KR20210024999A - 글리코사미노글리칸 저해제 및 촉진제 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환에 대한 부작용이 적은 의약품을 개발하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는 글리코사미노글리칸의 저해제 또는 촉진제를 제공한다.

Description

글리코사미노글리칸 저해제 및 촉진제

본 발명은, 글리코사미노글리칸의 저해제 및 촉진제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 락토페린 또는 그의 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 글리코사미노글리칸의 저해제 또는 촉진제에 관한 것이며, 또한 락토페린의 글리코사미노글리칸 저해 또는 촉진 작용에 기초하는, 글리코사미노글리칸 관련 질환의 치료에 있어서의 락토페린의 의약 용도에 관한 것이다.

글리코사미노글리칸의 대부분은, 프로테오글리칸으로서 코어 단백질이라고 불리우는 핵이 되는 단백질에 다당류가 부가한 형태로 존재하고, 체조직 중의 세포외 매트릭스나 세포 표면에 존재하는 것 이외에, 연골의 주성분으로서도 존재하고 있다. 그 중에서도 콘드로이틴 황산은, 여러가지 세포 증식 인자나 세포외 매트릭스 성분과 상호 작용하여, 세포 접착, 이동, 증식, 분화, 형태 형성과 같은 여러가지 세포 활동을 제어하고 있다. 또한, 콘드로이틴 황산 나트륨을 성분으로 한 요통증, 관절통, 견관절 주위염 등의 의약품이나, 식품이 판매되고 있다. 이하, 당에 관해서, 콘드로이틴 황산 A(CS-A), 콘드로이틴 황산 B(CS-B), 콘드로이틴 황산 C(CS-C), 콘드로이틴 황산 D(CS-D), 콘드로이틴 황산 E(CS-E), 히알루론산(HA), 헤파린(HP), 헤파란산(HS), 케라탄 황산(KS)의 약호를 나타낸다.

염증 부위의 과도한 콘드로이틴 황산의 발현은, 척수 손상이나 암의 전이, 알츠하이머병 등에 관계되고, 질환의 악화로 이어진다. 콘드로이틴 황산이 병태의 개선에 관계되는 척수 손상은, 일본에서는 환자가 이미 10만명 이상으로 증가하고, 또한 매년 약 5000명이 새롭게 발증하여, 전세계에서 약 20만명이 새롭게 발증하고 있다고 추정되고 있다. 그 질환은, 부상으로부터 수시간까지의 급성기, 몇주일까지의 아급성기, 그리고 그 이후의 만성기로 분류된다. 아급성기까지는 어느 정도의 조직 수복과 자발적 회복이 달성되지만, 만성기 이후는, 손상 부위에서 견고하게 형성된 글리아성 반흔에 의해, 파탄된 신경 회로의 재구축이 저해되어 회복이 곤란해진다(비특허문헌 1). 현재, 부상 후 72시간 이내에 대량의 스테로이드, 간세포 증식 인자의 투여나, 재생 의료에 의한 회복이 시도되고 있지만, 치료 방법은 확립되어 있지 않다.

척수 손상에서는, 신경 회로의 재구축을 저해하는 글리아성 반흔의 주요 요인인 반응성 아스트로사이트는, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸을 합성한다. 손상 부위에 존재하는 신경 세포의 성장 원추 표면에는, 글리코사미노글리칸의 수용체인 PTPσ나 LAR이 존재하고, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 특히 CS-E 당쇄가 이들 수용체에 결합함으로써 축삭 재생 저해에 관여하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 그 때문에, 척수 손상 모델을 사용한 실험에서는, CS-E의 수용체의 PTPσ(비특허문헌 3)나 탈인산화 효소 LAR의 녹아웃 마우스(비특허문헌 4)에 의한 신경 재생 항진, 프로테오글리칸 코어 단백에 결합하는 당쇄를 분해하는 박테리아 효소의 콘드로이티나아제 ABC를 사용한 CS-E의 분해(비특허문헌 5, 6), CS-E 합성효소 저해제(비특허문헌 7)에 의한 축삭 재생 등에서, 치료 효과가 보고되어 있다.

근년, 새로운 치료 방법으로서 콘드로이티나아제 ABC를 사용한 국소 투여 요법이 기대되어, 요추 추간판 헤르니아 치료약으로서 판매되고 있다. 그러나, 이 제제는 박테리아의 단백질 때문에, 국내 임상 시험 등으로부터 부작용(임상 검사치 이상 포함)이 53.3% 인정되었다. 주된 것으로서, Modic 분류의 추체 휘도 변화(23.6%), 요통(22.3%), 추간판 높이의 30% 이상의 저하(14.4%), 하지통(4.8%) 등이며, 중대한 것은 쇼크, 아나필락시스가 보고되어 있다. 이것으로부터, 부작용이 적은 의약품의 개발이 불가결하다.

인간에게는 콘드로이틴 황산을 분해하는 효소로서, 히알루로니다아제(Hyaluronidase)라고 하는 효소가 존재한다. 히알루로니다아제를 척수 손상 모델의 개에게 투여하여도 효과가 없다는 것(비특허문헌 8), 척수 손상 모델 마우스에게 투여했을 경우, 운동 개선은 인정되지 않고, 오히려 염증 악화의 경향이 관찰되고 있다 (비특허문헌 9). 재생 의료로서의 치료도 고려되고 있고, 2018년에, 배양한 자기 골수 간엽계 줄기 세포를 투여하는 치료가 승인되어 있다. 또한, iPS 세포로부터 손상한 신경 세포를 재생시키는 시도도 고려되고 있지만, 재생 의료는 치료비가 높고, 세포를 투여할 수 있을 때까지 시간이 걸리기 때문에, 부상 후 빠른 단계에서의 치료에 대응할 수 없다는 결점이 있다.

또한, 암 세포의 표면에는 콘드로이틴 황산이 많이 발현하여, 암의 전이에 관여하고 있다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10), 특히 폐암에서는, 정상 폐 조직의 세포, 특히 혈관 내피에 발현되어 있는 RAGE 단백질이 CS-E 등에 결합함으로써, 암 세포가 전이되는 것을 알 수 있다(비특허문헌 11, 12), 그 전이는, 콘드로이티나아제 ABC, 항 CS-E 항체, 항 RAGE 항체 등으로, 저해된다. 또한, 유방암의 전이에 관계되는 유방암 줄기 세포의 표면 마커 CD44에도 히알루론산이나 CS-C 등의 글리코사미노글리칸이 결합한다고 보고되어 있다(비특허문헌 10).

한편, 락토페린(Lf)은, 트랜스페린 패밀리에 속하는 분자량 약 8만의 철 결합성 당단백질이며, 초유나 눈물 등 포유류의 외분비액에 많이 포함된다. N-lobe 와 C-lobe의 구상 도메인으로 이루어지고, 각 도메인에는 1개의 3가 철이 결합한다. 철이 결합한 철 포화형(Holo)과 철이 유리된 철 유리형(Apo)은 그 입체 배좌가 다르다. 도 10에 인간 락토페린의 3차원 구조를 나타낸다.

락토페린은, 포유류의 선천성 및 적응 면역 기능의 중개 역할을 하는 세포 분비 분자이며, 그 방어 효과는, 항암 활성, 항염증 활성 및 면역 조절 활성으로부터, 다수의 미생물에 대한 항균 활성까지 여러 갈래에 걸친다. 이 광범위한 활성은, Lf의 철 결합능뿐만 아니라, Lf와 숙주 및 병원체의 분자 성분 및 세포 성분과의 상호 작용이 관여하는 작용 기전에 의해 가능해진다고 보고되어 있다(비특허문헌 13).

