KR20190053019A

KR20190053019A - 탈락막 자궁내막 세포를 포함하는 착상능 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20190053019A
Application number: KR1020170148965A
Authority: KR
Inventors: 구승엽
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2017-11-09
Publication date: 2019-05-17

Abstract

본 발명은 탈락막 자궁내막 세포를 포함하는 착상능 증진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 착상능 증진용 조성물, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다
본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물은 자궁이 손상된 개체에 투여되어 손상된 자궁을 재생시키고 나아가 착상률을 개선시킬 수 있는바, 착상능 증진용 조성물, 및 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

탈락막 자궁내막 세포를 포함하는 착상능 증진용 조성물 {A composition for enhancing implantation ability comprising decidual endometrial stromal cells}

본 발명은 탈락막 자궁내막 세포를 포함하는 착상능 증진용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 착상능 증진용 조성물, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

자궁내막 (endometrium)은 자궁 내 공간의 선을 이루는 세포로서 배아의 착상에 중요한 역할을 한다. 자궁내막은 성장인자와 사이토카인을 분비하여 배아가 착상하고 발달하는 환경을 제공한다. 이런 자궁내막은 에스트로겐과 프로게스테론의 조절에 의하여 모양적, 기능적으로 일정한 주기에 따라 변화를 일으킨다. 자궁내막 기질세포 (endometrial stromal cells)는 인간의 생리 주기와 초기 임신상태에서 탈락막 세포 (decidual cell)로 분화를 하게 된다. 탈락막 세포로의 성공적인 분화 과정은 포유류의 배아 착상에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 탈락막화 과정 중 프로락틴 (prolactin)과 IGF (insulin-like growth factor)와 같은 탈락막화 특이적 유전자가 발현되며 세포의 모양은 길쭉한 모양에서 둥글고 세포질이 큰 상태로 바뀌게 된다. 체외에서 탈락막화 과정은 자궁내막 세포에 에스트로겐과 프로게스테론을 처리하여 유도할 수 있다 (Ha Zhu et al., Gene, 2014, 551 (1): 1-14).

최근 고령화 사회와 함께 출산을 하는 산모의 나이가 높아지면서 불임/난임이 증가하고 있으며, 산업화로 인한 환경 오염과 여성의 사회진출 등으로 인해 여성이 받는 스트레스가 증가하면서, 임신율이 크게 낮아지고 있는 실정이다. 일반적으로 알려진 여성 불임 또는 난임의 원인으로는 배란장애, 수정란의 이송 장애 및 착상장애 등이 있으며, 그 중 착상장애에 의한 불임은 아직까지 명확한 해결 방법이 없는 실정이다.

정상적인 임신과정은 수정, 착상 및 태아발달의 순서로 진행되는데, 수정란의 착상에 있어서는 수정란의 질과 자궁내막의 두께 및 수용성(receptivity) 여부가 매우 중요한 요인이라 할 수 있다. 특히, 자궁내막과 관련하여, 수정란이 자궁 안쪽으로 이동하여 착상을 시도할 때 첫 번째로 확인하는 것은 자궁내막의 두께인데, 자궁내막의 두께는 최소 7 mm 이상이 되어야 하며 건강한 여성의 경우 10-14 mm 정도라고 알려져 있다.

비가역적인 자궁내막의 손상은 자궁수술, 결핵 감염 또는 자궁내막 감염 등에 의하여 발병되며, 자궁내막에 섬유화된 흉터를 발생시켜 유산과 불임/난임의 원인이 된다. 특히, 상기의 여러 가지 원인으로 자궁내막이 손상되면 자궁의 기능이 저하되고 그럼으로 하여 정상적인 수준의 두께를 유지하기가 어려워져, 착상이 제대로 이뤄지지 않거나 착상이 되더라도 배아의 발달이 정상적으로 이루어지지 않게 된다.

