 용어 "재조합" 또는 "변형된" 또는 "조작된"은 외인성 핵산 분자 (예를 들면, DNA, RNA) 또는 단백질의 도입에 의해 변형된 세포, 미생물, 핵산 분자 또는 벡터를 의미하거나, 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어, 탈조절 또는 구성적이도록 변경된 세포 또는 미생물을 의미하며, 여기서 변경 또는 변형은 유전 공학에 의해 도입될 수 있다. 유전적 변경에는 예를 들어 하나 이상의 단백질 또는 효소를 암호화하는 핵산 분자 (프로모터와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 기타 핵산 분자 추가, 결실, 치환 또는 기타 기능성 파괴, 또는 세포의 유전 물질에 추가를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 참조 또는 모 분자로부터의 이종 또는 상동 폴리펩티드의 암호화 영역 또는 이의 기능성 단편의 변형이 포함될 수 있다.
본 개시 내용 전체에 걸쳐 추가 정의가 제공된다.
KRAS G12V 신생 항원에 특이적인 결합 단백질
한 측면에서, 본 개시 내용은 TCR Vα 도메인 및 Vβ 도메인을 포함하는 결합 단백질 (예를 들어, 면역글로불린 수퍼패밀리 결합 단백질 또는 이의 일부)을 제공하며, 여기서 결합 단백질은 KRAS G12V 신생 항원에 결합하고 결합할 수 있고/거나, 그에 특이적이도록 구성된다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V 특이적 결합 단백질은 MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1):HLA 복합체, 또는 펩티드:HLA 복합체에 결합하거나, 결합할 수 있거나 특이적이도록 구성되며, 여기서, 펩티드는 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, HLA는 DRB1-1101 또는 DRB1-1104를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 서열 번호 2 또는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vα 도메인 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vα 도메인 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 서열 번호 48 또는 54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR1α 아미노산 서열, 서열 번호 49 또는 55에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR2α 아미노산 서열, 서열 번호 51 또는 57에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR1β 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 52 또는 58에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR2β 아미노산 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 각각 서열 번호 48, 49, 2, 51, 52, 및 3; 또는 각각 서열 번호 54, 55, 12, 57, 58 및 13에 제시된 바와 같은 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 서열 번호 9 또는 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR Vα 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 서열 번호 6 또는 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR Vβ 도메인을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 β 또는 α CDR 아미노산 서열 중 어느 하나 이상이 각각 Vβ 도메인 및/또는 Vα 도메인에 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상보성 결정 영역 (CDR) 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열 변화가 없을 수 있으며, 서열 변화를 갖는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개까지의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합만을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V 특이적 결합 단백질은 각각 서열 번호 6 및 9 또는 각각 서열 번호 16 및 19에 따른 TCR Vα 도메인 및 TCR Vβ 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 결합 단백질 (예를 들어, KRAS G12V-특이적 결합 단백질; 본원에서 논의된 HER2-ITD-특이적 결합 단백질)은 "신호 펩티드" (리더 서열, 리더 펩티드 또는 수송 펩티드로도 알려짐)를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 새로 합성된 폴리펩티드를 세포 내부 또는 외부의 적절한 위치로 표적화한다. 신호 펩티드는 국소화 또는 분비 도중 또는 완료되면 폴리펩티드로부터 제거될 수 있다. 신호 펩티드를 갖는 폴리펩티드는 본원에서 "전구 단백질"로 지칭되고, 신호 펩티드가 제거된 폴리펩티드는 본원에서 "성숙" 단백질 또는 폴리펩티드로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 결합 단백질은 성숙한 Vβ 도메인, 성숙한 Vα 도메인, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 결합 단백질은 성숙한 TCR β-사슬, 성숙한 TCR α 사슬, 또는 성숙한 TCR β-사슬 및 성숙한 TCR α 사슬을 포함한다.
세포에 의해 발현되는 본 개시 내용의 예시적인 결합 단백질 및 융합 단백질은 신호 펩티드 (예를 들어, 결합 전구 단백질로서)를 포함할 수 있고, 세포는 신호 펩티드를 제거하여 성숙한 결합 단백질을 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합 단백질은 기능성 결합 단백질을 형성하기 위해 세포 표면에서 결합할 수 있는 α 사슬 및 β 사슬과 같은 2 개의 성분을 포함한다. 2 개의 관련 성분은 성숙 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서 신호 또는 리더 펩티드는 서열 번호 50, 53, 56 또는 59의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 TCRVα 및 TCRVβ 도메인 중 임의의 것 또는 이를 포함하는 결합 단백질은 예시적인 신호 또는 리더 펩티드 서열이 결여되거나 상이한 신호 또는 리더 펩티드 서열을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
따라서, 본 개시 내용이 예를 들어 각각 서열 번호 50, 53, 56 또는 59에 상응하는 서열 번호 6, 9, 16, 또는 19 내에 함유된 아미노산 서열이 존재하지 않을 수 있는 TCRVα 및/또는 TCRVβ 도메인을 포함하는 KRAS G12V-특이적 결합 단백질을 고려하는 것이 이해될 것이다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 서열 번호 68 또는 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일성을 가지는 TCR Vα 도메인을 포함하고/하거나, 서열 번호 66 또는 70에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된 TCR Vβ 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 단백질은 인간 TCR V, D 및/또는 J 대립 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 가변 도메인을 포함한다. 배경으로, 림프구 발달 중에 Vα 엑손은 상이한 가변 및 결합 유전자 세그먼트 (V-J)에서 조립되고 Vβ 엑손은 상이한 가변, 다양성 및 결합 유전자 단편 (V-D-J)에서 조립된다. TCRα 염색체 유전자좌에는 70-80 개의 가변 유전자 세그먼트와 61 개의 결합 유전자 세그먼트가 있다. TCRβ 염색체 유전자좌에는 52 개의 가변 유전자 세그먼트와 6 개 또는 7 개의 결합 유전자 세그먼트와 함께 단일 다양성 유전자 세그먼트를 포함하는 2 개의 개별 클러스터가 있다. 기능성 Vα 및 Vβ 유전자 엑손은 가변 유전자 세그먼트와 Vα에 대한 결합 유전자 세그먼트, 및 가변 유전자 세그먼트와 다양성 유전자 세그먼트 및 Vβ에 대한 결합 유전자 세그먼트의 재조합에 의해 생성된다. 다양한 대립 유전자의 TCR 유전자 세그먼트에 따른 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있으며 ImMunoGeneTics 웹 사이트; 예를 들면, imgt.org/IMGTrepertoire/LocusGenes/listIG_TR/TR/human/Hu_TRgroup.html에서 찾을 수 있다.
결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된 TCR 유전자 세그먼트에 따라 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있지만, 참조된 유전자 세그먼트의 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질의 TCR Vα 도메인은 TRAV8-3 또는 TRAV8-1에 따른 아미노산 서열 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 연속 아미노 산 또는 그 이상), 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 TCR Vβ 도메인은 TRBV30 또는 TRBV12-4의 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 대립 유전자를 포함하여 인간 T 세포 수용체 가변 영역 대립 유전자 (예를 들면, TRAV, TRBV, TRAJ, TRBJ, TRBD)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며 예를 들어 IMGT (ImMunoGeneTics) 정보 System®; 예를 들면, imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRAV; imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBV; imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRAJ; imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBJ; 및 imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/alleles/list_alleles.php?species=Homo%20sapiens&group=TRBD을 통해 이용 가능하다.
일부 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질은 TCR α-사슬 결합 (Jα) 도메인 유전자 세그먼트에 의해 암호화된 아미노산 서열 및 TCR β-사슬 결합 (Jβ) 유전자 세그먼트에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. TCR Jα 도메인은 TRAJ13 또는 TRAJ38에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. TCR Jβ 도메인은 TRBJ2-4 또는 TRBJ2-3에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이들 인간 T 세포 수용체 가변 도메인 대립 유전자 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 임의의 실시양태 (즉, KRAS G12V-특이적 결합 단백질; Her2-ITD-특이적 결합 단백질)에서, 결합 단백질은 TCR β 사슬 불변 도메인 (Cβ), TCR α 사슬 불변 도메인 (Cα) 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 인간 TCR Cα 및 Cβ의 예시적인 아미노산 서열은 예를 들어 UniProtKb P01848 (Cα) 및 UniProtKb P01850 및 A0A5B9 (Cβ)에서 찾을 수 있다. 뮤린 TCR 불변 영역의 예시적인 아미노산 서열은 UniProtKb A0A0A6YWV4, A0A075B5J4 및 A0A075B5J3에서 찾을 수 있다. 이들 아미노산 서열은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 개시된 임의의 실시양태 (즉, KRAS G12V-특이적 결합 단백질; Her2-ITD-특이적 결합 단백질)에서, 결합 단백질은 Cβ 및 Cα를 추가로 포함하고, 여기서 Vβ 및 Cβ는 함께 TCRβ 사슬을 포함하고, Vα 및 Cα는 함께 TCR α 사슬을 포함하고, 여기서 TCR β 사슬 및 TCR α 사슬은 결합하여 이량체를 형성할 수 있다.
추가 실시양태에서, TCR Cβ는 아미노산 위치 57에서 천연 세린 대신 시스테인 아미노산을 포함하고 (예를 들어, GV(S→C)TD), TCR Cα는 아미노산 위치 48에서 천연 트레오닌 대신 시스테인 아미노산을 포함한다 (예를 들면, DK(T→C)VL; 참조: Cohen et al., Cancer Res. 67(8):3898-3903 (2007)).
특정 실시양태에서, TCR Cα는 서열 번호 67 또는 71에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다.
을 갖는다. 특정 실시양태에서, TCR Cβ는 서열 번호 69 또는 73에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다.
또한, 각각 서열 번호 11 또는 21에 포함된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 TCRα 사슬 및/또는 TCRβ 사슬을 포함하는 결합 단백질이 고려되며, 여기서 각각 서열 번호 50, 53, 56 또는 59에 따른 아미노산 서열은 존재하지 않을 수 있다. 이러한 결합 단백질은 "성숙한" TCRα 및/또는 TCRβ 사슬을 포함한다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V 특이적 결합 단백질 (또는 HER2-ITD 특이적 결합 단백질)은 TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, TCR, 키메라 항원 수용체, 또는 TCR의 항원 결합 단편은 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 추가 실시양태에서, TCR의 항원 결합 단편은 단일 사슬 TCR (scTCR)을 포함하거나 이로 구성된다.
또한 본원에는 KRAS G12V 신생 항원에 결합하고, 결합할 수 있고/있거나 특이적이도록 구성된 고친화성 재조합 TCR이 제공된다. 고친화성 재조합 TCR은 서열 번호 6, 9, 16 또는 19의 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일한 Vα 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고친화성 재조합 TCR은 서열 번호 68 또는 72에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된 TCR Vα 도메인을 포함하거나, 서열 번호 66 또는 70에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된 TCR Vβ를 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 서열 번호 2 또는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% (즉, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일성을 갖는 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vα 도메인 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vα 도메인 CDR3 아미노산 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시양태에서, 상보성 결정 영역 (CDR) 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열에 변화가 없을 수 있고, 서열 변화를 갖는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개까지의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합만을 가질 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V 특이적 고친화성 재조합 TCR은 서열 번호 48 또는 54에 따른 CDR1α 아미노산 서열, 서열 번호 49 또는 55에 따른 CDR2α 아미노산 서열, 서열 번호 51 또는 57에 따른 CDR1β 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 52 또는 58에 따른 CDR2β 아미노산 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, KRAS G12V 특이적 고친화성 재조합 TCR은 각각 서열 번호 48, 49, 2, 51, 52 및 3, 또는 각각 서열 번호 54, 55, 12, 57, 58 및 13에 제시된 바와 같은 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1):DRB1-1101 또는 (서열 번호 1):DRB1-1104 복합체, 또는 펩티드:DRB1-1101 또는 DRB1-1104에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1):DRB1-1101 또는 (서열 번호 1):DRB1-1104 복합체, 또는 펩티드:DRB1-1101 또는 DRB1-1104 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD8 및/또는 CD4의 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
Her2-ITD 신생 항원에 특이적인 결합 단백질
본 개시 내용의 또 다른 측면은 TCR Vα 도메인 및 Vβ 도메인을 포함하는 결합 단백질에 관한 것이며, 여기서 결합 단백질은 Her2-ITD 신생 항원에 결합하고, 결합할 수 있고/있거나 특이적이도록 구성된다.
일부 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질의 TCR Vα 도메인은 아미노산 서열 23과 적어도 약 85% (즉, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100%) 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vβ 도메인은 서열 번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, TCR Vα 도메인은 서열 번호 23에 제시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 TCR Vβ 도메인은 서열 번호 24에 제시된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 서열 번호 60에 따른 TCR Vα CDR1, 서열 번호 61에 따른 TCR Vα CDR2, 서열 번호 63에 따른 TCR Vβ CDR1 및/또는 서열 번호 64에 따른 TCR Vβ CDR2를 포함한다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD 특이적 결합 단백질은 각각 서열 60, 61, 23, 63, 64 및 24에 따른 TCR Vα CDR 1-3 및 TCR Vβ CDR 1-3을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, Her-ITD-특이적 결합 단백질은 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):HLA 복합체, 또는 펩티드:HLA 복합체에 결합하고, 결합할 수 있고/있거나 특이적이도록 구성될 수 있고, 여기서 펩티드는 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시양태에서, HLA는 DQB1-05:01 또는 DQB1-05:02를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, Her-ITD 특이적 결합 단백질은 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):HLA 복합체, 또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD8 및/또는 CD4의 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질은 서열 번호 27의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 TCR Vα 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 30의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 Vβ 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합 단백질의 CDR 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열 변화를 포함하지 않으며, 서열 변화를 갖는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실 또는 이들의 조합만을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD 특이적 결합 단백질은 서열 번호 74에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR Vα 도메인 및/또는 서열 번호 76에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR Vβ 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 단백질의 CDR 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열 변화를 포함하지 않으며, 서열 변화를 갖는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실 또는 이들의 조합만을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질의 TCR Vα 도메인은 TRAV8-6에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 결합 단백질의 TCR Vβ 도메인은 TRBV20에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 단백질은 TCR Jα 도메인 유전자 세그먼트에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열, 및 TCR Jβ 도메인 유전자 세그먼트에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 추가로 포함한다. Jα 도메인은 TRAJ34에 따른 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Jβ 도메인은 TRBJ2-5에 따른 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 85% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합 단백질은 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 Cα 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 Cβ 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 결합 단백질은 Cβ 및 Cα를 포함하고, 여기서 Vβ 및 Cβ는 TCR β 사슬을 포함하고, Vα 및 Cα는 TCR α 사슬을 포함하고, 여기서 TCR β 사슬 및 TCR α 사슬은 결합하여 이량체를 형성할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, Her2-ITD 특이적 결합 단백질은 TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편이거나 이를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편은 키메라, 인간화 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, TCR의 항원 결합 단편은 scTCR을 포함한다.
본 개시 내용의 또 다른 측면은 Her2-ITD 신생 항원에 결합하거나, 결합할 수 있거나, 이에 대해 특이적이도록 구성된 고친화성 재조합 TCR에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 고친화성 재조합 TCR은 서열 번호 74의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산을 서열을 가지는 Vα 도메인을 포함하는 α-사슬을 포함한다. 또한, 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, TCR은 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):DQB1-05:01 또는 (서열 번호 22):DQB1-05:02 복합체, 또는 펩티드:DQB1-05:01 또는 펩티드:DQB1-05:02 복합체에 결합할 수 있고, 여기서 펩티드는 CD8 및/또는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 연속적인 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 고친화성 재조합 TCR은 서열 번호 76의 아미노산 서열과 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Vβ 도메인을 포함하는 β-사슬을 포함한다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, TCR은 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):DQB1-05:01 또는 DQB1-05:02 복합체, 또는 펩티드:DQB1-05:01 또는 펩티드:DQB1-05:02 복합체에 결합할 수 있고, 여기서 펩티드는 CD8 및/또는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 연속적인 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD 특이적 고친화성 재조합 TCR은 본원에 제시된 예시적인 Her2-ITD CDR 서열에 따른 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및/또는 CDR3β, 또는 이에 적어도 85%의 동일성을 가지는 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, Her2-ITD-특이적 TCR은 서열 번호 60에 따른 TCR Vα CDR1, 서열 번호 61에 따른 TCR Vα CDR2, 서열 번호 63에 따른 TCR Vβ CDR1, 및/또는 또는 서열 번호 64에 따른 TCR Vβ CDR2를 포함한다.
특정 실시양태에서, Her2-ITD 특이적 TCR은 각각 서열 번호 60, 61, 23, 63, 64 및 24에 따른 TCR Vα CDR 1-3 및 TCR Vβ CDR 1-3을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, KRAS G12V-특이적 또는 Her2-ITD-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 임의로 세포 독성제 및/또는 검출 가능한 제제에 접합된 가용성 형태로 제공될 수 있다 (예를 들어, Walseng et al., PLoS One doi:10.1371/journal.pone.0119559 (2015) 참조). 예를 들어, 재조합적으로 생성된 가용성 TCR을 단리하고 정제하는 데 유용한 방법은 재조합 가용성 TCR을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터 시스템으로부터 상등액을 얻은 다음 상업적으로 이용 가능한 필터를 사용하여 배지를 농축하는 것을 포함할 수 있다. 농축 후, 농축물은 단일 적합한 정제 매트릭스 또는 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 일련의 적합한 매트릭스에 적용될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 사용될 수 있다. 이러한 정제 방법은 자연 환경에서 면역원을 단리할 때도 사용할 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 단리/재조합 가용성 TCR의 대규모 생산을 위한 방법은 적절한 배양 조건을 유지하기 위해 모니터링 및 제어되는 배치 세포 배양을 포함한다. 가용성 TCR의 정제는 본원에 기술되고 당 업계에 공지되었으며 국내외 규제 기관의 법률 및 지침에 부합하는 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 개시 내용의 또 다른 측면은 상기 기재된 바와 같은 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
면역원성 조성물
또한 본원에는 면역원성 조성물 (예를 들어, 백신에 사용하기 위한)이 제공된다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 MTEYKLVVV GAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1) 또는 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGS PYVSRLLG (서열 번호 22)와 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산을 가지는 펩티드 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 KRAS G12V에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있거나 유도 가능한 단리된 펩티드를 포함한다. 단리된 펩티드는 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하의 폴리펩티드에 포함되거나 함유될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 KRAS G12V 아미노산 서열로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 연속 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 Her2-ITD 항원에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있거나 유도가능한 단리된 폴리펩티드를 포함한다. 단리된 펩티드는 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하의 폴리펩티드에 포함되거나 함유될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 서열 번호 22에 제시된 Her2-ITD 아미노산으로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32 개의 연속 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에서 추가로 논의되는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비-자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체는 크림, 에멀젼, 겔, 리포좀, 나노입자 또는 연고를 포함할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 백신은 폴리-ICLC, CpG, GM-CSF 또는 알룸과 같은 면역-유효량의 보조제를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
또한 본원에 개시된 결합 단백질, 고친화성 재조합 TCR, 면역원성 조성물, 또는 이의 기능성 단편 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 당업자는 유전 코드의 축퇴성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, TCR 또는 면역원성 조성물을 암호화하는 수많은 뉴클레오티드 서열이 있음을 인식할 것이다. 이러한 일부 폴리뉴클레오티드는 자연, 원래 또는 동정된 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열에 대해 제한적이거나 최소한의 서열 동일성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드는 본 개시 내용에 의해 명백히 고려된다. 특정 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 서열이 구체적으로 고려된다. 코돈 최적화는 공지 기술 및 도구, 예를 들어 GenScript® OptimiumGeneTM 도구를 사용하여 수행할 수 있다. 코돈 최적화된 서열은 부분적으로 코돈 최적화된 (즉, 적어도 하나의 코돈이 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화됨) 서열 및 완전히 코돈 최적화된 서열을 포함한다. 특정 면역 숙주 세포에서의 발현을 위한 코돈 최적화는 예를 들어, Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135, 2006에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질을 암호화하거나, 대안적으로 결합 단백질은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 즉, 결합 단백질의 성분 또는 부분은 단일 핵산 분자상에 포함될 수 있거나 2 이상의 핵산 분자에 포함될 수 있는 2 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 결합 단백질 또는 TCR의 2 개 이상의 성분 또는 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일 개방 판독 프레임에서 작동 가능하게 연관된 2 개 이상의 암호화 서열을 포함한다. 이러한 배열은 유리하게는 예를 들어 TCR의 알파 및 베타 사슬의 동시 발현과 같은 원하는 유전자 산물의 조정된 발현을 허용하여 약 1:1 비율로 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, TCR (예를 들어, 알파 및 베타 사슬)과 같은 본 개시 내용의 결합 단백질의 2 개 이상의 치환기 유전자 산물은 별개의 분자로서 발현되고 번역 후 결합된다. 추가 실시양태에서, 본 개시 내용의 결합 단백질의 2 개 이상의 치환기 유전자 산물은 절단 가능하거나 제거 가능한 세그먼트에 의해 분리된 부분을 갖는 단일 펩티드로 발현된다. 예를 들어, 단일 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 의해 암호화된 분리 가능한 폴리펩티드의 발현에 유용한 자가 절단 펩티드는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A) 펩티드, 토세아아시그나 (Thoseaasigna) 바이러스 2A(T2A) 펩티드, 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 2A(E2A) 펩티드 및 구제역 바이러스 (FMDV) 2A(F2A) 펩티드를 포함한다. 예시적인 자가 절단 펩티드 ("리보솜 스킵 요소"라고도 함)는 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것들을 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, TCR α-사슬을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드 및 TCR β-사슬을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드가 단일 개방 판독 프레임에 포함되며, 여기서 단일 개방 판독 프레임은 α-사슬-암호화 폴리뉴클레오티드와 β-사슬-암호화 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 양 방향 (예를 들어, β-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드 자가 절단 펩티드-α-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드; α-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드 자가 절단 펩티드-β-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드)이 고려된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 암호화된 결합 단백질의 예시적인 아미노산 서열은 서열 11, 20 및 32에 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4, 5, 7, 8, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 25, 26, 28, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 100% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다.
본원에 기재된 바와 같은 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 특이적인 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화하는 단리된 또는 재조합 핵산 분자는 분자 생물학 또는 폴리펩티드 정제 분야의 다양한 방법 및 기술에 따라 생산 및 제조될 수 있다.
추가 실시양태에서, 결합 단백질 또는 TCR은 다음을 암호화하는 전이 유전자 작제물의 일부로서 발현되고/거나 숙주 면역 세포는 다음을 추가로 암호화할 수 있다: 하나 이상의 추가 보조 단백질, 예컨대 안전 스위치 단백질; 태그, 선택 마커; CD8 공동 수용체 β 사슬; CD8 공동 수용체 α 사슬 또는 둘 다; 또는 이들의 임의의 조합. 결합 단백질 및 보조 성분 (예를 들어, 하나 이상의 안전 스위치 단백질, 선택 마커, CD8 공동 수용체 β-사슬 또는 CD8 공동 수용체 α-사슬)을 암호화하고 발현하는 데 유용한 폴리뉴클레오티드 및 전이 유전자 작제물이 PCT 출원 PCT/US2017/053112에 기술되어 있다으며, 여기서의 폴리뉴클레오티드, 전이 유전자 작제물, 및 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 포함하는 보조 성분은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시 내용의 결합 단백질, 안전 스위치 단백질, 태그, 선택 마커, CD8 공동 수용체 β 사슬, 또는 CD8 공동 수용체 α-사슬의 일부 또는 전부가 단일 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있거나 별도의 핵산 분자이거나 그에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있음이 이해될 것이다.
예시적인 안전 스위치 단백질은 예를 들어, 세포 외 N 말단 리간드 결합 도메인 및 세포 내 수용체 티로신 키나제 활성이 결여되고, 천연 아미노산 서열을 보유하고 I 형 막 횡단 세포 표면 국재화를 갖고, 제약 등급 항-EGFR 단일 클론 항체, 세툭시맙 (Erbitux) tEGF 수용체 (tEGFr; Wang et al., Blood 118:1255-1263, 2011); 카스파제 폴리펩티드 (예를 들면, iCasp9; Straathof et al., Blood 105:4247-4254, 2005; Di Stasi et al., N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, 2011; Zhou and Brenner, Exp. Hematol. pii:S0301-472X(16)30513-6. doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011), RQR8 (Philip et al., Blood 124:1277-1287, 2014); 인간 c-myc 단백질 (Myc)에서 유래된 10-아미노산 태그 (Kieback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:623-628, 2008); 및 마커/안전 스위치 폴리펩티드, 예컨대 RQR (CD20 + CD34; Philip et al., 2014)에 대해 형태적으로 온전한 결합 에피토프를 가지는 절두된 EGF 수용체 폴리펩티드 (huEGFRt)를 포함한다.
