KR20210041562A - 가교된 하이드로겔의 동적 여과 방법 - Google Patents

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볼프강 케슬러
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파트리크 부코비치
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메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
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Abstract

본 발명은 겔로부터 원치 않는 분자를 제거하기 위한 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 회전하고 반투과성인 필터 디스크를 갖는 동적 여과 구조를 이용한 히알루론산 하이드로겔의 동적 여과에 관한 것이다.

Description

가교된 하이드로겔의 동적 여과 방법
본 발명은 겔로부터 원치 않는 분자를 제거하기 위한 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 회전하고 반투과성인 필터 디스크를 갖는 동적 여과 구조를 이용한 히알루론산 하이드로겔의 동적 여과에 관한 것이다.
히알루론산은 신체에 대해 자연 발생적인 폴리머로서, 언젠가부터 이는 정형외과 및 안과와 같은 상이한 분야의 의학에서 사용되고 있다. 요즘, 히알루론산은 미용 의학 및 성형 수술에서 더 많이 사용되고 있다. 히알루론산의 광범위한 적용은 특히, 물과의 매우 높은 결합 능력으로 인한 것이다. 수성 매질에서, 저농도의 히알루론산에서도, 점탄성 겔이 형성되는데, 이는 생물학적으로 분해 가능하고, 유리한 성질을 갖는다.
순수한 히알루론산은 인체에서 비교적 빠르게 분해된다. 이로 인하여, 히알루론산 분자는 종종 서로 화학적으로 가교되며, 이에 의해, 분해는 크게 감소되어, 요망되는 효과가 약 6 내지 12개월의 기간 동안 유지된다. 이에 따라, 가교된 히알루론산 겔은 특히, 주름 치료, 윗 입술 및 아랫 입술의 윤곽 및 볼륨 증가, 뺨 및 턱의 윤곽 개선을 위한, 및 코의 교정, 등을 위한 미용 의학에서 종종 사용된다.
공지된 히알루론산 겔은 크게 2가지 상이한 타입, 즉, 1상 및 2상 겔로 분류될 수 있다. 1상 히알루론산 겔은 단일상으로 이루어지고 비-미립자이다. 이러한 1상 겔의 제조는 예를 들어, WO 2008/068297호, US 8,450,475호, US 8,455,465호, US 7,741,476호, 및 US 8,052,990호에 개시되어 있다. 알려진 상업적 1상 히알루론산 겔에는 예를 들어, Juvederm®, Teosyal®, Glytone Professional®, 및 Belotero®, Esthelis®, Fortelis® Extra 및 Modelis® Shape로 알려진, 1상, 이중-가교된 히알루론산 겔이 있다.
2상 히알루론산 겔은 액체상에 분산되어 있는 가교된 히알루론산 물질을 포함한다. 이러한 겔은 미립자이고, 예를 들어, EP 0 466 300호에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 2상 겔에는 예를 들어, Hylaform®, Restylane®, 및 Perlane®이 있다.
가교된 히알루론산 겔의 제조는 다단계 공정에 의해 일어나고, WO 2005/085329호에 더욱 상세히 기술되어 있다.
히알루론산과 같은 다당류를 기초로 한 겔을 제조하는 방법은 WO 2014/064633호, US 2013/210760호, US 2013/203696호, WO 2010/115081호, WO 2012/062775호, WO 2013/185934호, WO 2009/077399호 및 WO 2008/034176호에 추가로 개시되어 있다.
히알루론산 겔의 투석(dialysis)을 위한 기존 방법은 흔히 비교적 높은 수작업 시간 및 노력을 필요로 한다. 이는 품질 및 재현성이 떨어지며 생산 시간 및 비용이 증가하기 때문에 불리하다. 또한, 투석 단계의 공정 시간에 따라 미생물 오염의 위험이 증가한다.
흔히, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에터(BDDE)가 히알루론산 하이드로겔을 위한 가교제로서 사용된다. 그러나, BDDE는 독성을 나타낼 수 있으며, 원치 않는 분자가 적은 하이드로겔을 생산하는 것이 요구되고 있다.
본 발명의 목적
본 발명은 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 생산 동안 생성된 원치 않는 분자를 제거하는 개선된 방법을 제공하는 목적을 기반으로 한다.
본 발명의 개요
본 발명은 원치 않는 분자를 제거하기 위해 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된 동적 여과 디바이스를 이용하여 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법으로서, i) 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 겔을 사전결정된 농도까지 농축시키거나; 겔을 동적 여과 디바이스의 공정 챔버 내로 직접적으로 펌핑하는 단계; ii) 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 원치 않는 분자를 감소시키기 위해 정용여과를 수행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 본 발명에 따라 가공된 겔("DCF 겔"; 저장 탄성률(storage modulus)(G') 200 Pa)과 표준 방법에 따라 가공된 겔("표준 겔"; 저장 탄성률(G') 216 Pa) 간의 주파수 스윕(frequency sweep) 비교.
