KR20210031854A - 항-약물 항체 (ada) 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 항-약물 항체 (ADA) 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공하며, 여기서 ADA 면역분석은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 하나 이상의 표적 차단 시약을 포함한다.
Description
관련 출원의 참조
이 출원은 2018년 7월 10일자로 출원된 미국 임시 출원 일련 번호 제62/696,016호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
바이오의약품 (예를 들어, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등과 같은 생물학적 제제)는 임상 실습에서 매우 성공적으로 입증되었다. 그러나, 완전하게 인간 치료용 단일클론 항체 조차도 바이오의약품은 약물 노출의 손실, 효능의 손실 및 심각한 부작용 등과 같은 원치 않는 효과를 야기할 수 있는 항-약물 항체 (ADA)를 생성할 가능성이 있다 (Koren, E., et al. Curr Pharm Biotechnol, 2002, 3(4): p. 349-60; Schellekens, H., Clin Ther, 2002, 24(11): p. 1720-40). 따라서, 면역원성 평가는 규제 기관으로부터의 것을 포함하여 약물 개발의 다양한 단계 동안 면역원성 시험에 대한 몇 가지 발표된 권장사항과 함께, 바이오의약품에 대한 안전성 시험의 중요한 부분이다 (Shankar, G., et al., J Pharm Biomed Anal, 2008, 48(5): p. 1267-81; Shankar, G., et al. Nat Biotechnol, 2007, 25(5): p. 555-61; Mire-Sluis, A.R., et al., J Immunol Methods, 2004, 289(1-2): p. 1-16; Swanson, S.J. and J. Bussiere, Curr Opin Microbiol, 2012, 15(3): p. 337-47; European Medicines Agency, C.f.M.P.f.H.U., Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-Drived Therapeutic Proteins. European Medicines Agency, London, UK, 2007; 및 US Department of Health and Human Services, U.F.C., CBER, Guidance for Industry -- Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins (Draft). US Department of Health and Human Services, Washington, DC, USA, 2009).
본 발명은 혈청 샘플 내의 약물에 대한 항-약물 항체 (ADA)의 존재의 결정을 위하여 사용되는 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법에 대한 것이다. 본 방법은 혈청 샘플을 제1 표지로 표지된 포획 약물; 제2 표지로 표지된 검출 약물; 및 약물 표적 차단 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이 접촉 단계는 그 다음 포획 약물, 검출 약물 및 약물 표적 차단 시약을 인큐베이션하여 약물 표적 차단 시약이 샘플에 존재하는 약물 표적과 상호작용할 수 있도록 하여, 이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는 단계가 이어진다. 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석을 수행하는 단계가 이어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 혈청 샘플은 인간 혈청 샘플이고, 특정 양태에서 샘플은 약물로 치료되는 대상체로부터의 것이다.
또 다른 양태에서, 약물 표적 차단 시약은 예를 들어 항체와 같은 결합 분자이다. 결합 분자가 항체인 일 실시형태에서, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또 다른 실시형태에서, 약물 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다.
일 양태에서, 인큐베이션 단계는 실온에서 수행된다. 또 다른 양태에서, 인큐베이션은 온화한 염기성 pH 조건 하에서 수행된다.
일 양태에서, 본 발명의 약물은 인간을 치료하는데 사용되는 치료 단백질, 예컨대 단일클론 항체 (예를 들어, 완전 인간 단일클론 항체)와 같은 치료 결합 분자 또는 면역글로불린 Fc 도메인, 예를 들어 인간을 치료하도록 설계된 IgG1 Fc 도메인에 융합된 수용체 단백질과 같은 치료 융합 단백질이다. 특정 양태에서, 약물은 치료적 인간 단일클론 항체이다.
본 발명의 일 양태에서, 약물 표적은 예를 들어 수용체에 대한 리간드와 같은 가용성 단백질이다. 특정 양태에서, 약물 표적 차단 시약은 IgG Fc 도메인에 융합된 수용체의 부분을 포함한다. 추가 양태에서, 수용체의 부분은 수용체의 세포외 부분이다. IgG Fc 도메인은 마우스 IgG Fc 도메인 또는 인간 IgG Fc 도메인일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 약물 표적은 가용성 또는 탈피 이량체 또는 다량체 약물 표적이다. 특정 양태에서, 약물 표적은 동종이량체 약물 표적이다.
일 양태에서, 본 발명의 포획 약물은 고체 표면에 부착된다. 특정 양태에서, 고체 표면은 미세역가 플레이트이다. 또 다른 양태에서, 고체 표면은 스트렙타비딘으로 코팅된다.
일 양태에서, 제1 표지는 비오틴 표지, 단백질 A 표지, 단백질 G 표지 및 글루타티오닌 S-트랜스퍼라제 (GST) 표지로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 제2 표지는 루테늄 표지, 방사선 표지, 축광 표지, 화학발광 표지, 형광 표지, 전기화학발광 표지 및 효소 표지로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 방법은 혈청 샘플을 제2 약물 표적 차단 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 제2 약물 표적 차단 시약은 예를 들어 항체와 같은 약물 표적 차단 결합 분자이다. 일 양태에서, 제2 약물 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 제2 약물 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재를 결정하기위한 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 혈청 샘플을 제1 표지로 표지된 포획 약물; 제2 표지로 표지된 검출 약물; 제1 약물 표적 차단 결합 분자; 및 제2 약물 표적 차단 결합 분자와 접촉시키는 단계, 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 포획 약물, 검출 약물, 제1 약물 표적 차단 결합 분자 및 제2 약물 표적 차단 결합 분자를 인큐베이션하는 단계, 및 제1 약물 표적 차단 결합 분자와 제2 약물 표적 차단 결합 분자를 샘플 내에 존재하는 약물 표적과 상호작용하게 함에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 제1 및 제2 약물 표적 차단 결합 분자는 항체이다.
본 발명은 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재를 결정하기위한 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 약물 표적은 예를 들어 수용체에 대한 리간드와 같은 가용성 단백질이고, 상기 방법은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는 제1 표지로 표지된 포획 약물; 제2 표지로 표지된 검출 약물; 하나 이상의 약물 표적 차단 결합 분자 (예를 들어, 항체)를 혈청 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 포획 약물, 검출 약물 및 하나 이상의 약물 표적 차단 결합 분자는 샘플 내에 존재하는 약물 표적과 상호작용하고 이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화한다.
본 발명은 청구범위에 기술된 발명의 범주를 제한하지 않는 이하의 도면 및 상세한 설명에 의해 예시된다.
도 1a 내지 c는 가교 면역원성 분석에서 가용성 이량체/다량체 표적으로부터의 간섭을 묘사한다. (a) 인간 혈청 샘플에서 양성 대조군 또는 ADA는 비오틴화된 약물과 루테닐화된 약물을 가교시키고 진양성(true positive) ADA 신호를 생성한다. (b) 그러나, 이량체/다량체 표적은 또한 비오틴화된 약물 및 루테닐화된 약물 둘 모두에 결합하고 표적-매개된 위양성(false positive) 신호를 생성할 수 있다. (c) 항-표적 항체 또는 기타 표적 차단 시약은 비오틴화된 약물 및 루테닐화된 약물에 대한 이량체 표적의 결합을 방지하고 표적 매개된 위양성 신호를 무효화할 수 있다. (c)로 표지된 시약은 포획 약물 (1), 검출 약물 (2) 및 하나 이상의 약물 표적 차단 분자 (3)를 나타낸다.
도 2a 내지 c는 분석 신호에 대한 표적 차단 항체 HuAb1 및 분석 pH의 영향을 묘사한다. (a) 표적 차단 항체없이, 산 해리는 내인성 결합 단백질로부터 표적을 아마도 방출함에 의해 순수한 인간 혈청 샘플에서 배경 분석 신호를 증가시켰다. (b) 중성 pH에서 HuAb1 100 μg/mL (대략적으로 3 ng/mL 내지 150 ng/mL)의 부가로 표적 내성 수준을 개선시켰고 HuAb1과 온화한 염기성 pH의 조합으로 (대략적으로 1.1 μg/mL로) 더욱 개선되었다. (c) 염기성 분석 조건 (pH 8.3)으로 100 μg/mL의 HuAb1의 부가는 순수한 인간 혈청 샘플에서 표적 매개된 신호를 크게 감소시켰다.
도 3a 내지 d는 표적 차단 항체 HuAb1 및 분석 pH 8.3을 사용하여 상이한 대상체로부터 임상 연구 샘플의 분석에서 얻은 ADA 신호가 표적 수준과 상관관계가 있지만 이들의 약동학적 프로필과 일치하지 않음을 묘사한다. (a) 각 임상 샘플에 대한 표적 농도. (b) 100 μg/mL의 표적 차단 항체 HuAb1 및 pH 8.3을 사용한 ADA 신호. (c) 테스트된 3명의 대상체에 대한 약물 X 농도 프로필. (d) HuAb1 (100 μg/mL) 및 온화한 염기성 pH와 조합하여 제2 항-표적 항체의 부가 (100 μg/mL에서 HuAb2)는 임상 샘플에서 표적 매개된 배경 신호를 효과적으로 감소시켰다.
도 4a 내지 c는 표적 간섭을 억제할뿐만 아니라 가능한 위음성(false negative) 신호를 피하기 위해 추가 분석 최적화 후 신호 대 노이즈 비 (분석 배경 신호와 비교한 샘플의 분석 신호)를 묘사한다. (a) HuSR 및 HuAb2 조합은 임상 연구 샘플에서 표적 간섭을 완화하는데 HuAb1 및 HuAb2 조합만큼 효과적이었다. (b) 및 (c) 마우스 Fc (MsSR 및 MsAb2)를 갖는 표적 차단 시약은 임상 연구 샘플에서 표적 간섭을 여전히 효과적으로 완화한다.
도 5는 100 μg/mL의 MsSR, 100 μg/mL의 MsAb2 및 분석 pH 8.3으로 임상 연구 샘플에서 표적 간섭의 제거를 묘사한다. 4개의 다른 시점 (1, 29, 57 및 113일차)에서 7명의 대상체로부터의 임상 연구 샘플에서 단지 배경 분석 신호만 검출되었다.
도 6a 내지 b는 면역화된 토끼 혈청 및 랫트 독성학 샘플에서 폴리클로날 ADA 검출에 대한 온화한 염기성 분석 pH 및 표적 차단 시약의 최소 영향을 묘사한다. (a) 온화한 염기성 pH 8.3은 약물 Fab-면역화된 토끼 혈청에서 ADA 검출에 부정적인 영향을 미치지 않았다. (b) 개선된 분석 형식은 표적-매개된 신호를 완화하고 랫트 독성학 샘플에서 실제 ADA 신호를 검출한다.