본 개시 내용의 변형된 면역 세포에 유용한 다른 보조 성분은 세포를 동정, 분류, 단리, 농축 또는 추적할 수 있게 하는 태그 또는 선택 마커를 포함한다. 예를 들어, 원하는 특성을 갖는 표지된 면역 세포 (예를 들면, 항원 특이적 TCR 및 안전 스위치 단백질)는 샘플 중의 표지되지 않은 세포로부터 분류될 수 있고 원하는 순도의 산물에 포함시키기 위해 보다 효율적으로 활성화 및 확장될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "선택 마커"는 선택 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입된 면역 세포의 검출 및 양성 선택을 허용하는 세포에 식별 가능한 변화를 부여하는 핵산 작제물 (및 암호화된 유전자 산물)을 포함한다. RQR은 CD20의 주요 세포 외 루프와 2 개의 최소 CD34 결합 부위를 포함하는 선택 마커이다. 일부 실시양태에서, RQR 암호화 폴리뉴클레오티드는 16-아미노산 CD34 최소 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, CD34 최소 에피토프는 CD8 공동 수용체 줄기 도메인 (Q8)의 아미노 말단 위치에 포함된다. 추가 실시양태에서, CD34 최소 결합 부위 서열은 CD20에 대한 표적 에피토프와 조합되어 T 세포 (RQR8)에 대한 컴팩트 마커/자살 유전자를 형성할 수 있다 (Philip et al., 2014, 본원에 참조로 포함됨). 이 작제물은 예를 들어 자기 비드 (Miltenyi)에 결합된 CD34 특이적 항체와 함께 작제물을 발현하고 조작된 T 세포를 발현하는 이식 유전자의 선택적인 결실을 허용하는 임상적으로 허용되는 약학 항체인 리툭시맙을 사용하는 면역 세포의 선택을 허용한다 (Philip et al., 2014).
추가의 예시적인 선택 마커는 또한 T 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 몇몇 절두된 I 형 막 횡단 단백질을 포함한다: 절두된 저친화성 신경 성장 인자, 절두된 CD19 및 절두된 CD34 (예를 들어, Di Stasi et al., N. Engl. J. Med. 365:1673-1683, 2011; Mavilio et al., Blood 83:1988-1997, 1994; Fehse et al., Mol. Ther. 1:448-456, 2000 참조; 각각 그 전체가 본원에 원용됨). CD19 및 CD34의 유용한 기능은 임상 등급 분류를 위해 이들 마커를 표적화할 수 있는 기성 Miltenyi CliniMACsTM 선택 시스템의 이용 가능성이다. 그러나, CD19와 CD34는 벡터 패키징 능력과 통합 벡터의 전사 효율에 부담을 줄 수 있는 상대적으로 큰 표면 단백질이다. 세포 외, 비신호 전달 도메인 또는 다양한 단백질 (예를 들면, CD19, CD34, LNGFR)을 포함하는 표면 마커도 사용할 수 있다. 모든 선택 마커를 사용할 수 있으며 우수 제조 관리 기준 (Good Manufacturing Practices)을 만족하여야 한다. 특정 실시양태에서, 선택 마커는 관심 유전자 산물 (예를 들어, TCR 또는 CAR과 같은 본 개시 내용의 결합 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 발현된다. 선택 마커의 추가 예는 예를 들어 GFP, EGFP, β-gal 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)와 같은 리포터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 CD34와 같은 선택 마커는 세포에 의해 발현되고 CD34는 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 관심 형질도입된 세포를 풍부하게 선택하거나 단리하는 데 (예를 들어, 면역 자기 선택에 의해) 사용될 수 있다. 본원에 사용된 CD34 마커는 항-CD34 항체, 또는 예를 들어, scFv, TCR 또는 CD34에 결합하는 다른 항원 인식 모이어티와 구별된다.
특정 실시양태에서, 선택 마커는 RQR 폴리펩티드, 절두된 저친화성 신경 성장 인자 (tNGFR), 절두된 CD19 (tCD19), 절두된 CD34 (tCD34) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
또한 본 개시 내용에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 본원에 개시된 바와 같은 예시적인 발현 벡터를 포함하는 임의의 적합한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 전달하거나 전달 가능하도록 구성될 수 있다.
전형적인 벡터는 숙주 유기체에서 복제 가능하거나, 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 벡터의 일부 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 등을 포함한다. 일부 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있는 반면 (예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터), 다른 벡터는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 추가로, 일부 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다 (이 벡터는 "발현 벡터"로 지칭될 수 있음). 관련 실시양태에 따르면, 하나 이상의 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 특이적인 면역글로불린 수퍼패밀리 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR, 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)가 대상에 공동 투여될 수 있고, 각각의 제제는 별개 또는 동일한 벡터에 존재할 수 있고, 다수의 벡터 (각각 다른 제제 또는 동일한 제제를 함유함)가 세포 또는 세포 집단에 도입될 수 있다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 홍역 및 센다이 (Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 헤르페스 (예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바르 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리아두창)를 포함)를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D 형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다 (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
특정 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터로부터 선택된 벡터)를 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토-믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 홍역 및 센다이 (Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 헤르페스 (예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바르 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리아두창)를 포함)를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D 형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다 (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
"레트로바이러스"는 역전사 효소를 사용하여 DNA로 역전사되고, 그 후 역전사된 DNA가 숙주 세포 게놈으로 통합되는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과 (retroviridae family) 속을 지칭한다. 감마레트로바이러스의 예는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다. 본원에 사용되는 "렌티바이러스 벡터"는 통합 또는 비통합일 수 있고, 상대적으로 거대한 패키징 능력을 가지며, 다양한 상이한 세포 유형을 형질도입할 수 있는, 유전자 전달을 위한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 보통 셋 (패키징, 외피 및 전달) 이상의 플라스미드의 생산자 세포 내로의 일시적 형질감염 후에 생성된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 세포 표면 상에서 수용체와 바이러스 표면 당단백질의 상호작용을 통해 표적 세포에 유입된다. 진입 시, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염 세포의 DNA 내로의 바이러스 통합을 위한 기질인, 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다. "렌티바이러스"는 분열 및 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 속을 의미한다. 렌티바이러스의 몇 가지 예에는 HIV (인간 면역 결핍 바이러스: HIV 1 형 및 HIV 2 형 포함); 말 전염성 빈혈 바이러스; 고양이 면역 결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV) 및 매디-비스나 (Maedi-Visna) 바이러스 (양 렌티바이러스)를 포함한다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터를 사용하는 방법 및 키메라 항원 수용체 이식 유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위한 세포를 패키징하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,119,772; Walchli, et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao, et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels, et al., Hum. Gene Ther. 14: 1155, 2003; Frecha, et al., Mol. Ther. 75: 1748, 2010; and Verhoeyen, et al., Methods Mol. Biol. 506:91, 2009에 기술되어 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템은 또한 상업적으로 이용 가능하다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 유래 벡터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 보다 복잡한 레트로바이러스-유래 벡터, 예를 들어 렌티바이러스-유래 벡터일 수 있다. HIV-1 유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말 감염성 빈혈 바이러스, SIV 및 Maedi-Visna 바이러스 (양 렌티바이러스)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. CAR 이식유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터 및 패키징 세포를 사용하는 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,119,772호; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; 및 Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009에 기재되어 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템 또한 상업적으로 이용 가능하다. DNA 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노 바이러스 기반 벡터 및 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기반 벡터; 앰플 리콘 벡터, 복제 결함 HSV 및 약독화 HSV를 포함하는 단순 포진 바이러스 (HSV)로부터 유래된 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 또한 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용될 수 있다 (Krisky et al., Gene Ther. 5:1517, 1998).
유전자 치료 용도로 개발된 다른 벡터가 또한 본 개시의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바큘로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래 된 것 (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), 또는 플라스미드 벡터 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 또는 다른 트랜스포손 벡터)를 포함한다.
바이러스 벡터 게놈이 별개의 전사체로서 숙주 세포에서 발현되는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 2개 (또는 그 초과)의 전사체 사이에 추가적인 서열을 포함하여, 이시스트론성 또는 다시스트론성 발현이 가능할 수 있다. 바이러스 벡터에서 사용되는 이러한 서열의 예는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 퍼린 절단 부위 (furin cleavage site), 바이러스 2A 펩티드 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원에 특이적인 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화하는 핵산은 벡터의 하나 이상의 특정 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 결찰되는 암호화 서열의 발현 및 처리에 영향을 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율성을 향상시키는 서열 (즉, Kozak 합의 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 관심 유전자 및 관심 유전자를 조절하기 위해 트랜스에서 또는 멀리서 작용하는 발현 조절 서열과 인접하면 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 또는 플라스미드 벡터는 형질도입 마커 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, tEGFR, tCD19, tNGFR 등)를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 폴리뉴클레오티드 작제물을 숙주 세포 (예를 들어, 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포)에 전달할 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 예를 들어 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포 또는 이들의 조합과 같은 인간 면역계 세포에 작제물을 전달할 수 있다. 추가 실시양태에서, 벡터는 작제물을 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의의 조합으로 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 작제물을 암호화하는 벡터는 숙주 세포에서 염색체 녹아웃을 수행하거나 (예를 들어, CRISPR-Cas 엔도뉴클레아제 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 엔도뉴클레아제) 또는 유전자 요법 대체 또는 유전자 복구 요법에서 치료용 이식 유전자 또는 이의 일부를 숙주 세포에 전달하는 데 사용될 수 있는 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 염색체 녹아웃 또는 유전자 대체 또는 유전자 복구 요법에 사용되는 뉴클레아제가 본 개시 내용의 작제물을 암호화하는 벡터와 독립적으로 숙주 세포에 전달될 수 있다.
KRAS G12V 또는 Her2-ITD 펩티드 항원에 특이적인 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 재조합적으로 생산하는데 사용되는 발현 벡터의 작제는 예를 들어 Sambrook, et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) and Ausubel, et al. (Current Protocols in Molecular Biology (2003))에 기재된 바와 같은 제한 엔도뉴클레아제 분해, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제 및 DNA 시퀀싱의 사용을 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 적합한 분자 생물학 공학 기술에 의해 달성될 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 얻기 위해 각 재조합 발현 작제물의 폴리뉴클레오티드는 관심있는 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 리더 서열 및 특히 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 (즉, 작동적으로) 연결된 프로모터와 같은 하나 이상의 적절한 발현 조절 서열 (조절 서열이라고도 함)을 포함한다.
또한 본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 (예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드 암호화를 포함) 및/또는 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같은 조혈 전구 세포 또는 면역계 세포, 예컨대 인간 면역계 세포일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이의 임의의 조합이다. 추가적으로, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 바와 같은 벡터를 사용하여 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 함유하도록 변형된다.
재조합 숙주 세포는 동종, 동계 또는 자가 (예를 들어, 치료를 위해 숙주 세포를 받는 대상)일 수 있다. 숙주 세포가 내인성 TCR을 암호화하는 특정 실시양태에서, T 세포에 의해 발현된 이종 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 내인성 TCR에 비해 CD3 단백질과 더 효율적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 T 세포에 의해 발현된 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 CD3 복합체와 회합할 수 있고 기능성 표면 발현 및 면역 활성, 예를 들어 사이토카인의 생성 및/또는 항원-발현 표적 세포의 사멸을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR은 내인성 TCR에 비해 더 높은 세포 표면 발현을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, KRAS V12G 펩티드 항원에 특이적인 결합 단백질 또는 친화성 TCR을 발현 및/또는 암호화하는 본 개시 내용에 따른 재조합 숙주 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, NK-T 세포 등)는 펩티드 항원 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재하에 IFN-γ와 같은 사이토카인을 생산할 수 있지만, 대조군 또는 참조 분자 (예를 들어, 이를 암호화하는 야생형 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)의 존재하에서는 덜 생산하거나 전혀 생산하지 않는다. 특정 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 펩티드 항원이 10, 1, 0.1 또는 약 0.01 μg/mL로 존재할 때 IFN-γ를 생성할 수 있다 (예를 들어, 펩티드가 펩티드 항원을 제시할 수 있는 표적 세포에 도입되는 경우 및 재조합 숙주 면역 세포가 표적 세포의 존재하에 있는 경우). 추가 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 (a) 표적 세포 (예를 들어, 1:2 재조합 숙주 면역 세포:표적 세포 비율에서) 및 (b) 0.01 μg/mL (또는 그 미만) 내지 약 100 μg/mL의 항원의 존재하에 있는 경우 적어도 약 100, 200, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생성할 수 있다. 사이토카인 생산은 예를 들어, eBioscience 제 인간 IFN-γ ELISA 키트 또는 Mabtech 제 ELISpot-Pro 키트와 같은 사이토카인 ELISA 키트를 사용하여 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 KRAS G12V 펩티드 및 항-HLA-DQ 항체, 항-HLA-DR 항체 또는 둘 모두의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 (a) KRAS G12V 펩티드 항원 및/또는 KRAS G12V 펩티드 암호화 핵산 (예를 들면, RNA) 및 (b) (i) HLA-DRB1-1101 또는 HLA DRB1-1104를 발현하고 (ii) KRAS G12V 항원을 숙주 면역 세포에 제시할 수 있는 세포주의 존재하에서 IFN-γ를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 Her2-ITD 펩티드 항원 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재하에 있을 때, Her2-ITD-특이적 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 (즉, 이종 폴리뉴클레오티드 암호화 포함) 및/또는 발현하고 사이토카인, 예를 들어 IFN-γ를 생산할 수 있지만, 야생형 서열을 갖는 기준 Her2 펩티드 (즉, 내부 순차 복제를 포함하지 않는 야생형 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 텝티드) 또는 야생형 Her2 펩티드를 암호화하는 기준 폴리뉴클레오티드의 존재하에 있는 경우 더 낮은 수준으로 사이토카인을 생산한다.
특정 실시양태에서, 재조합 숙주 면역 세포는 약 1 재조합 숙주 면역 세포:2 표적 세포 비율의 표적 (항원 제시 세포)의 존재하 및 추가로 약 0.01 내지 약 0.05 μg/mL의 Her2-ITD 펩티드 항원의 존재하에 적어도 약 50, 60, 70, 80 또는 그 이상의 pg/mL IFN-γ, 및/또는 (a) 표적 세포 및 (b) 펩티드 항원의 존재하에 펩티드 항원이 각각 약 0.02, 0.2, 2 또는 20 μg/mL로 존재할 때 적어도 약 100, 500, 1000, 5,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 면역 세포는 표적 세포, Her2-ITD 펩티드 항원 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 항-HLA-DR 항체 및/또는 항-HLA 클래스 I 항체의 존재하에 IFN-γ를 생산할 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 면역 세포는 Her2-ITD 펩티드 항원 및/또는 Her2-ITD 펩티드 암호화 RNA 및 HLA-DQB1-0501 또는 HLA-DQB1-0502를 발현하는 세포주의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있고. 숙주 면역 세포에 Her2-ITD 펩티드 항원을 제시할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 숙주 면역 세포와 같은 숙주 세포는 예를 들어 PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분 또는 TCR 성분 또는 이들의 임의의 조합과 같은 내인성 면역 세포 단백질의 염색체 유전자 녹아웃을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "염색체 유전자 녹아웃"은 숙주 세포에 의한 기능적 활성 내인성 폴리펩티드 산물의 생산을 방지 (예를 들어, 감소, 지연, 억제 또는 폐지)하는 숙주 세포에 도입된 저해제 또는 유전자 변경을 지칭한다. 염색체 유전자 녹아웃을 초래하는 변경은 예를 들어 도입된 넌센스 돌연변이 (조기 정지 코돈의 형성 포함), 미스센스 돌연변이, 유전자 결실 및 가닥 파손뿐만 아니라 숙주 세포에서 내인성 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 분자의 이종 발현을 포함할 수 있다.
염색체 유전자 녹아웃은 녹아웃 절차 또는 제제의 사용 후 숙주 면역 세포의 DNA 시퀀싱에 의해 직접 확인할 수 있다. 염색체 유전자 녹아웃은 또한 녹아웃 후 유전자 발현의 부재 (예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 mRNA 또는 폴리펩티드 산물의 부재)로부터 추론할 수 있다.
특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃 또는 유전자 녹인은 숙주 세포의 염색체 편집에 의해 만들어진다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제를 사용하여 염색체 편집을 수행할 수 있다. 본원에 사용된 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 사슬 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 엔도뉴클레아제는 표적화된 유전자를 절단함으로써 표적화된 유전자를 불활성화 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 엔도뉴클레아제는 자연 발생, 재조합, 유전자 변형 또는 융합 엔도뉴클레아제일 수 있다. 엔도뉴클레아제로 인한 핵산 가닥 파손은 일반적으로 상동 재조합 또는 비상동 말단 결합 (NHEJ)의 특징적인 메커니즘을 통해 복구된다. 상동성 재조합 동안, 공여자 핵산 분자는 공여자 유전자 "녹-인", 표적 유전자 "녹아웃" 및 임의적으로 공여자 유전자 녹인 또는 표적 유전자 녹아웃 이벤트를 통해 표적 유전자를 비활성화하는 데 사용될 수 있다. NHEJ는 절단 부위에서 DNA 서열의 변화, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 종종 초래하는 오류가 발생하기 쉬운 복구 과정이다. NHEJ는 표적 유전자를 "녹아웃"하는데 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 예에는 징크 핑거 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, CRISPR-Cas 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 및 메가 TAL이 포함된다.
본원에 사용된 "아연 핑거 뉴클레아제" (ZFN)는 Fokl 엔도뉴클레아제와 같은 비특이적 DNA 절단 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 약 30 개 아미노산의 각 징크 핑거 모티프가 약 3 개 염기쌍의 DNA에 결합하고, 특정 잔기의 아미노산이 삼중 서열 특이성을 변경하도록 변화될 수 있다 (예를 들어, Desjarlais et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993; Wolfe et al., J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999 참조). 다수의 징크 핑거 모티프가 약 9 내지 약 18 개 염기쌍 범위의 길이를 갖는 영역과 같은 원하는 DNA 서열에 대한 결합 특이성을 생성하기 위해 순차으로 연결될 수 있다. 배경으로, ZFN은 게놈에서 부위 특이적 DNA 이중 가닥 파손 (DSB)의 형성을 촉매함으로써 게놈 편집을 매개하고, DSB 부위에서 게놈과 상동성인 측면 서열을 포함하는 이식 유전자의 표적화된 통합이 상동성 지정 복구에 의해 촉진된다. 대안적으로, ZFN에 의해 생성된 DSB는 절단 부위에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 초래하는 오류가 발생하기 쉬운 세포 복구 경로인 NHEJ (비상동성 말단 결합 (non-homologous end joining))에 의한 복구를 통해 표적 유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 ZFN 분자를 사용하여 만들어진 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "전사 활성 인자-유사 이펙터 뉴클레아제" (TALEN)는 TALE DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인, 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. "TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위로 구성되며, 각각은 일반적으로 분기된 12 번째 및 13 번째 아미노산을 갖는 고도로 보존된 33-35 아미노산 서열을 갖는다. TALE 반복 도메인은 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. RVD (Repeat Variable Diresidue)라고하는 분기 아미노산 잔기는 특정 뉴클레오티드 인식과 관련이 있다. 이러한 TALE의 DNA 인식을 위한 자연 (정규) 코드는 TALE의 위치 12 및 13에 있는 HD (히스틴-아스파르트산) 서열이 시토신 (C)에 TALE 결합, T 뉴클레오티드에 NG (아스파라긴-글리신) 결합, A에 NI (아스파라긴-이소류신) 결합, G 또는 A 뉴클레오티드에 NN (아스파라긴-아스파라긴) 결합, T 뉴클레오티드에 NG (아스파라긴-글리신) 결합에 이르도록 결정되었다. 비정규 (비정형) RVD가 또한 알려져 있다 (예를 들어, 비정형 RVD가 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 US 2011/0301073 참조). TALEN은 T 세포의 게놈에서 부위 특이적 이중 가닥 파손 (DSB)을 지시하는 데 사용할 수 있다. 비상동성 말단 결합 (NHEJ)은 어닐링을 위한 서열 중첩이 거의 또는 전혀 없는 이중 가닥 파손의 양쪽에서 DNA를 결찰시켜 유전자 발현을 녹아웃시키는 오류를 유발한다. 대안적으로, 상동성 지정 복구는 DSB의 부위에 이식 유전자를 도입할 수 있으며, 이는 상동 측면 서열이 이식 유전자에 존재하도록 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하고 TALEN 분자를 사용하여 제조된다.
본원에 사용된 "CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas)" 뉴클레아제 시스템은 염기쌍 상보성을 통해 게놈 내 표적 부위 (프로토스페이서로서 알려짐)를 인식한 후, 짧은, 보존된 프로토스페이서 관련 모티프 (PAM)가 상보성 표적 서열의 3' 바로 뒤에 오는 경우 DNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA (crRNA) 유도 Cas 뉴클레아제를 사용하는 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 뉴클레아제의 서열과 구조에 따라 세 가지 유형 (즉, 유형 I, 유형 II 및 유형 III)으로 분류된다. 유형 I 및 III의 crRNA 유도 감시 복합체에는 여러 Cas 서브 유닛이 필요하다. 가장 많이 연구된 유형 II 시스템은 RNA 유도 Cas9 뉴클레아제, crRNA 및 트랜스-작용 crRNA (tracrRNA)의 적어도 세 구성 요소로 구성된다. tracrRNA는 이중체 형성 영역을 포함한다. crRNA 및 tracrRNA는 Cas9 뉴클레아제와 상호 작용하고 Cas9/crRNA:tracrRNA 복합체를 crRNA 상의 스페이서와 PAM으로부터 표적 DNA 상류상의 프로토스페이서 사이의 Watson-Crick 염기 쌍을 통해 표적 DNA의 특정 부위로 안내할 수 있는 이중체를 형성한다. Cas9 뉴클레아제는 crRNA 스페이서에 의해 정의된 영역 내에서 이중 가닥 절단을 절단한다. NHEJ에 의한 복구는 표적 유전자좌의 발현을 방해하는 삽입 및/또는 결실을 초래한다. 대안적으로, 상동성 측면 서열을 갖는 이식 유전자는 상동성 지정 복구를 통해 DSB의 부위에 도입될 수 있다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 가이드 RNA (sgRNA 또는 gRNA)로 조작될 수 있다 (예를 들어, Jinek et al., Science 337:816-21, 2012 참조). 또한, 표적 부위에 상보성인 가이드 RNA의 영역은 원하는 서열을 표적으로 하기 위해 변경되거나 프로그래밍될 수 있다 (Xie et al., PLOS One 9:e100448, 2014; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0068797, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0186843; 미국 특허 번호 8,697,359 및 PCT 공개 번호 WO 2015/071474; 각각본원에 참조로 포함됨). 특정 실시양태에서, 유전자 녹아웃은 삽입, 결실, 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하고 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 사용하여 제조된다.
예시적인 gRNA 서열 및 이를 사용하여 면역 세포 단백질을 암호화하는 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법은 문헌 [Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017) 참조, 그의 gRNA, CAS9 DNA, 벡터 및 유전자 녹아웃 기술은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다]에 기술되어 있다.
본원에 사용된, "호밍 엔도뉴클레아제"로도 지칭되는 "메가뉴클레아제"는 큰 인식 부위 (약 12 개 내지 약 40 개 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 지칭한다. 메가뉴클레아제는 서열 및 구조 모티프를 기반으로 5 개의 패밀리로 나눌 수 있다: LAGLIDADG (서열 번호 159), GIY-YIG (서열 번호 160), HNH, His-Cys box 및 PD-(D/E)XK (서열 번호 161). 예시적인 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함하며, 그 인식 서열은 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,420,032 및 6,833,252; Belfort et al., Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998 참조).
특정 실시양태에서, 자연 발생 메가뉴클레아제는 PD-1, LAG3, TIM3, CTLA4, TIGIT, HLA-암호화 유전자, 또는 TCR 성분-암호화 유전자로부터 선택된 표적의 부위-특이적 게놈 변형을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 유전자에 대한 새로운 결합 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제가 부위-특이적 게놈 변형에 사용된다 (예를 들어, Porteus et al., Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005; Sussman et al., J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004; Epinat et al., Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec. Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007; 미국 특허 공개 번호 US 2007/0117128; US 2006/0206949; US 2006/0153826; US 2006/0078552; 및 US 2004/0002092 참조). 추가 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 megaTAL로 알려진 융합 단백질을 만들기 위해 TALEN의 모듈형 DNA 결합 도메인으로 변형된 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 생성된다. MegaTAL은 하나 이상의 표적 유전자를 녹아웃시킬뿐만 아니라 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 외인성 공여자 템플릿과 함께 사용되는 경우 이종성 또는 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입 (녹인)하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 염색체 유전자 녹아웃은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 수용체를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)로 도입되는 억제 핵산 분자를 포함하고, 여기서 억제 핵산 분자는 표적 특이적 저해제를 암호화하고, 암호화된 표적 특이적 저해제는 숙주 면역 세포에서 내인성 유전자 발현 (즉, PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분 또는 TCR 성분, 또는 이들의 임의의 조합의)을 억제한다.
