KR20210048947A - 착상능 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 착상능 증진용 조성물에 관한 것으로써, CXCL12를 포함하는 배아의 착상능 증진용 조성물 및 착상능 증진 방법을 제공한다. 상기 착상능 증진용 조성물 및 방법에 의하면 반복착상실패군을 대상으로 착상능의 현저한 증가를 관찰할 수 있었다.

Description

착상능 증진용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING IMPLANTATION}

착상능 증진용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물을 사용하는 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

최근 고령화 사회와 함께 출산을 하는 산모의 나이가 높아지면서, 난임 인구의 증가로 시험관 아기 시술이 비교적 활발하게 이루어져 있으나 성공률은 50%를 넘지 못하는 수준이다. 시험관 아기 시술 성공률의 향상을 위하여 많은 연구자들이 노력하고 있지만 질 좋은 배아를 3번 이상 이식했음에도 불구하고 임신에 성공하지 못하는 반복착상실패(Repeated Implantation failure; RIF)는 여전히 시험관 아기 시술의 풀지 못한 과제(Unmet Needs)로 남아있다. 현재 배아 착상에 어려움을 겪고 있는 환자들에게 배아 이식 시 부착제 역할을 하는 Glue를 사용하고 있으나 그 효과가 임상적으로 미미하며, 최근 보고된 바(Berneau et al. Molecular Human Reproduction (2019))에 의하면 오히려 부착제의 사용으로 인하여 착상률이 감소한다고 알려져 있다. 이러한 기술적 배경 하에서, 난임 또는 불임의 예방 또는 치료에 대한 연구가 활발이 이루어지고 있으나(KR 공개특허 10-2019-0053019), 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 배아의 착상능 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 체외에서 수정란을 배양하여 배아를 발생시키는 단계; 체외에서 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 조성물로 배아를 코팅하는 단계; 및 상기 코팅된 배아를 자궁내막에 이식하는 단계를 포함하는 배아의 착상능을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

이하의 설명에서, 본 발명의 다양한 실시양태의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정의 특이적인 세부사항이 개시된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 이러한 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들이 이하에 정의된다.

용어 "한 (a)" 및 "하나 (an)"는, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 하나 이상을 나타낸다.

"약"은 기준 분량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼 가변적인 분량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다. 용어 "약"과 함께 사용된 수치의 맥락에서 논의된 임의의 실시양태에서, 용어 약은 생략될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다.

맥락이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위의 전반에서 용어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은 "포함하지만, 이로 제한되지 않는" 것과 같은 개방형의 포괄적 의미인 것으로 해석되어야 한다.

"이루어진"이란 "이루어진"이라는 구절을 수반하는 모든 것을 포함하고, 이로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "이루어진"이라는 어구는 열거된 요소가 요구되거나 의무적이고 다른 요소는 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.

"실시양태" 또는 "일 실시양태"에 대한 본 명세서 전반에 걸친 참조는 그 실시양태와 관련하여 기술된 특정 성격, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 위치에서 "일 실시양태에서" 또는 "실시양태에서"라는 어구의 등장이 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 나아가, 특정 성격, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

"증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의미한" 양이고, 본원에 기술된 양 또는 수준보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 이상 더 큰 (예컨대, 100, 500, 1000배) (그 사이 및 1 초과하는 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등을 포함함) 증가를 포함할 수 있다. 특별 실시양태에서, 이는 기준 양에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% (그 사이의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 15%, 26% 등을 포함함)의 증가를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 암과 같은 질병 또는 상태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 바람직한 효과를 포함하고, 치료되는 질병 또는 상태의 하나 이상의 측정가능 마커에서 최소한의 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. "치료" 또는 "치료하는"이 반드시 질병 또는 상태, 또는 이의 연관된 증상의 완전한 박멸 또는 완치를 나타내는 것은 아니다. 이 치료를 받은 대상체는 이를 필요로 하는 임의의 대상체이다. 이를 필요로 하는 대상체는 또한 질병의 동물 모델, 예컨대 약물 요법을 평가하는데 사용되는 동물 모델을 포함한다. 임상적 개선의 예시적인 마커는 당업자에게 명백할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "예방" 또는 "예방하는"은 질병 또는 상태의 증상 또는 병리의 개시 또는 진행, 예컨대 질병 또는 상태의 하나 이상의 측정가능 마커에서 최소한의 변화 또는 개선을 포함할 수 있다. "예방하다" 또는 "예방하는"이 반드시 질병 또는 상태 또는 이의 연관된 증상의 개시 또는 진행의 완전한 예방을 나타내는 것은 아니다.