도 7a 내지 b는 표적 차단 시약의 부재 및 존재에서 그리고 상이한 분석 pH로 약물에 대한 표적의 결합을 묘사한다. (a) 상이한 분석 조건을 갖는 결합 회합(association) 및 해리 곡선. 파장 시프트 (Δ nm)는, 약물에 대한 표적 결합의 결과로서의 바이오센서 팁의 두께에서의 변화에 직접적으로 비례한다. 약물에 대한 표적의 회합 및 해리는 pH 7.3 및 pH 8.2에서, 그리고 pH 7.3에서 MsAb2 및 MsSR의 존재 및 pH 8.2에서 MsAb2 및 MsSR의 존재에서 도시되어 있다. pH 7.3 및 pH 8.2에서의 완충액 대조군도 도시되어 있다. 약물에 대한 표적의 결합은 pH 8.3 단독으로 부분적으로 억제된다. 중성 분석 pH와 MsAb2 및 MsSR 조합은 약물에 대한 표적의 결합을 크게 감소시킬 수 있지만 결합의 완전한 억제는 MsAb2, MsSR 및 온화한 염기성 pH 조합으로 달성된다. (b) 임상 샘플에서 표적-매개된 신호는 온화한 염기성 pH 단독으로 또는 중성 pH에서 MsAb2 및 MsSR의 존재에 의해 부분적으로 억제되었다. 그러나, 표적 간섭의 완전한 억제는 MsAb2, MsSR 및 pH 8.3의 조합에 의해서 달성된다.
도 2a 내지 c는 분석 신호에 대한 표적 차단 항체 HuAb1 및 분석 pH의 영향을 묘사한다. (a) 표적 차단 항체없이, 산 해리는 내인성 결합 단백질로부터 표적을 아마도 방출함에 의해 순수한 인간 혈청 샘플에서 배경 분석 신호를 증가시켰다. (b) 중성 pH에서 HuAb1 100 μg/mL (대략적으로 3 ng/mL 내지 150 ng/mL)의 부가로 표적 내성 수준을 개선시켰고 HuAb1과 온화한 염기성 pH의 조합으로 (대략적으로 1.1 μg/mL로) 더욱 개선되었다. (c) 염기성 분석 조건 (pH 8.3)으로 100 μg/mL의 HuAb1의 부가는 순수한 인간 혈청 샘플에서 표적 매개된 신호를 크게 감소시켰다.
도 3a 내지 d는 표적 차단 항체 HuAb1 및 분석 pH 8.3을 사용하여 상이한 대상체로부터 임상 연구 샘플의 분석에서 얻은 ADA 신호가 표적 수준과 상관관계가 있지만 이들의 약동학적 프로필과 일치하지 않음을 묘사한다. (a) 각 임상 샘플에 대한 표적 농도. (b) 100 μg/mL의 표적 차단 항체 HuAb1 및 pH 8.3을 사용한 ADA 신호. (c) 테스트된 3명의 대상체에 대한 약물 X 농도 프로필. (d) HuAb1 (100 μg/mL) 및 온화한 염기성 pH와 조합하여 제2 항-표적 항체의 부가 (100 μg/mL에서 HuAb2)는 임상 샘플에서 표적 매개된 배경 신호를 효과적으로 감소시켰다.
도 4a 내지 c는 표적 간섭을 억제할뿐만 아니라 가능한 위음성(false negative) 신호를 피하기 위해 추가 분석 최적화 후 신호 대 노이즈 비 (분석 배경 신호와 비교한 샘플의 분석 신호)를 묘사한다. (a) HuSR 및 HuAb2 조합은 임상 연구 샘플에서 표적 간섭을 완화하는데 HuAb1 및 HuAb2 조합만큼 효과적이었다. (b) 및 (c) 마우스 Fc (MsSR 및 MsAb2)를 갖는 표적 차단 시약은 임상 연구 샘플에서 표적 간섭을 여전히 효과적으로 완화한다.
도 5는 100 μg/mL의 MsSR, 100 μg/mL의 MsAb2 및 분석 pH 8.3으로 임상 연구 샘플에서 표적 간섭의 제거를 묘사한다. 4개의 다른 시점 (1, 29, 57 및 113일차)에서 7명의 대상체로부터의 임상 연구 샘플에서 단지 배경 분석 신호만 검출되었다.
도 6a 내지 b는 면역화된 토끼 혈청 및 랫트 독성학 샘플에서 폴리클로날 ADA 검출에 대한 온화한 염기성 분석 pH 및 표적 차단 시약의 최소 영향을 묘사한다. (a) 온화한 염기성 pH 8.3은 약물 Fab-면역화된 토끼 혈청에서 ADA 검출에 부정적인 영향을 미치지 않았다. (b) 개선된 분석 형식은 표적-매개된 신호를 완화하고 랫트 독성학 샘플에서 실제 ADA 신호를 검출한다.
도 7a 내지 b는 표적 차단 시약의 부재 및 존재에서 그리고 상이한 분석 pH로 약물에 대한 표적의 결합을 묘사한다. (a) 상이한 분석 조건을 갖는 결합 회합(association) 및 해리 곡선. 파장 시프트 (Δ nm)는, 약물에 대한 표적 결합의 결과로서의 바이오센서 팁의 두께에서의 변화에 직접적으로 비례한다. 약물에 대한 표적의 회합 및 해리는 pH 7.3 및 pH 8.2에서, 그리고 pH 7.3에서 MsAb2 및 MsSR의 존재 및 pH 8.2에서 MsAb2 및 MsSR의 존재에서 도시되어 있다. pH 7.3 및 pH 8.2에서의 완충액 대조군도 도시되어 있다. 약물에 대한 표적의 결합은 pH 8.3 단독으로 부분적으로 억제된다. 중성 분석 pH와 MsAb2 및 MsSR 조합은 약물에 대한 표적의 결합을 크게 감소시킬 수 있지만 결합의 완전한 억제는 MsAb2, MsSR 및 온화한 염기성 pH 조합으로 달성된다. (b) 임상 샘플에서 표적-매개된 신호는 온화한 염기성 pH 단독으로 또는 중성 pH에서 MsAb2 및 MsSR의 존재에 의해 부분적으로 억제되었다. 그러나, 표적 간섭의 완전한 억제는 MsAb2, MsSR 및 pH 8.3의 조합에 의해서 달성된다.
의약품, 특히 치료적 단백질의 면역원성은 잠재적으로 심각한 부작용, 효능의 상실 및 약물 노출에서의 변화를 초래하여 독성, 약동학 (PK) 및 약력학 (PD) 데이터의 해석을 복잡하게 만들 수 있기 때문에 이것은 임상 및 전임상 연구에서 주요 관심사이다. 항-항체 약물 (ADA)을 검출하고 정량화하기 위한 ADA 면역분석은 바이오의약품의 면역원성을 결정하는데 중요한다. 그러나, 약물 표적은 ADA 면역분석을 방해하고 표적-매개된 위양성 결과를 초래할 수 있다 (도 1b 참조). 표적 수준은 산 해리 단계 동안 표적 상향-조절 및 표적:약물 및/또는 표적:결합 단백질 복합체로부터 표적의 방출을 기반으로 높을 수 있으며, 통상적으로 분석 약물 내성을 개선하기 위해 ADA 분석에 이용된다.
ADA는 통상적으로 ADA를 감지, 확인 및 적정하기 위해 다단계 접근 방식으로 테스트된다. 스크리닝 분석은 통상적으로 부동 절단 점을 이용하여 ADA에 대해 잠재적으로 양성인 샘플을 식별하는 반면, 확인 분석은 확인 절단 점을 사용하여 스크리닝 분석에서 관찰된 양성 반응이 (ADA에 대해 양성으로 샘플을 확인하는) 초과 약물의 존재에 의해 억제될 수 있는지 여부를 결정한다. 역가 절단 점은 역가 분석에서 양성 샘플에서의 ADA 수준을 평가하기 위해 사용된다. ADA 분석은 전형적으로 약물을 포획 및 검출 시약으로 사용하는 가교 형식을 사용한다. 이들 분석은 설정 및 실행이 비교적 용이하고, 대부분의 IgG4를 제외하고 대부분의 이소타입 반응을 검출하고 뛰어난 민감도를 제공한다. 그들은 종-특이적이지 않고 고-처리량이다. 그러나, 가용성 또는 탈피 이량체- 또는 다량체-약물 표적은 분석을 방해하고 표적 매개된 위-양성 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 메폴리주맙 치료 환자로부터의 투약-후 샘플에서 상승된 IL-5 동종이량체는 ADA 가교 분석에서 표적-매개된 위양성 신호를 생성함에 의해 관찰된 증가된 ADA 분석 양성에 기여했다 (문헌[Liao, K., et al., J Immunol Methods, 2017, 441: p. 15-23]).동종이량체인 NGF의 존재는 또한 비오틴과 루테늄-표지된 풀라누맙을 연결함에 의해 풀라누맙 투여 환자로부터의 샘플에서 위양성 분석 신호를 생성했다 (문헌[Dai, S., et al., AAPS J, 2014, 16(3): p. 464-77]).세포막 단편에 존재하는 CD20은 오파투무맙에 대한 ADA 분석에서 매트릭스 간섭을 유발하는 것으로 보고되었다 (문헌[Chen, K., et al., J Immunol Methods, 2013, 394(1-2): p. 22-31]). 더욱이, 산 해리는 최근에 혈청 샘플에서 단량체 표적을 이량체화하여 위양성 신호를 또한 초래하는 것으로 보고되었다 (문헌[Zoghbi, J., et al., J Immunol Methods, 2015, 426: p. 62-9]).
표적 간섭을 제한하려는 특정 방법이 보고되었다. 예를 들어, 표적 면역고갈뿐만 아니라, 표적 차단 항체로의 전처리 또는 표적-결합 단백질로의 차단은 가용성(soluble) 표적 간섭을 완화하는데 사용되어 왔다 (문헌[Liao, K., et al., J Immunol Methods, 2017, 441: p. 15-23; Dai, S., et al., AAPS J, 2014, 16(3): p. 464-77]; 문헌[Zhong, Z.D., et al., J Immunol Methods, 2010, 355(1-2): p. 21-8]; 문헌[Weeraratne, D.K., et al., J Immunol Methods, 2013, 396(1-2): p. 44-55]; 및 문헌[Maria M, L.J., Wakshull E, Quarmby V., AAPS National Biotechnology Conference. Seattle, WA, USA, 2009]). ADA의 검출에 영향을 미침이 없이 고도로 글리코실화된 표적 단백질로부터의 간섭을 차단하기 위해 밀 배아 응집소 (WGA) 렉틴의 사용을 포함한 다른 전략이 보고되었다 (문헌[Carrasco-Triguero, M., et al., Bioanalysis, 2012, 4(16): p. 2013-26]). ADA의 Fc 영역을 검출하기 위해 인간 가용성 Fcγ 수용체 I (hsFcγRI)를 사용하는 또 다른 대체 분석 형식이 또한 가용성 표적 간섭을 완화하는 것으로 보고되었으나, 이 형식은 모든 잠재적인 ADA 이소타입을 검출할 수 없을 수 있다 (문헌[Wessels, U., et al., Bioanalysis, 2016, 8(20): p. 2135-45]). ADA 및 중화 항체 (NAb) 분석에서 약물 표적 간섭을 완화하기 위한 다수의 전략을 설명하는 백서가 최근에 공표되었다 (문헌[Zhong, ZD, et al., AAPS J, 2017, 19(6): p. 1564-1575]). 따라서, 표적 간섭을 극복하고 비임상 및 임상 연구 둘 모두에서 유효한 면역원성 평가를 제공할 수 있는 신뢰할 수 있는 시험 방법을 개발하는 것이 중요한다.