특정 실시양태에서, 관심있는 결합 단백질 또는 TCR은 내인성 TCR 유전자좌에 녹인될 수 있고, 이에 의해 내인성 TCR을 녹아웃시키고 관심있는 단백질을 녹인할 수 있다. 예를 들어, Eyquem et al., Nature 543(7643):113-117 (2017) 참조.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 결합 단백질 또는 재조합 고친화성 TCR을 암호화 및/또는 발현하는 숙주 면역 세포는 예를 들어, 종양과 같이 동족 항원 (KRAS G12V 또는 Her2-ITD)을 발현하는 표적 조직으로 우선적으로 이동하거나 생체 내에서 국소화될 수 있지만, 동일 유형의 비인접 조직에 통계적으로 유의하게 감소된 양으로 존재한다. 예를 들어, 숙주 면역 세포는 폐 종양에 존재할 수 있지만 (예를 들어, 암호화된 결합 단백질의 TCR V-영역에 대한 딥 시퀀싱을 사용하여 결정된 바와 같이), 종양에 인접하지 않은 동일한 폐의 조직에 더 낮은 수준으로 존재하거나 전혀 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-인접 조직은 질환 또는 악성 조직으로부터 적어도 3 cm 제거된 조직을 포함하거나 이를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 대상에게 투여될 수 있는 것과 같이 세포 조성물에 풍부하다. 본원에 사용된 바와 같은, 혼합물의 세포 유형의 양과 관련하여 "풍부한" 또는 "고갈된"은 하나 이상의 농축 또는 고갈 과정 또는 단계에서 발생하는 세포의 혼합물에서 "풍부한" 유형의 수의 증가, "고갈된" 세포 수의 감소 또는 둘 다를 지칭한다. 따라서 풍부화 과정을 거친 원래 세포 집단의 출처에 따라, 혼합물 또는 조성물은 "풍부한" 세포의 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 (수 또는 개수)을 포함할 수 있다. 고갈 과정을 거친 세포는 고갈된" 세포의 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 (수 또는 개수)를 함유하는 혼합물 또는 조성물로 이어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 혼합물에서 특정 세포 유형의 양은 풍부화될 것이고 상이한 세포 유형의 양은 고갈될 것이며, 예를 들어, CD4+ 세포가 풍부화되는 반면, CD8+ 세포는 고갈되거나, CD62L+ 세포가 풍부화되는 반면 CD62L- 세포가 고갈되거나, 또는 이들의 조합이 가능하다.
또한 유효량의 변형된 면역 세포 또는 변형된 면역 세포를 포함하는 조성물을 포함하는 단위 용량이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다 (즉, 유사한 수의 PBMC를 갖는 환자 샘플과 비교하여 단위 용량에 존재하는 나이브 T 세포 집단의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5 미만%, 또는 약 1% 미만).
일부 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 50% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 50% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 60% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 60% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 70% 조작된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 70% 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 80% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 80% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 85% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 85% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단위 용량은 (i) 적어도 약 90% 변형된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물을, (ii) 적어도 약 90% 변형된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물과 약 1:1 비율로 조합하여 포함하며, 여기서 단위 용량은 나이브 T 세포를 감소된 양으로 포함하거나 실질적으로 포함하지 않는다.
본 개시 내용의 단위 용량이 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, TCR 또는 재조합 숙주 세포 (즉, KRAS G12V 또는 HER2-ITD 항원에 특이적인 결합 단백질 발현) 및 상이한 항원 (예를 들어, 상이한 KRAS 또는 HER2 항원, 또는 상이한 단백질 또는 표적으로부터의 항원, 예를 들어 BCMA, BRAF, CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-아세틸 GD2, O-아세틸 GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, 루이스 A, 루이스 Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A (예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A3, 및 MAGE-A4 포함), 메소텔린, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, HLA에 결합된 종양 또는 병원체 관련 펩티드, HLA에 결합된 hTERT 펩티드, HLA에 결합된 티로시나제 펩티드, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, HA1-H, Robo1, α-페토단백질 (AFP), 프리즐드, OX40, PRAME, 및 SSX-2 등)에 특이적인 결합 단백질을 발현하는 변형된 면역 세포를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 단위 용량은 KRAS G12V:HLA 또는 HER2-ITD:HLA 복합체에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 변형된 CD4+ T 세포 및 BRAFV600E 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 (예를 들어, CAR)을 발현하는 변형된 CD4+ T 세포 (및/또는 변형된 CD8+ T 세포)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 단위 용량은 동일하거나 거의 동일한 수의 조작된 CD45RA- CD3+ CD8+ 및 변형된 CD45RA- CD3+ CD4+ TM 세포를 포함한다.
본 개시 내용의 다양한 실시양태를 실행함에 있어서, 재조합 DNA, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드 합성; 면역 분석; 조직 배양; 및 변형 (예를 들면, 전기천공 및 리포펙션)에 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라, 또는 당 업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 및 관련 기술 및 절차는 일반적으로 당 업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 분자 유전학, 세포 생물학, 바이러스학 및 면역학 기술에서의 각종 일반적이고 보다 특정적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다 (예를 들어, Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of 복합체 Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3rd Edition, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001); 및 Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008) 참조).
용도
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 조성물 (예를 들어, 결합 단백질, TCR, 재조합 숙주 세포, 면역원성 조성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 관련 조성물)을 이를 필요로 하는 대상 (즉, KRAS G12V 항원 및/또는 Her2-ITD 항원과 관련된 질환 또는 장애를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상)에게 투여함으로써 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 질환에는 다양한 형태의 증식성 또는 과증식성 장애, 예를 들어 고형암 및 혈액 악성 종양이 포함된다.
"치료한다" 또는 "치료" 또는 "개선한다"는 대상 (인간 또는 예를 들어, 영장류, 말, 개, 마우스 또는 래트 등의 비인간 포유동물)의 질환, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시의 숙주 세포 및 임의로 애쥬번트를 포함하는 적절한 용량 또는 치료법이 치료적 또는 예방적 이점을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 또는 예방적/방지적 혜택에는 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생의 감소; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태 연장; 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 차도; 생존; 장기 생존; 또는 이들의 임의 조합이 포함된다.
본 개시 내용의 조성물 (예를 들어, 이를 발현하거나 암호화하는 결합 단백질 또는 숙주 세포)의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 치료하고자 하는 질환의 하나 이상의 증상을 통계적으로 유의한 방식으로 개선시키기에 충분한 화합물 또는 세포의 양을 지칭한다. 단독 투여되는 개별 활성 성분 또는 단독 활성 성분을 발현하는 세포를 언급할 때, 치료적 유효량은 그 성분 또는 그 성분만을 발현하는 세포의 효과를 가리킨다. 조합을 지칭할 때, 치료적 유효량은 연속적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 상관없이, 치료적 효과로 이어지는 활성 성분의 조합된 양, 또는 조합된 보조 활성 성분과 활성 성분을 발현하는 세포의 조합된 양을 지칭한다. 조합은 또한 동일하거나 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2 개의 상이한 결합 단백질과 같이 하나 이상의 활성 성분을 발현하는 세포일 수 있다.
본원에서 "통계적으로 유의하다"는 것은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산했을 때 0.050 이하의 p 값을 나타내며 측정되는 특정 사건이나 결과가 우연히 발생하지 않았음을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "양자 면역치료" 또는 "입양 면역요법"은 자연 발생 또는 유전자 조작된 질환 항원 특이적 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 투여를 지칭한다. 양자 세포 면역요법은 자가 (면역 세포는 수용자에게서 유래), 동종 (면역 세포는 같은 종의 공여자로부터 유래) 또는 동족 (면역 세포는 수용자와 유전적으로 동일한 공여자로부터 유래됨)일 수 있다.
본원에 사용된 "과증식성 장애"는 정상 또는 무병 세포와 비교하여 과도한 성장 또는 증식을 지칭한다. 예시적인 과증식성 장애는 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전암성 세포뿐만 아니라, 비-신생물성 또는 비악성 과증식성 장애 (예를 들어, 선종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 혈관종, 섬유증, 재협착증 및 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환 등과 같은 자가 면역 질환)을 포함한다. 과증식성 질환의 맥락에서보다 더 느리게 발생하는 비정상적 또는 과도 한 성장을 수반하는 특정 질환은 "증식성 질환"으로 지칭될 수 있으며 특정 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전악성 세포뿐만 아니라, 비종양성 또는 비악성 질환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 결합 단백질, 고친화성 재조합 TCR, 숙주 세포, 면역원성 조성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 유효량의 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상은 NSCLC, 결장직장암, 췌장암, 담즙암, 유방암, 난소암, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증을 갖거나 가질 것으로 의심될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상 (또는 대상 질환)은 KRAS G12V 신생 항원 또는 Her2-ITD 신생 항원 중 적어도 하나를 발현한다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 이점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 분자 또는 세포를 제공한다. 이러한 반응은 치료되지 않은 대상과 비교하여 치료된 대상에서 개선된 임상 결과 (예를 들어, 더 빈번한 관해, 완전 또는 부분적 또는 더 긴 무병 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. 종양 단백질에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 관련이 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 일상적인 표준 증식, 세포 독성 또는 사이토카인 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
예방적 사용을 위해, 용량은 질환 또는 장애와 관련된 질환을 예방하거나, 질환의 개시를 지연시키거나 또는 질환의 중증도를 감소시키는데 충분하여야 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조성물의 예방적 이점은 전임상 (시험관 내 및 생체 내 동물 연구를 포함) 및 임상 연구를 수행함으로써 그리고 적절한 통계적, 생물학적 및 임상적 방법 및 기법으로부터 얻은 데이터를 분석함으로써 결정될 수 있으며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질, 고친화성 재조합 TCR, 숙주 (즉, 변형된) 면역 세포, 면역원성 조성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 (조성물)이 또한 고려된다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합을 포함한다. 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물은 적합한 주입 매질을 추가로 포함한다. 적합한 주입 매질로 임의의 등장성 매질 제형, 전형적으로 생리 식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter), 수중 5% 덱스트로스, 링거 락테이트가 사용될 수 있다. 주입 매질에는 인간 혈청 알부민 또는 다른 인간 혈청 성분이 보충될 수 있다.
약학적 조성물은 의학 분야 업자에 의해 결정되는 바와 같이 치료 (또는 예방)될 질환 또는 상태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 지속 기간 및 투여 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기 (즉, 체중, 질량 또는 체표면적), 환자 상태의 유형 및 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점 (예컨대 개선된 임상 결과, 이를테면 더 빈번한 완전 또는 부분적 관해, 또는 더 긴 무 질환 및/또는 전반적 생존, 또는 증상 중증도의 감소를 포함하여, 본원에 기재된 바와 같이)을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다.
유효량의 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 목적하는 임상 결과 또는 이로운 치료를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안에서의 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 투여가 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 알려졌거나 확인된 대상에 대한 것인 경우, 용어 "치료량"은 치료와 관련하여 사용될 수 있고, 반면에 "예방적 유효량"은 예방적 과정으로서 질환 또는 질환 상태의 발생 (예를 들어, 재발)에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상에 대한 유효량의 투여를 기술하기 위해 사용될 수 있다.
입양 세포 요법의 경우, 치료적 유효 용량은 치료된 인간 또는 인간이 아닌 포유동물에서 임상적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 입양 전달에 사용되는 KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원에 특이적인 결합 단백질 또는 고친화성 재조합 TCR을 암호화 및/또는 발현하는 숙주 세포의 양 (즉, 통계적으로 유의한 방식으로 KRAS G12V 또는 Her2-ITD 신생 항원을 발현하는 세포에 대한 특정 T 세포 면역 반응, 예를 들어 세포 독성 T 세포 반응을 유도하거나 향상시키기에 충분한 양)이다. 다양한 실시양태에서, 치료적 유효 용량은 CD4+ T 세포 단독의 양이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합이다.
조성물 또는 단위 용량에서 세포의 양은 적어도 하나의 세포 (예를 들어, 하나의 재조합 CD8+ T 세포 하위 집단 (예를 들어, 임의로 기억 및/또는 나이브 CD8+ T 세포를 포함함); 하나의 재조합 CD4+ T 세포 하위 집단 (예를 들어, 임의로 기억 및/또는 나이브 CD4+ T 세포를 포함함)이거나, 보다 전형적으로 102 개 초과의 세포, 예를 들어 최대 104 개, 최대 105 개, 최대 106 개, 최대 107 개, 최대 108 개, 최대 109 개, 또는 1010 개 초과의 세포이다. 특정 실시양태에서, 세포는 약 104 내지 약 1010 세포/㎡의 범위, 바람직하게는 약 105 내지 약 109 세포/㎡의 범위로 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 최대 약 3.3×105 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 최대 약 1×106 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 최대 약 3.3×106 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 용량은 최대 약 1×107 세포/kg을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 최대 약 5×104 개 세포/kg, 5×105 개 세포/kg, 5×106 개 세포/kg, 또는 최대 약 5×107 개 세포/kg를 포함하는 용량으로 대상에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 적어도 약 5×104 세포/kg, 5×105 세포/kg, 5×106 세포/kg, 또는 최대 약 5×107 세포/kg을 포함하는 용량으로 대상에게 투여된다. 세포의 수는 조성물이 의도된 최종 용도뿐만 아니라 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 결합 단백질을 발현하거나 암호화하도록 변형된 세포는 이들 세포를 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 함유하는 세포 집단을 포함할 것이다. 본원에서 제공되는 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 리터 이하, 500 ml 이하, 250 ml 이하, 또는 100 ml 이하의 부피로 존재한다. 실시양태들에서, 원하는 세포의 밀도는 전형적으로 104 개 세포/ml보다 크고, 일반적으로 107 개 세포/ml보다 크고, 일반적으로 108 개 세포/ml보다 크다. 세포는 단일 주입으로 또는 일정 기간에 걸쳐 다중 주입으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 임상적으로 관련된 수의 세포는 누적적으로 106, 107, 108, 109, 1010 또는 1011 세포이거나 이를 초과하는 다중 주입으로 할당될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 단위 용량은 동종이계 공여자로부터의 조혈 줄기 세포와 공동 (예를 들어, 동시에 또는 동반하여) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단위 용량에 포함된 하나 이상의 세포는 대상에 자가이다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 밀봉된 앰플 또는 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 용기에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 환자에게 주입될 때까지 제형의 안정성을 보존하기 위해 냉동될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 투여는 전달 경로 또는 방식에 관계없이, 예를 들어 정맥 내, 경구, 질, 직장, 피하 등과 같이 대상에게 이를 전달하는 것을 의미한다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로 및 비경구적으로 시행될 수 있다. 투여는 인식된 상태, 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 확인된 대상을 치료하기 위한 것일 수 있거나, 그러한 상태, 질환 또는 질환 상태에 민감하거나 일어날 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 보조 요법과의 공동 투여는 임의의 순서 및 임의의 투여 계획으로 다수 작용제 (예를 들어, 1종 이상의 사이토카인을 갖는 재조합 숙주 세포; 면역억제 요법, 예컨대 칼시뉴린 저해제, 코티코스테로이드, 미소관 저해제, 저용량 마이코페놀산 전구약물 또는 이들의 임의 조합물)의 동시 및/또는 순차적 전달을 포함할 수 있다.
대상 조성물이 비경구로 투여되는 경우, 조성물은 또한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 비경구적으로 허용 가능한 비독성 희석제 또는 용매는 물, 링거액, 등장성 염 용액, 1,3-부탄디올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 물과의 혼합물로의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 용액 또는 현탁액은 또한 1종 이상의 완충제, 예컨대, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 타르트산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는 데 사용되는 모든 물질은 약학적으로 순수하고, 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상에 대해서 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 적절한 약학적 담체와 함께 목적하는 효과를 생성하도록 계산된 재조합 세포 또는 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 재조합 숙주 세포)의 복수 용량이 대상에게 투여되고, 이는 약 2 내지 약 4 주의 투여 간격으로 투여될 수 있다.
본 개시 내용의 치료 또는 예방 방법은 본원에 개시된 단위 용량, 세포 또는 조성물의 투여 전 또는 후에 추가 치료를 포함할 수 있는 치료 과정 또는 요법의 일부로서 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 대상은 단위 용량을 받는다 (예를 들어, 재조합 숙주 세포가 조혈 세포 이식 (HCT; 골수 절제 및 비골수 절제 HCT 포함)을 받고 있거나 이전에 받은 적이 있음). HCT를 수행하기 위한 기술 및 요법은 당 업계에 공지되어 있으며, 제대혈, 골수 또는 말초 혈액, 조혈 줄기 세포, 동원된 줄기 세포, 또는 양수 세포로부터 유래된 세포와 같은 임의의 적합한 공여자 세포의 이식을 포함할 수 있다. 따라서 특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 재조합 숙주 세포는 변형된 HCT 요법에서 조혈 줄기 세포와 함께 또는 그 직후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, HCT는 HLA 성분을 암호화하는 유전자, TCR 성분을 암호화하는 유전자의 염색체 녹아웃 또는 둘 다를 포함하는 공여자 조혈 세포를 포함한다.
CTL 면역 반응의 수준은 본원에 기술되고 당 업계에서 일상적으로 실시되는 수많은 면역학적 방법 중 어느 하나에 의해 결정될 수 있다. CTL 면역 반응의 수준은 본원에 기술된 KRAS G12V- 또는 Her2-ITD-특이적 결합 단백질 또는 TCR (또는 이를 암호화 및/또는 발현하는 숙주 세포) 중 어느 하나 또는 면역원성 조성물의 투여 전 및 후에 결정될 수 있다. CTL 활성을 결정하기 위한 세포 독성 분석은 당 업계에서 일상적으로 실행되는 여러 기술 및 방법 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Henkart, et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), pages 1127-50, 및 여기에 인용된 참고 문헌 참조).
항원-특이적 T 세포 반응은 적절한 상황에서 동족 항원 (예를 들어, 면역적합성 항원-제시 세포에 의해 제시될 때 T 세포를 프라이밍하거나 활성화하기 위해 사용되는 항원)에 노출되는 T 세포와 구조적으로 상이하거나 비관련 대조군 항원 대신에 노출되는 동일한 공급원 집단으로부터의 T 세포 사이에 만들어질 수 있는 본원에 기재된 임의의 T 세포 기능성 매개변수 (예를 들어, 증식, 사이토카인 방출, CTL 활성, 변경된 세포 표면 마커 표현형 등)에 따라 관찰된 T 세포 반응의 비교에 의해 전형적으로 결정된다. 대조군 항원에 대한 반응보다 통계학적 유의도가 더 큰 동족 항원에 대한 반응은 항원-특이성을 의미한다.
본원에 기재된 KRAS G12V- 또는 Her2-ITD-유래 신생 항원 펩티드에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플 (이로부터 혈청 또는 혈장이 준비될 수 있음), 생검 표본, 체액 (예를 들어, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식편, 기관 배양물 또는 대상 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물을 받기 전에 대상으로부터 얻을 수 있는데, 이의 생물학적 샘플은 기준선 (즉, 사전 면역화) 데이터를 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.
일부 실시양태에서, 대상 조성물을 받은 대상은 이전에 림프 고갈 화학 요법을 받은 적이 있다. 추가 실시양태에서, 림프 고갈 화학 요법은 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 항-흉선 세포 글로불린, 옥살리플라틴 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 개시 내용에 따른 방법은 조합 요법에서 질환 또는 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 추가 약제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 조합 요법은 조성물 (예를 들어, 결합 단백질, 고친화성 재조합 TCR, 이를 암호화 및/또는 발현하는 변형된 숙주 세포, 면역원성 조성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터)을 면역 체크포인트 저해제와 (동반하여, 동시에, 또는 순차적으로) 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 자극성 면역 체크포인트제의 작용제와 함께 본 개시 내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 조합 요법은 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 항체 또는 이들의 임의의 조합과 같은 2 차 요법과 함께 본 개시 내용의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 억제 약제" 또는 "면역억제제"는 면역 반응을 제어하거나 억제하는 데 도움을 주기 위한 억제 신호를 제공하는 하나 이상의 세포, 단백질, 분자, 화합물 또는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, 면역 억제제는 면역 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나; 면역 활성화를 감소, 예방 또는 지연시키거나; 면역 억제를 증가, 활성화 또는 상향조절하는 분자를 포함한다. (예를 들어, 면역 체크포인트 저해제와 함께) 표적에 대한 예시적인 면역 억제 약제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (CD112R), PVRL2, 아데노신, A2aR, 면역억제성 사이토카인 (예를 들어, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL-35), IDO, 아르기나제, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, Treg 세포 또는 이들의 임의 조합을 포함한다.
면역 억제 약제 (면역 체크포인트 저해제라고도 지칭됨)는 화합물, 항체, 항체 단편 또는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 융합체, 예컨대, CTLA4-Fc 또는 LAG3-Fc), 안티센스분자, 리보자임 또는 RNAi 분자 또는 저분자량 유기 분자일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 방법은 단독으로 또는 임의의 조합으로 하기 면역 억제 성분 중 어느 하나의 1종 이상의 저해제와 함께 본 개시의 조성물을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시 내용에 따른 치료 방법은 PD-1 저해제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. PD-1 저해제는 니볼루맙 (OPDIVO®); 펨브롤리주맙 (KEYTRUDA®); 이필리무맙 + 니볼루맙 (YERVOY® + OPDIVO®); 세미플리맙; IBI-308; 니볼루맙 + 렐라틀리맙; BCD-100; 캠렐리주맙; JS-001; 스파르탈리주맙; 티스렐리주맙; AGEN-2034; BGBA-333 + 티스렐리주맙; CBT-501; 도스타리맙; 두르발루맙 + MEDI-0680; JNJ-3283; 파조파닙 하이드로클로라이드 + 펨브롤리주맙; 피딜리주맙; REGN-1979 + 세미플리맙; ABBV-181; ADUS-100 + 스파르탈리주맙; AK-104; AK-105; AMP-224; BAT-1306; BI-754091; CC-90006; 세미플리맙 + REGN-3767; CS-1003; GLS-010; LZM-009; MEDI-5752; MGD-013; PF-06801591; Sym-021; 티스렐리주맙 + 파미파립; XmAb-20717; AK-112; ALPN-202; AM-0001; 알츠하이머 병에 대한 PD-1 길항 항체; BH-2922; BH-2941; BH-2950; BH-2954; 고형 종양에 대해 CTLA-4 및 PD-1을 길항하는 생물학적 제제; 종양학상 PD-1 및 LAG-3을 표적으로 하는 이중 특이적 단일 클론 항체; BLSM-101; CB-201; CB-213; CBT-103; CBT-107; 세포 면역요법 + PD-1 저해제; CX-188; HAB-21; HEISCOIII-003; IKT-202; JTX-4014; MCLA-134; MD-402; mDX-400; MGD-019; 종양학상 PDCD1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 종양 용해성 바이러스; OT-2; PD-1 길항제 + 로페그인터페론 알파-2b; PEGMP-7; PRS-332; RXI-762; STIA-1110; TSR-075; 종양학상 HER2 및 PD-1을 표적으로 하는 백신; 종양학 및 자가 면역 질환상 PD-1을 표적으로 하는 백신; XmAb-23104; 종양학상 PD-1을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; AT-16201; 종양학상 PD-1을 억제하는 이중 특이적 단일 클론 항체; IMM-1802; 고형 종양 및 혈액 종양에 대한 PD-1 및 CTLA-4를 길항하는 단일 클론 항체; 니볼루맙 바이오시밀러; 종양학상 CD278 및 CD28에 작용하고 PD-1을 길항하는 재조합 단백질; 자가 면역 장애 및 염증성 장애에 대해 PD-1을 작용시키는 재조합 단백질; SNA-01; SSI-361; YBL-006; AK-103; JY-034; AUR-012; BGB-108; 고형 종양에 대한 PD-1, Gal-9 및 TIM-3을 억제하는 약물; ENUM-244C8; ENUM-388D4; MEDI-0680; 전이성 흑색종 및 전이성 폐암에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 CTLA-4 및 PD-1을 표적으로 하는 단일 클론 항체; NSCLC에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1 및 TIM-3을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 혈액암 및 고형 종양에 대한 PD-1 및 VEGF-A를 억제하는 재조합 단백질; 종양학상 PD-1을 길항하는 소분자; Sym-016; 이네빌리주맙 + MEDI-0680; 전이성 흑색종에 대한 PDL-1 및 IDO를 표적으로 하는 백신; 교모세포종에 대한 항-PD-1 단일 클론 항체 + 세포 면역요법; 종양학상 PD-1을 길항하는 항체; 혈액 악성 종양 및 세균 감염에 대한 PD-1/PD-L1을 억제하는 단일 클론 항체; HIV에 대한 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 및/또는 고형 종양에 대한 PD-1을 억제하는 소분자를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 LAG3 저해제, 예컨대 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016, 또는 이들의 임의의 조합과 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 CTLA4의 저해제와 조합하여 사용된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질 (예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트) 또는 이들의 임의의 조합과 같은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편과 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대 에노블리투주맙 (MGA271), 376.96, 또는 둘 모두와 조합하여 사용된다. B7-H4 항체 결합 단편은 예를 들어 Dangaj et al., Cancer Res. 73: 4820, 2013 및 미국 특허 번호 9,574,000 및 PCT 특허 공개 번호 WO/201640724A1 및 WO 2013/025779A1에 설명된 scFv 또는 융합 단백질일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 CD244의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 BLTA, HVEM, CD160 또는 이들의 임의의 조합의 저해제와 조합하여 사용된다. 항CD-160 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2010/084158에 설명되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 TIM3의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 Gal9의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 디코이 아데노신 수용체와 같은 아데노신 신호 전달의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 A2aR의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 리릴루맙 (BMS-986015)과 같은 KIR의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 억제성 사이토카인 (전형적으로, TGFβ 이외의 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 IDO 저해제, 예컨대 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트 (INCB024360; Liu et al., Blood 115: 3520-30, 2010), 엡셀렌 (Terentis et al., Biochem. 49: 591-600, 2010), 인독시모드, NLG919 (Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 2013 년 4 월 6-10 일), 1-메틸-트립토판 (1-MT)-티라-파자민, 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 아르기나제 저해제, 예컨대 N (오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌 (nor-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥사노산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC) 또는 이들의 조합과 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 CA-170 (Curis, Lexington, Mass)과 같은 VISTA 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 TIGIT의 저해제, 예를 들어 COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canada), CD155의 저해제, 예를 들어 COM701 (Compugen) 또는 둘 다와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 PVRIG, PVRL2 또는 둘 모두의 저해제와 조합하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2016/134333에 설명되어 있다. 항-PVRL2 항체는 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2017/021526에 설명되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 LAIR1 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5 또는 이들의 임의의 조합의 저해제와 조합하여 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 개시 내용의 조성물은 자극성 면역 체크포인트 분자의 활성을 증가시키는 제제 (즉, 작용제)와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 조성물은 CD137 (4-1BB) 작용제 (예를 들어, 우렐루맙 등), CD134 (OX-40) 작용제 (예를 들어, MEDI6469, MEDI6383, 또는 MEDI0562 등), 레날리도미드, 포말리도미드, CD27 작용제 (예를 들어, CDX-1127 등), CD28 작용제 (예를 들어, TGN1412, CD80, 또는 CD86 등), CD40 작용제 (예를 들어, CP-870,893, rhuCD40L, 또는 SGN-40 등), CD122 작용제 (예를 들어, IL-2 등), GITR의 작용제 (예를 들어, PCT 특허 공개 번호 WO 2016/054638호에 기술된 인간화된 단일 클론 항체), ICOS의 작용제 (CD278) (예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 또는 이들의 임의 조합 등)와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 실시양태에서, 방법은 전술한 임의의 것을 포함하는 자극성 면역 체크포인트 분자의 하나 이상의 작용제를 단독으로 또는 임의의 조합으로 본 개시 내용의 조성물과 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조합 요법은 본 개시 내용의 조성물 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 2 차 요법을 포함한다: 비염증성 고형 종양에 의해 발현되는 암 항원에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 방사선 치료, 수술, 화학요법제, 사이토카인, RNAi, 또는 이들의 임의의 조합.