1 (점선) = DCF 겔: G'
2 (실선): 표준 겔: G'
3 (점선) = DCF 겔: G"
4 (실선): 표준 겔: G"
5 (점선) = DCF 겔: 복소 점도
6 (실선) = 표준 겔: 복소 점도
도 2: 본 발명에 따라 가공된 겔("DCF 겔"; 저장 탄성률(G') 241 Pa)과 표준 방법에 따라 가공된 겔("표준 겔"; 저장 탄성률(G') 249 Pa) 간의 진폭 스윕 비교. 교차점 = 유동점.
1 (점선) = DCF 겔: G'
2 (실선): 표준 겔: G'
3 (점선) = DCF 겔: G"
4 (실선): 표준 겔: G"
도 3:
1: DCF 겔: G'
2: DCF 겔 G"
3: DCF 겔: 복소 점도
도 4: 실시예 3/시험 4에 따른 겔의 주파수 스윕
삼각형 실선 ▲: 손실 탄성률(loss modulus) G"
사각형 실선 ■: 저장 탄성률 G'
원형 실선 ●: 복소 점도 [η*]
도 5: 실시예 3/시험 4에 따른 겔의 진폭 스윕
삼각형 실선 ▲: 손실 탄성률 G"
사각형 실선 ■: 저장 탄성률 G'
교차점 G" = G': 전단 응력 440 Pa; 저장 탄성률 54 Pa
도 6: 실시예 3/시험 5에 따른 겔의 주파수 스윕
삼각형 실선 ▲: 손실 탄성률 G"
사각형 실선 ■: 저장 탄성률 G'
원형 실선 ●: 복소 점도 [η*]
도 7: 실시예 3/시험 5에 따른 겔의 진폭 스윕
삼각형 실선 ▲: 손실 탄성률 G"
사각형 실선 ■: 저장 탄성률 G'
교차점 G"= G': 전단 응력 350 Pa; 저장 탄성률 98 Pa
본 발명은 하기 본 발명의 상세한 설명 및 여기에 포함되어 있는 실시예를 참조로 하여 더욱 용이하게 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동적 여과 디바이스"는 중공 샤프트 상에 이동 가능하게 배열된 플레이트 또는 디스크 형태의 중공 필터 부재를 이용한 수단을 지칭한다. 부재의 상대적인 이동에 의해, 여과되는 매질에서 난류가 발생하여, 필터 부재의 표면이 세정된다. 이러한 필터 디바이스는 예를 들어, WO 00/47312호에 기술되어 있다. 회전하는 필터 부재는 막횡단 압력(transmembrane pressure, TMP)으로부터 오버플로우 속도의 디커플링(decoupling)을 허용한다. 동적 여과 모듈에서 원심력과 전단력의 결합은 커버 층 빌드-업(cover layer build-up)의 제어를 개선시킨다. 이러한 기술을 이용함으로써, 막힌 층(clogging layer)의 형성이 감소된다. 또한, 상대적인 움직임은 필터 기계에서 농축물(retentate)의 혼합을 보장한다. 이러한 동적 여과 디바이스는 다른 회사, 예를 들어, Andritz AG(본사 오스트리아 그라츠 소재)로부터 획득될 수 있다. 동적 여과 디바이스의 핵심 부재는 막 디스크이다. 이의 직경, 디스크의 수 및 정렬은 의도된 스케일에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따르면, 동적 여과 방법은 다양한 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔(하기에서 "하이드로겔(들)"로도 지칭됨) 상에 적용될 수 있다. 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 생산 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 가교된 히알루론산 겔의 제조는 WO 2005/085329 A1호에 기술되어 있다. 다당류를 기반으로 하여 겔을 제조하는 추가 방법은 WO 2014/064633호, US 2013/210760호, US 2013/203696호, WO 2010/115081호, WO 2012/062775호, WO 2013/185934호, WO 2009/077399호 및 WO 2008/034176호에 개시되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법에 관한 것이다:
a) 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된 동적 여과 디바이스에 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔을 전달하고,
i) 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 겔을 사전결정된 농도까지 농축시키거나 동적 여과 디바이스의 공정 챔버 내로 겔을 직접적으로 펌핑하는 농축 단계 및
ii) 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 원치 않는 분자를 감소시키기 위해 정용여과를 수행하는 단계
를 포함하는, 겔을 정용여과하는 단계; 및
b) 선택적으로, 비가교 폴리머, 특히, 비가교 히알루론산, 및 물을 포함하는 혼합물을 겔에 첨가하는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정용여과"는 여과액이 생성되는 것과 동일한 속도로 농축물에 물 또는 새로운 완충제를 첨가함으로써 농축물(샘플)에서 본래 완충 염 또는 다른 저분자량 종을 세척하는 것을 포함하는 연속 정용여과(일정 부피 정용여과로도 지칭됨)를 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "원치 않는 분자"는 비반응성 또는 미결합 폴리머 가교제 분자(예를 들어, BDDE) 및 이의 분해 산물을 지칭한다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법은 겔로부터 원치 않는 분자를 상당히 제거하면서, 회전하는 필터 디스크로부터 발생하는 전단 응력(share stress)에도 불구하고 겔의 구조적 안정성이 유지된다는 것이 확인되었다. 또한, 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법을 수행하는 데 필요한 공정 시간 및 필요한 완충제가 종래 투석에 비해 상당히 감소되었다는 것이 확인되었다. 본 발명에 따른 방법의 또 다른 장점은 플럭스 속도(flux rate)가 기존 교류 여과에 비해 증가되며(2 내지 10배), 농축물이 더 농축될 수 있다는 것이다. 이러한 장점은 가교되고 고도의 점성 하이드로겔로부터 원치 않는 분자를 제거하는 개선된 방법을 야기시킨다.