본 발명은 ADA 면역분석, 예를 들어 가교 면역원성 분석에서 위양성 결과를 감소시키기 위해 ADA 면역분석에서 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 온화한 염기성 pH 분석 조건과 함께 하나 이상의 표적 차단 시약, 예를 들어 항체 또는 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질의 조합이 유의미한 ADA 반응을 나타내지 않은 PK 프로필을 가진 연구 샘플에서 재조합 표적 단백질에 대한 높은 내성 및 위양성 결과의 감소된 수준을 초래한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 표준 산 해리 절차 및 표적 차단 항체 단독이 효과적이지 않은 경우 표적 간섭을 완화하는 것을 제공한다.
I. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가하여, 매개변수의 값 또는 값의 범위가 언급될 때마다, 그것은 언급된 값과 범위 중간 값 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다는 것에 유의해야 한다.
다음의 상세한 설명에서, 설명의 목적으로, 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 번호, 재료 및 구성이 제시된다. 그러나, 본 발명이 이들 특정한 세부사항 없이 실행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 예에서, 잘 알려진 특징은 본 발명을 모호하게하지 않도록 생략되거나 단순화될 수 있다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬인, 2개의 무거운 (H) 사슬 및 2개의 가벼운 (L) 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임 워크 영역 (FR)으로 명명된 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원"은 면역계가 항체 또는 이에 대한 특정 세포-매개된 면역 반응을 생성하게 하는 임의의 물질을 의미한다. 질병 관련 항원은 면역계가 항체 또는 이에 대한 특정 세포-매개된 반응을 생성하게 하는 임의의 질병과 관련된 임의의 물질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합 도메인" (또한 "결합 영역" 또는 "결합 모이어티"로 지칭됨)은 특이적으로 및 비-공유적으로 표적과 회합, 결합 또는 조합하는 능력을 보유하는 분자 또는 이들의 일부 (예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질)를 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자, 분자 복합체 (즉, 둘 이상의 생물학적 분자를 포함하는 복합체) 또는 기타 관심 있는 표적에 대해 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 단일 사슬 면역글로불린 가변 영역 (예를 들어, scTCR, scFv), 수용체 엑토도메인, 리간드 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인), 또는 생물학적 분자, 분자 복합체 또는 기타 관심있는 표적에 결합하는 이들의 특이적인 능력을 위해 선택된 합성 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 이해되는 바와 같이 "결합 분자"는 특정 표적과 특이적으로 상호작용하는 분자이다. 이러한 결합 분자의 예는 항체 (단일클론 항체를 포함함) 및 이들의 단편, 조작된 항체, 융합 단백질 및 당업자에게 잘 알려진 기타 유사한 항원-결합 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 결합 분자는 표적과 상호작용할 수 있는 수용체 또는 수용체 유사 분자를 포함한다.
"항-약물 항체" 또는 "ADA"는, 예를 들어, 약물의 가변 도메인, 불변 도메인 또는 당구조와 같은, 약물의 임의의 영역에 대해 지향될 수 있는 항체이다. 이러한 항-약물 항체는 항체 치료 도중에 환자의 면역원성 반응으로 발생할 수 있다 (Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49 참조). 대부분의 "항-약물 항체"는 약물의 하나 이상의 상보적 결정 영역에 결합한다. 약물의 항원에 대한 항-약물 항체의 친화성은 일반적으로 그것의 표적 항원에 대한 약물의 친화성에 비해 낮다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "가교 면역분석" 또는 "ADA 가교 면역분석"은 2가 ADA가 ADA의 상이한 겹침 또는 간섭이 없는 에피토프에 결합하는 각각 2개의 다른 결합 분자 (즉, 포획 약물 및 검출 약물)에 의해 결합되는 샌드위치-유형 면역분석을 의미한다. 이 분석에서, 포획 항체, ADA 및 검출 항체를 포함하는 샌드위치가 형성되고, 따라서 ADA는 이에 결합하는 두 항체를 가교한다 (도 1a 참조). 포획 항체는 고체 표면, 예를 들어, 미세역가 플레이트 또는 다른 고체 표면에 부착될 수 있다. 가교 면역분석은 고-처리량 분석일 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADA 가교 면역분석은 2개의 항체 약물인, "포획 약물" 및 "검출 약물"을 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 약물 및 포획 약물은, 예를 들어 동일한 발현 벡터로 재조합적으로 생성되고 동일한 아미노산 서열을 포함하는, "동일한" 항체 분자를 포함한다.
pH는 수성 용액의 산도 또는 염기도를 특정하는데 사용되는 로그 척도이다. 그것은 대략적으로 수소 이온의 리터당 몰 단위로 측정된, 몰 농도의 베이스 10 로그의 음수이다. 보다 정확하게는 그것은 수소 이온의 활성의 베이스 10 로그의 음수이다. 7 미만의 pH를 갖는 용액은 산성이고 7보다 큰 pH를 갖는 용액은 염기성이다. 분석 조건과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "온화한 염기성 pH"는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5의 pH를 지칭한다. 일 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0의 pH를 포함한다. 다른 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.5의 pH를 포함한다. 다른 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 포함한다. 다른 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 또는 8.4 사이의 pH를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약물"은 질병의 치료를 위해 개체에게 투여될 수 있는 치료 단백질 또는 이들의 치료학적으로 유효한 부분을 지칭한다. 일 양태에서, 약물은 인간 치료 단백질, 예컨대 인간 치료적 단일클론 항체 또는 인간 치료 융합 단백질 예컨대 면역글로불린 Fc 도메인, 예를 들어 IgG1 Fc 도메인에 융합된 수용체 단백질이다. 또 다른 양태에서, 약물은 인간화된 치료적 단일클론 항체이다. 또 다른 양태에서, 약물은 키메라 항체이다. 또 다른 양태에서, 약물은 마우스 항체이다. 일 양태에서, 치료 약물은 임상 시험에서 평가되고 있다.
항체 약물과 같은 치료 약물은 종양 질환, 면역 질환, 중추 신경 질환, 혈관 질환, 감염성 질환과 같은 다양한 질환의 치료에 널리 사용되고 있다. 본 발명의 방법에 포함되는 항체 약물은 규제 기관 또는 임상 또는 전임상 시험에 의해 승인된 임의의 치료적 항체를 포함한다. 2018년부로 미국 및 EU에서 승인된 항체 약물은 베즐로톡주맙, 아벨루맙, 두필루맙, 두르발루맙, 오크레리주맙, 브로달루맙, 레슬리주맙, 올라라투맙, 다라투무맙, 엘로투주맙, 네시투무맙, 인플릭시맙, 오빌톡시맙, 아테졸리주맙, 세쿠키누맙, 메폴리주맙, 니볼루맙, 알리로쿠맙,이다루시주맙, 에볼로쿠맙, 디누툭시맙, 베바시주맙, 펨브롤리주맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 실툭시맙, 알렘투주맙, 페르투주맙, 인플릭시맙, 오비누투주맙, 브렌툭시맙, 라시바쿠맙, 벨리무맙, 이필리무맙, 데노수맙, 오파투무맙, 베실레소맙, 토실리주맙, 카나키누맙, 골리무맙, 우스테키누맙, 세르톨리주맙 페골, 카투맙소맙,에쿨리주맙, 라니비주맙, 파니투무맙, 나탈리주맙, 카투맙소맙, 베바시주맙, 오말리주맙, 세툭시맙,에팔리주맙, 이브리투모맙 티우세탄, 파놀레소맙, 아달리무맙, 토시투모맙, 알렘투주맙, 트라스투주맙, 젬투주맙 오조가미신, 인플릭시맙, 팔리비주맙, 네시투무맙, 바실릭시맙, 리툭시맙을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 약물은 또한 개발 중이거나 전-임상 또는 임상 시험 중, 즉 임상 시험에서 평가되고 있는 치료 약물을 포함한다.
항체 약물은, 예를 들어, IL-4R, IL-6R, IL-33, PD-1, CD20 X CD3, LAG-3, IL-33, Fel d 1, C5, ANGPTL-3, ACTIVIN A, GDF8, PCSK9, VEGF, NGF, 또는 바이러스 항원 예컨대 에볼라 또는 mers-cov를 포함하는 임의의 항원을 표적으로 하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 추가 치료 약물은 예를 들어 에비나쿠맙, 트레보그루맙, 세미플리맙, 알리로쿠맙, 애플리버셉트, 파시누맙, 릴로나셉트 및 사릴루맙을 포함한다.
치료 약물은 또한 승인된 약물의 바이오시밀러 버전, 예를 들어, 항체 또는 치료적 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, ALT-L9 (Alteogen), M710 (Momenta/Mylan), FYB203 (Formycon (DE)/Santo Holding GmbH) 및 CHS-2020 (Coherus)을 포함한 애플리버셉트 바이오시밀러가 개발 중이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "약물 표적"은 약물의 표적을 지칭한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약물 표적은 이량체 표적이다. 일 실시형태에서, 약물 표적은 동종이량체 약물 표적이다. 다른 실시형태에서, 약물 표적은 다량체 약물 표적이다. 다른 실시형태에서, 약물 표적은 가용성 또는 탈피 약물 표적이다. 약물 표적은 ADA 면역분석을 방해하고 위양성 분석 결과를 초래할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "약물 표적 차단 시약"은 면역분석에서 약물 표적에 결합 및/또는 차단할 수 있고, 이에 의해 포획 약물 또는 검출 약물에 대한 약물 표적의 결합을 방지하는 임의의 시약을 지칭한다. 일 실시형태에서, 약물 표적 차단 시약은 항-표적 차단 항체이다. 항-표적 차단 항체는 인간 불변 영역 또는 마우스 불변 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 약물 표적 차단 시약은 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질이며, 여기서 융합 단백질은 IgG Fc 도메인에 연결되거나 융합된 표적 수용체의 일부를 포함한다. 일 양태에서, 표적 수용체의 일부는 수용체의 세포외 부분이다. 특정 양태에서, IgG Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인이다. 다른 양태에서, IgG Fc 도메인은 마우스 IgG Fc 도메인이다. 본원에 상세히 기술된 바와 같이, ADA 면역분석, 예를 들어 ADA 가교 면역분석은 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 하나 이상의 약물 표적 차단 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 면역분석은 하나의 약물 표적 차단 시약을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역분석은 2개의 약물 표적 차단 시약을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 약물 표적 차단 시약 양자는 약물 표적 차단 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 분석은 하나 이상의 약물 표적 차단 항체 및 하나 이상의 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 바와 같이, 용어 "표지된"에 의해 수사된 개체 또는 시약 (예를 들어, 결합 분자, 포획 약물, 검출 약물, 항-약물 항체 (ADA), 약물, 단백질, 효소, 항체, 항체 단편 또는 관련 종)은 경험적으로 검출가능한 다른 분자 또는 화학 물질과 접합된 임의의 물질 (예를 들어,"검출가능한 표지")을 포함한다. 표지된-개체에 대한 표지로 적합한 화학 종은 루테늄, 방사선 표지, 축광 표지, 화학발광 표지, 형광 표지, 전기화학발광 표지, 효소 표지, 양자점 또는 광학 염료 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 표지는, 예를 들어, 비오틴, 단백질 A, 단백질 G, 글루타티오닌 S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함한다. 이들 표지는 포획 약물 항체를 표지하는데 사용될 수 있으며, 이는 그 다음 고체 표면에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형광 표지" 및 "형광단"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 물질이 다른 파장 (여기 파장)의 방사에 의해 조명될 때 특정 파장 (방출 파장)에서 광과 같은 전자기 에너지를 방출하는 임의의 물질을 지칭하고 하나 이상의 광학 신호를 제공하기 위해 샘플에서 관심있는 분석물과 특이적으로 상호작용하거나 반응할 수 있는 화학적 또는 생화학적 분자 또는 이들의 단편을 포괄하도록 의도된다.
