KR20210045059A - 이식 후 당뇨병의 발병 위험도 예측 방법 - Google Patents

이식 후 당뇨병의 발병 위험도 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)의 발병 위험도의 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

Description

이식 후 당뇨병의 발병 위험도 예측 방법 {Method for predicting risk of new onset diabetes after transplantation}
본 발명은 이식 후 당뇨병의 발병 위험도를 예측하기 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
현대 장기이식의 기술의 발달로 말기 신질환 환자 또는 말기 간질환 환자 등에서 장기이식을 통해 기존의 질환을 극복하고 장기간 생존하는 경우가 증가하고 있다. 이러한 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역 거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되는 MHC(major histocompatibility complex)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식 거부반응이 발생하게 된다. 최근 외과적 시술, HLA 유형(type) 판독기법의 발달 및 면역억제제의 개발에 의해 이식 성공률은 높아졌지만, 임상적으로 이식 후 T 세포-매개 급성거부반응을 막기 위해 매일 비특이적 면역억제제가 투여된다 (Pirsch, J. D., curr. opin. organ. transplant., 2, 76-81, 1997).
일반적으로 사용되는 면역억제제는 글루코코티코스테로이드(glucocoticosteroids)을 포함하여 DNA 합성을 차단하여 T 세포의 증식을 억제하는 아자티오프린(azathioprine)과 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이 있으며, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 사이크로스포린 A(cyclosporine A)와 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.
최근 장기이식환자들에서 당뇨병, 이상지질혈증, 대사증후군 등의 대사성질환의 발병이 증가하고 있고, 이의 원인 중 하나가 면역억제제에 의한 혈당상승 또는 이상지질혈증을 초래하는 것으로 알려져 있다. 특히, 칼시뉴린 억제제인 타크로리무스의 투약은 췌장 내 베타세포의 사멸을 유발하여 이식 환자의 약 30%의 높은 비율로 당뇨를 발병시키고 있다.
장기이식환자에서 보이는 당뇨병은 이식 전부터 당뇨병이 있었던 경우와 이식 전에는 당뇨병이 없다가 장기 이식 후 새롭게 당뇨병이 발병하는 경우가 있다. PTDM (posttransplantation diabetes mellitus)은 이식 전부터 당뇨병이 있던 환자도 포함될 수 있는 정의이고, NODAT (new onset diabetes after transplantation, 이식 후 당뇨병)은 이식 후에 새롭게 진단되는 당뇨병으로 한정할 수 있다. 이식 후 당뇨병은 장기이식 후 흔하게 발생되는 합병증 중의 하나이며, 이는 심혈관질환 이환율, 환자의 사망률 및 이식장기 손실과 관련되어 있다 (Wauters RP et al., Transplantation 2012;94:377-82). 따라서, 면역억제제의 복용에 따른 취약성을 이식 전에 파악하여 이식 장기의 생존율 증가를 위한 방법의 개발이 필요한 실정이다.
윤유정 및 강은석, 이식환자의 당뇨병 관리, The Journal of Korean Diabetes.
본 발명의 목적은 (a) 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)의 발병 위험도의 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)의 발병 위험도의 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 환자로부터 분리된 단핵세포로부터 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에 면역억제제를 처리하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 면역억제제는 타크로리무스(tacrolimus), 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 프로드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylpredisolone), 데플라자코트(deflazacort), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 아자티오프린(azathioprine), 미조리빈(mizoribine), 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인슐린의 발현량이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수를 측정하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수가 적은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포의 세포생존율을 측정하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 췌장전구세포의 세포생존율이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 측정은 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 환자로부터 분리된 단핵세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하고, 상기 제조된 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량, 형성된 콜로니 수 또는 세포생존율을 측정하여 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험도를 예측할 수 있다. 특히, 상기 췌장전구세포에 면역억제제인 타크로리무스를 처리한 후 인슐린의 발현량 또는 세포생존율을 측정하여 기준치에 비해 인슐린의 발현량이 낮고, 세포생존율이 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험도를 예측할 수 있어, 이식 전의 환자에서 발병 위험도를 예측하여 이식 장기의 생존율 증가를 위한 방법으로 활용될 수 있다.
