KR20210024006A - 면역 세포 조작을 위한 안정화된 mhc 분자가 있는 스캐폴드 - Google Patents

면역 세포 조작을 위한 안정화된 mhc 분자가 있는 스캐폴드 Download PDF

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KR20210024006A
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신 레커 하드루프
쇠렌 뉘보에 자콥센
수닐 쿠마르 사이니
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Abstract

본 발명은 종양 퇴행 또는 바이러스 제거를 매개하기위해 이상적인 표현형 및 기능적 특성을 얻기 위해 세포에 특정 기능적 자극을 제공하는 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell, aAPC) 스캐폴드에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 스캐폴드는 항원성 펩티드가 없는 안정화된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다. 상기 스캐폴드는 필요에 따라 항원성 펩티드를 로드 할 수 있으며, 펩티드-MHC-지향 방식으로 특정 T 세포의 효과적인 확장 및 기능적 자극을 위한 민첩한 플랫폼을 제공한다.

Description

면역 세포 조작을 위한 안정화된 MHC 분자가 있는 스캐폴드
본 발명은 종양 퇴행 또는 바이러스 제거를 매개하는데 이상적인 표현형 및 기능적 특성을 얻기 위해 특정 기능적 자극을 제공하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 스캐폴드는 항원성 펩티드가 없는 안정화된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다. 스캐폴드는 필요에 따라 항원성 펩티드를 로드 할 수 있으며, 펩티드-MHC-직접적인 방식으로 특정 T 세포의 효과적인 확장 및 기능적 자극을 위한 민첩한 플랫폼을 제공한다.
말초혈액 (peripheral blood, PBMC) 또는 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocytes, TILs)의 종양-반응성 T 세포를 환자로부터 추출하고 생체 외에서 활성화 및 확장하여 다시 환자에게 제공하는 치료 접근법 입양 세포 전달 (adoptive cell transfer, ACT)은 악성 흑색 종 연구에서 50% 이상의 환자에서 임상적 지속성 반응을 나타내었다. 그러나, PBMC 또는 TILs로부터의 종양 반응성 T 세포의 확장은 종종 T 세포 분화 및 기능적 용량의 대가로 광범위한 생체 외 배양을 필요로 한다. 결과적으로, 전달된 T 세포 제품은 종양 퇴행을 매개할 수 있는 적절한 표현형 및 기능적 특성을 가진 종양 반응성 CD8 T 세포의 충분한 빈도를 포함하지 않을 수 있다. 더욱이, 이러한 종양 침윤 T 세포의 대부분은 종양 특이적이 아니라 T 세포 수용체 (T cell receptor, TCR)인식이 종양 항원과 일치하지 않는 주변에서 T 세포의 방관자 (bystander) 침투일 수 있다. 마지막으로, 종양 반응성 T 세포의 분획은 종양 부위에 존재하는 억제 환경으로 인해 감소된 성장 잠재력을 가질 수 있다.
확장된 T 세포의 불충분한 분화 및 기능적 능력의 문제를 극복하기 위해 인공 항원 제시 세포 (antigen presenting cells, aAPC)를 활용하려는 시도가 있었다. 인공 항원 제시 세포의 이면에 있는 간단한 개념은 주요 조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에 의해 제시된 TCR과 특정 항원성 펩티드 간의 자연적인 상호 작용을 모방한다는 것이다. 이 상호 작용은 효율적인 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 T 세포의 활성화, 확장 및 분화를 통한 면역 생성의 핵심 단계이다. T 세포 반응의 자연적 생성은 T 세포 활성화 및 기능을 유도하는 역할을 하는 사이토 카인 및 공동 자극 분자와 같은 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)에 의해 추가로 지원된다. 따라서, 필요한 모든 분자를 단일 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 통합하는 것은 T 세포 확장의 일부 챌린지 (challenge)를 극복할 수 있는 유망한 도구이다. 인공 항원 제시 세포는 T 세포 활성화 및 분화를 위한 이상적인 면역학적 시냅스를 형성한다. 그러나, 중요한 챌린지 (challenge)는 기능적 표현형을 유지하면서 인공 항원 제시 세포가 추출된 TILs을 효율적으로 확장할 수 있도록 하는 분자 조합의 발견이다.
WO2002072631에는 MHC 플랫폼을 이용하는 많은 개념이 개시되어 있으며, 그중 하나는 하나 이상의 MHC 분자에 부착된 담체 분자를 포함하는 MHC 구축물이다. 상기 구축물은 또한 공동-자극 분자 또는 세포 조절 분자와 같은 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있다. MHC 구축물은 무엇보다도 구축물을 인식하는 세포의 확장에 사용되며 암 및 기타 질환과 같은 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 조성물을 생성하는데 사용되는 것으로 예상된다.
WO2002072631은 T 세포 확장에 적합할 수 있는 많은 공동 자극 분자 및 사이토 카인을 개시하지만, T 세포의 확장 목적에 특히 적합하고 효과적인 임의의 특정 조합을 확인하지 못한다.
US 2011/318380은 암 백신 및 면역 모니터링을 위한 WO2002072631에 기재된 MHC 구축물의 적용을 개시한다. 하지만, US 2011/318380은 T 세포의 확장 목적에 특히 적합하고 효과적인 공동 자극 분자 및 사이토 카인의 특정 조합을 예시하지 않는다.
WO2009003492는 주로 항원 특이적 T 세포의 검출에 초점을 맞추고 있지만, 또한 항원 특이적 T 세포의 확장을 개시하고 있다. 여기에는 복합 펩티드가 있거나없는 MHC 다량체, 이의 제조 방법 및 바람직하지 않은 표적 T 세포의 불활성화 또는 제거가 가능한 항원 특이적 T 세포의 분리를 포함하여 분석 및 치료에 사용하는 방법이 설명되어 있다. WO2009003492에 따른 MHC 멀티머 (multimers)는 덱스트란 스캐폴드 (dextran scaffold) 및 공동 자극 및 세포 조절 분자를 포함할 수 있다. 하지만, 상기 개시 내용은 T 세포의 확장의 목적에 특히 효과적인 분자의 특정 조합을 정확히 지적하지 못한다.
WO2009094273에는 항원 특이적 T 세포를 확장하기 위해 사용하기 위한 나노 입자, 사이토 카인, 커플링 제, T 세포 수용체 활성화제 및 공동 자극 분자를 포함하는 인공 항원 제시 세포 조성물이 개시되어 있다. 상기 T 세포 수용체 활성화제는 항원성 펩티드에 결합된 MHC 분자일 수 있다. 게다가, 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)에서 확장된 T 세포의 사용이 설명된다. 그러나, 인공 항원 제시 세포, 즉 IL-2에 대한 단일 사이토 카인의 적합성 만이 탐구되고 단지 외인성 사이토 카인 (exogenous cytokine)과 비교할 때만 조사된다.
따라서, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 이전 공개에 대한 공통점은 대체로 일반적인 방식으로만 개념을 설명한다는 것이다. T 세포 확장의 성공 기준, 예컨대 높은 활성 T 세포 비율, T 세포의 높은 항원 특이성 및 T 세포의 높은 기능성은 자극 분자의 특정 조합이 결합될 때만 충족되고, 잘 정의되고 효과적인 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 많이 필요하다. 단지 T 세포 확장에 대한 세 가지 성공 기준이 모두 충족된 때에만 생성된 T 세포 집단은 항 종양 또는 항 바이러스 기능을 적용하기 위해 최적으로 준비될 것이다.
알려진 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 다른 한계는 비효율적이고 유연하지 않은 생산이며, 이는 새로운 면역 요법의 개발을 가속화하기 위한 고-처리량 플랫폼에 대한 수요와 일치하지 않는다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 준비의 주요 병목 현상 (bottleneck)은 항원성 펩티드 제시를 위한 MHC 분자의 요구 사항에 기인한다. 간단히 말해서, MCH 분자의 리폴딩 과정은 중쇄가 β2-마이크로글로불린 (β2-microglobulin, B2M) 및 항원성 펩티드가 없는 상태에서 원래 상태로 접힐 수 없다는 사실로 인해 복잡하다. 따라서, 빈 MHC 클래스 I 분자는 매우 불안정하고 응집되기 쉽다. 따라서 T 세포 자극에 필요한 모든 펩티드-MHC 조합에는 독립적인 생산라인이 필요하다. 이는 항원 펩티드의 환경이 매우 넓고, 환자 당 HLA 분자당 효율적으로 제시되는 20,000 개의 펩티드와 MHC 클래스 I 분자가 12,000 개 이상의 알려진 MHC 클래스 I 분자가 존재하는 매우 다양하기 때문에 문제가 된다. 더욱이, 주어진 맥락에서 관련된 항원성 펩티드의 선택은 관심 질환, 환자의 MHC 프로파일 및 이용가능한 T 세포 레퍼토리에 따라 달라진다. 따라서, 현재 하나의 항원 펩티드 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드만을 생성할 수 있는 생산 라인은 거대한 항원 펩티드 다양성을 준수하는 것이 사실상 불가능하며, 기존의 개별화된 인공 항원 제시 세포 생산 기술을 활용하여 가능한 항원 펩티드 및 MHC 분자 조합의 광범위한 배열을 포괄해야 한다.
재조합 MHC 클래스 I 분자는 예컨대 불용성 봉입체를 형성하는 박테리아에서 생성된다. 이전에, 이러한 봉입체는 카오트로픽 (chaotropic) 제제의 용액에서 변성된 다음 특정 관심 항원 펩티드의 존재 하에 카오트로픽 제제를 제거 (예를 들어, 재생 및 재접힘)하여 pMHC 복합체를 형성한다. 상기 pMHC 복합체는 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 펼쳐진 단백질로부터 정제된다. 이것은 한 가지 유형의 pMHC만 생성하기는 힘들고 비효율적인 기술이다.
MHC 분자의 비효율적인 생산은 중간 펩티드를 가진 MHC 분자의 생산에 의해 해결되었으며, MHC 분자의 재접힘 후에 관심 항원 펩티드로 대체되었다. 이 기술은 MHC 펩티드 교환으로 알려져 있다. 하지만, 교환율은 100%가 아니며 교환 가능한 펩티드의 손실은 새로운 펩티드 결합에 사용할 수 없는 MHC 분자의 상당한 손실 (최대 50%)로 이어질 수 있다. 게다가, 이 생산 방법은 시간이 많이 걸리며 일반적으로 MHC 단량체 단계에서 펩티드 교환이 발생하여 더 큰 스캐폴드와 함께 사용하기에는 이 기술이 적합하지 않다. 상기 언급한 한계는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 어셈블리에 대한 화학량론 (stoichiometry)에 대한 제어 부족과 제자리에 있는 pMHC 분자에 따라 가변 제품 안정성과 관련된 문제를 제공한다.
pMHC를 포함하는 현재 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 기술의 또 다른 한계는 항원성 펩티드 의존적 수명을 갖는 것으로 알려진 주요 조직 적합성 복합체의 내재적 불안정성이다. pMHC의 불안정성은 pMHC가 완전히 기능적으로 유지되는 창을 제한하므로 기능적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하는데 유용하다. 또한 pMHC 복합체의 불안정성은 조립된 인공 항원 제시 세포 복합체가 완전한 기능을 유지하고 CD8 T 세포를 효율적으로 항원 특이적으로 자극할 수 있는 시간을 제한한다.
US 9,494,588에서는 단일 생산 라인에서 항원 특이적 MHC 클래스 I 분자를 생산하기위한 편리한 방법으로 MHC 클래스 I 분자의 폴딩 후 항원성 펩티드를 로딩 할 수 있는 빈 MHC 클래스 I 분자의 제공이 제안되었다. 하지만, 이 방법론이 대형 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 함께 사용할 수 있는지 여부는 순전히 추측이며 공개되지 않았다. 예컨대 wt MHC 분자와 유사한 항원 특이 적 상호 작용 특성을 가진 T 세포와 상호 작용하는 능력은 입증되지 않았다. 게다가, 도입된 돌연변이가 TCR-pMHC 상호 작용에 구조적으로 영향을 미칠 수 있는지 여부는 불분명하다. 마찬가지로, 이 수정된 상호 작용의 기능은 설명되지 않았다.
따라서, 높은 처리량 설정을 위한 개선된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 유리할 것이다. 특히, T 세포 집단을 확장하고 자극하여 높은 비율의 활성 T 세포를 산출하기 위해 사전에 생산되고 필요에 따라 항원성 펩티드를 로딩 할 수 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 제공, T 세포의 높은 항원 특이성과 T 세포의 높은 기능성이 유리할 것이다.
WO2002072631 WO2009003492 WO2009094273 US2011/318380 US 9,494,588
따라서, 본 발명의 목적은 말초 혈액 (PBMC) 또는 종양 침윤 림프구 (TILs)로부터 추출된 종양 반응성 T 세포의 확장 능력이 개선된 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드의 제공에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상이한 항원성 펩티드를 제시하는 개선된 인공 항원 제시 세포의 큰 라이브러리를 생성하기위한 보다 사용자 친화적이고 고처리량 플랫폼을 제공하는 것이다.
또한, 품질 보증 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 대량 생산은 품질 보증에 대한 규제 당국의 증가하는 요구 사항에 더 잘 부합할 것이다. 여기서 우리는 최종 사용자의 사이트에서 항원성 펩티드 로딩에 사용할 수 있는 품질 관리 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 하나의 큰 배치와 함께 생산 문제를 위한 '기성품'솔루션을 제공할 수 있다. 이것은 암 특이적 펩티드 항원을 예측하기 위해 종양 돌연변이를 식별하기 위해 환자 종양이 시퀀싱되는 고도로 개인화된 면역 치료 프로토콜의 증가에 대한 이상적인 솔루션이 될 것이다. 이러한 항원성 펩티드는 기성품 항원성 펩티드 수용 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 직접 로드되는 것으로 예상할 수 있다.
특히, 본 발명의 목적은 확장된 T 세포 집단의 T 세포 분화 및 기능적 능력이 불충분하다는 종래 기술의 상기 언급된 문제점을 해결하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 최적화된 표현형 및 기능적 특성을 갖는 수득 된 확장된 T 세포 집단을 이용하여 종양 퇴행 또는 바이러스 제거를 매개하는 것이다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 다음 주형 분자가 부착된 고분자 백본을 포함하는 인공항원제시 세포 (aAPC) 스캐폴드에 관한 것이다:
i. 적어도 1개의 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule), 및
ii. 적어도 1개의 MHC 클래스 I 분자 (MHC class I molecule),
MHC 클래스 I 분자는 이황화 가교 (disulfide bridge)에 의해 연결된 알파-1 도메인 (alpha-1 domain) 및 알파-2 도메인 (alpha-2 domain)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 다른 일 측면은 다음 단계를 포함하는 T 세포의 동시 시험관 내 자극 및 확장 방법에 관한 것이다:
i. T 세포를 포함하는 샘플 제공 단계,
ii. 샘플을 본 발명에 따른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 확장 용액과 접촉시키는 단계,
iii. 배양으로 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 특이성을 갖는 T 세포를 자극 및 확장하는 단계, 및
iv. 단계 iii)의 T 세포를 배양으로부터 획득하여 T 세포의 확장된 항원 특이적 집단을 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 약제로서 사용하기 위해 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 암 또는 바이러스 병태의 치료에 사용하기 위해 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 측면은 다음을 포함하는 T 세포 확장용 키트를 제공하는 것이다:
i. 본 발명에 따른 적어도 1개의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 제1 저장 수단, 및
ii. 적어도 1개의 항원성 펩티드를 포함하는 제2 저장 수단으로서, 제 1 저장 수단 및 제2 저장 수단의 내용물은 조합되도록 구성된다.
정의
본 발명을 더 자세히 논의하기 전에, 다음 용어 및 관례 (conventions)가 먼저 정의될 것이다:
인공 항원 제시 세포 (Artificial antigen presenting cell, aAPC) 스캐폴드
본 맥락에서, 용어 "인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드"는 항원 제시 세포와 유사하게 기능하기 위해 본 발명에 정의된 필요한 분자의 어셈블리를 의미한다.
고분자 백본 (polymeric backbone)
본 맥락에서, 용어 "고분자 백본"은 개별 주형 분자가 고정되는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 일부를 의미한다. 주형 분자는 고분자 백본 상에 또는 그 통합 부분으로서 위치하는 커플링 제와 주형 분자에 배치된 친화성 태그 사이의 상호 작용에 의해 부착된다. 대안적으로, 커플링 제는 주형 분자상에 있을 수 있으며, 상응하는 친화성 태그는 고분자 백본 상에 있다.
고분자 백본은 다당류 (polysaccharides), 비닐 고분자 (vinyl polymers), 폴리 에틸렌 글리콜 (poly ethylene glycol), 폴리 프로필렌 글리콜 (poly propylene glycol), 스트렙-탁틴 (strep-tactin), 폴리-스트렙타비딘 (poly-streptavidin), 비오틴 결합 단백질 (biotin-binding proteins) 및 폴리 히스티딘 결합 고분자로부터 선택된 물질 일 수 있다.
주형 분자 (Template molecules)
본 맥락에서, 용어 "주형 분자"는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본상에 부착된 임의의 분자를 지칭한다. 이들은 MHC 클래스 I 분자, 사이토 카인 및 공동-자극 분자와 같은 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecules) 및 CD47에서 선택될 수 있다. 주형 분자는 친화성 태그 (affinity tag)를 포함한다.
일 양태에서, 주형 분자는 고분자 골격이 아닌 고체 지지체에 직접 부착될 수 있다.
T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)
본 맥락에서, 용어 "T 세포에 영향을 미치는 분자"는 T 세포에 생물학적 효과를 갖는 임의의 분자를 지칭한다. 생물학적 효과는 T 세포의 증식, 분화 및 자극을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, T 세포에 영향을 미치는 분자는 원하는 높은 특이성, 높은 사멸 능력, 높은 생체 내 확장 및 생존 특성을 가져오는 분화를 얻기 위해 T 세포 집단을 확장하고 기능적으로 조작하는 데 활용될 수 있다. T 세포에 영향을 미치는 분자는 사이토 카인, 공동 자극 분자 및 접착 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 T 세포에 영향을 미치는 적어도 1개의 상이한 유형의 분자, 예컨대 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 상이한 유형의 T 세포에 영향을 미치는 분자를 포함할 수 있다.
또한, 각 인공 항원 제시 세포에 위치하는 T 세포에 영향을 미치는 분자의 수는 하나일 수 있으며, 인공 항원 제시 세포의 설계에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 상의 T 세포에 영향을 미치는 분자의 수는 1 내지 100, 예컨대 1 내지 50, 예컨대 1 내지 24, 예컨대 1 내지 20, 예컨대 1 내지 15, 예컨대 1 내지 10, 또는 예컨대 1 내지 5일 수 있다.