여기에 사용된 바와 같이 "표적 내성 수준"은 (플레이트 절단 점 위의 분석 신호로) 분석에서 표적-매개된 위양성 신호를 생성하는데 요구된 표적의 양으로 정의된다.
용어 "샘플"은 생물체 또는 이전의 생물체로부터의 임의의 양의 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 생물체는 인간, 마우스, 원숭이, 랫트, 토끼 및 기타 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 이러한 샘플은 대상체로부터의 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 샘플, 예를 들어 혈청 샘플은 약물의 임상 또는 전임상 시험 동안 대상체로부터 얻은 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 임상 시험 동안 약물 투여 후 대상체로부터 얻을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 또는 비인간 유기체를 지칭한다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 융합 복합체는 인간 및 수의학 질환 및 병태 둘 모두에 적용가능하다. 대상체는 "환자", 즉 질환 또는 병태에 대해 의료적 케어를 받는 살아있는 인간 또는 비-인간 유기체 또는 병리 또는 특정 병태의 존재/부재의 징후에 대해 조사중인 비 정의된 질병이 있는 인간 또는 비-인간 유기체일 수 있다. 대상체는 또한 약물에 대한 임상 시험의 참가자를 포함하며, 상기 대상체는 시험 목적으로 약물을 투여 받았다.
용어 "Fc 도메인" 또는 "면역글로불린 Fc" 또는 "Ig Fc"는 면역글로불린 중쇄 "결정화가능한 단편" 영역을 지칭하는 것으로 의미된다. 일반적으로, Fc 도메인은 이량체 복합체를 형성하기 위해 제2 Fc 도메인과 상호작용할 수 있다. Fc 도메인은 Fc 수용체로 지칭된 세포 표면 수용체 및/또는 보체 시스템의 단백질에 결합할 수 있거나 이들 결합 활성을 감소 또는 증가시키기 위해 변형될 수 있다. Fc 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgM 또는 IgE 항체 이소타입 (본원에서 각각 IgG Fc 도메인, IgA Fc 도메인, IgD Fc 도메인, IgM Fc 도메인 및 IgE Fc 도메인으로 지칭됨)에서 유래될 수 있다. Fc 도메인은 옵소닌화, 세포 용해, 비만 세포, 호염기구 및 호산구의 탈과립화 및 기타 Fc 수용체-의존적 과정을 포함하는 면역 활성; 보체 경로의 활성화; 및 생체내 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 그것의 크기에 관계없이 20개의 천연 아미노산 중 임의의 것을 포함하는 임의의 중합체를 지칭하는 것으로 의미된다. 용어 "단백질"은 종종 비교적으로 큰 단백질과 관련하여 사용되고 "펩타이드"는 종종 작은 폴리펩타이드와 관련하여 사용되지만, 당업계에서 이들 용어의 사용은 종종 중복된다. 용어 "폴리펩타이드"는 달리 언급하지 않는 한 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로 본 개시내용에 따라 유용한 펩타이드는 일반적으로 원심분리 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 표준 분자 크기측정 기술에 의해 판단된 것으로 약 0.1 내지 100 KD 이상 최대 약 1000 KD, 바람직하게는 약 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30과 50 KD 사이일 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "가용성"은 융합 분자가 음이온 또는 비-이온성 세제의 낮은 또는 무 농도의 존재하에 약 5 초과 내지 37℃의 온도 및 중성 pH 또는 그 근처에서 수성 용액으로 남아있는 경우 가용성임을 의미한다. 이들 조건하에서 가용성 단백질은 종종 낮은 침강 값, 예를 들어, 약 10 내지 50 Svedberg 단위 미만을 가질 것이다. 본원에서 언급된 수성 용액은, 전형적으로 약 5 내지 9의 pH 범위 내인 pH 및 약 2 mM 내지 500 mM의 이온 강도 범위를 확립하기 위한 완충 화합물을 전형적으로 갖는다. 때때로 프로테아제 억제제 또는 온순한 비-이온성 세제가 추가된다. 추가로, 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 운반 단백질이 원하는 경우 수 mg/mL까지 첨가할 수 있다. 예시적인 수성 완충액은 표준 인산염 완충 식염수, 트리스-완충 식염수, 또는 기타 잘 알려진 완충액 및 세포 배지 제형을 포함한다.
용어 "고체 표면"은 비-유체 물질을 의미하고, 중합체, 금속 (상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 재료로 만들어진 입자 (미세 입자 및 비드 포함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 기타 다공성 물질; 전극; 미세역가 플레이트; 고형 스트립; 큐벳, 튜브 또는 기타 분광계 샘플 용기를 포함한다.
용어 "분리된"은 자연 상태에서 인간의 손에 의해 변경된 조성물, 화합물, 물질 또는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 발생하는 조성물이나 물질은 원래의 환경에서 변경되거나 제거되거나 또는 둘 모두가 된 경우 분리된다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않지만, 본 용어가 본원에서 이용됨에 따라 그것의 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된다.
II. 표적 간섭 완화
아래에서 자세히 설명되는 바와 같이, 샘플에서 ADA를 검출하기 위한 ADA 가교 면역분석은 약물 표적 간섭 (위양성 ADA)에 민감한다. ADA 가교 면역분석에서, 샘플은 포획 약물 (표지 또는 비표지됨) 및 검출가능한 표지를 포함하는 검출 약물과 함께 인큐베이션된다. 샘플 인큐베이션 후, 포획 약물, ADA 및 검출 약물을 포함하는 샌드위치가 형성되고, 따라서 ADA는 이에 결합하는 두 약물을 가교시키고 결합된 ADA는 검출될 수 있다 (도 1a 참조). ADA 가교 분석에서 진양성 신호는 ADA가 포획 약물 및 검출 약물에 2가 결합하여 가교를 형성함으로 발생한다. 그러나, 이량체 또는 다량체 표적이 포획 약물과 검출 약물을 가교시키고 이에 의해 표적과 가교를 형성할 때 위양성 결과가 발생한다 (도 1b 및 예를 들어 문헌[Liao, K., et al., J Immunol Methods, 2017, 441: p. 15-23] 참조).
본원에 제공된 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하고 이에 의해 위양성 결과를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 온화한 염기성 pH 분석 조건에서 적어도 하나의 약물 표적 차단 시약과 함께 샘플을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공한다. 본 방법은 혈청 샘플을 포획 약물, 검출 약물 및 하나 이상의 약물 표적 차단 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 이들 성분은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 인큐베이션되어 약물 표적 차단 시약이 샘플에 존재하는 약물 표적과 상호작용할 수 있도록 하여, 이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는 단계가 이어진다.
일 양태에서, 방법은 하기 기술된 바와 같이 ADA 가교 면역분석을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 약물 표적 차단 시약은 면역분석에서 약물 표적에 결합 및/또는 차단할 수 있고, 따라서 포획 약물 및/또는 검출 약물에 대한 약물 표적의 결합을 방지할 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 약물 표적 차단 시약은 항체와 같은 표적 차단 결합 분자이다. 또 다른 추가 양태에서, 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함한다.
표적 차단 결합 분자 (예를 들어, 항체)와 약물 (예를 들어, 항체 약물)이 동일한 인간 불변 영역을 갖는 경우, 약물의 Fc 영역에 특이적인 혈청 샘플에서의 ADA는 표적 차단 인간 항체에 결합할 수 있고 잠재적으로 분석에서 검출을 손상시킬 수 있다. 표적 차단 항체의 인간 Ig 영역을 마우스 Ig 영역으로의 대체는 약물 표적 차단 항체와 ADA 검출의 간섭에서 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 일 양태에서 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다.
ADA 가교 면역분석은 하나 이상의 약물 표적 차단 시약을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 면역분석은 2개의 약물 표적 차단 시약을 포함한다. 특정 양태에서, 2개의 약물 표적 차단 시약은 약물 표적 차단 항체, 예를 들어 제1 약물 표적 차단 항체 및 제2 약물 표적 차단 항체이다. 보다 특정한 양태에서, 제1 및/또는 제2 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 제1 및/또는 제2 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 및 제2 표적 차단 항체 둘 모두는 인간 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 및 제2 표적 차단 항체 둘 모두는 마우스 불변 영역을 포함한다. 다른 양태에서, 제1 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함하고 제2 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함하고 제2 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 혈청 샘플을 포획 약물, 검출 약물, 제1 약물 표적 차단 항체 및 제2 약물 표적 차단 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공한다. 이들 성분은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 인큐베이션되고 따라서 제1 약물 표적 차단 항체 및 제2 약물 표적 차단 항체가 샘플에 존재하는 약물 표적과 상호작용할 수 있도록 하고 이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 ADA 가교 면역분석에 사용된 표적 차단 항체가 시험되는 약물과 일부 공통 CDR VH 재배열을 공유할 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 이들 VH 재배열 영역에 특이적인 ADA는 샘플에서의 표적 차단 항체에 결합하여 분석에서 이들의 검출을 잠재적으로 손상시킬 수 있다. 검출을 최적화하기 위해, 인간 IgG Fc에 융합된 표적 수용체를 조작하고 표적 차단 항체 중 하나 대신에 본 발명의 방법에서 사용하였다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 하나 이상의 약물 표적 차단 시약은 IgG Fc 도메인에 융합된 표적 수용체의 일부 (표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질)를 포함한다. 일 양태에서, 표적 수용체의 일부는 수용체의 세포외 부분이다. 또 다른 양태에서, 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질은 가용성이다. 특정 양태에서, 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질의 IgG Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인이다.
표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질 및 약물이 인간 IgG Fc 영역을 갖는 경우, 약물의 Fc 영역에 특이적인 혈청 샘플에서의 ADA는 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질에 결합하여 잠재적으로 분석에서 검출을 손상시킬 수 있다. 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질의 인간 Ig Fc 영역을 마우스 Ig 영역으로의 대체는 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질과 ADA 검출의 간섭에서 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질의 IgG Fc 도메인은 마우스 IgG Fc 도메인이다.