특정 실시양태에서, 조합 요법 방법은 본 개시 내용의 조성물을 투여하고 방사선 치료 또는 수술을 추가로 투여하는 것을 포함한다. 방사선 요법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 감마선 조사와 같은 X 선 요법 및 방사성 의약품 요법을 포함한다. 대상에서 주어진 암을 치료하는 데 적절한 수술 및 수술 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
면역 항암 또는 항종양 반응을 촉진하는 데 유용한 사이토카인은 예를 들어 IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-24 및 GM-CSF을 단독으로 또는 임의의 조합으로 본 개시 내용의 조성물과 함께 포함한다. 추가 실시양태에서, 사이토카인 투여 전에 대상에게 항-HER2-ITD 및/또는 항-KRAS G12V 조성물이 적어도 3 회 또는 4 회 투여된다면 사이토카인은 순차적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 사이토카인은 피하 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상은 칼시뉴린 저해제, 코르티코스테로이드, 미세소관 저해제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의 조합과 같은 면역 억제 요법을 추가로 받았거나 추가로 받고 있을 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 치료되는 대상은 비골수 파괴 또는 골수 파괴 조혈 세포 이식을 받았으며, 여기서 치료는 비골수 파괴 조혈 세포 이식 후 적어도 2 내지 적어도 3 개월 후에 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조합 요법 방법은 본 개시 내용에 따른 본 개시 내용의 조성물을 투여하고 화학요법제를 추가로 투여하는 것을 포함한다. 화학요법제는 크로마틴 기능 저해제, 토포이소머라제 저해제, 미소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질 (예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 저해제, DNA 상호작용제 (예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 저해제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학요법제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 저해제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예컨대, 자연 산물, 이를테면, 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미소관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포사이드 (VP 16)); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신에서 대사시키고 그 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌 (DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 복합체 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 (aromatase) 저해제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 저해제); 섬유소 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tissue plasminogen activator), 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비저해제 (브레벨딘); 면역억제제 (사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 저해제 (혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 저해제, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 저해제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 저해제 및 분화 유도인자 (트레티노인); mTOR 저해제, 토포이소머라제 저해제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 이리노테칸 (CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드 (코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 저해제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자, 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.
본 개시 내용의 또 다른 측면은 NSCLC, 결장직장암, 췌장암, AML, 담도암, 유방암, 난소암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증 중 어느 하나 이상의 치료에 사용하고/거나, 이를 위한 입양 면역요법의 치료 및/또는 사용을 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 본 개시 내용의 조성물 (예를 들어, 결합 단백질, TCR, 숙주 세포, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 면역원성 조성물)에 관한 것이다. 본원에서 고려되는 특정 치료 또는 예방 방법은 본원에 개시된 바와 같은 결합 단백질 또는 TCR을 암호화 및/또는 발현하는 숙주 세포 (자기, 동종 또는 동계일 수 있음)를 투여하는 것을 포함한다.
또한, 이를 필요로 하는 대상을 치료하고/하거나 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 대상은 NSCLC, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, AML, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 (기타) 적응증을 갖거나 가질 것으로 의심될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 대상에게 2 회 이상 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방법은 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은) 입양 세포 요법을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 방법은 대상에게 보조제 또는 체크포인트 저해제 중 적어도 하나를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 보조제 또는 체크포인트 저해제는 IL-2, PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 CTLA-4 저해제, 또는 본원에 개시된 다른 저해제 또는 조성물 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 기반 신생 항원 백신을 포함하는 면역원성 조성물을 사용할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2017/192924 참조, 이들의 T 세포 백신, 면역원성 향상제, 트랜스포존 발현 작제물 및 관련 방법은 전체적으로 참조로 통합된다). 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 리포솜 RNA 제제를 포함한다 (예를 들어, Kreiter, et al, Nature 520: 692, 2015 참조, 이를 제조하는 제제 및 방법은 전체가 본원에 참고로 포함됨). 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있는 펩티드-펄스 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 제조하는 데 사용된다.
본 개시 내용은 또한 항원 펄스 항원 제시 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항원 처리 및 항원 제시 세포에 의한 제시가 일어나기에 충분한 조건하에서 그에 충분한 시간 동안 시험관 내에서, (i) 대상과 면역 적합성인 항원 제시 세포 집단, 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 면역원성 조성물 및/또는 발현 벡터와 접촉시켜 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 항원 펄스 항원 제시 세포를 수득하는 것을 포함한다. 상기 방법은 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 조건하에서 그에 충분한 시간 동안 항원-펄스 항원-제시 세포를 하나 또는 복수의 면역 적합성 T 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 본원에 개시된 바와 같은 KRAS G12V 특이적 면역 세포 또는 Her2-ITD 특이적 면역 세포를 시험관 내 또는 생체 외에서 확장하여 각각 KRAS G12V 특이적 면역 세포 또는 KRAS G12V 특이적 면역 세포의 하나 이상의 클론을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포를 포함하고, 방법은 T 세포 수용체 구조적 특성화에 충분한 양으로 T 세포를 확장하고, 하나 이상의 클론의 하나 이상에 대한 핵산 서열을 암호화하는 T 세포 수용체 폴리펩티드를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 결정된 T-세포 수용체 폴리펩티드-암호화 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 면역 세포 집단을 시험관 내 또는 생체 외에서 형질감염 또는 형질도입하여 세포가 대상에게 투여되는 경우 각각 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 항원 특이적 T 세포 반응을 입양 전달하거나 부여하기에 효과적인 양으로 조작된 KRAS G12V 특이적 면역 세포 또는 조작된 Her2-ITD 특이적 면역 세포 집단을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
고급 TCR 시퀀싱이 기술되었으며 (예를 들어, Robins, et al, 2009 Blood 114:4099; Robins, et al, 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64, PMID: 20811043; Robins, et al. 2011 (Sept. 10) J. lmm. Meth. Epub ahead of print, PMID: 21945395; and Warren, et al., 2011 Genome Res. 21:790 참조), 본 개시에 따른 실시양태를 실행하는 과정에 사용될 수 있다. 유사하게, 원하는 항원 특이성의 T 세포를 사용하는 입양 전달 절차 (예를 들어, Schmitt, et al., Hum. Gen. 20: 1240, 2009; Dossett, et al., Mol. Ther. 77:742, 2009; Till et al, Blood 112:2261, 2008; Wang, et al., Hum. Gene Ther. 18:112, 2007; Kuball et al, Blood 109:2331, 2007; US 2011/0243972; US 2011/0189141; 및 Leen, et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007 참조)를 갖는 것과 같이 원하는 핵산으로 T 세포를 형질감염/형질도입하는 방법이 기술되어 있으며 (예를 들어, US 2004/0087025), HLA 수용체와 복합체화된 KRAS G12V (서열 번호 1) 또는 Her2-ITD (서열 번호 22) 신생 항원에 특이적인 향상된 친화성 TCR에 대한 것을 포함하여, 상기 방법론을 본원에 개시된 실시양태에 따라 개작하는 것이 본원의 교시에 기초하여 고려된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포주는 Ho 등에 의해 기술되었다 (2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52) 참조). 예를 들어, 수지상 세포 (DC)는 GM-CSF (800 U/ml) 및 IL-4 (1000 U/ml)가 보충된 DC 배지 (CELLGENIX™, Freiburg, Germany)에서 2 일에 걸쳐 (-2 일에서 0 일) 배양함으로써 PBMC의 플라스틱 부착 분획에서 유래될 수 있다. -1 일에 성숙 사이토카인 TNFα (1100 U/ml), IL-1β (2000 U/ml), IL-6 (1000 U/ml) 및 PGE2 (1 μg/ml)가 첨가될 수 있다. 0 일에 DC를 수확하여 세척하고 무혈청 DC 배지에서 2 내지 4 시간에 걸쳐 펩티드 (10 μg/ml의 단일 펩티드 또는 2 μg/ml의 펩티드 풀)로 펄스화할 수 있다. CD8 T 세포를 항-CD8 마이크로비드 (MILTENYI BIOTEC™, Auburn, CA)를 사용하여 PBMC에서 단리하고, IL-21 (30 ng/ml)의 존재하에 1:5 내지 1:10의 이펙터 표적 (E:T) 비율로 DC로 자극할 수 있다. 3 일째에 IL-2 (12.5 /ml), IL-7 (5 g/ml) 및 IL-15 (5 g/ml)를 추가할 수 있다. IL-21의 존재하에 2 시간 동안 펩티드 펄싱 후 항원 제시 세포 (APC)로서 조사 자가 PBMC의 플라스틱 부착 부분을 사용하여 10 일과 14 일 사이에 세포를 재자극시킬 수 있다. 재자극 후, 세포에 1 일부터 IL-2 (25 U/ml), IL-7 (5 ng/ml) 및 IL-15 (5 ng/ml)를 보충할 수 있다. 제한 희석으로 세포를 플레이팅하고 OKT3 (ORTHO BIOTECH™, Bridgewater, NJ)로 코팅된 TM-LCL 및 설명된 바와 같이 (Ho, et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52 참조) 피더로서 동종 PBMC (REP 프로토콜)로 확장하여 T-세포 클론을 생성할 수 있다.
실시예
다음 실시예는 개시된 방법, 용도 및 조성물을 설명한다. 본 개시 내용에 비추어, 당업자는 개시된 방법 및 조성물의 이들 실시예 및 다른 실시예의 변형이 과도한 실험없이 가능하다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1 - NSCLC 연구를 위한 임상 프로토콜
임상연구심의위원회에서 승인한 I-III 기 NSCLC에 대한 치료 의도 절제술을 받은 환자를 포함해 프로토콜에 등록된 4 명의 환자 (1347, 1490, 1238 및 1139)에게서 동의서를 받은 후, 프레드 허친슨 암 연구 센터에서 NSCLC 조직 및 비인접 폐 조직 (가능한 한 악성 병변에서 최대한 멀리, 최소 3 cm 제거)을 사용하여 단일 기관 연구를 수행하였다. 임상연구심의위원회에서 승인한 별도의 프로토콜에 등록된 한 명의 환자 (511)로부터 림프절 절제술에서 얻은 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 얻었다. 임상연구심의위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 환자 511, 1139 및 1238로부터 말초 혈액 샘플을 얻고, 환자 1347 및 1490으로부터 백혈구 성분을 채취하였다. 모든 연구는 혈액 제공 또는 백혈구 성분 채취에 대한 의학적 금기 환자를 제외했으며 Belmont 보고서에 따라 수행되었다.
환자 511은 70 세에 림프절 및 뼈로 전이된 폐 선암종을 나타낸 과거 흡연자였던 73 세 여성이었다. 이 환자는 카보플라틴 및 페메트렉시드로 치료된 후 페메트렉시드 단독 요법을 받았으며, 혈액을 제공했을 때 진단 후 3 년 동안 장기적인 질환 안정성 기간에 있었다.
환자 1347은 수술 절제술에 이어 보조제 카보플라틴 및 파클리탁셀로 치료된 IIB 기 편평 세포 암종을 나타낸 과거 흡연자였던 64 세의 남성이었다. 이 환자는 혈액 제공 당시 질환 증거없이 관찰 중이었다.
환자 1490은 초기 pT2a 폐 선암종을 나타내어 절제되었으나 이후 주변 및 종격동 국소 재발을 보인 과거 흡연자였던 62 세 여성이었다. 이 환자는 카보플라틴과 파클리탁셀과 함께 근치적 화학방사선 요법 시작 후 혈액을 제공하였다.
환자 1139는 초기에 I 기 폐 선암종을 절제한 후 국소 재발 및 뇌 전이로 정위 방사선 수술에 이어 카보플라틴 및 페메트렉시드로 4 주기 동안 치료받고 6 주기 동안 페메트렉시드가 유지된 과거 흡연자였던 69 세 여성이었다. 질환이 진행되어 니볼루맙으로 치료를 받았으며, 그 후 질환이 진행되었다. 환자는 니볼루맙 치료를 받는 동안 혈액을 제공하였다.
환자 1238은 초기에 IIIA 기 폐 선암종으로 절제술 치료를 받은 후 보조제 페메트렉시드 및 시스플라틴을 받았고, 1 년 후 전이성 질환으로 진행된 68 세의 비흡연 남성이었다. 이 환자는 아파타닙 후 진행, 펨브롤리주맙 후 진행 치료를 받았다. 그 후 환자는 도세탁셀과 라미시루맙을 복용한 후 라미시루맙 유지 관리를 받았고, 이 당시에 혈액을 제공하였다.
환자 1490은 초기 pT2a 폐 선암종을 나타내어 절제되었으나 이후 주변 및 종격동 국소 재발을 보인 과거 흡연자였던 62 세 여성이었다. 이 환자는 카보플라틴과 파클리탁셀과 함께 근치적 화학방사선 요법 시작 후 혈액을 제공하였다.
실시예 2 - 엑솜 캡처 및 RNA 시퀀싱을 위한 핵산 제조
환자 1490, 1238 및 1139의 경우 비인접 폐에서 비종양 DNA를 단리하였다. 환자 511 및 1347의 경우에는 혈액을 비종양 DNA로 사용하였다. 종양, 폐 조직 또는 혈액으로부터의 PBMC에서 유래된 단일 세포 현탁액을 QIAGEN™ DNA/RNA ALLPREP™ Micro 키트로 처리하여 엑솜 캡처를 위한 DNA를 단리하고 RNA는 후속 RNA-seq 프로파일링을 위해 보존하였다. 초기 종양 절제에서 단리된 DNA 외에, 환자 1347의 종양으로부터 환자 유래 이종이식 (PDX)을 확립하고 PDX 종양을 DNA 및 RNA 제제에 사용하였다. 게놈 DNA 농도를 INVITROGEN™ QUBIT® 2.0 형광측정기 (LIFE TECHNOLOGIES-INVITROGEN™, Carlsbad, CA, USA) 및 TRINEAN™ DROPSENSE96™ 분광 광도계 (CALIPER™ Life Sciences, Hopkinton, MA)에서 정량화하였다.
실시예 3 - 전체 엑솜 시퀀싱
AGILENT™ SURESELECTXT™ Reagent Kit를 사용하여 엑솜 시퀀싱 라이브러리를 제작하고 AGILENT™ All Human Exon v6 (AGILENT ™ Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 엑손 표적을 단리하였다. 200 ng의 게놈 DNA를 COVARIS® LE220 집중 초음파 장치 (COVARIS®, Inc., Woburn, MA, USA)를 사용하여 단편화하고 라이브러리를 SCICLONE® NGSx Workstation (PERKINELMER®, Waltham, MA, USA)에서 제작하고 캡처하였다. AGILENT™ 2200 TAPESTATION™을 사용하여 라이브러리 크기 분포를 검증하였다. LIFE TECHNOLOGIES-INVITROGEN™ QUBIT® 2.0 형광측정기를 사용하여 추가 라이브러리 QC, 풀링된 인덱스 라이브러리 블렌딩 및 클러스터 최적화를 수행하였다.
생성된 라이브러리는 paired-end 100 bp (PE100) 전략을 사용하여 ILLUMINA® HISEQ™ 2500에서 시퀀싱하였다. ILLUMINA®의 실시간 분석 v1.18 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석 및 염기 판정을 수행한 다음, ILLUMINA®의 bcl2fastq 변환 소프트웨어 v1.8.4 (support_illumina_com/downloads/bcl2fastq_conversion_software_184_html)을 사용하여 인덱스된 판독값의 "디멀티플렉싱" 및 FASTQ 파일 생성을 수행하였다.
표준 ILLUMINA® 품질 필터를 통과한 판독 쌍을 추가 분석을 위해 유지하여 여기에 보고된 샘플 중에서 종양에 대해 평균 65.2M 판독 쌍 및 정상에 대해 64.4M 판독 쌍을 산출하였다. 쌍을 이룬 판독값을 BWA-MEM 짧은 판독 정렬기를 사용하여 인간 게놈 참조 (GRCh37/hg19)에 대해 정렬시켰다 (Li H. arXiv preprint arXiv:13033997. 2013 and Li H, et al. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-60 참조). 표준 BAM 형식으로 생성된 정렬 파일을 Picard 2.0.1 및 GATK 3.5 (McKenna A, et al. Genome research. 2010;20(9):1297-303 참조)에 의해 권장 최적 사례 (Van der Auwera GA, et al. Current protocols in bioinformatics. 2013:11.0. 1-.0. 33 참조)에 따라 품질 점수 재보정, 인델 재정렬, 중복 제거에 대해 처리하였다.
분석 준비된 종양 및 정상 BAM 파일에서 체세포 돌연변이를 호출하는 데 다음 두 개의 독립적인 소프트웨어 패키지가 사용되었고: MuTect 1.1.7 (Cibulskis K, et al. Nature biotechnology. 2013;31(3):213 참조), Strelka 1.0.14 (Saunders CT, et al. Bioinformatics. 2012;28(14):1811-7 참조), VCF 형식의 두 도구로부터 변이체 호출은 Oncotator로 주석을 달았다 (Ramos AH, et al. Human mutation. 2015;36(4) 참조). 주석이 달린 미스센스 체세포 변이체를 다음과 같이 각 샘플에 대해 단일 요약으로 통합시켰다. 첫째, "somatic"으로 주석이 달렸지만 dbSNP에 존재하는 모든 돌연변이는 COSMIC에 존재하지 않거나 작은 대립 유전자 빈도가 1%보다 크면 제거하였다 (UCSC Genome Browser snp150Common 표에 따름). 양 변이체 호출기에 의해 지원되는 변이체는 유지시키고 하나의 변이체 호출기에 의해서만 지원되는 변이체에 대해서는 수동 검사하였다.
실시예 4 - RNA-SEQ 데이터 처리
환자 1347의 경우, PDX로부터의 종양 세포를 사용하여 후보 돌연변이에 대한 RNA 발현의 직접 측정을 수행하였다. TRUSEQ™ RNA Sample Prep v2 Kit (ILLUMINA®, Inc., San Diego, CA, USA) 및 SCICLONE® NGSx Workstation (PERKINELMER®, Waltham, MA, USA)을 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리 크기 분포를 AGILENT™ 2200 TAPESTATION™ (AGILENT™ Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 검증하였다. LIFE TECHNOLOGIES-INVITROGEN™ QUBIT® 2.0 형광측정기를 사용하여 추가 라이브러리 QC, 풀링된 인덱스 라이브러리 블렌딩 및 클러스터 최적화를 수행하였다. 라이브러리를 ILLUMINA® HISEQ™ 2500에서 시퀀싱하여 61M 판독 쌍 (쌍당 2 개의 50nt 판독값)을 생성하였다. 판독값을 먼저 마우스 참조 어셈블리 (mm9)에 정렬시켜 마우스에서 생착된 종양 이외 판독값을 제거하였다. 나머지 판독값을 RSEM 1.2.19 (Li B, et al. BMC bioinformatics. 2011; 12 (1):323 참조)를 사용하여 인간 RefSeq 유래 참조 전사체에 정렬시켜 각 유전자에 대한 풍부도를 백만당 전사체 (TPM) 단위로 유도하였다.
실시예 5 - 스크리닝을 위한 돌연변이 선택
각 환자에 대해, 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 정상 DNA 샘플과 비교하여 결정하고, 변이체 대립 유전자 빈도 및 발현에 따라 순위를 매겨 스크리닝을 위한 후보 펩티드를 선택하였다. 환자 511의 경우 변이체 대립 유전자 빈도가 20%보다 큰 MuTect 1.1.7 (Cibulskis K, Lawrence MS, Carter SL, Sivachenko A, Jaffe D, Sougnez C, et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol 2013;31:213) 및 Strelka 1.0.14 (Saunders CT, Wong WS, Swamy S, Becq J, Murray LJ, Cheetham RK. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics 2012;28:1811-7)로 호출된 돌연변이체를 폐 선암종에 대한 TCGA에서의 평균 발현에 의해 순위를 매기고 상위 45 개의 변이체를 스크리닝하였다.
환자 1490의 경우, MuTect 1.1.7 및 Strelka 1.0.14 둘 다에 의해 동정된 모든 SNV는 10-40%의 변이체 대립 유전자 빈도를 가졌다. 이들을 폐 선암종에 대한 TCGA의 평균 발현으로 순위를 매기고 상위 46 개의 돌연변이체를 스크리닝하였다.
환자 1139의 경우, 변이체 대립 유전자 빈도가 20%보다 큰 MuTect 1.1.7 및 Strelka 1.0.14 둘 다에 의해 호출된 SNV를 폐 선암종에 대한 TCGA에서의 평균 발현에 의해 순위를 매기고, 상위 46 개 돌연변이를 스크리닝하였다. 환자 1238의 경우, <50 개의 돌연변이가 검출되어, MuTect 1.1.7 또는 Strelka 1.0.14에 의해 호출된 SNV를 폐 선암종에 대한 TCGA에서의 평균 발현에 의해 순위를 매기고, 3 TPM (transcripts per million)보다 큰 발현을 갖는 SNV를 스크리닝하였다.