돌연변이 시스테인 잔기 (Mutant cysteine residue)
본 맥락에서, 용어 "돌연변이 시스테인 잔기"는 MHC 클래스 I 분자의 중쇄에 인위적으로 도입된 시스테인 잔기를 의미한다. 따라서, 돌연변이 시스테인 잔기는 상응하는 야생형 MHC 클래스 I 분자의 중쇄에 존재하지 않는다.
돌연변이 시스테인 잔기는 당업자에게 공지된 돌연변이 유발 기술, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다.
비-공유 상호 작용 (Non-covalent interaction)
본 맥락에서, 용어 "비-공유 상호 작용"은 공유 결합 이외의 다른 상호 작용을 통한 결합을 의미한다. 비공유 결합은 예를 들어, 소수성 상호 작용, 친수성 상호 작용, 이온 상호 작용, 반데르 벽력 (van der walls forces), 수소 결합 및 이들의 조합으로 형성될 수 있다.
커플링 제 (Coupling agent)
본 맥락에서, 용어 "커플링 제"는 인공 항원 제시 세포의 고분자 백본 상에 위치하는 분자 실체를 지칭한다. 커플링 제는 친화성 태그에 비공유적으로 결합될 수 있다. 커플 링 제의 예로는 스트렙타비딘 (streptavidin), 아비딘 (avidin), 스트렙-탁틴 (strep-tactin), 항체, 폴리 히스-태그 (poly His-tags), 금속 이온 킬레이트 (metal ion chelates) 등이 있다.
대안적으로, 커플링 제는 주형 분자상에 있을 수 있으며, 상응하는 친화성 태그는 고분자 백본 상에 있다.
친화성 태그 (affinity tag)
본 맥락에서, 용어 "친화성 태그"는 주형 분자에 위치한 분자 종을 의미한다. 친화성 태그는 비공유-상호 작용에 의해 결합제에 매우 특이적으로 결합한다. 커플링 제의 예로는 비오틴, 항체 에피토프, 히스-태그, 스트렙타비딘, 스트렙-탁틴, 폴리히스티딘, 펩티드, 금속 이온 킬레이트 등이 있다.
대안적으로, 친화성 태그는 고분자 백본에 있을 수 있으며, 상응하는 커플 링제는 주형 분자의 백본에 있다.
항원 펩티드 (Antigenic peptide)
본 맥락에서, 용어 "항원 펩티드"는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합하여 펩티드-MHC (pMHC) 복합체를 형성할 수 있는 펩티드를 지칭한다. pMHC 복합체는 항원성 펩티드를 면역세포에 제공하여 T 세포 수용체 의존성 면역 반응을 유도할 수 있다.
MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 일 수 있다.
MHC
본 맥락에서, 용어 "MHC"는 주요 기능이 병원체로부터 유래된 항원성 펩티드를 결합하고 적절한 T 세포에 의한 인식을 위해 세포 표면에 표시하는 단백질 복합체인 주요 조직 적합성 복합체를 지칭한다.
MHC 분자에는 MHC 클래스 I 분자 (MHC class I molecules)와 MHC 클래스 II 분자 (MHC class II molecules)의 두 가지 주요 클래스가 있다. 여기서, “”는 MHC 클래스 I 분자를 의미한다. MHC 클래스 I 분자는 MHC 유전자에 의해 생성된 알파 사슬 (중쇄)과 β2-마이크로 글로불린 유전자에 의해 생성된 베타 사슬 (경쇄 또는 β2-마이크로 글루불린)으로 구성된다.
중쇄는 각각 알파-1, 알파-2 및 알파-3으로 표시된 3 개의 도메인으로 구성된다. 알파-1 도메인은 비공유 결합 β2-마이크로 글루불린 옆에 위치한다. 알파-3 도메인은 MHC 클래스 I 분자를 세포막에 고정시키는 막 통과 도메인이다. 함께, 알파-1 및 알파-2 도메인은 특정 항원성 펩티드에 결합하는 펩티드 결합 홈을 포함하는 이종 이량체 (heterodimer)를 형성한다. 펩티드 결합 홈의 아미노산 서열은 특정 항원성 펩티드가 MHC 클래스 I 분자에 결합되는지를 결정하는 요소이다.
당연히, MHC 클래스 I 분자의 중쇄는 4개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하여 2개의 이황화 가교를 형성한다. MHC 클래스 I 분자의 올바르게 접힌 형태에서, 하나의 이황화 가교는 Cys101과 Cys164 사이의 알파-2 도메인 내부에 위치하며, 다른 이황화 가교는 Cys203과 Cys259 사이의 알파-3 도메인 내부에 위치하며, 아미노산 번호는 신호 펩티드가 없는 HLA-A를 참조한다.
본 발명에 있어서, 추가 이황화 가교는 2개의 시스테인 잔기의 재조합 도입에 의해 알파-1 도메인과 알파-2 도메인 사이에 도입된다. 바람직하게는, 2개의 돌연변이 된 시스테인은 알파-1 도메인의 시스테인 잔기와 알파-2 도메인의 시스테인 잔기 사이의 공간 거리가 2 내지 10 옹스트롬 (angstrom) 인 중쇄의 위치에 도입된다.
MHC 분자는 비어있거나 항원성 펩티드에 결합될 수 있다. 따라서, 본 맥락에서 항원성 펩티드가 없는 MHC 분자 (예를 들어, 빈 MHC 분자)와 결합된 항원성 펩티드를 갖는 MHC 분자를 지칭하는 pMHC 분자는 차이가 있다.
본 맥락에서, 용어 "로딩 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드", "항원 펩티드 수용 인공 항원 제시 세포 스캐폴드" 및 "빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드"는 항원성 펩티드가 없는 MHC 분자를 갖는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
인간에서, MHC 복합체는 인간 백혈구 항원 (HLA) 유전자 복합체에 의해 암호화된다. 따라서, 본 맥락에서, 용어 "MHC"는 또한 "HLA"를 포함한다. HLA의 세가지 주요 유형이 존재하며 본 맥락에서, MHC는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대한 유전자 좌위에 코딩 된 HLA 대립 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 유사하게, MHC는 HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, MIC A, MIC B, CD1d, ULBP-1, ULBP-2와 및 ULBP-3 같은 MHC 클래스 I- 유사 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
pMHC
본 맥락에서, 용어 "pMHC"는 항원성 펩티드에 결합된 상기 정의된 MHC 분자를 의미한다. 따라서, pMHC라는 용어는 항원성 펩티드가 로드 된 MHC 클래스 I 분자를 의미한다.
사이토 카인 (Cytokine)
본 맥락에서 용어 "사이토 카인"은 자극된 T 세포의 확장, 생존 및 효과기 기능에 영향을 미치는 면역 조절 분자를 의미한다. 사이토 카인에는 케모카인 (chemokines), 인터페론 (interferons), 인터루킨 (interleukins), 림포카인 (lymphokines) 및 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factors)가 포함된다.
인터루킨의 예는 IL-21, IL-2, IL-15, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17, IL-22 및 IL- 23을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사이토 카인은 또한 하나 이상의 인터루킨에 상응하는 T 세포 자극 및 활성화를 유도하는 인터루킨의 변이체 또는 모방체를 포함한다. 인터루킨의 변이 또는 모방체는 천연 사이토 카인의 결합 부위를 포함할 수 있지만 단백질의 나머지 부분에서 다양하다. 따라서, 인터루킨의 변이체 또는 모방체는 IL-2, IL-15 및 IL-21의 변이체 또는 IL-2/IL-15와 같은 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
사이토 카인 그룹에 포함된 특정 인터루킨 변이체 또는 모방체를 네오루킨-2/15 (Neoleukin-2/15)라고 한다. Neoleukin-2/15 (Neo-2/15)는 매우 안정적이고 IL-2Rβγc에 강하게 결합하지만 CD25에는 결합하지 않는 디자이너 사이토 카인이다.
감마 사슬 수용체 사이토 카인 (Gamma-chain receptor cytokines)
본 맥락에서, 용어 "감마 사슬 수용체 사이토 카인"은 공통 감마 사슬 서브 유닛을 포함하는 상응하는 사이토 카인 수용체에 결합하는 사이토 카인 그룹을 의미한다. 일반적인 감마 사슬 (γc) 수용체는 CD132 또는 인터루킨-2 수용체 서브 유닛 감마 (IL-2RG)라고도 한다. 감마 사슬 수용체 사이토 카인의 공통 분모 중 하나는 이들이 모두 공유 감마 사슬 수용체를 통해 세포 내 신호를 전달하고 T 세포 활성화 및 분화에 영향을 미친다는 것이다.
γc당 단백질은 세포 외, 막 통과 및 세포 내 도메인을 포함하고 일반적으로 림프구에서 발현되는 막 통과 단백질이다. γc 서브 유닛은 적어도 6개의 상이한 사이토 카인 수용체, 즉 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 수용체의 수용체 복합체의 일부이다. 따라서, 감마 사슬 수용체 사이토 카인 그룹은 적어도 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함한다. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 또한 하나 이상의 인터루킨에 상응하는 T 세포 자극 및 활성화를 유도하는 감마 사슬 수용체 사이토 카인의 변이체 또는 모방체, 예컨대 IL-2, IL-15 및 IL-21의 변이체, 또는 이들의 조합, 예를 들어, IL-2/IL-15를 포함한다.
공동 자극 분자 (Co-stimulatory molecule)
본 맥락에서, 용어 “공동 자극 분자”는 T 세포와의 상호 작용 시 T 세포 반응, 증식, 생산 및/또는 사이토 카인 분비를 향상시키고 분화를 자극 및 T 세포의 이펙터 기능 또는 보조 자극 분자와 접촉하지 않은 T 세포에 비해 T 세포의 생존을 촉진하는 분자를 의미한다. 공동 자극 분자의 예는 B7.1, B7.2, ICOS, PD-L1, α- 갈락토실세라마이드 (a-galactosylceramide), CD3, CD4, CD5, CD8, CD9, CD27, CD28, CD30, CD69, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD147, CDw150 (SLAM), CD152 (CTLA-4), CD153 (CD30L), CD40L (CD154), Fas (CD95), CD40, CD48, CD70, 및 CD72를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
접착 분자 (Adhesion molecule)
본 맥락에서, 용어 “접착 분자”는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 T 세포 사이의 접착을 유도하는 분자를 의미한다. 접착 분자는 ICAM-1, ICAM-2, GlyCAM-1, CD34, 안티-LFA-1, 안티-LFA-2 (CD2), LFA-3 (CD58), 안티-CD44, 안티-베타-7, CXCR4, CCR5, 안티-셀렉틴 L, 안티-셀렉틴 E 및 안티-셀렉틴 P을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
에피토프 (Epitope)
본 맥락에서, 용어 “에피토프”는 T 세포의 TCR에 의해 인식되는 항원 결정기를 의미한다. pMHC에 의해 제시된 에피토프는 모든 이물질에 대해 매우 특이적이며, TCR과의 상호 작용은 펩티드-MHC 지향 방식으로 특정 T 세포의 효과적인 확장 및 기능적 자극을 보장한다.
고체 지지체 (Solid support)
본 맥락에서, 용어 “고체 지지체”는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 부착될 수 있는 임의의 유형의 불용성 물질을 지칭한다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 고체 지지체에 공유 또는 가역적으로 부착될 수 있다. 고체 지지체에 부착된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 과잉 시약 또는 용매에서 쉽게 분리될 수 있다 (예를 들어, 여과, 크로마토 그래피, 원심 분리 등). 고체 지지체에는 비드, 웰 플레이트, 입자, 필터, 젤, 튜브 및 페트리 접시를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 주형 분자, 즉 분자 및 MHC 클래스 I 분자에 영향을 미치는 T 세포는 고체 지지체에 직접 부착될 수 있다.
샘플(Sample)
본 맥락에서, 용어 “샘플”은 대상체로부터 추출된 용액을 지칭하며, 용액은 T 세포 집단을 포함한다. 샘플은 특정 출처 (source)에 국한되지 않지만, 예를 들어, 혈액, 조직 또는 체액에서 추출할 수 있다. T 세포 집단은 다른 특이성을 가진 T 세포를 포함할 수 있다.
확장 용액 (Expansion solution)
본 맥락에서, 용어 “확장 용액”은 인공 항원 제시 세포에 대한 특이성을 갖는 T 세포의 확장에 사용하기 위한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 용액을 지칭한다. 확장 용액은 T 세포의 확장, 분화 및 자극을 지원하는 다른 실체를 추가로 포함할 수 있다. 확장 용액은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 고정된 것 이외의 추가 사이토 카인, 공동 자극 분자 또는 접착 분자를 포함할 수 있다.
임상 관련 수 (Clinically relevant number)
본 맥락에서, 용어 “임상 관련 수”는 질병과 싸우는데 필요한 세포의 수를 의미한다. 임상 관련 세포 수의 절대 값은 질병에 따라 다르다. 환자에게 재도입하기 전에 이용 가능한 세포의 수는 투여 당 105-1012 세포, 예컨대 투여 당 105-1010 세포, 예컨대 투여 당 106-109 세포의 범위 일 수 있다.
약제학적 조성물 (Pharmaceutical composition)
본 맥락에서, 용어 “약제학적 조성물”은 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 및/또는 약제학적 허용되는 담체에 현탁된, 본 발명에 따라 수득 된 확장된 T 세포 집단을 포함하는 조성물을 지칭한다.
약제학적으로 허용되는 (Pharmaceutically acceptable)
본 맥락에서, 용어 “약제학적으로 허용되는”은 생리학적으로 견딜 수 있고 인간에게 투여될 때 일반적으로 알레르기성 또는 유사한 비정상적 반응, 예컨대 위장 장애, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 용어 “약제학적으로 허용되는”은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 것을 의미한다.
보조제 (Adjuvant)
본 맥락에서, 용어 “보조제”는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 보조제는 항원을 천천히 방출하는 조직 저장소와 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 림프계 활성화제 역할을 할 수 있다. 종종, 항원 보강제가 없는 항원만으로 1차 챌린지는 체액성 또는 세포성 면역 반응을 이끌어 내지 못할 것이다. 보조제는 완전 프로인트 보조제 (Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 보조제, 사포닌, 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 젤, 리솔레시틴 (lysolecithin)과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올 (pluronic polyols), 폴리 음이온 (ployanions), 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀 림펫 세모시아닌 (keyhole limpet hemocyanins), 디니트로 페놀 (dinitrophenol) 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 보조제는 약제학적으로 허용된다.
부형제 (Excipient)
본 맥락에서, 용어 “부형제”는 본 발명의 조성물이 함께 투여되는 희석제, 보조제, 담체 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는 물 및 오일과 같은 멸균 액체, 예컨대 땅콩 유, 대두유, 광유, 참기름 등 일 수 있다. 물 또는 수용액 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 특히 주 사용 용액의 경우 담체로 사용된다. 적합한 약제학적 담체는 E. W. Martin의 “Remington 's Pharmaceutical Sciences”에 기재되어 있다.
서열 동일성 (Sequence identity)
본 맥락에서, 용어 “서열 동일성”은 여기에서 각각 뉴클레오티드, 염기 또는 아미노산 수준에서 유전자 또는 단백질 간의 서열 동일성으로 정의된다. 구체적으로, DNA 서열의 전사 체가 동일한 RNA 서열로 전사 될 수 있다면 DNA와 RNA 서열은 동일한 것으로 간주된다.
따라서, 본 맥락에서 “서열 동일성”은 아미노산 수준에서 단백질 간의 동일성 측정 및 뉴클레오티드 수준에서 핵산 간의 동일성 측정이다. 단백질 서열 동일성은 서열이 정렬될 때 각 서열에서 주어진 위치의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 유사하게, 핵산 서열 동일성은 서열이 정렬될 때 각 서열의 주어진 위치에서 뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 동일성 비율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 첫 번째 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭을 도입할 수 있다). 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다 (예를 들어, 동일성 % = 동일 위치 수/위치 총 수 (예를 들어, 중복 위치) x 100). 일 양태에서, 두 서열은 동일한 길이이다.
또 다른 양태에서, 두 서열은 길이가 다르고 갭은 다른 위치로 보인다. 서열을 수동으로 정렬하고 동일한 아미노산의 수를 계산할 수 있다. 대안적으로, 동일성 백분율 결정을 위한 두 서열의 정렬은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 알고리즘은 (Altschul et al. 1990)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명의 핵산 분자에 상동 성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 상동 성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다.
비교 목적으로 갭 정렬을 얻으려면 갭 BLAST를 사용할 수 있다. 또는, PSI-Blast를 사용하여 분자 간의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. NBLAST, XBLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램의 기본 매개 변수를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라. 대안적으로, 서열 동일성은 서열이 예컨대 정렬된 후에 EMBL 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)의 BLAST 프로그램에 의해 계산될 수 있다. 일반적으로, 예컨대 “점수 매트릭스” 및 “갭 패널티”에 대한 기본 설정은 정렬에 사용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, BLSATN 및 PSI BLAST 기본설정은 유리할 수 있다.
두 서열 사이의 동일성 백분율은 갭을 허용하거나, 허용하지 않고 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 비율을 계산할 때 정확히 일치하는 항목만 계산됩니다. 따라서 본 발명의 실시예는 어느 정도의 서열 변이를 갖는 본 발명의 서열에 관한 것이다.
안정화 된 MHC 클래스 I 분자가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드
T 세포는 면역 반응에서 중요한 역할을 하며, 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용하여 이물질을 인식하고 반응하여 MHC 분자 (pMHC)와 복합체를 이루는 이물질의 항원 펩티드를 표시한다. T 세포는 매우 특이적이며 T 세포 수용체 (TCR)의 단일 특이성을 발현하므로 T 세포가 단일 특정 pMHC 분자 만 인식하고 반응할 수 있다. T 세포가 항원과 MHC 분자의 특정 조합의 수용체를 개발하도록 처음 준비되면 이후에 다른 특이성을 인식할 수 없다. 이러한 T 세포의 전문화를 MHC 제한이라고하며 확장된 T 세포 집단을 “오염시키는 (polluting)”관련 없는 특이성 없이 단일 특이성의 T 세포를 확장하는 데 사용할 수 있다.
MHC 분자는 몇 가지 변종으로 존재하며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자가 가장 중요한 것으로 간주될 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 CD8 양성 세포 독성 T 세포 (CD8+ T 세포)와 상호 작용하고 MHC 클래스 II 분자는 CD4 양성 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)와 상호 작용한다. 일단 활성화된 CD8+ T 세포는 일반적으로 암세포, 감염된 세포 (특히 바이러스), 암 항원을 과발현 하는 것을 특징으로 하는 세포, 돌연변이 또는 신생 항원을 발현하는 세포, 암 고환 항원을 발현하는 세포 또는 다른 방식으로 손상된 세포를 죽이려고 한다. 반면에 CD4+ T 세포는 주로 면역 체계를 지원하여 기능한다. 사이토 카인을 방출하고 CD8+ T 세포를 강화한다. 단일 유형의 T 세포에 제한되지 않지만, 본 발명은 주로 CD8+ T 세포의 활성화, 자극 및 확장에 관한 것이다. 이것은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 활용이 CD4+ T 세포와 항원 제시 세포의 결합된 역할을 어느 정도 충족시키기 때문에 특히 사실이다.