분석은 하나 이상의 약물 표적 차단 항체 및 하나 이상의 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질을 포함할 수 있다. 더욱이, 분석은 표적 차단 항체 및 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질을 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법을 제공하며, 여기서 약물 표적은 가용성 단백질 예컨대, 예를 들어 수용체에 대한 리간드이고 본 방법은 혈청 샘플을 포획 약물, 검출 약물, IgG Fc 도메인에 융합된 수용체의 세포외 부분을 포함하는 약물 표적 차단 시약 및 약물 표적 차단 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이들 성분은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 인큐베이션되어 약물 표적 차단 시약 및 약물 표적 차단 항체가 샘플에 존재하는 약물 표적과 상호작용할 수 있도록 하여, 이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화한다.
일 양태에서, IgG Fc 도메인은 마우스 IgG Fc 도메인이다. 다른 양태에서, IgG Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인이다. 또 다른 양태에서, 약물 표적 차단 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 약물 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다. 일 양태에서, 표적 수용체 IgG Fc 융합 단백질은 마우스 IgG Fc를 포함하고 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 표적 차단 시약 각각은 ADA 가교 면역분석에서 약 10 μg/mL 내지 약 200 μg/mL의 농도를 갖는다. 일 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 20 μg/mL 내지 약 175 μg/mL의 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 30 μg/mL 내지 약 150 μg/mL의 농도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 40 μg/mL 내지 약 125 μg/mL의 농도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 50 μg/mL 내지 약 100 μg/mL의 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 μg/mL의 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 표적 차단 시약 각각은 약 100 μg/mL의 농도를 갖는다.
본원에 기술된 표적 간섭을 완화하는 방법은 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서 ADA 면역분석을 수행하는 단계를 포함한다. 온화한 염기성 pH는 중성 pH보다 약간 높은 범위의 pH 값을 포함한다. 일 실시형태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 7.5 내지 약 pH 9.5의 pH를 지칭한다. 일 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5의 pH를 포함한다. 일 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.0의 pH를 포함한다. 일 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 8.0 내지 약 pH 9.0의 pH를 포함한다. 다른 양태에서, 온화한 염기성 pH는 약 pH 8.5 내지 약 pH 9.5의 pH를 포함한다.
III. ADA 면역분석
면역분석법은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석을 수행하는 방법과 실제 적용 및 절차는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 면역학적 검출 방법을 다룬 문헌[Colowick, S. P. and Caplan, N. O. (eds.), "Methods in Enzymology", Academic Press], 특히 70, 73, 74, 84, 92 및 121권에 기술되어 있다. 다른 면역분석의 원리는, 예를 들어, 면역분석에 사용하기 위한 항체의 배향된 고정화를 기술하는 문헌[Hage, D. S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, B., et al. (Analyst 121 (1996) 29R-32R)]에 의해 기술되어 있다. 아비딘-비오틴-매개된 면역분석은, 예를 들어, 문헌[Wilchek, M., and Bayer, E. A., in Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469]에 기술되어 있다.
일반적으로 사용되는 ADA 분석 방법은 가교 면역분석이다 (예를 들어, 그 내용이 본원에 인용되어 포함되는, 문헌[Liao, K., et al., J Immunol Methods, 2017, 441: p. 15-23]; 문헌[Dai, S., et al., AAPS J, 2014, 16(3): p. 464-77]; 및 문헌[Zhong, Z.D., et al., AAPS J, 2017. 19(6): p. 1564-1575]을 참조한다 ). ADA 가교 면역분석은 다가 ADA가 2개의 다른 항체 약물 (포획 약물 및 검출 약물)에 의해 결합되는 샌드위치-유형 면역분석이며, 각각은 ADA의 상이한 겹침 또는 간섭이 없는 에피토프에 결합한다. 특히, 이 분석에서 샘플은 포획 약물 (표지 또는 비표지됨) 및 검출가능한 표지를 포함하는 검출 약물과 함께 인큐베이션된다. 샘플 인큐베이션 후, 포획 약물, ADA 및 검출 약물을 포함하는 샌드위치가 형성되고, 따라서 ADA는 이에 결합하는 두 약물을 가교시키고 결합된 ADA는 검출될 수 있다 (도 1a 참조). 일 양태에서, 면역분석은 고-처리량 분석이다.
ADA 가교 면역분석은 ADA의 존재 또는 양을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 검출가능한 표지에 접합된 검출 약물을 제공한다. 본 발명의 임의의 방법에 대한 검출가능한 표지의 비-제한적인 예는 루테늄, 방사선 표지, 축광 표지, 화학발광 표지, 형광 표지, 형광단, 합텐, 전기화학발광 표지 또는 효소 표지를 포함한다. 검출가능한 표지는 당업자에게 알려진 기구 및 장치를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 대표적인 형광단은 예를 들어 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오르세인, 플루오르세인 5-이소티오시아네이트 (FITC), 시아닌 염료 (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피 염료 (Invitrogen) 및/또는 알렉사 플루오르 염료 (Invitrogen), 단실, 단실 클로라이드 (DNS-C1), 5-(요오도아세트아미다)플루오르세인 (5-IAF, 6-아크릴로일-2-디메틸아미노나-프탈렌 (아크릴로단), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸-4-일 클로라이드 (NBD-Cl), 에티듐 브로마이드 , 루시퍼 옐로우, 로다민 염료 (5-카복시로다민 6G 염산염, 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트 (RITC (로다민-B-이소티오시아네이트), 로다민 800); 테트라메틸로다민 5-(및 6-) 이소티오시아네이트 (TRITC)), 텍사스 레드, 설포닐 클로라이드, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산 (ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-e-2-설폰산 (TNS)을 포함하나 이에 제한되지 않는 나프탈아민 설폰산 , 안트로일 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오르세인-포스파디딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파디딜에탄올아민, 피레닐-포스파디딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌 540, 나프틸 스티릴, 3,3'디프로필티아디카보시아닌 (diS-C3-(5)), 4-(p-디펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄 (di-5-ASP), Cy-3 로도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시숙신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지, 아주르 B, 나일 블루, Al 프탈로시아닌, 옥사신 1, 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌. (DAPI), 획스트 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지, 에티듐 호모다이머, N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄 (MQAE), Fura-2, 칼슘 그린, 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린, 파이토퓨어, 코로넨 및 메탈-리간드 복합체를 포함한다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 합텐은 예를 들어 디곡시게닌 및 비오틴을 포함한다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 효소는 예를 들어 알칼리성 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 호스래디쉬 과산화효소 (HRP), 대두 과산화효소 (SBP), 우레아제, β-락타마제 및 포도당 산화효소를 포함한다.
일 실시형태에서, 포획 약물은 고체 표면에 접합된다. 일 양태에서, 고체 표면에 대한 포획 약물의 접합은 특이적 결합 쌍을 통해 수행되며, 여기서 포획 약물은 표지되거나 접합된다. 일 양태에서, 특이적 결합 쌍 (제1 성분/제2 성분)은 스트렙타비딘 또는 아비딘/비오틴, 비오틴/뉴트라비딘, 비오틴/캡타비딘, 항체/항원 (예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996] 참조), 에피토프/항체, 단백질 A/면역글로불린, 단백질 G/면역글로불린, 단백질 L/면역글로불린, GST/글루타티온, His-태그/니켈, FLAG/M1 항체, 말토오스 결합 단백질/말토스, 칼모둘린 결합 단백질/칼모듈린, 효소/효소 기질, 렉틴/다당류, 스테로이드/스테로이드 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체 및 수용체-리간드 결합 쌍으로부터 선택된다. 일 양태에서, 포획 약물은 (특이적 결합 쌍의 제1 성분으로서) 비오틴에 접합된다. 이 경우 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통해 고체 상에 접합이 수행된다 (도 1a 참조).
일부 실시형태에서, GlcNac 결합 단백질은 결합 쌍의 제1 구성원 (예를 들어, 비오틴, 아비딘, 뉴트라비든, 캡타비드, 항체, 항원, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, GST, His-Tag, FLAG, MBP, 칼모둘린 결합 단백질, 효소, 수용체 또는 리간드)에 접합된다.
일 실시형태에서, ADA 면역분석에서 시험되는 샘플은 혈청 샘플이다. 일 양태에서, 혈청 샘플은 1% 내지 20% 혈청을 포함한다. 일 양태에서, 혈청 샘플은 약 1% 내지 약 10% 혈청을 포함한다. 또 다른 양태에서, 혈청 샘플은 약 10% 내지 약 15% 혈청을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혈청 샘플은 약 10% 내지 약 20% 혈청을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 혈청 샘플은 약 15% 내지 약 20% 혈청을 포함한다. 특정 양태에서, 혈청 샘플은 약 1% 혈청을 포함한다. 일 양태에서 혈청은 인간 혈청이다.
일 실시형태에서, ADA 가교 면역분석은 산-해리 단계를 포함한다. 일 양태에서, 혈청 샘플은 산, 예를 들어 아세트산에서 10-배 희석되고, 포획 약물 및 검출 약물과 함께 인큐베이션 이전에 실온에서 인큐베이션된다.
일 실시형태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 면역분석에서 약 0.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL의 농도를 갖는다. 일 양태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 0.5 μg/mL 초과 내지 10 μg/mL 미만의 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 약 0.5 μg/mL 내지 약 5 μg/mL의 농도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 약 0.5 μg/mL 내지 약 2.0 μg/mL의 농도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 약 0.5 μg/mL 내지 약 1 μg/mL의 농도를 갖는다. 바람직한 양태에서, 포획 약물 및 검출 약물은 약 0.5 μg/mL의 농도를 갖는다.
일 실시형태에서, 샘플, 포획 약물 및 검출 약물의 인큐베이션은 실온에서 수행된다. 일 양태에서, 샘플, 포획 약물 및 검출 약물의 인큐베이션 시간은 적어도 0.5시간이다. 다른 양태에서, 인큐베이션 시간은 적어도 1시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 시간은 적어도 1.5시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 시간은 최대 2시간이다. 또 다른 양태에서, 인큐베이션 시간은 0.5시간 내지 12시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 시간은 0.5시간 내지 5시간이다. 다른 양태에서, 인큐베이션 시간은 1시간 내지 12시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 시간은 1시간 내지 5시간이다. 다른 양태에서, 인큐베이션 시간은 5 내지 12시간이다.
일 실시형태에서, 샘플, 포획 약물 및 검출 약물의 인큐베이션 후, 샘플은 표지된 고체 표면, 예를 들어 스트렙타비딘 표지된 고체 표면으로 이전되고 추가로 인큐베이션되어 포획 약물이 고체 표면에 부착될 수 있다. 일 양태에서, 인큐베이션은 실온에서 수행된다. 또 다른 양태에서, 인큐베이션 후 샘플은 표지된 항체의 검출을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 ADA에 대한 결합에 대해 분석되며, 여기서 검출 약물은 약물 표지, 예를 들어 루테늄의 검출에 기초하여 검출된다. ADA 가교 분석에서 진양성 신호는 ADA가 포획 약물 및 검출 약물에 2가 결합하여 가교를 형성함으로 발생한다.