바이오폴리머-기반 하이드로겔은 생분해성 폴리머, 예를 들어, 히알루론산, 헤파로산, 알기네이트, 펙틴, 젤란 검, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 셀룰로스, 키토산, 카라기난, 잔탄, 또는 이들의 염 또는 유도체 또는 이들의 조합물으로 제조된다. 용어 "히알루론산"은 용어 "히알루로난"과 동의어로 사용된다.
하기 본 발명이 히알루론산 하이드로겔에 의해 기술되어 있지만, 이는 본 개시가 임의의 방식으로 히알루론산 하이드로겔로 한정되는 것을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 히알루론산 하이드로겔 대신에, 임의의 바이오폴리머-기반 하이드로겔, 특히, 위에서 언급된 예시적인 폴리머 중 하나로 제조된 하이드로겔이 사용될 수 있다.
바이오폴리머-기반 하이드로겔은 화학적 가교제에 의해 가교되며, 하이드로겔은 과잉의 사용된 화학적 가교제를 함유한다. 과잉의 화학적 가교제는 본 발명에 따른 방법에 의해 하이드로겔로부터 제거된다. 또한, 다른 원치 않는 분자는 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 하이드로겔로부터 제거될 수 있다.
용어 "가교제"는 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 작용기 중 하나 이상과 반응할 수 있고 이를 예를 들어, 하이드록실 기와 가교할 수 있는 적어도 2개의 기를 지닌 모든 화합물을 포함한다. 가교를 위한 가교제의 적합한 기는 카보닐, 에폭사이드, 할로겐, 비닐, 이소시아네이트, 또는 보호된 이소시아네이트 기로부터 선택될 수 있다. 가교제로서 사용될 수 있는 예시적인 화합물에는 예를 들어, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에터(BDDE), 폴리비닐실란(PVS), PEG-기반 가교제, 디비닐 설폰(DVS)이 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 하이드로겔로부터 미결합 또는 과잉의 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에터(BDDE) 및/또는 다른 원치 않는 분자를 제거한다.
바람직하게는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔(특히, 히알루론산으로 제조된 하이드로겔)은 10 내지 70 ㎎/g, 바람직하게는, 20 내지 50 ㎎/g 범위의 초기 농도를 나타낸다. 본 발명의 측면에서, 하이드로겔의 농도는 하이드로겔의 총량(g 단위로 제공됨)을 기준으로 가교된 바이오폴리머의 양(㎎ 단위로 제공됨)을 의미한다. 통상적으로, 초기 농도는 단계 a)에서 동적 여과 디바이스로 전달되고 선택적으로, 단계 i)에서 공정 챔버 내로 농축되거나 직접적으로 펌핑되는 하이드로겔의 농도이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 하이드로겔은 예를 들어, 내부 충전(infilling)을 촉진시키기 위해, 동적 여과 디바이스로 전달되기 전에 (예를 들어, 정용여과에 적용된 완충 용액을 사용하여) 희석되고, 바람직하게는, 정용여과 전에 선택적 단계 i)에서 농축될 수 있다. 바람직하게는, 하이드로겔은 3 내지 30 ㎎/g, 바람직하게는, 5 내지 20 ㎎/g, 더욱 바람직하게는, 5 내지 10 ㎎/g의 범위의 하이드로겔의 농도에서 출발하여 선택적 단계 i)에서 농축된다.