TCR-pMHC 상호 작용이 T 세포 활성화의 주요 동인이지만, 효과적인 면역 반응을 위해 T 세포를 준비하려면 몇 가지 다른 자극이 필요하다. 전반적으로 CD8+ T 세포의 활성화에는 두 가지 신호가 필요하다; 1) TCR과 pMHC 클래스 I 분자간의 상호 작용 및 2) T 세포의 막 수용체 인 CD28과 B7.1 (CD80) 또는 B7.2 (CD86)과 같은 APC에 위치한 CD28 리간드. 두 번째 신호는 증식, 사이토 카인 생산 및 세포 생존을 향상시키는 역할을 한다.
자극 신호 외에도 T 세포 반응은 억제 신호에 의해 조절된다. Tim-3, LAG-3 및 PD-1은 억제 신호의 매개체의 예이다. 그들은 과도한 T 세포 활성화를 방지하고 면역 체계가 유기체 전체에 만연하는 것을 방지하는 자연적인 메커니즘 역할을 한다.
2차 신호는 CD4+ T 세포에 의해 방출된 사이토 카인으로 CD8+ T 세포의 자극에 의해 지원되거나 일부 경우 대체될 수 있다. 따라서, 사이토 카인은 면역 반응의 조절에 관여하는 또 다른 중요한 분자 그룹을 구성한다. 사이토 카인에는 일반적으로 인터루킨, 인터페론, 케모카인, 림포카인 및 종양 괴사 인자가 포함된다. 이들은 수용체를 통해 작용하며 무엇보다도 T 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성을 조절한다. 함께, 인터루킨-2 (IL-2)와 공동 자극 신호는 지속적인 세포 분열의 보존을 위한 가장 중요한 요소이다. 공동 자극 분자와 사이토 카인 사이의 섬세한 상호 작용은 복잡하며 효율적이고 특이적인 T 세포 확장의 핵심 요소 중 하나이다.
면역 반응뿐만 아니라 세포 사멸, 증식, 부착 및 이동과 같은 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 또 다른 분자는 CD47이다. 이 막 통과 단백질은 인간 세포에서 편재적으로 발현되지만 많은 다른 종양 세포에서도 과발현되며 높은 수준의 CD47로 인해 암 세포가 식균 작용을 피할 수 있다. 그러나 CD47은 또한 면역 세포에서 널리 발현되어 면역 세포의 순환 시간을 연장하는 “나를 먹지 마”신호 역할을 한다. CD47을 발현하는 T 세포의 확장은 이러한 세포가 치료적으로 사용될 때 증가된 반감기를 가질 것으로 예상되기 때문에 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 주형 분자가 T 세포 집단에서 CD47 발현을 자극할 수 있는 리간드를 포함한다.
CD47은 또한, 인공 항원 제시 세포 자체에 유익한 특성, 예컨대 배양 또는 순환에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 반감기를 연장할 수 있는 “나를 먹지 마”신호를 유추할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 CD47을 추가로 포함한다.
상기 설명에서 예시된 바와 같이, T 세포의 활성화 및 증식에 관련된 많은 요소가 있다. 그러나, 면역 요법 및/또는 특정 T 세포 집단의 확장을 위해, 이러한 목적에 적합한 높은 활성 및 기능성을 가진 T 세포 집단을 제공하는 능력을 위해 이상적으로 충족되어야 하는 몇 가지 조건을 설정할 수 있다. 따라서 확장된 T 세포의 바람직한 특성은 다음과 같다:
a. 활성제의 높은 발현 (예컨대 CD28)
b. 저해제의 낮은 발현 (예컨대 PD1)
c. 다 기능성, 예를 들어, 여러 사이토 카인의 동시 분비
효율적인 활성화 및 자극에 필요한 여러 분자의 클러스터는 T 세포 기능 및 확장을 위한 최적의 용량을 제공하기 위해 동시에 존재해야 한다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 사용은 서로 정의된 근접성에서 필요한 분자의 조합을 수집하므로 특정 T 세포의 효율적인 확장을 위한 적합한 플랫폼을 구성한다.
고도로 전문화된 활성 T 세포의 효율적인 확장을 위해 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 활용하는 전망은 매우 유망하다. 그러나 MHC 항원 제시를 기반으로 하는 기술을 진정한 고 처리량 플랫폼으로 전환하는데는 지속적인 챌린지가 남아 있다. 이는 항원성 펩티드가 없으면 MHC 분자의 재접힘이 불가능하고 결과적으로 복잡하고 비용이 많이 들기 때문이다. 수천 개의 MHC 클래스 I 동종 형이 있을 뿐만 아니라 치료 목적으로 검사 또는 활용될 각 항원 펩티드에 대해 새로운 개별화된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 생성되어야 한다. 항원성 펩티드 없이 MHC 분자를 생산하고 대신 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하기 직전에 필요한 항원성 펩티드를 추가하는 것이 더 효율적이고 유연할 것이다. 훨씬 더 효율적이고 유연한 것은 항원성 펩티드가 없는 MHC 분자를 사용하여 완전히 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생산하고 대신 필요에 따라 항원성 펩티드를 추가하는 것이다.
따라서, T 세포의 확장 및 새로운 면역 요법의 개발을 위한 고 처리량 플랫폼을 제공하기 위해, 본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 생산 후 항원성 펩티드를 첨가할 수 있는 빈 MHC 클래스 I 분자를 제공할 수 있다. MHC 클래스 I 분자는 중쇄의 알파-1 및 알파-2 도메인을 연결하는 이황화 가교를 인공적으로 도입하여 안정화된다. 이황화 가교는 C-말단 펩티드 결합 포켓의 말단부에서 펩티드 결합 홈의 외부에 위치한다. MHC 클래스 I 분자의 이러한 구조적 변화는 결합된 특정 항원 펩티드의 형태적 및 동적 효과를 모방하여 MHC 클래스 I 분자를 안정화시킨다.
네이티브 클래스 I MHC 분자 (Native class I MHC molecules)는 특정 친화 도로 다양한 서열의 펩티드에 결합한다. 이것은 펩티드 결합을 용이하게 하는 주머니를 형성하는 펩티드 결합 홈의 말단에 보존된 아미노산을 사용함으로써 달성된다 (일반적으로 MHC 결합 홈의 A 및 F 주머니). 이러한 결합 포켓은 일반적으로 앵커 모티프 (일반적으로 위치 2 또는 3 및 펩티드의 c- 말단 위치)라고 하는 항원성 펩티드의 결합에 대한 일련의 요구 사항을 결정한다. 네이티브 MHC 클래스 I 분자는 앵커 모티프 (anchor motifs)의 인식을 통해 많은 다른 항원성 펩티드에 결합하지만, 각 대립 유전자는 높은 친화도로 사용 가능한 모든 항원성 펩티드의 별개의 하위 집합에만 결합한다. 그러나, 안정화된 MHC 클래스 I 분자의 인위적으로 도입된 이황화 가교는 결합된 특정 항원 펩티드의 형태적 및 동적 효과를 모방하기 때문에, 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 넓은 범위의 다양한 항원성 펩티드와 결합할 수 있는 빈 MHC 클래스 I 분자로 생성될 수 있다. 이것은 안정화된 MHC 클래스 I 분자의 이황화 가교를 기반으로 한 T 세포 상호 작용이 야생형 MHC 분자로 얻은 것과 완전히 동일하다는 발견에 의해 더욱 강조된다.
따라서, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 친화성 태그가 부착된 이황화 안정화된 빈 MHC 클래스 I 분자가 부착된 커플링 제와 접합된 고분자 백본으로 구성된다. 빈 MHC 클래스 I 분자는 특정 T 세포와의 특이적 상호 작용을 제어할 수 있는 pMHC 분자를 형성하기 위해 항원성 펩티드로 로딩 될 수 있다. 사이토 카인 및 공동 자극 분자와 같은 분자에 영향을 미치는 공동-부착된 친화성 태그 T 세포와 함께, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 특정 T 세포를 자극하여 증가된 기능적 특성을 달성한다. 따라서, 본 발명은 종양 퇴행 또는 바이러스 제거를 매개하는데 이상적인 표현형 및 기능적 특성을 얻기 위해 세포에 특정 기능적 자극을 제공하기 위해 MHC 로딩된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 사용을 통해 종양 반응성 T 세포를 확장하는 데 필요한 특정 조건을 입증한다. 항원성 펩티드로 빈 MHC 클래스 I 분자를 로딩 한 후 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 pMHC 분자의 인식을 기반으로 T 세포와 특이적으로 상호 작용할 것이며, 이 특정 상호 작용을 통해 특정 T 세포를 펩티드-MHC 지향 방식으로 효과적으로 확장하고 기능적으로 자극할 수 있다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 매우 다양한 상이한 주형 분자 (즉, MHC 클래스 I 분자, 분자에 영향을 미치는 T 세포)의 조합에 의해 조립될 수 있다. 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 다음을 포함하는 하나 또는 하나 이상의 공동 자극 분자인 B7.1, B7.2, ICOS, PD-L1, α-갈락토실세라마이드 (a-galactosylceramide), CD3, CD4, CD5, CD8, CD9, CD27, CD28, CD30, CD69, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD147, CDw150 (SLAM), CD152 (CTLA-4), CD153 (CD30L), CD40L (CD154), Fas (CD95), CD40, CD48, CD70, 및 CD72을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 다음을 포함하는 하나 또는 하나 이상의 사이토 카인인 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-6 (IL -6), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-8 (IL-8), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨-10 (IL-10), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15 (IL-15), 인터루킨-17 (IL-17), 인터루킨-21 (IL-21), 인터루킨-22 (IL-22), 인터루킨-23 (IL-23), 인터페론 알파 (IFN-α), 인터페론 베타 (IFN-β), 인터페론 감마 (IFN-γ), IGIF, 과립구 대 식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 종양 괴사 인자 베타 (TNF-β)및 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF) 및 이의 변이체 및 단편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항원성 펩티드를 로딩 할 때 T 세포 확장에 적합한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 설명되어 있어 높은 비율의 활성 T 세포, T 세포의 높은 항원 특이성 및 T 세포의 높은 기능성을 보장한다. 결과적으로, 본 발명의 일 측면은 다음의 주형 분자가 부착된 고분자 백본을 포함하는 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell; aAPC) 스캐폴드에 관한 것이다:
i. 적어도 1개의 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule), 및
ii. 적어도 1개의 MHC 클래스 I 분자 (MHC class I molecule),
MHC 클래스 I 분자는 이황화 가교에 의해 연결된 알파-1 도메인 및 알파-2 도메인을 포함하는 중쇄를 포함한다.
알파-1 및 알파-2 도메인 사이에 형성된 이황화 가교는 MHC 클래스 I 분자에 인위적으로 도입된다. 구체적으로, 두 개의 돌연변이 시스테인 잔기가 중쇄의 아미노산 서열에 도입되어 알파-1 및 알파-2 도메인 사이에 이황화 가교 형성을 가능하게 한다. 돌연변이 시스테인 잔기의 도입은 임의의 유형의 적합한 돌연변이 유발에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 기술은 당업자에게 공지 되어있다. 바람직하게는, 돌연변이 유발 위치는 알파-1 및 알파-2 도메인에 배치된 결과적인 돌연변이 시스테인 잔기가 정상적인 단백질 접힘 조건 하에서 이황화 가교의 형성을 가능하게 하는 서로 공간적 거리 내에 있도록 선택된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 이황화 가교는 알파-1 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기와 알파-2 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기 사이에 형성된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 알파-1 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기 및 알파-2 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기 사이의 공간 거리가 2 내지 10 옹스트롬, 예컨대 2 내지 8 옹스트롬, 바람직하게는 2 내지 5 옹스트롬이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄가 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 1, 또는
b. (a)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
아미노산 서열은 알파-1 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기 및 알파-2 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 1의 서열, 또는
b. (a)의 서열과 적어도 80%, (a)의 서열과 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% , 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
아미노산 서열은 알파-1 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기 및 알파-2 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기를 포함한다.
2개의 시스테인 잔기의 바람직한 돌연변이는 위치 139의 아미노산 및 위치 84 또는 85의 아미노산 중 하나의 변형을 포함한다. 위치 139의 아미노산은 중쇄의 알파-2 도메인에 위치하며 많은 경우 알라닌 잔기이다. 위치 84 또는 85의 아미노산은 중쇄의 알파-1 도메인에 위치하며 많은 경우 티로신 잔기이다. 시스테인 돌연변이는 표준 유전 공학을 사용하여 중쇄의 유전자 서열의 변형을 통해 아미노산 치환에 의해 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 알파-1 도메인의 돌연변이 시스테인 잔기는 아미노산 잔기 84 또는 85에 있고 알파-2 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기는 아미노산 잔기 139에 있다.
MHC 클래스 I 분자가 접히면, Cys-84 또는 Cys-85와 Cys-139 사이에 이황화 가교가 형성된다. 새로 형성된 이황화 가교는 MHC 클래스 I 분자를 안정화시켜 항원성 펩티드가 없는 용액에서 안정적으로 유지된다. 이들 안정한 빈 MHC 클래스 I 분자는 친화성 태그와 커플링 제 사이의 상호 작용에 의해 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본에 부착될 수 있다.
시스테인 돌연변이 잔기의 도입은 모든 유형의 MHC 클래스 I 분자 또는 MHC 클래스 I-유사 분자에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, MHC 클래스 I 분자가 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, MIC A, MIC B, CD1d, ULBP-1, ULBP-2, 및 ULBP-3로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 또한 H-2 복합체로 지칭되는 마우스의 MHC와 함께 사용하기 위한 적용이 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄가 H-2kb 또는 H-2Db와 같은 H-2 분자다. 본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 12 또는 13중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
MHC 클래스 I 분자의 바람직한 변이체는 각각 2 개의 돌연변이 시스테인 잔기를 포함하는 HLA-A, HLA-B 및 H-2를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
용어 “서열번호 2 내지 13”은 “서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13”으로 이해되어야 한다는 점에 유의한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
T 세포의 확장을 위해 많이 사용되는 HLA 대립 유전자는 HLA-A 02:01 대립 유전자이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산을 포함한다:
a. 서열번호 2, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 2, 또는
b. (a)의 서열과 적어도 80 %의 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열에 대해 예컨대 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 % 또는 적어도 99 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
MHC 클래스 I 분자는 친화성 태그와 커플링 제 사이의 상호 작용을 통해 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본에 부착된다. 바람직하게는, 비오틴과 같은 친화성 태그는 MHC 클래스 I 분자에 위치한다. 중쇄에 대한 비오틴의 부착은 중쇄의 비오틴화를 위해 Avi-태그 (Avi-tag)와 같은 핸들을 포함함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나와 적어도 80 % 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열 중 어느 하나에 대해서 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 중쇄는 서열번호 19를 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 14, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 14, 또는
b. (a)의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열에 대해 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 17, 또는
b. (a)의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열에 대해 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
중쇄는 β2-마이크로 글로불린 분자 (B2M)와 결합되어 MHC 클래스 I 분자를 형성한다. 구체적으로, 중쇄의 알파-3 도메인은 B2M에 인접해 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본원에 기재된 바와 같은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 β2- 마이크로 글로불린 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, β2-마이크로 글로불린 분자는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 15, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
MHC 클래스 I 분자는 링커를 통해 중쇄에 연결된 B2M과 함께 최종 융합 단백질로 제공될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
a. 서열번호 16, 또는
b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 16, 또는
b. (a)의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열에 대해 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다:
a. 서열번호 18, 또는
b. (a)의 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, (a)의 서열에 대해 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
일부 T 세포의 확장은 분자에 영향을 미치는 여러 T 세포가 동시에 존재할 때 강화될 수 있다. 달성된 이점은 T 세포의 확장 및 자극에서 다른 목적 (예를 들어, 성장, 분화, 활성화 등)을 제공하는 분자에 영향을 미치는 T 세포의 시너지 효과 일 수 있다. 따라서, 분자에 영향을 미치는 T 세포는 동일한 유형 또는 다른 유형의 분자에 속할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 적어도 2개의 상이한 T 세포 영향 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, T 세포 영향 분자는 사이토 카인, 공동 자극 분자, 접착 분자 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
분자에 영향을 미치는 한 가지 바람직한 유형의 T 세포는 사이토 카인이다. 사이토 카인은 체액성 면역 반응과 세포 기반 면역 반응 사이의 균형을 조절하고 T 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성을 조절한다. 일부 사이토 카인은 복잡한 방식으로 다른 사이토 카인의 작용을 강화하거나 억제하여 사이토 카인 선택 간의 상호 작용을 예측할 수 없게 만든다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포에 관한 것으로, T 세포에 영향을 주는 분자는 사이토 카인이다.
본 발명에 있어서 사이토 카인은 천연 사이토 카인뿐만 아니라 향상된 T 세포 활성화 및 기능을 유도하도록 조작된 사이토 카인의 변이체 또는 모방체를 모두 포함한다. 따라서, 인터루킨과 같은 사이토 카인의 변이체 또는 모방체는 하나 이상의 사이토 카인에 상응하는 T 세포 활성화 및 기능을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, T 세포 영향 분자는 사이토 카인, 또는 이의 변이체 및 유사체이다. 본 발명의 다른 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 천연 사이토 카인, 또는 이의 변이체 및 모방체로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 여기서 사이토 카인의 변이체 또는 모방체는 IL-2, IL-15 및 IL-21의 군으로부터 선택된 하나 이상의 인터루킨에 상응하는 T 세포 자극을 유도한다. 본 발명의 추가 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인의 변이체 또는 유사체는 IL-2, IL-15 및 IL-21으로부터 선택된 2종, 예컨대 IL-2/IL-15, 예컨대 IL-2/IL-21, 또는 예컨대 IL-15/IL-21의 인터루킨에 상응하는 T 세포 자극을 유도한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 IL-21, IL-2, IL-15, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17, IL-22, 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
IL-2는 면역 반응의 강도를 조절하기 위해 치료적으로 사용된다. IL-2는 IL-2 수용체 β 및 IL-2 수용체 γ(IL-2Rβ 및 IL-2Rγ)로 알려진 두 개의 수용체 서브 유닛에 동시에 결합하여 IL-2Rβγc라는 이종 이량체 신호 단백질을 형성함으로써 메시지를 전달한다. IL-2Rα(CD25라고도 함)라고하는 세 번째 비 신호 수용체는 신호 복합체 형성에 기여하여 IL-2와 IL-2Rβγc간의 결합을 약 100배 강화한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 적어도 IL-2, 또는 이의 변이체 및 모방체를 포함한다. 본 발명의 추가 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 IL-2, 또는 이의 변이체 및 모방체로 구성된다.
IL-2의 변종 또는 모방체는 Neoleukin-2/15로 불린다. Neoleukin-2/15 (Neo-2/15)는 매우 안정적이고 IL-2Rβγc에 강하게 결합하지만 CD25에는 결합하지 않는 디자이너 사이토 카인이다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 적어도 Neo-2/15를 포함한다. 본 발명의 다른 일 양태는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 Neo-2/15로 구성된다.
