KR20210032428A - 사이클로(-히스-프로)의 신규 다형 형태 - Google Patents

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KR20210032428A
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카이 올름스테드
데이비드 피어슨
엘레이네 맥퍼슨
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주식회사 노브메타파마
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Abstract

본 개시는 사이클로(-히스-프로)("CHP")의 신규 다형 형태의 합성 및 특성 분석에 관한 것이다. 본 개시는 이에 제한되지는 않으나, X-선 분말 회절(XRPD), 고체-상태 핵자기 공명(NIR, 또는 13C SSNMR), 라만 분광법, 시차 주사 열량측정(DSC), 동적 증기 흡착(DVS), 및 열중량 분석(TGA)을 포함하는 다양한 분석 기법을 사용하여 특성 분석하고 CHP의 다른 고체 형태와 구별될 수 있는 사이클로(-히스-프로) 수화물 결정 형태("CHP 수화물" 또는 "패턴 2" 화합물)를 제공한다.

Description

사이클로(-히스-프로)의 신규 다형 형태
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/696,190호를 우선권 주장하며, 그 전문이 법률에 의해 허용되는 전체 한도로 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 사이클로(-히스-프로)("CHP")의 신규 다형 형태에 관한 것이다.
사이클로(-히스-프로), C11H14N4O2는 CAS 등록번호 53109-32-3을 가지는 무수 디펩티드로 알려져 있다. 이것은 시상하부의 갑상선 자극 호르몬-방출 호르몬의 아미노-말단 피로글루탐산 잔기의 가수분해 제거로부터 생체내(in vivo) 유도된 내재성 환형 디펩티드이다. 사이클로(-히스-프로)는 종래의 화학적 방법으로 생체외(ex-vivo)에서 모두 합성할 수 있다. 이는 아교세포 기여의 특성을 조절하는 데 중요할 수 있다. Grotelli 등, The Role of Cyclo(His-Pro) in Neurodegeneration, Int J Mol Sci. 2016 Aug; 17(8): 1332. 사이클로(히스-프로)는 중추신경계에 편재하며, 신경보호와 강하게 연결된 유기 양이온 수송체의 핵심 기질이다. 환형 디펩티드는 또한 뇌-혈액 장벽을 통과할 수 있으며, 일단 뇌에서 Nrf2-NF-κB 신호전달 축을 변경하여 다양한 염증 및 스트레스 반응에 영향을 미칠 수 있다.
사이클로(-히스-프로)의 결정 무수 형태("무수 CHP" 또는 "패턴 1")는 지금까지 문헌에 보고된 형태이며, 잠재적인 치료적 적용분야를 가진다. 그러나, 특정 무수 형태는 불안정할 수 있다. 패턴 1 사용의 가능한 단점은 다음을 포함한다: (1) 주위 습도에서 높은 습도 조건까지의 명백한 물리적 불안정성; 및 (2) 바람직한 L,L-디펩티드의 부분입체 이성질체(diastereomer), 예컨대 D,L-CHP, L,D-CHP, 또는 D,D-CHP의 형성을 초래하는 수분 활성으로 인한 잠재적인 화학적 불안정성. 따라서, 보다 안정한 형태의 CHP가 당업계에서 필요하다.
요약
본 개시는 이에 제한되지는 않으나, X-선 분말 회절(XRPD), 고체-상태 핵자기 공명(NMR, 또는 13C SSNMR), 라만 분광법, 시차 주사 열량측정(DSC), 동적 증기 흡착(DVS), 및 열중량 분석(TGA)을 포함하는 다양한 분석 기법을 사용하여 특성 분석하고 CHP의 다른 고체 형태와 구별될 수 있는 사이클로(-히스-프로) 수화물 결정 형태("CHP 수화물" 또는 "패턴 2" 화합물)를 제공한다.
출원인은 예기치 않게 CHP 수화물(CAS RN: 2254826-95-2 (2019년 1월))이 무정형 사이클로(-히스-프로) 또는 패턴 1에 비해 우수한 안정성을 가지고 있음을 발견하였다. 이 놀라운 발견에 근거하여, 패턴 2는 패턴 1 또는 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물을 사용하는 대신에 단일 성분 약물로서 단독으로 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 현재 무수 CHP를 분리하기 위해 사용되는 컬럼 크로마토그래피 대신에 용매를 사용한 결정화에 의해 패턴 2를 분리하는 공정에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 패턴 2는 약 6개월, 또는 약 12개월, 또는 약 18개월, 또는 약 24개월, 또는 약 36개월 동안 일반적인 실온 저장 조건에서 안정하다.
또 다른 구현예에서, 본 개시는 실질적으로 순수한 패턴 2 물질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 패턴 2 물질은 적어도 약 90% 순수하거나, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 순수하다.
일 구현예에서, 샘플의 순도는 임의의 분석 방법으로 측정된다. 일 구현예에서, 순도는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), X-선 분말 회절(XRPD), pKa 분석, 편광 광학 현미경검사(PLM), 열중량 분석/시차 열 분석(TG/DTA), 시차 주사 열량측정(DSC), 푸리에-변환 적외선 분광법(FT-IR), 동적 증기 흡착(DVS), 가변 온도 및 습도 X-선 분말 회절법(VT-/VH-XRPD), 1H 핵자기 공명(NMR), 및/또는 이핵 단일 양자 코히어런스(HSQC) NMR로 측정된다. 다른 구현예에서, 샘플의 순도는 HPLC로 측정된다.
일 구현예에서, 패턴 2 물질은 HPLC로 측정시 적어도 약 90% 순수하거나, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 순수하다.
다른 구현예에서, 패턴 2 물질은 하기 중 적어도 2개를 특징으로 할 수 있다:
(a) 다음 목록에서 선택한 적어도 2개의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절도: 10, 13.7, 17, 18.1, 20.2 및 27.3 도 (±0.2°의 2θ);
(b) 약 6.4의 pKa;
(c) 편광 광학 현미경검사로 분석시 단편화된, 막대-유사 모폴로지를 갖는 복굴절;
(d) 열중량 분석 기법으로 분석시 약 6.5%의 초기 중량 손실 (0.9 당량의 물)에 뒤이어, 약 280℃에서의 샘플 분해;
(e) DSC의 제1 열 사이클에서 약 99℃의 개시 및 약 102℃에서의 피크를 갖는 흡열;
(f) 40℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 상대 습도(RH) 약 10% 미만에서 탈수 시작, 10%로부터 0% RH 시 약 5.8 중량% 손실 (0.8 당량의 물) 및 0%로부터 40% RH 시 수화;
(g) 50℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 약 20% RH 미만에서 탈수 시작, 약 20%로부터 0% RH 시 약 6.1 중량% 손실 (0.8 당량의 물) 및 0%로부터 약 40% RH 시 재수화; 및
(h) 60℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 약 20% RH 미만에서 탈수 시작, 약 20%로부터 0% RH 시 약 7 중량%의 손실 (1.0 당량의 물) 및 0%로부터 약 40% RH 시 재수화.
본 개시는 또한 패턴 2 물질 및 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 약 1%, 약 2%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% (w/w)의 CHP 수화물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 10% (w/w)의 CHP 수화물을 포함할 수 있다. 일 특정 구현예에서, 상기 조성물은 약 4% (w/w)의 CHP 수화물을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 정제, 캡슐, 캐플릿, 리퀴겔(liquigel), 트로키, 주사가능한 멸균 용액 등의 형태로 만들어질 수 있다.
대안적으로, 본원에 교시된 조성물은 사용 전에 적합한 비히클, 예컨대 멸균 발열성물질-제거수(sterile pyrogen-free water)로 재구성하기 위해 분말 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여에 적합한 화합물은 부피당 0.1 내지 90 중량 퍼센트의 화합물을 함유하는 멸균 등장성 식염용액을 포함할 수 있다. 예로서, 용액은 약 5 퍼센트 내지 약 20 퍼센트, 더 바람직하게는 약 5 퍼센트 내지 약 17 퍼센트, 더 바람직하게는 약 8 내지 약 14 퍼센트, 보다 더 바람직하게는 약 10 퍼센트의 화합물을 함유할 수 있다.
본 조성물, 방법 등의 추가 구현예는 하기 설명, 도면, 실시예, 및 청구범위에서 명백할 것이다. 상기 및 하기 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본원에 설명된 각각의 모든 특징, 및 이러한 특징들 중 둘 이상의 각각의 모든 조합은 그러한 조합에 포함된 특징들이 상호간에 부합하지 않는 것이 아닌 한 본 개시의 범위 내에 포함된다. 또한, 임의의 특징 또는 특징들의 조합은 임의의 구현예 또는 측면에서 특별히 제외될 수 있다. 추가 측면 및 구현예는, 특히 첨부된 실시예 및 도면과 관련하여 고려하면서 하기 설명 및 청구범위에서 설명된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허출원 공보의 사본은 요청시 그리고 필요한 수수료 지불시에 관청에 의해 제공될 것이다.
전술한 구현예의 특징들은 첨부된 도면을 참조하여 취해진, 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1은 결정 패턴 1의 X-선 분말 회절도이다.
도 2는 (a) 동적 증기 흡착(DVS) 후 CHP의 패턴 1 및 (b) 패턴 2에 대한 XRPD의 비교이다. 이러한 결과는 제조된 CHP 물질이 패턴 2(즉, CHP 수화물)이고, 패턴 1이 DVS 후 패턴 2로 변화되었음을 입증한다.
도 3은 40% RH에서의 DVS 전 및 DVS 후 패턴 2의 X-선 분말 회절도의 비교이다.
도 4는 VT-DVS 후 패턴 2의 X-선 분말 회절도의 분석이다. 물질이 패턴 1 및 2의 혼합물임을 보여준다.
도 5는 7일 동안 3개 조건 하에서 보관된 약 30 mg의 패턴 2에 대한 X-선 분말 회절도의 비교이다: 40℃/75% RH, 80℃, 및 주변광.
도 6은 유리 바이알에서 칭량하고, 50℃로 설정된 진공 오븐 안에 1시간 동안 넣어둔 약 2.2 g의 CHP 수화물(패턴 2)에 대한 XRPD 분석이다.
도 7은 진공 오븐에 추가 30분 동안 다시 넣어둔 CHP 수화물 또는 패턴 2(파란색 선: 도 5로부터의 샘플)의 XRPD 분석이다. 즉, 도 7의 자주색 선은 CHP 수화물(패턴 2 물질)을 진공 하에서 50℃로 1.5시간 동안 보관한 후 생성물의 XRPD를 분석한 것으로, 일부 패턴 1이 혼합된 대부분의 패턴 2를 보여준다.
도 8은 온도가 80℃로 증가된 오븐에 다시 넣어둔 CHP 수화물 또는 패턴 2(파란색 선: 도 5로부터의 샘플)의 XRPD 분석이다. 바이알을 추가로 18시간 동안 오븐 안에 넣어 두었다. 즉, 도 8의 분홍색 선은 CHP 수화물(패턴 2 물질)을 80℃에서 18시간 동안 보관한 후 생성물의 XRPD를 분석한 것으로, 일부 패턴 2가 혼합된 대부분의 패턴 1을 보여준다.
도 9는 다른 온도에서의 패턴 2의 변화 비교이다. 이것은 3개의 다른 기간 동안 건조되고, 그 결과가 XRPD로 분석된 도 5-7로부터의 샘플에 대한 생성물 XRPD 분석의 오버레이이다. 녹색 선은 50℃로 1시간 동안 보관된 패턴 2 샘플을 나타내고, 자주색 선은 50℃로 90분 동안 보관된 패턴 2 샘플을 나타내며, 분홍색 선은 80℃로 18시간 동안 보관된 패턴 2 샘플을 나타낸다 (분홍색 선).
도 10은 공급된 물질(대부분 패턴 1)의 초기 분석을 나타낸다. pKa 값은 6.4이다.
도 11은 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 비-편광 현미경 분석을 나타낸다.
도 12는 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 편광 광학 현미경검사 분석을 나타낸다.
도 13은 패턴 2의 비-편광 현미경 및 PLM 분석을 나타낸다.
도 14는 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 열중량 분석을 나타낸다.
도 15는 패턴 2의 열중량 분석/시차 열 분석 (TG/DTA)을 나타낸다.
도 16은 제1 열 사이클에서 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 DSC 분석을 나타낸다.
도 17은 냉각 사이클에서 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 DSC 분석을 나타낸다.
도 18은 제2 열 사이클에서 공급된 CHP (대부분 패턴 1)의 DSC 분석을 나타낸다.
도 19는 제1 열 사이클에서 패턴 2의 DSC 분석을 나타낸다.
도 20은 냉각 사이클에서 패턴 2의 DSC 분석을 나타낸다.
도 21은 제2 열 사이클에서 패턴 2의 DSC 분석을 나타낸다.
도 22는 CHP 수화물의 FR-IR 분광법의 결과를 나타낸다.
도 23은 60% RH 및 90% RH 사이에서 6.3% 중량 증가를 보이는 패턴 1의 DVS 등온선 플롯의 결과를 나타낸다.
도 24는 0-90% RH 사이에서 0.8%의 중량 증가로 약간의 흡습성을 보이는 제1 열 사이클에서 재결정화 후 패턴 1의 DVS 등온선 플롯의 결과를 나타낸다.
도 25는 패턴 1의 DVS 동력학적 플롯(kinetic plot)의 결과를 나타낸다.
도 26은 DVS 전후 물질의 XRPD를 나타낸다. DVS 후 XRPD 분석은 패턴 2로 지정된 신규 형태를 보여준다.
도 27은 CHP 수화물, 패턴 2의 TG/DTA를 나타낸다.
도 28은 CHP 수화물, 패턴 2 물질이 40%로부터 90% RH 시 및 10%로부터 90% RH 시 변화되지 않았음을 보여주는 DVS 등온선 플롯이다.
도 29는 CHP 수화물, 패턴 2의 DVS 동력학적 플롯을 나타낸다.
도 30은 CHP 수화물, 패턴 2를 40℃로 단일 사이클을 수행한 후 VT-DVS 분석으로서, 물질이 10% 미만에서 탈수되기 시작하여 5.8%의 중량(0.8 몰의 물에 해당함)이 손실되었음을 보여준다. 상기 물질은 0-40% RH에서 재수화되었다.
도 31은 CHP 수화물, 패턴 2를 50℃로 단일 사이클을 수행한 후 VT-DVS 분석으로서, 물질이 20% 미만에서 탈수되기 시작하여 6.1%의 중량(0.8 몰의 물에 해당함)이 손실되었음을 보여준다. 상기 물질은 0-40% RH에서 재수화되었다.
도 32는 CHP 수화물, 패턴 2를 60℃로 단일 사이클을 수행한 후 VT-DVS 분석으로서, 물질이 20% 미만에서 탈수되기 시작하여 7%의 중량(1.0 몰의 물에 해당함)이 손실되었음을 보여준다. 상기 물질은 0-40% RH에서 재수화되었다.
도 33은 CHP 수화물, 패턴 2 및 패턴 1의 VT-/VH-XRPD 분석 결과를 나타낸다.
도 34는 VT/DVS의 다양한 조건 후 CHP 수화물, 패턴 2 물질의 XRPD 회절도를 나타낸다. 패턴 1의 XRPD 회절도는 비교를 위해 제공된다.
도 35는 DMSO-d6 중 패턴 1의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 36은 DMSO-d6 중 패턴 2의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 37은 패턴 1 (파란색 선) 및 패턴 2 (빨간색 선)의 1H-NMR 스펙트럼 비교를 나타낸다.
도 38은 패턴 1의 HSQC-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 39는 패턴 1 및 2 혼합물의 HSQC-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 40은 패턴 1의 초기 동결건조 후 XRPD를 나타낸다.
도 41은 패턴 1의 장기간 동결건조 (72시간) 후의 XRPD를 나타낸 것으로, 동결건조로부터 회수된 물질은 XRPD에 의하면 대부분 무정형이었다.
도 42는 패턴 2의 초기 동결건조(72시간 건조) 후의 XRPD를 나타낸 것으로, 동결건조로부터 회수된 물질이 72시간 건조 후 패턴 2로 밝혀졌다.
도 43은 다양한 용매에서 패턴 1의 대략적인 용해도를 나타낸다.
도 44는 첨가된 용매의 부피를 기준으로 패턴 1의 용매 용해도 결과를 나타낸다.
도 45는 패턴 1이 다양한 용매로 처리되었을 때의 다형체 (패턴 1 또는 패턴 2)를 나타낸다.
도 46은 1차 다형체 스크리닝 용매를 나타낸다.
도 47은 다양한 용매-파트 1에서 형성된 다형체의 XRPD 회절도를 나타낸다.
도 48은 다양한 용매-파트 2에서 형성된 다형체의 XRPD 회절도를 나타낸다.
도 49는 다양한 용매-파트 3에서 형성된 다형체의 XRPD 회절도를 나타낸다.
도 50은 1차 다형체 선별 온도 사이클링을 나타낸다.
도 51은 패턴 1 (파란색) 및 패턴 2 (빨간색)에 대한 XRPD 회절도의 중첩이다.
도 52는 대표적인 블랭크(blank) 크로마토그램이다.
도 53은 대표적인 분별 용액 크로마토그램이다.
도 54는 CHP 무수물 (패턴 1) 및 CHP 수화물 (패턴 2) 간의 총 불순물에 대한 비교이다.
도 55는 [C11H14N4O2]H+에 상응하는, 235.1의 예상된 m/z가 확인되는 패턴 1 및 패턴 2의 LC-MS 스펙트럼이다. 용매에서 "고체 형태" 또는 다형체가 존재하지 않을 것이기 때문에 두 패턴은 일단 용매 (물)에 용해되면 동일한 LC-MS를 제공한다. LC-MS는 고체 형태가 아닌, 가용화된 CHP를 측정한다.
도 56은 공급된 CHP의 HPLC-UV 크로마토그램이다. 공급된 CHP가 99.5% 순수한 것임을 보여준다.
도 57은 용매 용해도 선별에서 회수된 고체에 대한 예시 XRPD 회절도이다.
도 58-60은 온도 사이클링으로부터 회수된 고체에 대한 XRPD 회절도이다.
도 61은 패턴 2의 XRPD 회절도 패턴이다.
도 62는 물에서 CHP의 반복 동결건조로부터 수득된 XRPD 회절도이다.
도 63은 물에서 CHP의 제3 동결건조 시도로부터 수득된 XRPD 회절도이다.
도 64-66은 1차 다형체 선별에서 온도 사이클링 실험과 관련된 회절도이다.
도 67은 1차 다형체 선별에서 증발 실험과 관련된 회절도이다.
도 68은 1차 다형체 선별에서 반-용매(anti-solvent) 첨가와 관련된 회절도이다.
도 69는 패턴 2 스케일업(scale-up)의 XRPD 결과이다.
도 70은 패턴 2 물질을 80℃로 가열하였을 때 수득된 물질의 XRPD 회절도이다.
도 71은 에탄올/DCM 실험에서 급속 회전 증발 중 회수된 고체에 대한 XRPD 회절도이다.
도 72는 패턴 2의 1차 다형체 선별의 XRPD 회절도이다.
도 73은 패턴 2의 편광 및 비-편광 광학 이미지이다.
도 74는 CHP 패턴 2의 핫 스테이지 현미경검사이다.
도 75는 핫 스테이지 후 물질의 편광 및 비-편광 이미지이다.
도 76은 패턴 2의 TG/DTA - TG 분석이다.
도 77은 99℃의 개시 및 102℃에서의 피크를 갖는 흡열 이벤트가 확인된 DSC의 초기 열 사이클이다.
도 78은 DSC의 냉각 사이클이다.
도 79는 DSC의 제2 열 사이클이다.
도 80은 CHP 패턴 2의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 81은 VT-/VH-XRPD 분석과 관련된 회절도이다.
도 82는 CHP 패턴 2의 DVS 등온선 플롯이다.
도 83은 CHP 패턴 2의 DVS 동력학적 플롯이다.
도 84는 비교 XRPD 회절도를 나타낸다.
도 85는 40℃에서 패턴 2의 DVS 등온선 플롯이다.
도 86은 40℃에서 패턴 2의 동력학적 플롯이다.
도 87은 50℃에서 패턴 2의 등온선 플롯이다.
도 88은 40℃에서 패턴 2의 동력학적 플롯이다.
도 89는 60℃에서 패턴 2의 등온선 플롯이다.
도 90은 60℃에서 패턴 2의 동력학적 플롯이다.
도 91은 비교 XRPD 회절도를 나타낸다.
도 92는 용해 후 패턴 1 샘플의 이미지를 나타낸다.
도 93은 용해 후 패턴 2 샘플의 이미지를 나타낸다.
도 94는 40℃/75% RH, 80℃ 및 주변광에서 테스트된 샘플에 대한 XRPD 2θ 회절도이다.
도 95는 안정성 샘플에 대한 HPLC 크로마토그램 중 하나이다. 이는 40℃/75% RH에서의 1주 안정성이다.
도 96은 안정성 샘플에 대한 HPLC 크로마토그램 중 하나이다. 이는 80℃에서의 1주 안정성이다.
도 97은 안정성 샘플에 대한 HPLC 크로마토그램 중 하나이다. 이는 주변 온도에서의 1주 안정성이다.
도 98은 순수한 패턴 1에 대한 2주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 99는 패턴 2에 대한 2주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 100은 순수한 패턴 1에 대한 4주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 101은 패턴 2에 대한 4주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 102는 순수한 패턴 1에 대한 8주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 103은 패턴 2에 대한 8주 시점의 XRPD 2θ 회절도이다.
도 104는 순수한 패턴 1의 HPLC 크로마토그램이다 - 초기 시점.
도 105는 순수한 패턴 1의 HPLC 크로마토그램이다 - 2주.
도 106은 순수한 패턴 1의 HPLC 크로마토그램이다 - 4주.
도 107은 순수한 패턴 1의 HPLC 크로마토그램이다 - 8주.
도 108은 순수한 패턴 2의 HPLC 크로마토그램이다 - 초기 시점.
도 109는 순수한 패턴 2의 HPLC 크로마토그램이다 - 2주.
도 110은 순수한 패턴 2의 HPLC 크로마토그램이다 - 4주.
도 111은 40℃/75%RH에서의 보관으로부터 얻은 XRPD 결과이다.
도 112는 불순물 테스트에 대한 블랭크, 분별 용액 및 샘플 용액 (6 M)의 대표적인 중첩 크로마토그램이다.
도 113은 1차 다형체 선별 증발이다.
도 114는 1차 다형체 선별 요약표이다.
도 115는 8주간의 안정성 외관 결과 요약이다.
다양한 측면 및 구현예가 이제 본원에서 충분히 기술될 것이다. 그러나, 이러한 측면 및 구현예는 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다: 오히려, 이러한 구현예는 본 개시가 철저하고 완전해지며, 본 발명 대상의 범위를 당업자에게 충분히 전달하도록 제공된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 앞이든 뒤이든 상관없이, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 구절은 반대가 명확하게 지시되거나, 용어 또는 구절이 사용된 문맥에서 명확하게 분명하지 않는 한, 그 용어 및 문구가 당업계에서 획득한 의미를 포함한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 그와 대등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 물질이 하기에 기술된다.