이러한 자궁내막의 손상은 세포 또는 조직 재료 공학적인 치료법을 필요로 한다. 자궁내막 손상의 세포 치료 연구는 설치류 모델에서 콜라겐과 골수 줄기세포를 이용하여 치료한 보고가 있으나, 치료 기간이 3 달 이상 필요로 하는 것으로 보고되어 한계가 있다 (Ding L et al., Biomaterials, 2014, 35 (18): 4888-4900). 이에, 효과적으로 자궁내막 손상을 치료할 수 있는 방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

한편, 히알루론산 (Hyaluronic acid)은 다당류의 복합체로서 폴리사카라이드가 디사카라이드 (disaccharide), β-1,4-D-글루쿠로닉산-β-1,3-N-아세틸-D-글루코사민 (β-1,4-D-glucuronic acid-β-1,3-N-acetyl-D-glucosamine)의 반복적인 구조로 이루어져 있으며 체내에 존재하는 물질이다. 히알루론산은 세포 내 지지체를 구성하는 중요한 물질로서 세포 및 조직의 모양을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 자궁내막의 손상을 회복하여 착상능을 증진시킬 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 탈락막 자궁내막세포 및 히알루론산을 혼합하여 손상된 자궁내막에 이식하는 경우 자궁내막 손상을 효과적으로 회복하여 착상률을 개선시키는 것을 확인함으로써, 탈락막 자궁내막세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물이 착상능 증진과 난임 또는 불임 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 착상능 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 자궁의 기능이 저하되거나 자궁내막 손상으로 불임 또는 난임인 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 혼합한 혼합물을 자궁이 손상된 마우스에 이식하였을 때, 손상된 자궁이 회복되고 임신 능력 (착상능)이 향상되는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명은 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 착상능 증진용 조성물, 및 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 조성물을 이용한 불임 또는 난임증을 치료하는 방법을 제공한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 착상능 증진용 조성물이다.

또한, 상기 조성물은 자궁내막의 손상을 회복하여 수정 배아의 착상을 촉진시킴으로써 임신을 촉진하는 용도로도 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "자궁내막 세포"는 자궁의 내벽을 덮은 점막에 위치한 세포로서, 수정란이 착상하고 발육하여 배아로 성장하고 태반을 형성하는 층을 의미한다.

본 발명에서 자궁내막 세포는 자궁내막 기질 세포 (endometrial stromal cell)를 의미하는 것으로, 두 용어는 혼용하여 사용되었다.

상기 자궁내막 기질 세포의 "탈락막화 (decidualization)"란, 임신한 개체의 자궁에서 나타나는 특성으로 프로게스테론에 의해 야기되는 변화를 의미한다. 따라서, 본 발명에서 "탈락막 자궁내막 세포"는 생체 내에서 프로게스테론에 의해 변화된 자궁내막 세포와 동일/유사한 특성을 나타내는 세포일 수 있다. 구체적으로 상기 탈락막 자궁내막 세포는 자궁내막 세포에 5 내지 15 일간 에스트로겐 및 프로게스테론을 처리하여 수득하는 것일 수 있고, 프로락틴 (prolactin)을 분비하고/하거나 IGF-1 (insulin like growth factor-1) 유전자를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 탈락막 자궁내막 세포는 체외에서 줄기세포 (예컨대, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등의 만능성 줄기세포 (pluripotent stem cell) 또는 중간엽 줄기세포 등의 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell))로부터 자궁내막 세포로 분화를 유도한 뒤 이를 탈락막화시켜 제조하거나, 혹은 분리된 자궁내막 세포를 탈락막화시켜 제조한 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "히알루론산"은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물을 의미하며, 황산콘드로이틴 등과 함께 주요한 뮤코다당류를 말한다.