바람직하게는, 하이드로겔은 요망되는 농도에 도달할 때까지 및 최대 70 ㎎/g의 최대 농도까지 선택적 단계 i)에서 농축된다. 특히, 선택적 농축 단계 i) 후 하이드로겔의 농도는 10 내지 70 ㎎/g, 바람직하게는, 20 내지 50 ㎎/g, 더욱 바람직하게는, 20 내지 35 ㎎/g 범위이다.
바람직하게는, 단계 ii)에서 정용여과는 10 내지 70 ㎎/g, 바람직하게는, 20 내지 50 ㎎/g, 더욱 바람직하게는, 20 내지 35 ㎎/g, 또한 바람직하게는, 23 내지 70 ㎎/g 범위의 하이드로겔의 농도에서 수행된다. 통상적으로, 하이드로겔(특히, 히알루론산으로 제조된 하이드로겔)의 농도는 정용여과 단계 ii) 동안 거의 동일한 수준에서 유지된다.
바람직하게는, 단계 ii)에서 정용여과는 하이드로겔에서 원치 않는 분자(예를 들어, BDDE)의 양이 정량 한계 미만이 될 때까지 수행된다. 예를 들어, 단계 ii)에서 정용여과는 1 내지 8시간, 바람직하게는, 2 내지 6시간의 기간 동안 수행된다.
바람직하게는, 단계 ii)에서 정용여과는 완충 용액, 바람직하게는, 포스페이트 완충 용액, 예를 들어, 나트륨 포스페이트, 예를 들어, Na2HPO4 및 NaH2PO4를 기반으로 한 완충 용액을 사용하여 수행된다. 특히, 단계 ii)에서 정용여과는 6 내지 8, 바람직하게는, 6.5 내지 7.5 범위의 pH 값을 갖는 완충 용액을 사용하여 수행된다.
바람직하게는, 하이드로겔은 70 1/분 내지 500 1/분, 바람직하게는, 70 1/분 내지 300 1/분, 더욱 바람직하게는, 100 1/분 내지 300 1/분 범위의 회전 속도를 적용함으로써 단계 i)에서 농축된다. 바람직하게는, 하이드로겔은 1 내지 3 bar 범위의 과압력에 의해 단계 i)에서 농축된다.
바람직하게는, 단계 ii)에서 정용여과는 70 1/분 내지 500 1/분, 바람직하게는, 70 1/분 내지 300 1/분, 더욱 바람직하게는, 100 1/분 내지 300 1/분 범위의 회전 속도를 적용함으로써 수행된다. 바람직하게는, 단계 ii)에서 정용여과는 1 내지 3 bar 범위의 과압력을 가함으로써 수행된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 동적 여과 디바이스에는 5㎚ 내지 2 ㎛의 기공 크기, 보다 특히, 30㎚ 내지 600㎚의 기공 크기, 보다 특히, 80㎚ 내지 300㎚의 기공 크기, 특히, 5㎚ 내지 60㎚의 기공 크기를 나타내는 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 동적 여과 디바이스에는 하나 이상의 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된다. 바람직한 실시형태에서, 동적 여과 디바이스에는 1 내지 10개, 바람직하게는, 4 내지 6개의 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된다. 반투과성 필터 디스크는 동일한 또는 상이한 치수를 나타낼 수 있다. 놀랍게도, 반투과성 필터 디스크(들)의 수가, 하이드로겔의 점도 및 가교된 구조에 악영향을 미치지 않으면서, 최대 10, 또는 바람직하게는, 최대 6까지 증가될 수 있다는 것이 확인되었다. 통상적으로, 디스크의 수가 증가하고 회전 속도가 증가함에 따라 전단력은 증가한다.
특정 실시형태에서, 동적 여과 디바이스에는 세라믹, 금속 또는 폴리머 물질로 제조된 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된다.
특정 실시형태에서, 바이오폴리머-기반 하이드로겔은 히알루론산으로 제조되며, 겔은 약 20 1/분 내지 150 1/분 범위 내의 회전 속도 및 약 0.5 내지 2 bar 범위 내의 압력을 가함으로써 10 내지 30 ㎎/g의 최종 농도까지 농축되며, 여기서, 정용여과는 20 1/분 내지 150 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 2 bar 범위 내의 압력을 가함으로써 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 바이오폴리머-기반 하이드로겔은 히알루론산으로 제조되며, 단계 ii)에서 정용여과는 20 1/분 내지 500 1/분, 바람직하게는, 70 내지 300 1/분 범위 내의 회전 속도, 및 0.5 내지 3 bar, 바람직하게는, 1 내지 3 bar 범위 내의 압력을 가함으로써 수행되며, 단계 ii)에서 정용여과는 10 내지 70 ㎎/g, 바람직하게는, 20 내지 50 ㎎/g, 더욱 바람직하게는, 20 내지 35 ㎎/g 범위의 하이드로겔의 농도에서 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 바이오폴리머-기반 하이드로겔은 히알루론산으로 제조되며, 단계 (i)(즉, 선택적 농축 단계가 아님)에서 동적 여과 디바이스의 공정 챔버 내로 직접적으로 펌핑되며, 단계 ii)에서 정용여과는 70 1/분 내지 500 1/분, 바람직하게는, 70 내지 300 1/분 범위 내의 회전 속도 및 1 내지 3 bar 범위 내의 압력을 가함으로써 수행되며, 여기서, 단계 ii)에서 정용여과는 10 내지 70 ㎎/g, 바람직하게는, 20 내지 35 ㎎/g 범위의 하이드로겔의 농도에서 수행되며, 동적 여과 디바이스에는 1 내지 10개, 바람직하게는, 4 내지 6개의 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된다.