달리 명시되지 않는 한, 개별 수치의 사용은 값 앞에 "약" 또는 "대략"이라는 단어가 선행되는 바와 같이 근사치인 것으로 기술된다. 유사하게, 달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 지정된 다양한 범위의 수치는 명시된 범위 내의 최소값과 최대값이 모두 앞에 "약" 또는 "대략"이라는 단어가 선행되는 바와 같이 근사치로 기술된다. 이러한 방식으로, 기술된 범위의 상한 및 하한의 변화는 범위 내의 값과 실질적으로 동일한 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 수치를 지칭할 때 "약" 및 "대략"이라는 용어는 개시된 대상이 가장 밀접하게 관련되거나 문제가 되는 범위 또는 요소와 관련된 기술 분야의 통상의 기술자에게 평범하고 일반적인 의미를 갖는다. 엄격한 숫자 경계에서 확장되는 정도는 여러 요인에 따라 달라진다. 예를 들어, 고려될 수 있는 일부 요소는 요소의 중요도 및/또는 주어진 변동량이 청구된 대상의 성능에 미칠 영향, 뿐만 아니라 당업자에게 알려진 다른 고려 사항을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 상이한 수치에 대해 상이한 양의 유효 자릿수의 사용은 "약" 또는 "대략"이라는 단어의 사용이 특정 수치 또는 범위를 확장하도록 기능하는 방식을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 일반적으로 "약" 또는 "대략"으로 수치를 확장한다. 또한, 범위의 개시는 최소값 및 최대값 사이의 모든 값 뿐만 아니라 "약" 또는 "대략"이라는 용어의 사용에 의해 제공되는 범위의 확장을 포함하는 연속적인 범위로 의도된다. 따라서, 본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로 기능하는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용되는 것처럼 본 명세서에 포함된다.
용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 당업계에서 인식되어 있고, 일반적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 지칭하며, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성제" 또는 "약물"은 인간 또는 동물에게 투여될 때 생화학적 반응을 유발하는 임의의 화학 물질을 지칭한다. 약물은 생화학적 반응의 기질 또는 생성물로 작용할 수 있거나, 약물이 세포 수용체와 상호작용하여 생리학적 반응을 유도할 수 있거나, 약물이 수용체와 결합하여 생리학적 반응을 유도하는 것을 차단할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적동등성(bioequivalent)"은 AUC, 부분 AUC 및/또는 Cmax에 대한 90% 신뢰구간(CI)이 0.80 내지 1.25 사이인 2개의 조성물, 생성물 또는 방법을 지칭한다.
용어 "CHP 수화물"("패턴 2"라고도 함)는 2019년 1월 7일에 발행된 CAS 등록번호: 2254826-95-2로 식별되는 화합물을 의미한다.
문구 "실질적으로 순수한"은 90% 초과, 또는 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 99.5% 초과의 총 순도를 갖는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 문구 "실질적으로 순수한 물질 A"는 물질 A가 모든 불순물에 대해 적어도 90% 순수하거나, 물질 A가 모든 불순물에 대해 적어도 95% 순수하거나, 물질 A가 모든 불순물에 대해 적어도 98% 순수하거나, 물질 A가 모든 불순물에 대해 적어도 99% 순수한 것을 의미한다.
일 구현예에서, 샘플의 순도는 임의의 분석 방법으로 측정된다. 일 구현예에서, 순도는 HPLC, X-선 분말 회절 (XRPD), pKa 분석, 편광 광학 현미경검사 (PLM), 열중량 분석/시차 열 분석 (TG/DTA), 시차 주사 열량측정 (DSC), 푸리에-변환 적외선 분광법 (FT-IR), 동적 증기 흡착 (DVS), 가변 온도 및 습도 X-선 분말 회절법 (VT-/VH-XRPD), 1H 핵자기 공명 (NMR), 및/또는 이핵 단일 양자 코히어런스(HSQC) NMR로 측정된다.
일부 구현예에서, X-선 분말 회절 패턴 또는 시차 주사 열량 측정 패턴을 지칭할 때 "실질적으로 나타낸 바와 같이"라는 용어는 본원에 묘사된 것과 반드시 동일하지는 않지만, 당업자에 의해 고려될 때 실험적 오류 또는 편차의 한계 내에 속하는 패턴을 의미한다.
용어 "치료학적 유효량"은 하기 정의된 바와 같이, 이러한 치료를 필요로하는 인간에게 투여될 때 치료에 영향을 미치기에 충분한 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 치료되는 인간 대상체, 인간 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
B. 개요
본 개시는 신규 화합물 CHP 수화물, 그 용도 및 이의 제조에 관한 것이다. 이는 하기에 설명된다:
Figure pct00001
2019년 1월 7일자에, CHP 수화물은 CAS 등록번호 (CAS RN): 2254826-95-2가 지정되었으며, CA 인덱스명: 피롤로[1,2-a]피라진-1,4-디온, 헥사히드로-3-(1H-이미다졸-5-일메틸)-, 수화물 (1:1), (3S, 8aS)-를 가진다. CHP 수화물은 252.3 g/mol의 분자량을 갖는다.
당업자는 화합물 구조가 다른 일반적으로 인정되는 명명법 시스템 및 기호를 사용하여 명명되거나 식별될 수 있음을 이해한다. 예로서, 화합물은 일반적인 명칭, 체계적 또는 비체계적 명칭으로 명명되거나 식별될 수 있다. 명명법 시스템 및 기호는 이에 제한되지는 않으나, CAS(Chemical Abstract Service) 및 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)를 포함한 화학 분야에서 일반적으로 인정되는 것이다. 따라서, CAS에 따라 피롤로[1,2-a]피라진-1,4-디온, 헥사히드로-3-(1H-이미다졸-5-일메틸)-, 수화물 (1:1), (3S, 8aS)-로 식별된 상기 제공된 화합물 구조는 CAS 명칭과 동등한 다른 명칭으로 식별될 수 있다.
C. CHP 수화물의 일반적인 특성 분석
일 구현예에서, CHP 수화물은 약 13.7도 2θ, 17도 2θ, 및 약 27.3도 2θ에서 특징적인 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(XRPD)을 가진다. 일부 구현예에서, X-선 분말 회절 패턴은 약 10도 2θ, 약 13.7도 2θ, 약 17도 2θ, 약 18.1도 2θ, 및 24.5도 2θ에서 임의의 하나 이상의 특징적인 피크를 더 포함한다.
일부 구현예에서, CHP 수화물은 약 170℃ 내지 약 172℃의 용융 온도를 가진다. 하나의 변형에서, CHP 수화물은 약 10도 2θ, 약 13.7도 2θ, 약 17도 2θ, 약 18.1도 2θ, 약 20.2도 2θ, 및 약 27.3도 2θ에서 임의의 하나 이상의 특징적인 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가진다.
상대적 XRPD 강도는 샘플 준비, 장착, 및 기기 그리고 스펙트럼을 수득하는데 사용되는 분석 과정 및 설정을 포함한, 여러 요인에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 이와 같이, 본원에 나열된 피크 지정은 ±0.2도 2θ의 변동을 포함하도록 의도된다.
다른 구현예에서, CHP 수화물은 약 170℃에서 시차 주사 열량측정에 의해 결정된 바와 같은 용융 온도 개시를 갖는 것을 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, CHP 수화물에는 실질적으로 용매가 없다.
CHP 수화물의 일부 구현예에서, 하기 (a)-(f) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모두가 적용된다: (a) CHP 수화물은 실질적으로 용매가 없으며; (b) CHP 수화물은 결정성이고; (c) CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 나타낸 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴을 가지며; (d) CHP 수화물은 실질적으로 도 19 - 도 21에 나타낸 바와 같은 시차 주사 열량측정 써모그램을 갖고; (e) CHP 수화물은 약 170℃에서 시차 주사 열량측정으로 결정된 바와 같은 용융 온도 개시를 가지며; (f) CHP 수화물은 실온 보관 조건에서 안정하다.
일부 구현예에서, CHP 수화물은 하기 특성 중 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모두를 포함한다:
(a) 실질적으로 도 2(b)에 나타낸 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴;
(b) 실질적으로 도 19-21에 나타낸 바와 같은 시차 주사 열량측정 써모그램; 및
(c) 약 170℃에서 시차 주사 열량측정으로 결정된 바와 같은 용융 온도 개시.
일부 구현예에서, CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 도시된 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴으로서 가장 큰 피크 중 적어도 2개를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는다. 일부 구현예에서, CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 도시된 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴으로서 가장 큰 피크 중 적어도 3개를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는다. 일부 구현예에서, CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 도시된 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴으로서 가장 큰 피크 중 적어도 4개를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는다. 일부 구현예에서, CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 도시된 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴으로서 가장 큰 피크 중 적어도 5개를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는다. 일부 구현예에서, CHP 수화물은 실질적으로 도 2(b)에 도시된 바와 같은 X-선 분말 회절 패턴으로서 가장 큰 피크 중 적어도 6개를 나타내는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는다.
D. 약학적 조성물
일 구현예에서, 실질적으로 순수한 패턴 2 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 약학적 조성물 총량에 대하여 실질적으로 순수한 패턴 2 화합물을 약 1 내지 약 20 퍼센트 (중량%) (즉, 약 1 퍼센트, 약 2 퍼센트, 약 3 퍼센트, 약 4 퍼센트, 약 5 퍼센트, 약 6 퍼센트, 약 7 퍼센트, 약 8 퍼센트, 약 9 퍼센트, 약 10 퍼센트, 약 11 퍼센트, 약 12 퍼센트, 약 13 퍼센트, 약 14 퍼센트, 약 15 퍼센트, 약 16 퍼센트, 약 17 퍼센트, 약 18 퍼센트, 약 19 퍼센트, 약 20 퍼센트)로 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 약학적 조성물은 약학적 조성물 총량에 대하여 패턴 2 화합물을 약 1 내지 약 100 퍼센트, 약 1 내지 약 10 퍼센트, 약 10 내지 약 20 퍼센트, 약 20 내지 약 30 퍼센트, 약 30 내지 약 40 퍼센트, 약 40 내지 약 50 퍼센트, 약 50 내지 약 60 퍼센트, 약 60 내지 약 70 퍼센트, 약 70 내지 약 80 퍼센트, 약 80 내지 약 90 퍼센트, 약 90 내지 약 100 퍼센트 (중량%)로 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 약학적 조성물 총량에 대하여 패턴 2 화합물을 약 1 내지 약 40 퍼센트 (중량%)로 포함할 수 있다. 특정 예에서, 약학적 조성물은 약학적 조성물 총량에 대하여 패턴 2 화합물을 약 4 퍼센트 (중량%)로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 패턴 2 화합물, 다른 치료적 활성제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 활성제는 생체분자, 생물 활성제, 소분자, 약물, 전구약물, 약물 유도체, 단백질, 펩티드, 백신, 보조제(adjuvant), 영상화제(예를 들어, 형광 모이어티), 폴리뉴클레오티드 또는 금속으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 활성제는 아연이다.
일 구현예에서, 패턴 2 약물 물질은 CHP의 불순물 수준에 대한 ICH 순도 가이드라인 Q.2A를 충족한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구, 국소, 비경구, 정맥내, 피내, 결장내, 직장내, 근육내 또는 복강내를 포함하는 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 앰플 또는 선택적 보존제가 첨가되어 있는 다중-용량 용기에 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리, 플라스틱 등으로 만들어진 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다. 제형은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
예를 들어, 비경구 제제는 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 0.9% 생리식염수 또는 기타 적합한 수성 매질이 있다.
일 구현예에서, 정맥내 "용액" 제형의 농도는 약 1 mg/리터 내지 약 200 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 150 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다. 다른 구현예에서, 정맥내 "용액" 제형의 농도는 약 1 mg/리터, 약 2 mg/리터, 약 3 mg/리터, 약 4 mg/리터, 약 5 mg/리터, 약 6 mg/리터, 약 7 mg/리터, 약 8 mg/리터, 약 9 mg/리터, 약 10 mg/리터, 약 11 mg/리터, 약 12 mg/리터, 약 13 mg/리터, 약 14 mg/리터, 약 15 mg/리터, 약 20 mg/리터, 약 25 mg/리터, 약 30 mg/리터, 약 35 mg/리터, 약 40 mg/리터, 약 45 mg/리터, 약 50 mg/리터, 약 55 mg/리터, 약 60 mg/리터, 약 65 mg/리터, 약 70 mg/리터, 약 75 mg/리터, 약 80 mg/리터, 약 85 mg/리터, 약 90 mg/리터, 약 95 mg/리터, 약 100 mg/리터, 약 110 mg/리터, 약 120 mg/리터, 약 130 mg/리터, 약 140 mg/리터, 약 150 mg/리터, 약 160 mg/리터, 약 170 mg/리터, 약 180 mg/리터, 약 190 mg/리터, 또는 약 200 mg/리터이다.
다른 구현예에서, 조성물은 확산 (슬로우 드립) 제형 또는 정맥내 볼루스 주사로 제형화될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 패턴 2 화합물은 경구로 투여되거나 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 투여는 즉시 방출형 정제 및 캡슐 또는 장용피복정 등을 통해 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제조함에 있어서, 활성 성분은 일반적으로 부형제에 의해 희석되고/되거나 캡슐, 사쉐, 페이퍼 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 담체 내에 봉입된다. 부형제가 희석제로서 역할을 하는 경우, 이는 활성 성분에 대해 비히클, 담체 또는 매질로서 작용하는 고체, 반고체 또는 액체 물질의 형태일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제, 환제, 분말, 로젠지, 사쉐, 카쉐, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서의 에어로졸 또는 액체 매질 중의 에어로졸), 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사가능한 용액 및 멸균 포장된 분말의 형태일 수 있다.
적합한 부형제의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알지네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미결정 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, USP 또는 멸균수, 시럽베이스 및 메틸 셀룰로오스를 포함한다. 제형은 다음을 추가적으로 포함할 수 있다: 윤활제, 예컨대 활석, 스테아린산 마그네슘, 스테아르산; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 보존제, 예컨대 메틸 및 프로필하이드록시-벤조에이트; 감미제; 및 향미제.
일부 구현예에서, 조성물은 단위 투여 형태로 제형화된다. 용어 "단위 투여 형태"는 인간 대상체 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정 양의 활성 물질 (치료학적 유효량)을 함유한다 (예를 들어, 정제, 캡슐, 앰플). 화합물은 일반적으로 약학적 유효량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 각 투여 단위는 약 1 mg 내지 약 100 mg의 패턴 2 화합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 각 투여 단위는 약 2 mg 내지 약 60 mg, 약 3 mg 내지 약 50 mg, 약 4 mg 내지 약 40 mg, 약 5 mg 내지 약 30 mg, 약 6 mg 내지 약 20 mg, 약 8 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 8 mg 내지 약 10 mg의 패턴 2 화합물을 함유한다.
다른 구현예에서, 각 투여 단위는 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg, 약 11 mg, 약 12 mg, 약 13 mg, 약 14 mg, 약 15 mg, 약 16 mg, 약 17 mg, 약 18 mg, 약 19 mg, 약 20 mg, 약 30 mg, 약 40 mg, 약 50 mg, 약 60 mg, 약 70 mg, 약 80 mg, 약 90 mg, 또는 약 100 mg의 패턴 2 화합물을 함유한다.
일 구현예에서, 대상체는 하루에 하나 이상의 투여 단위를 투여받는다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 하루에 15 mg의 패턴 2 화합물을 투여받는다.
고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 활성 주요 성분은 약학적 부형제와 혼합되어 본 개시의 화합물의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 혼합-블렌드(blend) 조성물을 형성한다. 이들 혼합-블렌드 조성물을 균질한 것으로 지칭하는 경우에, 조성물이 동등하게 유효한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산된다는 것을 의미한다.
본 개시의 정제 또는 환제는 장기적 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공하거나, 위의 산성 조건으로부터 보호하기 위해 분말-코팅되거나 또는 달리 배합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 후자가 전자 상의 외피의 형태로 포함할 수 있다. 상기 두 성분은 위에서의 붕해에 저항하고 내부 성분이 온전히 십이지장으로 통과하거나 또는 방출이 지연될 수 있게 역할하는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체산 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다. 일 구현예에서, 필름 코팅은 폴리비닐 알코올-기반 코팅이다.
본 조성물 및 방법에 유용한 화합물은, 해당하는 경우, 본원에 기술된 화합물의 이성질체, 예컨대 부분입체 이성질체 및 거울상 이성질체, 염, 용매화물, 및 다형체, 뿐만 아니라 라세미 혼합물 및 순수한 이성질체를 포함하여, 임의의 이들의 약학적으로 허용가능한 형태의 본원에 기술된 화합물을 포함한다.
적합한 부형제는 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 항산화제, 킬레이트제 및 착색제를 포함한다.
표 1은 하기를 포함하는 경구 투여 형태를 위한 예시적인 제형을 제공한다 (기술된 성분의 중량%를 기준으로 함):
표 1: 하기를 포함하는 경구 투여 형태용 예시적인 제형 (명시된 성분의 중량% 기준).
Figure pct00002
E. CHP 수화물의 제조
일부 구현예에서, CHP 수화물은 결정화에 의해 수득된다. CHP 무수물을 50℃에서 2 - 2.5 v의 EtOH/물 또는 아세톤/물에 용해시킨 후 시스템을 35℃로 냉각시켰다. 그 다음에, 0.5 v의 메틸 tert-부틸 에테르(MtBE)를 첨가한 후 0.5% 시드 (CHP 수화물)를 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 시스템을 2시간 내에 5℃로 냉각시켰다. 마지막으로, 7 v의 MtBE를 8시간 내에 첨가한 후 8시간 동안 교반하였다.
CHP 패턴 1의 배치(batch)에 대해 수행된 용해도 평가는 가장 높은 퍼센티지의 MtBE를 포함한 에탄올: 물: MtBE 블렌드를 제외하고 물을 함유하는 모든 용매 혼합물에서 높은 용해도를 나타내었다. 특히 높은 용해도는 물 및 물: 아세톤 블렌드에서 관찰되었다. 상기 물질은 아세톤, 아세토니트릴 및 THF (≤10 mg/mL)에서 용해도가 불량하다. 2-시점(two-point) 용해도 실험은, 평가된 2개의 용매 시스템 (에탄올: 물: MtBE 및 아세톤: 물) 중에서, 에탄올: 물: MtBE가 약간 더 나은 수율을 허용하였으나, 패턴 1 형성의 우려가 있었고; 반면 아세톤: 물은 패턴 2 배타성을 허용하였지만 수율 감소의 우려가 있었음을 나타내었다.
두 세트의 소규모 결정화 시험 (500 mg 규모)을 CHP 패턴 1을 사용하여 수행하였다. 제1 세트는 아세톤: 물 용매 시스템을 사용하고, 제2 세트는 에탄올: 물: MtBE 용매 시스템을 사용하였다. 반-용매 첨가는 5℃ 또는 50℃에서 수행되었다. 패턴 2는 용매 시스템 또는 반-용매 첨가 온도에 상관없이 XRPD에 의해 전적으로 회수되었다. 에탄올: 물/MtBE는 특히 고체가 더 높은 온도 (50℃)에서 분리될 때 더 큰 입자를 생성하였다. (특히 에탄올: 물: MtBE에서) 증발로 인한 용매 손실은 여과 후 회수된 고체의 질량에 비해 훨씬 낮은 계산된 수율을 초래하였다.
이러한 결정화 개발 연구는 양호한 수율 및 입자 균일성을 얻는 것을 목표로 냉각 및 반-용매 첨가 프로토콜의 조합을 탐구하였다. 이러한 연구는 20 g 규모에서, 2% 분쇄한 시드 로딩, 단계적 반-용매 첨가, 29℃에서 8시간 유지 기간의 사용 후 5℃로 냉각이 (광학 현미경검사 및 FBRM으로 평가된) 입자 균일성 및 수율과 관련하여 가장 유망한 프로토콜인 것으로 입증됨을 나타내었다.
F. X-선 분말 회절 (XRPD)
일 구현예에서, 본 개시는 하기의 실질적으로 순수한 사이클로(-히스-프로) 수화물(패턴 2) 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00003
약 17 및 약 27.3도 (±0.2°의 2θ)에서의 피크를 포함하는 XRPD 회절도를 특징으로 한다.
실질적으로 순수한 패턴 2의 일 구현예는 다음 목록에서 선택된 적어도 3개의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절도를 특징으로 한다: 13.7, 17, 18.1, 20.2 및 27.3도 (±0.2°의 2θ). 다른 구현예는 다음 목록에서 선택된 적어도 2개의 피크를 포함하는 XRPD 회절도를 특징으로 한다: 10, 13.7, 17, 18.1, 20.2 및 27.3도 (±0.2°의 2θ).
G. 핵자기 공명 (NMR) 또는 13 CSSNMR
일 구현예에서, 패턴 2의 1H NMR 스펙트럼은 하기의 화학적 이동을 나타낸다: 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 7.58 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 4.42 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.36-3.47 (m, 2H), 3.05 - 3.09 (m, 2H), 2.12 (br, 1H), 1.80 - 1.84 (m, 2H), 1.37 - 1.40 (m, 1H).
일 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 DMSO-d6 용매에서 CHP-무수와 본질적으로 동일한 1H-NMR을 나타낸다. 이는 하기 값을 포함한다: 1.7 ppm (m, 3H), 2.1 ppm (m, 1H), 2.5 ppm (s, 3H), 3.2 ppm (d, 1H), 3.5 ppm (m, 1H), 4.2 ppm (m, 2H), 7.0 ppm (s, 1H), 7.6 ppm (s, 1H), 8.1 ppm (s, 1H).
H. 고체 적외선 분광법
일 구현예에서, 패턴 2의 고체 적외선 스펙트럼은 3457, 3411 (m); 3292, 321l(m); 2976; 1658; 1633 (m); 및 1445-1424 (m) cm-1에서 신호를 나타낸다.
I. 시차 주사 열량측정 (DSC)
다른 구현예에서, 패턴 2의 개시 흡열이 약 100±2℃ 및 171±2℃로 밝혀졌다. 다른 구현예에서, 본 개시의 패턴 2 (CHP 수화물)는 약 75℃ 내지 약 100℃에서 흡열 개시를 나타낸다.
J. 동적 증기 흡착 (DVS)
또 다른 구현예에서, 패턴 2의 동적 증기 흡착은 하기 중 하나 이상을 보여준다:
- 40℃에서 10% RH 미만 시 탈수, 6±0.2 중량% 손실, 및 0%로부터 40% RH 시 재수화;
- 50℃에서 20% RH 미만 시 탈수, 6±0.2 중량% 손실, 및 0%로부터 40% RH 시 재수화; 및
- 60℃에서 20% RH 미만 시 탈수, 7±0.2 중량% 손실, 및 0%로부터 40% RH 시 재수화.
다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 4% 내지 약 8.5%, 또는 약 5% 내지 약 8%의 중량 손실을 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 5.5 내지 약 7.3%의 중량 손실을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 5.8 내지 약 7.0%의 중량 손실을 나타낸다.
K. 열중량 분석(TGA)
다른 구현예에서, 패턴 2의 TGA는 분해 전 6±0.5% 중량 손실을 보여준다.
다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 75-85℃에서 적어도 하나의 흡열 이벤트를 나타내며, 이는 물의 손실이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 115 내지 약 120℃에서 적어도 하나의 발열 이벤트를 나타내며, 이는 패턴 1으로의 재결정화 이벤트이다.
L. 용융 온도
다른 구현예에서, 패턴 2의 용융 온도는 170±2℃이다.