도 1은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자에서 분리된 단핵세포로부터 제조된 유도만능줄기세포에서 OCT4 (A), SOX2 (B), Nanog (C), LIN28 (D), DPPA5 (E) 및 TDGF1 (F)의 발현량을 real-time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 NODAT 또는 Non-NODAT 환자에서 분리된 단핵세포로부터 제조된 유도만능줄기세포에서 OCT4의 발현량을 유세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3A는 유도만능줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화 과정을 나타낸 것이고, 3B는 14 일의 분화 유도 후 현미경 하에서 세포의 형태를 분석한 결과이다.
도 4는 NODAT 또는 Non-NODAT 환자 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서 PDX-1 (A), NKX6.1 (B), FOXA2 (C), SOX17 (D), SOX9 (E), NGN3 (F) 및 HNF1B (G)의 발현량을 real-time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 NODAT 또는 Non-NODAT 환자 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린 및 인슐린 mRNA의 발현량을 유세포 분석 (A 내지 C) 및 real-time PCR (D 및 E)을 통해 측정한 결과이다.
도 6은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자 유래 유도만능줄기세포에서 인슐린 및 인슐린 mRNA의 발현량을 유세포 분석 (A 및 B) 및 real-time PCR (C)을 통해 측정한 결과이다.
도 7A는 NODAT 또는 Non-NODAT 환자 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에 타크로리무스를 처리하여 세포생존율을 측정한 실험과정을 나타낸 것이고, 7B는 타크로리무스의 농도(30, 40, 50 및 60 ㎍/mL)에 따른 세포생존율 결과를 나타낸 것이며, 7C는 세포생존율 결과로부터 곡선아래 영역(area under the curve, AUC)을 산출하여 비교한 결과이고, 7D는 50 ㎍/mL의 타크로리무스를 24 시간 동안 처리한 후 인슐린 mRNA의 발현량을 측정한 결과이다.
도 8은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포에 타크로리무스를 20, 30, 40 및 50 ㎍/mL의 농도로 처리한 후 세포생존율을 측정한 결과이다.
본 발명은 (a) 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)의 발병 위험도의 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)"은 이식 후에 새롭게 진단되는 당뇨병을 말한다.
본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
상기 "유도만능줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)"는 분화가 끝난 체세포 또는 제한된 분화능을 가지는 세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 리프로그래밍 과정을 통해 분화 이전의 세포 단계로 되돌린 만능성을 유도한 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있는데, 구체적으로 비슷한 세포모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가지는 특성을 가지고 있다. 인간 배아줄기세포와 같이 여성의 난자 등으로부터 획득하는 것이 아니라, 이미 분화가 끝난 체세포 등에서 유도된 것이기 때문에 인간 배아줄기세포와 같은 윤리적 문제점을 수반하지 않으며, 환자의 체세포에서 줄기세포로 전환할 수 있기 때문에 면역 거부 반응의 문제도 적다.
상기 "리프로그래밍(reprogramming)"은 분화된 세포를 만능성(pluripotent)을 가지는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 리프로그래밍은 리프로그래밍 유도인자(reprogramming factor)에 의하여 수행될 수 있다.
상기 "리프로그래밍 유도인자"는 분화된 세포에 처리 또는 발현되는 경우 유도만능줄기세포 특이적 유전자의 발현을 가져와 만능성을 가지는 유도만능줄기세포로 유도하는 물질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 본 발명에 제한없이 포함될 수 있으며, 그 예로 Oct3/4, sox-2, c-Myc 및 Klf-4 등을 들 수 있으나, 적용할 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, "췌장전구세포(pancreatic progenitor cells)"는 췌장을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포를 말한다.
본 발명에서의 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.
본 발명에서의 용어, "분화"란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.