하이드로겔의 정용여과 동안 또는 후에, 추가 물질, 예를 들어, 염, 완충 물질, 비타민(예를 들어, 비타민 E, C, B6), 산화방지제(예를 들어, 아스코르브산 또는 이의 유도체, 아연 옥사이드), 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 만니톨), 트리-칼슘 포스페이트 입자(예를 들어, 알파- 및 베타-트리-칼슘 포스페이트 및 하이드록시아파타이트 입자), 작용제(예를 들어, 마취제, 소염제, 자극-감소제, 혈관수축제 또는 혈관확장제, 항응고제, 보습제, 면역-억제제, 항생제, 등)뿐만 아니라 성장 인자, 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 신경독소)이 겔에 첨가될 수 있다. 특히, 마취제, 예를 들어, 리도카인이 겔에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 리도카인은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.05 내지 5.0 중량%, 0.1 내지 2.0 중량%, 0.1 내지 1.0 중량%, 0.1 내지 0.5 중량%, 0.1 내지 0.4 중량%, 0.2 내지 0.4 중량% 또는 0.2 내지 0.3 중량%의 농도로 겔에 함유된다.
바람직하게는, 단계 i)에서 선택적 농축 단계 및/또는 단계 ii)에서 정용여과는 15℃ 내지 80℃, 바람직하게는, 20℃ 내지 70℃ 범위의 온도에서 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 단계 ii)에서 정용여과 및 선택적으로, 농축 단계 i)은 60℃ 내지 70℃ 범위의 온도에서, 바람직하게는, 60℃ 내지 70℃ 범위의 온도에서, 및 2 내지 4시간(예를 들어, 3.5시간)의 기간 동안 수행된다. 특히, 60℃ 내지 70℃ 범위의 온도가 하이드로겔의 점도 감소로 인해 유리하다.
특정 실시형태에서, 단계 a)에서, 겔은 추가적으로, 원치 않는 분자를 감소시키기 위해 열처리되며, 여기서, 60℃가 최대 4시간 동안 적용된다.
동적 여과 디바이스는 디바이스 및/또는 통로를 스팀, 멸균 유체, 특히 세척액, 바람직하게는, 여과수, 및/또는 멸균된/입자-부재 공기로 세정하기 위한 멸균 수단, 바람직하게는, 순수 스팀을 포함할 수 있다. 멸균 수단은 멸균 유체를 포함한 공급 유닛, 및 멸균 유체를 위한 저장 유닛을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 겔은 121℃ 내지 135℃에서 약 2 내지 30분의 유지 시간과 함께 동적 여과 디바이스에서 멸균된다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 10시간 미만, 특히, 5시간 미만 내에 수행된다.
본 발명에 따른 방법은 추가적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
i) 진공(20 내지 200 mbar) 하에서 공기 버블을 제거하기 위해 겔을 탈기시키는 단계,
ii) 겔을 시린지에 채우는 단계,
iii) 오토클레이트에서 열에 의해 실린지 중의 겔을 멸균하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능한 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 심미적 적용, 특히, 연조직 확대술을 위한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 용도에 관한 것이다.