특히 유리한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생산하기 위해 상이한 그룹의 사이토 카인이 확인되었다. 이론에 얽매이지 않고, 하나의 효율적인 사이토 카인 그룹은 공유된 감마 사슬 수용체를 통해 세포 내 신호를 전달하고 T 세포 활성화 및 분화에 영향을 미치는 사이토 카인이다. 현재 맥락에서, 이러한 사이토 카인은 “감마 사슬 수용체 사이토 카인”으로 불린다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 감마 사슬 수용체 사이토 카인이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 수용체 사이토 카인은 IL-21, IL-2, IL-15, IL-4, IL-7 및 IL-9으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명자들은 감마 사슬 수용체 사이토 카인 패밀리 내의 자극 분자의 바람직한 조합을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-21, IL-2 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 적어도 IL-21을 포함한다.
앞서 설명한 바와 같이, 여러 T 세포에 영향을 미치는 분자 (이하 사이토 카인)간의 상호 작용은 T 세포의 확장이 이로울 수 있는 유리한 효과를 생성할 수 있다. 이것은 감마 사슬 수용체 사이토 카인 그룹에도 해당된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 2개 이상의 감마 사슬 수용체 사이토 카인을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 다음을 포함한다:
i. 적어도 IL-2 및 IL-21, 또는
ii. 적어도 IL-15 및 IL-21.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토카인은:
i. IL-2 및 IL-21, 또는
ii. IL-15 및 IL-21.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 다음을 포함한다:
i. 적어도 IL-4 및 IL-21,
ii. 적어도 IL-7 및 IL-21, 또는
iii. 적어도 IL-9 및 IL-21.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은:
i. IL-4 및 IL-21,
ii. IL-7 및 IL-21, 또는
iii. IL-9 및 IL-21.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 포함될 수 있는 분자에 영향을 미치는 또 다른 유형의 T 세포는 T 세포 반응, 증식, 생산 및/또는 사이토 카인의 분비를 향상시키고, T 세포의 분화 및 이펙터 (effector) 기능을 자극하거나 T 세포의 생존을 촉진하는 공동 자극 분자이다. 따라서, 공동 자극 분자는 자연에서뿐만 아니라, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 함께 작용하여 자체적으로 T 세포 확장 및 분화를 유도하고 사이토 카인과 같은 분자에 영향을 미치는 다른 T 세포의 효과를 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, T 세포 영향 분자는 적어도 하나의 공동 자극 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 공동 분자는 B7.2 (CD86), B7.1 (CD80), CD40, ICOS 및 PD-L1로 이루어진 군에서 선택된다. 주형 분자는 커플링 제와 친화성 태그 사이의 상호 작용을 통해 고분자 백본에 부착될 수 있다. 커플링 제는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본에 위치하며 소수성 상호 작용, 정전기 상호 작용 또는 공유 결합에 의해 백본에 부착될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 고분자 백본에 위치할 때, 커플링 제는 친화성이 태그된 템플릿 분자가 모듈 방식으로 고정될 수 있는 유연한 템플릿을 제공한다. 친화성 태그는 비공유 상호 작용을 통해 커플링 제에 특이적으로 결합하는 분자 종이다. 따라서 각 템플릿 분자에 친화성 태그를 부착하면 맞춤형 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 쉽게 조립할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 주형 분자는 고분자 골격에 위치한 커플링 제와 주형 분자의 친화성 태그 사이의 비공유 상호 작용을 통해 고분자 골격에 부착된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 주형 분자는 주형 분자에 위치한 커플링 제와 고분자 백본상의 친화성 태그 사이의 비공유 상호 작용을 통해 고분자 백본에 부착된다.
본 발명에 있어서 친화성 태그 및 커플링 에이전트로 잘 알려진 호환 가능한 쌍인 비오틴/스트렙타비딘 (biotin/streptavidin), 비오틴/아비딘 (biotin/avidin), 비오틴/뉴트라 비딘 (biotin/neutravidin), 비오틴/스트렙-탁틴 (biotin/strep-tactin), 폴리-히스/금속 이온 킬레이트 (poly-His/metal ion chelate), 펩티드/항체 (peptide/antibody), 글루타티온-S-트랜스퍼라제/글루타티온 (glutathione-S-transferase/glutathione), 에피토프/항체 (epitope/antibody), 말토오스 결합 단백질/아밀라아제 (maltose binding protein/amylase) 및 말토오스 결합 단백질/말토오스 (maltose binding protein/maltose)가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 친화성 태그 및 커플링 제의 다른 알려진 호환 가능한 쌍도 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 커플링 제/친화성 태그는 비오틴/스트렙타비딘, 비오틴/아비딘, 비오틴/뉴트라 비딘, 비오틴/스트렙-탁틴, 폴리-히스/금속 이온 킬레이트, 펩티드/항체, 글루타티온-S-트랜스퍼 라제/글루타티온, 에피토프/항체, 말토오스 결합 단백질/아밀라아제 및 말토오스 결합 단백질/말토오스로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
다른 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 커플링 제는 스트렙타비딘이고 친화성 태그는 비오틴이다.
주형 분자가 부착되는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본은 또한 다양한 다른 재료를 기반으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 여러 유형의 백본은 다당류 (polysaccharides), 합성 다당류 (synthetic polysaccharides), 비닐 고분자 (vinyl polymers), 폴리 에틸렌 글리콜 (poly ethylene glycol), 폴리 프로필렌 글리콜 (poly propylene glycol), 유도체 화 된 셀룰로오스 (derivatised cellulosics), 스트렙-탁틴 (strep-tactin) 및 폴리-스트렙타비딘 (poly-streptavidin )을 포함하는 것일 수 있나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다당류는 덱스트란 또는 카복시 메틸 덱스트란, 덱스트란 폴리 알데히드 및 시클로 덱스트린과 같은 덱스트란의 다른 변이체 일 수 있다. 합성 다당류의 예는 피콜 (ficoll)이다. 비닐 고분자는 폴리 (아크릴산), 폴리 (아크릴 아미드), 폴리 (아크릴 에스테르), 폴리 (메틸 메타크릴레이트), 폴리 (말레 산), 폴리(아크릴아미드), 폴리 (메타크릴 산) 및 폴리 (비닐 알코올)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 유도체 화된 셀룰로오스로 구성된 고분자 백본은 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 히드록시-에틸 셀룰로오스 및 히드록시-에틸 셀룰로오스를 포함하는 유도체 화 된 셀룰로오스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 자가 조립 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 형성하기 위한 기초 역할을 할 수 있는 상용 고분자 백본이 존재한다. 이러한 고분자 백본은 예컨대 비오틴화 된 MHC 복합체와 같은 올리고머화하여 여러 비오틴화 된 분자에 결합할 수 있는 멀티머를 형성하는 스트렙-탁틴 단백질을 기반으로 하는 IBA GmbH 및 Beckman Coulter의 스트렙타머 및 예컨대 사이토 카인 및 공동화된 분자에 결합할 수 있는 T 세포에 영향을 주는 분자의 스트렙타머 (Streptamers)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본은 다당류 (polysaccharides), 비닐 고분자 (vinyl polymers), 폴리 에틸렌 글리콜 (poly ethylene glycol), 폴리 프로필렌 글리콜 (poly propylene glycol), 스트렙-탁틴 (strep-tactin) 및 폴리-스트렙 타비딘 (poly-streptavidin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본은 다당류이다.
본 발명의 또 다른 그리고 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 다당류는 덱스트란이다.
고분자 백본의 크기는 각 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 부착할 수 있는 템플릿 분자 수에 대한 물리적 한계를 설정한다. 고분자 백본의 크기는 분자량에 의해 결정된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란은 50 내지 3000 kDa, 예컨대 100 내지 2500, 예컨대 250 내지 2500 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란은 250 kDa, 270 kDa, 750 kDa 및 2000 kDaa로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 갖는다.
각 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 부착된 분자의 수 외에도 또 다른 중요한 매개 변수는 주형 분자가 고분자 백본에 분포하는 밀도이다. 밀도는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 포함된 모든 분자 사이의 비율을 조정하여 변경될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본: MHC 클래스 I 분자: 공동 자극 분자: 사이토카인 사이의 비율은 1: 1: 1: 1, 1: 2: 1: 1, 1: 4: 1: 1, 1: 4: 2: 1, 1: 4: 2: 2, 1: 10: 5: 5, 1: 4: 4: 4, 1: 8: 8: 8, 1: 10: 10: 10, 1: 20: 20: 20, 1: 30: 30: 30, 1: 40: 40: 40, 1: 50: 50: 50, 1: 50: 10: 10 또는 1: 50: 20: 20로 이루어진 군에서 선택된 비율을 갖는다. 본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본: MHC 클래스 I 분자: 사이토 카인 1: 사이토 카인 2 사이의 비율은 1: 1: 1: 1, 1: 2: 1: 1, 1: 4: 1: 1, 1: 4: 2: 1, 1: 4: 2: 2, 1: 10: 5: 5, 1: 4: 4: 4, 1: 8: 8: 8, 1: 10: 10: 10, 1: 20: 20: 20, 1: 30: 30: 30, 1: 40: 40: 40, 1: 50: 50: 50, 1: 50: 10: 10 또는 1: 50: 20: 20로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본: MHC 클래스 I 분자: 공동 자극 분자: 사이토 카인 1: 사이토 카인 2 사이의 비율은 1: 1: 1: 1: 1, 1: 2: 1: 1: 1, 1: 4: 1: 1: 1, 1: 4: 2: 1: 1, 1: 4: 2: 2: 2, 1: 10: 5: 5: 5, 1: 4: 4: 4: 4, 1: 8: 8: 8: 8, 1: 10: 10: 10: 10, 1: 20: 20: 20: 20, 1: 30: 30: 30: 30, 1: 40: 40: 40: 40, 1: 50: 50: 50: 50, 1: 50: 10: 10: 10 또는 1: 50: 20: 20: 20 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 다양한 대상체로부터의 T 세포의 확장에 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 인간, 뮤린 (murine), 래트 (rat), 돼지 (porcine), 소 또는 조류 분자와 같은 척추 동물 MHC 분자이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 척추 동물 MHC 클래스 I 분자는 인간 분자이다.
설명한 바와 같이, MHC 분자는 여러 변형으로 존재한다. MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및 MHC 클래스 I 유사 분자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. MHC 클래스 I 유사 분자는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, MICA, MICB, MR1, ULBP-1, ULBP-2 및 ULBP-3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 인간 MHC 클래스 I 분자이다. 인간의 경우 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체라고 하는 유전자 복합체에 의해 암호화된다. MHC 클래스 I에 해당하는 HLA를 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C라고 한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 적어도 하나의 MHC 클래스 I 분자는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 알파-1 및 알파-2 도메인을 연결하는 이황화 가교에 의해 안정화된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다. 이것은 항원성 펩티드가 없는 MHC 클래스 I 분자로 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 형성을 가능하게 하지만, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 항원 부하 MHC 클래스 I 분자가 있거나 없는 상태로 제공될 수 있다. 언로드 된 MHC 클래스 I 분자가 제공되는 경우에도 결국 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 의도된 용도에는 항원성 펩티드를 로딩하여 pMHC 분자를 형성하는 것이 포함된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, MHC 클래스 I 분자는 항원성 펩티드가 없는 펩티드 결합 홈을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, MHC 클래스 I 분자는 항원성 펩티드 (pMHA)를 포함하는 펩티드 결합 홈을 포함한다.
pMHC 분자에 의해 제시된 항원성 펩티드는 궁극적으로 어떤 유형의 T 세포가 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 (이전에 MHC 제한으로 언급된 개념)에 의해 확장될 것인지를 결정한다. 본 발명에 따른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 함께 사용하기에 적합한 항원 성 펩티드는 본질적으로 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 항원 공급원은 인간, 바이러스, 박테리아, 기생충, 식물, 진균 또는 종양을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, pMHC의 항원성 펩티드는 인간, 바이러스, 박테리아, 기생충, 식물, 진균 및 종양으로 구성된 군으로부터 선택된 공급원으로부터 유래된다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 일 용도는 입양 세포 전달 (ACT)에 사용하기 위한 종양 반응성 T 세포의 확장에 있다. 입양 세포 전달 전략의 강점은 T 세포가 국소 종양 환경과는 반대로 항원 특이적 T 세포 집단의 효율적인 확장에 최적인 환경에서 생체 외에 존재한다는 것이다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 또 다른 잠재적 용도는 이식 후 전형적으로 발생하는 특정 감염과 싸우기 위해 특이적인 T 세포 집단의 확장을 위한 것이다. 이식을 받는 환자는 일반적으로 이식 거부 반응을 피하기 위해 면역 억제 치료를 받는다. 많은 경우, 그러한 치료는 이미 약해진 환자의 심각한 감염을 일으키는 공격적인 바이러스 균주에 환자를 취약하게 만든다. 본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 입양 세포 전달 (adoptive cell transfer, ACT) 전략에 의해 심각한 감염을 치료할 목적으로 이식 환자로부터 추출된 T 세포의 효율적인 확장에 완벽하게 적합하다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, pMHC의 항원성 펩티드는 암 관련 에피토프 또는 바이러스 에피토프이다.
본 발명의 대안적인 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, pMHC의 항원성 펩티드는 네오 에피토프, 예컨대 암 네오 에피토프 또는 암 신생 항원이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 암 관련 에피토프는 바이러스 유발 암과 관련된 바이러스 에피토프이다.
하지만, 본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 암 관련 에피토프는 암과 관련된 과발현 항원이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 암 관련 에피토프는 암 고환 항원 (cancer testis antigen)이다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 고분자 백본에 부착된 pMHC 분자에 의해 제시될 수 있는 임의의 항원성 펩티드와 함께 기능한다. 본 발명에서는 일부 표시가 바람직하다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 바이러스 에피토프는 인유두종 바이러스 (human papillomavirus, HPV), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스 (Merkel cell polyomavirus, MCV), 거대 세포 바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV), 인간 T 림프절 바이러스 (human T-lymphotropic virus, HTLV), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV) 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 단일 T세포 특이성을 확장할 수 있는 정확도와 관련하여 각 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 효율성을 최적화하기 위해, 본 발명의 한 버전에서, 각 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 예를 들어, 각 유형의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대해 하나의 항원 펩티드만 의도적으로 로드하려는 의도로 MHC 클래스 I 분자의 단일 변이체만 보유하고 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 동일한 MHC 클래스 I 분자를 포함한다.
각 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대해 단일 항원 펩티드만 표시함으로써, 서로 다른 특이성을 가진 T 세포 간의 경쟁이 최소로 제한된다. 원하는 경우, 서로 다른 펩티드를 제공하는 여러 가지 다른 스캐폴드를 함께 풀링하고 동시에 확장할 수 있다. 모든 주형 분자 (예를 들어, 분자에 영향을 미치는 pMHC 및 T 세포)를 서로 근접하게 클러스터링하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 인해 T 세포 간의 경쟁이 최소로 유지되기 때문에 다양한 특이성을 가진 T 세포의 동시 확장이 가능하다. 결과적으로, 본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 확장된 T 세포 집단은 특이성을 유지하고 다른 특이성의 풀은 피험자에게 재 도입되는 경우 모든 면역 반응의 폭을 보장한다. 이 후자의 특성은 면역 탈출 변종을 피하기 위해 임상적으로 중요하다. 응답의 폭은 단일 확장에서 함께 풀링되는 서로 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 수를 결정하여 조정할 수 있다.
고분자 백본은 고분자 백본의 크기에 따라 합리적인 임의의 수의 MHC 클래스 I 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 각각의 고분자 백본은 적어도 5개, 예컨대 적어도 8개, 예컨대 적어도 10개, 예컨대 적어도 20개, 예컨대 적어도 30개, 예컨대 적어도 30개, 예컨대 적어도 40개, 예컨대 적어도 50개 또는 예컨대 적어도 100개의 MHC 클래스 I 분자를 포함한다.
본 발명의 대안적인 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 각각의 고분자 백본은 적어도 2개, 예컨대 적어도 3개 또는 예컨대 적어도 4개의 MHC 클래스 I분자를 포함한다.
일부 응용 분야의 경우 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 견고한 지지대에 고정하는 것이 실용적일 수 있으며, 예를 들어, 특정 유형의 분석을 위해 또는 확장된 T 세포 집단에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 분리한다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 고체 지지체 상에 고정된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 템플릿 분자가 직접 부착되는 고체 지지체에 관한 것이다. 따라서, 이 특별한 경우에 주형 분자는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 고분자 백본에 배치되지 않는다.
고체 지지체의 많은 변형이 존재하며 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 적용에 따라 선택될 수 있다. 고체 지지체의 변형은 비드, 웰 플레이트, 입자, 필터, 겔, 튜브 및 페트리 접시를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고체 지지체는 비드, 웰 플레이트, 입자, 필터, 겔, 튜브 및 페트리 접시로 이루어진 그룹에서 선택된다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 링커, 항체 등과 같은 임의의 통상적인 수단에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다.
과다한 상이한 주형 분자가 존재하므로 다수의 상이한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립할 수 있다. 본 발명자들은 주형 분자의 특정 조합이 특히 효율적이고 바람직한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생성한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 상기
i. 고분자 백본은 덱스트란,
ii. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-15 및 IL-21이며, 및
iii. 공동 자극 분자는 B7.2 (CD86) 이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본상의 MHC 클래스 I 분자, IL-15, IL-21 및 B7.2 (CD86) 사이의 비율은 2: 1: 1: 1이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-15, IL-21 및 B7.2 (CD86) 사이의 비율은 1: 10: 5: 5: 5이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-2, IL-15 및 IL-21이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란, 및
ii. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-21, IL-2 및 IL-15이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-2, IL-5 및 IL-21 사이의 비율은 1: 10: 5: 5: 5이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 텍스트란,
ii. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-2, IL-15 및 IL-21이며, 및
iii. 공동 자극 분자는 B7.2 (CD86) 이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-2, IL-5, IL-21 및 B7.2 (CD86) 사이의 비율은 1: 10: 5: 5: 5: 5이다.
본 발명의 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란, 및
ii. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-2와 IL-21, 또는 IL-15와 IL-21이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 사이토 카인은 적어도 IL-6 및 IL-10을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란,
ii. 공동 자극 분자는 B7.2 (CD86) 이며, 및
iii. 사이토 카인은 IL-6 및 IL-10이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본상의 MHC 클래스 I 분자, IL-6, IL-10 및 B7.2 (CD86) 사이의 비율은 2: 1: 1: 1이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-6, IL-10 및 B7.2 (CD86) 사이의 비율은 1: 10: 5: 5: 5이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 적어도 IL-2 및 IL-21을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란, 및
ii. 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-2와 IL-21이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본상의 MHC 클래스 I 분자, IL-2 및 IL-21 사이의 비율은 1: 1: 1이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 공동 자극 분자는 적어도 B7.2 (CD86)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태 (Still another embodiment)는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-2 및 IL-21 사이의 비율은 1: 8: 8: 8이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 고분자 백본은 적어도 IL-1 및 PD-L1을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란,
ii. 공동 자극 분자는 B7.2 (CD86) 및 PD-L1이며, 및
iii. 사이토 카인은 IL-1이다.