M. 준안정 영역 폭(MSZW)의 측정
또 다른 구현예에서, 0% MtBE에서의 침전 결여는 반-용매 첨가가 결정화가 일어나는데 필요함을 나타내었다. 10% MtBE에서, 약 43.2℃의 준안정 영역 폭이 관찰되었다. 20% MtBE에서, CHP는 출발 농도가 >100 mg/mL가 될 때까지 용액 중에 남아 있었다. 325 및 425 mg/mL 실험을 위한 준안정 영역 폭은 각각 약 35.2 및 약 30.7℃인 것으로 결정되었다. MtBE 함량을 30% v/v로 증가시키면, (325 mg/mL에서) 약 30±0.5℃의 MSZW가 제공되었다. 또한, 60% MtBE에서, MSZW는 (100 mg/mL에서) 51.4℃이었다. 80% MtBE에서, 100 mg/mL 및 425 mg/mL 농도로 준비된 샘플은 더 높은 온도에서도 실험 기간 내내 슬러리로 남아 있었다. 준안정 영역 폭 분석 전체에 걸쳐, 약 56 - 61℃의 온도가 투명점을 얻기 위해 요구되는 경향이 주목되었다.
P. 치료 방법
본 개시의 패턴 2 화합물은 다양한 질환 및 장애, 예컨대 당뇨병 및 기타 대사 질환, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 급성 신손상(AKI), 만성 신장병(CKD), 신장 섬유증을 치료하고, 산화적 손상에 대한 세포보호를 제공하며, PC12 세포주에서 염증 반응을 억제하고, 식욕 억제제로서 치료학적 유효량으로 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시의 특정 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 변형이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위의 벗어남 없이 여전히 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 제시된 모든 사항은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1 - 패턴 1 (무수 CHP)에서 패턴 2 (CHP 수화물)로의 전환
2 g 양의 패턴 1 물질 (롯트 No PS00726-55-D)을 80℃에서 1 mL 물에 용해시켰다. 상당한 양의 증발에 대응하기 위해, 1 mL의 물을 더 첨가하였다. 80℃에서, 이로 인해 맑은 암갈색 용액이 생성되었다. 그 다음, 용액을 50℃까지 급속하게 냉각시키고, 9.5 부피 (19 mL)의 아세톤을 용액에 첨가하여 연황색 용액을 수득하였다. 오일링(oiling) 또는 침전은 검출되지 않았다. 용액을 실온으로 냉각하여 현저한 양의 고체 침전물을 생성하였다. (수율을 높이기 위해) 용액을 6℃로 냉각시키고 슬러리를 여과하였다. 고체는 필터 상에서 건조하여 탈수를 방지하였다. 패턴 1로의 탈수는 진공 하에서 80℃ 이상에서 발생하기 때문에, 진공 하에서 50℃로 건조하는 것이 패턴 2를 보존하는 데 안전한 것으로 간주되었다. XRPD는 생성물이 약 72%의 수율을 갖는, 패턴 2임을 확인하였다.
CHP 수화물의 배치는 다음을 포함하는 다양한 기법으로 분석하였다: X-선 분말 회절 (XRPD), pKa 분석, 편광 광학 현미경검사 (PLM), 열중량 분석/시차 열 분석 (TG/DTA), 시차 주사 열량측정 (DSC), 푸리에-변환 적외선 분광법 (FT-IR), 동적 증기 흡착 (DVS), 가변 온도 및 습도 X-선 분말 회절법 (VT-/VH-XRPD), 1H 핵자기 공명 (NMR), 및 이핵 단일 양자 코히어런스(HSQC) NMR.
A. X-선 분말 회절 (XRPD)
XRPD 분석은 PANalytical X'pert pro 상에서, 샘플을 3 및 35° 2θ 사이에서 스캐닝하여 수행하였다. 물질을 부드럽게 분쇄하여 임의의 응집체를 풀어주고, 샘플을 지지하기 위해 Kapton 또는 Mylar 폴리머 필름이 있는 다중-웰 플레이트에 로딩하였다. 이후, 다중-웰 플레이트를 회절분석기에 넣고, 40 kV/40 mA의 발전기 설정을 사용한 전송 모드(스텝 크기 0.0130° 2θ)에서 실행되는 Cu K 방사선 (α1 λ = 1.54060 Å; α2 = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α1 : α2 비율 = 0.5)을 사용하여 분석하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 배치는 XRPD에 의하면 결정성이었고, 패턴 1로 지정되었다. XRPD 분석은 5 g의 CHP 수화물 샘플로 수행되었다. 샘플을 유리 바이알에서 칭량하고, 6 mL의 90:10 에탄올/물 혼합물을 첨가하여 슬러리를 만들었다. 이후, 혼합물을 주변 온도에서 약 24시간 동안 교반한 다음 XRPD로 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 이 물질은 패턴 2로 확인되었다(도 2(b)). 도 3에 도시된 바와 같이, DVS 후에 패턴 2의 분석은 DVS 후 40% RH에서 형태 변화가 없음을 보여주었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 분석은 다양한 온도의 DVS(VT-DVS) 후, 물질이 패턴 1 및 2의 혼합물임을 보여주었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 약 30 mg의 패턴 2 (검은색 선, 도 5)는 7일 동안 3개의 조건 하에서 보관되었다: 40℃/75% RH, 80℃, 및 주변광. XPRD 분석을 수행하여 물질 형태의 임의의 변화를 평가하였다. 7일 후에, 40℃/75% RH에서 보관된 샘플 (파란색 선, 도 5) 및 주변광에서 보관된 샘플 (녹색 선, 도 5)에서는 변화가 관찰되지 않았다. 80℃에서 보관된 샘플은 패턴 1 (빨간색 선, 도 5)로 전환되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 패턴 2 샘플 (도 7의 파란색 선)은 진공 오븐에 추가 30분 동안 다시 넣어두었다. XRPD 분석 (도 7의 자주색 선)에서는 물질이 여전히 일부 패턴 1 피크를 갖는 대부분 패턴 2임을 보여주었다.
도 6에 도시된 바와 같이, CHP 수화물 (패턴 2)를 유리 바이알에 칭량하고, 50℃로 설정된 진공 오븐 안에 1시간 동안 넣어두었다. XRPD 분석 (녹색 선)에서는 물질이 여전히 일부 패턴 1 피크를 갖는 대부분 패턴 2임을 보여주었다.
도 8에 도시된 바와 같이, 도 5로부터의 투입 물질 (검은색 선)을 온도가 80℃로 증가된 오븐에 다시 넣어두었다. 바이알을 추가로 18시간 동안 오븐 안에 넣어 두었다. XRPD 분석 (분홍색 선)은 물질이 패턴 1 및 2의 혼합물임을 보여주었다. 이전에 임의의 패턴에서는 보이지 않았던 8° 2θ에 추가 피크가 있었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 도 5로부터의 패턴 2는 3개의 다른 기간 동안 건조되었으며, 결과는 XRPD로 분석하였다. 샘플을 50℃에서 1시간 동안 건조하면 패턴 1 피크를 갖는 패턴 2 (녹색 선)가 생성되었고, 또한 샘플을 50℃에서 90분 동안 건조하면 패턴 1 피크를 갖는 패턴 2 (자주색 선)가 생성되었으며, 샘플을 80℃로 18시간 동안 건조하면 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물 (분홍색 선)이 나타났다.
도 34에는 패턴 2가 패턴 1로 변화되는 상이한 조건이 요약되어 있다. 패턴 2 (검은색 선, 도 34)의 샘플을 0% RH에서 80℃로 처리하면 (실행 2, 빨간색 선) 20분 이내에 패턴 2가 패턴 1로 전환되며 (실행 3, 파란색 선), 반면 0% RH, 주변 온도에서는 1시간 후에도 패턴 2가 남아 있었다 (빨간색 선). 패턴 2는 40% RH, 주변 온도에서 안정하다 (실행 1, 갈색 선).
B. pKa 분석
pKa 분석은 pKa 포인트를 결정하기 위한 산/염기 적정(titration)인 전위차 기법을 통해 패턴 1에 대해 수행하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 무수 CHP (패턴 1)의 분석은 pKa 값 6.4를 도출하였다.
C. 광학 현미경검사 (비-편광) 및 편광 광학 현미경검사 (PLM)
광학 현미경검사는 Motic 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어 (Motic Images Plus 2.0)가 장착된 Olympus BX50 편광 현미경에 결합된 컨트롤러 유닛이 연결되어 있는 보정된 Linkam THM600 핫 스테이지를 사용하여 시각적으로 측정하였다. 약 0.5 mg의 물질을 현미경 커버슬립에 놓고 10℃/분의 속도로 가열하면서 정례적인 간격으로 이미지 촬영하여 임의의 열 전이를 기록하였다. 모든 이미지는 달리 명시되지 않는 한, 10x 대물렌즈를 사용하여 기록되었다.
(PLM) 분석은 Motic 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어 (Motic Images Plus 2.0)가 장착된, Olympus BX50 편광 현미경을 사용하여 수행되었다. 모든 이미지는 달리 명시되지 않는 한, 20x 대물렌즈를 사용하여 기록되었다. 결정화도 (복굴절)의 존재는 PLM에 의해 결정되었다. 편광 광학 현미경은 주로 이들의 광학적 이방성 특성으로 인해 가시적인 표본을 관찰하고 촬영하도록 고안되었다.
도 11 (비-편광 현미경) 및 도 12 (편광 광학 현미경)는 공급된 CHP (대부분 패턴 1)가 명확한 모폴로지가 없는 복굴절임을 입증하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 패턴 2가 단편화된(fragmented), 막대-유사(rod-like) 모폴로지를 갖는 복굴절성인 것으로 밝혀졌다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물 (패턴 2)은 PLM 하에서 단편화된 막대-유사 모폴로지를 나타낸다.
D. 열중량 분석/시차 열 분석 (TG/DTA)
약 5 mg의 물질을 개방 알루미늄 팬에 칭량하여 Seiko 6200/7200 동시 열중량/시차 열 분석기 (TG/DTA)에 로딩하고 실온에서 유지하였다. 이후, 샘플 무게의 변화가 임의의 시차 열 이벤트 (DTA)와 함께 기록되는 시간 동안 10℃/분의 속도로 20℃에서 300℃로 샘플을 가열하였다. 질소는 300 cm3/분의 유속으로, 퍼지 가스로서 사용되었다.
도 14에 도시된 바와 같이, 패턴 1의 TGA 분석은 약 75-85℃에서 0.6%의 초기 중량 손실 (0.08 당량의 물)을 나타내었다. 상기 0.6%의 물은 표면수(surface water)-비결합수(non bound water)에 기인하였다. 샘플이 약 260℃에서 분해되기 전에, 0.2% 및 0.3% (각각, 0.03 및 0.04 당량의 물)인 두 추가 중량 손실이 관찰되었다. 제1 중량 손실은 물질에 혼합된 소량의 패턴 2 물질이 물을 잃어 패턴 1이 되었기 때문일 수 있다. 양은 중량 손실을 기준으로 8%로 추정된다. 약 100℃에서의 제2 물 손실은 비-결합 표면수의 증발 때문일 수 있다. DTA 분석은 170℃의 개시 및 172℃에서의 피크를 갖는 하나의 급격한 흡열 이벤트를 식별하였다.
도 15에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 TGA 분석은 6.5%의 초기 중량 손실 (0.9 당량의 물) 이후, 약 280℃에서의 샘플 분해를 보여주었다. DT 트레이스(trace)는 초기 중량 손실과 관련된 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 118℃에서 발열 이벤트 (패턴 1으로의 재결정화)로 이어졌다. 샘플 용융으로 여겨지는, 제2 흡열은 170℃에서 관찰되었고 172℃에서 피크이었다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 75-85℃에서 적어도 하나의 흡열 이벤트를 나타내며, 이는 물의 손실이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 115 내지 약 120℃에서 적어도 하나의 발열 이벤트를 나타내며, 이는 패턴 1으로의 재결정화 이벤트이다.
E. 시차 주사 열량측정 (DSC)
DSC는 알루미늄 DSC 팬에 칭량된 약 5 mg의 물질을 첨가하고, 구멍이 난 알루미늄 뚜껑으로 밀폐되지 않게 밀봉하여 수행하였다. 이후, 샘플 팬을 (냉각기가 장착된) Seiko DSC6200에 로딩하고 냉각하고, 20℃로 유지하였다. 일단 안정된 열-흐름 반응이 수득되면, 샘플 및 참조를 10℃/분의 스캔 속도로 250℃로 가열하고 열 흐름 반응 결과를 모니터링하였다. 질소는 50 cm3/분의 유속으로, 퍼지 가스로서 사용되었다.
도 16에 도시된 바와 같이, 패턴 1의 제1 열 사이클은 75℃에서 시작하여 85℃에서 피크를 갖는 작고 넓은 흡열을 보여주었다. 이는 도 14에서 볼 수 있는 TG/DTA에서 관찰된 0.6%의 중량 손실과 일치한다. 제2의 큰 흡열 이벤트는 169℃에서 관찰되었으며, 171℃의 피크를 갖는다. 이는 TG/DTA에서 볼 수 있는 용융과 일치한다. 도 16에서의 제1 넓은 피크는 패턴 2에서 패턴 1로의 탈수 때문일 수 있다. 도 16에서의 제2 피크는 패턴 1의 용융일 수 있다.
도 17에 도시된 바와 같이, 열 이벤트는 냉각 사이클에서 관찰되지 않았다. 도 18에 도시된 바와 같이, 매우 작고 넓은 피크인, 잠재적인 유리 전이점은 제2 열 사이클에서 약 80℃로 관찰되었다.
도 19에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 제1 열 사이클은 99℃의 개시 및 102℃의 피크를 갖는 흡열을 식별하였다. 샘플 용융은 170℃에서 시작하여 173℃에서 피크가 있음이 관찰되었다. 이는 TG/DTA에서 볼 수 있는 데이터와 일치한다. 도 20에 도시된 바와 같이, 열 이벤트는 패턴 2의 냉각 사이클에서 관찰되지 않았다.
도 21에 도시된 바와 같이, 가능한 유리 전이점은 CHP 수화물의 제2 열 사이클에서 77°에서 관찰되었다.
일 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 75℃ 내지 약 100℃에서 흡열 개시를 나타낸다.
F. 푸리에-변환 적외선 분광법 (FT-IR)
FR-IR은 Bruker ALPHA P 분광기 상에서 수행되었다. 충분한 물질을 분광기의 플레이트 중앙에 놓고, 스펙트럼은 하기 매개변수를 사용하여 수득하였다: 해상도: 4 cm-1, 백그라운드 스캔 시간: 16 스캔, 샘플 스캔 시간: 16 스캔, 데이터 수집: 4000 내지 400 cm-1, 결과 스펙트럼: 투과율, 및 소프트웨어: OPUS 버전 6.
도 22에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 FT-IR은 구조와 일치한다. 패턴 2의 고체 적외선 스펙트럼은 3457, 3411 (m); 3292, 321l(m); 2976; 1658; 1633 (m); 및 1445-1424 (m) cm-1에서 신호를 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 및 CHP 수화물은 약 500 cm-1 내지 약 1660 cm-1에서 적어도 9개의 밴드를 나타내는 본질적으로 동일한 IR 스펙트럼을 보여준다. 패턴 2는 결정 격자에 있어 물 (수화물)로 인해 3457 및 3411 cm-1에서 스트레칭(stretching)을 갖는 반면, 패턴 1은 그렇지 않다.
G. 동적 증기 흡착 (DVS)
DVS는 약 10-20 mg의 샘플을 메쉬 증기 흡착 밸런스 팬에 넣고, Surface Measurement Systems사의 DVS 고유 동적 증기 흡착 밸런스에 로딩하여 수행하였다. 샘플은 25℃에서 안정된 중량이 달성될 때까지 (dm/dt 0.004%, 최소 스텝 길이 30분, 최대 스텝 길이 500분) 각 단계에서 샘플을 유지하면서, 40%로부터 90% 상대 습도(RH)까지 10% 증분으로 램핑(ramping) 프로파일을 적용하였다. 흡착 사이클의 완료 후에, 샘플은 0% RH로의 동일한 과정을 사용하여 건조시킨 다음, 다시 40% RH로의 제2 흡착 사이클을 거쳤다. 두 사이클이 수행되었다. 샘플의 흡습성 특성이 결정되도록, 흡착/탈착 사이클 동안의 중량의 변화를 플롯팅하였다. 이후, XRPD 분석은 임의의 잔류 고체에 대해 수행되었다.
도 23에 도시된 바와 같이, 패턴 1의 DVS의 등온선 플롯은 60% RH로부터 90% RH 시 6.3% 중량 증가를 보였고, 이는 CHP 수화물, 패턴 2로의 전환을 나타낸다. 도 24에 도시된 바와 같이, 패턴 2로의 전환 후에, 물질은 0% 및 90% RH 사이에서 0.8 중량%의 최대 흡수율(maximum uptake)로 단지 약간의 흡습성만을 보였으며, 이는 결정 구조의 일부가 아닌 표면수로 추측된다. 이러한 현상은 도 25 패턴 1의 DVS의 동력학적 플롯에 도시되어 있고, 패턴 1이 처음에 수화되어 패턴 2를 형성하지만, 탈착 단계 동안 물을 잃지 않음을 보여주며, 이는 0.8%의 약간의 중량 증가가 고체 구조의 일부가 아님을 나타낸다.
도 26에 도시된 바와 같이, DVS 후 패턴 1의 XRPD 분석은 패턴 2로 지정된 신규 형태를 보여주었다. 도 27에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 DVS 후 TG/DTA 분석은 6.8%의 초기 중량 손실 (0.95 당량의 물) 이후, 약 280℃에서의 샘플 분해를 보여주었다. DT 트레이스는 중량 손실과 관련된 흡열 이벤트 이후, 약 120℃에서의 발열 이벤트인, (패턴 1으로의) 재결정화, 168℃의 개시 및 172℃의 피크를 갖는 용융으로 이어졌다.
CHP 패턴 2는 0% - 90% 습도 하에서 탈수/재수화를 확인하기 위해 몇몇 더 높은 온도 조건에 배치되었다: 25℃ (도 28); 40℃ (도 30); 50℃ (도 31); 및 60℃ (도 32).
도 28에 도시된 바와 같이, DVS의 등온선 플롯은 패턴 2 물질이 40%로부터 90% RH 시 및 10%로부터 90% RH 시 변화되지 않았음을 보여주었다. 이후, 물질은 10% RH 미만 시 3.5 중량%를 잃었고, 0%로부터 90% RH 시 재수화되었다. 도 29에 도시된 바와 같이, DVS의 동력학적 플롯은 CHP 수화물이 80%로부터 0% RH 시 500분 내에 탈착 단계 동안 3.5%의 물을 손실함 (빨간색 선)을 보여준다. 도 30, 31, 및 32에 도시된 바와 같이, 패턴 2는 40℃, 50℃, 및 60℃에서 단일 사이클로 적용되었다. 40℃는 물질이 10% RH 미만에서 탈수되기 시작하여 10%로부터 0% RH 시 약 5.8 중량%를 손실함 (0.8 당량의 물)을 보여주었다. 상기 물질은 0%로부터 40% RH 시 수화된다 (도 30). 50℃는 물질이 20% RH 미만에서 탈수되기 시작하여 20%로부터 0% RH 시 약 6.1 중량%를 손실함 (0.8 당량의 물)을 보여주었다. 상기 물질은 0%로부터 40% RH 시 재수화된다 (도 31). 60℃ 분석은 물질이 20% RH 미만에서 탈수되기 시작하여 20%로부터 0% RH 시 약 7 중량%를 손실함 (1.0 당량의 물)을 보여주었다. 상기 물질은 0%로부터 40% RH 시 재수화된다 (도 32).
다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 3% 내지 약 9%, 또는 약 4% 내지 약 8.5%, 또는 약 5% 내지 약 8%의 중량 손실을 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 5.5 내지 약 7.3%의 중량 손실을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 약 5.8 내지 약 7.0%의 중량 손실을 나타낸다.
H. 가변 온도 및 습도 X-선 분말 회절법 (VT-/VH-XRPD)
VT-/VH-XRPD 분석은 패턴 2 물질에 대해 수행되었다. 패턴 2는 40% RH 및 주변 온도에서의 초기 스캔에 존재하였다. 패턴 2는 주변 온도에서 RH가 0%로 낮아졌을 때 실행 2에 남아 있었다. 온도를 80℃로 증가시키고, 샘플은 스캔을 실행하기 전에 20분 동안 그대로 두었다. 수득된 회절도는 생성된 물질이 순수한 패턴 1임을 시사한다. 순수한 패턴 1은 80℃ 및 0% RH에서 80분 후에 남아 있었다. 도 33은 이러한 결과를 나타낸다.
도 34는 다양한 VT/DVS 후 패턴 2 물질의 XRPD를 보여준다. 다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 실온에서 적어도 약 0% 내지 약 90% RH 시 존재한다. 또 다른 구현예에서, 100%의 패턴 2는 80℃에서 0% RH 시 패턴 1로 전환된다.
I. 1 H 핵자기 공명 (NMR)
NMR은 양성자에 대해 500.12MHz에서 작동하는 DCH 저온탐침(cryoprobe)이 장착된 Bruker AVIIIHD 분광기를 사용하여 수행하였다. 실험은 중수소화된 DMSO로 수행하였으며, 각 샘플은 약 10 mM 농도로 준비하였다. 패턴 1 CHP (DMSO-d6)의 1H-NMR 스펙트럼은 그 결과가 화합물의 구조와 일치함을 보여준다 (도 35). 패턴 2 (DMSO-d6)의 1H-NMR 스펙트럼은 도 36에 제공된다. 패턴 2 및 패턴 1 CHP는 둘 다 용매에 완전히 용해되었으므로, 동일한 NMR 스펙트럼을 보여주었다. 도 37에 도시된 바와 같이, NMR은 건조된 물질, 패턴 2 (도 9로부터의 분홍색 선)에 대해 수행되었다. 패턴 2 투입 물질로부터 건조된 물질에서는 변화가 관찰되지 않았다.
일 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 DMSO-d6 용매 중 CHP-무수와 본질적으로 동일한 1H-NMR을 나타낸다.
J. 이핵 단일 양자 코히어런스(HSQC) NMR
HSQC-NMR은 Bruker 500 MHz NMR 장비를 사용하여 패턴 2에 대해 수행되었다. DMSO-d6는 NMR 샘플 용매로 사용되었다. 도 38에 도시된 바와 같이, 패턴 1의 결과는 2개의 이미다졸 C-H의 화학적 이동이 4.2 ppm에 있음을 나타내었다.
HSQC-NMR 실험은 건조된 물질, 패턴 2 (도 9로부터의 분홍색 선)에 대해 수행되었다. 도 39에 도시된 바와 같이, 결과는 건조된 물질 (패턴 1 및 패턴 2의 혼합) 및 패턴 2 물질의 NMR이 동일함을 나타내었다.
K. 동결건조
용해도 선별의 경우: 330 mg의 CHP 패턴 1을 물 (3.3mL)에 (약하게 가열하여) 용해하고, 33개의 바이알로 균등하게 나누었다. 이후, 상기 바이알은 밤새 동결건조 하기 전에, -50℃에서 동결시켰다. 결정성 화합물의 동결건조가 주어진 화합물의 결정 형태보다 정례적으로 더 가용성인 무정형 물질을 생성한다는 것이 널리 알려져 있다.
도 40에 도시된 바와 같이, 패턴 1의 동결건조로부터 회수된 물질을 XRPD로 분석했을 때 일부 결정 피크를 나타내었다. 출원인은 초기 피크가 무정형 형태와 혼합된 수화물 및 무수 형태의 혼합물을 나타내는 것으로 여긴다.