실시예
하기에는, 본 발명에 따른 방법이 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1: 겔의 희석, 농축 및 정용여과 단계를 포함하는 방법
BDDE로 가교되고(예를 들어, WO 2005/085329호 참조) 24 ㎎/g의 초기 농도를 나타내는 히알루론산 하이드로겔을 Na2HPO4*2H2O: 0.994 g/ℓ; NaH2PO4*2H2O: 0.51 g/ℓ; 만니톨: 42 g/ℓ 및 주사용수를 함유한 완충제를 사용하여 1:4 내지 1:8 범위로 희석하였다. 희석된 겔을 파이프 또는 배관을 통해 동적 여과 디바이스 유입구에 연결된 용기로 옮겼다. 동적 여과 디바이스는 하나의 필터 디스크(0.034㎡ 필터 면적, 152㎜ 직경 및 7㎚의 기공 크기), 겔 저장소로서의 하나의 용기 및 완충제 저장소로서의 제2 용기를 갖는 Krauss Maffei 동적 교차흐름 필터 DCF 152/S(Andritz AG)로 이루어졌다. 두 용기 모두를 상이한 공정 단계에서 개개 매질을 선택하기 위해 배관 및 볼 밸브를 통해 DCF 152/S의 유입구 포트에 연결하였다. 이중 재킷의 온도를 20℃의 사전설정 온도에서 유지하기 위해 DCF 152/S의 하우징의 이중 재킷을 냉장 서큘레이터에 연결하였다. DCF 152/S의 여과액을 용기에 모으고, 여과액을 양을 결정하기 위해 저울에 올려 놓았다. 하기 단계를 적용하였다:
i) 희석된 겔을 함유한 밀폐된 겔 용기에 압력(1.5 bar)을 가함으로써 겔을 농축하고, DCF 152/S의 유입구 포트쪽 길을 개방하고, 필터 디스크 및 중공 샤프트를 통해 여과액을 제거하는 단계(WO 00/47312호 참조). 필터 디스크를 150 rpm으로 회전시켰다. 겔 중 히알루론산의 농도가 24 ㎎/g일 때까지 겔을 농축하였다.
ii) 완충제를 함유한 밀폐된 완충제 용기에 압력(1.5 bar)을 가함으로써 Na2HPO4*2H2O: 0.994 g/ℓ; NaH2PO4*2H2O: 0.51 g/ℓ; 만니톨: 42 g/ℓ 및 주사용수를 함유한 완충 용액으로 정용여과를 수행하고, DCF 152/S의 유입구 포트쪽으로 길을 개방하고, 필터 디스크 및 중공 샤프트를 통해 여과액을 제거하는 단계(WO 00/47312호 참조). 완충 용액은 리도카인(0.27 내지 0.33 w/w%)을 함유할 수 있다. 대안으로서, 정용여과 후에 리도카인이 첨가될 수 있다. 필터 디스크를 150 rpm으로 회전하였다. BDDE가 정량 한계 미만으로 존재할 때까지 겔을 여과하였다.
BDDE의 양을 하기 방법에 따라 결정하였다:
1. 샘플 제조:
a. HA의 효소 분해
히알루로니다아제 용액의 첨가 및 점도가 감소될 때까지 약한 쉐이킹(slight shaking) 하에서 1 내지 4시간 동안 후속 인큐베이션에 의해 HA를 분해시켰다.
b. BDDE의 추출
에틸아세테이트(5%v/v)의 첨가 및 400 rpm에서 20분 동안 오비탈 쉐이킹에 의해 분해된 샘플(a에 기술됨)로부터 BDDE를 추출하였다. 유기상 및 수상을 분리하기 위해 용액을 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. BDDE를 함유한 유기상을 GC-바이알로 옮겼다.
2. 가스크로마토그래피 결정
a. 5㎕의 샘플(1 b에 기술됨)을 GC(분할 주사기, 분할 비율 1:5, 250℃)에 주사하고, 온도 기울기 100℃-40℃/분-280℃ 및 30초 동안 280℃에서의 최종 유지를 이용하여 DB-1 컬럼(Agilent DB-1, 30m, 0.25㎜ ID, 0.25 ㎛ 필름) 상에서 분리하였다. 검출기로서 FID를 이용하였다.
b. 데이터 평가를 유럽 약전 챕터 2.2.46에 따른 내부 표준 방법에 의해 수행하였다.
실시예 1에 따른 하나의 실험 결과는 하기 표 1에 나타내었다:
Figure pct00001
2개의 상이한 겔의 비교를 도시한 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 방법 동안 겔의 구조적 안정성이 유지되었다. 하나의 겔은 본 발명에 따라 처리하고("DCF 겔") 및 다른 겔은 표준 방법으로 처리하였다("표준 겔").
실선은 표준 방법에 따라 생성된 투석 후 겔의 G', G" 및 η의 특징적인 진행을 나타낸 것인 반면, 점선은 본 발명에 따라 가공된 겔의 특징적인 진행을 나타낸 것이다.
겔의 특징분석을 위해 통상적으로 사용되는 주파수 시험에서 나타나는 곡선 진행에 대한 유의미한 차이가 존재하지 않는다는 것이 명백하다. 본 발명에 따른 겔과 관련된 곡선은 겔의 HA-농도가 약간 더 낮기 때문에 표준 겔과 관련된 곡선보다 약간 아래에 있다. 겔의 구조적 안정성과 관련하여, G' 및 G"(G' > G")의 병행 증가는 겔이 본 발명에 따른 방법 동안 이의 가교된 구조를 유지함을 명확하게 나타낸다.