본 발명의 유도만능줄기세포는 환자로부터 분리된 단핵세포로부터 제조된 것일 수 있다. 유도만능줄기세포의 제조는 특별히 제한되지 않으며, 이 기술분야에서 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에 면역억제제를 처리하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 면역억제제는 타크로리무스(tacrolimus), 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 프로드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylpredisolone), 데플라자코트(deflazacort), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 아자티오프린(azathioprine), 미조리빈(mizoribine), 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 타크로리무스(tacrolimus)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 타크로리무스(tacrolimus)는 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에 20 ~ 60 ㎍/mL의 농도로 5 ~ 48 시간 동안 처리되는 것일 수 있고, 바람직하게는 40 ~ 50 ㎍/mL의 농도로 24 시간 동안 처리되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에 타크로리무스(tacrolimus)를 처리한 후 인슐린 또는 인슐린 mRNA의 발현량이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수를 측정하는 단계를 추가적으로 수행하고, 상기 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수가 적은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포의 세포생존율을 측정 또는 타크로리무스(tacrolimus)를 처리한 후 세포생존율을 측정하는 단계를 추가적으로 수행하고, 상기 췌장전구세포의 세포생존율이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1.1. 단핵세포에서 유도만능줄기세포(iPSCs)의 제조
본 발명은 서울성모병원 가톨릭대학교의 기관검토위원회(The institutional Review Board(IRB) of the Catholic University of Korea)에서 승인받아 수행되었다. 환자의 단핵세포는 서울성모병원에서 제공받아, 신장 이식 후 1 년 뒤에 이식 후 당뇨병(new-onset diabetes after transplantation, NODAT)의 진단을 받은 환자와 그렇지 않은 환자(Non-NODAT)로 샘플을 구분하였다.
환자에서 분리된 단핵세포는 인산완충 식염수(PBS)로 희석하였고, 피콜 농도구배(Ficoll gradient)를 통해 850 x g에서 30 분간 원심분리하였다. 단핵세포를 수집, 세척 및 동결시켜 실험 전까지 보관하였다.
단핵세포에서 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍을 위하여, 냉동된 단핵세포는 해동하여 CC110 사이토카인 칵테일이 보충된 StemSpan 배지(STEMCELL Technological, Vancouver, British Columbia, Canada)로 재현탁하였다. 세포는 5일 동안 5% CO2, 37℃ 세포배양기에서 유지되었다. 이후, 단핵세포를 3x105 cells/well의 농도로 24-웰 플레이트에 분주(seeding)하였고, CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit (Thermo Fisher Scientific, LLC)를 사용하여 리프로그래밍을 유도하였다. 형질도입은 3 x 105 cells/well 단위당 7.5의 MOI (multiplicity of infection)로 수행되었다. 세포는 바이러스를 첨가한 후 1,160 x g, 35 ℃에서 30 분간 원심분리한 후, 5% CO2, 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 다음 날, 세포를 비트로넥틴(vitronectin; Life Technologies)으로 코팅된 12-웰 플레이트로 옮기고, 1,160 x g, 35 ℃에서 10 분 동안 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리 후 TeSR-E8 배지(STEMCELL Technologies Inc.)를 기존 배지와 1:1의 비율로 첨가하였다. 리프로그램된 세포는 일일 배지 교환으로 TeSR-E8 배지에서 유지 및 확장되었다
1.2. 유도만능줄기세포(iPSCs)에서 췌장전구세포(pancreatic progenitor cells)로의 분화
유도만능줄기세포(iPSCs)에서 췌장전구세포로의 분화는 제조자의 매뉴얼에 따라 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor Kit (StemCell)를 사용하여 수행되었다. 단핵세포로부터 제조된 유도만능줄기세포는 14 일 동안 췌장전구세포로 분화 유도되었다.
1.3. Real-time PCR
유도만능줄기세포(iPSCs) 또는 췌장전구세포에 RNA zol bee reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 균질화하였고, chloroform을 첨가하여 RNA를 추출한 후, isopropanol을 첨가하여 침전시켰다. RNA 침전물은 75% ethanol로 세척한 후 증류수로 희석하하였다. 분리된 RNA의 농도는 260 ㎚에서 측정된 O.D.(optical density) 값을 이용하여 정량화하였다. cDNA는 총 RNA 5 ㎍을 oligo (dT) priming과 superscript reverse transcriptase II (BN615, Dyne Bio, INC. Seongnamsi, Korea)를 이용하여 역전사시켜 만들었으며, Smart Cycler II system (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA)을 이용하여 증폭시키고, SYBR Green으로 확인하였다. 각각의 PCR 반응은 10 μM forward primer, 10 μM reverse primer, 2×SYBR Green Premix Ex Taq (Genet Bio, Daejeonsi, Korea), 0.5 ㎕ cDNA 및 D.W. (멸균증류수)를 포함 하는 최종 20 ㎕의 혼합물로 시행하였으며, LightCycler system (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN, USA)을 사용하였다.