본 발명의 착상능 증진용 조성물은 상기 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 혼합하여, 이를 자궁내막의 손상된 부위에 이식하여 자궁내막 손상을 회복하여 착상능을 증진시킬 수 있다. 상기 자궁내막 손상의 회복 또는 치료 효과는 이식된 탈락막 자궁내막 세포가 손상 조직에 병합되어 직접 분열함으로써 야기되는 것일 수 있고, 또는 이식된 세포로부터 분비되는 호르몬 및/또는 사이토카인에 의해 본래 개체에 존재하는 세포의 분화/분열이 촉진되어 야기되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 효과는 탈락막 자궁내막 세포를 단독으로 이식한 경우에 비해 히알루론산을 혼합하여 이식함으로써 현저히 증가할 수 있다. 특히, 손상된 자궁내막이 회복됨으로써, 배아의 착상률이 증가될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 착상능을 증진시키거나 또는 착상능을 증진시켜 임신을 촉진하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "자궁내막의 손상"은 자궁수술, 결핵 감염, 물리적 손상 또는 자궁내막 감염 등의 원인에 의해 자궁내막의 전부 또는 일부 조직 구조의 정상적인 완전성의 파괴를 의미하는 것으로, "상처", "병변", "괴사" 및 "궤양" 등을 포함하는 것으로 의도된다. 자궁내막이 손상되면 자궁기능이 저하되어 배아가 착상될 수 없거나 비정상적 배아 발달을 야기할 수 있어, 불임 또는 난임의 원인이 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "착상능 증진"은 난자와 정자의 결합으로 만들어진 수정란이 자궁에 착상하여 태아로 발육하는 과정이 촉진되는 것을 의미하는 것으로서, 구체적으로는 수정란이 자궁내막에 착상되는 과정을 촉진시키거나 착상 확률을 높여 임신을 촉진하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "수정 배아"는 난자와 정자가 합쳐진 접합체(zygote)가 한 번 이상 세포분열을 하기 시작한 시기부터 하나의 완전한 개체가 되기 전까지의 발생 초기 단계를 의미하는 것을 의미하며, 구체적으로는 시험관내 수정 배아일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 용어, "착상"은 수정된 배아가 자궁내벽에 붙어 태아가 모체로부터 산소 및 영양분을 받을 수 있는 상태를 의미한다.

구체적으로 상기 조성물은 탈락막 자궁내막 세포 1 X 10⁵내지 1 X 10⁶ 개당 히알루론산 50 내지 200 ㎕가 혼합된 것일 수 있고, 상기 히알루론산은 5 mg/ml 내지 15 mg/ml의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 상기 조성물은 LIF (leukemia inhibitory factor)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 LIF는 10² 내지 10⁴ unit/ml의 농도로 상기 조성물에 혼합될 수 있는데, LIF가 추가로 포함됨으로써 조성물을 이식했을 때, 착상률이 더욱 개선될 수 있다. 나아가, 착상률을 더욱 개선시킬 수 있는 성장인자 혹은 사이토카인, 예컨대 EGF (epidermal growth factor) 등이 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 자궁내막 세포에 에스트라디올 및 프로게스테론을 처리하여 탈락막화를 유도함으로써 탈락막 자궁내막 세포를 제조하였다 (도 1 및 도 2). 그 다음 상기 제조된 탈락막 자궁내막 세포를 히알루론산과 혼합한 뒤 이를 자궁 손상 모델 생쥐의 자궁에 이식한 결과, 자궁내막 세포만을 주입한 군에 비해 자궁 조직이 현저하게 재생된 것을 확인하였고 (도 4), 그럼으로 하여 착상률이 개선되는 것을 확인하였다 (도 5). 나아가, 이러한 효과는 LIF를 추가로 혼합하였을 때 더욱 개선되는 것을 확인하였다 (도 5). 따라서, 본 발명의 착상능 증진용 조성물은 자궁내막 손상을 매우 우수하게 회복시킴으로써, 자궁내막 손상이나 자궁기능의 저하로 인해 저하된 착상능을 정상 수준까지 회복시키거나 임신을 촉진하는 용도로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 상기 조성물은 착상능이 현저히 감소된 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 손상된 자궁내막 부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 손상 부위로 이동될 수 있다. 본 발명의 조성물은 이식 시 면역 거부 반응이 일어나지 않도록 면역반응 억제제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 조성물은 특별히 제한된 것은 아니나, 착상능 증진용 조성물 외 자궁내막 손상을 치료하기 위한 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 수정 배아의 착상을 촉진시키는 착상능 증진용 식품 조성물, 착상능 증진용 사료 조성물, 또는 착상능 증진용 의약외품 조성물로 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능식품을 포함하는 것일 수 있다.

상기 탈락막 자궁내막 세포와 히알루론산은 안정성이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 착상능을 증진하거나 또는 임신을 촉진할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.

건강기능식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 착상능을 증진하거나 또는 임신을 촉진하는 데에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 착상을 증진 또는 임신을 촉진하는 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

상기 사료 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 의약외품 조성물에서, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적을 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미할 수 있다. 또한 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 상기 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용 할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.