J. Neurotrauma 2005;22(5), 544-558. Trends in Glycoscience and Glycotechnology 2011;23(133) 201-211. Science 2009 Oct 23;326(5952):592-6. Neurobiol Dis 2015;73:36-48. FEBS Journal 280(2013) 2462-2470 Nature. 2002 Apr 11;416(6881):636-40. ACS Chem. Biol. 2017, 12, 3126-3133. Surg. Neurol. 13, 157-159, 1980 제37회 일본 당질 학회 연회 요지집, 오다들 2018년 8월 30 일 Biochemical Journal (2018) 475 587-620. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2008;283(49):34294-34304. Biomed Res Int. 2013;656319. Biochimica et Biophysica Acta, Volume 1820, Issue 3, March 2012, Pages 226-236

따라서, 글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환에 대한 부작용이 적은 의약품의 개발이 요망되고 있다.

상기의 결점을 극복하기 위한 수단으로서, 본 발명자들은, 안전성이 높은 인간 락토페린(hLF) 및 그 기능적 부분, 유도체 등을 전형적으로 사용하는, 글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환에 대한 부작용이 적은 의약 조성물 및 그것을 사용한 해당 질환의 치료법을 제안한다.

발명자들은, 다질환의 증악에 관계되는 글리코사미노글리칸의 기능을 저해 항진하는 생체내 물질을 탐색함에 있어서, 락토페린에 착안하고, 특정한 글리코사미노글리칸에 있어서, 락토페린이 그 기능 저해 또는 항진을 하는 것을 검토해 왔다. 발명자들은, 락토페린, 그 N-lobe 및 락토페린에 포함되는 염기성 펩티드를 사용하여, 원편광 2색성(CD) 스펙트럼에 의해 락토페린과 특정한 글리코사미노글리칸만이 결합하는 것, 척수 손상 개선 작용의 약리 활성은, 세포 모델을 사용하여 축삭 신장 활성이 있는 것, 암 치료 작용은, 암 세포주의 증식 억제나 세포사의 비율, 스크래치 어세이에 의한 암 세포의 침윤이나 유주능 저해가 있다는 것을 발견하였다. 이러한 점에서, 특정한 글리코사미노글리칸에 대한 질환에 락토페린과 그 활성을 갖는 펩티드, 구상 도메인, 변이체, 유도체 등이 유효한 치료약이 될 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

본 개시는 이하의 [1] 내지 [19]를 포함한다.

[1] 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는 글리코사미노글리칸의 저해제 또는 촉진제.

[2] 상기 락토페린이, 철 유리형(Apo) 또는 칠 포화형(Holo)의 락토페린인, 상기 [1]에 기재된 저해제 또는 촉진제.

[3] 상기 락토페린은 인간 유래의 것인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 저해제 또는 촉진제.

[4] 상기 락토페린이, 이하의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드인, 상기 [1]에 기재된 저해제 또는 촉진제:

(a) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 락토페린의 N-lobe를 포함하는 단백질;

(c) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 70개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;

(d) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;

(e) GRRRRSVQWCA(서열번호 7)의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.

[5] 상기 락토페린의 유도체가, 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)(서열번호 9), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA) (서열번호 10) 또는 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF) (서열번호 11)인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 저해제, 촉진제.

[6] 상기 글리코사미노글리칸이, 콘드로이틴 황산-A(CS-A), 콘드로이틴 황산-B(CS-B), 콘드로이틴 황산-C(CS-C), 콘드로이틴 황산-D(CS-D), 콘드로이틴 황산-E(CS-E), 헤파린(HP) 및 헤파란 황산(HS) 및 케라탄 황산(KS)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 저해제, 촉진제.

[7] 상기 글리코사미노글리칸이, 콘드로이틴 황산-C(CS-C), 콘드로이틴 황산-D(CS-D) 또는 콘드로이틴 황산-E(CS-E)인, 상기 [6]에 기재된 저해제, 촉진제.

[8] 상기 글리코사미노글리칸이, CS-E 인, 상기 [6]에 기재된 저해제, 촉진제.

[9] 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는, 글리코사미노글리칸에 관련하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약 조성물.

[10] 상기 락토페린이 철 유리형(Apo) 또는 철 포화형(Holo)의 락토페린이며, 0.001 내지 10g/kg/일의 양이 되도록 조제되어 있는, 상기 [9]에 기재된 의약 조성물.

[11] 상기 락토페린은 인간 유래의 것인, 상기 [9] 또는 [10]에 기재된 의약 조성물.

[12] 상기 락토페린이, 이하의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드인, 상기 [9]에 기재된 의약 조성물:

(a) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;

(b) 락토페린의 N-lobe를 포함하는 단백질;

(c) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 70개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 글리코사미노글리칸의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;

(d) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;

(e) GRRRRSVQWCA(서열번호 7)의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.

[13] 상기 락토페린의 유도체가, 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)(서열번호 9), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA) (서열번호 10) 또는 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF) (서열번호 11)인, 상기 [9] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[14] 상기 글리코사미노글리칸이, 콘드로이틴 황산-C(CS-C), 콘드로이틴 황산-D(CS-D) 또는 콘드로이틴 황산-E(CS-E)인, 상기 [9] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[15] 콘드로이틴 황산 분해 효소와 병용하기 위한, 상기 [9] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[16] 상기 질환은, 척수 손상, 암 전이, 암, 당뇨병, 염증, 동맥 경화, 섬유화, 급성 호흡기 질환, 알츠하이머병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 상기 [9] 내지 [15] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[17] 식품의 형태로 있는, 상기 [9] 내지 [16] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[18] 주사제의 형태로 있는, 상기 [9] 내지 [16] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

[19] 경구 투여되는 것인, 상기 [9] 내지 [16] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

본 발명자들은 hLF, hLF N-lobe 및 그의 유도체인 hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF가 글리코사미노글리칸의 1종인 CS-E에 강하게 결합하는 것을 발견하였다. 닭 배아의 척수 후근 신경절 신경 세포를 사용한 실험에서, CS-E에 의해 신경 축삭 신장의 저해, 성장 원추의 붕괴가 관찰되지만, hLF, hLF N-lobe, hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, 그리고 hLF-G-CSF를 첨가하면, 축삭 신장 저해가 억제되어, 성장 원추의 붕괴로부터 보호하는 작용이 인정되었다. 이것으로부터, 특히 급성기에 있어서의 치료 용도로의 이용 가능성이 나타났다.

본 발명의 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제·촉진제는, 글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환 또는 병태의 치료를 위한 의약으로서 유용하다.

