KR20210020836A

KR20210020836A - 홍합접착단백질로 코팅된 치과용 임플란트

Info

Publication number: KR20210020836A
Application number: KR1020200102400A
Authority: KR
Inventors: 김명호; 강혜원; 임무학; 박현정; 서재란; 최봉혁; 원동환
Original assignee: (주)네이처글루텍
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2021-02-24
Also published as: KR102462168B1

Abstract

본 발명은 (1) 임플란트를 입자 분사 후 산처리법으로 표면처리하는 단계; (2) 홍합접착단백질 및 아스코르브산을 포함하는 코팅 수용액에 상기 (1) 단계의 임플란트를 침지시켜 임플란트 표면에 홍합접착단백질-아스코르브산 코팅막을 형성시키는 단계; 및 (3) 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염을 포함하는 pH 8~9의 완충용액에 상기 (2) 단계의 코팅막이 형성된 임플란트를 침지시키는 단계;를 포함하는 치과용 임플란트의 제조방법에 관한 것이다.

Description

홍합접착단백질로 코팅된 치과용 임플란트{Dental implant coated with mussel adhesive protein}

본 발명은 홍합접착단백질로 코팅된 치과용 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

치과용 임플란트는 인간의 턱뼈 위에 인공치아를 영구적으로 이식시키기 위해 사용하기 때문에 인간의 생체조직에 대하여 매우 안정적인 생체친화 재료를 사용하여야 하며 부작용 및 기타 화학, 생화학적 반응성이 없는 것이어야 한다. 또한 반복되는 하중 및 순간적인 압력의 부과에도 변형 및 파괴되지 않도록 기계적 강도가 매우 높아야하기 때문에 임플란트의 적절한 소재로서 티타늄의 생체적합성이 우수하다는 사실은 상당히 예전부터 알려져 왔으며, 현재까지 활발히 사용되고 있다. 임플란트 표면의 진화된 양상을 살펴보면 1세대는 선반 가공에 의한 매끈한 표면처리 방식으로 오랜 기간 동안 임플란트 술식에 이용되어 왔다. 그러나 골 밀도가 낮은 골에서도 임플란트 시술의 성공 여부는 인조조직인 임플란트가 뼈 조직 안에서 결합되는 골융합(Osseointegration)이 얼마나 견고하게, 그리고 빨리 완성되는가에 달려있다고 할 수 있기 때문에, 골융합에 있어서 중요한 결정인자로 임플란트의 표면처리 방식이 지적되어 왔다.

기존의 통상의 가공 방법으로 처리된 피막 표면을 형성한 표면에 비해 표면 거칠기를 증가시켜 생체조직과 접촉하는 표면적을 넓힌 2세대 임플란트에는 흡수성 분사 매질법인 RBM법(Resorbable blasting media)과 임플란트의 표면에 Al₂O₃ 입자를 분사(blasting)하고, 이후 강산(H₂SO₄/HCl)을 처리하는 방법으로서 크레이터(crater)와 마이크로-피트(micropit)를 생성키는 화학적 가공 방법인 입자 분사 후 산처리법(Sandblasting with large grit and Acid etching, SLA법 또는 SA법)이 있다. RBM법은 저렴하지만 시술 기간이 길다는 단점이 있고, RBM법에서 발전된 형태인 SLA법은 현재 대표적으로 사용되고 있는 제품군으로. 기존의 RBM법에 비하여 표면적이 40% 이상 증가하는 효과를 보였기 때문에 조골세포의 분화에 유리하며, 골과 임플란트 사이의 골유착능을 증가시킬 수 있다는 장점이 있다. 이에 따라 임플란트 시술 후 평균 치유 기간을 12주에서 6～8주로 단축할 수 있다.

하지만 SLA법에 의해 표면 처리된 친수성 티타늄 표면은 공기 중에 노출될 경우, 임플란트 표면의 산화층이 성장하고 공기 중 탄소 오염원의 비가역적 흡착에 의해 빠르게 소수화되는 단점을 가진다. 소수화된 표면은 골세포의 임플란트 표면으로의 유입을 방해하여 초기 골과 임플란트 사이의 접촉률을 감소시키기 때문에 골 유착 성능이 감소되어 초기 임플란트 시술 실패에 대한 잠재적인 이유가 된다.

따라서 SLA법으로 형성된 표면이 대기 중에서 소수화되는 것을 방지하고자 물이나 불활성 기체가 충진된 용기에 포장함으로써 공기와의 접촉을 차단하여 친수성을 유지시키기 위한 방식이 사용되었다. 하지만 위와 같은 포장 방법도 친수성 유지에는 효과적이지만, 임플란트 표면의 미세 구조(표면적의 증가, 거칠기의 향상)를 변화시키는 표면처리만으로는 골 유착 성능을 더욱 향상시켜 임플란트 시술 기간을 단축하기에는 한계가 있다.