본 발명의 또 다른 일 양태 (An even further embodiment)는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본상의 MHC 클래스 I 분자, IL-1, B7.2 (CD86) 및 PD-L1 사이의 비율은 2: 1: 1: 1이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 덱스트란 백본, MHC 클래스 I 분자, IL-1, B7.2 (CD86) 및 PD-L1 사이의 비율은 1: 10: 5: 5: 5이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란,
ii. 공동 자극 분자는 B7.2 (CD86) 및 ICOS이며, 및
iii. 사이토 카인은 IL-10이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란, 및
ii. 사이토 카인은 IL-1 및 IL-2이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로,
i. 고분자 백본은 덱스트란, 및
ii. 사이토 카인은 IL-2와 IL-15이다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐 폴드는 병원 및 실험실에서 사용하기에 적합한 키트의 일부일 수 있다. 이러한 키트는 샘플에서 추출한 T 세포를 확장하는 데 적합한 배지뿐만 아니라 다른 특이성을 가진 T 세포를 확장하는 데 적합한 하나 이상의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함할 수 있다. 키트는 또한 T 세포 함유 샘플의 확장에 필요한 다른 화합물 또는 분자를 보유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 다음을 포함하는 T 세포 확장용 키트에 관한 것이다:
i. 본 발명에 있어서 적어도 1개의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 제1 저장 수단, 및
ii. 적어도 1개의 항원성 펩티드를 포함하는 제2 저장 수단, 제1 저장 수단 및 제2 저장 수단의 내용물은 결합 (combined) 되도록 구성된다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 관한 것으로, 제2 저장 수단은 항원성 펩티드 라이브러리를 포함한다. 항원성 펩티드 라이브러리는 가장 자주 사용되는 항원성 펩티드의 선택을 포함할 수 있다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 대상체의 면역 체계를 돕기 위해 대상체에 직접 투여하기위한 면역 요법으로 사용될 수 있다. 인공 항원 제시 세포는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 경피 또는 경구와 같은 임의의 경로를 통해 국소 또는 전신으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 T 세포 확장 및/또는 입양 T 세포 (입양 세포 전달, adoptive cell transfer, ACT) 요법을 위한 자동화 시스템의 일부로 사용될 수 있다. 따라서, 인공 항원 제시 세포 세포는 예를 들어, 임상용 T 세포 제조용 장치 또는 시스템의 구성요소 일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 T 세포 확장 및/또는 입양 T 세포 (입양 세포 전달, adoptive cell transfer, ACT) 요법을 위한 장치 또는 시스템에 관한 것이다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 다양한 형태의 형광 활성화 세포 분류 또는 유사한 세포 선택 전략과 함께 세포 제조에 사용될 수 있다.
T 세포의 확장 방법
건강에 해로운 피험자로부터 면역 반응 T 세포를 추출하고, 생체 외 T 세포를 확장하고, 확장된 T 세포 집단을 피험자에게 다시 도입함으로써, 그렇지 않으면 면역 체계를 마비시키는 면역 억제 질환의 몇 가지 문제를 극복할 수 있다. 그러나, 비록 예를 들어, 채집 절차 및 후속 환자에게 재 도입에 의한 말초 혈액은 문제가 없는 T 세포의 추출이더라도, 주어진 특이성의 T 세포의 활성화 및 확장은 종종 충분한 분화 및 기능적 능력이 부족한 결과 T 세포 집단에 대해 큰 챌린지로 남아 있다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 T 세포의 동시 시험관 내 자극 및 확장에 적합하며, 높은 비율의 활성 T 세포, T 세포의 높은 항원 특이성 및 T 세포의 높은 기능성을 갖는 T 세포 집단을 생성한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 다음의 단계를 포함하는 T 세포의 동시 시험관 내 자극 및 확장 방법에 관한 것이다:
i. T 세포를 포함하는 샘플을 제공 단계,
ii. 샘플을 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 확장 용액과 접촉시키는 단계,
iii. 배양에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 특이성을 갖는 T 세포를 자극 및 확장하는 단계, 및
iv. 배양으로부터 단계 iii) 의 T 세포를 획득하여 T 세포의 확장된 항원 특이적 집단을 수득하는 단계.
본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 T 세포의 동시 시험관 내 자극 및 확장 방법에 관한 것이다:
i. 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 제공하고, MHC 클래스 I 분자는 항원성 펩티드가 없는 펩티드 결합 홈을 포함하는 단계,
ii. pMHC 분자를 포함하는 로딩 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 제공하기 위해 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 항원 성 펩티드와 혼합하는 단계,
iii. T 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
iv. 샘플을 단계 ii) 의 로딩 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 접촉시키는 단계,
v. 배양에서 상기로드 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 특이성을 갖는 T 세포를 자극 및 확장하는 단계, 및
vi. 배양으로부터 단계 iii) 의 T 세포를 수확하여 T 세포의 확장된 항원 특이적 집단을 수득하는 단계.
T 세포를 포함하는 샘플은 피험자로부터 추출된 다음 T 세포의 성장을 허용하는 조건 하에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 배양물에 넣는다. 따라서, T 세포의 확장은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 더하여 세포 증식에 필요한 모든 화합물 및 인자를 포함하는 용액 또는 배지에서 수행되어야 함을 이해해야 한다. 따라서, T 세포 확장이 수행되는 배양물은 무관한 세포의 성장을 억제하거나 예를 들어, IL-2와 같은 T 세포의 성장을 촉진하는 화합물을 포함할 수 있다.
확장된 T 세포 집단의 품질을 향상시키기 위해, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 인공 항원 제시 세포를 샘플과 혼합하기 전에 모든 비 결합 pMHC 분자를 제거하기 위해 분자량 차단 필터를 통해 원심 분리에 의해 여과될 수 있다. 이는 스캐폴드에 접합되지 않은 pMHC 분자로부터의 자극을 피하고, 과잉 항원성 펩티드 및 분자에 영향을 미치는 T 세포를 제거하여 관련 없는 T 세포 하위 집합의 자극을 제한하기 위한 것이다. MHC 분자에 착화 되지 않은 항원성 펩티드에도 동일하게 적용되며 분자량 차단 필터를 통해 원심 분리하여 제거할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 설명된 방법에 관한 것으로, 팽창 용액은 샘플과 접촉하기 전에 여과된다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 설명된 방법에 관한 것으로, 팽창 용액은 분자량 차단 필터를 통한 원심 분리에 의해 여과된다.
본 발명의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 장점은 다수의 상이한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용할 때 교차 반응성이 설명된 바와 같이 최소로 감소되기 때문에 상이한 T 세포 특이성의 동시 확장을 허용한다는 것이다. 따라서 본 발명의 방법은 상이한 특이성을 갖는 다양한 T 세포를 함유하는 샘플에도 효과적이다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 단계의 샘플은 i) 적어도 2개의 다른 특이성, 예컨대 적어도 5개의 다른 특이성, 적어도 10개의 다른 특이성, 적어도 15개의 다른 특이성, 적어도 20개의 다른 특이성, 또는 적어도 50개의 다른 특이성을 갖는 T 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 용액은 적어도 2개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, 예컨대 적어도 5개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, 예컨대 적어도 10개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, 예컨대 적어도 15개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, 예컨대 20개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는, 또는 예컨대 적어도 20개의 다른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 같다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 상기 적어도 2개의 다른 특이성, 예컨대 적어도 5개의 다른 특이성, 예컨대 적어도 10개의 다른 특이성, 또는 예컨대 적어도 20개의 다른 특이성을 가진 T 세포는 동일한 샘플에서 동시에 자극되고 확장된다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i. 적어도 5개의 상이한 특이성을 갖는 T 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
ii. 샘플을 적어도 5개의 상이한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 확장 용액과 접촉시키는 단계,
iii. 배양으로 적어도 5개의 상이한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 적어도 5개의 상이한 특이성을 갖는 T 세포를 병렬 자극 및 확장하는 단계, 및
iv. 단계 iii)의 T 세포를 배양으로부터 획득하여 적어도 5 개의 상이한 특이성을 갖는 확장된 항원 특이적 T 세포 집단을 수득하는 단계.
확장된 T 세포를 포함하는 샘플 (sample)은 임의의 출처에서 유래할 수 있지만 일반적으로 혈액, 조직 또는 체액에서 추출된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 샘플은 말초 혈액 단핵 세포, 종양, 조직, 골수, 생검, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 림프액, 흉막액, 뇌척수액 및 활액으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서 기술된 방법에 따라 확장된 T 세포를 포함하는 샘플은 또한 줄기 세포 또는 TCR 변형/형질 도입된 세포로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 상의 pMHC 분자와의 상호 작용에 필요한 TCR을 발현하는 임의의 T 세포를 확장하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의한 확장에 적합한 T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T (natural killer T, NKT) 세포, 알파-베타 T 세포, 감마-델타 T 세포, NK 세포, 선천성 점막 관련 불변 T (mucosal-associated invariant T, MAIT) 세포 및 림포카인 활성화 킬러 (lymphokine-activated killer, LAK) 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
T 세포 수용체 (TCR) 유전자 요법은 종양 반응성 T 세포의 기존 존재에 의존하지 않으며, 정의된 암 항원성 펩티드를 선택하도록 허용한다. 이 접근법은 αβ-TCR 이종 이량체를 함께 형성하는 TCR-α 및 β 사슬을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 T 세포 간에 항원 특이성이 전달될 수 있다는 관찰을 기반으로 한다. 따라서, 종양 반응성 TCR을 코딩하는 유전자의 도입은 환자 유래 세포 (자가 유래) 또는 비 환자 유래 세포 (이종) 세포를 관심 항원으로 리디렉션하여 그렇지 않으면 부재 할 종양 반응성 T 세포 구획을 확립하는 데 사용할 수 있다. 지금까지 몇몇 TCR 공학적 치료 접근법은 고형 종양에서 임상 활성을 보여주었다. 이러한 TCR 치료 방법의 대부분은 TCR 형질 도입된 세포의 생체 외 확장에 의존한다. 이러한 세포는 자가 또는 이종 T 세포, NK 세포, MAIT 세포 또는 NKT 세포 일 수 있다. 암 특이적 TCR 유전자가 세포로 형질 도입되기 때문에 이들은 기존의 TCR 존재에 의존하지 않으므로 반드시 T 세포 일 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, T 세포는 CD8 T 세포, CD4 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포 및 선천성 점막 관련 불변 T (MAIT) 세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, T 세포는 CD8 T 세포이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, T 세포는 CAR T 세포이다.
확장된 T 세포 집단을 환자에게 재도입하여 치료적 관점에서 의미를 갖기 위해서는 추출된 T 세포를 임상적으로 관련된 수로 확장할 필요가 있다. 본 발명의 방법에 의한 T 세포의 확장은 대략 100 내지 3000 배일 수 있다. 환자에게 재도입하기 전에 이용 가능한 세포의 수는 105 내지 1012개의 세포 범위, 예컨대 105 내지 1010개의 세포 범위, 예컨대 106 내지 109개의 세포 범위 일 수 있다. 세포는 투여 경로에 따라 20 mL 내지 1 L의 부피로 투여된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, T 세포는 임상적으로 관련된 수로 확장된다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대해 전술한 바와 같이, MHC 클래스 I 분자는 다양한 항원성 펩티드를 제공할 수 있다. 항원성 펩티드의 선택과 관련하여 동일한 고려 사항이 방법에 적용된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, pMHC의 항원성 펩티드는 암 관련 에피토프 또는 바이러스 에피토프이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 항원성 펩티드는 암 관련 에피토프 또는 바이러스 에피토프를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 암 관련 에피토프는 바이러스 유발 암과 관련된 바이러스 에피토프이다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 설명된 방법에 관한 것으로, 바이러스 에피토프는 인유두종 바이러스 (human papillomavirus, HPV), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스 (Merkel cell polyomavirus, MCV), 거대 세포 바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV), 인간 T 림프절 바이러스 (human T-lymphotropic virus, HTLV), B 형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV), C 형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV) 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택된다.
확장된 T 세포 집단의 사용
본 발명의 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단은 입양 면역 요법 (또는 입양 세포 전달)에 초점을 맞춘 치료 요법에 효과적으로 사용될 수 있다고 생각된다. 이러한 치료 요법에서, 치료가 필요한 피험자로부터 면역 반응 T 세포를 추출한다. 대상체는 인간, 소, 돼지, 새, 개, 고양이, 마우스, 쥐 등과 같은 임의의 포유 동물 일 수 있다. T 세포의 공급원은 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포, 종양, 조직, 골수, 생검, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 림프액, 흉막액, 뇌척수액 또는 활액 일 수 있다.
대상체로부터 추출되면, 원하는 특이성 또는 특이성의 T 세포를 포함하는 샘플은 대상체 및 치료될 상태 또는 질병에 맞춤화 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 확장된다. 이러한 확장은 전술한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 수행된다. T 세포 집단이 임상적으로 관련된 수로 확장되면, 면역 반응을 유도하고 질병을 치료하기 위해 피험자에게 투여된다.
결과적으로, 본 발명의 일 측면은 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 T 세포 집단은 항원 특이적 세포의 높은 분획, 멀티 사이토 카인 분비 프로파일, 젊은 표현형 (young phenotype) 및 덜 피로와 같은 여러 유리한 특성을 갖는다. 멀티 사이토 카인 분비 프로파일은 INF-γ 및 TNF-α의 동시 분비 및 세포 독성 탈과립을 특징으로 할 수 있다. 젊은 표현형은 예컨대 CD28과 같은 활성제의 높은 발현을 특징으로 할 수 있다.
감소된 피로는 예컨대 PD1과 같은 저해제의 낮은 발현을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 확장된 T 세포 집단은 다음으로부터 선택된 적어도 하나, 예컨대 적어도 2개, 예컨대 적어도 3개의 특징을 갖는다:
i. 배양 2주 후 항원 특이적 T 세포가 10배 이상 확장되고,
ii. 나중에 항원 공격 시 INF- γ 및 TNF-α의 분비,
iii. CD28의 높은 발현, 및
iV. PD1의 낮은 발현.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 확장된 T 세포 집단은 다음의 특징을 포함한다:
i. 배양 2주 후 항원 특이적 T 세포가 10배 이상 확장되고, 및
ii. 나중에 항원 공격 시 INF- γ 및 TNF-α의 분비.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 확장된 T 세포 집단은 다음 특징을 포함한다:
i. 배양 2주 후 항원 특이적 T 세포가 10배 이상 확장되고,
ii. 나중에 항원 공격 시 INF- γ 및 TNF-α의 분비,
iii. CD28의 높은 발현, 및
iv. PD1의 낮은 발현.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 2주 배양 후 항원 특이적 T 세포는 적어도 10 배, 예컨대 적어도 25 배, 예컨대 적어도 50 배, 예컨대 적어도 100 배, 예컨대 적어도 1000 배, 예컨대 적어도 5000 배 이상 확장된다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 2주 배양 후 항원 특이적 T 세포는 10 내지 5000 배 범위, 예컨대 100 내지 1000 배 범위로 확장된다.
본 발명의 추가적인 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, CD28의 높은 발현은 CD28의 발현이 샘플에서 확장되지 않은 비특이적 T 세포의 CD28 발현과 비교하여 적어도 2배 발현 증가, 예컨대 적어도 5배 발현 증가, 예컨대 적어도 10배 발현 증가된 것이다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, PD1의 낮은 발현은 샘플에서 확장되지 않은 비특이적 T 세포의 PD1 발현과 비교하여 최대 절반 (50%)에서 PD1 발현, 예컨대 최대 1/4 (25%) 발현, 예컨대 최대 1/10 (10%) 발현으로 정의된다.
본 발명의 네 번째 측면은 약학적 용도로 사용되는 본 발명에 있어서 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 질환 또는 장애의 입양 면역 요법 방법에 관한 것이다:
i. 피험자로부터 T 세포를 포함하는 샘플을 추출하는 단계,
ii. 상기 샘플을 본 발명에 있어서 인공 항원 제시 스캐폴드를 포함하는 확장 용액과 접촉시키는 단계,
iii. 배양으로 인공 항원 제시 스캐폴드에 대한 특이성을 갖는 T 세포를 자극 및 확장하는 단계,
iv. 단계 iii) 의 T 세포를 배양으로부터 획득하여 확장된 항원 특이적 T 세포 집단을 수득하는 단계, 및
v. 확장된 항원 특이적 T 세포 집단을 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계.
인공 항원 제시 스캐폴드에 대해 상술한 바와 같이, MHC 클래스 I 분자는 다양한 항원성 펩티드를 제공할 수 있다. 항원성 펩티드의 선택에 관한 동일한 고려 사항이 본 발명의 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단의 사용에 적용된다.
따라서, 본 발명의 다른 일 측면은 암 또는 바이러스 상태의 치료에 사용하기 위해 본 발명에 있어서 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 암은 바이러스 상태와 관련이 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 있어서 상기 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단에 관한 것으로, 바이러스는 인유두종 바이러스 (human papillomavirus, HPV), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스 (Merkel cell polyomavirus, MCV), 거대 세포 바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV), 인간 T 림프절 바이러스 (human T-lymphotropic virus, HTLV), B 형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, HBV), C 형 간염 바이러스 (hepatitis C virus, HCV) 및 인플루엔자 바이러스로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서 방법에 의해 수득 된 확장된 T 세포 집단은 하나 이상의 보조제 및/또는 부형제 및/또는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물로 제형화 될 수 있다. 부형제는 완충제, 현탁제, 분산제, 가용 화제, pH 조절제 및/또는 보존제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
약학적 조성물은 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 경피 또는 경구와 같은 임의의 경로를 통한 국소 또는 전신 투여를 위한 입양 면역 요법(또는 입양 세포 전달)에 사용될 수 있다.
본 발명의 측면 중 하나의 맥락에서 설명된 일 양태 및 특징은 본 발명의 다른 측면에도 적용된다는 점에 유의해야 한다.
본 출원에 인용된 모든 특허 및 비 특허 문헌은 그 전체가 본 발명에 참고로 포함된다.
본 발명은 종양 퇴행 또는 바이러스 제거를 매개하기 위해 이상적인 표현형 및 기능적 특성을 얻기 위해 세포에 특정 기능적 자극을 제공하는 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell, 인공 항원 제시 세포) 스캐폴드에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 스캐폴드는 항원성 펩티드가 없는 안정화된 MHC 클래스 I 분자를 포함한다. 스캐폴드는 필요에 따라 항원성 펩티드를 로드 할 수 있으며, 펩티드-MHC-지향 방식으로 특정 T 세포의 효과적인 확장 및 기능적 자극을 위한 민첩한 플랫폼을 제공한다.