상기 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "불임 또는 난임증"은 피임을 시행하지 않은 부부가 정상적인 부부관계에도 불구하고 1년 이내에 임신에 도달하지 못하는 것을 의미하는 것으로, 이에 제한된 것은 아니나 상기 불임 또는 난임증은 난자의 비착상(Nonimplantation of ovum) 또는 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증(Female infertility of uterine origin)일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 자궁내막이 손상되거나 자궁기능 저하에 의한 불임 또는 난임증일 수 있다.

본 발명의 불임 또는 난임증의 치료용 약학적 조성물은 상기 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 혼합하여, 이를 자궁내막의 손상된 부위에 이식하여 자궁내막 손상을 회복시킴으로써, 배아의 착상률을 증진시키고, 착상된 배아의 발달을 개선하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 불임 또는 난임증의 치료 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 자궁내막 손상에 의한 불임 또는 난임증의 치료 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 탈락막 자궁내막 세포를 히알루론산과 혼합한 뒤 이를 자궁 손상 모델 생쥐의 자궁에 이식한 결과, 자궁내막 세포만을 주입한 군에 비해 자궁 조직이 현저하게 재생되고 (도 4), 착상률이 개선되는 것을 확인하였다 (도 5). 따라서, 본 발명의 조성물은 자궁내막의 손상을 치료하여 자궁의 기능을 정상적으로 회복시킴으로써 자궁내막이 손상되거나 자궁의 기능 저하에 의한 불임 또는 난임증을 치료할 수 있는 용도로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 상기 치료용 조성물은 불임 또는 난임증 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 손상된 자궁내막을 가진 환자의 자궁내막 부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 손상 부위로 이동될 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 이식시 면역 거부 반응이 일어나지 않도록 면역반응 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 특별히 제한된 것은 아니나, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 외 불임 또는 난임증을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물, 사료 조성물, 또는 의약외품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 자궁내막이 손상되거나 자궁 기능이 저하되어 불임 또는 난임인 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법이다.

상기 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 자궁내막 손상 및 불임 또는 난임증에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물의 투여는 임의의 동물에 적용 가능하며, 동물은 인간 및 영장류 뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 래트 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 구체적으로는, 인간을 제외한 임의의 동물에 적용 가능하다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 불임 또는 난임이 된 개체, 구체적으로는 자궁내막이 손상되거나 자궁의 기능이 저하되어 불임 또는 난임이 된 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로 손상된 자궁 조직이나 자궁기능이 저하된 조직에 투여될 수 있다.

본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물은 자궁이 손상된 개체에 투여되어 손상된 자궁을 재생시켜 착상률을 개선시킬 수 있는바, 착상능 증진용 조성물, 및 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 분리된 자궁내막 세포를 탈락막화시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 분화된 세포의 IGF-1 (Insulin like growth factor-1) 유전자 발현 및 프로락틴 (prolactin)의 분비 수준을 확인한 것이다.
도 3은 탈락막 자궁내막 세포를 히알루론산과 혼합하여 배양한 사진이다.
도 4는 자궁 손상 모델 생쥐에 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 이식한 조직 염색 사진이다.
도 5는 자궁 손상 모델 생쥐에 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산 (또는 추가적으로 LIF를 첨가)을 이식한 뒤 상기 생쥐를 임신시키고, 착상률 및 배아 발달을 확인한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 탈락막 자궁내막 세포의 제조

자궁내막 세포 (Endometrial stromal cells)는 다음의 과정을 통하여 수득하였다. 8 주령 생쥐의 자궁을 채취한 후, 포셉과 가위를 이용하여 적출한 자궁을 약 5mm 크기로 조각내었다. 작은 조각으로 자른 자궁을 1 mg/ml 농도의 콜라게나제 타입 I (collagenase type I) 용액에 두고, 37 ℃ 항온수조에서 2 시간 동안 반응시켰다. 2 시간 후, 상기 콜라게나제와 동량의 배양용액 (DMEM/F12 + 10 % FBS)을 첨가하여 중성화시킨 후 70 ㎛ 사이즈의 나일론 매시 (mesh)로 걸러내어 단일 세포 (single cell) 형태의 자궁내막 세포만을 분리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 자궁내막 세포는 DMEM/F12에 10 %의 FBS를 첨가한 배양 용액으로 2 주간 배양하였다.