도 1은 CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른(Apo 및 Holo) 전장 인간 락토페린(hLf)의 2차 구조 해석의 결과를 도시하는 도면이다. (A) 철 포화형 hLf(Holo hLf)의 2차 구조 해석 결과; (B) 철 유리형 hLf(Apo hLf)의 2차 구조 해석 결과.
도 2는 CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른 hLf N-lobe의 2차 구조 해석의 결과를 도시하는 도면이다. (A) 철 포화형 hLf N-lobe(Holo hLf N-lobe)의 2차 구조 해석 결과; (B) 철 유리형 hLf N-lobe(Apo hLf N-lobe)의 2차 구조 해석 결과.
도 3은 CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른 전장 인간 락토페린(hLf) 및 hLf N-lobe 각각의 열변성 시험의 결과를 도시하는 도면이다. (A) 글리코사미노글리칸 비 존재 하에서의 Apo/Holo hLf(좌측) 및 Apo/Holo hLf N-lobe(우측)의 열안정성을 나타낸다.; (B) 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Apo hLf의 열안정성. (C) 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Holo hLf N-lobe의 열안정성. (D) 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Apo hLf N-lobe의 열안정성.
도 4는 CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 hLfcin1-11(GRRRRSVQWCA(서열번호 7))의 2차 구조 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 5는 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E) 존재 하에서의, 염소산(NaClO₃) 처리한 비소세포 폐암 세포주 PC-3의 세포 증식에 대한 hLF N-lobe의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 (A) 염소산(NaClO₃) 처리 또는 (B) 콘드로이틴 황산 분해 효소(ChABC) 처리한 비소세포 폐암 세포주 PC-3의 세포 증식에 대한 철 포화형(Holo) hLF N-lobe의 효과를 도시하는 도면이다.
도 7은 인간 폐암 PC-14 세포의 CS-E 의존적인 전이에 대한 hLF N-lobe의 효과를 도시하는 도면이다.
도 8은 PC-12 세포의 돌기 신장 및 성장 원추에 대한 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E)의 효과를 도시하는 도면이다.
도 9는 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E) 존재 하에서의 PC-12 세포의 돌기 신장 및 성장 원추에 대한 hLf N-lobe의 효과를 도시하는 도면이다.
도 10은 인간 락토페린의 3차원 구조를 도시하는 도면이다(배경기술).
도 11은 Solid-phase binding assay에 의한, 인간 락토페린(hLF), hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, LF-G-CSF)와 각종 황산화 글리코사미노글리칸(sGAG)과의 결합 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 12는 CS-E의 닭 배아 척수 후근 신경절(DRG) 세포의 축삭 신장 저해 활성에 대한 hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)의 억제 작용의 결과를 도시하는 도면이다.
도 13은 CS-E의 닭 배아 척수 DRG 세포의 성장 원추 붕괴 활성에 대한 hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)의 억제 작용의 결과를 도시하는 도면이다.

1. 용어의 정의

본원 명세서 중에서 사용되는 용어 "락토페린"은, 특별히 언급하지 않는 한, 전장 락토페린, 락토페린의 기능적 부분(Functional moiety)으로 이루어지는 단백질 또는 당해 기능적 부분을 함유하는 단백질을 의미한다. 본원 명세서 중, 락토페린의 "기능적 부분"이란, 그것만으로 전장 락토페린의 "기능"과 동등 혹은 적어도 그 일부의 기능을 갖는 락토페린의 일부 또는 변이체(variant(s))를 의미한다. 또한, 전장 락토페린에는, 인간 락토페린(서열번호 1), 소 락토페린(서열번호 2), 양 락토페린(서열번호 3), 염소 락토페린(서열번호 4), 말 락토페린(서열번호 5), 낙타 락토페린(서열번호 6) 등이 포함되지만, 이것으로 한정되지 않는다.

이러한 락토페린의 아미노산 서열 및 그것을 코드하는 뉴클레오티드 서열의 정보는, Web 상에서 용이하게 액세스 가능한 서열 데이터 베이스(예를 들어, NCBI 데이터 베이스)에 액세스함으로써 입수 가능하다. 편의를 위해서, 이하의 표 1에 이들 인간 및 몇 가지 포유 동물의 서열 정보를 나타낸다.

본 명세서 중, "락토페린의 기능"이란, 적어도 인비트로에서의, 바람직하게는 인비보에서의, 글리코사미노글리칸의 발현 또는 기능의 저해능 또는 촉진능을 의미한다. "글리코사미노글리칸의 기능"으로서는, 당업자에게 글리코사미노글리칸의 기능으로서 인식되어 있는 것이라면 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 세포 접착, 이동, 증식, 분화, 형태 형성과 같은 여러가지 세포 활동의 제어가 포함된다.

락토페린의 "기능적 부분"으로서는, 전형적으로는,

(1) 락토페린의 구상 도메인(N-lobe 또는 C-lobe),

(2) 락토페린의 변이체(예를 들어, 서열번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 1 내지 6 중 어느 것의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 수개(예를 들어, 2개에서 70개 정도까지)의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/혹은 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질),

(3) 락토페린의 부분 펩티드(예를 들어, 인간 락토페린의 아미노산 잔기 20-30으로 이루어지는 펩티드("GRRRRSVQWCA"(서열번호 7))) 등이 포함된다.

상기 (2)에 기재된 변이체는, 전형적으로는, 천연에 존재하는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 락토페린의 변이체이지만, 그것으로 한정되지 않고, 예를 들어 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487(1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)", "Gene, 34, 315(1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 인위적으로 취득할 수 있는 것도 포함된다.

상기 (2)의 변이체의 예에 있어서, 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/혹은 부가 등에 의한 변이의 정도는, 변이체 단백질이 원래의 단백질의 기능과 동등 혹은 적어도 그 일부의 기능을 갖는 한 허용되며, 전형적으로는, 원래의 아미노산 서열의 10% 정도까지, 즉, 아미노산 잔기의 수에 있어서, 1 내지 수개(예를 들어, 2개로부터 순차 70개 정도까지)의 변이를 가질 수 있다.

상기 (2)의 변이체의 예에 있어서, "90% 이상의 동일성"으로서는, 원래의 아미노산 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 동일성이 포함될 수 있다.

본 명세서 중, "락토페린의 유도체(derivative(s))"란, 락토페린에 대하여 유전자 공학의 방법에 의해 원하는 수식을 한 락토페린 분자를 의미한다. 그러한 락토페린 유도체의 예로서는, 예를 들어 락토페린과 다른 단백질과의 융합 단백질이 포함된다. 그러한 융합 단백질의 예로서는, 본원 명세서에서 후술하는 실시예에 비한정적인 예로서 나타나는, 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)(서열번호 9), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA)(서열번호 10), 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF)(서열번호 11) 등이 포함된다.

락토페린에 대해서, "글리코사미노글리칸의 발현 또는 기능의 저해능 또는 촉진능"은, 글리코사미노글리칸의 발현량 또는 기능의 측정값을, 락토페린의 비존재 하와 존재 하 사이에서 비교하고, 락토페린의 존재 하에서 상기 측정값이 감소 또는 증대하는 것을 확인함으로써 정량적으로 측정할 수 있다. 그러한 정량적인 측정 방법의 비한정적인 예가, 본원 명세서에서 후술하는 실시예에 나타내고 있다.

본 명세서 중, "글리코사미노글리칸"은, 당해 분야에서 당업자에게 일반적으로 인식되고 있는 의미로 사용되며, 반복 2당 단위로 이루어지는 긴 비분지 다당류를 의미한다. 본 발명에 관련하여 글리코사미노글리칸의 예로서는, 콘드로이틴 황산 A(CS-A), 콘드로이틴 황산 B(CS-B), 콘드로이틴 황산 C(CS-C), 콘드로이틴 황산 D(CS-D), 콘드로이틴 황산 E(CS-E), 히알루론산(HA), 헤파린(HP), 헤파란산(HS), 케라탄 황산(KS) 등이 포함되지만, 이것으로 한정되지 않는다.

2. 락토페린을 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제

본 발명의 하나의 실시 형태에 따르면, 락토페린을 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제(혹은, 저해 또는 촉진을 위한 조성물)가 제공된다. 상기 저해제 또는 촉진제에 있어서, 락토페린은, 철 유리형(Apo) 또는 철 포화형(Holo)의 락토페린일 수 있다. 본 발명의 락토페린을 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제는, 락토페린에 의한 글리코사미노글리칸의 발현 또는 기능의 저해능 또는 촉진능을 이용하는 것이며, 본 발명의 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제에 의해, 글리코사미노글리칸의 발현량 또는 기능이 저해 또는 촉진된다.

본 발명의 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제는, 락토페린 이외에, 당업자에게 알려져 있는 임의의 용매, 분산매, 결합제, 첨가제, 등의 부형제를 포함해도 좋다.