또한, 두 겔("DCF 겔" 및 "표준 겔"; 상기 참조) 모두의 유동점이 동일하다는 것이 도 2에 도시되어 있으며, 이는 본 발명에 따라 가공된 겔의 구조적 안정성이 유지되었다는 것을 추가로 나타낸다.
실시예 2: 겔을 희석하는 단계가 없는 겔을 정용여과하는 방법
BDDE(예를 들어, WO 2005/085329호 참조)로 가교되고 32 내지 35 ㎎/g의 농도를 나타내는 히알루론산 하이드로겔을 동적 여과 디바이스의 공정 챔버로 직접적으로 펌핑하였다. 겔은 226.8 ppm의 미결합 BDDE를 함유하였다. 동적 여과 디바이스는 하나의 필터 디스크(0.034㎡ 필터 면적, 152㎜ 직경 및 5㎚의 기공 크기), 겔 저장소로서의 하나의 용기 및 완충제 저장소로서의 제2 용기를 갖는 Krauss Maffei 동적 교차흐름 필터 DCF 152/S(Andritz AG)로 이루어졌다. 상이한 공정 단계에서 개개 매질을 선택하기 위해 두 용기 모두를 배관 및 볼 밸브를 통해 DCF 152/S의 유입구 포트에 연결하였다. 이중 재킷의 온도를 20℃의 사전설정 온도에서 유지시키기 위해 DCF 152/S의 하우징의 이중 재킷을 냉장 서큘레이터에 연결하였다. DCF 152/S의 여과액을 용기에 모으고, 여과약의 양을 결정하기 위해 저울 위에 올려놓았다. 하기 단계를 적용하였다:
i) 완충제를 함유한 밀폐된 완충제 용기에 압력(1.5 bar)을 가함으로써 Na2HPO4*2H2O: 5.96 g/ℓ; NaH2PO4*2H2O: 2.57 g/ℓ; NaCl: 2.29 g/ℓ 및 주사용수를 함유한 완충 용액으로 정용여과를 수행하고, DCF 152/S의 유입구 포트쪽으로 길을 열고, 필터 디스크 및 중공 샤프트를 통해 여과액을 제거하는 단계(WO 00/47312호 참조). 완충 용액은 리도카인(0.27 내지 0.33 w/w%)을 함유할 수 있다. 대안으로서, 정용여과 후에 리도카인이 첨가될 수도 있다. 필터 디스크를 150 rpm(1/분)으로 회전시켰다. 미결합 BDDE가 정량 한계(LOQ) 미만으로 존재할 때까지 겔을 여과하였다. BDDE의 양을 상기에서 설명된 바와 같이 결정하였다(실시예 1 참조). 동적 여과 공정을 2시간 및 1분 내에 수행하였다.
추가 실험 결과는 하기 표 2에 나타나 있다:
Figure pct00002
본 발명에 따른 방법 동안 겔의 구조적 안정성이 유지되었다는 사실에 대한 또 다른 예는 도 3에서 확인될 수 있다. 실시예 2에 따른 방법을 적용한 후에, 겔의 특징분석을 위해 통상적으로 사용되는 주파수 시험의 도움으로 겔을 분석하였다. 사용된 주파수 범위는 0.1 내지 10 Hz였다. G' 및 G"(G' > G")의 병렬 증가는 겔("DCF 겔")이 실시예 2에 따른 방법 동안 이의 가교된 구조를 유지함을 명확하게 나타내는 것이다.
실시예 3: 겔을 희석하는 단계 없이, 6개의 필터 디스크를 갖는 동적 여과 디바이스를 이용하여 겔을 정용여과하는 방법
사용된 동적 여과 디바이스가 6개(실시예 1 및 실시에 2에서와 같이 1개 대신에)의 필터 디스크(0.034㎡ 필터 면적, 152㎜ 직경 및 5㎚의 기공 크기)를 갖는 Krauss Maffei 동적 교차흐름 필터 DCF 152/S(Andritz AG)라는 차이와 함께 위에서 언급된 실시예 2에 따라 실시예 3을 수행하였다. BDDE로 가교되고(예를 들어, WO 2005/085329호 참조) 66 ㎎/g의 농도를 나타내는 히알루론산 하이드로겔을 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 바와 같은 완충 용액을 사용하여 인자 1:2로 희석하였다. 약 33 ㎎/g의 농도를 갖는 히알루론산 하이드로겔를 동적 여과 디바이스의 공정 챔버 내로 직접적으로 펌핑하였다. 겔은 226.8 ppm의 미결합 BDDE를 함유하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 정용여과를 수행하였으며, 여기서, 다른 공정 조건은 표 3에 제공되어 있다. BDDE가 정량 한계 미만으로 존재할 때까지 및 통상적으로, 여과액의 부피가 여과 디바이스의 챔버 부피의 7배가 될 때까지 정용여과를 수행하였다.