일 양상은 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 배아의 착상능 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어 “조성물”은 시약을 의미할 수 있으며, 상기 시약은 특정한 용도에 한정되지 아니하고, 화학적 방법에 의한 물질의 검출이나 정량을 위한 반응에 사용되는 화합물을 의미할 수 있다. 본 발명의 배아의 착상능 증진용 조성물이란, 배아의 착상능 증진 효과를 가질 수 있는 모든 화합물을 의미할 수 있으며, 배아의 착상능 증진을 위한 배지, 자궁 내 이식단계 이전의 코팅물질 등 일 수 있다.

본 발명에서 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)는 stromal cell-derived factor 1 (SDF1)를 의미하며, 케모카인 단백질 또는 유전자 자체를 의미할 수 있다. 케모카인 단백질은 백혈구 유주작용, 활성화작용을 하는 염기성헤파린 결합성 저분자 단백질이다.

본 발명에서 용어, "배아"는 난자와 정자가 합쳐진 접합체(zygote)인 수정란이 한 번 이상 세포분열을 하기 시작한 시기부터 하나의 완전한 개체가 되기 전까지의 발생 초기 단계를 의미하는 것을 의미하며, 구체적으로는 시험관 내 수정 배아일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 상기 배아는 포유동물 유래의 배아일 수 있으며, 포유동물은 설치목, 영장목, 기제목, 우제목, 식육목, 식충목 또는 장비목일 수 있다.

본 발명에서 용어, “착상(implantation)”이란, 수정되어 배아로 발달중인 배반포(blastocyst)가 모체의 자궁내막 층에 부착되는 임신초기 현상을 의미한다.

본 발명에서 용어, "착상능 증진"은 난자와 정자의 결합으로 만들어진 수정란이 자궁에 착상하여 태아로 발육하는 과정이 촉진되는 것을 의미하는 것으로서, 구체적으로는 수정란이 자궁내막에 착상되는 과정을 촉진시키거나 착상 확률을 높여 임신을 촉진하는 것을 의미할 수 있다.

상기 "자궁내막" 또는 “자궁내막 세포”는 자궁의 내벽을 덮은 점막에 위치한 세포로서, 수정란이 착상하고 발육하여 배아로 성장하고 태반을 형성하는 층을 의미한다. 본 발명에서 자궁내막 세포는 자궁내막 기질 세포 (endometrial stromal cell)를 의미하는 것으로, 두 용어는 혼용하여 사용되었다.

또 다른 양상은 상기 조성물은 배아 이식 단계 전에 배아 표면에 코팅되는 것이며, 히알루론산을 포함하는 배아 부착제를 추가적으로 포함하는 것인 조성물이다.

본 발명에서 용어, "히알루론산"은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물을 의미하며, 황산콘드로이틴 등과 함께 주요한 뮤코다당류를 말한다.

상기 배아 부착제는 Vitrolife사의 EmbryoGlue®제품으로, 히알루론산을 포함할 수 있다. 상기 배아부착제는 여성의 자궁내막에 자연적으로 존재하는 물질인 히알루론산을 보충해주는 것으로서, 히알루론산은 점액 형태로 존재하면서 착상 직전에 급증하여 배아를 이식할 때 배아의 탈락을 방지해 줄 수 있다. 그러나 배아 부착제의 시술이 권장되는 시험군은 반복착상실패에 해당되는 환자들로서, 배아 부착제 단독 사용만으로는 착상능 향상에 크게 기여하지 못한다는 문제점이 있을 수 있다.

또 다른 양상은 상기 배아 부착제와 CXCL12의 혼합 중량비는 0.5:10 내지 10:0.5이다. 또는 1:8 내지8:1, 1:7 내지 7:1, 1:6 내지 6:1, 1:5 내지 5:1, 1:3 내지 3:1, 1:1일 수 있다.

또 다른 양상은 상기 조성물은 CXCR4/7((C-X-C chemokine receptors type 4 및 7))을 활성화시켜 착상능을 증가시키는 것이다.

상기 CSCR 4 및 CSCR7은 CXCL12의 수용체로써, 자궁 내막 상피세포에 존재할 수 있다. CXCL12는 상기 수용체를 활성화시켜, 자궁 내막 상피세포의 착상능을 증가시킬 수 있다.