본원에 기술된 면역분석을 위한 고체 표면은 최신 기술에 널리 기술되어 있다 (예를 들어, 본원에 인용되어 포함되는 문헌[Butler, J. E., Methods 22 (2000) 4-23] 참조). 분석의 고체 표면 성분은 "고체 표면"이 포획 약물과 상호작용하도록 의도된 그의 표면 상에 적어도 하나의 모이어티를 함유한다는 점에서 분석이 접촉할 수 있는 불활성 고체 표면과 구별된다. 고체 표면은 튜브, 스트립, 큐벳 또는 미세역가 플레이트와 같은 고정 구성성분이거나 비드 및 미세입자와 같은 고정되지 않은 구성성분일 수 있다. 미세입자는 균일한 표면 형식을 위한 고체 상으로 또한 사용될 수 있다. 단백질 및 기타 물질의 비-공유 또는 공유 부착을 허용하는 다양한 미세입자가 사용될 수 있다. 이러한 입자는 폴리스티렌 및 폴리(메틸메타크릴레이트)와 같은 중합체 입자; 금 나노입자 및 금 콜로이드와 같은 금 입자; 및 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자와 같은 세라믹 입자를 포함한다. 예를 들어, 본원에 인용되어 포함된 문헌[Martin, C. R., et al., Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A]를 참조한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 전체 내용뿐만 아니라 도면은 이에 의해 본원에 인용되어 포함된다.
실시예
실시예 1: 표적 차단 시약 및 온화한 염기성 pH로 가교 면역원성 분석에서 표적 간섭 완화
재료 및 방법
재료 및 시약
본원에 기술된 기능성 약물 분석 및 표적 분석의 경우, 달리 특정되지 않는 한 모든 용액은 분석 완충액 (0.5% BSA, 0.05% 트윈-20, 1X PBS)에서 제조되었다. 본원에 기술된 ADA 분석을 위해, 달리 특정되지 않는 한 모든 용액은 1% BSA, 1X PBS에서 제조되었다. PBS는 Life Technologies (뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)로부터의 것이다. 1.5 M Trizma 염기는 Sigma (미주리주 세인트 루이스 소재)로부터의 것이다. 빙초산은 Thermo Fisher Scientific (매사추세츠주 월텀 소재)로부터의 것이다. HBS-EP+ (10X) 완충액은 GE Life Science (매사추세츠주 말보로 소재)로부터의 것이다. 인간 혈청은 Bioreclamation (뉴욕주 힉스빌 소재)으로부터의 것이다. 스트렙타비딘-도포된 마이크로플레이트는 Meso Scale Discovery (메릴랜드 주 록빌 소재)로부터의 것이다. 재조합 인간 표적 단백질은 R&D System (미네소타주 미니애폴리스 소재)로부터의 것이다. 블랙 마이크로웰 플레이트, 호스래디쉬 과산화효소 (HRP)-접합된 NeutrAvidin™ 및 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate™는 Thermo Fisher Scientific (일리노이주 록포드 소재)로부터의 것이다. HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG, Fc 단편 특이성, 항체는 Jackson ImmunoResearch (펜실베이니아주 웨스트 그로브 소재)로부터의 것이다. AHC 바이오센서 (항 인간 IgG Fc 포획)는 Pall ForteBio (캘리포니아주 프리몬트 소재)로부터의 것이다. 완전 인간 단일클론 항체 약물, 마우스 항-약물 단일클론 항체, 비오티닐화된 약물, 루테닐화된 약물 및 모든 인간 및 마우스 항-표적 단일클론 항체 (본원에서 HuAb1, HuAb2 (인간) 및 MsAb2 (마우스)로 지칭됨), 가용성 인간 및 마우스 수용체 융합 단백질 (본원에서 각각 HuSR 및 MsSR로 지칭됨) 및 비오틴화된 인간 항-표적 단일클론 항체 (ADA 및 표적 분석에서 사용됨)는 Regeneron Pharmaceuticals (뉴욕주 태리타운 소재)에 의해 생산되었다.
pH 결정
pH 측정은 InLab Expert Pro-ISM™ 전극을 갖는 보정된 Metler Toledo 미터 (오하이오주 콜럼버스 소재)를 사용하여 수행되었다. 풀링된 인간 혈청은 300 mM 아세트산에 10-배 희석되었다. 산성화된 샘플을 그 다음 다른 농도의 Tris-염기 용액으로 10-배 완충되었다. pH 측정은 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 최종 분석 용액에 대해 수행되었다.
ADA 분석
인간 혈청 샘플에서 항-약물 항체 (ADA)는 비-정량적 ADA 가교 면역분석을 사용하여 검출되었다 (도 1a 내지 c). 이 ADA 가교 분석은 마우스 항-약물 단일클론 항체를 양성 대조군으로 이용하고 비오틴화된 약물과 루테닐화된 약물을 가교 구성성분으로 이용한다 (도 1a). 혈청 샘플을 300 mM 아세트산에 10-배 희석함에 의하여 산성화하고 실온 (RT)에서 적어도 10분 동안 인큐베이션했다. 비오틴화된 약물 및 루테닐화된 약물 (0.5 μg/mL)은 혈청 샘플에 첨가하기 이전에 60 mM Tris-염기를 함유하는 분석 완충액에서 제조되었다. 산-처리된 혈청 샘플은 그 다음 표지된 약물 용액에 10-배 희석되었다. 실온에서 약 60분 동안 인큐베이션 후, 샘플을 차단된 (5% BSA) Streptavidin Multi-Array™ 96- 웰 플레이트 (MSD)로 옮기고 실온에서 약 60분 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하고 리드 완충액을 추가하고 예를 들어 SECTOR Imager 2400과 같은 MSD 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독했다. 표적-매개된 간섭을 차단하기 위해 (도 1b), 항-표적 단일클론 항체 (100 μg/mL) 및/또는 가용성 수용체 단백질 (100 μg/mL)이 또한 표지된 약물 용액에 포함되었다 (도 1c). 또한, 표지된 약물 용액은 pH를 온화한 염기성 조건으로 조정하기 위해 60mM Tris에서 제조되었으며, 이는 또한 비오틴화된 약물과 루테닐화된 약물 둘 모두에 대한 표적의 결합을 최소화한다.
표적 분석
절차는 마우스 항-표적 단일클론 항체 (1 μg/mL)로 코팅된 미세역가 플레이트를 이용하고 표준으로 재조합 표적 단백질을 사용한다. 표준 및 QC는 인간 혈청으로부터의 내인성 표적 단백질에 의한 간섭을 회피하기 위해 당업자에게 잘 알려진 배지에서 제조되었다. 표준 물질, 대조군 및 샘플을 300 mM 아세트산에 10-배 희석하고 실온에서 약 30분 동안 인큐베이션했다. 산 처리된 샘플을 플레이트에 첨가하기 이전에 약물 간섭을 최소화하기 위해 항-약물 단일클론 항체 (100 μg/mL)가 스파이킹된 300 mM Tris-염기 용액을 사용하여 중화 (1:2 희석)했다. 플레이트 상에 포획된 표적 단백질은 다른 비오틴화된 인간 항-표적 단일클론 항체 (200 ng/mL)를 사용한 다음 호스래디쉬 과산화효소 (NeutrAvidin-HRP™) (100 ng/mL)에 접합된 NeutrAvidin™을 사용하여 검출했다. 과산화효소에 특이적인 루미놀-계 기질을 추가하여 총 표적의 농도에 비례하는 신호 강도를 달성했다.
기능성 약물 분석
기능성 약물 분석은 표적에 결합되지 않았거나 표적에 결합된 아암이 하나뿐인 항체 약물의 수준을 정량화한다. 따라서, 그것은 여전히 표적 분자에 결합할 수 있다. 절차는 표적 (0.5 μg/mL)으로 도포된 미세역가 플레이트를 이용하고 항체 약물을 표준으로 사용했다. 플레이트 상에 포획된 약물은 마우스 항-인간 IgG4 단일클론 항체 (250 ng/mL)를 사용한 후 호스래디쉬 과산화효소 접합된 염소 항-마우스 IgG, Fc 특이적 (항-마우스 IgG-HRP) (100 ng/mL)을 사용하여 검출했다. 과산화효소에 특이적인 루미놀-계 기질을 그 다음 첨가하여 기능성 약물의 농도에 비례하는 신호 강도를 달성했다.
생물층 간섭법
pH 7.3 또는 8.3 하에서 마우스 표적 차단 항체 MsAb2 및 가용성 마우스 수용체 융합 단백질 MsSR의 부재시 및 존재시의 항체 약물에 대한 표적 결합을 30℃에서 1000 rpm의 쉐이킹 속도로 Octet RED96 시스템 (Pall Forte Bio) 상에서 연구했다. AHC 바이오 센서는 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.02% (v/v) 나트륨 아지드, 1 mg/mL BSA, pH 7.3을 포함하는 희석 완충액으로 30분 동안 사전-평형화되었다.
장입 단계는, 동일한 희석 완충액에서 20초 동안 5 μg/mL의 약물 농도로 수행하고(~0.5 nm의 두께를 달성하기 위함), 이어서, 바이오 센서가 pH 7.3에서 60 nM의 MsAb2 및 MsSR을 갖거나 갖지 않는 60 nM 농도에서 200 μL의 표적을 함유하는 웰 안으로 침지되기 전에, 동일한 희석 완충액에서 60초 기준선 단계로 수행하였다. 동일한 절차를 pH 8.3 환경 하에서 또한 수행했다. 회합 곡선은 총 ~200초 동안 수집된 후, ~300초의 해리 단계가 이어졌다.
결과 및 논의
표적 차단 항체 HuAb1로 온화한 염기성 pH 분석 조건은 표적 내성 수준을 증가시키고 인간 순수한 샘플에서 배경 신호를 감소시킨다
정상 인간 혈청에서 보고된 목표 수준은 약 10 ng/mL이다. 표적은 순환하는 항체 약물 및 여러 억제성 결합 단백질과 복합체를 형성한다. 항-약물 항체는 산-해리 단계를 이용하는 가교 ADA 면역원성 분석으로 측정되었다 (도 1a 내지 c). 산 처리는 통상적으로 약물 내성 수준을 증가시키지만, 약물 및 임의의 표적 결합 단백질과 복합체화된 표적을 방출하여 순수한 인간 혈청 샘플에서 높은 배경 신호를 생성한다 (도 2a).산 전처리를 사용하여 ADA와 풀라누맙을 분리했을 때 유사한 결과가 이전에 보고되었다. NGF-풀라누맙 복합체는 또한 해리되어 유리 NGF를 방출하며, 이는 ADA 분석을 방해하고 위-양성 결과를 생성했다 (Dai, S., et al., AAPS J, 2014, 16(3): p. 464-77).