또 다른 동결건조의 경우, 도 40의 각 10 mg의 샘플을 200 μL의 물에 재-용해시켰다. 바이알은 72시간 동안 동결건조 하기 전에 -50℃에서 다시 동결시켰다. 동결건조로부터 회수된 물질은 도 41에 도시된 바와 같이, XRPD에 의하면 대부분 무정형이었다.
무정형화 테스트의 경우: CHP 수화물 (패턴 2)을 증류수에 용해시켰다. 이 용액을 26개의 유리 바이알로 균등하게 나누고, 바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다. 일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 48시간 동안 건조하였다. 도 42에 도시된 바와 같이, 패턴 2의 동결건조로부터 회수된 물질은 XRPD로 분석했을 때 패턴 2로 밝혀졌다.
또 다른 무정형화의 경우, 각 바이알에 1 mL의 증류수를 첨가하여 샘플을 재-용해시켰다. 이후, 용액을 26개의 20 mL 유리 바이알에 피펫팅하여 옮기고, 추가로 15 mL의 증류수를 채웠다. 바이알은 약 48시간 동안 동결건조 되기 전에 -50℃에서 동결시켰다. 48시간 후에, 샘플은 완전히 동결건조 되지 않았으며, 바이알을 데시케이터에 다시 넣고 72시간 동안 더 동결건조시켰다. XRPD로 분석된 물질은 여전히 패턴 2 피크를 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다.
다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물의 동결건조는 패턴 2가 패턴 1보다 더 안정하고, 무정형화 후에도 적어도 약 10% 내지 약 40% 순수하게 남아있음을 보여준다.
L. 용해도 선별
33 x 10 mg의 CHP 패턴 1 (무수 형태) 샘플을 2 mL 바이알에서 동결건조시키고, 100 μL의 상이한 용매 시스템을 각 바이알에 첨가하였다. 각 첨가 사이에, 혼합물이 용해되었는지 확인하고, 용해가 관찰되지 않으면, 혼합물을 약 40℃로 가열하여 다시 확인하였다. 300 μL의 용매를 첨가한 후, 100 μL의 분취량을 첨가하였다. 이 과정은 용해가 관찰될 때까지 또는 1 mL의 용매가 첨가될 때까지 계속되었다. 용해가 일어나지 않으면 고체를 여과로 분리하고, XRPD를 수집하였다. 용해가 일어나면 용매가 증발하도록 두고, 임의의 남아있는 고체에 대해 XRPD를 수집하였다.
도 43은 다양한 용매에서 패턴 1의 대략적인 용해도를 제공하고, 도 44는 첨가된 용매의 부피를 기준으로 패턴 1의 용매 용해도 결과를 제공한다. 도 43 및 44에 도시된 바와 같이, 높은 용해도는 에탄올, 메탄올, N, N-디메틸아세트아미드, 물, DMSO, 트리플루오로에탄올, 1-프로판올, 및 메탄올/물 혼합물에서 관찰되었다. 샘플은 뚜껑을 열어 증발하도록 두었으며, 관찰된 고체는 XRPD로 분석하였다.
도 45에 도시된 바와 같이, XRPD 분석은 동력학적 용해도 스크리닝으로부터 패턴 1 (결정 형태) 이외에 2개의 고유한 패턴을 식별하였지만, 패턴 3은 패턴 2와의 혼합물로서만 나타났다. 아세톤, 디클로로메탄 (DCM), 에틸 포르메이트, 및 MtBE에서는 패턴 2 (수화물 형태)를 생성하였다. 결정 및 수화물 형태의 혼합물은 에탄올에서 관찰되었다. 클로로벤젠에서는 패턴 2 및 3의 혼합물이 생성되었으며, THF에서는 일부 패턴 2 피크를 갖는 주로 무정형 물질이 회수되었다. 무색 겔은 메탄올에서 볼 수 있었으며, XRPD로 분석되지 않았다. 용매 시스템에서는 증발 동안 결정이 생성되었으며, 잠재적인 THF 용매화물로서 식별되었다.
도 45에 도시된 바와 같이, 나열된 30개의 용매 시스템 중 9개는 XRPD 분석을 위한 불충분한 고체를 생성하였다. 16개의 용매에서 패턴 2가 회수되었으며, 패턴 1은 1-프로판올에서 관찰되었고, 패턴 1 및 2의 혼합물은 에탄올에서 볼 수 있으며, 패턴 2 및 3의 혼합물은 클로로벤젠에서 생성되었고, 일부 패턴 2 피크를 갖는 주로 무정형인 물질은 THF에서 생성되었다.
도 46은 1차 다형체 스크리닝 용매를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 개시의 CHP 수화물은 1-프로판올, 2-프로판올, 메탄올/물 혼합물, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 헵탄, 이소 프로필 아세테이트, 메틸 에틸 케톤 (MEK), 메틸 이소부틸 케톤, 니트로메탄, 톨루엔, 및 트리플루오로에탄올에서의 동력학적 결정화 (2-6시간)로부터 생성될 수 있다.
M. 제1 다형체 선별
40 mg의 무수 CHP를 포함하는 24개의 바이알에 상이한 용매를 묽은 슬러리가 관찰될 때까지 100 μL의 분취량으로 첨가하였다. 이후, 바이알을 72시간에 걸쳐 4시간 사이클로 주변 온도 및 40℃ 사이에서 온도 사이클링시켰다. 남아있는 모든 고체는 원심분리로 분리하고 XRPD로 분석하였다.
도 46은 동력학적 (2-6시간) 다형체 스크리닝을 위해 사용된 용매를 보여주고, 도 50은 패턴 1의 1차 다형체 선별 온도 사이클링을 보여준다.
결과는 물이 샘플에 존재하는 경우, 패턴 2가 우세함을 보여준다. 샘플 자체로부터, 용매 시스템 또는 대기로부터 흡착할 수 있는 물이 샘플에 불충분하게 존재하는 경우, 패턴 1만이 형성되었다. 이러한 결과는 표 24 및 25에 요약되어 있다.
실시예 2 - CHP 수화물 제조 공정
본 연구는 (1) 패턴 1 (무수물, C16081735-D)을 패턴 2 (수화물, 패턴 2)로 전환하기 위한 전이 공정 평가; (2) 지정된 제조업체에 보관된 비-GMP CHP 패턴 1 (무수물)을 사용하여 약 100 그램 규모에서 실행된 시범 평가; (3) cGMP(Current Good Manufacturing Practice regulations) 조건 하에서 약 400 g의 패턴 2의 제조; 및 (4) 바람직한 패턴 2 (수화물, 패턴 2)를 확실히 얻기 위한 건조 조건 평가;를 수행하였다.
사양은 하기와 같이 설정되었다: HPLC 순도: ≥ 98.0%; 불순물 프로파일: H-His-OH≤ 1.0%, 각각 다른 개별 ≤ 1.0%; 키랄 순도: ≥ 98.0%; 키랄 불순물: 각각 ≥0.1 % 불순물로 보고; DL, LD, LL 광학 이성질체 ≤ 1.0%, 등
패턴 2 (사이클로(L-히스-L-프로) 디펩티드 수화물)의 제조를 위한 재현 가능한 공정은 EtOH/H2O = 9/1 (V/V)에 패턴 1 (무수물)을 용해시키고, MtBE를 첨가하여 패턴 2 (수화물)를 침전시키는 것으로 개발되었다. 이 공정은 370 g 규모의 cGMP 배치 상에서 성공적으로 구현되었다. 최종적으로, 99.9% HPLC 순도 및 100.0% 키랄 순도를 갖는 총 288 g의 패턴 2 (CHP 수화물)가 cGMP 조건 하에서 생성되었다.
A. 개요 및 합성 반응식
패턴 1 (무수화물)을 패턴 2 (수화물, 패턴 2)로 전환하는 공정을 평가하였다. 두 가지 결정화 과정이 제공되었는데, 하나는 물에서 무수물 고체의 용해 및 아세톤 첨가에 의한 침전이고 (합성 반응식 1 참조); 다른 하나는 EtOH/물 = 9/1에서 무수물 고체의 용해 및 MtBE 첨가에 의한 침전이다 (합성 반응식 2 참조). 두 과정의 품질 및 수율과 최적화 작업을 위해 선택된(fixed) 반응식 2를 평가하였다.
최종적으로, 최적화된 공정 (반응식 3 참조)이 성공적으로 실행되어 288 g의 패턴 2 (CHP 수화물)가 생성되었다. 교대생산(campaign production)은 반응식 3을 따랐다.
Figure pct00004
반응식 1: 패턴 2(CHP 수화물)에 대한 제1 합성 경로
Figure pct00005
반응식 2: 패턴 2(CHP 수화물)에 대한 제2 합성 경로
Figure pct00006
반응식 3: cGMP 생산을 위한 패턴 2(CHP 수화물)에 대한 최적화된 합성 경로
두 과정 (반응식 1 및 2)을 모두 평가하고, 타겟 패턴 2를 갖는 수화물로서 생성물을 제공하였다. 두 조건 하에서 화학적 안정성을 연구하였으며, 패턴 2는 50℃에서 20시간 동안 안정적이었다. 그러나, 물/아세톤 과정은 매우 적은 양의 물 (1V)을 우수 용매로서 사용하여, 최소 교반 부피가 매우 작은 적합한 반응기를 선택하기가 어려웠다. 또한, 물/아세톤 과정은 단지 약 70%의 분리 수율을 제공하였다. EtOH/H2O/MtBE 과정이 약 90% 분리 수율을 갖는 최적화 작업을 위해 선택되었다. 최적화된 결정화 과정에 따라, 370 g 규모의 cGMP 배치가 정밀화학시험생산센터(Kilo-Lab)에서 성공적으로 실행되었다.
B. 요약
패턴 2의 제조를 위해, 물/아세톤 및 EtOH/H2O/MtBE를 사용한 2개의 결정화 과정을 평가하였으며, 두 공정 모두 생성물을 타겟 패턴 2를 갖는 수화물로서 제공하였다. 모든 조건 하에서 화학적 안정성을 연구하였으며, 생성물은 50℃에서 20시간 동안 안정적이었다. 물/아세톤 과정이 단지 약 70%의 분리 수율을 제공함을 고려하여, EtOH/H2O/MtBE 과정이 최적화 작업을 위해 선택되었다. MtBE 첨가의 온도 및 속도를 연구하였으며, 5℃에서 다소 느린 속도로 MtBE를 첨가하는 과정을 완성하여 상당한 양의 고체가 용기의 벽에 부착되는 것을 방지하였다. 최적화된 결정화 과정에 따라, 한 번의 시범 실행이 100 g 규모로 수행되었으며, 결정화는 패턴 2로서 96.44 g의 생성물을 약 90% 분리 수율로 성공적으로 제공하였다. 건조 안정성 연구를 기반으로, 수화물 생성물은 -0.09 MPa 하에서 40℃ 미만의 실험실 오븐에서 안정적이었다.
C. 물/아세톤 조건을 사용한 결정화 과정의 평가
Figure pct00007
물/아세톤 조건으로 RFP 결정화 과정을 평가하고자 2개의 시험을 수행하였다 (표 2). 실험 PS03027-2에서 시드 없이 결정화가 관찰되지 않았으며, 시드 첨가 후 고체가 침전하였다. 실험 PS03027-4에서 시드를 첨가하였으며, 결정화가 순조롭게 진행되었다. XRPD는 타겟 패턴 2가 수득됨을 나타내었다. 물/아세톤 시스템에서의 생성물 손실 (약 20%)이 다소 높았으며, 이는 RFP의 수율 (72%)과 일치하였다.
표 2. CHP 수화물의 제조 결과
Figure pct00008
주석: 시드는 실온(RT)에서 1 vol 물로 재-슬러리화된 패턴 1로 준비하였다.
D. EtOH/물/MTBE를 사용한 대안적인 결정화 과정 평가
Figure pct00009
대안적인 EtOH/물/MTBE 결정화 조건을 평가하고자, 5 g 규모로 하나의 롯트를 수행하였으며, 결정은 MtBE 첨가 중 결정핵생성되고, XRPD는 표적 패턴 2가 수득됨을 나타내었다. 모액의 손실은 물/아세톤 조건보다 다소 낮았다(8%) (표 3).
표 3. CHP 수화물의 제조 결과
Figure pct00010
E. 물/아세톤 및 EtOH/물/MtBE에서의 화학적 안정성 연구
화합물의 용액 상태 화학적 안정성은 상이한 온도에서 상이한 용매 시스템으로 연구되었다 (표 4). 용액은 50℃ 및 80℃로 유지하고, 용액의 순도를 추적하였다. 화합물은 일반적으로 적어도 20시간 동안 안정하였다.
표 4. 물/아세톤 및 EtOH/물/MtBE의 화학적 안정성
Figure pct00011
F. CHP 수화물(패턴 2)의 용해도 연구
물/아세톤 및 EtOH/물/MtBE에서 CHP 수화물의 용해도를 연구하였으며, 두 조건 하에서 용매 비율 및 온도에 민감한 것으로 밝혀졌다 (표 5 및 표 6). EtOH/물/MtBE에서의 결정화 수율은 90% 이상이었다.
표 5. 물/아세톤에서 패턴 2의 용해도
Figure pct00012
표 6. EtOH/물/MtBE에서 패턴 2의 용해도
Figure pct00013
주석: 1) 패턴 2 물질로서 롯트 PS03027-2-H를 사용하였다.
G. EtOH/물/MtBE 조건의 공정 최적화
EtOH/물/MtBE에서의 결정화를 더 이해하고자, MtBE를 각각 50℃, 35℃, 및 5℃에서 첨가하는 3개의 실험을 수행하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 3개의 실험은 바람직한 결정 형태를 제공하였으며 잔류 용매는 낮았다.
표 7. EtOH/물/MtBE에서의 공정 최적화 (5 g 규모)
Figure pct00014
더 큰 규모에서 과정을 검증하고자, 표 8에 나타낸 바와 같이, 3개의 15 g 규모의 실험을 수행하였다. (MtBE가 50℃ 및 35℃에서 첨가되는) PS03027-13 및 PS03027-14 실험 중, 크러스트 형성(encrustation) 문제가 관찰되었다. 상당한 양의 고체가 특히 MtBE를 첨가하는 동안 용기 벽에 부착되었다. 이 문제를 피하고자, PS0027-15 실험 중, MtBE를 5℃에서 첨가하고 첨가는 8시간 (이전 실험에서는 4시간)으로 연장하였다. 벽 상에 크러스트(crust)가 훨씬 적은 것으로 밝혀졌다. 따라서, MtBE는 5℃에서 다소 느린 속도로 첨가되어야 하는 것으로 결론 내렸다.
표 8. EtOH/물/MtBE에서의 공정 최적화 (15 g 규모)
Figure pct00015
H. MtBE의 빠른 첨가에 대한 스트레스 테스트
표 9에 나타낸 바와 같이, 스트레스 테스트는 MtBE 첨가가 다소 빠른 속도로 수행되는 과정에 대해 수행되었다. 실험 중 고체의 XRPD를 추적하였으며, 데이터는 패턴 2가 결정화 내내 관찰됨을 나타내었다.
표 9. MtBE의 빠른 첨가에 대한 스트레스 테스트
Figure pct00016
I. EtOH/물/MtBE에서의 형태 안정성 연구
EtOH/물/MtBE에서 형태 안정성을 연구하고자, 100 mg의 무수 패턴 1 고체 및 100 mg의 패턴 2 고체를 첨가하여, 각각 50℃, 35℃, 및 5℃에서 경쟁적인 리파이닝(repining) 실험을 수행하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 패턴 1 및 패턴 2의 혼합 형태는 상이한 조건 하에서 빠르게 패턴 2로 전환된다.
표 10. EtOH/물/MtBE에서 패턴 1 및 패턴 2의 경쟁적인 슬러리화
Figure pct00017
주석: 투입 물질: 100 mg의 무수 고체(패턴 1, 롯트# PS00726-55-D)를 100 mg의 패턴 2 고체(롯트# PS03027-5/9/10/11-H)와 함께 첨가하였다.
J. 35℃, 40℃, 50℃ 및 65℃에서의 건조 안정성 연구
건조 안정성은 각각 35℃, 40℃, 50℃, 및 65℃에서 수행되었다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 패턴 2는 적어도 4일 동안 40℃까지 안정적이다.
표 11. 35℃, 40℃, 50℃, 및 65℃에서의 건조 안정성
Figure pct00018
K. 더 나쁜 결정을 패턴 2로 다시 전환하기 위한 슬러리화 과정 연구
35-40℃로 10시간 동안 건조할 때 조차도, 과도한 건조 (KF=5.4%, 이론상 7.4%) 때문에 패턴 2 (패턴 218001)의 cGMP 배치에 대한 결정화도가 낮아졌다. 불량한 결정 패턴 2 고체를 바람직한 패턴 2로 전환하고자, 두 가지 재-슬러리화 실험을 수행하였다. 2 g의 패턴 218001-스텝5.7을 8vol의 EtOH/물/MtBE = 9v/1v/30v으로 RT 및 5℃에서 재-슬러리화시켜, 단 30분만에 패턴 2로 전환되는 것으로 밝혀졌다. 고체를 분리하여 14시간 동안 건조시켰으며, 그 형태는 상기 기간 동안 변하지 않았다. 모액 농도를 기준으로 한 손실은 5% 내외였다 (반면, 총 손실은 플라스크 벽 및 조작에서의 손실을 포함하여 10%인 것으로 예상되었다). 한 가지 장점은 상기 과정에서 약 10%의 생성물이 손실될 수 있지만, 모든 고체가 패턴 2로 전환된다는 것이다.
L. 패턴 1에서 패턴 2로의 일반적인 경로
1. EtOH (1.75-1.79X; 2.25V)를 N2 하에서 R1에 충전한다.
2. 정제수 (0.245-0.255X; 0.25V)를 N2 하에서 R1에 충전한다.
3. R1을 5-10분 동안 교반하여 EtOH/물=9:1(v/v) 혼합 용액을 얻는다.
4. 용액을 R1에서 드럼통으로 옮긴다.
5. 패턴 1 (1.0eq, 1.0X)을 R1에 충전한다.
6. 단계 4로부터의 EtOH/물 혼합물 (1.61-1.63X, 2.0V)을 N2 하에서 R1에 충전한다.
7. R1을 N2 하에서 47-53℃로 조정한다.
8. R1을 47-53℃에서 10-60분 동안 N2 하에서 교반한다.
9. 용액을 R1으로부터 R2로 연마 여과한다. R2의 자켓을 50-55℃로 예열하였다.
10. 단계 4로부터의 EtOH/물 혼합물 (0.39-0.41X; 0.5V)을 N2 하에서 R1에 충전한다.
11. R1을 5-30분 동안 N2 하에서 교반한다.
12. 용액을 R1으로부터 R2로 연마 여과한다.
13. R2를 47-53℃로 조정하고 10-60분 동안 N2 하에서 교반한다. 완전한 용해는 프로젝트 리더가 확인한다.
14. R2를 32-37℃로 N2 하에서 조정한다.
15. MtBE (0.36-0.38X; 0.5V)를 32-37℃에서 천천히 R2로 N2 하에서 첨가한다.
16. 패턴 2 시드 결정 (0.015-0.025X)을 32-37℃에서 R2로 충전한다.
17. R2를 32-37℃에서 2-3시간 동안 N2 하에서 교반한다.
18. R2를 2-3시간 내에 3-8℃로 N2 하에서 조정한다.
19. 샘플을 취해서 여과하고, XRPD 분석용 케이크를 보낸다: XRPD (PS03027-15-H와 일치함). 기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 20을 수행한다; 그렇지 않으면 프로젝트 리더와 상의한다.
20. MtBE (5.1-5.3X; 7V)를 3-8℃에서 8시간에 걸쳐 N2 하에서 R2에 충전한다.
21. R2를 3-8℃에서 8-10시간 동안 N2 하에서 교반한다.
22. 샘플을 취해서 여과하고, XRPD 분석용 케이크를 보낸다: XRPD (PS03027-15-H와 일치함): 잔류 패턴 2 분석을 위해 여과물을 보낸다: 상층액에서의 잔류 H (≤ 1.5% w/w).
기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 25를 수행한다; 그렇지 않으면 단계 23을 수행한다.
23. R2를 3-8℃에서 4-10시간 동안 N2 하에서 교반한다.
24. 샘플을 취해서 여과하고, XRPD 분석용 케이크를 보낸다: XRPD (PS03027-15-H와 일치함); 잔류 H 분석을 위해 여과물을 보낸다: 상층액에서의 잔류 H (≤ 1.5% w/w). 기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 25를 수행한다.
25. 현탁액을 3-8℃로 N2 하에서 여과한다.
26. EtOH (0.355X), 정제수 (0.05X) 및 MtBE (1.11X)를 깨끗한 드럼통에 충전한다.
27. 단계 26에서의 물질을 교반하여 투명한 혼합물 용액을 얻는다.
28. 단계 27 용액 (1.5-1.6X)을 R2로 옮겨 R2를 헹군다.
29. R2를 3-8℃로 냉각한다.
30. 습식 케이크를 3-8℃에서 R2 헹굼 용액으로 세척한다.
31. 습식 생성물의 품질을 확인한다:
XRPD (PS03027-15-H와 일치함); HPLC≥98.0% 면적; H-His-OH≤1.0% 면적
각각 다른 개별 ≤1.0% 면적; RRT로 각각의 불순물 ≥0.05% 면적을 보고함
주석: 단계 32를 병행한다.
기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 33을 수행한다.
32. 모액에서 잔류 패턴 2를 확인한다. 패턴 2의 잔류량 (%, 보고)을 보고한다.
33. 진공 하에서 35-40℃로 10-12시간 동안 건조한다. 과도한 건조를 방지하기 위해 오븐 내에 수조를 놓는 것을 권장한다.
34. 잔류 용매를 확인한다:
EtOH (≤5000ppm); MtBE (≤5000ppm); 수분 함량 (보고)
건식 생성물의 다형체를 확인한다: XRPD (PS03027-15-H와 일치함)
기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 37을 수행한다; 그렇지 않으면 단계 35를 수행한다.
35. 진공 하에서 35-40℃로 5-8시간 동안 건조한다. 과도한 건조를 방지하기 위해 오븐 내에 수조를 놓는 것을 권장한다.
36. 잔류 용매를 확인한다:
EtOH (≤5000ppm); MtBE (≤5000ppm); 수분 함량 (보고)
건식 생성물의 다형체를 확인한다: XRPD (PS03027-15-H와 일치함)
기준: 결과가 사양을 충족하면, 단계 37을 수행한다.
37. 건식 생성물을 드럼통에 채우고 체질한다.
38. 방출 분석을 위해 샘플을 취한다.
M. 전체 특성 분석
HPLC 순도, 1HNMR, TGA, DSC 및 XRPD 스펙트럼은 표 12에 나타내었다.
표 12. 패턴 2의 특성 분석
Figure pct00019
실시예 3 - CHP 수화물의 결정화 공정 개발
본 연구는 CHP 수화물 (패턴 2)의 결정화 개발에 중점을 두었다. CHP 수화물의 배치에 대한 초기 특성 분석 후에, 용해도 연구, 소규모 결정화 평가, 준안정 영역 폭 측정 및 스케일업 결정화를 수행하였다. 작업 프로그램의 목표는 CHP 수화물 패턴 2의 성공적인 생산을 가능하게 할 수 있는 결정화 조건을 확립하는 것이었으며, 이는 제조를 위해 효과적으로 스케일업이 될 수 있다.