또 다른 양상은 상기 배아 부착제는 10 내지 20 중량%로 포함되고, CXCL12는 75 내지 95 중량%로 포함되는 것이다. 상기 배아 부착제는 12 내지 18, 13 내지 17, 14 내지 17중량%일 수 있으며, 상기 CXCL12는 77 내지 93, 79 내지 90, 81 내지 85 중량%일 수 있다.

일 양상은 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 불임 또는 난임증은 난자의 비착상, 또는 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증인 것인 약학적 조성물이다.

본 발명에서 용어, "불임 또는 난임증"은 피임을 시행하지 않은 부부가 정상적인 부부관계에도 불구하고 1년 이내에 임신에 도달하지 못하는 것을 의미하는 것으로, 이에 제한된 것은 아니나 상기 불임 또는 난임증은 난자의 비착상(Nonimplantation of ovum) 또는 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증(Female infertility of uterine origin)일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 자궁내막이 손상되거나 자궁기능 저하에 의한 불임 또는 난임증일 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은, 상기 기재한 활성성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 달리, 상기 약제는 경구 투여 또는 표적 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질 등에 비추어 결정될 수 있다. 또한, 치료되는 질환, 부위-특이적 치료의 필요성, 투여되는 약물의 양과 같은 조건들을 고려하여 전신적 또는 국소적으로 투여할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물을 제공하거나 치료하는 방법을 수행함에 있어서, 상기 약제는 단독으로 또는 조합하여, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 약제는 일반적으로 허용되는 의학적 관행에 따라 의도된 질환에 대해 전형적으로 처방되는 다른 약제와 동시 투여될 수 있다. 또한, 상기 약제는 일반적으로 포유동물, 예를 들면, 인간의 생체내(in vivo)에서 이용될 수 있다.

일 양상은 체외에서 수정란을 배양하여 배아를 발생시키는 단계;

체외에서 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 조성물로 배아를 코팅하는 단계; 및

상기 코팅된 배아를 자궁내막에 이식하는 단계를 포함하는 배아의 착상능을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 CXCL12를 포함하는 조성물로 배아를 코팅하는 단계는 상기 조성물을 이용한 드롭(drop)을 접시 위에 생성하는 단계; 미네랄 오일로 드롭의 증발을 방지하는 단계; 인큐베이터 안에서 드롭을 평형화하는 단계; 및 상기 평형화된 드롭 안에 배아를 넣고 인큐베이션 하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 배아를 체외에서 CXCL12로 코팅하는 단계는, 전핵기(pronucleus), 2-세포기, 4-세포기, 6-세포기, 8-세포기, 12-세포기, 상실배(morula), 초기 배반포(early blastocyst), 확장 배반포(expanded blastocyst), 탈각중 배반포(hatching blastocyst) 및 탈각 배반포(hatched blastocyst) 시기에 코팅 할 수 있으며, 바람직하게는 확장 배반포 시기일 수 있다.

본 발명은 CXCL12를 포함하는 조성물로 배아를 코팅하여, 상기 코팅된 배아의 착상능을 증진시키는 효과가 있다. 구체적으로, 상기 CXCL12 및 배아부착제를 0.5:10 내지 10:0.5의 중량비로 혼합한 조성물을 제공한다.

도 1에 있어서, 도 1a는 배아 부착에 대한 방해 요인 배제 조건, 도 1b는 탭핑(tapping)을 통한 배아 부착 방해 조건에서의 배아 부착 안정도를 나타낸 결과이다.
도 2에 있어서, 도 2a는 배아 부착에 대한 방해 요인 배제 조건, 도 2b는 tapping을 통한 배아 부착 방해 조건을 의미하며, CXCL12 및 배아부착제의 다양한 혼합 중량비에서의 배아 부착 안정도를 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 착상능 증진용 조성물의 제조

착상능 증진용 조성물의 제조는 다음과 같이 이루어졌다. 배아 부착제: 3ul (16.7%), CXCL12: 15ul (83.3%)을 혼합하여 총 부피 18ul의 조성물을 제조하였다. 조성물을 이용한 볼륨 18ul의 드롭을 실험용 디쉬 위에 만들고 미네랄 오일을 이용하여 드롭의 증발을 막는다. 상기 드롭을 37°C로 설정된 인큐베이터 안에서 2시간 동안 평형화(equilibriation)시켜 착상능 증진용 조성물을 완성하였다.