표적 차단 항체가 없고 중성 분석 pH 하에서의 ADA 분석에서, 재조합 표적 단백질을 사용하여 결정된 표적 내성 수준 (플레이트 절단 점 이상의 분석 신호를 얻기 위해 요구된 표적의 양으로 정의됨)은 약 3 ng/mL이다 (도 2b). 표적 내성 수준은 중성 분석 pH에서 100 μg/mL의 표적 차단 항체 HuAb1의 존재 하에서 약 150 ng/mL로 증가한다. 흥미롭게도 분석 pH 8.3과 동일한 농도의 인간 표적 차단 항체 HuAb1로, 표적 내성 수준은 약 1.1 μg/mL로 증가했다 (도 2b). 표적 내성 수준은 분석 pH가 8.9일 때 약 7.5 μg/mL로 훨씬 더 높다. 분석의 민감도 및 약물 내성 한계 (DTL) 값은 중성 pH 또는 pH 8.3 하에서 유사했다. 순수한 인간 혈청 샘플의 분석 신호는 또한 100 μg/mL의 HuAb1과 온화한 염기성 pH로 배경 수준으로 감소되었다 (도 2c).
2개의 표적 차단 시약과 조합된 온화한 염기성 pH는 임상 연구 샘플에서 표적 매개된 배경 신호를 억제한다
인간 표적 차단 항체 HuAb1과 온화한 염기성 pH 조건의 조합이 또한 임상 연구 샘플에서 표적 간섭을 억제할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 4개의 상이한 시점 (1, 29, 57 및 113일차)에서 약물로 단일 용량 연구에서 얻은 3명의 대상체로부터 단계 I 임상 샘플이 시험되었다. 29일 및 57일차 샘플에서, 인-하우스 표적 분석으로 측정한 바와 같이, 113일차 샘플에서 기준선에 가까운 표적 수준으로, 표적 수준에서 10 내지 12-배 증가가 관찰되었다 (도 3a). 이들 샘플에서 관찰된 최고 표적 농도는 약 60 ng/mL로 ADA 분석의 표적 내성 수준보다 훨씬 낮았다. 그러나, 이들 샘플이 ADA 분석에서 시험되었을 때, pH 8.3에서 100 μg/mL 인간 표적 차단 항체 HuAb1로 29일 및 57일차 샘플에서 113일차 샘플에서의 배경 수준에 가까운 분석 신호를 갖는 양성 신호가 검출되었다 (도 3b).
이들 대상체는 단일 용량의 항체 약물을 투여받았고 PK 프로필은 유의미한 ADA 반응을 시사하지 않았다 (도 3c). 부가하여, 이들 샘플에서의 ADA 신호는 이들의 표적 수준과 상관관계가 있는 것으로 나타난다. 연속적으로, 많은 군의 투약-후 샘플이 또한 시험되었으며, 대다수는 양성 ADA 신호를 나타냈다. 따라서, 상승된 표적 수준의 존재는 표지된 약물과 표적-매개된 가교를 생성함에 의해 분석에서 양성 신호의 원인이 될 가능성이 높다.
이들 임상 샘플에서 관찰된 명백한 표적 간섭을 추가로 완화하기 위해, 제2 인간 표적 차단 항체 HuAb2를 중성 pH 또는 온화한 염기성 pH와 조합하여 HuAb1에 부가했다. 흥미롭게도, 표적 매개된 배경 신호는 기준선 수준은 아니지만 중성 분석 pH로 100 μg/mL의 표적 차단 항체 HuAb1 및 HuAb2로 현저하게 감소했다. 그러나, 투약-후 샘플의 하위 집합은 여전히 플레이트 절단 점 위에 분석 신호를 생성했다. 이들 샘플을 동일한 농도의 표적 차단 항체 HuAb1 및 HuAb2이지만 분석 pH 8.3으로 다시 검사했을 때, 이들은 모두 플레이트 절단 점 아래의 분석 신호를 가졌다 (도 3d).
염기성 pH와 100 μg/mL 표적 차단 항체 HuAb1로 원래 분석 형식은 약 1.1 μg/mL 재조합 표적 단백질에 내성일 수 있는 것으로 나타났다 (도 2a). 그러나, 상대적으로 낮은 표적 단백질 수준 (≤60 ng/mL)을 가진 임상 샘플에서는 표적 간섭이 관찰되었다. 이것은 재조합 표적 단백질이 분석에서 천연 단백질과 유사하게 행동하지 않을 수 있고/있거나 표적 단백질의 상이한 형태가 재조합 단백질과 비교할 때 상이한 결합 특성을 갖는 환자에서 발현될 수 있어, 표적 차단 항체 HuAb1을 임상 샘플에서 표적 간섭을 억제하는데 덜 효과적으로 만든다는 것을 나타낸다. 재조합과 내인성 표적 단백질 사이의 ADA 분석에서의 이 불일치한 결과는 분석 성능을 특징화하기 위해 실제 연구 샘플을 사용하는 것의 중요성을 강조한다.
또 다른 흥미로운 발견은 표적 내성 수준에 대한 온화한 염기성 pH의 영향이었다. HuAb1과 HuAb2의 조합은 중성 pH 조건 하에서 이들 임상 샘플에서 표적 간섭을 완전히 억제하지 못했다. 표적 간섭을 완전히 제거하기 위해 2개의 표적 차단 항체와 함께 약간의 염기성 조건이 요구되었다.
표적 수용체 MsSR과 표적 차단 항체 MsAb2의 조합은 또한 표적 간섭을 완화한다
표적 차단 항체 HuAb1은 치료용 항체 약물과 일부 공통 CDR VH 재-배열을 공유하고, 따라서 이들 VH 재-배열 영역에 특이적인 임의의 ADA는 표지된 약물이 아닌 분석 완충액에서의 HuAb1에 결합하여 잠재적으로 분석에서 검출을 손상시킬 수 있다. 이 잠재적인 문제를 극복하기 위해, 인간 IgG Fc- 융합을 갖는 표적 수용체인 HuSR이 처음으로 표적 차단 항체 HuAb1을 대체하기 위해 사용되었다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 100 μg/mL의 HuAb2와 100 μg/mL의 HuSR의 조합은 단계 I 임상 샘플에서 표적 매개된 배경 신호를 효과적으로 억제할 수 있다. 실제로, HuAb2/HuSR 또는 HuAb1/HuAb2 조합으로 유사한 표적 내성 수준을 얻었다.
부가하여, 표적 차단 항체 HuAb2는 항체 약물과 동일한 인간 IgG4 불변 영역을 가지고 표적 수용체 HuSR은 인간 IgG Fc를 갖는다. 항체 약물의 Fc 영역에 특이적인 환자 혈청 샘플에서의 임의의 항-약물 항체는 HuAb2 및 HuSR에 결합할 수 있으며, 이는 또한 잠재적으로 분석에서 이들의 검출을 손상시킬 수 있다. 이 잠재적인 문제를 극복하기 위해, HuSR의 Fc 도메인과 HuAb2의 전체 불변 영역을 인간에서 마우스로 전환하여 ADA 검출에서 이들의 가능한 간섭을 더욱 감소시켰다. MsAb2 (마우스 불변 영역을 갖는 HuAb2) 및 MsSR (마우스 Fc를 갖는 HuSR)의 조합은 여전히 임상 샘플에서 표적 간섭을 효과적으로 완화했다 (도 4b 및 도 4c). 1, 29, 57 및 113일차 임상 샘플은 이들이 혈청에 존재하는 높은 수준의 표적을 갖더라도 이 새로운 분석 형식으로 배경 신호만 나타냈다 (도 5).
온화한 염기성 pH 및 표적 차단 시약은 토끼 출혈 및 랫트 독성학 샘플에서 실제 ADA 검출에 최소한의 영향을 미친다
온화한 염기성 pH와 표적 차단 시약이 안정성 및/또는 ADA의 검출에 최소한의 영향을 미치는 것을 보장하기 위해, 약물 Fab-면역화된 토끼로부터의 조기 출혈을 현행 분석 형식으로 분석했다.
면역화 후 약 30 내지 40일에서 수집된 두 토끼로부터의 출혈 1 및 출혈 2를 중성 pH 또는 pH 8.3에서 2개의 표적 차단 시약으로 분석하였다. 이들 초기 토끼 출혈은 통상적으로 낮은 친화성을 갖는 약물에 대한 다클론 항체 반응을 가지며, 그 검출은 보다 엄격한 분석 조건에 의해 더 영향을 받을 수 있다. 도 6a에 도시된 바와 같이, ADA 평균 계수 값은 분석 pH에 관계없이 각 분석 조건 하에서 유사했으며, 이는 온화한 염기성 pH와 표적 차단 시약의 부가가 이들 샘플에서 안정성 또는 ADA의 검출에 최소한의 영향을 미치거나 전혀 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
pH 8.3에서 2개의 표적 차단 시약을 사용하는 형식이 투약-후 샘플에서 ADA를 검출할 수 있음을 추가로 확인하기 위해, 독성학 연구에서 2마리의 랫트로부터 랫트 혈청 샘플을 표적 및 ADA 수준 둘 모두에 대해 분석했다. 표적 수준은 기준선 샘플과 비교하여 랫트 1로부터의 28 및 85일차 샘플에 적어도 10-배와, 랫트 2로부터의 28일차 샘플에서 약 10-배 증가했지만, ADA 분석 신호에서 비정상적인 상승은 이 샘플에서 관찰되지 않아, 표적 간섭이 완화되었음을 나타낸다. 동시에, 85일차에 시작하여 두 동물 모두에서 높은 수준의 ADA가 검출되었으며, 이는 2개의 표적 차단 시약 및 약간 염기성 pH 분석 조건의 추가가 ADA의 검출을 방해하지 않았음을 나타낸다 (도 6b).
표적 차단 시약과 함께 온화한 염기성 pH는 약물에 표적의 결합을 억제한다
온화한 염기성 pH 및 표적 차단 시약이 임상 샘플에서 표적 간섭을 완화하는데 도움이 될 수 있는 이유를 이해하기 위해, Octet 실험을 수행하여 표적 차단 시약이 있거나 없는 다양한 pH 조건 하에서 약물에 대한 표적의 결합을 시험하였다. 결과는 도 7a에 도시되어 있다. 결합 회합 곡선에서 볼 수 있듯이, MsAb2 및 MsSR의 부재에서 pH 7.3에 비해 pH 8.2에서 반응이 약간 낮았으며, 이는 표적과 약물 사이의 회합이 분석 pH에 의해 약간 영향을 받음을 나타낸다. 그러나, pH 8.2에서 더 빠른 해리 속도가 pH 7.3에 비해 관찰되었으며, 이는 표적과 약물 사이의 결합 친화도가 pH 8.2에서 더 약함을 나타낸다. pH 7.3에서, MsAb2 및 MsSR의 존재에서 염기성 pH 단독과 유사한 빠른 해리 속도가 또한 관찰되었다. 그러나, 표적 차단 시약의 존재는 또한 약물에 대한 표적의 회합에 상당하게 영향을 미쳤다. 마지막으로, 결합의 완전한 억제는 pH 8.2에서 MsAb2와 MsSR의 조합으로 달성된다. 결합에서 pH-의존성 차이는 잠재적으로 온화한 염기성 pH에서 표적 형태의 변화 또는 pH 8.2에서 표적에 대한 표적 차단 시약의 더 나은 결합에 기인하고, 따라서 약물에 대한 표적의 회합을 억제한다.