CHP 패턴 1에 대해 수행된 용해도 평가는, 가장 높은 퍼센티지의 MtBE를 포함한 에탄올: 물: MtBE 블렌드를 제외하고, 물을 함유하는 모든 용매 혼합물에서 높은 용해도를 나타내었다. 특히 높은 용해도는 물 (≥200 mg/mL) 및 아세톤: 물 블렌드 (물: 아세톤 [90:10] 중 ≥200)에서 관찰되었다. 상기 물질은 아세톤, 아세토니트릴 및 THF (≤10 mg/mL)에 불완전하게 용해되는 것으로 관찰되었다.
2-시점 용해도는 평가된 2개의 용매 시스템 중에서 에탄올: 물: MtBE가 약간 더 나은 수율로 허용되었으나, 패턴 1 형성의 위험이 있음을 나타내었다. 아세톤: 물은 패턴 2 배타성을 허용하였지만 수율은 손실된다.
일 구현예에서, CHP 수화물을 제조하기 위해 하기 공정이 제공된다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1을 50℃로 예열된 자켓형 반응기 용기에 첨가한다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성한다.
·오버헤드 교반기를 사용하여 300 rpm으로 교반한다.
·완전한 용해가 달성될 시, 25 mL의 MtBE를 용기에 (한 방울씩) 첨가한다.
·MtBE 첨가 완료 시, 2 중량% (400 mg)의 분쇄된 결정 패턴 2 CHP를 시딩하여 실험한다.
·50℃에서 20분 동안 계속 교반한다.
·5 mL의 MtBE를 용기에 (한 방울씩) 더 첨가한다.
·20 mL/시간의 속도로 70 mL의 MtBE를 첨가한다.
·첨가 완료 시, 0.1℃/분으로 30℃에서 29℃로 냉각한다.
·29℃에서 8시간 동안 계속 교반한다.
·0.25℃/분의 속도로 29℃에서 5℃로 냉각한다.
·20 mL/시간의 속도로 190 mL의 MtBE를 첨가한다.
·5℃에서 12시간 동안 계속 교반한다.
·여과하여 고체를 분리하고, 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 필터 케이크를 세척한다.
·고체를 40℃에서 1시간 동안 진공 하에서 건조한다.
실험실 규모에서 혼합 성능의 추정을 수행한 후, 공장 규모의 기하학적 구조를 모델링하여 공정의 성공적인 전환을 가능하게 하는 혼합 매개변수를 추정하였다. 이 과정을 10 ㎏ 규모로 전환하는 것은 하기 과정에 따라 수행할 수 있다:
·약 10 ㎏의 CHP 패턴 1을 50℃로 예열된 자켓형 반응기 용기에 첨가한다.
·25 L의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성한다.
·48 rpm으로 교반한다.
·완전한 용해가 달성될 시, 12.5 L의 MtBE를 용기에 첨가한다.
·MtBE 첨가 완료 시, 2 중량% (200 g)의 분쇄된 결정 패턴 2 CHP를 시딩하여 실험한다.
·50℃에서 20분 동안 계속 교반한다.
·2.5 L의 MtBE를 용기에 (한 방울씩) 더 첨가한다.
·10 L/시간의 속도로 35 L의 MtBE를 첨가한다.
·첨가 완료 시, 0.1℃/분으로 30℃에서 29℃로 냉각한다.
·29℃에서 8시간 동안 계속 교반한다.
·0.25℃/분의 속도로 29℃에서 5℃로 냉각한다.
·10 L/시간의 속도로 95 L의 MtBE를 첨가한다.
·5℃에서 12시간 동안 계속 교반한다.
·여과하여 고체를 분리하고, 20 L의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 필터 케이크를 세척한다.
·고체를 진공 하에서 40℃로 건조한다.
공장 규모 용기의 전력 손실이 실험실 규모 용기의 전력 손실과 좀더 비슷하게 되는 48 RPM의 사용이 권장된다. 공장에서의 전력 손실은 0.067 W/kg인 것으로 추정되는 반면, 실험실 규모에서 이는 0.064 W/kg인 것으로 추정된다. 또한, 이러한 매개 변수를 추정하는 데 사용된 모델은 입자가 아마도 현탁된 것으로 추정한다.
대안적으로, 공장에서의 교반기는 55 RPM으로 작동할 수 있다. 이는 입자가 용기에 현탁될 경우, 방금 현탁된 혼합 속도인 NJS인 것으로 혼합 모델에 의해 추정된다. 이는 혼합이 효과적일 것이라는 확신을 더해 주지만, 입자가 0.101 W/kg의 훨씬 더 높은 전력 손실을 경험할 위험이 있다.
그러나, CHP 수화물을 수득하기 위해 상기 기술된 하나 이상의 단계가 생략될 수 있거나 단계의 순서가 변경될 수 있음을 이해해야 한다.
B. 분석 방법
1. X-선 분말 회절 (XRPD)
XRPD 분석은 PANalytical X'pert pro 상에서, 샘플을 3 및 35° 2θ 사이에서 스캐닝하여 수행하였다. 물질을 부드럽게 분쇄하여 임의의 응집체를 풀어주고, 샘플을 지지하기 위해 Mylar 폴리머 필름이 있는 다중-웰 플레이트에 로딩하였다. 이후, 다중-웰 플레이트를 회절분석기에 넣고, 40 kV/40 mA의 발전기 설정을 사용한 전송 모드(스텝 크기 0.0130° 2θ)에서 실행되는 Cu K 방사선 (α1 λ = 1.54060 Å; α2 = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α1 : α2 비율 = 0.5)을 사용하여 분석하였다.
2. 편광 광학 현미경 (PLM)
복굴절의 존재, 입자 크기 및 모폴로지는 Motic 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어 (Motic Images Plus 2.0)가 장착된, Olympus BX50 편광 현미경을 사용하여 평가되었다. 모든 이미지는 달리 명시되지 않는 한, 20x 대물렌즈를 사용하여 기록되었다.
3. 열중량 분석 (TGA)
약 5 mg의 물질을 개방 알루미늄 팬에 칭량하여 동시 열중량/시차 열 분석기 (TG/DTA)에 로딩하고 실온에서 유지하였다. 이후, 샘플 무게의 변화가 임의의 시차 열 이벤트 (DTA)와 함께 기록되는 시간 동안 10℃/분의 속도로 20℃에서 350℃로 샘플을 가열하였다. 질소는 300 cm3/분의 유속으로, 퍼지 가스로서 사용되었다.
4. 핵자기 공명 (NMR)
NMR 실험은 양성자에 대해 500.12 MHz에서 작동하는 DCH 저온탐침이 장착된 Bruker AVIIIHD 분광기로 수행하였다. 실험은 중수소화된 디메틸 설폭사이드로 수행하였으며, 각 샘플은 약 10 mM 농도로 준비하였다.
5. 초점 빔 반사율 측정 (FBRM)
초점 빔 반사율 측정은 Mettler Toledo D600 탐침을 사용하여 수행되었다. 각 결정화를 위해, 탐침을 결정화 시작시 반응 용기에 넣고, 결정핵 생성 및 결정 성장을 모니터링하였다. 코드 길이 분포 및 다양한 카운트 통계는 하기 설정을 사용하여, 전반적으로 모니터링하였다:
전자 식별 범위 미세(Electronic Discrimination Range Fine)
스캔 속도 2 ms-1
샘플 시간 10 초
6. 크리스탈 16
크리스탈 16(Crystal 16) 기기는 투명한 바이알의 용액 (또는 슬러리)을 통한 빛의 투과도 퍼센티지를 사용하여, 시간 및 온도의 함수로서 용액 (또는 슬러리)의 탁도 프로파일을 생성한다. 얻은 프로파일을 사용하여 운점 (핵 생성 온도) 및 투명점 (용해 온도)을 결정하였다.
7. 고성능 액체 크로마토 그래피-자외선 검출 (HPLC-UV)
HPLC 분석은 하기 장비 매개변수로 수행되었다.
기기: Dionex Ultimate 3000
컬럼: LC/168 X-Bridge 페닐 컬럼 (150 mm x 4.6 mm x 3.5 μm)
컬럼 온도: 30℃
자동 샘플러 온도: 5℃
UV 파장: 220 nm
주입량 : 5 μL
유속: 1 ml/분
이동상 A: 10 mM 암모늄 아세테이트
이동상 B: 아세토니트릴
희석제: 물 중 0.1% TFA
구배 프로그램:
Figure pct00020
C. 실험
1. CHP 패턴 1의 초기 특성 분석
CHP 패턴 1은, 섹션 B의 상세한 과정에 따라 XRPD, 1H-, HSCQ- & 13C-NMR 및 HPLC로 특성 분석하였다.
2. CHP 패턴 1 (무수)의 대략적인 용해도
37개의 선택된 용매 시스템 (표 13)에서 CHP의 대략적인 용해도를 용매 첨가 기법으로 추정하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 mg의 CHP 패턴 1을 37개의 바이알 각각에 칭량하였다.
·각 용매/용매 혼합물을, 용해가 관찰되거나 최대 2 mL의 용매가 첨가될 때까지, 5 부피 분취량 (100 μL)으로 적절한 바이알에 첨가하였다.
·첨가 중간에, 샘플을 40℃로 가열하여 상승된 온도에서 용해를 확인하였다.
·2 mL의 용매가 물질의 용해 없이 첨가된 경우, 용해도는 10 mg/mL 미만으로 계산되었다.
·용매 첨가 후, 37개의 모든 바이알을 냉장고에 넣어 약 18시간 동안 2-8℃ 사이에서 충돌 냉각시켰다.
·존재하는 임의의 고체를 원심분리 여과로 분리하고, (물질의 양이 허용되는 경우) XRPD로 분석하였다.
·고체가 생성되지 않은 경우, 바이알은 뚜껑을 열고 주변 온도에서 증발하도록 두었다.
·존재하는 임의의 고체는 (물질의 양이 허용되는 경우) XRPD로 분석하였다.
표 13: 대략적인 용해도 용매 목록
Figure pct00021
3. 2-시점 용해도
2-시점 용해도 연구는 하기 과정을 사용하여 5℃ 및 50℃에서 11개의 용매 혼합물로 수행하였다:
·1 mL의 선택된 용매 혼합물을 미리-칭량된 질량의 CHP 패턴 1을 포함하는 1.5 mL 스크류 탑 유리 바이알에 첨가하여 슬러리를 생성하였다. 각 용매 시스템에 대해 선택된 초기 질량은 섹션 2에 상술된 바와 같이 대략적인 용해도의 결과를 기반으로 하였다. 용매 블렌드는 표 14에 나타내었다.
·바이알은 5℃ 또는 50℃로 설정된 온도조절장치로 제어된 반응 블록에서 유지시켰으며, 교반은 자석 교반기 플레이트를 통해 제공되었다.
·완전한 용해가 1시간 후에 관찰된 경우, 더 많은 CHP 패턴 1 고체를 실험에 투입하여 슬러리를 형성하였다.
·유동성 슬러리가 모든 바이알에 형성되었을 시, 실험은 요구된 온도에서 약 18시간 동안 교반하도록 하였다. 요구된 CHP 패턴 2의 최종 질량은 표 14에 나타내었다.
·약 18시간 후, 교반을 중단하고 0.45 μm PVDF 바늘 필터 및 주사기를 사용하여 상층액을 여과하였다.
·상층액의 농도는 HPLC로 분석하였다.
·바이알에 남아 있는 슬러리를 각각 0.22 μm 나일론 필터 원심분리 튜브로 옮기고, 고체를 원심분리로 분리하였다.
·회수된 고체는 (양이 허용되는 경우) XRPD 및 HPLC로 순도를 분석하였다.
표 14: 2-시점 용해도에 대한 최종 CHP 질량
Figure pct00022
4. 소규모 결정화
소규모 결정화 시험은 공급된 CHP(패턴 1)에 대해 수행되었다. 이러한 시험의 목적은 추가의 결정화 연구에 가장 적합한 용매 시스템, 온도 및 농도를 조사하고자 하는 것이다. 이는 아세톤: 물, 및 에탄올: 물: MtBE의 2개의 다른 용매 시스템을 사용하여 수행되었다.
결정화 세트 A: 아세톤: 물
·약 500 mg의 공급된 CHP(패턴 1)를 4×20 mL의 신틸레이션 바이알에 칭량하였다.
·각 바이알에, 적절한 부피의 아세톤: 물(80:20 v/v%)을 첨가하여 샘플을 용해하였다. 사용된 용매 부피에 대해서는 표 15를 참조한다.
o 교반기 막대를 각 바이알에 첨가하고, 실험은 50℃에서 교반하였다.
·50℃에서 1시간 후에, 아세톤을 4개의 바이알 중 2개 (바이알 1 및 3)에 적가하였다.
·실험은 50℃에서 약 1시간 동안 교반되도록 두었다.
·1시간 후에, 바이알을 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다.
·5℃가 되면, 아세톤을 나머지 2개의 바이알 (바이알 2 및 4)에 적가하였다.
·실험은 5℃에서 약 18시간 동안 교반되도록 두었다.
·5℃에서 18시간 후에, 생성된 슬러리를 47 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 42.5 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 여과하였다.
·고체를 미리-칭량된 바이알로 옮기고, XRPD, PLM 및 HPLC로 화학적 순도를 분석하였다.
·여과된 모액은 HPLC 농도 분석을 위해 제공되었다.
·실험은 표 15에 요약되어 있다.
결정화 세트 B : 에탄올: 물: MtBE
·약 500 mg의 공급된 CHP(패턴 1)를 5×20 mL의 신틸레이션 바이알에 칭량하였다.
·각 바이알에, 2 mL의 에탄올: 물(90:10 v/v%)을 첨가하여 샘플을 용해시켰다.
o 교반기 막대를 각 바이알에 첨가하고, 실험은 50℃에서 교반하였다.
·50℃에서 1시간 후에, MtBE를 5개의 바이알 중 3개 (바이알 1, 3 및 5)에 적가하였다.
·실험은 50℃에서 약 1시간 동안 교반되도록 두었다.
·50℃에서 1시간 후에, 바이알 1에 존재하는 슬러리를 47 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 42.5 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 여과하였다.
o 이전 결과로서 50℃에서 여과된 실험은 MtBE의 이 퍼센티지(80%)에서, 냉각 후 패턴 1 형성의 잠재적 위험을 나타내었다.
·나머지 바이알을 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다.
·5℃가 되면, MtBE를 나머지 2개의 바이알 (바이알 2 및 4)에 적가하였다.
·실험은 5℃에서 약 18시간 동안 교반되도록 두었다.
·5℃에서 18시간 후에, 생성된 슬러리를 47 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 42.5 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 여과하였다.
·모든 고체를 미리-칭량된 바이알로 옮기고, XRPD, PLM 및 HPLC로 화학적 순도를 분석하였다.
·여과된 모액은 HPLC 농도 분석을 위해 제공되었다.
·실험은 표 15에 요약되어 있다.
표 15: 소규모 결정화 - 용매 요약
Figure pct00023
5. 준안정 영역 폭(MSZW) 측정
2개의 매개변수 - 냉각 및 반-용매 첨가를 조사함으로써, 공급된 CHP(패턴 1)에 대해 MSZW 측정을 수행하였다.
냉각 방법
냉각을 통한 MSZW의 측정은 크리스탈 16을 사용하여 완료하였다. 사용된 과정은 하기에 개략적으로 나타내었다:
·공지된 양의 CHP(패턴 1)를 스크류 캡 바이알에 칭량하였다.
·각 바이알에, 1 mL의 적절한 용매 시스템을 첨가하여 슬러리를 형성하였다. 교반기 막대를 각 바이알에 넣었다.
·각 실험에 사용된 용매 시스템 및 CHP의 질량은 표 16에 요약되어 있다. 바이알을 크리스탈 16 기기의 샘플 홀더에 넣고, 요구된 온도 프로그램을 시작하였다. 온도 프로파일은 표 17A에서 볼 수 있다.
·시스템의 탁도를 전체적으로 모니터링하여 투명점(clear point) 및 운점(cloud point)을 결정하게 하였다.
표 16: 냉각 MSZW 결정을 위한 실험 세부사항
Figure pct00024
표 17A: 냉각 MSZW 결정을 위한 온도 프로파일
Figure pct00025
a. 반-용매 첨가 방법
반-용매 첨가에 대한 MSZW의 결정은 에탄올: 물: MtBE를 사용하여 완료하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 공급된 CHP 패턴 1을, 50℃로 예열된 250 mL의 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 40분) 되었을 시, 75 mL의 MtBE를 10 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다.
·MtBE 첨가 완료 시, 실험은 0.25℃/분으로 5℃로 냉각하고, 5℃에서 밤새 유지시켰다.
·5℃에서 9시간 후에, 고체를 83 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
·필터 케이크의 샘플을 취하여 XRPD로 분석하였다.
·나머지 케이크는 진공 하에서 35℃로 1시간 동안 건조하였다.
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
6. 결정화 개발
결정화 스케일업 실험은 에탄올: 물: MtBE에서 수행하였다. 다양한 실험 조건, 예컨대 냉각 속도, 반-용매 첨가 속도 및 온도, 시드 로딩 및 온도, 및 반-용매 비율을 평가하였다. 하기 프로토콜이 고려되었다:
a. 결정화 1
결정화 1의 경우, 용액에 2 중량%의 시드 결정을 시딩하였다. 시딩 및 MtBE 첨가는 35℃에서 수행되었다. 슬러리를 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 공급된 CHP 패턴 1을 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 30분) 되었을 시, 실험은 0.25℃/분의 속도로 35℃로 냉각하고, 10 mL의 MtBE를 10 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다.
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 35℃에서 약 2시간 동안 모니터링되었다.
·실험은 0.25℃/분으로 5℃로 냉각한 다음, 140 mL의 MtBE를 10 mL/시간(14시간)의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하여 25:75 v/v%의 최종 용매 비율을 갖게 하였다.
·고체를 83 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과에 의해 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체를 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
b. 결정화 2
결정화 2의 경우, 용액에 2 중량%의 시드 결정을 시딩하였다. 시딩 및 MtBE 첨가는 50℃에서 수행되었다. 슬러리를 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 공급된 CHP 패턴 1을 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 10 mL의 MtBE를 10 mL/시간의 속도로 주사기 펌프를 통해 첨가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 2시간 동안 모니터링되었다;
·140 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하여 25:75 v/v%의 최종 용매 비율을 갖게 하였다.
·실험은 0.25℃/분으로 5℃로 냉각한 다음, 5℃에서 약 9시간 동안 유지시켰다;
·5℃에서 9시간 후에, 고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
c. 결정화 3
결정화 3의 경우, 용액에 2 중량%의 시드 결정을 시딩하였다. 시딩 및 MtBE 첨가는 35℃에서 수행되었다. 슬러리를 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 공급된 CHP 패턴 1을 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 0.25℃/분 ℃의 속도로 5℃로 냉각시켰다;
o 결정핵 생성은 시스템이 23℃에 도달하면 관찰되었다;
·시스템을 50℃로 가열하여 물질을 재-용해시켰다. 용해가 관찰되면, 시스템은 0.25℃/분 ℃의 속도로 25℃로 냉각시켰다;
o 결정핵 생성은 시스템이 25℃에 도달하면 관찰되었다;
·시스템을 50℃로 가열하여 물질을 재-용해시켰다. 용해가 관찰되면, 시스템은 35℃로 냉각하고 실험에 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
·140 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하여 26:74 v/v%의 최종 용매 비율을 갖게 하였다;
·실험은 0.25℃/분으로 5℃로 냉각한 다음, 5℃에서 약 9시간 동안 유지시켰다;
·고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과에 의해 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
d. 결정화 4
결정화 4의 경우, 용액에 2 중량%의 시드 결정을 시딩하였다. 시딩 및 MtBE 첨가는 50℃에서 수행되었다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 2 (결정화 1 및 3으로부터 회수된 물질)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 20 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 주사기 펌프를 통해 첨가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 2시간 동안 모니터링되었다;
·140 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하여 24:76 v/v%의 최종 용매 비율을 갖게 하였다.
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템은 5℃로 밤새 유지시켰다;
·5℃에서 8시간 후에, 고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과에 의해 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃에서 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
e. 결정화 5
결정화 5의 경우, 용액에 2 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩 및 MtBE 첨가는 50℃에서 수행되었다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1 및 2 블렌드 (공급된 CS/352/18로부터의 패턴 1 및 결정화 4로부터의 패턴 2)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 25 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 적가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다.
o 시스템은 50℃에서 약 75분 동안 모니터링되었다;
·140 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하여 23:77 v/v%의 최종 용매 비율을 갖게 하였다.
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템은 5℃로 밤새 유지시켰다;
·5℃에서 9시간 후에, 고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
f. 결정화 6
결정화 6의 경우, 용액에 2 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩은 50℃에서 수행하고, 단계적 MtBE 첨가를 사용하였다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 29℃로 냉각하고, 상기 온도에서 8시간 동안 유지하였다. 이후, 슬러리를 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1 및 2 블렌드 (공급된 CS/352/18로부터의 패턴 1 및 결정화 5로부터의 패턴 2)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 25 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 적가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다.
o 시스템은 50℃에서 약 10분 동안 모니터링되었다;
o 시드는 지속되지 않았다. 추가 5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 용기에 적가하였다.
·70 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다;
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 29℃로 냉각시켰다;
·시스템은 8시간 동안 29℃로 유지시켰다;
·29℃에서 8시간 후에, 시스템은 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템이 5℃에 도달하면, 제2 단계 MtBE 첨가를 시작하였다. 190 mL를 20 mL/시간의 속도로 첨가하였다. 15:85 v/v%의 최종 용매 비율.
·시스템은 약 12시간 동안 5℃로 유지시켰다.
·이후, 고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC와 키랄 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
g. 결정화 7
결정화 7의 경우, 용액에 2 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩은 50℃에서 수행하고, 단계적 MtBE 첨가를 사용하였다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1 및 2 블렌드 (공급된 CS/352/18로부터의 패턴 1 및 결정화 6으로부터의 패턴 2)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 27.5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 수동으로 (한 방울씩) 첨가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 400 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 10분 동안 모니터링되었다;
·70 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다;
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템은 밤새 5℃로 유지시켰다;
·5℃에서 9시간 후에, 제2 단계 MtBE 첨가를 시작하였다. 190 mL를 20 mL/시간의 속도로 첨가하였다. 15:85 v/v%의 최종 용매 비율.
·고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
h. 결정화 8
결정화 8의 경우, 용액에 5 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩은 50℃에서 수행하고, 단계적 MtBE 첨가를 사용하였다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1 및 2 블렌드 (공급된 CS/352/18로부터의 패턴 1 및 결정화 7로부터의 패턴 2)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 27.5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 수동으로 (한 방울씩) 첨가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 1 g의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 10분 동안 모니터링되었다;
·70 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다;
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템은 밤새 5℃로 유지시켰다;
·5℃에서 약 9시간 후에, 제2 단계 MtBE 첨가를 시작하였다. 190 mL를 20 mL/시간의 속도로 첨가하였다. 15:85 v/v%의 최종 용매 비율.
·고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
i. 결정화 9
결정화 9의 경우, 용액에 5 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩은 50℃에서 수행하고, 단계적 MtBE 첨가를 사용하였다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 30℃로 냉각하고, 상기 온도에서 8시간 동안 유지하였다. 이후, 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 20 g의 CHP 패턴 1 및 2 블렌드 (공급된 CS/352/18로부터의 패턴 1 및 결정화 8로부터의 패턴 2)를 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·50 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 27.5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 수동으로 (한 방울씩) 첨가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 1 g의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 10분 동안 모니터링되었다;
·70 mL의 MtBE를 15 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다;
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 30℃로 냉각시켰다;
·시스템은 8시간 동안 30℃로 유지시켰다;
·30℃에서 8시간 후에, 시스템은 0.1℃/분의 속도로 5℃로 냉각을 재개시켰다.