환자 1347에 대해 호출된 체세포 변이체는 변이체 대립 유전자 빈도가 낮은 많은 수 (>10,000)의 C>A/G>T 전환을 나타내었다. 유사한 특성을 가진 유사한 수의 변이체가 상응하는 정상 샘플에서도 발견되었으며, 이는 DNA 전단 중에 산화로 인한 인공물일 것임을 제시한다 (Wakabayashi O, Yamazaki K, Oizumi S, Hommura F, Kinoshita I, Ogura S, et al. CD4þ T cells in cancer stroma, not CD8þ T cells in cancer cell nests, are associated with favorable prognosis in human nonsmall cell lung cancers. Cancer Sci 2003;94:1003-9). 이 특정 샘플이 가지는 이같은 문제를 방지하기 위해, 해당 환자 유래 이종이식편 (PDX)으로부터 RNA-seq 데이터를 레버리지하였다. PDX RNA-seq를 마우스 게놈에 대해 정렬시켜 (마우스 게놈의 mm9 방출) 마우스에서 발생하는 판독값을 억제하였다. 나머지 판독값에 대한 변이체 호출을 2 패스 STAR 정렬, 스플라이싱 판독값의 분할 및 soft-masked 염기 (software.broadinstitute.org/gatk/documentation/article.php?id=3891)를 무시한 HaplotypeCaller (McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A, et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res 2010; 20:1297-303)의 적용을 비롯해, Broad Institute의 GATK "Best Practices" RNA-seq 변이체 호출 워크플로우에 따라 수행하였다. HaplotypeCaller를 해당 정상 혈액 엑솜 샘플에서 생식 계열 변이체를 호출하는 데에도 사용하였다. RNA-seq에 의해 발견되고 생식 계열 엑솜 캡처에서 관찰되지 않은 변이체는 유지시켰다. 추가 후보 변이체를 캡처하기 위해, MuTect 체세포 변이체 호출기를 사용하여 분석 준비가 완료된 PDX RNA-seq BAM 파일 또는 PDX 엑솜 캡처 BAM 파일을 정상 혈액 엑솜 BAM 파일에 대해 비교하였다. 위의 모든 과정을 통해 확인된 미스센스 돌연변이를 PDX 및 절제된 종양 엑솜에 의해 지원되아 정상 혈액 엑솜 데이터에서는 관찰되지 않는 것을 유지하기 위해 모두 병합 게놈 뷰어 (IGV) (McKenna et al., (2010))를 사용하여 수동으로 검사한 235 개의 후보 변이체 세트에 병합시켰다. 변이체를 각 위치에서 대체 대립 유전자를 지원하는 RNA-seq 판독값 수에 따라 순위를 매기고, 상위 57 개 돌연변이를 펩티드 합성을 위해 선택하였다. MuTect 1.1.7과 달리, Strelka 변이체 호출기는 후보 체세포 삽입 및 삭제를 보고한다. 보고된 25 개 미만의 인델을 수동으로 검사하고 변이체 대립 유전자 빈도 및 함유 유전자 (TCGA LUAD에서 집계 또는 1347 PDX에서 직접 측정)의 예상 발현을 포함해, 위의 점 돌연변이체와 유사한 필터링 기준에 적용하였다. 생성된 단백질이 넌센스 매개 붕괴될 가능성이 있는 프레임 이동 또한 제외시켰다. 환자 1238에서 발견된 Her2-ITD를 제외하고, 넌센스 매개 붕괴의 대상이될 것으로 예측되지 않은 단백질 암호화 인델은 확인되지 않았다. 넌센스 매개 붕괴의 유도 기준은 전사체의 말단 엑손 이전에 정지 코돈을 생성하는 것이다.
실시예 6 - T 세포 배양
림프구 분리 배지 (Corning)를 사용하여 밀도 구배 원심분리를 통해 얻은 환자 및 정상 공여자의 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하고 EDTA (3.6 mM)가 보충된 PBS로 3 회 세척하였다.
ELIM BIOPHARM™에서 얻은 중첩 20-mer 펩티드로 환자 PBMC를 자극하였다. 20 아미노산 서열의 위치 +7 또는 +13에서 돌연변이된 잔기를 갖는 각 돌연변이에 걸쳐 있는 2 개의 펩티드를 자극에 사용하였고, 자극에 사용된 50 개의 돌연변이를 포함한 최대 100 개의 펩티드 풀이 사용되었다. T 세포 반응성을 분석하기 위한 후속 실험을 위치 +13에 돌연변이 아미노산이 있는 >80% 순도 27-mer 펩티드로 수행하였다.
냉동 보존된 PBMC를 해동하고 L-글루타민과 함께 10% 인간 혈청 (사내에서 생산), 50 μM 베타-머캅토에탄올, 페니실린 (100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 U/mL)이 보충된 HEPES (GIBCO™), 4 mM L-글루타민 (CTL 배지라고 함) 및 2 ng/ml 재조합 인간 IL-7 (PEPROTECH®)를 함유한 RPMI 배지에서 하룻밤 정치시켰다. 다음날 아침, PBMC를 세척하고 107 개의 세포를 사이토카인 없이 각 펩티드 1 ㎍/ml의 풀을 포함하는 5 ml CTL 배지에서 6 웰 플레이트의 개별 웰에 플레이팅하였다. 재조합 IL-2 (PEPROTECH®)를 +3 일에 10 U/ml의 최종 농도로 첨가하고, 보충 IL-2를 사용한 절반 배지 변경을 +3, +6 및 +9 일에 수행하였다. +13 일에, 개별 웰로부터 세포를 수확하고 ELISA 및/또는 사이토카인 염색 분석법으로 분석하였다.
초기 분석에서 반응성이 있는 것으로 확인된 항원 특이적 T 세포의 농축을, 하나 또는 여러 (최대 5 개의 풀링된) 정제된 돌연변이 펩티드 및 초기 자극으로 성장 효율을 개선한 추가 사이토카인을 사용한 PBMC의 자극 후에 후속 제한 희석 배양물에서 수행하였다. 요약하면, PBMC를 먼저 IL-21 (30 ng/ml), IL-7 (5 ng/ml), IL-15 (1 ng/ml) 및 IL-2 10 U/ml의 존재하에 1 μg/ml의 27-mer 돌연변이 펩티드로 13 일 동안 자극시킨 후, 배양물을 20 μg/ml의 단일 27-mer 펩티드로 5 시간 동안 펄스화시킨 자가 B 세포로 재자극시킨 다음, 항-CD4-퍼시픽 블루 (클론 RPA 14, Biolegend cat. 300521) 및 항 CD8-FITC (클론 HIT8a, BD pharmigen cat. 555634)를 사용하여 염색하고 FACSARIA™ II (BD Biosciences)에서 생세포 IFN-γ 분비 T 세포 (인터페론 분비 키트 APC, Miltenii cat. no. 130-090-762, 캡처 및 검출 시약 포함)를 분류하였다.
분류된 T 세포는 항원 특이적 세포뿐만 아니라 순도를 모르는 IFNγ를 비특이적으로 생산한 세포를 포함하였다. 항원 특이적인 클론 또는 올리고클론 세포 집단을 단리하기 위해, 분류된 세포 (웰당 3 개 또는 10 개 세포)를 1.0×105 조사된 동종 PBMC, 2 μg/ml 파이토헤마글루티닌 (SIGMA®) 및 IL-2 (100 U/ml)의 존재하에 96 웰 플레이트에서 제한 희석으로 14 일 내지 20 일 동안 확장시켰는데, 14 일에 추가 IL2를 보충하였다. 확장 후 T 세포주 (10,000-100,000 개 세포)를 돌연변이 펩티드 (10 μg/mL)로 펄스화된 자가 B 세포 (100,000 개의 세포)와 인큐베이션하고, ELISA로 IFN-γ 생산을 측정하여 항원 특이성을 가진 T 세포를 동정하였다. 이어 반응성 주를 이전에 설명된 급속 확장 프로토콜을 사용하여 확장시키고 냉동 보존하였다 (Riddell SR, et al. Journal of immunological methods. 1990;128(2):189-201 참조). 냉동 보존된 세포를 해동하고 10% DMSO 및 추가 10% 인간 혈청이 보충된 CTL 배지 (최종 농도 20% 인간 혈청 (Riddell SR, Greenberg Riddell SR, Greenberg PD. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. J Immunol Methods 1990;128:189-201))에서 밤새 정치시켰다. 냉동 보존된 세포를 해동하고 분석 전에 IL2 (10 U/mL)가 보충된 CTL 배지에서 밤새 정치시켰다.
TIL 배양을 위해, 환자 유래 종양 조직의 6-12 개 단편 (2×2×2 mm)을 T 세포 배지 (RPMI 1640, 10% 소 태아 혈청, 10 mM HEPES, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 젠타마이신, 50 μM 베타-머캅토에탄올)의 24 웰 플레이트에서 IL2 (6,000 U/mL)의 존재하에 35 일 동안 배양하였다. TIL을 합류시 계대시켰다. 35 일 확장 프로토콜 완료 후, 세포를 면역학적 분석에 사용하기 전에 냉동 보존하였다.
실시예 7 - 항원 제시 세포
제조업체의 지침 (MILTENYI BIOTEC™)에 따라 CD19를 인식하는 항체 (MILTENYI BIOTEC™, cat. 130-050-301)로 코팅된 자기 비드로 양성 선택을 사용하여 PBMC로부터 자가 B 세포를 단리하였다. B 세포를 10% 인간 혈청 (사내), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (LIFE TECHNOLOGIES™)이 보충된 IMDM 배지 (LIFE TECHNOLOGIES™), 2 mM L-글루타민 (LIFE TECHNOLOGIES™) 및 200 U/ml IL-4 (PEPROTECH®)로 구성된 B 세포 배지에서 인간 CD40L을 발현하는 3T3 세포의 존재하에 7 일 동안 설명된 바와 같이 배양하였다 (Tran E, et al. Science. 2014;344(6184):641-5 참조). 이어서 B 세포를 조사된 (5000 Gy) 3T3 발현 인간 CD40L 세포로 재자극하고 IL-4를 함유하는 신선한 배지를 3 일마다 첨가하였다. B 세포를 자극 후 +3 일에 분석에 사용하였다. KRAS-특이적 T 세포의 경우, 일부 실험에서 항원 제시 세포로 HLA-DRB1-1104인 B-LCL 세포주 (CLC)를 사용하였다. HLA 유형의 LCL 세포주 BM14, DEM, LUY, CB6B 및 DEU는 Research Cell Bank (Seattle, WA)에서 구입하였다. 나머지 LCL 주는 Marie Bleakley, Fred Hutchinson Cancer Research Center에서 입수하였다.
실시예 8 - mRNA 발현 및 형질감염
엔도솜을 표적으로 하는 RNA 발현을 Sahin 그룹 (Kreiter S, Selmi A, Diken M, Sebastian M, Osterloh P, Schild H, et al. Increased antigen presentation efficiency by coupling antigens to MHC class I trafficking signals. J Immunol 2008;180:309-18)에 의해 기술된 방법을 사용하여 수행하였고, 여기서 항원은 클래스 I MHC 분류 신호에 항원을 융합하여 엔도솜을 표적으로 한다.
인간 HLA-B 유전자의 N-말단 25 개 아미노산에 융합된 T7 프로모터에 이어, BamHI 제한 부위, 강화된 GFP의 암호화 서열, AgeI 제한 부위, 인간 HLA-B 유전자의 C 말단 55 개 아미노산, 이어 인간 베타-글로빈 비번역 영역, 이어 30-뉴클레오티드 폴리-A 꼬리, 및 이어 폴리-A 꼬리에 SapI 제한 부위 지정 절단을 포함하는 mRNA 발현 작제물 pJV57 (Veatch JR, Lee SM, Fitzgibbon M, Chow IT, Jesernig B, Schmitt T, et al. Tumor infiltrating BRAFV600E-specific CD4 T cells correlated with complete clinical response in melanoma. J Clin Invest 2018;128:1563-8)을 유전자 합성 (Geneart, Life Sciences)에 의해 작제하였다.
5' AgeI 및 3' BamHI 부위에 플랭킹된 Her2 아미노산 760-787을 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (Ultramers, Integrated DNA Technologies)를 AgeI/BamHI 소화된 pJV57에 결찰시켜 pJV126을 클로닝시켰다. YVMA 순차 복제를 포함하는 5' AgeI 및 3' BamHI 부위에 플랭킹된 Her2 아미노산 760-787을 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (Ultramers, Integrated DNA Technologies)를 결찰시켜 pJV127를 만들었다.
pJV128 및 pJV129를, 각각 G12V 치환을 갖는 KRAS의 첫 25 개 아미노산 또는 KRAS의 첫 25 개 아미노산을 사용하여 유사한 방식으로 합성하였다. JV57을 기반으로 하는 pJV126 및 기타 플라스미드를 SapI (Thermo Fisher)로 선형화하고, mRNA를 Highscribe T7 ARCA mRNA 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 시험관 내 전사시키고 제조업체의 지침에 따라 리튬 침전으로 정제시켰다.
RNA 형질감염을 위해, B 세포 또는 B-LCL을 수확하고 PBS로 1x 세척한 다음, Opti-MEM (Life Technologies)에 30×106 세포/mL로 재현탁시켰다. IVT RNA (10 mg)를 2-mm 갭 전기천공 큐벳 바닥에 분취하고 100 mL의 APC를 큐벳에 직접 첨가하였다. 전기천공에 사용된 최종 RNA 농도는 100 mg/mL이다. 전기천공을 BTX-830 구형파 전기천공기 (150V, 20 ms 및 1 펄스)를 사용하여 수행하였다. 이어서 세포를 공동 배양하기 전에 16 시간 동안 IL4가 보충된 B 세포 배지로 옮겼다 (Tran E, Turcotte S, Gros A, Robbins PF, Lu YC, Dudley ME, et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4þ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 2014;344:641-5).
실시예 9 - 사이토카인 방출 분석
5% 열 불활성화된 소 태아 혈청이 보충된 RPMI (GIBCO™)에서 특정 농도의 펩티드로 펄스화된 100,000 개의 자가 B 세포 또는 B-LCL 주가 있는 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 50,000 개의 T 세포를 인큐베이션하여 ELISA 분석을 수행하였다. 상등액의 IFN-γ를 1:1, 1:10 및 1:100으로 희석하고 인간 IFN-γ ELISA 키트 (EBIOSCIENCE™)를 사용하여 기술적 중복 또는 3 중으로 정량화하였다. 펩티드 첨가 1 시간 전에 20 ㎍/ml 항체 항 클래스 I (BIOLEGEND®, cat. 311411), 항 HLA DR (BIOLEGEND® clone L243, cat. 307611) 또는 HLA-DQ (ABCAM™, clone spv-13, cat. ab23632)를 항원 제시 세포에 첨가하여 HLA 차단 실험을 수행하였다. 20,000-100,000 T 세포를 제조업체의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISPOT-PRO™ 키트 (MABTECH ™)를 사용하여 CTL 배지에서 20 μg/ml의 각 펩티드로 펄스화된 200,000 자가 B 세포와 함께 인큐베이션하여 ELISpot 분석을 수행하였다. 세포 내 IFN-γ 염색을 위해, PBMC (100,000)를 브레펠딘 A (GOLGIPLUG™, BD BIOSCIENCES™)의 존재하에 제시된 펩티드 (20 μg/ml)로 펄스화된 자가 B 세포 (100,000)와 함께 인큐베이션한 다음 고정시키고, BD™ 세포 내 염색 키트 (BD BIOSCIENCES™)를 사용하여 침투시킨 뒤, FACSCANTO™ II 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
실시예 10 - TCR 식별 및 작제
TCR 알파 및 베타 서열을 실시예 11-12에 기재된 바와 같이 5' RACE에 의해 클론 T 세포 집단으로부터 수득하였다. 코돈 최적화된 서열에 대한 TCR 서열을 이전에 보고된 바와 같이 합성하고 번역 스킵 서열에 의해 연결된 렌티바이러스 벡터로 클로닝하였다 (Veatch JR, et al. The Journal of clinical investigation. 2018;128(4)1563-68 참조). 샘플에서 TCR Vβ 서열의 빈도를 ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES®로부터의 IMMUNOSEQ™ 인간 TCRB 키트를 사용하여 얻고 ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES® 소프트웨어 플랫폼에서 분석하였다.
실시예 11 - TCR Vβ 및 Vα 시퀀싱
제조업체의 지침에 따라 QIAGEN™ DNEASY™ 또는 QIAMP™ 마이크로 DNA 키트를 사용하여 DNA를 단리하였다. 제조업체의 지침에 따라 인간 TCRB 시퀀싱 키트 (ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES®)를 사용하여 TCRB 시퀀싱을 수행하고, MiSeq (Fred Hutchinson Cancer Research Center Genomics core)를 사용하여 시퀀싱한 후, ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES® 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 하였다.
실시예 12 - TCR 서열의 식별
RNEASY™ Plus Mini Kit (QIAGEN™)를 사용하여 T 세포주로부터 전체 RNA를 추출하였다. 제조업체 프로토콜에 따라 SMARTER® RACE 5'/3'Kit (CLONTECH™)를 사용하여 RNA로부터 RACE-ready cDNA를 생성하였다. CLONEAMP™ HiFi PCR Premix (CLONTECH™)를 사용하여 3' cDNA 단편을 증폭시켰다. 유전자 특이적 프라이머 (인간 TCR Cbeta1 역: 5'-CCA CTT CCA GGG CTG CCT TCA GAA ATC-3' 서열 번호 41; 인간 TCR Cbeta2 역: 5'-TGG GAT GGT TTT GGA GCT AGC CTC TGG-3' 서열 번호 42; 인간 TCR Calpha 역: 5'-CAG CCG CAG CGT CAT GAG CAG ATT A-3' 서열 번호 43)을 알파 및 베타 TCR 밴드 (1Kb)가 검출되도록 설계하였다. 3 단계 터치다운 PCR 반응을 10 초 동안 95 ℃, 15 초 동안 60 ℃ (사이클마다 0.2 ℃ 씩 감소), 1 분 동안 72 ℃의 35 사이클 수행하였다. 단편을 1% 아가로스 겔에서 실행시키고 PENTR™ Directional TOPO™ 클로닝 (THERMO FISHER™)을 위해 정제시켰다 (QIAQUICK™ 겔 추출 키트, QIAGEN™). 각 TCR 알파 및 베타에 대해 8-10 개의 클론으로부터 DNA를 추출하고 (QIAPREP™ Spin Miniprep Kit, QIAGEN™), Sanger 시퀀싱하였다 (JV298: 5'-TCG CTT CTG TTC GCG CGC TT-3' 서열 번호 44; JV300: 5'-AAC AGG CAC ACG CTC TTG TC-3' 서열 번호 45).
실시예 13 - TCR 벡터 작제
6 개의 점 돌연변이를 기술된 바와 같이 우드척 (woodchuck) 간염 바이러스 X 단백질 (Lim CS, et al. RNA biology. 2016;13(9):743-7 참조)의 시작 코돈 및 추정 프로모터 영역에 도입함으로써 추가로 변형된 벡터 PRRL (JJones S, et al. Human gene therapy. 2009;20(6):630-40 참조)에서 TCR을 작제하였다 (P2A 번역 스킵 서열에 의해 분리된 TCR β 유전자가 TCR 알파 유전자 앞에 있음). 기술된 바와 같이 도입된 TCR 사슬의 쌍화를 용이하게 하기 위해 시스테인 잔기를 도입하였다 (Kuball J, et al. Blood. 2007;109(6):2331-8 참조). 특정 가변 영역 및 CDR3 서열이 표 1에 제시되어 있다. TRBV 및 CDR3 및 TRBJ 서열, 이어서 잔기 57에서 시스테인이 치환된 TCRB 서열, 이어서 P2A 스킵 서열 및 TRAV 및 CDR3 서열, 이어서 TRAJ TRAC 서열을 포함하는 코돈 최적화된 DNA 단편을 유전자 스트링 (LIFE SCIENCES™)으로 합성하고 NEBUILDER® 클로닝 키트 (NEW ENGLAND BIOLABS®)를 사용하여 PstI 및 AscI (THERMO FISHER™)로 선형화된 렌티바이러스 벡터 PRRL-SIN에 클로닝하고 서열을 검증하였다. 잔기 57에서 치환된 시스테인은 재조합 TCR의 α-사슬과 β-사슬의 쌍을 보장할 수 있고 내인성 TCR α-사슬 및 β-사슬과의 오쌍을 피할 수 있다. 형질도입 1 주 후, 특정 항체 (표 2)를 사용하여 Vβ 발현을 기준으로 세포를 분류하고 상술한 바와 같이 확장시켰다. 확장 후 14 일에 T 세포를 분석에 사용하거나 냉동 보존하였다.
| 클론 | V-영역 | CDR3 | J-영역 | 항체 |
| KRAS 클론 3 베타 | TRBV30 | CAWSALAGARDTQYF (서열 번호 3) |
TRBJ2-3 | V 베타 20 -FITC (coulter IM1562) |
| KRAS 클론 3 알파 | TRAV8-3 | CAVGRSNSGGYQKVTF (서열 번호 2) |
TRAJ13 | |
| KRAS 클론 9 베타 | TRBV12-4 | CASSLGLPGTDTQYF (서열 번호 13) |
TRBJ2-3 | V 베타 8-PE 클론 JR.2 (biolegend cat 348104) |
| KRAS 클론 9 알파 | TRAV8-1 | CAVTVVNAGNNRKLIW (서열 번호 12) |
TRAJ38 | |
| Her2-ITD 베타 | TRBV20 | CSAPPLAGDETQYF (서열 번호 24) |
TRBJ2-5 | V 베타 2-PE (milltenyicat 130-110-061) |
| Her2-ITD 알파 | TRAV8-6 | CAVSVNTDKLIF 서열 번호 22) |
TRAJ34 |
실시예 14 - CRISPR-CAS9 매개 유전자 결실
동일한 부피의 80 μM TracRNA (IDT)와 80 μM의 gRNA AGAGTCTCTCAGCTGGTACA (Kargl J, Busch SE, Yang GH, Kim KH, Hanke ML, Metz HE, et al. Neutrophils dominate the immune cell composition in non-small cell lung cancer. Nat Commun 2017;8:14381)를 이중 완충액 (IDT)에서 혼합한 뒤, 가열 블록에서 95 ℃로 5 분 동안 가열하고 서냉시켜 TCR 알파 불변 영역의 제1 엑손을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 RNP를 이전에 기술된 바와 같이 생성하였다 (Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clin Cancer Res 2016;23:2255-66). 생성된 40 μM 이중화 RNA를 동일 부피 24 μM Cas9 단백질 (IDT) 및 1/20 부피의 400 μM Cas9 전기천공 강화제 (IDT)와 혼합하고, 전기천공 전에 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
0 일에, EasySEP 인간 CD4+ 단리 키트 (StemCell)를 사용하여 음성 면역 선택에 의해 IRB 승인 프로토콜에 대한 사전 동의서를 받은 4 명의 환자에게서 얻은 냉동 보존된 건강한 인간 공여자 PBMC로부터 CD4+ T 세포를 단리하고, CTL 배지에서 IL2 (50 U/mL) 및 IL7 (5 ng/mL)의 존재하에 3:1 비드:세포 비율 (Dynabeads, Invitrogen)의 항-CD3/항-CD28 마이크로비드로 2 일 동안 자극하였다. 또, 0 일에 Lenti-X 세포 (Clontech)를 TCR 벡터, psPAX2 (Addgene 플라스미드 번호 12260) 및 pMD2.G (Addgene 플라스미드 번호 12259) 패키징 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. +2 일에, 자기 비드를 제거하고, 1×106 세포를 프로그램 EH-115를 사용하여 20 μl의 버퍼 P3에서 Lonza 4D 핵 형성기를 사용하여 핵 형성시켰다. 렌티바이러스 형질도입 전에 세포를 배지에서 4 시간 동안 정치시켰다. Lenti-X 세포에서 렌티바이러스 상등액을 수확하고, 0.45 μm 폴리에테르설폰 (PES) 주사기 필터 (Millipore)를 사용하여 여과한 다음, 900 μL를 48 웰 조직 배양 플레이트의 50,000 개의 활성화 T 세포에 첨가하였다. 폴리브렌 (Millipore)을 4.4 μg/mL의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 800×g 및 32 ℃에서 90 분 동안 원심분리하였다. 16 시간 후에 바이러스 상등액을 IL2 (50 IU/mL) 및 IL7 (5 ng/mL)이 보충된 신선한 CTL로 대체하였다. 그런 다음 IL2 및 IL7이 보충된 CTL을 사용하여 48-72 시간마다 배지 절반 교환을 수행하였다. 형질도입된 T 세포를 형질도입된 TCRVb에 특이적인 항체를 사용하여 자극 +7 일 또는 +8 일에 분류하고, 면역 분석을 수행하기 전에 12-14 일 동안 상기 기재된 급속 확장 프로토콜을 사용하여 성장시켰다.