도 1a는 예시적인 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드에 대한 개략적 개요를 나타낸다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 언로드된 MHC 클래스 I 분자 (또는 로드된 펩티드-MHC (pMHC) 클래스 I 분자)와 같은 주형 분자와 사이토 카인 또는 공동 자극 분자와 같은 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)가 부착된 백본으로 구성된다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 예가 제공되며, 백본 및 주형 분자의 다른 비율이 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 조립된다.
도 1b는 템플릿 분자의 조합을 신중하게 선택하는 방법에 대한 그림은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 결합될 수 있고 환자로부터 추출한 특정 T 세포 집단을 확장하는데 사용될 수 있다.
도 2a는 (A) PE (X-축) 및 APC (Y-축) 표지 된 사량체로 생체 외에서 직접 검출된 건강한 기증자로부터의 HLA-A1 FLU BP-VSD 특이적 CD8 T 세포의 빈도를 나타낸다. (B) 비율 1: 10: 5: 5: 5 (스캐폴드: pMHC: B7-2: IL-15: IL-21) 및 배양 배지에 첨가된 20 IU/ml IL-2의 인공 항원 제시 스캐폴드로 2주 배양한 후 HLA-A1 FLU BP-VSD 특이적 CD8 T 세포의 빈도, (C) 유리 FLU BP-VSD 펩티드, IL-15 및 IL-21, 또는 (D) 관련없는 펩티드 특이성을 전달하는 비율이 1: 10: 5: 5: 5인 인공 항원 제시 스캐폴드.
도 2b는 (E) HLA-A1 FLU BP-VSD 특정 CD8 T 세포의 빈도에 따른 확장 속도는, 확장 후 1 주 및 2 주 기준선에서 테트라머 염색에 의해 검출되었다. (F) 2주 확장 후 HLA-A1 FLU BP-VSD 특이적 CD8 T 세포의 절대 수.
도 3은 Cys 돌연변이체 및 야생형 MHC 분자로 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 CD8 T 세포의 기능을 비교하기 위한 HLA-A*02:01, FLU 58-66 GILGFVFTL 펩티드 (서열번호 20)로 자극한 후 CD8 T 세포 사이에서 TNF-α 및 IFN-γ의 발현에 대한 도트 플롯 (dot plots)을 나타낸다. HLA-A*02:01, 건강한 기증자 PBMC로부터 0.3% 초기 빈도 (왼쪽, pMHC 이중 색상 사량체 염색 플롯)의 특이적 CD8 T 세포 FLU 58-66 GILGFVFTL은 1: 8: 8: 8 비율로 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 10일 동안 확장되었다 (스캐폴드: pMHC: IL-2: IL-21). TNF-α 항체는 PE-Cy7 표지 (Y축)이고 IFN-γ 항체는 APC 표지 (X 축)이다. 이러한 염색은 중복으로 이루어졌으며 각 염색 중 하나만 표시된다.
도 4는 Cys 돌연변이체 및 야생형 MHC 분자로 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 CD8 T 세포의 기능을 비교하여 HLA-A*02:01, EBV BMF1 GLCTLVAML 펩티드 (서열번호 21)로 자극 후 CD8 T 세포 중 TNF-α 및 IFN-γ의 발현에 대한 도트 플롯 (dot plots)을 나타낸다. HLA-A*02:01, 건강한 기증자 PBMC의 초기 빈도가 0.05 % 인 EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 CD8 T 세포 (왼쪽, 확장 전, pMHC 이중 색상 사량체 염색 플롯)는 1: 8: 8: 8 (스캐폴드: pMHC: IL-2: IL-21) 비율로 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 10 일 동안 확장하고 EBV BMF1 GLCTLVAML 펩티드로 자극했다. 확장 배양 후 펩티드 자극에 사용된 관련 없는 펩티드 (HLA-A*02:01 HIV Pol ILKEPVHGV (서열번호 23)) 특이성을 가진 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 음성 대조군으로 사용했다. TNF-α 항체는 PE-Cy7 표지 (Y 축)이고 IFN-γ 항체는 APC 표지 (X 축)이다. 이러한 염색은 중복으로 이루어졌으며 각 염색 중 하나만 표시된다.
도 5는 조립 후 Cys 돌연변이 MHC (즉, 로드 가능한) 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 확장 효율을 항원 로드 된 스캐폴드의 사전 조립 (Cys 돌연변이 또는 야생형 MHC)과 비교하였을 때 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 확장된 HLA A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV (서열번호 22) 특이적 CD8 T 세포의 사량체 염색 도트 플롯을 나타낸다. 도 5A는, HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV 특이적 CD8 T 세포의 기준선 빈도 (pMHC 특이적 이중 양성 사량체에 의해 결정된 총 CD8 T 세포의 %). 도 5B는, 10일 동안 확장된 HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV 특정 CD8 T 세포 비교 및 Cys 돌연변이 MHC가 있는 조립 후 펩티드-항원로드 인공 항원 제시 세포에 걸쳐 pMHC 특이적 PE 사량체를 사용하여 정량화, Cys 돌연변이 MHC가 있는 사전 로드 된 인공 항원 제시 세포, 및 야생형 MHC가있는 사전로드 된 인공 항원 제시 세포.
도 6은 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 CD8 T 세포의 기능을 Cys 돌연변이 MHC가 있는 조립 후 펩티드 항원 로드 된 인공 항원 제시 세포, Cys 돌연변이체 MHC가 있는 사전로드 된 인공 항원 제시 세포 및 야생형 MHC가 있는 사전로드 된 인공 항원 제시 세포로 확장된 기능을 비교하여 HLA-A*02:01, CMV pp65 NLVPMVATV 펩티드 (서열번호 22)로 자극 후 CD8 T 세포 사이에서 TNF-α 및 IFN-γ 의 발현을 나타내는 도트 플롯이다. TNF-α 항체는 PE-Cy7 표지 (Y 축)이고 IFN-γ 항체는 APC 표지 (X 축)이다. 이러한 염색은 중복으로 이루어졌으며, 각 염색 중 하나만 표시된다.
도 7은 HLA-A*02:01, EBV BMF1 GLCTLVAML 펩티드 (서열 번호 21)로 자극한 후 TNF-α 및 IFN-γ 이중 양성 CD8 T 세포의 도트 플롯을 나타낸다. HLA-A*02:01, 건강한 기증자 PBMC의 EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 CD8 T 세포는 Cys 돌연변이 MHC를 갖는 조립 후 펩티드-항원로드 인공 항원 제시 세포에 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 걸친 확장된 CD8 T 세포의 기능, Cys 돌연변이 MHC가 있는 사전로드 된 인공 항원 제시 세포, 야생형 MHC가있는 사전 로드 된 인공 항원 제시 세포를 비교하기 위해 aAPC 스캐 폴드 1: 8: 8: 8 (스캐폴드: MHC/pMHC: IL-2: IL-21)을 사용하여 10 일 동안 확장되었다 (도 7B). TNF-α 항체는 PE-Cy7 표지 (Y 축)이고 IFN-γ 항체는 APC 표지 (X 축)이다. 이러한 염색은 중복으로 이루어졌으며 각 염색 중 하나만 표시된다. 기증자 PBMC에서 기준 HLA-A*02:01, EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 CD8 T 세포는 전체 CD8 T 세포의 %로 pMHC 특이적 이중 색상 사량체로 측정한 것으로 나타낸다 (도 7A).
도 8은 wt MHC (상단 패널) 또는 Cys 돌연변이 pMHC 사량체 (하단 패널)로 제조된 pMHC 사량체를 사용한 HLA-A*02:01 항원 특이적 CD8 T 세포의 TCR 인식을 비교하는 유세포 분석의 도트 플롯을 나타낸다. Cys 돌연변이체 MHC가 wt MHC와 비교하는 방식으로 CD8 T 세포 TCR을 인식하는지 확인하기 위해 4 가지 다른 항원 특이성을 분석했다. CD8 양성 T 세포는 총 CD8 T 세포의 백분율로 표시되고 두 가지 색상으로 감지되므로 이중 양성 도트 플롯 (X 및 Y 축)이 있다.
도 9는 HLA-A*01: 01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 펩티드 (서열 번호 30)로 자극 후 CD8 T 세포의 확장을 보여준다. (A) 각각 형광 마커 PE 및 BV605로 각각 표지 된 MHC 사량체를 사용한 말초 혈액에서 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 특이 적 CD8 T 세포의 식별. (B) neo2/15 + pMHC Ag 스캐폴드를 사용한 2 주 확장 후 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 특이적 CD8 T 세포의 집단. CD8 T 세포 (Y 축)와 BV605 (x 축)로 표시된 MHC 사량체 양성 T 세포가 묘사되어 있다. 인구는 확장 전 전체 CD8 T 세포 중 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 특이적 CD8 T 세포의 0.6 %에서 확장 후 8.4 %로 향상되었다. (C) 항원 노출에 반응하는 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 특이적 CD8 T 세포의 능력. 모든 T 세포의 40 %는 다중 사이토 카인 분비로 반응한다.
본 발명은 이하에서 보다 상세히 설명될 것이다.
본 발명은 이제 다음의 비 제한적인 실시예에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.
실시예 1: 인공 항원 제시 스캐폴드 (antigen presenting scaffold)를 사용한 항원 특이적 CD8 T 세포의 확장 (도 2a 및 2b)
건강한 공여자로부터의 HLA-A1 FLU BP-VSD (VSDGGPNLY (서열 번호 29)) 특이 적 CD8 T 세포는 1: 10: 5: 5: 5 (스캐폴드: pMHC: B7-2: IL-15: IL-21) 비율의 인공 항원 제시 스캐폴드, 유리 FLU BP-VSD 펩티드 (서열번호 29), IL-15, 및 IL-21 사이토 카인, 또는 MHC 복합체에서 관련없는 펩티드 특이성을 운반하는 1: 10: 5: 5: 5 비율의 인공 항원 제시 스캐폴드의 존재 하에 병렬로 확장되었다. 인공 항원 제시 스캐폴드는 야생형 MHC로 준비되었다. 모든 배양물에 20 IU/ML IL-2를 보충하고 2주 동안 배양하였다. HLA-A1 FLU BP-VSD 특이적 CD8 T 세포의 확장은 일주일에 한 번 사량체 염색 (tetramer staining)에 의해 추적되었다. 대표적인 도트 플롯을 도 2a에 나타내었다.
결론: (도 2a) 이 실험은 인공 항원 제시 스캐폴드를 사용하여 pMHC 지시 방식으로 낮은 빈번한 기준선 반응으로 항원 특이적 CD8 T 세포를 확장하는 것이 가능함을 입증한다. 배양액에 자유롭게 첨가된 펩티드, IL-15 및 IL-21로 자극된 세포와 항원 제시 스캐폴드로 자극된 세포의 확장을 비교하면, 인공 항원 제시 스캐 폴드로 자극된 세포가 특정 CD8 T 세포의 빈도와 절대 수 모두에서 가장 많이 확장되었다는 것이 분명하다 (도 2b 참조). 더욱이, 무관한 펩티드 MHC 특이성을 지닌 인공 항원 제시 스캐폴드는 A1 FLU BP-VSD 특이적 CD8 T 세포 확장을 자극할 수 없었으며, 이는 세포가 pMHC 지시된 상호 작용이 확립되지 않으면 공동 부착된 사이토 카인 및 공동 자극 분자로부터 이익을 얻을 수 없음을 입증했다.
실시예 2: Cys 돌연변이 MHC (항원/펩티드 수용) 생산 및 특정 T 세포 확장을 위한 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드 조립
여기에서는 MHC 복합체와 사이토 카인 및 자극 분자와 같은 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)를 스트렙타비딘-비오틴 상호 작용을 통해 덱스트란에 결합하여 인공 항원 제시 세포 스캐 폴드를 만드는 방법을 설명한다. 본 실시예에서, wt MHC 및 이황화 안정화된 Cys 돌연변이 MHC 둘 모두는 준비가 되어 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 조립에 사용되었다. 원칙적으로, 비오틴-스트렙타비딘은 임의의 이량체화 도메인으로 대체될 수 있으며, 여기서 이량체화 도메인의 절반은 MHC 복합체 또는 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)에 결합되고 다른 절반은 덱스트란 또는 유사한 스캐폴드 백본에 결합된다.
스트렙타비딘 변형 덱스트란은 Fina Biosolutions의 MW 250 KDa, 750 KDa, 2000 KDa 및 약 270 KDa의 덱스트란을 갖는 이뮤덱스 (Immudex)와 같은 다양한 크기의 덱스트란으로 시판된다.
wt MHC 및 Cys 돌연변이 MHC 둘 다 고전적인 E. Coli 발현에 의해 생산되었으며, 여기에서는 각각의 Avi-태그를 갖는 wt HLA-A 02:01 및 Avi-태그를 갖는 Cys 돌연변이체 HLA-A 02:01의 중쇄 (서열번호 14)의 사용이 예시된다. 간단히 말해서, wt MHC 및 Cys 돌연변이 MHC 단백질과 경쇄 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 단백질은 pET 시리즈 플라스미드를 사용하여 대장균에서 생산되었다. E. Coli 생산 단백질을 함유하는 봉입체를 초음파 처리에 의해 수확하고, 용해 완충액 (Tris Cl 50 mM, pH 8.0, 1 mM EDTA, 25 % 수크로스) 에서 E. Coli 세포를 용해시켰다. 변성 단백질의 가용성 분획은 세제 완충액 (Tris-Cl 20mM, pH 7.5, 200mM NaCl, 2mM EDTA, NP40 1 %, 데옥시콜산 1 %) 및 세척 버퍼 (0.5 % Triton X-100, 1mM EDTA)로 세척하여 봉입체로부터 수확되었고, 재-가용화 완충액 (HEPES 50mM, pH 6.5, 8M 요소, 0.1mM β-메르캅토에탄올)에서 4 ℃에서 48 시간 배양 및 -80 ℃에서 MHC 클래스 I 모노머 생산에 사용될 때까지 보관하였다.
Cys 돌연변이 MHC 모노머는 Cys 돌연변이 MHC 단백질 및 예컨대 예를 들어, 디펩티드/트리펩티드/소분자와 같은 헬퍼 분자가 있는 B2M의 시험관 내 폴딩 (폴딩버퍼: 100 mM Tris-Cl, pH 8.0, 400 mM L-아르기닌 (arginine), 2 mM EDTA, 및 프로테아제 억제제 칵테일 (protease inhibitor cocktail))에 의해 만들어졌다. wt MHC는 헬퍼 분자가 포함되지 않았다는 점을 제외하고 Cys 돌연변이 MHC 단량체처럼 만들어졌다. 대신에 wt MHC 분자는 UV-불안정성 펩티드 KILGFVF-XV (서열 번호 24)의 존재 하에 재접힘 되었으며, 여기서 X는 UV 민감성 아미노산 인 3-아미노-2- (2-니트로페닐) 프로피온산을 나타내며, 자외선에 노출되면 전체 길이의 펩티드가 깨진다. 생성된 절단된 펩티드 단편의 MHC 분자에 대한 감소된 결합 친화성은 들어오는 교환 항원성 펩티드의 결합을 가능하게 한다.
MHC 단량체는 통상적인 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 대안적으로, 다른 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography)에 의한 Cys 돌연변이 MHC 단량체의 정제는 디펩티드 글리신-류신과 같은 MHC 단량체 안정화 도우미 분자가 있거나 없는 버퍼를 사용하여 수행할 수 있다.
항원성 펩티드 (빈 MHC 단량체)가 없는 이렇게 생산된 안정한 Cys 돌연변이 MHC 단량체는 다양한 연구, 진단 및 치료 용도를 위한 다수의 항원성 펩티드 로드 MHC 단량체 (antigenic peptide loaded MHC monomers)의 신속한 생성에 매우 유용하다. 항원 펩티드 로드 Cys 돌연변이 MHC (pMHC) 단량체는 100 μM 펩티드와 200 μg/mL Cys 돌연변이 빈 MHC 단량체를 실온에서 30 내지 60 분 동안 배양하여 제조할 수 있다. Wt pMHC는 선택한 200 μM 항원-펩티드를 포함하고 모노머를 360 nm에서 1 시간 동안 UV 광선에 노출시킴으로써 UV 불안정한 펩티드가 있는 MHC 단량체로부터 생성될 수 있다.
사이토 카인 및 보조 자극 분자와 같은 pMHC 및 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)는 표준 화학 및 효소 프로토콜 모두에 의해 비오틴화 될 수 있다. 예를 들어, pMHC는 BirA 효소 및 유리 비오틴을 사용하여 부위 특이적 비오틴화를 허용하는 MHC 중쇄에 비오틴화 컨센서스 펩티드 서열을 포함함으로써 효소적으로 비오틴화 될 수 있다. 사이토 카인 및 공동 자극 분자는 바이오레전드 (BioLegend) 및 프리프로테크 (PreProtech)와 같은 공급 업체에서 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 단백질은 ThermoFisher Scientific의 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin과 같은 상용 비오틴화 시약을 사용하고 공급 업체의 프로토콜에 따라 반응하여 쉽게 비오틴화 된다.
본 발명의 실시예에 있어서, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 스트렙타비딘-비오틴 상호 작용을 통해 조립되었다. 요약하면, 비오티닐화 된 분자 및 스트렙타비딘 접합된 덱스트란을 PBS와 같은 수성 완충액에서 아래 설명된 실시예에 따라 상대 화학량론으로 조합하여 60 nM 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 최종 농도를 제공했다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 4 ℃에서 1 시간 동안 조립하고 그 후 세포 배양에 첨가할 때까지 4 ℃에서 보관했다. 조립된 스캐폴드는 최소 1 개월 동안 4 ℃에서 보관할 수 있다. 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 결합되지 않은 분자를 아미콘 울트라 (Amicon Ultra) 원심 분리 필터 유닛 Ultra-4, MWCO 100 kDa와 같은 MW 차단 필터를 통해 원심 분리하여 결합되지 않은 항원 펩티드, pMHC, 사이토 카인 및 공동 자극 분자로부터 정제 및 분리할 수 있다.
T 세포 배양은 인간 PBMC 또는 TILs로부터 확립되었고 48 웰 평평한 바닥 배양 플레이트에서 2x106 세포/ml로 시작되었고 37 ℃ 및 5 % CO2에서 2 주 동안 배양되었다. 5 % 열 불활성화 된 인간 혈청이 보충된 1 mL 신선한 X-VIVO 15 배지에 0.2 nM 최종 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 첨가하여 세포를 주 2회 자극하였다. 배양 1 주 후, 세포를 24 웰 평평한 바닥 배양 플레이트로 옮기고, 유세포 분석법에 의해 항원 특이적 CD8 T 세포의 확장을 추적하기 위해 MHC 테트라머 염색을 위한 배양물에서 일주일에 한 번 샘플을 채취했다.