·제2 단계 MtBE 첨가를 시작하였다. 190 mL를 20 mL/시간의 속도로 첨가하였다. 15:85 v/v%의 최종 용매 비율.
·시스템은 밤새 5℃로 유지시켰다;
·5℃에서 약 10시간 후에, 고체를 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 40 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
j. 결정화 10
결정화 10은 결정화 6과 같은 동일한 과정을 사용하였다. 용기 크기로 인해, 매개변수가 원래 실험의 70%로 축소되었다. 또한, 공급된 CHP (패턴 1)의 신규 배치(batch)가 본 실험 (CS/802/18)에 사용되었다.
용액에 2 중량%의 분쇄된 시드 결정을 시딩하였다. 시딩은 50℃에서 수행하고, 단계적 MtBE 첨가를 사용하였다. 슬러리를 0.1℃/분의 속도로 29℃로 냉각하고, 상기 온도에서 8시간 동안 유지하였다. 이후, 슬러리를 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각하였다. 하기 과정이 사용되었다:
·약 14 g의 공급된 CHP 패턴 1을 칭량하고, 50℃로 예열된 자켓형 용기로 옮겼다.
·35 mL의 에탄올: 물 (90:10 v/v%) 용매 혼합물을 용기에 첨가하여, 400 mg/mL의 출발 농도를 달성하였다.
o 실험은 50℃에서, 약 300 rpm으로 오버헤드 교반기를 사용하여 교반하였다.
o FBRM 프로브를 용기에 삽입하여 결정핵 생성 및 입자 수를 모니터링하고 기록하였다.
·완전한 용해가 달성(약 20분) 되었을 시, 실험은 50℃로 유지시키고, 17.5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 적가하였다;
·MtBE 첨가 완료 시, 실험에 막자 및 막자사발을 사용하여 분쇄된 280 mg의 CHP 패턴 2를 시딩하였다;
o 시스템은 50℃에서 약 10분 동안 모니터링되었다;
o 시드는 지속되지 않았다. 추가 3.5 mL의 MtBE를 주사기를 사용하여 용기에 적가하였다.
·50 mL의 MtBE를 20 mL/시간의 속도로 연동 펌프를 통해 첨가하였다;
·이후, 실험은 0.1℃/분으로 29℃로 냉각시켰다;
·시스템은 8시간 동안 29℃로 유지시켰다;
·29℃에서 8시간 후에, 시스템은 0.25℃/분의 속도로 5℃로 냉각시켰다;
·시스템이 5℃에 도달하면, 제2 단계 MtBE 첨가를 시작하였다. 134 mL를 20 mL/시간의 속도로 첨가하였다. 15:85 v/v%의 최종 용매 비율.
·시스템은 약 12시간 동안 5℃로 유지시켰다.
·이후, 고체를 88 mm의 부흐너 깔때기 및 와트만 1등급 여과지(직경 = 70 mm; 기공 크기 = 11 μm)를 사용하여 진공 여과로 분리하였다.
o 필터 케이크를 28 mL의 에탄올: 물: MtBE (9 vol: 1 vol: 30 vol)로 세척한 후, 이를 진공 하에서 1시간 동안 40℃로 건조하였다.
·건조된 고체는 XRPD, TG/DTA, PLM, 키랄 HPLC 및 HPLC로 순도를 분석하였다;
·여과된 모액의 농도는 HPLC로 측정하였다.
실시예 4 - 순도 결정
CHP 및 CHP-수화물의 순도는 HPLC를 사용하여 측정하였다. CHP 및 CHP-수화물에 대한 순도 측정을 위한 HPLC 방법의 크로마토그래피 매개변수는 표 17B에 요약되어 있다.
표 17B: CHP 및 CHP-수화물에 대한 순도 측정을 위한 HPLC 방법의 크로마토그래피 매개변수
Figure pct00026
어세이 결정을 위한 표준 용액의 준비 (0.8 mg/mL의 CHP 무수물 또는 0.85 mg/mL의 CHP 수화물): 약 40 mg의 C16081735-D 참조 표준을 칭량하고, 50 mL 부피의 플라스크로 옮긴다. 희석제를 사용하여 부피로 희석하고 잘 혼합한다 (필요한 경우에 초음파 처리하여 용해한다). 이를 STD-1로 라벨링한다. 표준 검사로 사용할 제2 표준 용액을 준비한다. 이를 STD-2로 라벨링한다.
어세이 결정을 위한 샘플 용액의 준비 (0.85 mg/mL의 CHP 수화물): 약 42.5 mg의 CHP 수화물 샘플을 50 mL 부피의 플라스크에 넣어 칭량한다. 희석제를 사용하여 부피로 희석하고 잘 혼합한다.
대표적인 블랭크 크로마토그램 및 대표적인 분별 용액 크로마토그램은 각각 도 52 및 53에 도시되어 있다.
실시예 5 - CHP 수화물에 대한 안정성 비교
A. CHP 무수물 및 CHP 수화물 패턴 2 간의 화학적 안정성 비교
CHP 무수물 (패턴 1) 및 수화물 (패턴 2) 화합물은 GMP 조건 하에서 제조되었다. CHP 무수물 화합물에 대한 안정성 연구는 6개월 동안 가속 조건 (40±5℃/75±5% RH) 및 12개월 동안 실온 조건 (25±5℃/60±5% RH) 하에서 수행되었다. CHP 수화물 화합물에 대한 추가 안정성 연구는 6개월 동안 가속 조건 (40±5℃/75±5% RH) 하에서 수행되었다 (표 18).
표 18. CHP 무수물 및 수화물 패턴 2에 대한 안정성 연구
Figure pct00027
1T = 테스트 됨
2NS = 예정되지 않음
3S = 예정됨
CHP 무수물 화합물의 장기 보관 조건은 CHP가 흡습성이기 때문에 주의 깊은 취급이 필요하다. CHP 무수물은 안정성 연구 동안 수분을 흡수하였으며, CHP의 분해로 인해 신규 불순물의 증가 및 CHP 무수물의 감소가 관찰되었다 (표 19). CHP 수화물 패턴 2의 안정성 데이터는 표 20에 나타내었다.
표 19. 가속 조건에서 CHP 무수물 (패턴 1)의 불순물 증가
Figure pct00028
표 20. 가속 조건에서 CHP 수화물 (패턴 2)의 불순물 증가
Figure pct00029
CHP 무수물은 CHP의 수분 함량이 7%에 도달할 때까지 수분을 흡수하였다. 따라서, CHP 무수물은 수분을 흡수하는 경향이 있다. CHP 무수물의 분해도 관찰되었다. 대조적으로, 가속 조건 하에서 6개월 동안 안정성 연구를 하는 동안 안정된 패턴 2 수화물 형태에 유의한 품질 변화는 없었다.
CHP 무수물 및 CHP 수화물 (패턴 2) 간의 총 불순물에 대한 비교는 도 54에 도시되어 있다.
실시예 6 - CHP 수화물에 대한 다형체 선별
다형성 연구는 개선된 고체-상태 특성을 가진 임의의 신규 다형체를 식별하려는 목적으로 CHP에 대해 수행되었다. 본 연구에서, CHP 패턴 2는 개발을 위한 안정한 형태로서 식별되었으며, 이는 화학양론적 일수화물이다. 본 연구는 공급된 CHP 무수물의 초기 분석 (패턴 1, 배치: 1058707), 30개의 용매 시스템에서의 용매 용해도 선별, 및 24개의 용매 시스템과 4개의 공정 관련 조건 (사이클링, 냉각, 반-용매 첨가 및 증발)을 사용하는 1차 다형체 선별을 수반하였다. 이후 1주의 안정성 평가 및 pH 용해도 평가를 포함하는, CHP 패턴 2의 2차 선별 스케일업을 하였다.
공급된 바와 같은, 물질은 XRPD에 의하면 결정성이고, 정의된 모폴로지가 없는 복굴절성 입자로 이루어진 것으로 밝혀졌다. 열적으로, 패턴 1은 샘플 용융이 170℃에서 나타나기 전 가열 개시에서 세 가지 작은 질량 손실을 나타내는 것으로 밝혀졌다. DVS 분석은 형태 변화가 일어났음을 보여주었으며, DVS 후 생성된 물질은 투입 물질의 수화된 형태임을 시사하였다. DVS 후 고체의 TG/DTA는 2차 다형체 선별 동안 분석된 패턴 2 물질의 열 데이터와 일치하는 TG/DTA 써모그램으로 이를 뒷받침하였다.
높은 용해도는 에탄올 및 메탄올에서 100≥x≥50 mg/mL 사이로 추정된 대략적인 용해도를 갖는 것으로 관찰되었다. 용해도 선별로부터 수집된 정보를 사용하여, 1차 다형체 선별은 공급된 CHP (패턴 1)로부터 준비된, 우세한 무정형 투입 물질을 사용하여 수행되었다. 하나의 신규 다형체, 순수한 패턴 1이, 패턴 1 및 2에 추가하여, 1차 선별에서 관찰되었다.
1차 다형체 선별로부터의 결과를 기반으로, 패턴 2는 추가 분석을 위해 스케일업되었다. 열적으로, 패턴 2 물질은 TG/DTA 실험 시작부터 재결정화가 약 120℃에서 일어나기 전에 0.9 당량의 물을 잃는 것을 확인하였다. 이는 170℃에서 용융으로 이어졌다. 용융 온도는 패턴 1의 것과 동일한 것으로 밝혀졌으며, 이는 샘플이 가열시 패턴 1로 탈수 및 재결정됨을 시사하였다. 재결정화 이벤트가 DSC 트레이스에서는 뚜렷하지 않았지만, 패턴 2에서 패턴 1으로의 재결정화의 증거는 핫 스테이지 PLM 현미경검사로 명백하였다. 패턴 2 CHP에 대한 단기적인 1주 안정성 연구는 평가된 조건 하에서 우수한 화학적 안정성을 나타내었지만, XRPD 분석은 패턴 2 투입 물질이 밀폐된 바이알에서 80℃로 7일 보관 후에 패턴 1로 전환됨을 보여주었다. 주변 및 40℃/75%RH에서 보관된 샘플은 패턴 2로 남아 있었다.
패턴 2 CHP에 대한 장기적인 8주 안정성 연구는, 40℃/75%RH에서 우수한 물리적 안정성을 나타내었다. XRPD 분석은 패턴 2가 8주 평가 기간 내내 우세함을 확인하였다.
순수한 패턴 1은 패턴 2의 VT/VH-XRPD 특성 분석 동안 초기에 관찰되었다. 80℃/0%RH에서 생성된 회절도는 일부 누락된 피크를 갖지만, 특히 17°2θ에서 패턴 1 물질과 유사한 피크 프로파일을 보여주었다. 초기 패턴 2 회절도와의 추가 비교는 누락된 피크가 패턴 2 회절도에 존재함을 나타내었다. 이는 (패턴 1로서 지정된) 공급된 물질이 순수한 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물임을 시사하였다. 순수한 패턴 1의 스케일업은 50℃ 또는 80℃의 가열에 의해 성공적이지 않았지만, 에탄올/디클로로메탄 혼합물이 물을 공비화(azeotroping) 하는 것 이외에 물질을 용해시켜 무수 패턴 1의 형성을 촉진하기 때문에, 에탄올/DCM에서 급속 증발에 의해 달성되었다.
순수한 패턴 1 CHP에 대한 8주 안정성 연구는, 40℃/75%RH에서 불량한 물리적 안정성을 나타내었다. XRPD 분석은 순수한 패턴 1이 14일 후에 패턴 2로 전환되었음을 확인하였다.
패턴 1 및 패턴 2 물질 둘 다는 안정성 평가 기간 내내 키랄적으로 순수하게 남아 있었다. 연구는 원래의 샘플에 대해 계속되었지만, 2주 시점으로부터 안정성 테스트를 받은 물질은 상기 온도 및 습도에서 순수한 패턴 1의 불량한 안정성으로 인해, 패턴 1이라기보다는 패턴 2이었다.
순수한 패턴 1 CHP의 단기적인 1일 안정성 테스트는 물질이 40℃/75%RH에서 2시간 후에 패턴 2로 전환됨을 보여주었다.
가장 안정된 형태로서 패턴 2를 강조하는 본 문서 내에 기술된 관찰을 기반으로, 패턴 2 물질을 준비하기 위한 신뢰할 수 있고, 확장 가능한 과정을 제공할 목적으로 결정화 개발 작업 프로그램이 권장된다.
A. 물질
하기 물질을 분석하였다.
배치/롯트/샘플 ID: 사이클로(-히스-프로) 배치: 1058707
SFS ID: CS/298/18/1 및 CS/298/18/2
공급된 양: 10g
외관: 회백색 고체
B. 분석 방법
1. X-선 분말 회절 (XRPD)
XRPD 분석은 PANalytical X'pert pro 상에서, 샘플을 3 및 35°2θ 사이에서 스캐닝하여 수행하였다. 물질을 부드럽게 분쇄하여 임의의 응집체를 풀어주고, 샘플을 지지하기 위해 Kapton 또는 Mylar 폴리머 필름이 있는 다중-웰 플레이트에 로딩하였다. 이후, 다중-웰 플레이트를 회절분석기에 넣고, 40 kV/40 mA의 발전기 설정을 사용한 전송 모드(스텝 크기 0.0130° 2θ)에서 실행되는 Cu K 방사선 (α1 λ = 1.54060 Å; α2 = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α1 : α2 비율 = 0.5)을 사용하여 분석하였다.
2. 편광 광학 현미경 (PLM)
결정화도 (복굴절)의 존재는 Motic 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어 (Motic Images Plus 2.0)가 장착된, Olympus BX50 편광 현미경을 사용하여 결정되었다. 모든 이미지는 달리 명시되지 않는 한, 20x 대물렌즈를 사용하여 기록되었다.
3. 핫 스테이지 광학 현미경
열 이벤트는 Motic 카메라 및 이미지 캡처 소프트웨어 (Motic Images Plus 2.0)가 장착된 Olympus BX50 편광 현미경에 결합된 컨트롤러 유닛이 연결되어 있는 보정된 Linkam THM600 핫 스테이지를 사용하여 시각적으로 모니터링되었다. 약 0.5 mg의 물질을 현미경 커버슬립에 놓고 10℃/분의 속도로 가열하면서 정례적인 간격으로 이미지 촬영하여 임의의 열 전이를 기록하였다. 모든 이미지는 달리 명시되지 않는 한, 10x 대물렌즈를 사용하여 기록되었다.
4. 열중량 분석 (TGA)
약 5 mg의 물질을 개방 알루미늄 팬에 칭량하여 동시 열중량/시차 열 분석기 (TG/DTA)에 로딩하고 실온에서 유지하였다. 이후, 샘플 무게의 변화가 임의의 시차 열 이벤트 (DTA)와 함께 기록되는 시간 동안 10℃/분의 속도로 20℃에서 300℃로 샘플을 가열하였다. 질소는 300 cm3/분의 유속으로, 퍼지 가스로서 사용되었다.
5. 시차 주사 열량측정 (DSC)
약 5 mg의 물질을 알루미늄 DSC 팬에 칭량하고, 구멍이 난 알루미늄 뚜껑으로 밀폐되지 않게 밀봉하였다. 이후, 샘플 팬을 (냉각기가 장착된) Seiko DSC6200에 로딩하고 20℃로 유지하였다. 일단 안정된 열-흐름 반응이 수득되면, 샘플 및 참조를 10℃/분의 스캔 속도로 250℃로 가열하고 열 흐름 반응 결과를 모니터링하였다. 질소는 50 cm3/분의 유속으로, 퍼지 가스로서 사용되었다.
6. 적외선 분광법 (IR)
적외선 분광법은 Bruker ALPHA P 분광기 상에서 수행되었다. 충분한 물질을 분광기의 플레이트 중앙에 놓고, 스펙트럼은 하기 매개변수를 사용하여 수득하였다:
해상도: 4 cm-1
백그라운드 스캔 시간: 16 스캔
샘플 스캔 시간: 16 스캔
데이터 수집 : 4000 내지 400 cm-1
결과 스펙트럼: 투과율
소프트웨어: OPUS 버전 6
7. 핵자기 공명 (NMR)
NMR 실험은 양성자에 대해 500.12 MHz에서 작동하는 DCH 저온탐침이 장착된 Bruker AVIIIHD 분광기로 수행하였다. 실험은 중수소화된 DMSO에서 수행하였으며, 각 샘플은 약 10 mM 농도로 준비하였다.
8. 동적 증기 흡착 (DVS)
약 10-20 mg의 샘플을 메쉬 증기 흡착 밸런스 팬에 넣고, Surface Measurement Systems사의 DVS 고유 동적 증기 흡착 밸런스에 로딩하였다. 샘플은 25℃에서 안정된 중량이 달성될 때까지 (dm/dt 0.004%, 최소 스텝 길이 30분, 최대 스텝 길이 500분) 각 단계에서 샘플을 유지하면서, 40%로부터 90% 상대 습도(RH)까지 10% 증분으로 램핑 프로파일을 적용하였다. 흡착 사이클의 완료 후에, 샘플은 0% RH로의 동일한 과정을 사용하여 건조시킨 다음, 다시 40% RH로의 제2 흡착 사이클을 거쳤다. 두 사이클이 수행되었다. 샘플의 흡습성 특성이 결정되도록, 흡착/탈착 사이클 동안의 중량의 변화를 플롯팅하였다. 이후, XRPD 분석은 임의의 잔류 고체에 대해 수행되었다.
9. 가변 온도 동적 증기 흡착 (VT-DVS)
약 10-20 mg의 샘플을 메쉬 증기 흡착 밸런스 팬에 넣고, Surface Measurement Systems사의 DVS Advantage 동적 증기 흡착 밸런스에 로딩하였다. 샘플은 40℃에서 안정된 중량이 달성될 때까지 (dm/dt 0.004%, 최소 스텝 길이 30분, 최대 스텝 길이 500분) 각 단계에서 샘플을 유지하면서, 40%로부터 90% 상대 습도(RH)까지 10% 증분으로 램핑 프로파일을 적용하였다. 흡착 사이클의 완료 후에, 샘플은 0% RH로의 동일한 과정을 사용하여 건조시킨 다음, 다시 40% RH로의 제2 흡착 사이클을 거쳤다. 샘플의 흡습성 특성이 결정되도록, 흡착/탈착 사이클 동안의 중량의 변화를 플롯팅하였다. 실험은 50℃에서 그리고 마지막으로 60℃에서 반복되었다. 이후, XRPD 분석은 임의의 잔류 고체에 대해 수행되었다.
10. 가변 온도 및 습도 X-선 분말 회절 (VT-/VH-XRPD)
VT-/VH-XRPD 분석은 온도 및 습도 챔버가 장착된 Philips X'Pert Pro Multipurpose 회절분석기로 수행하였다. 샘플은 40 kV/40 mA의 발전기 설정을 사용한 Bragg-Brentano 기하학 (스텝 크기 0.008 °2θ)에서 실행되는 Cu K 방사선 (α1 λ = 1.54060 Å; α2 = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α1 : α2 비율 = 0.5)을 사용하여 4 및 35.99°2θ 사이에서 스캐닝되었다. 측정은 하기 습도 프로파일의 각 단계에서 수행되었다:
프로그램: 40% RH/주변 온도-초기 스캔
0% RH/주변 온도-초기 스캔, 1시간 유지, 스캔
0% RH/80℃-초기 스캔, 20분 유지, 스캔
0% RH/80℃-초기 스캔, 80분 유지, 스캔
11. 고성능 액체 크로마토그래피-자외선 검출 (HPLC-UV)
기기: Dionex Ultimate 3000
컬럼: LC/168 X-Bridge 페닐 컬럼 (150 mm x 4.6 mm x 3.5 μm)
컬럼 온도: 30℃
자동 샘플러 온도: 5℃
UV 파장: 220 nm
주입량: 5 μL
유속: l ml/분
이동상 A: 10 mM 암모늄 아세테이트
이동상 B: 아세토니트릴
희석제: 물 중 0.1% TFA
구배 프로그램:
Figure pct00030
12. 액체 크로마토그래피-질량분석법 (LC-MS)
기기: Dionex Ultimate 3000
컬럼: ACE Excel 3 Super C18, 75 x 4.6 mm
컬럼 온도: 30℃
주입량: 10 μL
유속: 1.0 mL/분
이동상 A: 탈-이온수 중 0.1% 포름산
이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산
희석제: 아세토니트릴
바늘 세척: 아세토니트릴, 바이알 위치 #100
PDA 범위: 190-400 nm
구배 프로그램:
Figure pct00031
13. 키랄 HPLC
컬럼: Daicel IC (5.0 μm, 250*4.6 mm)
컬럼 온도: 30℃
주입량: 5μL
유속: 1.0 mL/분
이동상 A: n-헥산 중 0.01% DEA
이동상 B: EtOH: MeOH=2:8(v/v)
희석제: 아세토니트릴
PDA 범위: 220 nm
구배 프로그램:
Figure pct00032
C. 실험
1. 초기 특성 분석
본원에서 CHP로 일컬어지는, 제공된 사이클로(히스-프로)를 받는 즉시, 섹션 B에서 약술된 기법 및 방법을 이용한, 초기 특성 분석은 XRPD, PLM, TG/DTA, DSC, DVS (XRPD 후 분석 포함), 1H 및 HSQC NMR, HPLC (순도 및 UV 스펙트럼용), pKa, 및 LC-MS를 사용하여 수행되었다.
2. 용매 용해도 선별용 샘플 준비
수중 동결건조
물질을 하기와 같이 용매 용해도 선별을 위해 동결건조하여 준비하였다:
·공급된 CHP (패턴 1) (330 mg)에 3.3 mL의 증류수를 첨가하여, 투명한 무색 용액을 수득하였다;
·상기 용액을 33개의 2 mL 유리 바이알로 균등하게 나누었다 (각 바이알에 약 100 μL 및 10 mg의 고체를 포함함);
·바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다;
·일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 18시간 동안 건조하였다. 상기 시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하여 배치의 무정형 특성을 확인하였다.
수중 반복 동결건조
반복 동결건조는 하기와 같이 수행되었다:
·(섹션 5.2.1에 따라 준비된) 각 10 mg의 샘플은 200 μL의 증류수에 재-용해시켰다;
·바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다;
·일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 72시간 동안 건조하였다. 상기 시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하여 배치의 무정형 특성을 확인하였다.
3. 용매 용해도 선별
공지된 질량 (섹션 5.2.2로부터의, 10 mg)의 CHP 동결건조물에, 100 μL의 적절한 용매를 첨가하고, 고체가 남아 있을 경우 바이알을 ~40℃로 약하게 가열하여 용해를 도왔다. 용매 첨가는 물질이 완전히 용해되거나 2 mL가 첨가 (< 5 mg/mL) 될 때까지 계속하였다. 샘플은 뚜껑을 열고 주변에서 증발하도록 두었다. 용해도 선별에 사용된 용매는 표 21에서 확인할 수 있다.