본 발명의 락토페린을 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제는, 인비트로 또는 인비보에서 사용할 수 있다.

3. 락토페린을 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제 또는 촉진제의 의약으로의 적용

본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 락토페린을 함유하는, 글리코사미노글리칸에 관련하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약 조성물(이하, 단순히 "본 발명의 의약 조성물"이라고 한다.)이 제공된다. 본 발명의 의약 조성물에 있어서, 락토페린은 철 유리형(Apo) 또는 철 포화형(Holo)이며, 전형적으로는 락토페린의 양이 0.001 내지 10g/kg/일이 되도록 조제되고 있다. 피검 대상은, 인간 또는 동물(예를 들어, 인간을 제외하는 포유 동물)일 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 다른 약제(예를 들어, 콘드로이틴 황산 분해 효소)와의 병용(동시 또는 연속적)으로 사용할 수도 있다.

락토페린은, 생체 내에 원래 존재하는 단백질이며, 또한 식품에도 포함되어 있기 때문에, 본 발명에 따라 의약으로서 사용했을 경우에는, 부작용도 적고, 환자 또는 피검체에 고통을 강요하지도 않고, 다른 질환을 유발하는 리스크도 적다는 이점을 갖는다.

"글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환 또는 병태"의 예로서는, 전형적으로는, 암(예를 들어, 폐암, 유방암, 정소암, 간암 등), 암 전이, 축삭 재생에 관련하는 질환(예를 들어, 척수 손상, 알츠하이머병 등), 당뇨병, 염증, 동맥 경화, 섬유화, 급성 호흡기 질환 등이 포함되지만, 이것으로 한정되지 않는다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서, 락토페린은, 그대로, 혹은 약학적으로 허용되는 담체 등과 함께 의약으로서 제제화되어, 각종 질환의 치료를 위해서 인간 또는 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 락토페린을, 치료를 필요로 하는 환자 또는 피검체에 투여하는 공정을 포함하는, 글리코사미노글리칸(의 기능)에 관련하는 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다.

발명이 다른 실시 형태에 따르면, 락토페린은, 글리코사미노글리칸에 관련하는 질환 또는 병태의 치료를 위한 의약 제조를 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서, 락토페린은, 의료용(예를 들어, 치료 또는 예방용) 키트의 구성 요소의 하나로서 당해 키트에 포함되어 제공될 수 있다. 당해 키트에는, 당해 의약 조성물 이외에, 적용 방법, 적용량 등을 설명한 사용 설명서를 포함할 수 있다.

본 명세서 중, 용어 "약학적으로 허용된다" 또는 "약리학적으로 허용된다"는, 과잉인 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그 밖의 문제 혹은 합병증이 없으며, 타당한 이점/위험의 비와 상응하고 있고, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 위해서 적절하다고 하는 올바른 의학적 판단의 범위 내에 있는 그러한 물질, 재료, 조성물, 및/또는 제형을 언어로 표현하기 위해서 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 "약(리)학적으로 허용되는 담체"로서는, 당업자에게 알려져 있는 임의의 용매, 분산매, 코팅, 계면 활성제, 항산화제, 보존료(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존료, 약제, 약물 안정제, 겔, 결합제, 첨가제, 붕괴제, 활제, 감미제, 향미료, 염료 및/또는 그것들의 재료 및 조합이 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료한다"는, (i) 병적 상태가 일어나는 것을 방지하는 것(예를 들어, 예방), (ii) 병적 상태를 저지하는 것 또는 그 발달을 막는 것, (iii) 병적 상태를 경감, 관해, 혹은 완치하는 것, 및/또는 병적 상태와 관련하는 증상이 경감, 관해, 혹은 완치하는 것을 포함한다.

본 발명에 따라, 락토페린을 의약으로서 환자 또는 피검체에게 투여하는 경우, 예를 들어 락토페린을 단독 또는 관용의 부형제와 함께 제제하고, 캡슐제, 정제, 주사제 등의 적절한 제형으로서, 경구적 또는 비경구적 투여에 사용할 수 있다. 예를 들어, 캡슐제는, 본 발명의 저해제 또는 촉진제 또는 락토페린을 유당, 전분 또는 그의 유도체, 셀룰로오스 유도체 등의 부형제와 혼합하여 젤라틴 캡슐에 충전하여 조제할 수 있다.

또한, 정제는, 상기 부형제 이외에, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 알긴산, 아라비아 고무 등의 결합제와 물을 첨가하여 반죽하고, 필요에 따라 과립으로 만든 후, 다시 탈크, 스테아르산 등의 활택제를 첨가하고, 통상의 압축 타정기를 사용하여 정제로 조제할 수 있다.

또한, 주사에 의한 비경구 투여 시에는, 락토페린을 용해 보조제와 함께 멸균 증류수 또는 멸균 생리 식염수에 용해하고, 앰플에 봉입하여 주사용 제제로 만든다. 필요에 따라 안정화제, 완충 물질 등을 함유시켜도 좋다. 이러한 비경구 투여 제제는, 정맥내 투여, 혹은 점적 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.

또한, 락토페린을 그대로, 혹은 제제화한 후, 이것을 영양제나 음식품 등에 첨가해도 좋다.

본 발명에 따르면, 락토페린의 투여량은, 여러가지 요인, 예를 들어 치료해야 할 환자 또는 피검체의 증상, 중증도, 연령, 합병증의 유무 등에 따라 변화한다. 또한, 투여 경로, 제형, 투여 횟수 등에 따라서도 다르지만, 일반적으로는, 경구 투여의 경우는, 유효 성분으로서, 통상, 0,001 내지 10g/kg/일, 0.005 내지 10g/kg/일, 0.01 내지 10g/kg/일, 0.01 내지 5g/kg/일로 할 수 있다. 인간에게 투여할 경우, 일반적으로는, 치료상 유효량으로서, 1일당 10mg 내지 15,000mg, 10mg 내지 12,000mg, 10mg 내지 10,000mg, 20mg 내지 10,000mg, 20mg 내지 8,000mg, 30mg 내지 8,000mg, 30mg 내지 6,000mg의 양이다. 이러한 1일당의 용량을 한번에 또는 분할하여 글리코사미노글리칸에 관련하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여의 경우는, 경구 투여의 경우에 있어서의 투여량의 약 1/100 내지 1/2양 정도의 범위 내로 적절하게 선별하여 투여할 수 있다.

본 발명은, 이하의 실시예에 의해 보다 상세하게 기재된다. 이들 실시예는, 예시이며, 본 발명의 범위를 어떠한 양식에서도 한정하는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 나타낸다. 또한, 본문 중 및 도면 중에서의 약어는, 인간 락토페린(hLF), 인간 락토페린 N-lobe(hLF N-lobe), 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA), 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF), 인간 IgG(hIgG), 인간 혈청 알부민(HSA), 콘드로이틴 황산 A, B, C, D, E(CS-A, B, C, D, E), 헤파린(HP), 황산화 글리코사미노글리칸(SGAG), 닭 배아 척수 후근 신경절(DRG)이다.

[실시예 1] 전장 인간 락토페린(hLf) 및 hLf 구상 도메인의 각종 글리코사미노글리칸 존재에서의 2차 구조와 열 안정 평가

hLf, hLf N-lobe와 sGAG 당쇄의 몰비를 1:0, 1:1, 1:5로 하여, PBS(-)에서 전액량을 250μl로 조제하였다. 조제한 샘플을 알루미늄 블록에서 37℃, 1시간 인큐베이트하였다. 원이색성 분산계 J-1500(니혼분코)은 표 2-1, 2-2에 나타냈다.