Figure pct00003
도 4(시험 4) 및 도 5(시험 5)에 도시된 바와 같이 실시예 3에 따른 시험 4 및 시험 5에 따른 DCF 방법 동안 겔의 구조적 안정성이 유지되었다. 실시예 3에 따른 방법을 적용한 후에, 겔의 특징분석을 위해 통상적으로 사용되는 주파수 시험의 도움으로 겔을 분석하였다. 사용된 주파수 범위는 0.1 내지 10 Hz였다. G' 및 G"(G' > G")의 병렬 증가는, 겔이 실시예 3(시험 4 및 시험 5)에 따른 방법 동안 이의 가교된 구조를 유지한다는 것을 명확하게 나타낸다.
놀랍게도, 실시예 2에 비해 필터 디스크의 수뿐만 아니라 회전 속도가 증가될 때, 하이드로겔의 구조가 부정적으로 영향을 받지 않는다(즉, 가교 구조가 유지됨)는 것이 확인되었다. 통상적으로, 디스크의 수가 증가하고 회전 속도가 증가함에 따라 전단력이 증가한다.

Claims (15)

  1. 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법으로서,
    a) 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔을 반투과성 필터 디스크(들)가 장착된 동적 여과 디바이스 내로 전달하고,
    i) 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 상기 겔을 사전결정된 농도까지 농축시키거나, 상기 겔을 상기 동적 여과 디바이스의 공정 챔버 내로 직접적으로 펌핑하는 농축 단계, 및
    ii) 원치 않는 분자를 감소시키기 위해 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 6 bar 범위 내의 과압력을 가함으로써 정용여과를 수행하는 단계
    를 포함하는, 상기 겔을 정용여과하는 단계;
    b) 선택적으로, 상기 셀에 비가교 폴리머, 특히, 비가교 히알루론산, 및 물을 포함하는 혼합물을 첨가하는 단계를 포함하는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오폴리머-기반 하이드로겔이 히알루론산, 헤파로산, 알기네이트, 펙틴, 젤란 검, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 셀룰로스, 키토산, 카라기난, 잔탄, 또는 이들의 염 또는 유도체 또는 이들의 조합물으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머로 제조된, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔이 화학적 가교제에 의해 가교되며, 상기 하이드로겔이 과잉의 상기 화학적 가교제를 함유하며, 과잉의 상기 화학적 가교제 및/또는 다른 원치 않는 분자는 제거되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반투과성 필터 디스크(들)가 5㎚ 내지 2 ㎛의 기공 크기, 보다 특히, 30㎚ 내지 600㎚의 기공 크기, 보다 특히, 80㎚ 내지 300㎚의 기공 크기, 특히, 5㎚ 내지 60㎚의 기공 크기를 나타내는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동적 여과 디바이스에 1 내지 10개의 반투과성 필터 디스크(들)가 장착되어 있는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반투과성 필터 디스크(들)가 세라믹, 금속 또는 폴리머 물질로 제조된, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 BDDE에 의해 가교되며, 상기 하이드로겔이 과잉의 BDDE를 함유하며, 과잉의 BDDE 및/또는 다른 원치 않는 분자는 제거되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오폴리머-기반 하이드로겔이 히알루론산으로 제조되며, 단계 ii)에서의 상기 정용여과는 20 1/분 내지 500 1/분 범위 내의 회전 속도 및 0.5 내지 3 bar 범위 내의 압력을 가함으로써 수행되며, 단계 ii)에서의 상기 정용여과는 10 내지 70 ㎎/g 범위의 상기 하이드로겔의 농도에서 수행되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 정용여과 동안 또는 후에, 마취제가 상기 겔에 첨가되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  10. 제9항에 있어서, 정용여과 동안 또는 후에, 리도카인이 상기 겔에 첨가되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)에서의 상기 정용 여과 및 선택적으로, 상기 농축 단계 i)이 60℃ 내지 70℃ 범위의 온도에서 및 2 내지 4시간의 기간 동안 수행되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 겔이 상기 디바이스에서 약 2 내지 30분의 유지 시간과 함께 121℃ 내지 135℃에서 멸균되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 10시간 미만, 특히, 5시간 미만 내에 수행되는, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔의 동적 여과 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득 가능한, 가교된 바이오폴리머-기반 하이드로겔.
  15. 심미적 적용, 특히, 연조직 확대술(soft tissue augmentation)을 위한, 제14항의 하이드로겔의 용도.
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