실시예 15 - 통계 분석
Graphpad Prism 7.0을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. Elispot 데이터를 다중 비교를 위해 Sidak 보정과 함께 일원 ANOVA로 분석하였다. 종양 조직 내 TCR Vβ 템플릿의 강화를 Fisher의 정확한 검정을 사용하여 평가하였다.
실시예 16 - 결과
폐 선암종 환자 4 명과 편평 세포 암종 환자 1 명에게서 종양 검체를 얻었다 (표 1). 종양 및 정상 생식 계열 DNA의 전체 엑솜 시퀀싱을 수행하였다. 단백질 암호화 변이체를 변이체 대립 유전자 빈도 및 mRNA 발현에 따라 순위를 매겼다.
이러한 결과 및 타당성에 기초하여, T-세포 반응 분석을 위해 환자 당 20-57 개의 돌연변이를 선택하였다 (표 1; 다른 데이터는 나타내지 않음). 각 돌연변이를 포함하는 중접 20 개 아미노산 펩티드 풀로 PBMC를 자극하고 IFNγ Elispot 분석에 의해 반응성을 평가하여 후보 신생 항원에 대한 T-세포 반응의 초기 스크리닝 분석을 수행하였다 (도 1A). 후보 신생 항원에 대한 배경보다 높은 반응성을 갖는 T-세포 배양물을 돌연변이 및 야생형 서열에 상응하는 정제된 27-mer 펩티드에 대한 반응으로 IFN-γ 생산에 대해 재분석하였다 (예시적인 데이터는 도 1B에 제시됨). 전체적으로, 스크리닝된 238 개의 신생 항원 중 21 개 (8.8%)에 대한 T-세포 반응이 검출되었고 야생형 펩티드 반응에 비해 유의하게 증가하였다 (p<0.05). KRAS 및 Her2-ITD의 돌연변이에 대한 추가적인 약한 반응이 관찰되었고 컷오프 기준을 충족하지 못했지만 종양 발생에서 이러한 돌연변이의 중요한 역할 때문에 추가 연구용으로 선택하였다.
추가적인 동결 보존 샘플 및 TIL을 이용할 수 있는 1490 및 1347 환자의 혈액으로부터 확장된 잠재적인 신생 항원-반응성 T 세포를 특성화하였다. 이들 환자로부터의 PBMC를 반응을 유발하는 (위의 기준을 충족함) 각 돌연변이체에 대해 정제된 27-mer 펩티드로 자극하고, 재자극 후에 IFN-γ+ 세포를 분류하고 제한 희석 클로닝으로 확장하였다. 돌연변이 GUCY1A3에 반응하는 단일 CD4+ 클론과 환자 1490로부터의 SREK1의 돌연변이에 반응하는 두 개의 상이한 CD4+ 클론이 단리되었다. 이들 클론은 각각 야생형 펩티드에 비해 돌연변이에 대한 특이성을 나타내었다 (도 3B 내지 3F).
다른 단리된 T-세포 클론이 돌연변이 SREK1 펩티드에 반응했지만 반응은 SREK1 야생형 펩티드에서 보이는 것과 유사하였고 (데이터는 미도시), 이는 잠재적으로 스크리닝 Elispot (도 1B)에서 관찰된 야생형 펩티드에 대한 반응성을 설명한다. 환자 1490 및 1347로부터의 다른 신생 항원에 특이적인 T 세포주 또는 클론은 단리할 수 없었다. 상이한 TCRVβ 서열을 갖는 SREK1에 특이적인 2 개의 클론이 초기 종양 절제 (8/24095 템플릿)에서 검출되었고, 동일 절제로부터의 비인접 폐 조직에 비해 풍부하였다 (비인접 폐에서 1/62424 템플릿, p=0.0002). GUCY1A3 TCRVβ는 종양 절제 샘플 또는 폐에서 검출되지 않았다.
이러한 관찰은 신생 항원에 반응하는 CD4+ T 세포가 종양 조직에 국한될 수 있는 혈액으로부터 단리될 수 있음을 제시한다.
환자 1490 및 1347의 경우, 고용량 IL2 (Kargl et al (2017))에서 종양 단편을 배양하여 초기 절제 샘플로부터 TIL 배양물을 제조하고, TIL을 이전에 설명한 Elispot 및 20-mer 중첩 펩티드가 있는 세포 내 IFN-γ에 의해 신생 항원 반응성에 대해 분석하였다. 환자 1347로부터 스크리닝된 항원에 대한 반응성은 발견되지 않았지만 환자 1490로부터의 TIL에 있는 CD8+ T 세포는 PWP2에의 돌연변이에 반응하였다 (도 2A).
분류된 PWP2-반응성 CD8+ T 세포에 의해 발현된 TCRVβ를 식별하고, 초기 종양 절제 샘플, 비인접 폐 및 TIL 배양 후 PWP2-반응성 TCRVβ 빈도를 결정하였다. TCRVβ 서열은 비인접 폐에 비해 종양 절제에서 풍부했으며 (0.2%, 54/24095 템플릿 대 0.03%, 18/62424 템플릿, p<0.0001) TIL 배양에 의해 추가로 풍부해졌다 (템플릿의 4.8%, 도 2B).
PWP2-반응성 T-세포주를 IFNγ 캡처 후 TIL로부터 확장시키고, 야생형 10-mer 펩티드가 아닌 돌연변이체에 대한 반응성을 확인하였다 (도 2C 및 2D). 0.07% TCRVβ 템플릿 빈도로 말초 혈액을 자극한 후 TCRVβ 시퀀싱으로 TCRVβ 클론형을 식별하였는데, 이는 IFN-γ Elispot 분석으로 검출하기에 너무 낮을 수 있다. 따라서, 잠재적으로 방법의 둔감성 또는 만성 항원의 존재로 인해 기능적으로 손상될 수 있는 T 세포 확장의 어려움으로 인해 배양된 TIL 산물 및 혈액에서 상이한 특이성을 가진 T 세포가 단리될 수 있다.
이 분석에 의해 혈액 또는 종양에서 식별된 잠재적인 신생 항원 특이적 T 세포 대부분은 다른 암에 대한 이전 연구와 일치하는 개인의 환자 특이적 돌연변이를 인식하였다. 환자 1139에서의 재발성 유도 돌연변이 KRASG12V 및 환자 1238에서의 Her2-ITD에 대한 혈액에서 상대적으로 약한 T-세포 반응은 통계적 유의성에 도달하지 않았지만 악성 표현형에 대한 이러한 단백질의 중요성을 고려하여 특이성을 특성화하기 위해 추가 노력하였다. 환자 1139로부터의 PBMC를 KRASG12V 펩티드로 2 회 자극한 다음 IFNγ-분비 CD4+ T 세포를 식별하고 분류하였다. 제한 희석 배양물에서 T 세포를 확장시켰다. 저농도의 KRASG12V 펩티드에 대한 반응으로 특이적으로 IFN-γ를 분비하지만 상응하는 야생형 KRAS 펩티드에는 반응하지 않는 4 개의 T-세포 배양물을 얻었다.
TCRVβ 시퀀싱은 이들 T 세포가 클론 3, 5 및 9로 지칭되는 3 개의 상이한 TCRVβ 클론형을 갖는 단일 클론 집단을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 4A). KRASG12V에 대한 IFN-γ 생산은 항-HLA-DR에 의해 부분적으로 차단되었지만 항-HLA-DQ에 의해서 차단되지 않았으며, 이는 HLA-DR에 의한 제한을 제시한다 (도 4B). 환자의 HLA 유전자형은 HLA-DRB1*11:04/13:01, HLADQB1*03:01/06:03이었다. 3 개의 T-세포 클론은 모두 KRASG12V 펩티드로 펄스화된 HLA-DRB1*11:01 또는 11:04를 발현하는 LCL 세포주와 반응성을 보였지만, HLA-DRB1*11의 부재하에서는 DQB1*03:01 또는 DQB1*06:01을 발현하는 펩티드 펄스형 LCL은 그렇치 않았으며, 이는 HLA-DRB1*11에 의한 HLA 제한을 나타낸다 (도 4C). 종양으로부터 인접하지 않은 폐 또는 절제 검체에서 KRASG12V 특이적 TCRVβ 클론형이 검출되지 않았으며, 각각 10,000 TCRVβ 템플릿의 깊이로 시퀀싱되었다.
매우 높은 펩티드 농도에서 야생형 펩티드로 펄스화된 APC에 대한 KRASG12V 특이적 T-세포 클론의 반응성이 관찰되었다. 항원은 일반적으로 엔도솜에서 내인성 처리 후 CD4+ T 세포에 제시된다 (Kreiter et al. (2017)). 따라서, KRASG12V-반응성 T-세포 클론이 처리된 항원을 인식하는지 여부를 결정하기 위해, HLA-매칭 B-LCL을 엔도솜 표적화 서열을 갖는 KRASG12V 또는 야생형 KRAS를 암호화하는 미니 유전자 작제물로 형질감염시켰다. 3 개의 클론은 각각 야생형 KRAS 서열이 아닌 KRASG12V를 발현하는 세포를 특이적으로 인식하였으며 (도 4D, 4E), 이는 내인성으로 처리된 신생 항원에 대한 특이성을 나타낸다. T-세포 클론으로부터 KRASG12V-특이적 TCRVβ 및 Vα 서열을 5' RACE에 의해 수득하고, 이들 TCR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 작제하였다. 클론 3 및 9로부터의 TCR의 두 정상 공여자로부터의 CD4+ T 세포로의 형질도입은 펩티드 또는 KRASG12V를 발현하지만 야생형 KRAS 서열을 발현하지 않는 표적 세포에 대한 특이성을 부여하였다 (도 4F-4I).
이들 실험에서, 유전자이식 TCR의 유전자 전달 (도 4J) 전에 공여자 T 세포에 대해 내인성 TCRα 불변 영역 유전자 (TRAC)의 엑손 1을 CRISPR-Cas9 매개 파괴시켜 동종 항원 제시 세포로 이들 세포의 배경 활성화를 최소화하였다 (도 4K). KRASG12V-특이적 TCR로 조작된 T 세포는 야생형 KRAS 펩티드보다 >2 log10 낮은 저농도의 돌연변이 펩티드로 펄스화된 표적 세포의 인식을 나타냈다.
환자 1238은 아미노산 YVMA (Her2-ITD)의 프레임 내 중복을 생성하는 반복적인 Her2 엑손 20 삽입에 대해 약한 CD4+ T-세포 반응을 나타내었다 (도 6A 및 1B). KRASG12V 특이적 T 세포를 단리하기 위해 상술된 것과 동일한 접근법이 단리된 Her2-ITD 특이적 CD4+ T 세포주에 성공적으로 사용되었다.
TCRVβ 시퀀싱에 의한 다중 T-세포주의 분석 결과 10 개의 모든 T-세포주에 존재하는 단일 반복 TCRVβ 클론형을 나타내었으며 (도 6B; 도 8에 나타낸 KRAS 클론형에 대한 데이터), 이는 하나의 T-세포주 (# 35)에서 거의 클론성이었다. 이 세포주는 낮은 펩티드 농도에서 돌연변이 Her2-ITD 펩티드를 인식했지만 상응하는 야생형 Her2 펩티드는 인식하지 못했고 (도 5A, 5B), 반응성은 항-HLA-DQ에 의해 완전히 차단되었지만 항-HLA-DR 또는 항-클래스 I에 의해서는 차단되지 않았다 (도 5C, 5D). 차단 데이터와 일치하여, T 세포는 HLA-DQB1*05:01 및 05:02를 발현하는 Her2-ITD 펩티드 펄스 B-LCL 세포주와만 반응하였고, 이는 HLA DQB1-05에 의한 HLA 제한을 제시한다 (도 5G). 이들 T 세포는 또한 엔도솜으로 표적화된 돌연변이체이지만 야생형이 아닌 Her2 서열로 형질감염된 MHC 클래스 II+ 세포를 특이적으로 인식하였다 (도 5E, 5F). Her2-ITD-특이적 세포주의 TCRVβ 및 Vα 서열을 5' RACE에 의해 획득하였다. CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실에 의한 내인성 TCRα 파괴 후 TCR 서열의 렌티바이러스 유전자 전달은 돌연변이체이지만 야생형이 아닌 Her2 서열로 형질감염된 Her2-ITD 펩티드 및 MHC 클래스 II+ 세포에 특이성을 부여하였다 (도 5H 내지 5J). Vβ2 특이적 항체로 염색하여 측정된 전달된 TCR의 발현은 내인성 TCRα 불변 영역 유전자 TRAC의 CRISPR 매개 결실에 의해 개선되었다 (도 5K).
환자 1238로부터의 초기 폐 절제 샘플의 TCRVβ 딥-시퀀싱으로 종양 절제된 20179 템플릿 중 3 개에서 Her2-ITD-특이적 TCRVβ 클론형을 확인하였다. 절제술로부터 비인접 폐 조직의 5 배 더 깊은 시퀀싱에도 불구하고 Her2-ITD 특이적인 클론형은 관찰되지 않았으며 이는 종양에서 Her2-반응성 CD4+ T 세포가 풍부해졌음을 보여준다 (도 5L, 풍부성에 대해 p=0.004). 종양 절제 2 년 후 혈액에서 Her2-ITD-특이적 CD4+ T 세포의 존재는 이들 세포가 종양에 대한 지속적인 기억 T 세포 반응의 일부라는 것과 일치한다.
본 개시는 또한 다음의 예시적인 실시양태를 제공한다:
실시양태 1.
서열 번호 2 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) α-사슬 가변 도메인 (Vα); 및
서열 번호 3 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR β-사슬 가변 도메인 (Vβ)을 포함하는 결합 단백질로서,
상기 결합 단백질은 MTEYKLVVV GAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1):인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있고, 여기서 펩티드는 서열 번호 1의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되는,
결합 단백질.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, Vα는 서열 번호 2의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, Vα는 서열 번호 12의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 13의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
(i) 서열 번호 48 또는 54에 따른 CDR1α 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호 49 또는 55에 따른 CDR2α 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호 51 또는 57에 따른 CDR1β 아미노산 서열; 및/또는
(iv) 서열 번호 52 또는 58에 따른 CDR2β 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 5. 실시양태 4에 있어서, 각각 서열 번호 48, 49, 2, 51, 52 및 3에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 각각 서열 번호 54, 55, 12, 57, 58 및 13에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, HLA는 DRB1-1101 또는 DRB1-1104를 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, Vα는 서열 번호 6, 16, 66 또는 70 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, Vβ는 서열 번호 9, 19, 68 또는 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, Vα 및/또는 Vβ의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열 변화가 없고, 서열 변화가 있는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실 또는 이들의 조합만을 갖는, 결합 단백질.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, Vα는 TRAV8-3 또는 TRAV8-1에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, Vβ는 TRBV30 또는 TRBV12-4에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서,
TRAJ13 또는 TRAJ38에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열; 및
TCR β-사슬 결합 (Jβ) 유전자 세그먼트에 따른 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 14. 실시양태 13에 있어서, TRBJ2-4 또는 TRBJ2-3에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, Vα는 서열 번호 6 또는 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 9 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, Vα는 서열 번호 16 또는 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 19 또는 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, TCR β 사슬 불변 도메인 (Cβ), TCR α 사슬 불변 도메인 (Cα) 또는 둘 다를 추가로 포함하는 결합 단백질.
실시양태 18. 실시양태 17에 있어서,
(i) Cα는 서열 번호 67 또는 71에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되고/되거나;
(ii) Cβ는 서열 번호 69 또는 73에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, (서열 번호 1):HLA 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 20.
서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) α-사슬 가변 (Vα) 도메인; 및
서열 번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR β-사슬 가변 도메인 (Vβ)을 포함하는 결합 단백질로서,
여기서 결합 단백질은 SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 상기 펩티드는 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, Vα는 서열 번호 23의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 24의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 22. 실시양태 20 또는 21에 있어서, 서열 번호 60에 따른 CDR1α, 서열 번호 61에 따른 CDR2α, 서열 번호 63에 따른 CDR1β 및/또는 서열 번호 64에 따른 CDR2β를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 각각 서열 번호 60, 61, 23, 63, 64 및 24에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 24. 실시양태 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, HLA는 DQB1-05:01 또는 DQB1-05:02를 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 25. 실시양태 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, Vα는 서열 번호 27 또는 74의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 26. 실시양태 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, Vβ는 서열 번호 30 또는 76의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 27. 실시양태 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 3 개 또는 4 개의 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열에 변화가 없고, 서열 변화가 있는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합만을 갖는, 결합 단백질.
실시양태 28. 실시양태 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, Vα는 TRAV8-6에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 29. 실시양태 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, Vβ는 TRBV20에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 30. 실시양태 20 내지 29 중 어느 하나에 있어서,
TRAJ34에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열; 및
TCR β-사슬 결합 (Jβ) 유전자 세그먼트에 따른 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 31. 실시양태 30에 있어서, TRBJ2-5에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, Vα는 서열 번호 27 또는 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 30 또는 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 33. 실시양태 20 내지 32 중 어느 하나에 있어서, TCR β 사슬 불변 도메인 (Cβ), TCR α 사슬 불변 도메인 (Cα) 또는 둘 다를 추가로 포함하는 결합 단백질.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서,
(i) Cα는 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되고/되거나;
(ii) Cβ는 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 35. 실시양태 20 내지 34 중 어느 하나에 있어서, (서열 번호 22):HLA 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나, 이로 구성된, 결합 단백질.
실시양태 36. 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편인 결합 단백질.
실시양태 37. 실시양태 36에 있어서, TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편은 키메라, 인간화 또는 인간인, 결합 단백질.
실시양태 38. 실시양태 36 또는 실시양태 37에 있어서, TCR의 항원 결합 단편은 단일 사슬 TCR (scTCR)을 포함하는, 결합 단백질.
실시양태 39. 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나의 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
실시양태 40. 실시양태 1 내지 39 중 어느 하나의 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
실시양태 42. 실시양태 40 또는 41에 있어서, 서열 번호 4, 5, 7, 8, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 25, 26, 28, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된, 폴리뉴클레오티드.
실시양태 43. 실시양태 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 암호화된 결합 단백질은 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬을 포함하고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 α-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드와 β-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
실시양태 44. 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있는 발현 벡터.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 발현 벡터.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
실시양태 49. 실시양태 44 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터인, 발현 벡터.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터인, 발현 벡터.
실시양태 51. 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 44 내지 50 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서, 이의 세포 표면에서 암호화된 결합 단백질을 발현할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종성인, 재조합 숙주 세포.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 조혈 전구 세포 또는 면역계 세포, 임의로 인간 면역계 세포인, 재조합 숙주 세포.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포인, 또는 이들의 조합인, 재조합 숙주 세포.
실시양태 54. 실시양태 52 또는 53에 있어서, 면역계 세포는 T 세포인, 재조합 숙주 세포.
실시양태 55. 실시양태 53 또는 54에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 재조합 숙주 세포.
실시양태 56. 실시양태 52 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 결합 단백질은 내인성 TCR에 비해 CD3 단백질과 보다 효율적으로 결합할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 57. 실시양태 52 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 결합 단백질은 내인성 TCR에 비해 더 높은 표면 발현을 갖는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 58. 실시양태 52 내지 57 중 어느 하나에 있어서,
펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에서 IFN-γ를 생산할 수 있지만, 참조 펩티드:HLA 복합체의 존재하에서는 IFN-γ를 더 적은 양으로 생산하거나 또는 검출 가능한 IFN-γ를 생산하지 않고,
여기서 펩티드 항원은 서열 번호 1 또는 22에 따르거나, 펩티드 항원은 각각 서열 번호 1 또는 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 구성되며,
참조 펩티드는 각각 서열 번호 33 또는 34에 따른,
재조합 숙주 세포.
실시양태 59. 실시양태 58에 있어서, 펩티드 항원이 10, 1, 0.1 또는 약 0.01 μg/mL의 농도로 존재하는 경우 IFN-γ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 60. 실시양태 58 또는 59에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 0.01 μg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도로 존재하는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 61. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나에 있어서,
(a) KRAS G12V 펩티드:HLA 복합체; 및
(b) (i) 항-HLA-DQ 항체 또는 (b) (ii) 항-HLA-DR 항체의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 62. 실시양태 58 내지 61 중 어느 하나에 있어서, (i) KRAS G12V 펩티드 항원 및/또는 KRAS G12V 펩티드-암호화 RNA 및 (ii) HLA-DRB1-1101 또는 HLA DRB1-1104를 발현하고 KRAS G12V 항원을 숙주 면역 세포에 제시할 수 있는 세포의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 63. 실시양태 58 내지 62 중 어느 하나에 있어서,
(i) 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 50 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있으며, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르고 약 0.01 μg/mL 또는 약 0.05 μg/mL로 존재하고/하거나;
(ii) 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 100, 500, 1000, 5,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되고, 약 0.02, 0.2, 2, 또는 20 μg/mL로 존재하는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 64. 실시양태 58 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르며 적어도 약 0.01 μg/mL로 존재하는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 65. 실시양태 58 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체 및 항-HLA-DR 항체 및/또는 항-HLA 클래스 I 항체의 존재하에 IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 66. 실시양태 58 내지 65 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 번호 22에 따른 Her2-ITD 펩티드 항원 및/또는 서열 번호 22를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) HLA-DQB1-0501 또는 HLA-DQB1-0502를 발현하고 Her2-ITD 펩티드 항원을 숙주 면역 세포에 제시할 수 있는 세포주의 존재하에 IFN-γ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 67. 실시양태 58 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포이고 내인성 면역 세포 단백질의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 68. 실시양태 67에 있어서, PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분, TCR 성분 또는 이들의 임의 조합의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 재조합 숙주 세포.
실시양태 69. 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증, 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증을 지닌 대상에게 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나의 결합 단백질 또는 실시양태 58 내지 68 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 치료를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 조성물은 비경구 또는 정맥 내로 투여되는, 방법.
실시양태 71. 실시양태 69 또는 실시양태 70에 있어서, 대상에게 복수 용량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 72. 실시양태 71에 있어서, 복수 용량은 약 2 주 내지 약 4 주의 투여 간격으로 투여되는, 방법.
실시양태 73. 실시양태 69 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 대상에게 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 74. 실시양태 73에 있어서, 사이토카인은 IL-2, IL-15, 또는 IL-21을 포함하는, 방법.
실시양태 75. 실시양태 69 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 대상은 면역 억제 요법을 추가로 받고 있는, 방법.
실시양태 76. 실시양태 69 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 면역 억제제 저해제, 임의로 PD-1 저해제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 77. 실시양태 76에 있어서, PD-1 저해제는 니볼루맙 (OPDIVO®); 펨브롤리주맙 (KEYTRUDA®); 이필리무맙 + 니볼루맙 (YERVOY® + OPDIVO®); 세미플리맙; IBI-308; 니볼루맙 + 렐라틀리맙; BCD-100; 캠렐리주맙; JS-001; 스파르탈리주맙; 티스렐리주맙; AGEN-2034; BGBA-333 + 티스렐리주맙; CBT-501; 도스타리맙; 두르발루맙 + MEDI-0680; JNJ-3283; 파조파닙 하이드로클로라이드 + 펨브롤리주맙; 피딜리주맙; REGN-1979 + 세미플리맙; ABBV-181; ADUS-100 + 스파르탈리주맙; AK-104; AK-105; AMP-224; BAT-1306; BI-754091; CC-90006; 세미플리맙 + REGN-3767; CS-1003; GLS-010; LZM-009; MEDI-5752; MGD-013; PF-06801591; Sym-021; 티스렐리주맙 + 파미파립; XmAb-20717; AK-112; ALPN-202; AM-0001; 알츠하이머 병에 대한 PD-1 길항 항체; BH-2922; BH-2941; BH-2950; BH-2954; 고형 종양에 대해 CTLA-4 및 PD-1을 길항하는 생물학적 제제; 종양학상 PD-1 및 LAG-3을 표적으로 하는 이중 특이적 단일 클론 항체; BLSM-101; CB-201; CB-213; CBT-103; CBT-107; 세포 면역요법 + PD-1 저해제; CX-188; HAB-21; HEISCOIII-003; IKT-202; JTX-4014; MCLA-134; MD-402; mDX-400; MGD-019; 종양학상 PDCD1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 종양 용해성 바이러스; OT-2; PD-1 길항제 + 로페그인터페론 알파-2b; PEGMP-7; PRS-332; RXI-762; STIA-1110; TSR-075; 종양학상 HER2 및 PD-1을 표적으로 하는 백신; 종양학 및 자가 면역 질환상 PD-1을 표적으로 하는 백신; XmAb-23104; 종양학상 PD-1을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; AT-16201; 종양학상 PD-1을 억제하는 이중 특이적 단일 클론 항체; IMM-1802; 고형 종양 및 혈액 종양에 대한 PD-1 및 CTLA-4를 길항하는 단일 클론 항체; 니볼루맙 바이오시밀러; 종양학상 CD278 및 CD28에 작용하고 PD-1을 길항하는 재조합 단백질; 자가 면역 장애 및 염증성 장애에 대해 PD-1을 작용시키는 재조합 단백질; SNA-01; SSI-361; YBL-006; AK-103; JY-034; AUR-012; BGB-108; 고형 종양에 대한 PD-1, Gal-9 및 TIM-3을 억제하는 약물; ENUM-244C8; ENUM-388D4; MEDI-0680; 전이성 흑색종 및 전이성 폐암에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 CTLA-4 및 PD-1을 표적으로 하는 단일 클론 항체; NSCLC에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1 및 TIM-3을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 혈액암 및 고형 종양에 대한 PD-1 및 VEGF-A를 억제하는 재조합 단백질; 종양학상 PD-1을 길항하는 소분자; Sym-016; 이네빌리주맙 + MEDI-0680; 전이성 흑색종에 대한 PDL-1 및 IDO를 표적으로 하는 백신; 교모세포종에 대한 항-PD-1 단일 클론 항체 + 세포 면역요법; 종양학상 PD-1을 길항하는 항체; 혈액 악성 종양 및 세균 감염에 대한 PD-1/PD-L1을 억제하는 단일 클론 항체; HIV에 대한 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 및/또는 고형 종양에 대한 PD-1을 억제하는 소분자를 포함하는 방법.