도 1 은, CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른(Apo 및 Holo) 전장 인간 락토페린(hLf)의 2차 구조 해석의 결과를 나타낸다. 도 1A는, 철 포화형 hLf(Holo hLf)의 2차 구조 해석 결과를 나타내고, 도 1(B)는 철 유리형 hLf(Apo hLf)의 2차 구조 해석 결과를 나타낸다. CS-C, CS-D, CS-E의 존재 하에서, 전장 hLf의 2차 구조가 현저하게 변화하였다. 이 효과는, hLf의 철의 유무에 영향받지 않았다.

도 2는, CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른 hLf N-lobe의 2차 구조 해석의 결과를 나타낸다. 도 2A는, 철 포화형 hLf N-lobe(Holo hLf N-lobe)의 2차 구조 해석 결과를 나타내고, 도 2B는, 철 유리형 hLf N-lobe(Apo hLf N-lobe)의 2차 구조 해석 결과를 나타낸다. CS-C, CS-D, CS-E의 존재 하에서, hLf N-lobe의 2차 구조가 현저하게 변화하였다. 이 효과는, hLf N-lobe의 철의 유무에서 영향받지 않았다.

도 3은, CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 철 결합도가 다른 전장 인간 락토페린(hLf) 및 hLf N-lobe 각각의 열변성 시험의 결과를 나타낸다. 도 3A는, 글리코사미노글리칸 비 존재 하에서의 Apo/Holo hLf(좌측) 및 Apo/Holo hLf N-lobe(우측)의 열안정성을 나타낸다. 도 3B는, 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Apo hLf의 열안정성을 나타낸다. 도 3C는, 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Holo hLf N-lobe의 열안정성을 나타낸다. 도 3D는, 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E(좌측), HP 및 HS(우측)) 존재 하에서의 Apo hLf N-lobe의 열안정성을 나타낸다. CS-E의 존재 하에서, 전장 hLf, hLf N-lobe의 열안정성이 대폭으로 향상하였다. 이 효과는, hLf, hLf N-lobe의 철의 유무에서 영향받지 않았다.

도 4는, CD 분광 분석에 의한, 각종 글리코사미노글리칸 존재 하에서의 hLfcin1-11(GRRRRSVQWCA)의 2차 구조 해석의 결과를 나타낸다. CS-C, CS-D, CS-E의 존재 하에서, hLfcin1-11의 2차 구조가 변화하였다.

[실시예 2] 염소산 나트륨(NaClO₃) 처리한 PC-3 세포에 대한 철 포화형 인간 락토페린 N-lobe의 활성

2-1. 세포 증식 시험

염소산 나트륨(NaClO₃) (Wako)을 최종 농도 1M이 되도록 초순수에 용해하였다. 조제한 용액은, 0.22μm 시린지 필터를 사용하여, 여과 멸균하였다. 염소산 나트륨 처리는, 세포에 대하여, 그것들이 갖는 당쇄의 황산화를 억제하는 작용이 있다고 보고되어 있다(Hoogewerf들., The Journal of Biological Chemistry, 266, 16564-16571(1991)). 본 평가에서는, N-lobe의 활성에 세포 표면에 있는 당쇄가 관여하는지를 평가하기 위해서 사용하였다.

96웰 플레이트에 젤라틴 코트를 실시하였다. 젤라틴 용액을 파기하고, 1mM 염소산 나트륨 공존 하에서 세포를 5×10³ cells/well로 파종하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다. 컨트롤로서, 염소산 나트륨을 첨가하지 않은 상태에서 파종한 세포를 준비하고, 동일하게 배양하였다. 염소산 나트륨 용액을 최종 농도 1mM이 되도록 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 사용하여 조정하였다. 상청을 파기하고, 시험 배지에 교환하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. Cell Counting kit-8을 10μl/well 첨가하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 2시간 발색시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 450nm의 흡광도를 측정하였다.

96웰 플레이트에 젤라틴 코트를 실시하였다. 젤라틴 용액을 파기하고, 1mM 염소산 나트륨 공존 하에서 세포를 5×10³ cells/well로 파종하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다. 비교 대상으로서, 염소산 나트륨을 첨가하지 않은 상태에서 파종한 세포를 준비하고, 동일하게 배양하였다. 염소산 나트륨을 최종 농도 1mM, N-lobe를 최종 농도 5μM이 되도록 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 사용하여 조정하였다. 염소산 나트륨을 최종 농도 1mM이 되도록 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 사용하여 조정하였다. 또한, N-lobe를 최종 농도 5μM이 되도록 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 사용하여 조정하였다. 컨트롤로서, 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 준비하였다. 배양 상청을 파기하고, 시험 배지를 100μl/well로 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. Cell Counting kit-8을 10μl/well 첨가하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 2시간 발색시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 450nm의 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 1을 초과했을 경우, 희석하여 측정을 행하였다.

도 5는, 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E) 존재 하에서의 염소산(NaClO₃) 처리한 비소세포 폐암 세포주 PC-3의 세포 증식에 대한 hLF N-lobe의 효과를 나타낸다. CS-C, CS-D의 존재 하에서는, hLf N-lobe의 PC-3 세포에 대한 세포 증식 저해의 증강이 보여지고, CS-E에 의한 세포 증식은 N-lobe의 존재에 의해 억제되었다.

2-2. 세포 생존 시험

유리 바닥 디쉬(IWAKI)에 0.1% 젤라틴 코트를 실시하였다. 젤라틴 용액을 파기하고, PC-3 세포를 5×10⁴ cells/dish로 파종하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다. 10μM N-lobe 용액을 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640으로 10μM로 조정하였다. 컨트롤의 0μM으로서, 혈청 함유 배지에 N-lobe 용액을 10μM 첨가했을 때와 동량의 PBS(-)을 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. 1mg/ml PI Solution(도진가가쿠)을 최종 농도 1μg/ml, 4mM Calcein-AM(Thermo scientific)을 최종 농도 400μM이 되도록, RPMI-1640에 용해하여 염색액으로 하였다.

PC-3 세포에 대해서는, 이하의 수순을 밟았다. 상청을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 300μl/dish 첨가하고, 세포를 세정하였다. 세정액을 파기하고, 염색액을 200μl/dish로 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 15분간 배양하고, 그 때는, 차광하면서 배양하였다. 상청을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 300μl/dish로 첨가하고, 세정하였다. PC-3 세포에 대해서는, 이하와 같다. 상청을 1.5ml 튜브에 회수하고, 디쉬에 남은 세포에는, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 300μl/dish로 첨가하였다. 회수한 상청을 200×g, 4℃, 2분간 원심하였다. 상청을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 500μl/tube를 첨가하여 탭핑하였다. 200×g, 4℃, 2분간 원심하였다. 상청을 파기하고, 염색액을 100μl/tube를 첨가하고, 탭핑하였다. 디쉬의 상청을 파기하고, 염색액을 200μl/dish로 첨가하였다. 또한, 튜브에 회수한 세포도 염색액마다 전량을 디쉬로 되돌렸다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 15분간 배양하고, 그 때는, 차광하면서 배양하였다. 상청을 1.5ml 튜브에 회수하고, 디쉬에 남은 세포에는, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 300μl/dish로 첨가하였다. 회수한 상청을 200×g, 4℃, 2분간 원심하였다. 상청을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 1ml/tube를 첨가하여 탭핑하였다. 이 조작을 세정 조작으로 하여 3회 행하였다. 세정액을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 200μl/dish로 첨가하였다. 디쉬의 상청을 파기하고, 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 200μl/dish로 첨가하였다. 또한, 튜브에 회수한 세포의 전량을 디쉬로 되돌렸다. 주사형 공초점 레이저 현미경 FV3000RS를 사용하여 관찰하였다.