배양된 자궁내막 세포를 탈락막화 (Decidualization)시키기 위해, 10 nM 에스트라디올 (estradiol)과 10 μM 프로게스테론 (progesterone)을 배지에 첨가하여 약 14 일간 탈락막화를 유도하였다 (도 1). 도 1에서 확인할 수 있는 것처럼, 탈락막화로 인해 길쭉한 모양에서 둥글고 세포질이 큰 상태로 세포의 모양이 변형되었다.

또한, 탈락막 자궁내막세포로의 유도를 확인하기 위해, 탈락막 세포로 분화되었을 때 분비하는 프로락틴 (prolactin)의 분비 여부와 IGF-1 (Insulin like growth factor-1) 유전자의 발현여부를 확인하여 평가하여, 상기 세포가 탈락막화된 세포의 특성을 가지는지를 추가적으로 확인하였다.

구체적으로, 탈락막화된 자궁내막에서 발현되는 유전자인 IGF의 발현 여부 및 정도를 실시간 정량적중합반응 (quantitative real-time polymerase chain reaction)을 이용하여 분석하였다. 또한 프로락틴의 분비 여부를 확인하기 위하여, 탈락막화 자궁내막의 배양액을 수거하여 배양액 내의 프로락틴 농도를 측정하였다.

그 결과, 에스트라디올 및 프로게스테론을 첨가하여 탈락막화를 유도한 경우 IGF-1의 발현 및 프로락틴의 분비가 증가하는 것을 확인였으며, 이를 통해 상기 세포는 탈락막화가 유도되었음을 알 수 있었다 (도 2). 탈락막화 후 경과 시간에 따른 IGF-1의 발현 정도는 탈락막화를 유도한 뒤 1~24 시간 경과 시점에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 프로락틴의 분비 정도는 트롬빈 (thrombin)의 첨가 정도에 따라 영향을 받았으며, 50 ㎍/ml 농도 이상으로 첨가한 군에서 프로락틴의 분비가 통계적으로 유의하게 증가하였다 (F: fibrin, T: thrombin).

실시예 2. 탈락막 자궁내막세포와 히알루론산 혼합물의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 탈락막 자궁내막 세포를 체내 무해하고 생분해성을 가지는 히알루론산과 혼합하여, 이의 자궁내막 손상에 대한 회복 및 치료 효과를 확인하였다.

구체적으로, 14 일간 탈락막화가 유도된 자궁내막세포 1 X 10⁶ 개를 10 mg/ml 농도의 히알루론산 100 ㎕와 혼합하여 주사액을 준비 하였다. 상기 히알루론산과 혼합된 세포를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배양액에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배양된 자궁내막 세포를 SEM (scanning electron microscope) 방식을 이용한 전자 현미경으로 평가 하였다.

그 결과, 히알루론산과 자궁내막 세포가 혼합된 후, 배양 시간이 경과함에 따라, 교차 결합 (cross-linking)이 잘 발달된 미세구조 상의 세포 분포를 확인할 수 있었다 (도 3).

실시예 3. 탈락막 자궁내막 세포와 히알루론산 혼합물의 체외 자궁손상 복원 평가

8 주령 암컷 생쥐 (C57/BL6)의 자궁에 50 %의 에탄올 (EtOH)을 주입하여 자궁 손상 모델을 제작하였다. 에탄올 주입 2 주 후, 자궁 손상 모델 생쥐의 자궁에 탈락막 자궁내막 세포와 히알루론산의 혼합물을 주입하고, 2 주 후 자궁 손상의 복원 정도를 평가하였다. 정상 생쥐, 미처리 자궁 손상 모델 생쥐, 및 탈락막 세포만 주입한 자궁 손상 모델 생쥐를 대조군으로 하였으며, 자궁 조직을 조직 염색으로 확인하였다.