1.4. 세포생존율 측정
유도만능줄기세포(iPSCs) 또는 췌장전구세포의 세포생존율을 측정하기 위하여, 세포는 80% confluency로 분주하였고, 24 시간 후에 타크로리무스(tacrolimus)를 20~60 ㎍/mL의 농도로 처리하였으며, 5, 10, 24 시간 후 cell counting kit-8 (CCK-8, Dojindo molecular, Rockville, MA, USA) 시약을 2 시간 동안 처리하였다. 이후, 450 nm에서 흡광도를 측정하고 세포생존율을 분석하였다.
1.5. 유세포 분석(flow cytometry)
형광이 표지된 항체(OCT4, Insulin)를 세포검체에 적정비율로 혼합하여 15 분간 실온, 암소에서 반응시킨 후, PBS로 세척하고, 최종 PBS 500 ㎕로 부유하여 분석하였다. 분석은 FSC(forward side scatter), SSC(side scatter) 산점도(dot plot)를 이용하여 응집되거나 깨진 세포는 제거한 뒤, 해당 항체의 isotype를 기준으로 형광분율을 측정하였다.
1.6. 통계학적 분석 방법
분석결과는 PRISM software (version 7.03 for Windows; GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) 통계 프로그램을 이용하였고, multiple comparison은 1-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test를 사용하여 각 군 간의 평균치를 검정하였으며, P 값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.
실시예 2. 단핵세포 유래 유도만능줄기세포(iPSCs)의 분화능 확인
본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자에서 분리된 단핵세포에서 제조된 유도만능줄기세포의 분화능을 확인하기 위하여, 유도만능줄기세포 마커로 알려진 OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, DPPA5 및 TDGF1의 발현을 real-time PCR을 통해 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 각 환자에서 분리된 단핵세포로부터 제조된 유도만능줄기세포는 줄기세포 마커인 OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, DPPA5 및 TDGF1의 발현이 모두 확인되었다 (도 1).
또한, 본 발명자들은 live 상태의 유도만능줄기세포에서 상기 줄기세포 마커 중 OCT4의 발현을 유세포 분석을 통해 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포로부터 제조된 모든 유도만능줄기세포에서 OCT4의 발현이 모두 증가하였음을 확인하였다 (도 2).
상기 결과로부터, NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포로부터 제조된 모든 유도만능줄기세포는 모두 줄기세포의 특성인 분화능을 획득한 것으로 확인되었다.
실시예 3. 단핵세포 유래 유도만능줄기세포(iPSCs)로부터 췌장전구세포로의 분화 결과
본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자에서 분리된 단핵세포에서 제조된 유도만능줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화를 유도하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 분화는 stage 1~4 까지 총 14 일 동안 진행되었고 (도 3A), 14 일이 경과된 후 일부 세포에서 콜로니(colony)가 형성되는 것을 확인하였다 (도 3B). 특히, Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 세포에서는 NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 세포에 비하여 형성된 콜로니 수가 현저히 높게 나타났음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 유도만능줄기세포로부터 췌장전구세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 췌장전구세포의 마커로 알려진 PDX-1, NKX6.1, FOXA2, SOX17, SOX9, NGN3 및 HNF1B의 발현 여부를 real-time PCR을 통해 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 분화가 완료된 췌장전구세포에서 PDX-1, NKX6.1, FOXA2, SOX17, SOX9, NGN3 및 HNF1B가 모두 발현되어 췌장전구세포의 분화가 잘 이루어졌음을 확인하였다 (도 4).