도 6(A)는, 염소산(NaCl0₃) 처리한 비소세포 폐암 세포주 PC-3의 세포 증식에 대한 철 포화형(Holo) hLF N-lobe의 효과를 나타낸다. 염소산 처리한 PC-3 세포에 있어서, N-lobe 처리에 의해 생존 세포의 감소 및 사세포의 증가가 관찰되었으므로, 세포 표면에 존재하는 당이 N-lobe의 활성을 감약하고 있다는 것이 시사되었다.

2-3. 콘드로이틴 황산 분해 효소(ChABC) 처리한 PC-3 세포에 대한 철 포화형 인간 락토페린 N-lobe의 활성

PC-3 세포를 5×10³ cells/well로 파종하고, 1UN/ml 콘드로이틴 황산 분해 효소 ChABC(SIGMA)의 공존 하에서, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 24시간 배양하였다. 비교 대상으로서, 1UN/ml ChABC을 첨가하지 않는 상태에서 파종한 세포를 준비하고, 동일하게 배양하였다. 세포를 파종했을 때에는, 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 사용하였다. 5% FBS, 1UN/ml ChABC, 5μM N-lobe를 포함하는 RPMI-1640과 5% FBS, 1UN/ml ChABC를 포함하는 RPMI-1640을 포함하는 RPMI-1640을 조정하였다. 또한, 5% FBS, 5μM N-lobe를 포함하는 RPMI-1640과 5% FBS를 포함하는 RPMI-1640을 조정하였다. 배양 상청을 파기하고, 시험 배지를 100μl/well로 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 3일간 배양하였다. Cell Counting kit-8을 10μl/well 첨가하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 2시간 발색시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm의 흡광도를 측정하였다.

도 6(B)는, 콘드로이틴 황산 분해 효소(ChABC) 처리한 비소세포 폐암 세포주 PC-3의 세포 증식에 대한 철 포화형(Holo) hLF N-lobe의 효과를 나타낸다. ChABC 처리한 PC-3 세포에 있어서, N-lobe에 의한 증식 저해가 보다 증강되었으므로, 세포 표면에 존재하는 CS가 N-lobe의 활성을 감약하고 있다는 것이 확인되었다.

염소산(NaClO₃) 처리만으로는 세포 증식에 특별히 영향은 없었다 (도 6(A)). 한편, 콘드로이틴 황산 분해 효소(ChABC)만의 처리로 PC-3 세포의 세포 증식이 저해되는 것이 나타났다 (도 6(B)). 이것은, ChABC 처리+N-lobe에서의 PC-3 세포의 세포 증식 저해가 증강된 것, 즉, ChABC 처리와 N-lobe의 병용에 의한 적어도 상가작용이 확인된 것을 나타낸다.

[실시예 4] 인간 폐암 세포 PC-14 세포의 CS-E 의존적인 전이에 대한 인간 락토페린 N-lobe의 효과

12웰 플레이트에 PC-14 세포를 4×10⁵ cells/well로 파종하였다. 하룻밤 배양하여 세포 단층을 형성시켰다. 스크래치 가이드를 대면서, 스크래처로 세포 단층에 균일한 흠집을 형성하였다. 혈청을 포함하지 않는 RPMI-1640을 1ml/well로 첨가하고, 세정하였다. 세정 조작을 3회 행하였다. rhLF 용액 혹은 N-lobe 용액을 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640로 5μM으로 조정하고, 37℃로 인큐베이트하였다. 배양 상청을 파기하고, rhLF 용액 혹은 N-lobe 용액 함유 배지를 400μl/well로 첨가하였다. 컨트롤로서, rhLF 용액 및 N-lobe 용액의 첨가량과 동량의 PBS(-)을 첨가한 배지를 400μl/well로 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후의 세포의 상청을 파기하고, 37℃로 따뜻하게 한 4% 포름알데히드 용액을 350μl/well로 첨가하였다. 실온에서 20분간 정치하고, 세포를 고정화하였다. 상청을 파기하고, 37℃로 따뜻하게 한 PBS(-)을 1ml/well 넣고, 실온에서 10분간 정치하였다. 이 조작을 세정 조작으로 하여 3회 행하였다. 세정액을 버리고, 염색액(2% 에탄올을 포함하는 0.2% 크리스탈 바이올렛)을 350μl/well로 첨가하고, 실온에서 15분간 정치하였다. 염색액을 버리고, PBS(-)을 1ml/well로 첨가하고, 실온에서 10분간 정치하였다. 이 조작을 세정 조작으로 하여 4회 행하였다. 염색한 세포를 현미경으로 관찰하였다. 흠집의 거리는 Image J를 사용하여 해석하였다.

도 7은, 인간 폐암 PC-14 세포의 CS-E 의존적인 전이에 대한 hLF N-lobe의 효과를 나타낸다. 스크래치 어세이를 사용한 평가: CS-E 존재 하에서 PC-14 세포는 보다 전이하였다(스크래치의 내측에 존재하는 세포 수로 평가하였다). N-lobe의 첨가에 의해, CS-E 존재 하에서 전이한 세포 수가 감소하였다. 이것은, hLf N-lobe 가 PC-14 세포의 CS-E 의존적인 전이를 저해한 것을 나타낸다.

[실시예 5] PC-12 세포를 사용한 척수 손상 모델에의 효과

5-1. PC-12 세포에서의 CS-E를 사용한 척수 손상 모델

CS 당쇄를 균일 기질로 하여 래트 유래 부신 갈색 세포종 세포주 PC-12에 작용시키고, 그 돌기 길이를 측정하기 위해서, 라미닌과 각종 CS(CS-A, CS-C, CS-D, CS-E의 4종)를 12mm 유리 바닥 디쉬에 코트하였다. NGF 투여 10시간 후, PC-12 세포의 돌기 길이와 돌기 선단 부위에 존재하는 성장 원추의 붕괴 수를 산출하였다.

도 8은, PC-12 세포의 돌기 신장 및 성장 원추에 대한 각종 글리코사미노글리칸(CS-A 내지 E)의 효과를 나타낸다. CS-E 존재 하에서, 축삭 신장이 현저하게 저해되었다.

5-2. CS-E에 의한 돌기 신장을 제어하는 락토페린 N-lobe

라미닌과 CS-E의 혼합액 중에, 동 몰수의 hLf N-lobe를 첨가하고, 첨가 10 시간 후의 PC-12 세포의 돌기 길이와 돌기 선단 부위에 존재하는 성장 원추의 붕괴 수를 산출하였다.

도 9는, 콘드로이틴 황산 E에 의한 PC-12 세포의 돌기 신장 억제 효과는, 인간 락토페린 N-lobe의 투여에서 감약하고, 돌기의 신장을 촉진하는 것을 나타낸다.

[실시예 6] hLF, hLF 구상 도메인 및 hLF 유도체와 콘드로이틴 황산 E(CS-E)와의 결합 평가

중성 아비딘을 코트한 스트립 웰 플레이트(Thermo scientific사)에, 600nM 비오틴화 CS-E(PG 리서치사)를 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켜 CS-E 고정화 플레이트를 제작하였다. CS-E 고정화 플레이트의 각 웰을 PBS(-)로 세정 후, 블로킹 원(나카라이테스크사)으로, 1시간 진탕하여 블로킹을 행하였다. 그 후, 1.5μM의 hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)를 첨가하고, 4 시간 반응시켰다. 1차 항체 반응은, Blocking/Sample Dilution Buffer(Chondrex사)로 10000배 희석한 HRP 표지 항 hLF 항체(Bethyl Laboratories사)를 사용하여 실온에서 1시간 행하였다. 반응 후는 PBS(-)로 세정한 후, 발색 기질액 TMB(나카라이테스크사)를 첨가하고, 실온에서 반응시켰다. 1규정 HCl로 반응을 정지하고, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도를 측정하였다. 경합 실험은, hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)와 동시에, 3μM의 CS-C, CS-E, HP, HSA를 첨가하여 4시간 반응시켰다.