그 결과, 자궁 손상 모델은 자궁 내막이 완전히 손상된 것을 확인 할 수 있었으나, 탈락막 자궁내막 세포와 히알루론산 혼합물을 주입한 군은 미처리 대조군 및 세포만 주입한 군에 비하여 자궁 조직이 현저하게 재생된 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

실시예 4. 탈락막 자궁내막세포와 히알루론산 혼합물 치료제의 임신능 평가

다음으로, 본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산 혼합물의 임신능을 평가하고자 하였다. 상기 실시예 3의 실험군에 더하여 탈락막 자궁내막 세포, 히알루론산 및 LIF (Leukemia inhibitory factor)를 포함하는 혼합물을 제조하여 그 효과를 함께 평가하였다. LIF 첨가 조성물은 혼합물 제조 시 10³ unit / ml 농도로 LIF를 함께 첨가하여 제조하였다. 그 다음, 상기 실시예 3에서와 동일한 방식으로 자궁내막 손상을 유도하고, 각각의 처리를 한 뒤, 생쥐의 임신을 유도하였다. 임신 유도는 상기 생쥐의 자궁에 동일 종의 암컷 생쥐에서 채취한 배반포 (blastocyst)를 10 개씩 주입한 후, 생식능이 제거된 수컷 생쥐를 넣어서 가임신을 유도하는 방식으로 수행하였다. 임신 유무는 오전 8 시에 플러그체크를 통하여 확인하였다. 임신 9 일후, 에반스 블루 (Evans blue) 염색 용액을 5 mg/ml 농도로 제조하여 임신한 암컷 생쥐의 꼬리 정맥에 100 ㎕씩 주입하였다. 주입 15 분 후 자궁을 적출하여 착상된 배아의 개수를 확인하였다. 착상된 배아의 정상적인 착상과 발달을 판별하기 위하여 조직 염색으로 이상 유무를 판별하였다.

그 결과, 탈락막 자궁내막세포 및 히알루론산 혼합물의 처리군과 탈락막 자궁내막 세포, 히알루론산 및 LIF가 첨가된 혼합물의 처리군은 정상 생쥐와 유사한 수준으로 임신된 배아의 착상과 발달이 잘 일어나는 것을 확인하였다 (도 5). 탈락막 자궁내막세포 및 히알루론산 혼합물을 넣어준 배아의 착상률은 42 %, LIF를 추가로 첨가한 처리군의 착상률은 46 %로, 정상 생쥐의 착상률에 비하여 약간 떨어지지만 손상 대조군 (0 %)에 비하여 월등히 많은 배아의 착상을 확인할 수 있었으며, 탈락막 자궁내막 세포만을 처리한 군 (36 %)에 비해서도 매우 높은 착상률을 확인할 수 있었다 (도 5).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산 혼합물 (또는 LIF를 추가로 포함하는 혼합물) 치료제는 손상된 자궁내막을 기능적으로 복원하여 정상치에 가까운 수준으로 착상률을 증진시켜 임신을 가능하게 하는 것을 알 수 있었다.

이에, 본 발명의 탈락막 자궁내막 세포 및 히알루론산을 포함하는 조성물은 자궁내막 손상을 치료하기 위한 용도로 유용하게 사용될 수 있으며, 자궁내막 손상을 치료하여 자궁의 기능을 회복시킴으로써 착상을 촉진하여 착상능을 증진 및 임신을 촉진하고, 시험관내 수정배아의 착상을 촉진하는 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물이 자궁내막의 손상을 회복함으로써 자궁내막이 손상되거나 자궁기능 저하에 의한 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료 용도로도 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 착상능 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 탈락막 자궁내막 세포는 프로락틴 (prolactin) 또는 IGF-1 (Insulin like growth factor-1)을 분비하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 탈락막 자궁내막 세포 1 X 10⁵ 내지 1 X 10⁶ 개 당 히알루론산 50 ㎕ 내지 200 ㎕가 혼합된 것인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 히알루론산은 5 mg/ml 내지 15 mg/ml의 농도인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 LIF (leukemia inhibitory factor)를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 LIF는 10² unit/ml 내지 10⁴ unit/ml인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 자궁내막 손상 회복 및 배아의 착상률을 증가시켜 임신을 촉진하는 것인, 조성물.
탈락막 자궁내막 세포 (decidual endometrial stromal cell) 및 히알루론산 (hyaluronic acid)을 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 불임 또는 난임증은 난자의 비착상(Nonimplantation of ovum), 또는 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증(Female infertility of uterine origin)인 것인, 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 자궁에서 기원한 여성 불임 또는 난임증은 자궁내막이 손상되거나 자궁 기능 저하에 의한 것인, 약학적 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 자궁내막이 손상되거나 자궁기능의 저하로 불임 또는 난임인 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불임 또는 난임증의 예방 또는 치료방법.