4. 1차 다형체 선별용 샘플 준비
a. 수중 동결건조
물질은 1차 다형체 선별을 위해 하기와 같이 동결건조하여 준비하였다:
·공급된 CHP (1.04)에 13 mL의 증류수를 첨가하여, 투명한 무색 용액을 수득하였다;
·상기 용액을 26개의 2 mL 유리 바이알로 균등하게 나누었다 (각 바이알에 약 500 μL 및 40 mg의 고체를 포함함);
·바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다;
·일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 48시간 동안 건조하였다. 상기 시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하여 배치의 무정형 특성을 확인하였다.
b. 수중 반복 동결건조
제2 동결건조 시도는 하기와 같이 수행되었다:
·(섹션 a에 따라 준비된) 각 40 mg의 샘플에 1.5 mL의 증류수를 첨가하여 물질을 재-용해하였다;
·바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다;
·일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 72시간 동안 건조하였다. 상기 시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하여 배치의 무정형 특성을 확인하였다.
표 21. 용매 용해도 선별 용매 목록
Figure pct00033
C. 수중 반복 동결건조 (2)
제3 동결건조 시도는 하기와 같이 수행되었다:
·(섹션 b에 따라 준비된) 각 40 mg의 샘플에 1 mL의 증류수를 첨가하여 물질을 재-용해하였다;
·이후, 용액을 26개의 20 mL 유리 바이알에 피펫팅하여 옮기고, 추가로 15 mL의 증류수를 채웠다;
·바이알은 동결건조를 위한 준비로 -50℃에서 동결시켰다;
·일단 동결되면, 샘플을 동결 건조기에 부착된 데시케이터에 넣고 약 120시간 동안 건조하였다. 상기 시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하여 배치의 무정형 특성을 확인하였다.
5. 1차 다형체 선별
CHP의 1차 다형체 스크리닝은 하기와 같이 수행되었다:
·섹션 b로부터의 약 40 mg의 CHP가 포함되어 있는 24개의 바이알이 이 실험에 사용되었다;
·상기 물질을 적절한 용매/용매 혼합물에 현탁시키고, 온도를 주변 및 40℃ 사이로 72시간에 걸쳐 4시간 사이클로 사이클링시켰다. 사용된 용매는 표 22에서 확인할 수 있다;
·생성된 고체는 원심분리로 여과하여 분리하고 XRPD로 분석하였다. 임의의 신규 형태는 TG/DTA로 분석하였다;
·여과된, 포화 용액을 3개의 바이알로 나눈 다음, 하기와 같은 후속 다형체 스크리닝 실험에 사용하였다:
a. 증발
CHP의 포화 용액을 2 mL 바이알로 옮기고; 이후, 상기 바이알은 뚜껑을 열고 주변 온도에서 증발하도록 두어 물질을 회수하였다. 모든 회수된 물질은 XRPD로 특성 분석하였다.
b. 충돌 냉각
CHP의 포화 용액은 96시간 동안 2-8℃에서 보관하였다. 이때 회수된 임의의 물질을 XRPD로 분석하고, 바이알을 옮겨 -20℃에서 72시간 동안 보관하였다. 상기 시간 후에, 회수된 임의의 물질은 XRPD로 분석하였다.
c. 주변에서 반-용매 첨가
최대 2 mL의 반-용매 (헵탄 또는 MtBE)를 CHP의 포화 용액에 적가하였다. 샘플은 주변 온도에서 72시간 동안 뚜껑을 닫아 두었다. 임의의 생성된 고체는 XRPD로 분석하였다.
표 22. 1차 다형체 선별 용매 목록
Figure pct00034
6. 2차 다형체 선별
a. 패턴 2의 스케일업
CHP 패턴 2는 하기와 같은 요약된 과정으로 스케일업을 하였다:
·5 g의 공급된 CHP(패턴 1)를 6 mL의 90:10 에탄올/물 혼합물에서 슬러리화하였다;
·생성된 슬러리를 교반기에 올려놓고 약 24시간 동안 교반하였다;
·24시간 후 샘플은 쉐이커에서 꺼내고, 고체는 XRPD로 분석하였다;
·고체는 P-SFS1482-00 섹션 2.4에 따라 특성 분석하였다.
a. 순수한 패턴 1의 스케일업
i. 패턴 2의 80℃ 가열
·(섹션 5.6.1에 따라 준비된) 약 2.2 g의 패턴 2 물질을 50℃로 설정된 진공 오븐 안에 넣었다;
·1시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하였다;
·바이알을 진공 오븐으로 다시 넣고, 온도는 60℃로 증가시켰다;
·30분 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하였다;
·바이알을 진공 오븐으로 다시 넣고, 온도는 80℃로 증가시켰다;
·80℃에서 18시간 후에, 샘플을 취해서 XRPD로 분석하였다;
ii. 에탄올/DCM에서의 급속 회전 증발
·1 g의 공급된 CHP 패턴 1을 칭량하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고 40 mL의 에탄올에 용해하였다;
·일단 고체가 용해되면, 2 mL의 디클로로메탄을 피펫팅하여 플라스크에 가하였다;
·이후, 플라스크를 회전 증발기에 부착하고, 주변 온도로 진공 하에서 급속 증발시켰다;
·옅은 베이지색 고체를 회수하여 XRPD로 분석하였다.
7. pH 용해도 평가
CHP 패턴 1 및 2는 pH 용해도 평가를 위해 하기와 같이 준비하였다:
·100 mg의 CHP 패턴 1 및 패턴 2를 4 mL, 5 mL 스크류 탑 유리 바이알에서 각각 칭량하였다;
·37℃로 예열된, 100 μL의 선택된 버퍼를 각 바이알에 첨가하였다;
·샘플은 각 부피의 버퍼 첨가 후 약 10분 동안 인큐베이터 쉐이커에서 37℃로 가열하고 샘플 용해를 확인하였다.
C. 결과
1. 초기 특성 분석
CHP (CS/298/18)의 초기 특성 분석은 하기를 나타내었다:
·물질은 XRPD에 의하면 결정성이었다 (도 1). 제공된 CHP의 XRPD 패턴은 패턴 1로 표기되었다.
·PLM 분석은 물질이 명확한 모폴로지가 없는 복굴절성임을 확인하였다. 편광 및 비-편광 이미지는 각각 도 12 및 도 11에서 볼 수 있다.
·TG 분석은 가열의 개시로부터 샘플 분해가 관찰되는 약 280℃까지 일련의 작은 질량 손실 (0.6%, 0.2% 및 0.3%)이 있음을 보여주었다. DTA는 170℃의 개시 및 172℃에서의 피크를 갖는 하나의 급격한 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 필시 샘플 용융이다. TG/DTA 써모그램은 도 14에서 볼 수 있다.
·도 16은 DSC 분석의 제1 열 사이클을 보여준다. 작고 넓은 흡열 이벤트는 75℃에서 그리고 85℃에서의 피크가 주목되었다. 제2 흡열 이벤트는 169℃에서 관찰되었으며, 171℃에서 피크를 갖는다. 이는 TG/DT에서 나타난 용융과 일치하였다. 유의한 열 이벤트는 냉각 사이클에서 관찰되지 않았다 (도 17). 매우 작은 흡열 이벤트, 필시 약한 유리 전이는 제2 열 사이클 동안 75℃ - 80℃에서 주목되었다 (도 18).
·도 23의 DVS 등온선 플롯은 명확한 형태 변화를 나타내는 60%RH로부터 90%RH 시 +6.3%의 질량 변화를 보여주었다. 형태의 변화 후, 물질은 0% 및 90%RH 사이에서 0.8 중량%의 최대 흡수율로 약간의 흡습성을 보였다 (도 24). DVS 동력학적 플롯은 도 25에서 볼 수 있다. XRPD 분석에서는 패턴 1 투입 물질이 DVS 습도 조건에 노출 후 패턴 2 (섹션 3에 상세히 설명된, 용매 용해도 선별에서 초기에 나타남)로 재결정화됨을 확인하였다. XRPD 회절도는 도 26에서 볼 수 있다. 패턴 1 및 패턴 2의 회절도의 비교는 다수의 패턴 2 피크가 공급된 패턴 1에도 존재함을 보여준다. 이는 공급된 패턴 1이 잠재적인 혼합물임을 시사하였다. 이는 (섹션 B.1에 따라) 패턴 2 물질에 대해 VT/VH-XRPD를 수행하여 더 조사되었다.
·TG/DTA 분석은 패턴 2의 경우 DVS 후 회수된 고체에 대해 수행하였다. 써모그램은 도 27에서 볼 수 있다. TG 분석은 6.8%의 초기 중량 손실 (0.95 당량의 물) 이후, 280℃에서의 샘플 분해를 보여주었다. DT 트레이스는 초기 중량 손실과 관련된 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 제2 흡열 (샘플 용융)이 l68℃에서 관찰되기 전에, 발열 이벤트, 필시 물질의 재결정화로 이어졌다.
·공급된 CHP의 1H-NMR (도 35) 및 HSQC-NMR (도 38)은 제공된 구조와 일치하였다. 이미다졸 CH 신호는, 아마도 느린 이완으로 인해, 관찰되지 않았다.
·공급된 물질의 분석으로 6.38의 pKa 값을 얻었다 (도 10).
·CHP 패턴 1의 LC-MS 스펙트럼에서는 [C11H14N4O2]H+에 상응하는, 235.1의 예상된 m/z가 확인되었다 (도 55).
·공급된 CHP는 HPLC-UV로 분석하였을 때 99.5% 순수하였다. 관련된 크로마토그램은 도 56에 있다.
2. 용매 용해도 선별용 샘플 준비
a. 수중 동결건조
수중 동결건조로부터의 고체의 분석은 물질이 여전히 결정성임을 나타내었다. 무정형 물질의 2θ 회절도는 도 40에 제시되어 있다.
b. 수중 반복 동결건조
물에서 반복 동결건조된 고체의 분석은 상기 물질이 우세한 것으로 나타났다.
3. 용매 용해도 선별
상기 약술한 바와 같이, CHP 동결건조물의 용해도는 30개의 선택된 용매/용매 혼합물에서 평가되었다. 표 23의 결과로부터, 상기 물질은 본 연구에 사용된 대부분의 용매/용매 혼합물에서 낮은 용해도를 보였다. 높은 용해도는 메탄올 및 에탄올에서 100≥x≥50 mg/mL 사이로 추정된 대략적인 용해도를 갖는 것으로 관찰되었다. 물질은 또한 물, DMSO, DMA, 트리플루오로에탄올 및 메탄올/물 혼합물 모두에 가용성인 것으로 관찰되었다.
용매 용해도로부터, 회수된 고체의 XRPD 분석에서의 결과는 표 24에 있다. 생성된 각 패턴에 대한 XRPD 회절도의 예는 도 57에서 볼 수 있다. 나머지 회절도는 도 58 - 도 60에 포함되어 있다.
표 23: CHP 동결건조물의 용매 용해도 결과
Figure pct00035
표 24: 용매 용해도 선별로부터 XRPD 패턴 요약표
Figure pct00036
4. 1차 다형체 선별용 샘플 준비
a. 수중 동결건조
수중 동결건조된 고체의 분석은 샘플이 여전히 결정성임을 나타내었다. 회절도 패턴은 패턴 2로 식별되었다 (도 61).
b. 수중 반복 동결건조
도 62는 물에서 CHP의 반복 동결건조로부터 수득된 회절도를 보여준다. XRPD 분석은 물질이 도 61에 도시된 이전 샘플보다 덜 결정성이지만, 여전히 패턴 2 피크를 포함하고 있음을 확인하였다.
c. 수중 반복 동결건조 (2)
도 63은 물에서 CHP의 제3 동결건조 시도로부터 수득된 회절도를 보여준다. XRPD 분석은 물질이 도 61에 도시된 샘플보다 덜 결정성이지만, 도 62로부터 패턴 2 피크가 남아 있음을 확인하였다.
5. 1차 다형체 선별
상기 약술된 바와 같이, 다형성을 나타내는 CHP의 성향은 24개의 선택된 용매/용매 혼합물에서 평가되었다.
a. 온도 사이클링
1차 다형체 선별로부터의 온도 사이클링 실험 결과는 표 25에 제시되어 있다. 관련된 회절도는 도 64 - 66에 제시되어 있다.
·CHP 순수한 패턴 1은 50:50 메탄올/MtBE, 10:90 메탄올/MtBE, 에탄올/MtBE 혼합물 모두 및 에틸 아세테이트로부터 회수되었지만, 일부 우선배향(preferred orientation)이 이 샘플에서는 분명하였다.
·패턴 1은 에틸 포르메이트, 아세토니트릴, MEK 및 THF에서 회수되었다.
·5개의 용매 시스템은 패턴 2를 생성하였다; 헵탄, 이소프로필 아세테이트, MIBK, MtBE, 및 톨루엔.
·DCM으로부터 생성된 고체의 우선배향은 패턴을 지정할 수 없음을 의미하였다.
·고체는 클로로벤젠에서 주목되었으나 불충분한 양으로 생성되므로, XRPD 분석을 수행할 수 없었다.
·오일은 메탄올에서 생성되었다.
·나머지 용매 시스템은 용액이 생성되므로, XRPD 분석을 수행할 수 없었다.
표 25: 1차 다형체 선별 온도 사이클링
Figure pct00037
b. 증발
1차 다형체 선별로부터의 증발 실험의 결과는 표 26 및 도 113에 제시되어 있다. 관련된 회절도는 도 67에 제시되어 있다.
·불량한 결정 패턴 1은 아세토니트릴로부터 회수되었다.
·패턴 2는 트리플루오로에탄올로부터 한 번 및 니트로메탄으로부터도 한 번으로, 두 번 생성되었다.
·무정형 물질은 DCM 및 THF에서 식별되었다.
·고체는 10:90 에탄올/MtBE, 50:50 에탄올/ MtBE, MIBK 및 에탄올에서 주목되었으나 불충분한 양으로 생성되므로, XRPD 분석을 수행할 수 없었다.
·대부분의 용매 시스템은 바이알 벽 상에 무색 필름을 생성하므로, XRPD로 분석할 수 없었다.
표 26. 1차 다형체 선별 증발
Figure pct00038
c. 충돌 냉각
표 27은 1차 다형체 선별에서 2-8℃ 및 -20℃ 둘 다의 충돌 냉각으로부터 수득된 결과를 보여준다.
·충돌 냉각 실험은 온도 사이클링으로부터 불충분한 모액 생산으로 인해 50:50 메탄올/MtBE 및 메탄올에서는 수행하지 않았다.
·나머지 실험에서는 용액만 생성되었으므로, XRPD 분석을 수행할 수 없었다.
표 27: 1차 다형체 선별 충돌 냉각
Figure pct00039
d. 반-용매 첨가
표 28은 1차 다형체 선별에서 반-용매 첨가로부터 수득된 결과를 보여준다. 관련된 회절도는 도 68에 제시되어 있다.
·불충분한 고체가 아세톤, DCM, 및 50:50 에탄올/MtBE에서 생성되었다.
·(에탄올로부터의) 패턴 1이 반-용매 첨가 실험에서 관찰된 유일한 패턴이었다.
·반-용매 실험은 온도 사이클링으로부터 불충분한 모액 생산으로 인해 50:50 메탄올/MtBE 및 메탄올에서는 수행되지 않았다.
표 28. 1차 다형체 선별 반-용매 첨가
Figure pct00040
6. 1차 다형체 선별 요약
표 29 및 도 114는 1차 다형체 선별로부터의 결과 요약을 나타낸다.
표 29: 1차 다형체 선별 요약표
Figure pct00041
1차 다형체 선별에서는 온도 사이클링 후에 생성되고, 순수한 패턴 1로서 지정된, 1개의 신규 형태의 CHP를 식별하였다. 패턴 1 및 2는 또한 온도 사이클링으로부터 다수의 용매 시스템에서도 재생성되었다. 2-8℃ 및 -20℃ 둘 다의 충돌 냉각 실험에서는 투명한 용액만 회수되었다. 대부분의 용매 시스템은 반-용매 첨가 실험에 있어서 투명한 용액이 회수되었으나, 패턴 1은 MtBE 첨가 후 에탄올에서 볼 수 있었다.
7. 2차 다형체 선별
a. 패턴 2의 스케일업
도 69는 패턴 2 스케일업의 XRPD 결과를 보여준다. XRPD 회절도에서는 패턴 2 형성이 확인되었다.
b. 순수한 패턴 1의 스케일업
i. 패턴 2의 80℃ 가열
순수한 패턴 1은 본 실험에서 성공적으로 생성되지 않았다. 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물은 50℃ 및 80℃ 모두에서 회수되었다. 8°2θ에서 이전에 볼 수 없었던 피크가 샘플을 50℃에서 90분 동안 유지한 후 나타났다. 이 피크는 80℃에서 18시간 후에 강도가 증가하였다. 관련된 회절도는 도 70에서 볼 수 있다.
ii. 에탄올/DCM의 급속 회전 증발
에탄올/DCM의 급속 증발로부터 회수된 고체의 분석은 물질이 XRPD에 의하면 순수한 패턴 1인 것으로 나타났다. 회절도는 도 71에 있다.
c. 패턴 2의 특성 분석
90:10 에탄올/물로부터의 CHP 패턴 2의 분석은 하기 결과를 산출하였다:
·물질은 XRPD에 의하면 결정성이었고, 1차 다형체 선별에서 수득된 패턴 2 회절도의 결정성과 일치하였다 (도 72).
·PLM 이미지는 CHP 패턴 2에 대해서도 촬영되었으며, 상기 물질이 단편화된, 막대-유사 모폴로지를 갖는 복굴절성인 것으로 밝혀졌다. 편광 및 비-편광 광학 이미지는 도 73에서 볼 수 있다.
·핫 스테이지 현미경검사는 CHP 패턴 2에 대해서도 수행되었다. 초기 이미지는 막대-유사 모폴로지로 식별되었다 (도 74). 이는 도 69의 PLM 분석으로부터의 이미지와 일치하였다. 물질은 95℃에서 용융하기 시작하고, 101℃에서 완전히 용융된 것으로 관찰되었다. 재결정화는 115℃에서 일어나는 것으로 관찰되었다. 핫 스테이지 후 촬영된 PLM 이미지는 물질 모폴로지가 더 이상 명확하게 정의되지 않았지만, 샘플이 여전히 복굴절성임을 보여준다. 핫 스테이지 후 물질의 편광 및 비-편광 이미지는 도 75에서 볼 수 있다.
·TG/DTA - TG 분석은 6.5%의 초기 중량 손실 (0.9 당량의 물) 이후 280℃에서의 샘플 분해를 보여주었다. DT 트레이스는 초기 중량 손실과 관련된 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 제2 흡열 (샘플 용융)이 170℃에서 관찰되기 전에, 발열 이벤트, 필시 물질의 재결정화로 이어졌다 (도 76).
·DSC의 초기 열 사이클은 99℃의 개시 및 102℃에서의 피크를 갖는 흡열 이벤트를 식별하였다 (도 77). 이는 TGA에서 보이는 재결정화 이벤트가 DSC에서는 나타나지 않았지만, TGA에서 관찰된 흡열 데이터와는 일치하였다. 열 이벤트는 냉각 사이클에서 관찰되지 않았다 (도 78). 제2 열 사이클은 75℃에서 가능한 유리 전이를 식별하였다 (도 79).
·도 80은 CHP 패턴 2의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. 피크 표는 표 30에서 볼 수 있다.
·VT-/VH-XRPD 분석: 패턴 2 투입 물질은 주변 온도에서 습도가 0%로 낮아졌을 때 남아 있었다. 온도가 80℃로 증가함에 따라, 물질은 순수한 패턴 1로 지정된 형태로 변화하였다. 순수한 패턴 1은 80분 동안 80℃로 유지되었을 때 남아 있었다. 표 31은 각 단계에서의 습도, 온도 및 패턴 식별을 보여준다. 관련된 회절도는 도 81에서 볼 수 있다.
·CHP 패턴 2의 DVS 분석은 물질이 40%RH로부터 90%RH 시, 또는 90%RH로부터 10%RH 시 형태가 변화하지 않았으나, 10%RH 미만에서 3.5 중량% (0.5 당량의 물)가 손실됨을 보여주었다. 재수화는 0%로부터 90%RH 시 일어나는 것으로 주목되었다. 이는 도 82의 DVS 등온선 플롯에서 볼 수 있다. 도 83은 DVS 동력학적 플롯을 보여준다. DVS 후 XRPD 분석은 40%RH에서 형태의 변화가 없음을 보여주었다. XRPD 회절도의 비교는 도 84에서 볼 수 있다. 본 실험에서 관찰된 비-화학양론적 물 손실은 탈수의 동력학이 너무 느려서 기기가 단계 완료 전에 다음 단계로 이동하는 것과 더불어, 주변 온도 (약 25℃)에 기인한 것으로 여겨졌다. 이를 추가로 조사하고자, 가변 온도 DVS 실험이 수행되었으며, 하기에 상세히 설명된다.
·40℃에서 VT-DVS 분석은 물질이 10%RH 미만에서 탈수되기 시작하여, 10%로부터 0%RH 시 약 5.8 중량%를 손실함 (0.8 당량의 물)을 보여주었다. 이후, 물질은 0%로부터 40%RH 시 재수화된다. DVS 등온선 플롯은 도 85에서 그리고 동력학적 플롯은 도 86에서 볼 수 있다. 50℃에서의 DVS 분석은 물질이 20%RH 미만에서 탈수되기 시작하여, 약 6.1 중량%를 손실함 (0.8 당량의 물)을 보여주었다. 이후, 물질은 0%로부터 40%RH 시 재수화된다. 도 87은 50℃ 등온선 플롯을 보여주고, 도 88은 동력학적 플롯을 보여준다. 60℃에서 VT-DVS는 물질이 20%RH 미만에서 탈수되기 시작하여, 약 7 중량% 또는 1.0 당량의 물이 손실됨을 보여주었다. 물질은 0% 내지 40%RH 사이에서 재수화되는 것으로 주목되었다. 60℃ 등온선 플롯은 도 89에서 볼 수 있다. 동력학적 플롯은 도 90에서 볼 수 있다. 회수된 고체에 대한 XRPD 분석은 DVS 후, 물질이 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물임을 보여주었다. 비교 XRPD 회절도는 도 91에서 볼 수 있다.
·CHP 패턴 2의 HPLC 순도가 99.5%인 것으로 밝혀졌다.
표 30: 에탄올/물로부터의 CHP 패턴 2의 FT-IR 피크 표
Figure pct00042
표 31. CHP 패턴 2의 VT/VH-XRPD 결과
Figure pct00043
8. pH 용해도 평가
CHP 패턴 1 및 패턴 2 둘 다에 대한 pH 용해도 평가는 용해가 테스트된 모든 pH 값 (pH 1, 4, 6.8 및 7.2)에서 3 부피의 버퍼 첨가 후에 일어나는 것으로 밝혀졌다. 패턴 1 및 패턴 2의 용해도는 500≥x≥333.3 mg/mL로 추정되었다. 결과 요약은 표 32에 나타낸다.
용해 후 샘플의 이미지는 패턴 1 물질에 대해서는 도 92에서 그리고 패턴 2에 대해서는 도 93에서 볼 수 있다.
표 32. pH 용해도 결과 요약표
Figure pct00044
9. 안정성 연구
a. 1주 안정성 평가
40℃/75%RH, 80℃ 및 주변광에서 테스트된 샘플에 대한 XRPD 2θ 회절도는 도 94에 도시되어 있다. 40℃/75%RH 또는 주변광에서 보관된 샘플의 경우 형태 변화가 관찰되지 않았다. 패턴 2 물질은 이전의 열 실험, DVS 및 VT/VH XRPD 실험을 기반으로 예상된 바와 같이, 80℃에서 7일 후에 패턴 1로 전환되는 것으로 밝혀졌다.
CHP 패턴 2에 대한 HPLC 순도 결과는 표 33에 제시되어 있다. 7일 보관 후 모든 조건에서 순도 저하는 없었다. 안정성 샘플에 대한 HPLC 크로마토그램은 도 95 - 97에 도시되어 있다.