도 11A는, hLF와 sGAG(CS-E, CS-C, HP)와의 결합 결과를 나타낸다. 도 11B는, hLF N-lobe와 sGAG(CS-E, CS-C, HP)와의 결합 결과를 나타낸다. 도 11C는, hLF-CH2-CH3 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)과 sGAG(CS-E, CS-C, HP)과의 결합 결과를 나타낸다. 도 11D는, hLF-HSA 융합 단백질(hLF-HSA)과 sGAG(CS-E, CS-C, HP) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)과의 결합 결과를 나타낸다. 도 11E는, hLF-과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질과 sGAG(CS-E, CS-C, HP)과의 결합 결과를 나타낸다. hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)은, CS-E와 직접 결합하였다(A, B, C, D, E의 (1)과 (2)). 고정화 CS-E에 대하여, hLF, hLF N-lobe 및 hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)와 동시에, 다른 sGAG(CS-E, CS-C, HP) 또는 HSA를 작용시켰더니, CS-E과 HP에서는 경합 저해가 보여졌지만(A, B, C, D, E의 (3)과 (5)), CS-C와 HSA에서는 보이지 않았다(A, B, C, D, E의 (4)와 C의 (6)).

[실시예 7] 닭 배아 척수 후근 신경절 세포를 사용한 척수 손상 모델에의 효과

7-1. CS-E의 축삭 신장 저해에 대한 hLF, hLF 구상 도메인 및 hLF 유도체의 효과

100μg/ml 폴리-D-리신(Sigma-aldrich사)를 도포한 14 mmφ 유리 바닥 디쉬(마쓰나미 유리 고교사)에, 도 12에 나타내는 10μg/ml 라미닌(Gibco사), 10μg/ml CS-E(PG 리서치사), 138nM의 hLF, hLF N-lobe, hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)의 조합을 미리 혼합하고, 37℃에서 1시간 반응한 시료를 디쉬에 도포하였다. 8일령 닭 배아로부터 척수 후근 신경절 세포를 채취하고, 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 37℃에서 18분간 처리하였다. 2% B-27 supplement(Gibco사), 1% 페니실린-스트렙토마이신액(Thermo Fisher Scientific사), 20ng/ml 마우스 NGF2.5S(Alomone labs사)를 함유하는 Neurobasal medium(Thermo Fisher Scientific사)으로 DRG를 현탁하고, 37℃에서 24시간 배양하였다. WraySpect(레이마사)를 사용하여 축삭의 길이를 계측하였다. 종축은, 300개의 DRG의 최장의 축삭 길이를 계측하고, 그 평균을 나타냈다.

도 12A는, CS-E의 축삭 신장 저해 활성에 대한 hLF 및 hLF N-lobe의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 12B는, CS-E의 축삭 신장 저해 활성에 대한 hLF-CH2-CH3의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 12C는, CS-E의 축삭 신장 저해 활성에 대한 hLF-HSA의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 12D는, CS-E의 축삭 신장 저해 활성에 대한 hLF-G-CSF의 억제 작용 결과를 나타낸다.

CS-E에 의한 DRG의 축삭 신장 저해 활성(A, B, C, D의 (1)과 (2))은, hLF (A의 (3), B의 (5), C의 (5), D의 (4)), hLF N-lobe (A의 (4)), hLF-CH2-CH3(B의 (3)), hLF-HSA (C의 (3)), hLF-G-CSF(D의 (3))의 존재 하에서 완전히 억제되어, CS-E를 작용시키지 않은 신경 축삭(A, B, C, D의 (1))의 길이, 혹은 그 이상으로 회복하였다. 융합 단백질(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA)의 컨트롤로서, hLF와 hIgG(B의 (4)), hLF와 HSA(C의 (4))를 각각 첨가한 경우도, CS-E를 작용시키지 않은 신경 축삭(A, B, C의 (1))의 길이까지 회복하였다. 특히 hLF-HSA(C의 (3))와 hLF-G-CSF(D의 (3))에서는, 축삭의 신장이 CS-E를 작용시키지 않은 신경 축삭(C, D의 (1))보다 항진하고, hLF와 HSA를 함께 첨가한 경우(C의 (4))에는 그 효과는 인정되지 않으므로, 융합 단백질로서 조제하는 것의 효과가 나타났다. 또한, CS-E를 작용시키지 않은 신경 축삭(A, B, C, D의 (1))에 대하여, hLF (A의 (5), B의 (8), C의 (8), D의 (6)), hLF N-lobe (A의 (6)), hLF-CH2-CH3(B의 (7)), hLF-HSA (C의 (7)), hLF-G-CSF(D의 (5))를 첨가하여도 축삭의 신장에는 영향을 미치지 않았다.

7-2. CS-E의 성장 원추 붕괴에 대한 hLF 및 hLF 유도체의 효과

100μg/ml 폴리-D-리신을 도포 후, 다시 10μg/ml 라미닌을 도포한 디쉬에, 8일령 닭 배아 척수 후근 신경절(DRG) 세포를 파종하고, 2% B-27 supplement(Gibco사), 1% 페니실린 스트렙토마이신액(Thermo Fisher Scientific사), 20ng/ml 마우스 NGF2.5S(Promega사)를 함유하는 Neurobasal medium(Thermo Fisher Scientific사)의 배양액으로 24시간 배양하였다. 배양액 중에, 10μg/ml CS-E 또는 10μg/ml CS-E 와 138nM의 hLF, hLF N-lobe, hLF 유도체(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA, hLF-G-CSF)를 공존시키고, 30분 후의 성장 원추의 붕괴율을 산출하였다. 종축은, 총 성장 원추 중의 붕괴율을 나타낸다.

도 13A는, CS-E에 의한 성장 원추의 붕괴 활성에 대한 hLF 및 hLF N-lobe의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 13B는, CS-E에 의한 성장 원추의 붕괴 활성에 대한 hLF-CH2-CH3의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 13C는, CS-E에 의한 성장 원추의 붕괴 활성에 대한 hLF-HSA의 억제 작용 결과를 나타낸다. 도 13D는, CS-E에 의한 성장 원추의 붕괴 활성에 대한 hLF-G-CSF의 억제 작용 결과를 나타낸다.

CS-E에 의한 DRG의 성장 원추의 붕괴 활성(A, B, C, D의 (1)과 (2))은, hLF (A의 (3), B의 (5), C의 (5), D의 (4)), hLF N-lobe (A의 (4)), hLF-CH2-CH3(B의 (3)), hLF-HSA (C의 (3)), hLF-G-CSF(D의 (3))의 존재 하에서 완전히 억제되어, CS-E를 작용시키지 않은 신경 세포의 성장 원추 붕괴(A, B, C, D의 (1))와 같은 정도까지 회복하였다. 융합 단백질(hLF-CH2-CH3, hLF-HSA)의 컨트롤로서, hLF와 hIgG(B의 (4)), hLF와 HSA(C의 (4))를 함께 첨가한 경우도, CS-E를 작용시키지 않은 신경 세포의 성장 원추 붕괴(A, B, C의 (1))와 동일한 정도까지 회복하였다. 특히 hLF-HSA(C의 (3))와 hLF-G-CSF(D의 (3))을 첨가한 경우에서는, 성장 원추 붕괴율이 CS-E를 작용시키지 않은 신경 세포(C, D의 (1))보다 낮은 경향을 나타냈다. hLF와 HSA를 각각 첨가한 경우(C의 (4))에는 그 효과는 인정되지 않으므로, 융합 단백질로서 조제하는 것의 효과가 나타났다. 또한, CS-E를 작용시키지 않은 신경 세포(A, B, C, D의 (1))에, hLF(A의 (5), B의 (8), C의 (8), D의 (6)), hLF N-lobe(A의 (6)), hLF-CH2-CH3(B의 (7)), hLF-HSA(C의 (7)), hLF-G-CSF(D 의(5))를 각각 첨가하여도 성장 원추 붕괴에 영향을 미치지 않았다.