실시예 3: Cys 돌연변이 MHC 모노머를 사용하여 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용한 항원 특이적 CD8 T 세포의 확장 및 야생형 MHC 모노머로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 비교한 기능 평가 (도 3 내지 4)
FLU 58-66 GILGFVFTL (서열번호 20)에 대한 Cys 돌연변이 MHC 클래스 I HLA-A*02:01 단량체 및 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열번호 21)에 대한 Cys 돌연변이 MHC 클래스 I HLA-A*02:01 단량체 및 이들 인공 항원 제시 세포를 사용하는 건강한 공여자 PBMC로부터의 특정 CD8 T 세포 확장 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 사용의 조립 설명에 관한 것이다. 야생형 MHC 클래스 I HLA-A*02:01 모노머로부터 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 비교 기능 평가가 제공된다. 데이터는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 단량체는 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었다. 간단히 말해서, Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 DNA 서열 (서열번호 14) 및 야생형 인간 B2M (서열번호 15) 구축물을 포함하는 중쇄 구축물은 이러한 단백질을 생산하기 위해 E.Coli 발현 균주 pLysS로 형질 전환되었다. 발현된 단백질을 포함하는 봉입체는 용해 완충액에서 초음파 처리를 사용한 다음 세제 완충액으로 세척하고, 4 ℃에서 48 시간 동안 세척 완충액 및 단백질을 요소 완충액에 용해시켜 단백질의 변성 된 가용성 분획을 수집하는 표준 절차에 의해 수확되었다. 야생형 HLA-A* 02:01의 가용성 변성 단백질을 생산하기 위해 유사한 절차를 따랐다.
Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 의 변성 가용성 분획을 접어 Cys 돌연변이 HLA-A*02:01의 단량체를 생성했다. Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 및 B2M의 중쇄 단백질은 디펩티드 글라이신-류신 (Dipeptide Glycine-Leucine (GL))의 존재하에 Tris-Cl 100 mM, pH 8.0, L-Arginine 400 mM 및 EDTA 2 mM을 포함하는 폴딩 버퍼에서 1: 2 몰비로 혼합되었다. 폴딩 후, 단량체는 Avi-tag의 프로토콜에 따라 30 ℃에서 1 시간 동안 비오틴-단백질 리가제 효소 반응을 사용하여 중쇄에 포함된 Avi-태그 서열에서 비오틴화 되었다. Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 의 비오틴화 된 단량체는 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC, Waters Corporation, USA)에 의해 정제되었다. 폴딩 반응에는 HLA-A*02:01 특정 항원 펩티드가 포함되지 않았기 때문에 Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 단량체는 비어 있고 펩티드를 수용한다. 정제 후 Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 단량체의 품질 평가를 단백질 농도 및 비오틴화에 대해 수행하고 추가 사용까지 -80 ℃에 보관했다.
야생형 HLA-A*02:01 모노머는 위에 설명된 것과 유사한 과정에 의해 제조되었지만, UV-불안정한 HLA-A*02:01- 특이적 펩티드 (서열번호 24)의 존재하는 야생형 MHC의 접힘과 안정성에 필수적이다. 따라서 정제되고 비오틴화 된 야생형 HLA-A*02:01 모노머는 항상이 펩티드 관련 형태에 있을 것이다.
FLU 58-66 GILGFVFTL (서열번호 20) 또는 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열번호 21)에 특이적인 Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 을 사용하여 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하기 위해 PBS에서 희석된 각 특이성의 100μM 펩티드는 다음과 같다. 100 μg/mL Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 모노머와 60 분 동안 PBS에서 20 μL 반응으로 혼합한다. 동시에, IL-2 및 IL-21을 덱스트란 스캐폴드와 함께 30 분 동안 배양하여 사이토 카인 IL-2 및 IL-21을 1: 8: 8 몰비로 덱스트란 스캐폴드에 조립하였다. 이러한 조립된 사이토 카인 덱스트란 스캐폴드에 항원 특이적 Cys 돌연변이 HLA-A *02:01 단량체를 1:8의 몰비로 첨가하고, 30분 동안 배양하여 백본, pMHC, IL-2, IL-21 비율이 1: 8: 8: 8인 항원 제시 스캐폴드를 생성하였다. 20 μM D-Biotin을 추가하고 20 분 동안 배양하여 스캐폴드에서 가능한 모든 유리 스트렙타비딘 부위를 차단했다.
야생형 HLA-A*02:01 단량체가 사전 결합된 펩티드와 연관되었기 때문에, FLU 58-66 GILGFVFTL (서열번호 20) 또는 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열번호 21)에 특이적인 야생형 HLA-A*02:01을 사용하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 사전 결합된 펩티드를 FLU 58-66 GILGFVFTL 또는 EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 펩티드로 교환하기위한 추가 단계를 필요로 한다. 100 μg/ml 야생형 HLA-A*02:01 모노머를 PBS에서 200 μM 항원성 펩티드와 혼합하여 총 부피가 20 μL이 되도록 하고 사전 결합된 UV 불안정한 펩티드와 항원 특이적 펩티드의 교환을 촉진하기위해 UV 램프 (366nm)에서 60 분 동안 배양한다. 반응 후, Cys 돌연변이 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대하여 상기 설명한 바와 같이 1: 8: 8: 8 (백본: pMHC: IL-2: IL-21)의 몰비로 야생형 HLA-A* 02:01 단량체 및 사이토 카인을 사용하여 인공 항원 제시 세포를 조립하였다. 스캐폴드는 T 세포 확장에 사용될 때까지 4 ℃에서 보관된다.
Cys 돌연변이 및 FLU 58-66 GILGFVFTL 및 EBV BMF1 GLCTLVAML에 특이적인 야생형 HLA-A*02:01 분자를 사용하여 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 평가하고 비교하기 위해, 이 두 가지 유형의 스캐폴드를 사용한 병렬 배양은 각 특이성에 해당하는 두 개의 서로 다른 건강한 기증자의 PBMC를 사용하여 설정되었다. 양성 특이성의 스캐폴드와 함께, 관련없는 펩티드 (HLA-A*02:01 HIV Pol ILKEPVHGV (서열번호 23))로 만든 음성 대조군 스캐폴드도 포함되었다. 모든 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 기반 T세포 확장은 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 48 웰 평평한 바닥 세포 배양 플레이트에서 특이성 당 2x106 PBMC로 시작되었다. 각 특이성의 3μl 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 2 일 또는 3 일에 4 회씩 첨가하고 2 주 동안 배양을 유지하였다. 10 개의 샘플을 수집하여 항원 특이적 자극에 의해 유도된 세포 내 사이토 카인 염색을 사용하여 확장을 테스트하였다. 각 특이성의 확장된 세포는 300.000 세포/100 μL의 세포 농도에서 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 2 시간 동안 5 μM 관련 항원 펩티드로 챌린지되었다. 항원성 펩티드로 배양한 후, 확장된 세포를 세척하고 먼저 관련 세포 표면 항체 (CD3, CD4, CD8 및 생존 성 염료)로 염색한 다음 세포 투과 완충액을 사용하여 TNFα (PE-Cy7) 및 IFNγ(APC)에 대한 세포 내 염색을 수행했다. 그런 다음 세포를 고정하고 유세포 분석기로 분석했다. 본 발명에 있어서 두 개의 항원성 펩티드를 사용한 예가 제공된다. 그러나, 본 발명은 한정된 항원 펩티드 세트로 제한되지 않는다. 다른 관련 펩티드는 서열번호 25 내지 28을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
결론: (도 3 및 도 4) 본 실험은 FLU 58-66 GILGFVFTL (도 1a 및 1b) 및 EBV BMF1 GLCTLVAML (도 2a 및 2b) 항원을 제시하기 위해 HLA-A*02:01 단백질의 Cys 돌연변이 변이체가 사용된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용함으로써 pMHC 지시 방식으로 낮은 빈번한 기준선 반응으로 항원 특이적 CD8 T 세포를 확장하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다 (demonstrate). 본 예는 항원 특이적 T 세포의 확장을 위한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 신속한 생산 및 항원 다양화를 위한 Cys 돌연변이 MHC의 사용이 가능함을 나타낸다.
Cys 돌연변이 MHC 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 CD8 T 세포는 FLU 58-66 GILGFVFTL (도 1a 및 1b) 및 EBV BMF1 GLCTLVAML (도 2a 및 2b)에 대한 항원성 펩티드 특이적 확장된 CD8 T 세포에 의한 세포 내 사이토 카인 (TNFα 및 IFNγ)방출에 의해 보여주는 바와 같이 야생형 MHC로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 기능적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 기능적 분석은 또한 Cys 돌연변이 MHC가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 관련없는 펩티드 특이적 CD8 T 세포의 확장이 관찰되지 않았기 때문에 항원 특이적 세포만 확장함을 확인하였다.
실시예 1에서, wt MHC 분자로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 자극된 세포는 자유 항원성 펩티드 및 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)를 사용한 확장 및 자극에 비해 특정 CD8 T 세포의 빈도 및 절대 수 측면에서 우수한 확장을 나타냄을 보여준다. 본 실시예에서 Cys 돌연변이 MHC 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 wt MHC 분자로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 유사한 효율로 CD8 T 세포를 확장하고 자극하는 것으로 입증되었다. 결과적으로 Cys 돌연변이 MHC 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 분자에 영향을 미치는 자유 항원 펩티드 및 T 세포를 사용하는 확장 및 자극보다 우수하다.
실시예 4 : 디설파이드 안정화 된 빈 MHC 클래스 I을 사용한 항원 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드의 조립 및 인공 항원 제시 세포를 사용한 특정 T 세포 확장 (도 5 내지 7)
여기에서는 항원 펩티드 없이 Cys 돌연변이 MHC를 사용하여 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하는 방법을 설명한다. 이러한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 항원성 펩티드를 수용하고 사전에 예를 들어, 암 펩티드 항원이 전체 종양 시퀀싱에서 확인되는 맞춤형 암 면역 요법에 관련한 항원 식별을 생성할 수 있다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 인공 항원 제시 스캐폴드의 조립 (사전 조립) 전에 항원성 펩티드를 MHC로 로딩하는 것과 반대로, Cys 돌연변이 MHC 단량체로의 항원 성 펩티드의 로딩이 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 조립 (조립 후) 후에 수행된다는 점을 제외하고 실시예 2 및 3에 설명된 대로 본질적으로 조립된다.
빈 MHC 분자가 있는 이러한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 단일 단계에서 관심 항원 펩티드로 로드 될 수 있으며, 이에 따라 이들을 pMHC 특정 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 변환할 수 있다. 이러한 항원 수용 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 각 pMHC 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생성하기 위한 처리 시간을 제거하고 각 pMHC 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 빈 MHC 분자가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 안정된 마스터 배치로부터 생성되기 때문에 배치 특정 변이를 제한한다.
건강한 공여자 PBMC로부터 HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV (서열번호 22) 특이적 CD8 T 세포를 확장하기 위한 이러한 적재 가능한 (조립 후) 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 사용이 여기에 설명되어 있다. Cys 돌연변이 MHC 및 야생형 MHC 분자를 사용하여 사전 로드 된 항원 펩티드가 있는 (사전 조립된) 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 조립된 후 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 정량적 확장 효율 비교는 도 5에 나타내었다. HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV에 특이적인 이러한 확장된 CD8 T 세포의 기능은 조립 후 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, Cys 돌연변이 MHC가 있는 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 및 야생형 MHC가있는 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 사이토 카인 방출을 측정하여 결정되었다. (도 6).
일반적인 개념 증명, 조립 후 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용한 CD8 T 세포 확장 검증은 상이한 건강한 공여자 PBMC로부터의 HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열 번호 21) 특이적 CD8 T 세포의 확장 및 기능성 평가에 의해 수행되었다. 결과는 Cys 돌연변이 MHC가있는 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 및 야생형 MHC가 있는 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 의한 확장과 비교되었다 (도 7).
빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하기 위해, 항원성 펩티드가 즉시 로딩되지 않은 것을 제외하고는 실시예 2에 기술된 바와 같이 Cys 돌연변이 MHC 클래스 I 모노머를 생산하였다. 이러한 비오틴화 된 빈 MHC 단량체, 사이토 카인 및 공동 자극 분자를 스트렙타비딘-비오틴 상호 작용을 통해 스트렙타비딘 변형 덱스트란에 조립하여 빈 MHC 클래스 I 분자를 갖는 항원 수용 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생성하였다.
Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 분자를 사용하여 빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 조립하는 과정은 다음과 같이 수행되었다. 덱스트란 스캐폴드 백본은 PBS 버퍼에서 4 ℃에서 30 분 동안 1: 8: 8의 몰비로 비오틴화 된 IL-2 및 IL-21과 함께 먼저 배양되었다. 그 후, 100 μg/mL의 Cys 돌연변이 MHC (빈) 단량체를 첨가하고 그리고 4 ℃에서 30 분 동안 배양하여 1: 8: 8: 8의 몰비 (스캐폴드: Cys 돌연변이 MHC:IL-2: IL-21)를 갖는 조립 후 로딩 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생성한다. 덱스트란 백본에 남아있는 빈 스트렙타비딘 결합 부위는 20μM D-비오틴을 첨가하여 차단했다. 이러한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 항원 특이성을 포함하지 않기 때문에 HLA-A*02:01의 이러한 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 많은 배치를 추가로 사용할 때까지 4 ℃에서 보관했다.
HLA-A*02:01의 조립 후 로딩 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 평가하여 건강한 공여자 PBMC로부터 HLA-A* 02:01 CMV pp65 NLVPMVATV (서열 번호 22) 특이적 CD8 T 세포를 확장시켰다. 확장 배양을 시작하는 날, HLA-A*02:01의 빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 항원성 펩티드를 빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 직접 첨가하여 HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 전환되었다. 간단히 말해서, PBS에 희석된 100 uM 펩티드를 20 uL 빈 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 함께 배양하고 30분 동안 배양하였다. 조립 후 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 단일 단계로 변환하여 생성된 이러한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 확장 배양을 설정하는 데 사용되었다. 3 μL의 특정 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 2x106 PBMC에 추가하고 5 % 혈청이 보충된 X-vivo 배지의 48 웰 플레이트에서 배양을 시작했다. 그런 다음 2주 동안 3 μL 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 3 번 더 추가하여 배양을 2 주 동안 유지했다. 동시에, HLA -A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV 특이성의 유사한 확장 배양은 야생형 및 Cys 돌연변이 HLA-A*02:01 단량체로 만든 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 시작되었다. 이 설정의 확장 배양은 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 확장 효율성과 비교 평가를 위해 사용되었다. 10 일 후, 샘플을 수집하고 각 특이성의 CD8 T 세포 확장을 pMHC 사량체를 사용하여 각 특이성에 대해 결정했다 (도 5).
이러한 확장된 배양물로부터 다른 세트의 확장된 세포는 기능을 평가하고 세 가지 유형의 인공 항원 제시 스캐폴드 (Cys 돌연변이 MHC가 있는 조립 후 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, 사전 조립 로드 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 Cys 돌연변이 MHC 및 야생형 MHC로 사전 조립 로드 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드)를 비교하기 위해 수집되었다.
기능 평가를 위한 확장된 세포는 HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV 항원으로 챌린지 (challenge)하여 항원 자극 사이토 카인 TNFα 및 IFNγ를 세포 독성 사멸의 마커로 유도하고 검출했다. 이들 마커를 동시에 발현하는 CD8 T 세포는 높은 사멸 능력을 갖는 것으로 해석된다. 세포는 300000 세포/100 μL의 세포 농도에서 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 5 μM 관련 펩티드로 2 시간 동안 챌린지 (challenge) 되었다. 항원성 펩티드로 배양한 후, 확장된 세포를 세척하고 먼저 관련 세포 표면 항체 (CD3, CD4, CD8 및 생존성 염료)로 염색한 다음 세포 투과 완충액을 사용하여 TNFα (PE-Cy7) 및 IFNγ(APC)에 대한 세포 내 염색을 수행했다. 그런 다음 세포를 고정하고 유세포 분석기로 분석했다 (도 6).
조립 후 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 추가 검증 실험에서, HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열번호 21) 다른 건강한 공여자 PBMC로부터의 특정 CD8 T 세포는 조립 후 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 (1: 8: 8: 8)를 사용하여 확장되었다. 이 스캐폴드는 100 μM EBV BMF1 GLCTLVAML 펩티드를 20 μL 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 추가하여 항원 특이적 pMHC 스캐폴드로 변환하고 30 분 동안 배양하여 HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 생성했다. HLA-A*02:01 야생형 또는 Cys- 돌연변이 MHC 분자를 사용하는 EBV BMF1 GLCTLVAML 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성되었다.
HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML에 특정한 확장 배양은 48 웰 플레이트에서 건강한 기증자 PBMC의 세 가지 유형의 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 시작되었고 관련 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 3일 마다 자극과 함께 2 주 동안 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 유지되었다. 확장된 CD8 T 세포의 기능적 평가는 각 특이성에 대해 300.000 개의 세포를 수집하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 항원성 펩티드로 챌린지 (challenge) 한 후 세포 내 사이토 카인 방출을 측정함으로써 확장 10 일 후에 수행되었다. 간단히 말해서, 확장된 세포는 300.000 세포/100 μL의 세포 농도에서 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 2 시간 동안 5 μM EBV BMF1 GLCTLVAML 펩티드로 챌린지되었다. 항원성 펩티드로 배양한 후, 확장된 세포를 세척하고 먼저 관련 세포 표면 항체 (CD3, CD4, CD8 및 생존성 염료)로 염색한 다음 세포 투과 완충액을 사용하여 TNFα (PE-Cy7) 및 IFNγ(APC)에 대한 세포 내 염색을 수행했다. 그런 다음 세포를 고정하고 유세포 분석기로 분석했다 (도 7).
결론: (도 5 내지 7) 이 실험은 항원 펩티드 로딩의 단일 단계에서 항원 특이적 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 변환되는 조립 후 로딩 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 낮은 빈번한 기준선 반응으로 항원 특이적 CD8 T 세포를 확장하는 것이 가능함을 입증한다. 도 5는 기준선 (도 5A)에서 총 CD8 + T 세포의 0.18 %에서 총 CD8+ T 세포의 25 % (도 5B)로 확장되는 HLA-A*02:01 CMV pp65 NLVPMVATV (서열번호 22) CD8 T 세포에 특이적인 이러한 조립 후 로드 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 확장 효율을 보여준다. 효율성은 야생형 및 Cys 돌연변이 MHC 분자를 모두 사용하여 사전 조립된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 비슷했다. 항원 특이적 사이토 카인 방출로 측정하였을 때, 확장된 CD8 T 세포의 기능성은 세 가지 변종 (조립 후 Cys 돌연변이 MHC가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드, Cys 돌연변이 MHC가 있는 사전 조립로드 된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 및 야생형 MHC가 있는 사전 조립 로드 된 인공 항원 제시 세포) (도 6) 모두에서 비슷한 것으로 나타났다. 도 7의 결과는 상이한 공여자 PBMC로부터의 조립 후 로딩 가능한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 HLA-A*02:01 EBV BMF1 GLCTLVAML (서열 번호 21)에 특이적인 확장된 CD8 T 세포의 기능을 추가로 확립한다. 이것은 조립 후 로드 가능한 인공 항원 제시 세포가 효율적인 T 세포 자극을 제공함을 보여주고 다기능 T 세포를 활성화하며, 따라서 사용할 때까지 적재 가능한 형태로 4 ℃에서 보관할 수 있어 유리한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 제공하며 항원성 펩티드의 단일 단계 첨가에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 임의의 특이성으로 전환될 수 있다.