이들 결합 데이터는 염기성 pH 단독이 임상 샘플에서 표적-매개된 신호를 부분적으로 억제할 수 있음을 보여주는 ADA 분석 데이터를 추가로 지지한다. 중성 pH에서 MsAb2와 MsSR의 조합은 표적-매개된 신호를 현저히 억제하지만, 표적 간섭의 완전한 억제는 단지 MsAb2, MsSR 및 pH 8.3의 조합으로 얻어진다 (도 7b).
리간드 결합 분석 (LBA)은 인공 신호를 생성하거나 원하는 분석 상호작용을 차단하여 분석 결과를 혼동시킬 수 있는 간섭 분자에 고도로 민감성이다. 표적 간섭은 일반적인 문제이고 약물에 대한 그것의 특이성과 각 표적 단백질의 고도로 가변성인 생물학에 기인하여 극복하기 어려울 수 있다. 표적은 통상적으로 중단하기 어려울 수 있는 순환중인 약물 및 그것의 결합 단백질과의 긴밀한 복합체를 형성한다. 부가하여, 표적:약물 및 표적:결합 단백질 복합체의 형성 또는 생물학적 경로에 고유한 피드백 메커니즘에 기인한 순환에서 상대적으로 높은 수준으로 표적 수준이 증가할 수 있다. ADA 가교 분석에서, 이량체 또는 다량체 표적의 존재는 위양성 결과를 초래하고 면역원성의 평가를 혼란스럽게 할 수 있다. 이 영향은 ADA 분석에서 약물 내성을 증가시키기 위해 일반적으로 사용되는 전략인 산 해리에 의해 악화될 수 있으며, 이는 또한 잠재적으로 표적-함유 복합체를 파괴하여 표적을 방출하고 표적-매개된 위양성 신호를 초래할 수 있다. 따라서, 분석 개발 중에는 신중한 고려를 하여, 잠재적인 인공물이 분석에 유입하는 위험에 대해 각 전략의 이점을 평가하여야 한다. 생물학을 기반으로, 분석에서 그 간섭을 완화하기 위해 표적-특이적 접근법이 평가될 필요가 있다.
표적 차단 항체 (단일 항체로 또는 조합으로), 수용체, 보조-인자뿐만 아니라 표적 결합 단백질로의 전-처리가 사용되어 표적 간섭을 완화할 수 있다. 부가하여, 분석 pH는 이량체 또는 다량체 표적에 직접적으로 영향을 미치거나 표적에 대한 약물 결합 친화도를 변화시킴에 의해 표적 간섭을 완화하기 위해 변경될 수도 있다. 또한, 혈청 샘플에서 천연 표적 단백질이 그것의 재조합 버전과 다르게 거동할 수 있으므로 실제 투여-후 샘플을 시험함에 의하여 선택된 표적 완화 전략/분석 형식의 효능을 평가하는 것이 중요한다. PK 데이터 및 표적 수준의 사용은 또한 실제 ADA 반응을 표적 매개된 신호와 구별하는데 도움이 될 수 있다.
표적 차단 시약의 부가는 표적 간섭을 완화하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 항체 치료제의 경우에 이들 시약이 약물에 유사한 CDR 서열을 공유하지 않거나 (항-표적 항체의 경우) 또는 인간 IgG 불변 서열을 함유하지 않는 (항체, 수용체 및 결합 단백질의 경우) 것이 보장되어야 하는데, 이는 이들 공유 서열은 이들 서열에 특이적인 ADA의 검출을 감소시킬 수 있기 때문이다. 마지막으로, 약물에 대한 다클론 반응과 함께 낮은-친화성 ADA 양성 동물 샘플의 사용은 분석에 대한 수정에 의해 검출이 보다 영향을 받을 가능성이 큰 진정한 낮은 친화성, 낮은 역가 ADA 반응이 최종 분석 조건 하에서 여전히 검출될 수 있다는 것을 보장하는데 도움이 될 수 있다.
본 개시내용에서, 약물 표적은 순환에서 그것의 억제성 결합 단백질과 함께 다중 비활성 복합체를 형성하는 동종이량체이다. 산-해리는 ADA 분석의 약물 내성 한계 (DTL)를 증가시키는 반면, 약물에 결합된 표적과 그것의 억제성 결합 단백질에 결합된 표적을 방출할 것이다. 방출된 표적은 ADA 분석에서 표적 간섭을 초래할 것이다. 또한, 약물로 마우스의 처리는 표적 발현을 상향- 조절한다. 전구체 및 표적의 성숙한 형태에 특이적인 항체로의 웨스턴 블롯 분석은 약물 주입 28일 후 마우스에서 상이한 표적의 형태가 상향-조절되었음을 나타냈다. 따라서, 가능한한 많은 표적 내성을 가진 강력한 ADA 분석이 요구된다.
표적 차단 항체 (HuAb1) 및 온화한 염기성 pH 분석 조건 (pH 8.3)을 포함함으로써, 본 발명자들은 재조합 표적 단백질에 대해 높은 내성 수준을 얻을 수 있었다. 분석은 제2 표적 차단 항체 HuAb2를 부가하도록 최적화되었다. 이것은 표적 내성을 유의하게 향상시켰고, 임상 연구 샘플에서 양성률이 크게 감소되었다. HuAb1 항-표적 항체를 대체함에 의해 분석에서 추가의 최적화가 이루어 졌다. HuAb1은 약물과 일부 보완 결정 영역 (CDR) 서열을 공유하기 때문에, 그것은 잠재적으로 항-약물 ADA를 결합하고 따라서 ADA 검출을 감소시킬 수 있었다. 따라서, 인간 IgG Fc (HuSR)에 융합된 표적 수용체의 외부 부분이 HuAb1 대신에 사용되었다. HuAb2와 조합하여, HuSR은 표적 간섭뿐만 아니라 HuAb1/HuAb2 콤보를 차단할 수 있었다. 연속적으로, HuSR의 Fc 도메인과 HuAb2의 전체 불변 영역을 인간에서 마우스로 전환하여 (MsAb2 및 MsSR) ADA 검출에서 가능한 간섭을 더욱 감소시켰다. Octet 시스템을 사용한 특징화 실험은 약물에 대한 표적의 결합이 온화한 염기성 pH 또는 항-표적 차단 시약 단독의 존재에 의해 억제됨을 나타냈다. 그러나, 결합의 완전한 억제는 MsAb2, MsSR 및 온화한 염기성 pH의 조합으로 달성된다. 면역화된 토끼로부터 낮은-역가 ADA 양성 출혈과 랫트에서 비임상 연구에서 알려진 ADA 양성 샘플의 분석은 ADA-양성 샘플을 검출하는 분석의 능력과 ADA 검출에 대한 염기성 pH 및 표적 차단 시약의 최소 영향을 확인했다.
이들 발견은 표준 표적 차단 항체가 효과가 없을 때 가교 면역원성 분석에서 표적 간섭을 극복하기 위한 대안적인 전략을 제공한다.
균등물
당업자는 일상적인 실험 이하를 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 포괄되도록 의도된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 본원에 인용되어 포함된다.
Claims (30)
- 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법으로서, 상기 방법은
상기 혈청 샘플을
제1 표지로 표지된 포획 약물;
제2 표지로 표지된 검출 약물; 및
약물 표적 차단 시약;과 접촉시키는 단계,
상기 혈청 샘플을 온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서, 상기 포획 약물, 검출 약물 및 약물 표적 차단 시약으로 인큐베이션하는 단계,
및 상기 약물 표적 차단 시약이 샘플에 존재하는 약물 표적에 결합하도록 허용하는 단계를 포함하고,
이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는, 방법. - 제1항에 있어서, 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물 표적 차단 시약은 약물 표적 차단 항체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물 표적은 예를 들어 수용체에 대한 리간드와 같은 가용성(soluble) 단백질인, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 약물 표적 차단 시약은 IgG Fc 도메인에 융합된 수용체의 부분을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 수용체의 부분은 수용체의 세포외 부분인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 IgG Fc 도메인은 마우스 IgG Fc 도메인인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 IgG Fc 도메인은 인간 IgG Fc 도메인인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 혈청 샘플을 제2 약물 표적 차단 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 제2 약물 표적 차단 시약은 약물 표적 차단 항체인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 약물 표적 차단 항체는 마우스 불변 영역을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물은 인간 치료적 단일클론 항체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물은 인간화된 치료적 단일클론 항체인, 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화된 치료적 단일클론 항체는 임상적 시험에서 평가되어 지는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물 표적은 가용성 또는 탈피 다량체 약물 표적인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 약물 표적은 동종이량체 약물 표적인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 온화한 염기성 pH 분석 조건은 약 8.3 내지 약 8.9의 pH 조건을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 온화한 염기성 pH 분석 조건은 약 8.3의 pH 조건을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 온화한 염기성 pH 분석 조건은 약 8.9의 pH 조건을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 샘플은 인간 혈청 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈청 샘플은 약물로 치료되는 대상체로부터의 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 인큐베이션은 실온에서 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석은 고-처리량 분석인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포획 약물은 고체 표면에 부착되는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 고체 표면은 미세역가 플레이트인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 고체 표면은 스트렙타비딘으로 도포되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포획 표지는 비오틴 표지, 단백질 A 표지, 단백질 G 표지 및 글루타티오닌 S-트랜스퍼라제 (GST) 표지로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 표지는 루테늄 표지, 방사선 표지, 축광 표지, 화학발광 표지, 형광 표지, 전기화학발광 표지 및 효소 표지로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법으로서, 상기 방법은
상기 혈청 샘플을
제1 표지로 표지된 포획 약물;
제2 표지로 표지된 검출 약물;
제1 약물 표적 차단 항체; 및
제2 약물 표적 차단 항체와 접촉시키는 단계,
온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서, 상기 포획 약물, 검출 약물, 제1 약물 표적 차단 항체 및 제2 약물 표적 차단 항체를 인큐베이션하는 단계,
및 상기 제1 약물 표적 차단 항체 및 제2 약물 표적 차단 항체가 샘플에 존재하는 약물 표적에 결합하도록 허용하는 단계를 포함하고,
이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는, 방법. - 혈청 샘플 내의 약물에 대한 ADA의 존재의 결정을 위한 항-약물 항체 (ADA) 가교 면역분석에서 약물 표적 간섭을 완화하는 방법으로서, 상기 약물 표적은 가용성 단백질이고, 상기 방법은
상기 혈청 샘플을
제1 표지로 표지된 포획 약물;
제2 표지로 표지된 검출 약물;
IgG Fc 도메인에 융합된 수용체의 세포외 부분을 포함하는 약물 표적 차단 시약; 및
약물 표적 차단 항체와 접촉시키는 단계,
온화한 염기성 pH 분석 조건 하에서, 상기 포획 약물, 검출 약물, 약물 표적 차단 시약 및 약물 표적 차단 항체를 인큐베이션하는 단계,
및 상기 약물 표적 차단 시약 및 약물 표적 차단 항체가 샘플에 존재하는 약물 표적에 결합하도록 허용하는 단계를 포함하고,
이에 의해 ADA 가교 면역분석에서 약물 표적의 간섭을 완화하는, 방법.
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