본 발명의 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는 글리코사미노글리칸 저해제·촉진제는, 글리코사미노글리칸의 기능에 관련하는 질환 또는 병태의 치료법에, 치료제로서 또는 치료제의 제조에 사용될 수 있다.

<110> NRL Pharma, Inc. <120> Glycosaminoglycan Inhibitor and Augmentor <130> G2086WO <150> JP 2018-121377 <151> 2018-06-26 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 20 25 30 Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 35 40 45 Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 50 55 60 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 65 70 75 80 Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 85 90 95 Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 115 120 125 Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 130 135 140 Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val 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Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 165 170 175 Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 180 185 190 Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 195 200 205 Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 210 215 220 Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 245 250 255 Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 260 265 270 His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 275 280 285 Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 290 295 300 Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320 Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 355 360 365 Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 370 375 380 Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 385 390 395 400 Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 405 410 415 Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430 Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 435 440 445 Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 450 455 460 Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 485 490 495 Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 500 505 510 Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 515 520 525 Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 530 535 540 Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 545 550 555 560 Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 565 570 575 Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 580 585 590 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 595 600 605 Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 610 615 620 Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 625 630 635 640 Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 645 650 655 Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 660 665 670 Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 675 680 685 Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 690 695 700 Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys Asp Pro Asp Ala His Lys Ser Glu Val 705 710 715 720 Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val 725 730 735 Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His 740 745 750 Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala 755 760 765 Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly 770 775 780 Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met 785 790 795 800 Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu 805 810 815 Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu 820 825 830 Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu 835 840 845 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala 850 855 860 Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu 865 870 875 880 Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp 885 890 895 Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys 900 905 910 Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala 915 920 925 Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val 930 935 940 Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His 945 950 955 960 Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr 965 970 975 Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys 980 985 990 Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn 995 1000 1005 Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 1010 1015 1020 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 1025 1030 1035 Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp 1040 1045 1050 Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr 1055 1060 1065 Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr 1070 1075 1080 Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln 1085 1090 1095 Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 1100 1105 1110 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 1115 1120 1125 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu 1130 1135 1140 Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 1145 1150 1155 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 1160 1165 1170 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys 1175 1180 1185 Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 1190 1195 1200 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu 1205 1210 1215 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 1220 1225 1230 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His 1235 1240 1245 Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 1250 1255 1260 Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu 1265 1270 1275 Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln 1280 1285 1290 Ala Ala Leu Gly Leu 1295 <210> 11 <211> 890 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hLF-G-CSF fusion protein <400> 11 Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser 20 25 30 Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys 35 40 45 Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln 50 55 60 Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp 65 70 75 80 Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro 85 90 95 Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110 Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu 115 120 125 Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly 130 135 140 Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly 145 150 155 160 Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser 165 170 175 Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu 180 185 190 Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro 195 200 205 Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly 210 215 220 Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg 245 250 255 Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser 260 265 270 His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp 275 280 285 Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro 290 295 300 Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe 305 310 315 320 Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser 325 330 335 Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg 340 345 350 Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys 355 360 365 Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu 370 375 380 Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys 385 390 395 400 Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly 405 410 415 Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala 420 425 430 Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val 435 440 445 Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser 450 455 460 Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu 485 490 495 Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser 500 505 510 Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile 515 520 525 Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Asn Glu Arg 530 535 540 Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly 545 550 555 560 Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly 565 570 575 Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala 580 585 590 Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser 595 600 605 Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp 610 615 620 Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe 625 630 635 640 Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser 645 650 655 Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg 660 665 670 Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val 675 680 685 Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu 690 695 700 Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys Ser Arg Leu Glu Ala Thr Pro Leu Gly 705 710 715 720 Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln 725 730 735 Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys 740 745 750 Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His 755 760 765 Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala 770 775 780 Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu 785 790 795 800 Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly 805 810 815 Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr 820 825 830 Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro 835 840 845 Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala 850 855 860 Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser 865 870 875 880 Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 885 890

Claims (19)

1. 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는 글리코사미노글리칸의 저해제 또는 촉진제.
2. 제1항에 있어서, 상기 락토페린이, 철 유리형(Apo) 또는 철 포화형(Holo)의 락토페린인, 저해제 또는 촉진제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락토페린은 인간 유래의 것인, 저해제 또는 촉진제.
4. 제1항에 있어서, 상기 락토페린이, 이하의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드인, 저해제 또는 촉진제:
   (a) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
   (b) 락토페린의 N-lobe를 포함하는 단백질;
   (c) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 70개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;
   (d) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;
   (e) GRRRRSVQWCA(서열번호 7)의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토페린의 유도체가, 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)(서열번호 9), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA)(서열번호 10) 또는 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF)(서열번호 11)인, 저해제, 촉진제.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸이, 콘드로이틴 황산-A(CS-A), 콘드로이틴 황산-B(CS-B), 콘드로이틴 황산-C(CS-C), 콘드로이틴 황산-D(CS-D), 콘드로이틴 황산-E(CS-E), 헤파린(HP) 및 헤파란 황산(HS) 및 케라탄 황산(KS)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인, 저해제, 촉진제.
7. 제6항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸이 콘드로이틴 황산-C(CS-C), 콘드로이틴 황산-D(CS-D) 또는 콘드로이틴 황산-E(CS-E)인, 저해제, 촉진제.
8. 제6항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸이 CS-E인, 저해제, 촉진제.
9. 락토페린 또는 그의 유도체를 함유하는, 글리코사미노글리칸에 관련하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 락토페린이 철 유리형(Apo) 또는 철 포화형(Holo)의 락토페린이며, 0.001 내지 10g/kg/일의 양이 되도록 조제되어 있는, 의약 조성물.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 락토페린은 인간 유래의 것인, 의약 조성물.
12. 제9항에 있어서, 상기 락토페린이, 이하의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질 또는 펩티드인, 의약 조성물:
    (a) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 락토페린의 N-lobe를 포함하는 단백질;
    (c) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 70개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 글리코사미노글리칸의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;
    (d) 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 콘드로이틴 황산의 발현 또는 기능을 저해 또는 촉진하는 활성을 갖는 단백질;
    (e) GRRRRSVQWCA(서열번호 7)의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토페린의 유도체가, 힌지 결실 인간 락토페린/인간 IgG Fc 융합 단백질(hLF-CH2-CH3)(서열번호 9), 인간 락토페린/인간 혈청 알부민 융합 단백질(hLF-HSA)(서열번호 10) 또는 인간 락토페린-인간 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 융합 단백질(hLF-G-CSF)(서열번호 11)인, 의약 조성물.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸이, 콘드로이틴 황산-C(CSC), 콘드로이틴 황산-D(CS-D) 또는 콘드로이틴 황산-E(CS-E)인, 의약 조성물.
15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 콘드로이틴 황산 분해 효소와 병용하기 위한, 의약 조성물.
16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은, 척수 손상, 암 전이, 암, 당뇨병, 염증, 동맥 경화, 섬유화, 급성 호흡기 질환, 알츠하이머병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 의약 조성물.
17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 식품의 형태인, 의약 조성물.
18. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 주사제의 형태인, 의약 조성물.
19. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여되는 것인, 의약 조성물.

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