이들 예를 종합하면 항원 특이적 T 세포의 확장을 위한 인공 항원 제시 세포 스캐폴드의 신속한 생산 및 항원 다양화를 위한 빈 Cys 돌연변이 MHC의 사용이 가능함을 나타낸다. 이것은 환자 유래 암 특이적 T 세포의 신속한 확장이 긍정적 인 임상 결과를 위해 필수적인 입양 T 세포 전달 환경에서 유리하다.
본 발명에 있어서 두 개의 항원성 펩티드를 사용한 예가 제공된다. 그러나, 본 발명은 한정된 항원 펩티드 세트로 한정되는 것은 아니다. 다른 관련 펩티드는 서열번호 25 내지 28을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 5: 이황화 안정화된 (Cys 돌연변이) pMHC 사량체의 TCR 인식
본 실시예에서 TCR을 인식하는 wt pMHC의 능력과 동일한 TCR을 인식하는 Cys 돌연변이 pMHC의 능력을 비교하였다. 이것은 Cys 돌연변이 pMHC가 wt pMHC와 유사한 방식으로 TCR에 펩티드 항원을 제공하는지 확인하기 위해 수행되었다.
간단히 말해서, MHC 사량체는 플루오로크롬 (fluorochrome) 접합된 스트렙타비딘 (streptavidin)과 결합된 비오틴 화 된 wt pMHC 단량체로 부터 제조되었다. 비오틴화 된 pMHC 단량체 및 Cys 돌연변이 MHC 단량체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었다. wt HLA-A*02:01 단량체를 사용하는 항원 펩티드 특이 적 MHC 사량체 (pMHC)를 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다.
간단히 말해서, wt HLA-A*02:01 단량체 (UV 불안정한 펩티드 KILGFVF-X-V (서열번호 24)와 사전 결합됨)는 UV 램프 (366 nm 파장)하에서 1 시간 동안 PBS 완충액에서 20 μL 반응 부피에서 200 μM 항원 펩티드와 100 μg/mL wt HLA-A*02:01 단량체를 배양하여 항원 펩티드로 교환되었다. 이러한 교환 후 항원성 펩티드 특이적 단량체를 형광 단 표지 된 스트렙타비딘과 접합시켜 항원성 펩티드 특이적 사량체를 제조하고, 각 사량체 특이성을 2 개의 상이한 형광 단으로 제조하여 형태 분석을 위해 2 개의 상이한 색상을 갖는 각 특이성의 CD8 T 세포를 검출하였다. 항원 펩티드 특이적 Cys 돌연변이 MHC 단량체는 각 특이성에 대해 두 가지 다른 색상으로 형광 단 표지 된 스트렙타비딘과 함께 배양하여 사량체화 되었다.
TCR 인식의 비교 분석을 위해, wt 및 Cys 돌연변이 MHC 사량체는 4 가지 다른 HLA-A*02:01 항원 특이성에 대해 준비되었다; EBV LMP2 FLYALALLL (서열번호 26), FLU 58-66 GILGFVFTL (서열번호 20), EBV LMP2 CLGGLLTMV (서열번호 25), and EBV BMF1 GLCTLVAML (서열번호 21). wt 및 Cys 돌연변이 MHC 사량체를 사용하여 건강한 공여자로부터 CD8 T 세포를 검출하고 총 CD8 T 세포의 백분율로 항원성 펩티드 특이적 T 세포를 평가했다 (도 8).
결론: 본 실시예는 Cys 돌연변이 MHC가 항원성 펩티드 특이적 T 세포에 결합하는 wt MHC와 동일한 능력을 가지고 있음을 보여준다. 두 형태의 pMHC 모노머는 MHC 사량체로 전환될 수 있으며, 동일한 항원성 펩티드 특이적 T 세포 집단을 동일하게 효율적으로 검출하는 것으로 나타났다.
실시예 6: 암 모델에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장된 T 세포의 기능적 능력
본 실시예에서 종양 물질에서 인간 암 특이적 종양 침윤 림프구 (TILs)를 분리한다. TILs는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 확장되고 암 모델에서 기능적 용량에 대해 테스트된다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 T 세포는 고용량의 IL-2를 사용하는 빠른 확장에 의해 최첨단 TILs 확장 프로토콜로 확장된 T 세포로 벤치마킹 된다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장된 T 세포의 항 종양 활성은 3D 미세 종양 모델에서 조사된다. 신선한 흑색 종 조직은 수술 후 24 시간 이내에 처리된다. 조직 샘플은 콜라게나아제 (collagenase) 효소의 혼합물을 사용하여 세척, 다져지고 및 약하게 소화된다. 이후, 미세 종양 제제는 세포 스트레이너를 통해 순차적으로 여과되어> 50μm 크기의 3D 미세 종양을 분리한다. 이러한 3D 미세 종양은 무 혈청 (serum-free) 조건에서 확장된다. 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장된 T 세포의 항 종양 반응성은 형광 염료 기반 세포 독성 분석을 사용하여 동일한 환자로부터 확립된 3D 미세 종양과의 공동 배양에서 평가된다. 자가 세포 생성물 (대조군)에 대한 3D 미세 종양 세포의 세포 독성 반응은 최대 96 시간 동안 평가된다. 위에서 언급한 세포 독성 분석과 병행하여 각 세포 생성물에 의한 3D 미세 종양 침윤 정도는 생세포 3D 공초점 형광 현미경을 사용하여 분석된다.
결론: 본 실시예는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 확장된 T 세포가 자가 암 미세 종양에 대한 항 종양 반응성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 7: 인간화 마우스 모델에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장된 T 세포의 생체 내 항 종양 활성
본 실시예에서 인간화 된 huIL2-NOG 마우스에서 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장 T 세포의 생체 내 항 종양 활성을 보여주며, 이는 최근 입양 전이된 흑색 종 유래 TILs의 임상 활동을 모델링하고 예측하기 위해 보고되었다.
간단히 말해서, 종양은 NOD/SCID/IL2Rγ (NOG) 마우스에 이식된다. 생착 후, 종양은 인간 IL-2 (huIL2-NOG)에 대해 형질 전환된 3 내지 5 개의 NOG 마우스 또는 3 내지 5 개의 NOG 마우스에 연속적으로 이식된다. huIL2-NOG 마우스는 꼬리 정맥에 주입하여 인공 항원 제시 세포 확장 T 세포로 처리한다. 종양 성장은 캘리퍼 측정 또는 영상화 (종양 유형에 따라 다름)에 의해 입양 T 세포 전달로 처리되거나 처리되지 않은 종양 보유 마우스 사이에서 비교된다. 생쥐에서 확장된 T 세포는 면역 표현형이 지정되고 억제 및 자극 신호에 대해 분석된다.
결론: 본 실시예는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드 확장된 T 세포가 생체 내 항 종양 반응성을 가짐을 입증한다.
실시예 8: Neoleukin-2/15 (Neo-2/15)와 함께 인공 항원 제시 스캐폴드를 사용한 항원 특이 적 CD8 T 세포의 확장
본 실시예는 A1 CMV pp65 YSEHPTFTSQY (서열번호 30)에 대한 야생형 MHC 클래스 I HLA-A*01:01 단량체 및 이들 인공 항원 제시 스캐폴드를 사용하는 건강한 공여자 PBMC로부터의 특정 CD8 T 세포 확장을 사용하는 Neo-2/15를 사용한 인공 항원 제시 스캐폴드에 대해 설명한다 (도 9).
야생형 HLA-A*02:01 단량체는 실시예 2에 기술된 것과 유사한 공정에 의해 제조되었으며, 그러나 UV-불안정 HLA-A*01:01-특이적 펩티드 STAPG-X-LEY (서열번호 31)의 존재 하에, 여기서 X는 UV 민감성 아미노산인 3-아미노-2-(2-니트로페닐) 프로피온산을 나타내며, UV 광선에 노출되면 전체 길이의 펩티드가 파괴되며 야생형 MHC의 접힘 및 안정성에 필수적이다. 따라서, 정제되고 비오티닐화 된 야생형 HLA-A*01:01 단량체는 항상 이 펩티드 결합 형태 일 것이다.
야생형 HLA-A*01:01 단량체가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 사전 결합된 펩티드와 연관되었기 때문에, A1 CMV pp65 YSEHPTFTSQY에 대해 야생형 HLA-A*01:01 단량체를 사용하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 특이 적 펩티드로 사전 결합된 펩티드의 펩티드 교환을 필요로 하였다. 100 μg/ml 야생형 HLA-A*01:01 단량체는 PBS의 200 μM 항원성 펩티드와 총 부피가 20 μL가 될 때까지 혼합하고 UV 램프 (366nm)에서 60 분 동안 배양하여 사전 결합된 UV 불안정한 펩티드와 항원 성 특이 적 펩티드의 교환을 촉진했다. 반응 후, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 야생형 HLA-A*01:01 단량체 및 사이토 카인을 사용하여 조립되었다. 스캐폴드는 T 세포 확장에 사용될 때까지 4 ℃에 보관된다.
인공 항원 제시 세포 스캐폴드 기반 T 세포 확장은 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 48웰 평평한 바닥 세포 배양 플레이트에서 특이성 당 2 x 106 PBMC로 시작되었다. 3 μl 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 2 일 또는 3 일에 4 번씩 첨가하고 2 주 동안 배양을 유지하였다. 10 개의 샘플을 수집하여 항원 특이적 자극에 의해 유도된 세포 내 사이토 카인 염색을 사용하여 확장을 테스트했다. 확장된 세포는 300.000 세포/100 μL의 세포 농도에서 5 % 인간 혈청이 보충된 X-vivo 배지에서 2 시간 동안 5 μM 관련 항원 펩티드로 챌린지 (Challenge)되었다. 항원성 펩티드와 함께 배양한 후, 확장된 세포를 세척하고 먼저 관련 세포 표면 항체 (CD3, CD4, CD8 및 생존성 염료)로 염색한 다음 세포 투과 완충액을 사용하여 TNFα (PE-Cy7) 및 IFNγ (APC)에 대한 세포 내 염색을 수행했다. 그런 다음 세포를 고정하고 유세포 분석기로 분석했다.
본 발명에 있어서 하나의 항원성 펩티드를 사용한 예가 제공된다. 그러나, 본 발명은 한정된 항원 펩티드 세트로 한정되지 않는다. 다른 관련 펩티드는 서열번호 25 내지 28을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
결론: 본 실시예는 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 항원과 함께 Neo-2/15를 표시하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 pMHC 지시 방식으로 낮은 빈번한 기준선 반응으로 항원 특이 적 CD8 T 세포를 확장하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다 (도 9). 본 실시예는 HLA-A*01:01과 함께 Neo-2/15를 표시하는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 사용하여 항원 특이적 T 세포의 신속한 생산이 가능함을 입증한다.
Neo-2/15 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 확장된 CD8 T 세포는 HLA-A*01:01 CMV pp65 YSEHPTFTSQY 항원에 대한 항원성 펩티드 특이적 확장된 CD8 T 세포에 의한 세포 내 사이토 카인 (TNFα 및 IFNγ)방출에 의해 나타낸 바와 같이 IL-2로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 기능적으로 유사한 것으로 밝혀졌다. 기능 분석은 또한 Neo-2/15가 있는 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 관련없는 펩티드 특이적 CD8 T 세포의 확장이 관찰되지 않았기 때문에 항원 특이적 세포만 확장함을 확인한다.
실시예 1에서, wt MHC 분자로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드로 자극된 세포는 자유 항원성 펩티드 및 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule)를 사용한 확장 및 자극에 비해 특정 CD8 T 세포의 빈도 및 절대 수 측면에서 우수한 확장을 나타냄을 보여준다. 실시예 3에서 Cys 돌연변이 MHC 인공 항원 제시 세포 스캐폴드가 wt MHC 분자로 제조된 인공 항원 제시 세포 스캐폴드와 유사한 효율로 CD8 T 세포를 확장하고 자극한다는 것이 입증되었다. 본 실시예에서 Neo-2/15를 갖는 인공 항원 제시 스캐폴드가 항원 특이적 CD8 T 세포를 유리하게 확장하고 자극한다는 것이 입증되었다.
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Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 275 280 285 Glu Trp His 290 <210> 18 <211> 404 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Homo sapiens/ Cys-mut HLA-A 0201 B2M + linker + heavy chain + Avi-tag w/o TM <400> 18 Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn 1 5 10 15 Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser 20 25 30 Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val 35 40 45 Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu 50 55 60 Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg 65 70 75 80 Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg 85 90 95 Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro 115 120 125 Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr 130 135 140 Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro 145 150 155 160 Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu 165 170 175 Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly 180 185 190 Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val 195 200 205 Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg 210 215 220 Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys 225 230 235 240 Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Cys Ala Gln Thr Thr 245 250 255 Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr 260 265 270 Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His 290 295 300 His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser 305 310 315 320 Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp 325 330 335 Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly 340 345 350 Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln 355 360 365 Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr 370 375 380 Leu Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 385 390 395 400 Glu Trp His Glu <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avi-tag for biotinylation/ Avi-tag <400> 19 Ala Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 1 5 10 15 Glu <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus/ FLU MP 58-66 GIL <400> 20 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus/ EBV BMF1 GLC <400> 21 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytomegalovirus/ CMV pp65 NLV <400> 22 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human immunodeficiency virus/ HIV Pol (C20) <400> 23 Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UV-labile peptide/ X refers to a UV sensitive amino acid, 3-amino-2-(2-nitrophenyl) <400> 24 Lys Ile Leu Gly Phe Val Phe Xaa Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus/ EBV LMP2 CLG <400> 25 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus/ EBV LMP2 FLY <400> 26 Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epstein-Barr virus/ EBV BRLF1 YVL <400> 27 Tyr Val Leu Asp His Leu Ile Val Val 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytomegalovirus/ CMV IE1 VLE <400> 28 Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza virus/ FLU BP-VSD <400> 29 Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytomegalovirus/ CMV pp65 <400> 30 Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> UV-labile peptide/ X refers to a UV sensitive amino acid, 3-amino-2-(2-nitrophenyl) propionic acid <400> 31 Ser Thr Ala Pro Gly Xaa Leu Glu Tyr 1 5

Claims (21)

  1. 다음의 주형 분자가 부착된 고분자 백본 (polymeric backbone)을 포함하는 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 스캐폴드:
    i. 사이토 카인 (cytokines), 공동 자극 분자 (Co-stimulatory molecules), 접착 분자 (adhesion molecules) 및 항체 (antibodies)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1개의 T 세포에 영향을 미치는 분자 (T cell affecting molecule), 및
    ii. 적어도 1개의 MHC 클래스 I 분자 (MHC class I molecule),
    상기 MHC 클래스 I 분자는 이황화 가교 (disulfide bridge)에 의해 연결된 알파-1 도메인 (alpha-1 domain) 및 알파-2 도메인 (alpha-2 domain)을 포함하는 중쇄를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이황화 가교는 알파-1 도메인 및 알파-2 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기 사이에 형성된 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드:
    a. 서열번호 1의 서열, 또는
    b. (a)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
    상기 아미노산 서열은 알파-1 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기 및 알파-2 도메인에 위치하는 돌연변이 시스테인 잔기를 포함한다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알파-1 도메인의 돌연변이 시스테인 잔기는 아미노산 잔기 84 또는 85에 있고 상기 알파-2 도메인에 위치한 돌연변이 시스테인 잔기는 아미노산 잔기 139에 있는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  5. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄는 다음으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 인공 항원 제시 세포 스캐폴드:
    a. 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나, 또는
    b. (a)의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
  6. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자 백본은 적어도 5개, 예컨대 적어도 8개, 예컨대 적어도 10개, 예컨대 적어도 20개, 예컨대 적어도 30개, 예컨대 적어도 40개, 예컨대 적어도 50개 또는 예컨대 적어도 100개의 MHC 클래스 I 분자를 포함하는 것인 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  7. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 적어도 2종의 다른 T 세포에 영향을 미치는 분자를 포함하는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  8. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포에 영향을 미치는 분자는 사이토 카인인 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 사이토 카인은 IL-21, IL-2, IL-15, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17, IL-22 및 IL -23으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  10. 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토 카인은 감마 사슬 수용체 사이토 카인인 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 감마 사슬 수용체는 IL-21, IL-2, IL-15, IL-4, IL-7 및 IL-9으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  12. 제10항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감마 사슬 수용체 사이토 카인은 IL-21, IL-2 및 IL-15로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 항원 제시 세포 스캐폴드는 적어도 2개의 감마 사슬 수용체 사이토 카인을 포함하는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  14. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자는 항원성 펩티드가 없는 펩티드 결합 홈을 포함하는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 클래스 I 분자는 항원성 펩티드 (pMHC)를 포함하는 펩티드 결합 홈을 포함하는 것인, 인공 항원 제시 세포 스캐폴드.
  16. 다음의 단계를 포함하는 T 세포의 동시 시험관 내 자극 및 확장 방법:
    i. T 세포를 포함하는 샘플 제공 단계,
    ii. 상기 샘플을 제15항에 따른 인공 항원 제시 세포 스캐폴드를 포함하는 확장 용액과 접촉시키는 단계,
    iii. 배양으로 상기 인공 항원 제시 세포 스캐폴드에 대한 특이성을 갖는 T 세포를 자극 및 확장하는 단계, 및
    iv. 단계 iii)의 T 세포를 상기 배양으로부터 획득하여 T 세포의 확장된 항원 특이적 집단을 수득하는 단계.
  17. 제16항에 따른 방법에 의해 획득된 확장된 T 세포 집단.
  18. 제17항에 있어서, 상기 확장된 T 세포 집단은 다음으로부터 선택된 적어도 하나, 예컨대 적어도 2개, 예컨대 적어도 3개의 특징을 갖는 것인 확장된 T 세포 집단:
    i. 배양 2주 후 항원 특이적 T 세포가 10배 이상 확장되고,
    ii. 나중에 항원 공격 시 INF- γ및 TNF-α의 분비,
    iii. CD28의 높은 발현, 및
    iV. PD1의 낮은 발현.
  19. 약학적 용도로 사용되는 제17항 또는 제18항의 확장된 T 세포 집단.
  20. 암 또는 바이러스 상태의 치료에 사용되는 제17항 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 확장된 T 세포 집단.
  21. 다음을 포함하는 T 세포 확장용 키트:
    i. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1개의 인공 항원 제시 스캐폴드를 포함하는 제1 저장 수단; 및
    ii. 적어도 1개의 항원성 펩티드를 포함하는 제2 저장 수단;
    상기 제1 저장 수단 및 제2 저장 수단의 내용물은 결합 (combined) 되도록 구성된다.
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