실시양태 78. 실시양태 69 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 재조합 CD4+ T 세포, 재조합 CD8+ T 세포 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
실시양태 79. 실시양태 69 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 재조합 숙주 세포는 동종, 자가 또는 동계인, 방법.
실시양태 80. 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증의 치료에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나의 결합 단백질, 실시양태 39의 조성물, 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 실시양태 44 내지 50 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 실시양태 51 내지 68 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포.
실시양태 81. 실시양태 51 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증의 입양 면역요법에 사용하기 위한 재조합 숙주 세포.
실시양태 82. 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증이 치료 표적인 적응증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나의 결합 단백질, 실시양태 39의 조성물, 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 실시양태 44 내지 50 중 어느 하나의 발현 벡터, 또는 실시양태 51 내지 68 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포.
실시양태 83.
(i) MTE YKL VVV GAV GVG KSA LTI QLI Q (서열 번호 1) 또는 SPK ANK EIL DEA YVM AYV MAG VGS PYV SRL LG (서열 번호 22)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 및
(ii) 비자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
실시양태 84. 실시양태 83에 있어서, 비자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체는 크림, 에멀젼, 겔, 리포좀, 나노 입자 또는 연고를 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 85.
(i) MTE YKL VVV GAV GVG KSA LTI QLI Q (서열 번호 1) 또는 SPK ANK EIL DEA YVM AYV MAG VGS PYV SRL LG (서열 번호 22)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 및
(ii) 면역 유효량의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.
실시양태 86. 실시양태 84에 있어서, 보조제가 폴리-ICLC, CpG, GM-CSF 또는 알룸을 포함하는, 면역원성 조성물.
실시양태 87. 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상에게 실시양태 83 내지 86 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상을 치료하거나 상기 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
실시양태 88. 실시양태 87에 있어서, 면역원성 조성물은 대상에게 2 회 이상 투여되는, 방법.
실시양태 89. 실시양태 87 또는 실시양태 88에 있어서, 입양 세포 요법을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 90. 실시양태 86 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 보조제 또는 체크포인트 저해제 중 적어도 하나를 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 보조제 또는 체크포인트 저해제는 IL-2, PD-1 저해제, PD-L1 저해제 또는 CTLA-4 저해제 중 적어도 하나를 임의로 포함하는, 방법.
실시양태 91. 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하 아미노산의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 KRAS G12V 아미노산 서열로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 인접 아미노산 서열을 포함하는, KRAS G12V에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 단리된 펩티드.
실시양태 92. 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하 아미노산의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 22에 제시된 Her2-ITD 아미노산 서열로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32 개의 인접 아미노산 서열을 포함하는, Her2-ITD에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 단리된 펩티드.
실시양태 93. (i) 항원 제시 세포 집단, 및 (ii) 실시양태 40 내지 43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 실시양태 44 내지 50 중 어느 하나의 발현 벡터를 항원 제시 세포에 의한 항원 처리 및 제시에 충분한 조건하에서 그 시간 동안 시험관 내에서 접촉시켜 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 항원-펄스 항원-제시 세포를 수득하는 것을 포함하는, 항원-펄스 항원-제시 세포의 제조 방법.
실시양태 94. 실시양태 93에 있어서, 항원-펄스 항원-제시 세포를 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 조건하에서 그 시간 동안 하나 또는 복수의 면역 적합성 T 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 95. 실시양태 93의 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포를 시험관 내에서 확장하여 각각 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포의 하나 이상의 클론을 수득하고, 상기 하나 이상의 클론 중 하나 이상에 대한 핵산 서열을 암호화하는 T 세포 수용체 폴리펩티드를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 96. 실시양태 95에 있어서, T 세포 집단을 시험관 내에서 상기 결정된 T-세포 수용체 폴리펩티드-암호화 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 형질감염 또는 형질도입시켜 조작된 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 조작된 Her2-ITD-특이적 T 세포 집단을 항원-특이적 T-세포 반응을 입양적으로 전달하기에 효과적인 양으로 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
상기한 다양한 실시양태를 조합하여 추가 실시양태를 제공할 수 있다. 2018 년 8 월 22 일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 62/721,439호를 포함해, 본 명세서에서 언급되거나/되고 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허출원 공개, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공개물은 전부 그의 전문이 본원에서 참조로 원용된다. 실시양태들의 측면은, 필요에 따라 각종 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하도록 변형되어 추가의 실시양태를 제공할 수 있다.
상기한 상세한 설명에 비추어 실시양태에 대한 상기 변형 및 다른 변형이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어들은 청구범위를 명세서 및 청구항에 기재된 특정 실시양태들로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하고, 청구범위가 부여한 대응 전체 범위와 함께 모든 가능한 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 상기 개시에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> Fred Hutchinson Cancer Research Center
Veatch, Joshua
Riddell, Stanley R.
<120> IMMUNOTHERAPY TARGETING KRAS OR HER2
ANTIGENS
<130> 360056.472WO
<140> PCT/US2019/047550
<141> 2019-08-21
<150> US 62/721,439
<151> 2018-08-22
<160> 90
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V Immunogenic Peptide
<400> 1
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln
20 25
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha
<400> 2
Cys Ala Val Gly Arg Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta
<400> 3
Cys Ala Trp Ser Ala Leu Ala Gly Ala Arg Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha native nucleic
acid
<400> 4
tgtgctgtgg gccgatcgaa ttctgggggt taccagaaag ttaccttt 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha codon optimized
nucleic acid
<400> 5
tgcgccgtgg gcagatctaa tagcggcggc taccagaaag tgaccttt 48
<210> 6
<211> 310
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Vbeta amino acid
<400> 6
Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val
1 5 10 15
Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val
20 25 30
Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro
35 40 45
Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu
50 55 60
Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys
85 90 95
Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Ala
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Arg Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta native nucleic acid
<400> 7
tgtgcctgga gtgcgttggc gggagctaga gatacgcagt atttt 45
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta codon optimized
nucleic acid
<400> 8
tgtgcttgga gtgctctggc aggcgccaga gatacccagt atttt 45
<210> 9
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Valpha amino acid
<400> 9
Met Leu Leu Glu Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile His Phe Val Leu Arg
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ile His Ile Thr Val
20 25 30
Ser Glu Gly Ala Ser Leu Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Ala
35 40 45
Thr Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Gln Gly Ile Lys
65 70 75 80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Lys Arg Ser Gln Ser Ser Phe Asn Leu Arg
85 90 95
Lys Pro Ser Val His Trp Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val
100 105 110
Gly Arg Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Ile Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Gln Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 10
<211> 1827
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire TCR transgene (Nucleic
acid codon optimized)
<400> 10
atgctttgtt ctttgctggc tctgctgctg ggcaccttct ttggcgtcag aagccagacc 60
atccaccagt ggcctgctac actggtgcag cctgttggaa gccctctgag cctggaatgt 120
accgtggaag gcaccagcaa tcccaacctg tactggtaca gacaggccgc tggaagagga 180
ctgcagctgc tgttttacag cgtcggcatc ggccagatca gcagcgaggt tccacagaat 240
ctgagcgcca gcagacccca ggacagacag tttatcctga gcagcaagaa gctgctgctg 300
agcgacagcg gcttctacct gtgtgcttgg agtgctctgg caggcgccag agatacccag 360
tattttggcc ctggcaccag actgaccgtg ctggaagatc tgaagaacgt gttcccacct 420
gaggtggccg tgttcgagcc ttctgaggcc gagatcagcc acacacagaa agccacactc 480
gtgtgtctgg ccaccggctt ttaccccgat cacgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc 540
aaagaggtgc acagcggcgt ctgcacagat ccccagcctc tgaaagaaca gcccgctctg 600
aacgacagcc ggtactgcct gtctagcaga ctgagagtgt ccgccacctt ctggcagaac 660
cccagaaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgatgagtgg 720
acccaggata gagccaagcc tgtgacacag atcgtgtctg ccgaagcctg gggcagagcc 780
gattgtggct ttaccagcga gagctaccag cagggcgtgc tgtctgccac aatcctgtac 840
gagatcctgc tgggaaaagc cactctgtac gccgtgctgg tgtctgccct ggtgctgatg 900
gccatggtca agcggaagga tagcagaggc ggaagcggcg ccacaaactt cagcctgctt 960
aaacaggccg gcgacgtgga agagaacccc ggacctatgc tgctggaact gatccctctg 1020
ctggggattc acttcgtgct gagaaccgct agagcccaga gcgtgaccca gcctgatatc 1080
cacatcaccg tgtctgaggg cgcctctctg gaactgcggt gcaattacag ctacggcgcc 1140
actccttacc tgttttggta cgtgcagagc ccaggccagg gactgcaact cctgctgaag 1200
tactttagcg gcgacaccct ggtgcagggc atcaagggat tcgaggccga gttcaagaga 1260
agccagtcca gcttcaacct gcggaagcct tccgtgcatt ggagtgatgc cgccgagtac 1320
ttttgcgccg tgggcagatc taatagcggc ggctaccaga aagtgacctt tggcatcggc 1380
accaagctgc aagtgatccc caacattcag aaccccgatc ctgcagtgta ccagctgcgg 1440
gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg acttcgacag ccagaccaac 1500
gtgtcccaga gcaaggacag cgacgtgtac atcaccgata agtgcgtgct ggacatgcgg 1560
agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca acaagagcga cttcgcctgc 1620
gccaacgcct tcaacaacag cattatcccc gaggacacat tcttcccaag ccccgagagc 1680
agctgcgacg tgaagctggt ggaaaagagc ttcgagacag acaccaacct gaacttccag 1740
aacctcagcg tgatcggctt ccggatcctg ctgctgaagg tggccggctt caacctgctg 1800
atgaccctgc ggctgtggtc cagctga 1827
<210> 11
<211> 608
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire TCR transgene AA
(beta, P2A, alpha)
<400> 11
Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val
1 5 10 15
Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val
20 25 30
Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro
35 40 45
Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu
50 55 60
Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys
85 90 95
Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Ala
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Arg Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Glu
325 330 335
Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile His Phe Val Leu Arg Thr Ala Arg Ala
340 345 350
Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ile His Ile Thr Val Ser Glu Gly Ala
355 360 365
Ser Leu Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr Leu
370 375 380
Phe Trp Tyr Val Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys
385 390 395 400
Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Gln Gly Ile Lys Gly Phe Glu Ala
405 410 415
Glu Phe Lys Arg Ser Gln Ser Ser Phe Asn Leu Arg Lys Pro Ser Val
420 425 430
His Trp Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Gly Arg Ser Asn
435 440 445
Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Ile Gly Thr Lys Leu Gln
450 455 460
Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
465 470 475 480
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
485 490 495
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
500 505 510
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
515 520 525
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
530 535 540
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
545 550 555 560
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
565 570 575
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
580 585 590
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha
<400> 12
Cys Ala Val Thr Val Val Asn Ala Gly Asn Asn Arg Lys Leu Ile Trp
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta
<400> 13
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Leu Pro Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha native nucleic
acid
<400> 14
tgtgccgtga cggtggttaa tgctggcaac aaccgtaagc tgatttgg 48
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha codon optimized
nucleic acid
<400> 15
tgcgccgtga ccgtggtcaa cgccggcaac aacagaaagc tgatctgg 48
<210> 16
<211> 313
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Vbeta amino acid
<400> 16
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Leu Gly Leu Pro Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta native nucleic acid
<400> 17
tgtgccagca gtttagggct accagggaca gatacgcagt atttt 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta codon optimized
nucleic acid
<400> 18
tgtgccagca gcctgggact gcccggcacc gatacacagt atttt 45
<210> 19
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Valpha amino acid
<400> 19
Met Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala Leu Arg
1 5 10 15
Asp Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gln His Asn His His Val Ile Leu
20 25 30
Ser Glu Ala Ala Ser Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly
35 40 45
Thr Val Asn Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Gln His Leu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly Ile Lys
65 70 75 80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Ile Lys Ser Lys Phe Ser Phe Asn Leu Arg
85 90 95
Lys Pro Ser Val Gln Trp Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val
100 105 110
Thr Val Val Asn Ala Gly Asn Asn Arg Lys Leu Ile Trp Gly Leu Gly
115 120 125
Thr Ser Leu Ala Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 20
<211> 1836
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire TCR transgene (Nucleic
acid codon optimized)
<400> 20
atgggatctt ggacactgtg ttgcgtgtcc ctgtgcatcc tggtggccaa gcacacagat 60
gccggcgtga tccagtctcc tagacacgaa gtgaccgaga tgggccaaga agtgaccctg 120
cgctgcaagc ctatcagcgg ccacgattac ctgttctggt acagacagac catgatgaga 180
ggcctggaac tgctgatcta cttcaacaac aacgtgccca tcgacgacag cggcatgccc 240
gaggatagat tcagcgccaa gatgcccaac gccagcttca gcaccctgaa gatccagcct 300
agcgagccca gagatagcgc cgtgtacttt tgtgccagca gcctgggact gcccggcacc 360
gatacacagt attttggccc tggcaccaga ctgaccgtgc tggaagatct gaagaacgtg 420
ttcccacctg aggtggccgt gttcgagcct tctgaggccg agatcagcca cacacagaaa 480
gccacactcg tgtgtctggc caccggcttc tatcccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540
gtcaacggca aagaggtgca cagcggcgtc tgtaccgatc ctcagcctct gaaagagcag 600
cccgctctga acgacagcag atactgcctg agcagcagac tgagagtgtc cgccaccttc 660
tggcagaacc ccagaaacca cttcagatgc caggtgcagt tctacggcct gagcgagaac 720
gatgagtgga cccaggatag agccaagcct gtgacacaga tcgtgtctgc cgaagcctgg 780
ggcagagccg attgtggctt taccagcgag agctaccagc agggcgtgct gtctgccaca 840
atcctgtacg agatcctgct gggcaaagcc actctgtacg ccgtgctggt gtctgccctg 900
gtgctgatgg ccatggtcaa gcggaaggat agcagaggcg gaagcggcgc cacaaacttc 960
tcactgctga aacaggccgg cgacgtggaa gagaaccctg gacctatgct gctcctgctg 1020
atccctgtgc tgggcatgat cttcgccctg agagatgcta gagcccagtc cgtgtctcag 1080
cacaaccacc atgtgatcct gagcgaagcc gcctctctgg aactgggctg caattacagc 1140
tacggcggca ccgtgaatct gttttggtac gtgcagtacc ccggccagca tctccagctg 1200
ctgctgaagt actttagcgg cgaccctctg gtcaagggca tcaagggatt cgaggccgag 1260
ttcatcaaga gcaagttcag cttcaacctg cggaagccca gcgtgcagtg gagcgataca 1320
gccgagtatt tctgcgccgt gaccgtggtc aacgccggca acaacagaaa gctgatctgg 1380
ggcctgggca ccagcctggc tgtgaacccc aatattcaga accccgatcc tgcagtgtac 1440
cagctgcggg acagcaagag cagcgacaag agcgtgtgcc tgttcaccga cttcgacagc 1500
cagaccaacg tgtcccagag caaggacagc gacgtgtaca tcaccgataa gtgcgtgctg 1560
gacatgcgga gcatggactt caagagcaac agcgccgtgg cctggtccaa caagagcgac 1620
ttcgcctgcg ccaacgcctt caacaacagc attatccccg aggacacatt cttcccaagc 1680
cccgagagca gctgcgacgt gaagctggtg gaaaagagct tcgagacaga caccaacctg 1740
aacttccaga acctcagcgt gatcggcttc cggatcctgc tgctgaaggt ggccggcttc 1800
aacctgctga tgaccctgcg gctgtggtcc agctga 1836
<210> 21
<211> 611
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire TCR transgene AA
(beta, P2A, alpha)
<400> 21
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Leu Gly Leu Pro Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
305 310 315 320
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
325 330 335
Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala Leu Arg Asp
340 345 350
Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gln His Asn His His Val Ile Leu Ser
355 360 365
Glu Ala Ala Ser Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly Thr
370 375 380
Val Asn Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Gln His Leu Gln Leu
385 390 395 400
Leu Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly Ile Lys Gly
405 410 415
Phe Glu Ala Glu Phe Ile Lys Ser Lys Phe Ser Phe Asn Leu Arg Lys
420 425 430
Pro Ser Val Gln Trp Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Thr
435 440 445
Val Val Asn Ala Gly Asn Asn Arg Lys Leu Ile Trp Gly Leu Gly Thr
450 455 460
Ser Leu Ala Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr
465 470 475 480
Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr
485 490 495
Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val
500 505 510
Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys
515 520 525
Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala
530 535 540
Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
545 550 555 560
Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr
565 570 575
Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile
580 585 590
Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu
595 600 605
Trp Ser Ser
610
<210> 22
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD Immunogenic Peptide
<400> 22
Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala
1 5 10 15
Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly
20 25 30
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha
<400> 23
Cys Ala Val Ser Val Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta
<400> 24
Cys Ser Ala Pro Pro Leu Ala Gly Asp Glu Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha native nucleic
acid
<400> 25
tgtgctgtga gtgtgaacac cgacaagctc atcttt 36
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 alpha codon optimized
nucleic acid
<400> 26
tgcgccgtgt ctgtgaacac cgacaagctg atcttc 36
<210> 27
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Valpha amino acid
<400> 27
Met Leu Leu Leu Leu Val Pro Ala Phe Gln Val Ile Phe Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gly Thr Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser Gln Val Pro Val
20 25 30
Phe Glu Glu Ala Pro Val Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Val
35 40 45
Ser Val Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Lys Tyr Leu Ser Gly Ser Thr Leu Val Glu Ser Ile Asn
65 70 75 80
Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Arg
85 90 95
Lys Pro Ser Val His Ile Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val
100 105 110
Ser Val Asn Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln
115 120 125
Val Phe Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta native nucleic acid
<400> 28
tgcagtgctc ctcccctagc gggagatgag acccagtact tc 42
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - CDR3 beta nucleic acid -
codon optimized
<400> 29
tgtagcgccc ctccactggc cggcgacgag acacaatatt tt 42
<210> 30
<211> 308
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Vbeta Amino Acid
<400> 30
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala
1 5 10 15
Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser
20 25 30
Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe
35 40 45
Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser
50 55 60
Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys
65 70 75 80
Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr
85 90 95
Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Pro Pro
100 105 110
Leu Ala Gly Asp Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu
115 120 125
Val Leu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
130 135 140
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
165 170 175
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
180 185 190
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
195 200 205
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
210 215 220
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
225 230 235 240
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
245 250 255
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
260 265 270
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
275 280 285
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
290 295 300
Asp Ser Arg Gly
305
<210> 31
<211> 1809
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire Nucleic Acid TCR
Transgene
<400> 31
atgttgcttt tgttgctgct cctcggacct ggctctggac tgggagctgt ggtttctcag 60
cacccctctt gggtcatctg caagagcggc accagcgtga agatcgagtg cagaagcctg 120
gacttccagg ccaccacaat gttctggtac agacagttcc ccaagcagag cctgatgctg 180
atggccacct ctaacgaggg cagcaaggcc acatatgagc agggcgtcga gaaggacaag 240
ttcctgatca accacgccag cctgacactg agcaccctga cagtgacaag cgcccatcct 300
gaggacagca gcttctacat ctgtagcgcc cctccactgg ccggcgacga gacacaatat 360
tttggccctg gcaccagact gctggtgctg gacctgaaga acgtgttccc acctgaggtg 420
gccgtgttcg agccttctga ggccgagatc agccacacac agaaagccac actcgtgtgt 480
ctggccaccg gcttctatcc cgatcacgtc gaactgtctt ggtgggtcaa cggcaaagag 540
gtgcacagcg gcgtctgtac cgatcctcag cctctgaaag agcagcccgc tctgaacgac 600
agcagatact gcctgagcag cagactgaga gtgtccgcca ccttctggca gaaccccaga 660
aaccacttca gatgccaggt gcagttctac ggcctgagcg agaacgatga gtggacccag 720
gatagagcca agcctgtgac acagatcgtg tctgccgaag cctggggcag agccgattgt 780
ggctttacca gcgagagcta ccagcaaggc gtgctgtctg ccaccatcct gtacgagatc 840
ctgctgggca aagccactct gtacgccgtg ctggtgtctg ccctggtcct gatggctatg 900
gtcaagcgga aggatagcag aggcggaagc ggcgccacaa acttctcact gctgaaacag 960
gcaggcgacg tggaagagaa ccccggacct atgctgctgc ttctggtgcc tgccttccaa 1020
gtgatcttta ccctcggcgg cacaagagcc cagagcgtga cacagctgga tagccaggtg 1080
ccagtgttcg aagaggcccc tgtggaactg cggtgcaact acagcagcag cgtgtccgtg 1140
tacctgtttt ggtacgtgca gtaccccaac cagggcctgc agctgctcct gaagtatctg 1200
agcggcagca ccctggtgga atccatcaat ggcttcgagg ccgaattcaa caagagccag 1260
accagcttcc acctgagaaa gcccagcgtg cacatcagcg ataccgccga gtacttctgc 1320
gccgtgtctg tgaacaccga caagctgatc ttcggcaccg gcacaaggct ccaggtgttc 1380
cccaacattc agaaccccga tcctgcagtg taccagctgc gggacagcaa gagcagcgac 1440
aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac agccagacca acgtgtccca gagcaaggac 1500
agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc 1560
aacagcgccg tggcctggtc caacaagagc gacttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac 1620
agcattatcc ccgaggacac attcttccca agccccgaga gcagctgcga cgtgaagctg 1680
gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac ctgaacttcc agaacctcag cgtgatcggc 1740
ttccggatcc tgctgctgaa ggtggccggc ttcaacctgc tgatgaccct gcggctgtgg 1800
tccagctga 1809
<210> 32
<211> 602
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Entire TCR Amino Acid
Sequence
<400> 32
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly Ala
1 5 10 15
Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr Ser
20 25 30
Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met Phe
35 40 45
Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser
50 55 60
Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp Lys
65 70 75 80
Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val Thr
85 90 95
Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Pro Pro
100 105 110
Leu Ala Gly Asp Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu
115 120 125
Val Leu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
130 135 140
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
165 170 175
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
180 185 190
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
195 200 205
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
210 215 220
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
225 230 235 240
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
245 250 255
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
260 265 270
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
275 280 285
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
290 295 300
Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Leu Val
325 330 335
Pro Ala Phe Gln Val Ile Phe Thr Leu Gly Gly Thr Arg Ala Gln Ser
340 345 350
Val Thr Gln Leu Asp Ser Gln Val Pro Val Phe Glu Glu Ala Pro Val
355 360 365
Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Val Ser Val Tyr Leu Phe Trp
370 375 380
Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Leu
385 390 395 400
Ser Gly Ser Thr Leu Val Glu Ser Ile Asn Gly Phe Glu Ala Glu Phe
405 410 415
Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Arg Lys Pro Ser Val His Ile
420 425 430
Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Ser Val Asn Thr Asp Lys
435 440 445
Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Phe Pro Asn Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
465 470 475 480
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
485 490 495
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
500 505 510
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
515 520 525
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
530 535 540
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
545 550 555 560
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
565 570 575
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
580 585 590
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS WT peptide
<400> 33
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln
20 25
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 WT Peptide
<400> 34
Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala
1 5 10 15
Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly
20 25
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence -Thoseaasigna virus 2A (T2A)
peptide
<400> 35
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Porcine teschovirus-1 2A
(P2A) peptide
<400> 36
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Equine rhinitis A virus
(ERAV) 2A (E2A)
<400> 37
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Foot-and-mouth disease virus
2A (F2A) peptide
<400> 38
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - mutant peptide
<400> 39
Thr Glu Arg Trp Asp Asn Leu Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - mutant peptide
<400> 40
Ala Glu Arg Trp Asp Asn Leu Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Human TCR Cbeta1 Reverse
<400> 41
ccacttccag ggctgccttc agaaatc 27
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Human TCR Cbeta2 Reverse
<400> 42
tgggatggtt ttggagctag cctctgg 27
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Human TCR Calpha Reverse
<400> 43
cagccgcagc gtcatgagca gatta 25
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - JV298 primer
<400> 44
tcgcttctgt tcgcgcgctt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - JV300 primer
<400> 45
aacaggcaca cgctcttgtc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - guide rna
<400> 46
agagtctctc agctggtaca 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - TCR beta guide rna
<400> 47
ggagaatgac gagtggaccc 20
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 CDR1alpha
<400> 48
Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 CDR2alpha
<400> 49
Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu
1 5
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCRalpha
signal peptide
<400> 50
Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly Val
1 5 10 15
Arg Ser Gln Thr
20
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 CDR1beta
<400> 51
Gly Thr Ser Asn Pro Asn
1 5
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 CDR2beta
<400> 52
Ser Val Gly Ile Gly
1 5
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCRbeta
signal peptide
<400> 53
Met Leu Leu Glu Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile His Phe Val Leu Arg
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 CDR2alpha
<400> 54
Tyr Gly Gly Thr Val Asn
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 CDR2alpha
<400> 55
Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu
1 5
<210> 56
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCRalpha
signal peptide
<400> 56
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp
20
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 CDR1beta
<400> 57
Ser Gly His Asp Tyr
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 CDR2beta
<400> 58
Phe Asn Asn Asn Val Pro
1 5
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCRbeta
signal peptide
<400> 59
Met Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Leu Gly Met Ile Phe Ala Leu Arg
1 5 10 15
Asp Ala Arg Ala Gln
20
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCR CDR1alpha
<400> 60
Ser Ser Val Ser Val Tyr
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCR CDR2alpha
<400> 61
Tyr Leu Ser Gly Ser Thr Leu
1 5
<210> 62
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCRalpha signal
peptide
<400> 62
Met Leu Leu Leu Leu Val Pro Ala Phe Gln Val Ile Phe Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gly Thr Arg Ala
20
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCR CDR1beta
<400> 63
Asp Phe Gln Ala Thr Thr
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCR CDR2beta
<400> 64
Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala
1 5
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - Her2 ITD TCRbeta signal
peptide
<400> 65
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly Leu Gly
1 5 10 15
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCR Valpha
(mature)
<400> 66
Arg Ala Gln Ser Val Thr Gln Pro Asp Ile His Ile Thr Val Ser Glu
1 5 10 15
Gly Ala Ser Leu Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Ala Thr Pro
20 25 30
Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Leu
35 40 45
Leu Lys Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val Gln Gly Ile Lys Gly Phe
50 55 60
Glu Ala Glu Phe Lys Arg Ser Gln Ser Ser Phe Asn Leu Arg Lys Pro
65 70 75 80
Ser Val His Trp Ser Asp Ala Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Gly Arg
85 90 95
Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Lys Val Thr Phe Gly Ile Gly Thr Lys
100 105 110
Leu Gln Val Ile Pro Asn
115
<210> 67
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCR Calpha
<400> 67
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCR Vbeta
(mature)
<400> 68
Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro Val Gly Ser Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn Pro Asn Leu Tyr Trp
20 25 30
Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu Phe Tyr Ser Val
35 40 45
Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln Asn Leu Ser Ala Ser
50 55 60
Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser Lys Lys Leu Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser Ala Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Arg Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu
100 105 110
<210> 69
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 3 TCR Cbeta
<400> 69
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 70
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCR Valpha
(mature)
<400> 70
Ser Val Ser Gln His Asn His His Val Ile Leu Ser Glu Ala Ala Ser
1 5 10 15
Leu Glu Leu Gly Cys Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly Thr Val Asn Leu Phe
20 25 30
Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Gln His Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr
35 40 45
Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val Lys Gly Ile Lys Gly Phe Glu Ala Glu
50 55 60
Phe Ile Lys Ser Lys Phe Ser Phe Asn Leu Arg Lys Pro Ser Val Gln
65 70 75 80
Trp Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Thr Val Val Asn Ala
85 90 95
Gly Asn Asn Arg Lys Leu Ile Trp Gly Leu Gly Thr Ser Leu Ala Val
100 105 110
Asn Pro Asn
115
<210> 71
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCR Calpha
<400> 71
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 72
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCR Vbeta
(mature)
<400> 72
Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly Gln
1 5 10 15
Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe
35 40 45
Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro
65 70 75 80
Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly
85 90 95
Leu Pro Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Leu Glu
115
<210> 73
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS G12V clone 9 TCR Cbeta
<400> 73
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD TCR Valpha (mature)
<400> 74
Gln Ser Val Thr Gln Leu Asp Ser Gln Val Pro Val Phe Glu Glu Ala
1 5 10 15
Pro Val Glu Leu Arg Cys Asn Tyr Ser Ser Ser Val Ser Val Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys
35 40 45
Tyr Leu Ser Gly Ser Thr Leu Val Glu Ser Ile Asn Gly Phe Glu Ala
50 55 60
Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Arg Lys Pro Ser Val
65 70 75 80
His Ile Ser Asp Thr Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Val Ser Val Asn Thr
85 90 95
Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Gln Val Phe Pro Asn
100 105 110
<210> 75
<211> 140
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD TCR Calpha
<400> 75
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
20 25 30
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
35 40 45
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
50 55 60
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
65 70 75 80
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
85 90 95
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
100 105 110
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
115 120 125
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 76
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD TCR Vbeta (mature)
<400> 76
Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr Thr Met
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr
35 40 45
Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu Lys Asp
50 55 60
Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser Ala Pro
85 90 95
Pro Leu Ala Gly Asp Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Leu Val Leu
115
<210> 77
<211> 178
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD TCR Cbeta
<400> 77
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 78
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2_TCR_clono_CDR3b_2
<400> 78
Cys Ala Ser Ser Ser Arg Gly Leu Ala Gly Val Gly Ser Ser Tyr Glu
1 5 10 15
Gln Tyr Phe
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2_TCR_clono_CDR3b_3
<400> 79
Cys Ala Ser Ser Leu Glu Val Asp Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2_TCR_clono_CDR3b_4
<400> 80
Cys Ala Ser Ser Gln Arg Gln Gly Gly Asn Glu Lys Leu Phe Phe
1 5 10 15
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2_TCR_clono_CDR3b_5
<400> 81
Cys Ala Ser Ser Leu Gly Glu Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2_TCR_clono_CDR3b_6
<400> 82
Cys Ala Ser Ser Pro Ala Val Ser Gly Glu Lys Leu Phe Phe
1 5 10
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS_TCR_clono_CDR3b_1
<400> 83
Cys Ala Ser Ser Phe Gly Gln Gly Arg Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS_TCR_clono_CDR3b_2
<400> 84
Cys Ala Trp Ser Asp Leu Phe Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - KRAS_TCR_clono_CDR3b_3
<400> 85
Cys Ala Trp Ser Thr Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD amino acid
<400> 86
Tyr Val Met Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser
1 5 10
<210> 87
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 ITD nucleotide
<400> 87
atacgtgatg gcatacgtga tggctggtgt gggctcc 37
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 amino acid
<400> 88
Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser
1 5
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - HER2 nucleotide
<400> 89
atacgtgatg gctggtgtgg gctcc 25
<210> 90
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence - 12 base pair duplicated
insertion
<400> 90
atacgtgatg gc 12
Claims (96)
- 서열 번호 2 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) α-사슬 가변 도메인 (Vα); 및
서열 번호 3 또는 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR β-사슬 가변 도메인 (Vβ)을 포함하는 결합 단백질로서,
MTEYKLVVV GAVGVGKSALTIQLIQ (서열 번호 1):인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있고, 여기서 펩티드는 서열 번호 1의 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되는,
결합 단백질. - 제1항에 있어서, Vα는 서열 번호 2의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 3의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항에 있어서, Vα는 서열 번호 12의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 13의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 서열 번호 48 또는 54에 따른 CDR1α 아미노산 서열;
(ii) 서열 번호 49 또는 55에 따른 CDR2α 아미노산 서열;
(iii) 서열 번호 51 또는 57에 따른 CDR1β 아미노산 서열; 및/또는
(iv) 서열 번호 52 또는 58에 따른 CDR2β 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 결합 단백질. - 제4항에 있어서, 각각 서열 번호 48, 49, 2, 51, 52 및 3에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제5항에 있어서, 각각 서열 번호 54, 55, 12, 57, 58 및 13에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HLA는 DRB1-1101 또는 DRB1-1104를 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 서열 번호 6, 16, 66 또는 70 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ는 서열 번호 9, 19, 68 또는 72 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Vα 및/또는 Vβ의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 적어도 3 개 또는 4 개는 서열 변화가 없고, 서열 변화가 있는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실 또는 이들의 조합만을 갖는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 TRAV8-3 또는 TRAV8-1에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ는 TRBV30 또는 TRBV12-4에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
TRAJ13 또는 TRAJ38에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열; 및
TCR β-사슬 결합 (Jβ) 유전자 세그먼트에 따른 아미노산 서열을 추가로 포함하는,
결합 단백질. - 제13항에 있어서, TRBJ2-4 또는 TRBJ2-3에 따른 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 서열 번호 6 또는 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 9 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 서열 번호 16 또는 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 19 또는 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, TCR β 사슬 불변 도메인 (Cβ), TCR α 사슬 불변 도메인 (Cα) 또는 둘 다를 추가로 포함하는 결합 단백질.
- 제17항에 있어서,
(i) Cα는 서열 번호 67 또는 71에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되고/되거나;
(ii) Cβ는 서열 번호 69 또는 73에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된,
결합 단백질. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, (서열 번호 1):HLA 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 1의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR) α-사슬 가변 (Vα) 도메인; 및
서열 번호 24의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR β-사슬 가변 도메인 (Vβ)을 포함하는 결합 단백질로서,
SPKANKEILDEAYVMAYVMAGVGSPYVSRLLG (서열 번호 22):인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 구성된,
결합 단백질. - 제20항에 있어서, Vα는 서열 번호 23의 CDR3 아미노산 서열을 포함하고 Vβ는 서열 번호 24의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 서열 번호 60에 따른 CDR1α, 서열 번호 61에 따른 CDR2α, 서열 번호 63에 따른 CDR1β 및/또는 서열 번호 64에 따른 CDR2β를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
- 제22항에 있어서, 각각 서열 번호 60, 61, 23, 63, 64 및 24에 제시된 CDR1α, CDR2α, CDR3α, CDR1β, CDR2β 및 CDR3β 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, HLA는 DQB1-05:01 또는 DQB1-05:02를 포함하는, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 서열 번호 27 또는 74의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ는 서열 번호 30 또는 76의 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 3 개 또는 4 개의 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열에 변화가 없고, 서열 변화가 있는 CDR은 최대 2 개의 아미노산 치환, 최대 연속 5 개의 아미노산 결실, 또는 이들의 조합만을 갖는, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 TRAV8-6에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, Vβ는 TRBV20에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
TRAJ34에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열; 및
TCR β-사슬 결합 (Jβ) 유전자 세그먼트에 따른 아미노산 서열을 추가로 포함하는,
결합 단백질. - 제30항에 있어서, TRBJ2-5에 따른 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Vα는 서열 번호 27 또는 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, Vβ는 서열 번호 30 또는 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, TCR β 사슬 불변 도메인 (Cβ), TCR α 사슬 불변 도메인 (Cα) 또는 둘 다를 추가로 포함하는 결합 단백질.
- 제33항에 있어서,
(i) Cα는 서열 번호 75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되고/되거나;
(ii) Cβ는 서열 번호 77에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 85% 동일성을 갖거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된,
결합 단백질. - 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, (서열 번호 22):HLA 복합체 및/또는 펩티드:HLA 복합체에 결합할 수 있으며, 여기서 펩티드는 CD4 부재하에 또는 이에 독립적으로 세포 표면상에 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나, 이로 구성된, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편인 결합 단백질.
- 제36항에 있어서, TCR, 키메라 항원 수용체 또는 TCR의 항원 결합 단편은 키메라, 인간화 또는 인간인, 결합 단백질.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, TCR의 항원 결합 단편은 단일 사슬 TCR (scTCR)을 포함하는, 결합 단백질.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제39 중 어느 하나의 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제40항에 있어서, 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드.
- 제40항 또는 41항에 있어서, 서열 번호 4, 5, 7, 8, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 25, 26, 28, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된, 폴리뉴클레오티드.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 암호화된 결합 단백질은 TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬을 포함하고, α-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드와 β-사슬 암호화 폴리뉴클레오티드 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제44항에 있어서, 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있는 발현 벡터.
- 제45항에 있어서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포인, 발현 벡터.
- 제46항에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
- 제47항에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 발현 벡터.
- 제44항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터인, 발현 벡터.
- 제49항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터인, 발현 벡터.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 제44항 내지 제50항 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서, 이의 세포 표면에서 암호화된 결합 단백질을 발현할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 이종성인, 재조합 숙주 세포.
- 제51항에 있어서, 조혈 전구 세포 또는 면역계 세포, 임의로 인간 면역계 세포인, 재조합 숙주 세포.
- 제52항에 있어서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 조합인, 재조합 숙주 세포.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 면역계 세포는 T 세포인, 재조합 숙주 세포.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, T 세포는 나이브 T 세포, 중앙 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포, 또는 이들의 임의의 조합인, 재조합 숙주 세포.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질은 내인성 TCR에 비해 CD3 단백질과 보다 효율적으로 결합할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질은 내인성 TCR에 비해 더 높은 표면 발현을 갖는, 재조합 숙주 세포.
- 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에서 IFN-γ를 생산할 수 있지만, 참조 펩티드:HLA 복합체의 존재하에서는 IFN-γ를 더 적은 양으로 생산하거나 또는 검출 가능한 IFN-γ를 생산하지 않고,
여기서 펩티드 항원은 서열 번호 1 또는 22에 따르거나, 펩티드 항원은 각각 서열 번호 1 또는 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개의 연속 아미노산을 포함하거나 이로 구성되며,
참조 펩티드는 각각 서열 번호 33 또는 34에 따른,
재조합 숙주 세포. - 제58항에 있어서, 펩티드 항원이 10, 1, 0.1 또는 약 0.01 μg/mL의 농도로 존재하는 경우 IFN-γ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 0.01 μg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도로 존재하는, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) KRAS G12V 펩티드:HLA 복합체; 및
(b) (i) 항-HLA-DQ 항체 또는 (b) (ii) 항-HLA-DR 항체의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있는,
재조합 숙주 세포. - 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, (i) KRAS G12V 펩티드 항원 및/또는 KRAS G12V 펩티드-암호화 RNA 및 (ii) HLA-DRB1-1101 또는 HLA DRB1-1104를 발현하고 KRAS G12V 항원을 숙주 면역 세포에 제시할 수 있는 세포의 존재하에 IFNγ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 50 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되고 약 0.01 μg/mL 또는 약 0.05 μg/mL로 존재하고/하거나;
(ii) 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 100, 500, 1000, 5,000, 또는 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되고 약 0.02, 0.2, 2, 또는 20 μg/mL로 존재하는,
재조합 숙주 세포. - 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체의 존재하에 적어도 약 10,000 pg/mL IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성되고 적어도 약 0.01 μg/mL로 존재하는, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원:HLA 복합체 및 항-HLA-DR 항체 및/또는 항-HLA 클래스 I 항체의 존재하에 IFN-γ를 생산할 수 있고, 여기서 펩티드 항원은 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열 번호 22에 따르거나, 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 Her2-ITD 펩티드 항원 및/또는 서열 번호 22를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열 번호 22의 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 28, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31 개의 인접 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 및 (ii) HLA-DQB1-0501 또는 HLA-DQB1-0502를 발현하고 Her2-ITD 펩티드 항원을 숙주 면역 세포에 제시할 수 있는 세포주의 존재하에 IFN-γ를 생산할 수 있는, 재조합 숙주 세포.
- 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포이고 내인성 면역 세포 단백질의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 재조합 숙주 세포.
- 제67항에 있어서, PD-1, TIM3, LAG3, CTLA4, TIGIT, HLA 성분, TCR 성분 또는 이들의 임의 조합의 염색체 유전자 녹아웃을 포함하는, 재조합 숙주 세포.
- 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증, 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증을 지닌 대상에게 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 치료를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법.
- 제69항에 있어서, 조성물은 비경구 또는 정맥 내로 투여되는, 방법.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 대상에게 복수 용량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제71항에 있어서, 복수 용량은 약 2 주 내지 약 4 주의 투여 간격으로 투여되는, 방법.
- 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제73항에 있어서, 사이토카인은 IL-2, IL-15, 또는 IL-21을 포함하는, 방법.
- 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 면역 억제 요법을 추가로 받고 있는, 방법.
- 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 억제제 저해제, 임의로 PD-1 저해제를 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제76항에 있어서, PD-1 저해제는 니볼루맙 (OPDIVO®); 펨브롤리주맙 (KEYTRUDA®); 이필리무맙 + 니볼루맙 (YERVOY® + OPDIVO®); 세미플리맙; IBI-308; 니볼루맙 + 렐라틀리맙; BCD-100; 캠렐리주맙; JS-001; 스파르탈리주맙; 티스렐리주맙; AGEN-2034; BGBA-333 + 티스렐리주맙; CBT-501; 도스타리맙; 두르발루맙 + MEDI-0680; JNJ-3283; 파조파닙 하이드로클로라이드 + 펨브롤리주맙; 피딜리주맙; REGN-1979 + 세미플리맙; ABBV-181; ADUS-100 + 스파르탈리주맙; AK-104; AK-105; AMP-224; BAT-1306; BI-754091; CC-90006; 세미플리맙 + REGN-3767; CS-1003; GLS-010; LZM-009; MEDI-5752; MGD-013; PF-06801591; Sym-021; 티스렐리주맙 + 파미파립; XmAb-20717; AK-112; ALPN-202; AM-0001; 알츠하이머 병에 대한 PD-1 길항 항체; BH-2922; BH-2941; BH-2950; BH-2954; 고형 종양에 대해 CTLA-4 및 PD-1을 길항하는 생물학적 제제; 종양학상 PD-1 및 LAG-3을 표적으로 하는 이중 특이적 단일 클론 항체; BLSM-101; CB-201; CB-213; CBT-103; CBT-107; 세포 면역요법 + PD-1 저해제; CX-188; HAB-21; HEISCOIII-003; IKT-202; JTX-4014; MCLA-134; MD-402; mDX-400; MGD-019; 종양학상 PDCD1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 종양 용해성 바이러스; OT-2; PD-1 길항제 + 로페그인터페론 알파-2b; PEGMP-7; PRS-332; RXI-762; STIA-1110; TSR-075; 종양학상 HER2 및 PD-1을 표적으로 하는 백신; 종양학 및 자가 면역 질환상 PD-1을 표적으로 하는 백신; XmAb-23104; 종양학상 PD-1을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드; AT-16201; 종양학상 PD-1을 억제하는 이중 특이적 단일 클론 항체; IMM-1802; 고형 종양 및 혈액 종양에 대한 PD-1 및 CTLA-4를 길항하는 단일 클론 항체; 니볼루맙 바이오시밀러; 종양학상 CD278 및 CD28에 작용하고 PD-1을 길항하는 재조합 단백질; 자가 면역 장애 및 염증성 장애에 대해 PD-1을 작용시키는 재조합 단백질; SNA-01; SSI-361; YBL-006; AK-103; JY-034; AUR-012; BGB-108; 고형 종양에 대한 PD-1, Gal-9 및 TIM-3을 억제하는 약물; ENUM-244C8; ENUM-388D4; MEDI-0680; 전이성 흑색종 및 전이성 폐암에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 CTLA-4 및 PD-1을 표적으로 하는 단일 클론 항체; NSCLC에 대한 PD-1을 길항하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1 및 TIM-3을 억제하는 단일 클론 항체; 종양학상 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 혈액암 및 고형 종양에 대한 PD-1 및 VEGF-A를 억제하는 재조합 단백질; 종양학상 PD-1을 길항하는 소분자; Sym-016; 이네빌리주맙 + MEDI-0680; 전이성 흑색종에 대한 PDL-1 및 IDO를 표적으로 하는 백신; 교모세포종에 대한 항-PD-1 단일 클론 항체 + 세포 면역요법; 종양학상 PD-1을 길항하는 항체; 혈액 악성 종양 및 세균 감염에 대한 PD-1/PD-L1을 억제하는 단일 클론 항체; HIV에 대한 PD-1을 억제하는 단일 클론 항체; 및/또는 고형 종양에 대한 PD-1을 억제하는 소분자를 포함하는 방법.
- 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 재조합 CD4+ T 세포, 재조합 CD8+ T 세포 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
- 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 동종, 자가 또는 동계인, 방법.
- 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제39항의 조성물, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 또는 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포.
- 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증의 입양 면역요법에 사용하기 위한 재조합 숙주 세포.
- 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제39항의 조성물, 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 또는 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포.
- (i) MTE YKL VVV GAV GVG KSA LTI QLI Q (서열 번호 1) 또는 SPK ANK EIL DEA YVM AYV MAG VGS PYV SRL LG (서열 번호 22)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 및
(ii) 비자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는
면역원성 조성물. - 제83항에 있어서, 비자연적으로 발생하는 약학적으로 허용되는 담체는 크림, 에멀젼, 겔, 리포좀, 나노 입자 또는 연고를 포함하는, 면역원성 조성물.
- (i) MTE YKL VVV GAV GVG KSA LTI QLI Q (서열 번호 1) 또는 SPK ANK EIL DEA YVM AYV MAG VGS PYV SRL LG (서열 번호 22)와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드; 및
(ii) 면역 유효량의 보조제를 포함하는
면역원성 조성물. - 제84항에 있어서, 보조제가 폴리-ICLC, CpG, GM-CSF 또는 알룸을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 비-소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암, 췌장암, 난소암, 유방암, 담도암, KRAS G12V 신생 항원이 치료 표적인 적응증 또는 Her2-ITD 신생 항원이 치료 표적인 적응증을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상에게 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 치료를 필요로 하는 대상을 치료하거나 상기 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
- 제87항에 있어서, 면역원성 조성물은 대상에게 2 회 이상 투여되는, 방법.
- 제87항 또는 제88항에 있어서, 입양 세포 요법을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제 또는 체크포인트 저해제 중 적어도 하나를 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 보조제 또는 체크포인트 저해제는 IL-2, PD-1 저해제, PD-L1 저해제 또는 CTLA-4 저해제 중 적어도 하나를 임의로 포함하는, 방법.
- 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하 아미노산의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 1에 제시된 KRAS G12V 아미노산 서열로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개의 인접 아미노산 서열을 포함하는, KRAS G12V에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 단리된 펩티드.
- 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 또는 7 개 이하 아미노산의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 서열 번호 22에 제시된 Her2-ITD 아미노산 서열로부터의 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 또는 32 개의 인접 아미노산 서열을 포함하는, Her2-ITD에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 단리된 펩티드.
- (i) 항원 제시 세포 집단, 및 (ii) 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 항원 제시 세포에 의한 항원 처리 및 제시에 충분한 조건하에서 그 시간 동안 시험관 내에서 접촉시켜 KRAS G12V 또는 Her2-ITD에 대한 항원-특이적 T-세포 반응을 유도할 수 있는 항원-펄스 항원-제시 세포를 수득하는 것을 포함하는, 항원-펄스 항원-제시 세포의 제조 방법.
- 제93항에 있어서, 항원-펄스 항원-제시 세포를 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 조건하에서 그 시간 동안 하나 또는 복수의 면역 적합성 T 세포와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제93항의 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포를 시험관 내에서 확장하여 각각 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 Her2-ITD-특이적 T 세포의 하나 이상의 클론을 수득하고, 상기 하나 이상의 클론 중 하나 이상에 대한 핵산 서열을 암호화하는 T 세포 수용체 폴리펩티드를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제95항에 있어서, T 세포 집단을 시험관 내에서 상기 결정된 T-세포 수용체 폴리펩티드-암호화 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 형질감염 또는 형질도입시켜 조작된 KRAS G12V-특이적 T 세포 또는 조작된 Her2-ITD-특이적 T 세포 집단을 항원-특이적 T-세포 반응을 입양적으로 전달하기에 효과적인 양으로 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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