실시예 2. 착상능 증진 여부의 확인

배아의 착상능 평가를 위해 체외용 모델을 제조 및 실험하였다. 제조 및 실험 방법은 다음과 같다. 수정 후 5일이 지난 배반포를 실시예 1의 착상능 증진용 조성물로 코팅한 후, 96-웰 플레이트에서 배양중인 자궁내막상피 세포의 단층 위로 옮겨 공배양을 시작한다. 공배양 과정을 37.0 ℃, 5 % CO2 에서 24 시간 동안, 이어서 추가적으로 24 시간 동안 배양한 후, 실온에서 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (BDH, Poole, UK)에 고정시켰다. 배아를 역 현미경 (Leica, UK)으로 검사하고 고정 전후에 위치를 기록했다. 면역 형광 영상화를 위해, 마트리겔로 코팅 된 커버 슬립을 24- 웰 플레이트에 사용 하였다. 공 배양 24 시간 후, 배아 부착의 안정성을 측정 하였다. 측정하기 전에, 플레이트를 좌우로 세 번 흔들었다(tapping의 효과). 각 측정은 현미경으로 수동으로 수행되었으며, 플레이트를 탭핑하였을 때 각 마우스 배아의 안정성을 검사했다.

부착의 안정성에 기초하여, 스코어는 개별 배아에 할당 되었다: (i) 플로팅; (ii) 태핑 후 약하게 부착되었지만 분리됨; (iii) 태핑 후 약하게 부착되고 여전히 부착; (iv) 강하게 부착되고 (v) 강하게 부착되고 일부 영양막 세포가 성장하는 것으로 관찰됨.

도 1에 나타난 바와 같이, 배아 착상 모델을 이용하여 쥐에서 얻어낸 배아를 자궁내막상피세포층에 부착(embryo attachment)을 유도하였을 때, attachment 초기 기간 (24시간) 동안, 대조군(Control)과 기존에 사용중인 배아 부착제(Glue)를 사용한 군에 비하여 A(Glue + CXCL12 (1:1))와 B(Glue + CXCL12 (1:3))의 조건에서 배아 부착이 이루어진 안정도가 현저하게 높아진 것을 확인 할 수 있었다.

실시예3. CXCL12와 배아 부착제의 혼합 중량비별 효능 검증

실시예 2와 동일한 방법으로 조성물의 혼합 중량비별 배아 부착능에 대한 효능을 검증하기 위하여 아래와 같은 4가지 조건으로 배아 부착실험을 진행하였다.

A: Glue + CXCL12 (1:0.5) / B: Glue + CXCL12 (1:1) / C: Glue + CXCL12 (1:3) / D: Glue + CXCL12 (1:5)

4가지 실험군에서의 배아 부착 안정성을 비교해본 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 기존의 배아 부착제와 CXCL12의 비율이 1:5일때 배아 부착의 안정성이 비교 실험군 중 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 배아의 착상능 증진용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 배아 이식 단계 전에 배아 표면에 코팅되는 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 히알루론산을 포함하는 배아 부착제를 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 배아 부착제와 CXCL12의 혼합 중량비는 0.5:10 내지 10:0.5인 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 CXCR4 및 7(C-X-C chemokine receptors type 4 및 7)을 활성화시켜 착상능을 증가시키는 것인 조성물.
6. 청구항 3에 있어서, 상기 배아 부착제는 10 내지 20 중량%로 포함되고, CXCL12는 75 내지 95 중량%로 포함되는 것인 조성물.
7. CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 불임 또는 난임증은 난자의 비착상, 또는 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증인 것인 약학적 조성물.
9. 체외에서 수정란을 배양하여 배아를 발생시키는 단계;
   체외에서 CXCL12(C-X-C motif chemokine 12)를 포함하는 착상능 증진용 조성물로 배아를 코팅하는 단계; 및
   상기 코팅된 배아를 자궁내막에 이식하는 단계를 포함하는 배아의 착상능을 증가시키는 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 CXCL12를 포함하는 조성물로 배아를 코팅하는 단계는, 전핵기(pronucleus), 2-세포기, 4-세포기, 6-세포기, 8-세포기, 12-세포기, 상실배(morula), 초기 배반포(early blastocyst), 확장 배반포(expanded blastocyst), 탈각중 배반포(hatching blastocyst) 및 탈각 배반포(hatched blastocyst) 시기로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 것인 배아의 착상능을 증가시키는 방법.
    

Images