상기 결과로부터, NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포는 췌장전구세포로 분화 유도되는 것을 확인하였다. 다만, NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서는 Non-NODAT 환자 유래 분화 유도된 췌장전구세포에 비하여 콜로니의 수가 적게 형성되는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 유도만능줄기세포(iPSCs) 유래 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량 측정 결과
본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린(insulin) 및 인슐린 mRNA의 발현량을 각각 유세포 분석 및 real-time PCR을 통해 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서는 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에 비해 인슐린 항체로 염색된 양성세포의 수가 감소된 것으로 확인되었다 (도 5A 내지 5C). 또한, 인슐린 mRNA의 발현에 있어서도, NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서는 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에 비해 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 5D 및 5E).
다만, 본 발명자들은 인슐린(insulin) 및 인슐린 mRNA의 발현량에 있어 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포에서는 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 확인하였다 (도 6).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포에서 인슐린 발현에 어떠한 차이가 나타나지 않았으나, 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에서는 NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에 비해 인슐린의 발현이 낮게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 5. 타크로리무스(tacrolimus) 처리에 따른 유도만능줄기세포(iPSCs) 유래 췌장전구세포의 세포생존율 및 인슐린 발현량 결과
본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에 타크로리무스를 처리한 후 세포생존율 및 인슐린의 발현량을 측정하는 실험을 수행하였다. 간단히, NODAT 또는 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에 타크로리무스를 30, 40, 50 및 60 ㎍/mL의 농도로 처리한 후, 5, 10 및 24 시간 후에 세포생존율을 측정하였다 (도 7A).
그 결과, 타크로리무스의 농도에 따른 세포생존율의 변화 추이 중에서 곡선아래 영역(area under the curve, AUC)을 산출하여 비교한 경우 40 및 50 ㎍/mL의 타크로리무스 처리 농도에서 NODAT 및 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포의 세포생존율에 유의미한 차이가 있음을 확인하였다 (도 7B 및 7C). 즉, 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에 40 또는 50 ㎍/mL의 타크로리무스를 처리한 경우 NODAT 환자 유래 췌장전구세포는 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에 비해 세포생존율이 감소된 것으로 확인되었다.
또한, 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에 50 ㎍/mL의 타크로리무스를 24 시간 동안 처리한 경우 NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서 인슐린 mRNA의 발현량은 Non-NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서의 발현량에 비해 현저하게 낮은 것으로 확인되었다 (도 7D).
다만, 본 발명자들은 NODAT 또는 Non-NODAT 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포에 타크로리무스를 20, 30, 40 및 50 ㎍/mL의 농도로 처리한 후 세포생존율을 측정한 경우 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 확인하였다 (도 8).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 유도만능줄기세포로부터 분화 유도된 췌장전구세포에 타크로리무스를 처리한 경우 NODAT 환자 유래 췌장전구세포에서 세포생존율이 감소되었고, 인슐린 mRNA의 발현량이 현저하게 낮았음을 확인하였다.
이로써, 본 발명자들은 환자의 단핵세포 유래 유도만능줄기세포로부터 췌장전구세포로 분화 유도한 후, 분화 유도된 췌장전구세포의 콜로니 수 측정, 인슐린 발현량의 측정, 타크로리무스 처리한 후 세포생존율 및 인슐린 발현량의 측정을 통해 이식 전에 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험도를 예측할 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. (a) 유도만능줄기세포(iPSC)에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 인슐린의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 이식 후 당뇨병(NODAT, new onset diabetes after transplantation)의 발병 위험도의 예측을 위한 정보제공 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포는 환자로부터 분리된 단핵세포로부터 제조된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에 면역억제제를 처리하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 면역억제제는 타크로리무스(tacrolimus), 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 프로드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylpredisolone), 데플라자코트(deflazacort), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 아자티오프린(azathioprine), 미조리빈(mizoribine), 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 인슐린의 발현량이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수를 측정하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 췌장전구세포에서 형성된 콜로니의 수가 적은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 췌장전구세포의 세포생존율을 측정하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 췌장전구세포의 세포생존율이 기준치에 비해 낮은 경우 이식 후 당뇨병(NODAT)의 발병 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정은 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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