표 33. CHP 패턴 2의 1주 안정성 순도 결과
Figure pct00045
b. 8주 안정성 평가
i. 2주 시점
2주 시점에 대한 XRPD 2θ 회절도는 순수한 패턴 1의 경우 도 98에, 그리고 패턴 2의 경우 도 99에 도시되어 있다. 결과는 순수한 패턴 1이 40℃/75%RH에서 14일 후에 패턴 2로 전환되었음을 보여준다. 14일 후 CHP 패턴 2에 대해 관찰된 형태의 변화는 없었다.
ii. 4주 시점
4주 시점에 대한 XRPD 2θ 회절도는 순수한 패턴 1의 경우 도 100에, 그리고 패턴 2의 경우 도 101에 도시되어 있다. 결과는 이전에 2주 후 패턴 2로 전환된 순수한 패턴 1 물질이 40℃/75%RH에서 4주 후에 패턴 2로서 남아 있음을 보여준다. 4주 후 CHP 패턴 2에 대해 관찰된 형태의 변화는 없었다.
iii. 8주 시점
8주 시점에 대한 XRPD 2θ 회절도는 순수한 패턴 1의 경우 도 102에, 그리고 패턴 2의 경우 도 103에 도시되어 있다. 결과는 이전에 2주 후 패턴 2로 전환된 순수한 패턴 1 물질이 40℃/75%RH에서 8주 후에 패턴 2로서 남아 있음을 보여준다. 8주 후 CHP 패턴 2에 대해 관찰된 형태의 변화는 없었다.
iv. 외관 테스트
표 34 및 도 115는 8주 안정성 연구의 외관 테스트 결과를 보여준다. 순수한 패턴 1 및 패턴 2의 외관은 실험 기간 내내 변함없이 남아 있었다.
표 34: 8주 안정성 외관 결과 요약
Figure pct00046
v. 키랄 HPLC
HPLC 분석은 순수한 패턴 1 및 패턴 2 투입 샘플 둘 다 높은 키랄 순도임이 확인되었다. 안정성 평가 기간 내내 키랄 순도에는 변화는 없었다. 결과 요약은 표 35에서 볼 수 있다. HPLC 크로마토그램은 도 104 - 도 110에서 확인할 수 있다.
표 35: 키랄 HPLC 결과 요약
Figure pct00047
c. 1일 안정성 평가
40℃/75%RH에서의 보관으로부터의 XRPD 결과는 도 111에 도시되어 있다. 순수한 패턴 1이 40℃/75%RH에서 2시간 후에 패턴 2로 전환되는 것으로 밝혀졌다. 원래의 실험에는 4, 6 및 8 시간의 시점이 더 포함되었으나, 제1 시점 이후에 물질이 패턴 2로 전환되었으므로, 실험은 2시간 후에 중단하였다.
d. 결과 요약
1. 초기 특성 분석
제공된 물질인, CHP는 XRPD에 의하면 결정성이고, PLM에 의해 명확하게 정의된 모폴로지가 없는 복굴절성인 것으로 밝혀졌다. 상기 물질은 TG/DTA에 의하면 0.6, 0.2 및 0.3%의 몇 가지 질량 손실을 보였으며, 280℃로 가열된 경우 분해되는 것으로 밝혀졌다. 용융은 170℃에서도 관찰되었다. DSC는 75℃에서 용매 (물) 손실로 인한, 작은 흡열 이벤트를 나타내었다. 제2 흡열 이벤트는 169℃에서 관찰되었으며, 171℃에서 피크를 갖는다. 이는 TG/DT에서 보이는 용융과 일치하였다. 유의한 열 이벤트는 냉각 사이클에서 관찰되지 않았으나, 약한 유리 전이가 제2 열 사이클 동안 75℃에서 주목되었다.
DVS 데이터는 명확한 재결정화 이벤트를 나타내는 60%RH로부터 90%RH 시 +6.3%의 질량 변화를 보여주었다. 재결정화 후, 물질은 0% 및 90%RH 사이에서 0.8 중량%의 최대 흡수율로 약간의 흡습성을 보였다. DVS 후, XRPD 분석은 형태의 변화를 확인하였다. DVS 후 생성된 회절도 패턴은 패턴 2로 지정되었으며, 패턴 1의 수화된 형태로 식별되었다. DVS 후, TG/DTA는 패턴 2 투입 물질이 가열시 탈수되고 6.8 중량% (0.95 당량의 물)가 손실되었음을 보여주었다. 이는 샘플이 168℃에서 용융되기 전에, 재결정화가 뒤따랐다. 이 용융의 온도는 패턴 1 용융과 일치하였다. 두 샘플 간의 용융점의 일관성은 패턴 2가 일수화물이며, 패턴 1으로의 재결정화 전에 가열시 약 1 당량의 물이 손실됨을 의미한다.
NMR 데이터는 제공된 구조와 일치하며, 용매 함량이 없음을 보여주었다.
2. 용매 용해도
공급된 CHP (패턴 1)는 본 연구에 사용된 대부분의 용매/용매 혼합물에서 낮은 용해도를 보여주었다. 높은 용해도는 메탄올 및 에탄올에서 100≥x≥50 mg/mL 사이로 추정된 대략적인 용해도를 갖는 것으로 관찰되었다. 물질은 또한 물, DMSO, DMA, 트리플루오로에탄올, 및 메탄올/물 혼합물 모두에 가용성인 것으로 관찰되었다. 패턴 2는 (공급된 패턴 1에 추가로) 본 실험 동안 식별된 유일한 신규 결정 형태이었다. 패턴 2는 17개의 용매 시스템으로부터 회수되었으며, 패턴 1은 오로지 1-프로판올에서만 보였다. 패턴 1 및 패턴 2의 혼합물은 에탄올에서 주목되었다. THF에서는 일부 패턴 2 피크를 갖는 무정형 물질이 회수되었다.
3. 1차 다형체 선별
1차 다형체 선별에서는 온도 사이클링 후에 생성되고 순수한 패턴 1로서 지정된, 1개의 신규 형태의 CHP를 식별하였다. 패턴 1 및 2는 또한 온도 사이클링으로부터 다수의 용매 시스템에서도 재생성되었다. 2-8℃ 및 -20℃ 둘 다의 충돌 냉각 실험에서는 투명한 용액만 회수되었다. 대부분의 용매 시스템은 반-용매 첨가 실험에 있어서 투명한 용액이 회수되었으나, 패턴 1은 MtBE 첨가 후 에탄올에서 보였다.
4. 2차 다형체 선별
2차 다형체 선별에서는 에탄올/물로부터 CHP 패턴 2의 성공적인 스케일업을 확인하였다. 물질의 분석은 하기 결과를 도출하였다:
·물질은 XRPD에 의하면 결정성이었고, 1차 다형체 선별에서 수득된 패턴 2의 회절도의 결정성과 일치하였다.
·PLM 이미지는 CHP 패턴 2에 대해서도 촬영되었으며, 상기 물질이 단편화된, 막대-유사 모폴로지를 갖는 복굴절성인 것으로 밝혀졌다.
·핫 스테이지 현미경검사의 실험 초기에 촬영된 초기 이미지는 막대-유사 모폴로지로 식별되었고, 이는 패턴 2 PLM 이미지와 일치하였다. 물질은 95℃에서 용융하기 시작하고, 101℃에서 완전히 용융된 것으로 관찰되었다. 재결정화는 115℃에서 일어나는 것으로 관찰되었다. 핫 스테이지 후 촬영된 PLM 이미지는 물질 모폴로지가 더 이상 명확하게 정의되지 않았지만, 샘플이 여전히 복굴절성임을 보여준다.
·TG/DTA - TG 분석은 6.5%의 초기 중량 손실 이후 280℃에서의 샘플 분해를 보여주었다. DT 트레이스는 초기 중량 손실과 관련된 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 제2 흡열 (샘플 용융)이 170℃에서 관찰되기 전에, 발열 이벤트, 필시 물질의 재결정화로 이어졌다.
·DSC의 초기 열 사이클은 99℃의 개시 및 102℃에서의 피크를 갖는 흡열 이벤트를 식별하였다. 이는 TGA에서 보이는 재결정화 이벤트가 DSC에서는 나타나지 않았지만, TGA에서 관찰된 흡열 데이터와는 일치하였다. 열 이벤트는 냉각 사이클에서 관찰되지 않았으나, 작은 유리 전이가 제2 열 사이클에서 75℃로 관찰되었다.
·VT-/VH-XRPD 분석: 패턴 2 투입 물질은 주변 온도에서 습도가 0%로 낮아졌을 때 남아 있었다. 온도가 80℃로 증가함에 따라, 물질은 순수한 패턴 1로 지정된 형태로 변화하였다. 순수한 패턴 1은 80분 동안 80℃로 유지되었을 때 남아 있었다.
·CHP 패턴 2의 DVS 분석은 물질이 40%RH로부터 90%RH 시 또는 90%RH로부터 10%RH 시 형태가 변화하지 않았으나, 10%RH 미만에서 3.5 중량% (0.5 당량의 물)가 손실됨을 보여주었다. 재수화는 0%로부터 90%RH에서 일어나는 것으로 주목되었다. DVS 후 XRPD 분석은 40%RH에서 형태의 변화가 없음을 보여주었다.
·VT-DVS - 샘플은 40℃에서 10%RH 미만, 및 50 및 60℃에서 20%RH 미만 시 탈수되었다. 물질은 증가하는 각 온도에서 더 높은 퍼센티지의 물이 손실되었으나, 각 실험에서 0%로부터 40%RH 시 재수화되었다. 패턴 1 및 2의 혼합물은 XRPD에 의하면 VT-DVS 후 확인되었다.
·CHP 패턴 2의 HPLC 순도가 99.5%인 것으로 밝혀졌다.
순수한 패턴 1은 XRPD로 확인되는 패턴 1 및 2의 혼합물과 더불어, 80℃로 가열시에 성공적으로 재생성되지 않았다. 또한, XRPD는 일단 샘플이 50℃에서 90분 동안 유지되면 이전에 보이지 않은 8°2θ에서의 피크를 식별하였다. 이 피크는 80℃에서 18시간 후에 강도가 증가하였다. 이 피크는 본 연구에서 생성된 임의의 다른 회절도에서도 볼 수 없었다.
순수한 패턴 1의 성공적인 재-제조는 에탄올/DCM에서의 급속 증발에 의해 달성되었다.
5. 1주 안정성 연구
1주 안정성 연구는 패턴 2가 평가된 조건 (40℃/75%RH, 80℃ 및 주변광) 하에서 우수한 화학적 안정성을 나타냄을 보여주었다. 7일 후에 임의의 샘플에 대해서도 순도 변화가 관찰되지 않았다.
80℃의 상승된 온도는 1주 후에 패턴 2로부터 패턴 1로의 탈수를 야기하였으나, 물질이 40℃/75%RH 및 주변광에서 보관될 때는 패턴 2로 남아 있었다.
6. 8주 안정성 연구
8주 안정성 연구는 물질이 제1 (2주) 시점 후 수화된 패턴 2로 전환됨과 더불어, 순수한 패턴 1 물질이 40℃/75%RH에서 불량한 물리적 안정성을 나타냄을 보여주었다. 연구는 원래의 샘플에 대해 계속되었지만, 2주 시점으로부터 안정성 테스트를 받은 물질은, 상기 온도 및 습도에서 순수한 패턴 1의 불량한 안정성으로 인해, 패턴 1이라기보다는 패턴 2이었다. XRPD에 의해 확인된 형태의 변화에도 불구하고, 테스트된 임의의 시점에서도 외관 변화가 주목되지 않았다.
반대로, 패턴 2는 8주 안정성 평가 기간 동안 관찰된 형태의 변화 없이 우수한 물리적 안정성을 보여주었다. 패턴 2 물질의 외관은 실험 내내 임의의 시점에서도 변화하지 않았다. 순수한 패턴 1 및 패턴 2 둘 다는 8주 평가의 초기에 높은 키랄 순도임을 밝혀내었으며, 이는 실험 기간 내내 모든 샘플에서 많이 남아 있었다.
7. 1일 안정성 연구
1일 안정성 평가는 순수한 패턴 1 물질이 고습도 조건에서 패턴 2로 쉽게 전환됨을 확인하였다. XRPD 분석은 40℃/75%RH에서 단지 2시간 후에 형태 변화가 일어났음을 확인하였다.
8. pH 용해도 평가
CHP 패턴 1 및 패턴 2 둘 다에 대한 pH 용해도 평가는 용해가 테스트된 모든 pH 값 (pH 1, 4, 6.8 및 7.2)에서 3 부피의 버퍼 첨가 후에 일어나는 것으로 밝혀졌다. 패턴 1 및 패턴 2의 용해도는 500≥x≥333.3 mg/mL로 추정되었다.
e. 결론
패턴 2 CHP에 대한 장기 8주 안정성 연구는, 40℃/75%RH에서 우수한 물리적 안정성을 나타내었다. XRPD 분석은 패턴 2가 8주 평가 기간 내내 우세함을 확인하였다. 순수한 패턴 1 CHP에 대한 8주 안정성 연구는, 40℃/75%RH에서 불량한 물리적 안정성을 나타내었다. 패턴 2는 추가 개발에 가장 적합한 형태의 CHP이다.
실시예 7 - 안정성 연구
목적: 원료의약품, GMP 모드에 대한 안정성 데이터를 저장하고 생성하기 위함.
패키징: 각 개별 시점에서의 샘플을 케이블 타이로 모두 고정시킨 이중 정전기 방지 LDPE 백(bag)으로 포장하였다. 동일한 보관 조건으로 포장된 샘플을 섬유 드럼 내에 함께 보관하고, 금속 뚜껑으로 닫았다. 모든 패키지는 동일한 방식으로 준비하고 라벨을 붙였다. 패키지 재료 설명에 대한 세부사항은 표 36에 제공된다.
표 36. 패키지 재료 설명
Figure pct00048
주석: 정전기 방지 LDPE 백은 STA에 의해 제공되었으며, 이는 안정성 연구에 사용되기 전에 작은 것으로 잘려져 열(heat) 밀봉될 것이다.
타임 제로는 샘플이 거치대에 배치되는 날이 될 것이다. 초기 테스트 결과는 샘플이 30일의 방출 테스트 일자 이내에 거치대에 놓이는 한, 방출 테스트로부터 나왔으며, 그렇지 않았다면, 초기를 반복하였다. 안정성 프로토콜은 표 37에 제공되었다.
표 37. 안정성 프로토콜
Figure pct00049
테스트 항목: X = 샘플을 추출하고 외관, HPLC에 의한 분석 및 불순물, 키랄 및 수분 함량에 대해 테스트한다.
Y = 샘플을 추출하고 XRPD에 대해 테스트한다.
"---" = 예정되지 않음
연구 요건: 총 22.5g의 샘플 (초기 테스트가 필요하지 않은 경우, 총 21 g의 샘플):
·필요한 경우, 초기 테스트용 1.5 g;
·21 g의 샘플은 14개 파트(parts), 각 파트에 대해 1.5 g으로 나뉘어질 것이며, 각 파트에 대한 샘플은 케이블 타이로 모두 고정시킨 이중 정전기방지 LDPE 백(bag)에서 칭량되어야 한다. 각 보관 조건에 대한 안정성 샘플은 섬유 드럼 내에 함께 보관하고, 금속 뚜껑으로 닫은 다음, 각각 25±2℃/60+5%RH (9 백) 및 40±2℃/75±5%RH (5 백)에서 보관한다.
샘플링 시간:
6개월 이하 보관된 샘플은 예정일 또는 예정일 이후 영업일 기준 2일 이내에 추출되었다. 6개월 이상 보관된 샘플은 예정일의 영업일 기준 +2일 이내에 추출되었다.
샘플 보관 및 테스트 기간 제한:
1개월 내지 1년, 및 1년 이상 동안 보관된 안정성 샘플은 샘플을 각각 안정성 챔버로부터 추출한 후 영업일 기준 10일 및 20일 이내에 분석되고 완료되었다. 타임 제로 테스트가 수행된 경우, 연구 개시 후 영업일 기준 10일 이내에 분석되었다.
패턴 2의 안정성에 대한 상세한 정보는 표 38 및 표 39에 제공된다.
표 38. 25℃/60%RH에서 6개월 안정성 결과.
Figure pct00050
* 주석: 참조 표준 (배치 No.: PS03027-15-H)은 XRPD 분석에 사용되었다. 참조 표준 (배치 No.: 1056491)은 다른 화학물질에 대해 각각 사용되었다.
*1주석: 초기 데이터는 C180726100-H의 방출성 COA를 참조하였다.
표 39. 40℃/75%RH에서 6개월 안정성 결과.
Figure pct00051
안정성 샘플에 대한 결과는 사양의 허용 기준을 충족하였다. 불순물 테스트에 대한 블랭크, 분별 용액 및 샘플 용액 (6M)의 대표적인 중첩 크로마토그램이 도 112에 제공된다.
본원에 기술된 구현예는 예시적인 것으로 의도된다. 당업자는 변경 및 변형이 하기의 청구범위에 포함된 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (30)

  1. 약 13.7, 17, 및 27.3 도 (±0.2°의 2θ)에서의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절(XRPD) 회절도를 특징으로 하는 사이클로(-히스-프로) 수화물 화합물.
    Figure pct00052
  2. 제1항에 있어서, 상기 XRPD 회절도는 약 10 도 (±0.2°의 2θ)에서의 피크를 더 포함하는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 XRPD는 도 2(b)에 나타낸 바와 실질적으로 유사한 것인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 약 75℃ 내지 약 100℃에서 시차 주사 열량측정(DSC)의 흡열 개시를 갖는, 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 약 115℃ 내지 약 120℃의 DSC 발열 개시를 갖는, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 약 100℃ 및 약 170℃에서 최대 피크인 2개의 흡열 피크를 갖는 DSC 써모그램을 갖는, 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 하기 중 적어도 2개를 특징으로 하는 화합물:
    (a) 다음 목록에서 적어도 2개의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절도: 10, 13.7, 17, 18.1, 20.2 및 27.3 도 (±0.2°의 2θ);
    (c) 편광 광학 현미경검사로 분석시 단편화된, 막대-유사 모폴로지를 갖는 복굴절;
    (d) 열중량 분석 기법으로 분석시 6.5%의 초기 중량 손실 (0.9 당량의 물)에 뒤이어, 약 280℃에서의 샘플 분해;
    (e) DSC의 제1 열 사이클에서 99℃의 개시 및 102℃에서의 피크를 갖는 흡열;
    (f) 40℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 상대 습도(RH) 10% 미만에서 탈수 시작, 10%로부터 0% RH 시 약 6 중량% 손실 (0.8 당량의 물) 및 0%로부터 40% RH 시 수화; 및
    (h) 60℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 20% RH 미만에서 탈수 시작, 20%로부터 0% RH 시 약 7 중량%의 손실 (1.0 당량의 물) 및 0%로부터 40% RH 시 재수화.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 90%, 적어도 약 95%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 약 100%로 이루어진 군으로부터 선택된 순도를 갖는, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 실온에서 약 6개월, 약 12개월, 약 18개월, 약 24개월, 또는 약 36개월 동안 안정한 것인, 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 실질적으로 용매가 없는, 화합물.
  11. 사이클로(-히스-프로) 수화물을 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 약 1%, 약 2%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10% (w/w)의 사이클로(-히스-프로) 수화물을 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 약 1 내지 약 20 퍼센트 (중량%)의 사이클로(-히스-프로) 수화물을 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 추가의 치료적 활성제, 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 이들의 조합을 더 임의로 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 경구로, 국소적으로, 비경구로, 정맥내로, 피내로, 결장내로, 직장내로, 근육내로 또는 복강내로 투여하기에 적합한 투여 형태인, 약학적 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화된, 약학적 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 상기 사이클로(-히스-프로) 수화물의 농도는 약 1 mg/L 내지 약 200 mg/㎖인, 약학적 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 경구 단위 투여 형태로 제형화된, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 약 1 mg 내지 약 100 mg의 사이클로(-히스-프로) 수화물의 투여 단위를 포함하는, 약학적 조성물.
  20. 하기를 포함하는 약학적 조성물:
    a. 실질적으로 순수한 사이클로(-히스-프로) 수화물;
    b. 적어도 하나의 추가의 치료적 활성제; 및
    c. 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 활성제는 생체분자, 생물 활성제, 소분자, 약물, 전구약물, 약물 유도체, 단백질, 펩티드, 백신, 보조제, 영상화제, 폴리뉴클레오티드 또는 금속인, 약학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 활성제는 아연인, 약학적 조성물.
  23. 하기 단계를 포함하는 사이클로(-히스-프로) 수화물의 합성 방법:
    a. EtOH/물에 사이클로(-히스-프로) 무수물을 첨가하여 혼합물을 형성하는 단계;
    b. 혼합물을 약 50℃로 가열하여 용해시켜 용액을 형성하는 단계;
    c. 단계 (b)의 용액을 약 35℃로 냉각시키는 단계;
    d. 시드(seed)를 첨가하고 약 2 내지 약 3시간 동안 에이징하는 단계;
    e. 약 5℃로 냉각하는 단계;
    f. 약 5℃에서 약 8시간 동안 MtBE를 첨가하는 단계;
    g. 약 5℃에서 약 8 내지 약 10시간 동안 교반하는 단계;
    h. 필터링하여 습식 생성물을 얻는 단계; 및
    j. 상기 습식 생성물을 EtOH/물/MtBE로 세척하고, 진공 하에서 약 35℃로 건조하여 사이클로(-히스-프로) 수화물 화합물을 형성하는 단계.
  24. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 약 13.7, 17, 및 27.3 도 (±0.2°의 2θ)에서의 피크를 포함하는 XRPD 회절도를 특징으로 하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 XRPD 회절도는 약 10도 (±0.2°의 2θ)에서의 피크를 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 화합물은 적어도 20시간 동안 안정한, 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 사이클로(-히스-프로) 수화물은 용매를 사용한 결정화에 의해 분리되는, 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 사이클로(-히스-프로) 수화물의 DSC 써모그램은 약 100℃ 및 약 170℃에서 최대 피크인 2개의 흡열 피크를 갖는 것인, 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 사이클로(-히스-프로) 수화물은 하기 중 적어도 2개를 특징으로 하는, 방법:
    (a) 다음 목록에서 적어도 2개의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절도: 10, 13.7, 17, 18.1, 20.2 및 27.3 도 (±0.2°의 2θ);
    (c) 편광 광학 현미경검사로 분석시 단편화된, 막대-유사 모폴로지를 갖는 복굴절;
    (d) 열중량 분석 기법으로 분석시 6.5%의 초기 중량 손실 (0.9 당량의 물)에 뒤이어, 약 280℃에서의 샘플 분해;
    (e) DSC의 제1 열 사이클에서 99℃의 개시 및 102℃에서의 피크를 갖는 흡열;
    (f) 40℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 RH 10% 미만에서 탈수 시작, 10%로부터 0% RH 시 약 6 중량% 손실 (0.8 당량의 물) 및 0%로부터 40% RH 시 수화; 및
    (h) 60℃ 동적 증기 흡착 분석 중에 20% RH 미만에서 탈수 시작, 20%로부터 0% RH 시 약 7 중량%의 손실 (1.0 당량의 물), 및 0%로부터 40% RH 시 재수화.
  30. 제23항에 있어서, 상기 사이클로(-히스-프로) 수화물은 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% 순수한 것인, 방법.
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