이에, 본 발명은 기존의 SLA법으로 형성된 표면과 같은 물리적인 표면 처리 방법이 갖는 한계를 극복하기 위하여 홍합접착단백질을 치과용 임플란트 표면에 코팅시키는 방법과 초친수성을 갖게 하는 표면처리 방법으로 제조된 치과용 임플란트 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 표면이 SLA법으로 처리된 치과용 임플란트 표면의 소수성을 개선하기 위한 것으로, 초친수성이며, 혈액친화성이 향상되어 조골세포의 분화 및 증식을 유도 또는 촉진할 수 있는 빠른 골형성 및 골유착 특성을 갖는 치과용 임플란트 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (1) 임플란트를 입자 분사 후 산처리법(Sandblasting with large grit and Acid etching, SLA법)으로 표면처리하는 단계;

(2) 홍합접착단백질 및 아스코르브산을 포함하는 코팅 수용액에 상기 (1) 단계의 임플란트를 침지시켜 임플란트 표면에 홍합접착단백질-아스코르브산 코팅막을 형성시키는 단계; 및

(3) 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염을 포함하는 pH 8~9의 완충용액에 상기 (2) 단계의 코팅막이 형성된 임플란트를 침지시키는 단계;를 포함하는 치과용 임플란트의 제조방법을 제공한다.

상기 홍합접착단백질은 홍합에서 유래한 접착단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합접착단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 홍합접착단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 4), fp-3 (서열번호 5), fp-4 (서열번호 6), fp-5 (서열번호 7), 및 fp-6 (서열번호 8)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 국제공개번호 제 WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 홍합접착단백질은 fp-151(서열번호 9), fp-131(서열번호 10), fp-353(서열번호 11), fp-153(서열번호 12), fp-351(서열번호 13) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 홍합 접착단백질은 fp-1 에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 fp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 홍합접착단백질은 fp-151의 변이체(서열번호 15)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 서열번호 15의 단백질 서열은 서열번호 9와 대비하여 링커 서열 등이 제외된 서열이다. 구체적으로, 서열번호 14로 표시되는 fp-1 변이체 서열 사이에 서열번호 16으로 표시되는 Mgfp-5의 서열을 융합한 융합 단백질 서열이다.

본 발명은 또한 위 언급된 홍합접착단백질들의 특성을 유지할 수 있는 보존적 아미노산 서열을 포함하는 범위에서 홍합접착단백질은 변형될 수 있다. 즉, 실질적으로 동등한 효과를 나타내는 상기 서열번호들의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90%이상, 즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하고, 전체 티로신 잔기의 10 ~ 100%가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하다. 대부분의 홍합접착단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 1 ~ 50 %일 수 있다. 홍합접착단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 카테콜 화합물인 도파(DOPA)로 변환될 수 있다. 그러나 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합접착단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.

상기 카테콜 화합물은 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 가교작용을 통해 홍합접착단백질에 접착력을 부여하는 화합물을 의미한다. 구체적으로 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 홍합접착단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합접착단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합접착단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 홍합접착단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.

본 발명에 의하면, 상기 (2) 단계의 코팅 수용액은 pH가 2 내지 3일 수 있으며, 용매로 증류수 또는 생리식염수를 사용할 수 있나 이에 제한되지는 않는다..

본 발명에 의하면, 상기 코팅 수용액 중의 홍합접착단백질 대 아스코르브산의 함량비는 1 : 10 내지 200 몰비로 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 10 내지 25 몰비로 포함되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 12.5 몰비로 포함되는 것일 수 있다. 코팅막의 성분으로 홍합접착단백질과 아스코르브산을 함께 사용하는 경우, 홍합접착단백질만을 사용하는 경우에 비하여 혈액친화성 및 친수성이 향상되고, 생체적합성 및 생리활성이 우수하다. 뿐만 아니라, 아스코르브산의 첨가는 코팅안정성을 증가시켜 장기간 보관 또는 사용에도 안정적으로 코팅층이 유지된다.

본 발명에 의하면, 상기 코팅 수용액 중의 홍합접착단백질의 농도는 0.01 내지 100 mM일 수 있으며, 아스코르브산의 농도는 홍합접착단백질 1 몰에 대하여 아스코르브산 10 내지 200 몰비로 포함된다.

본 발명에 의하면, 상기 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염은 소듐카보네이트, 소듐바이카보네이트, 쇼듐포스페이트, 칼슘 카보네이트, 포타슘카보네이트, 마그네슘카보네이트, 칼슘포스페이트, 포타슘포스페이트 및 마그네슘포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 예컨대 쇼듐바이카보네이트일 수 있다.

본 발명에 의하면, 홍합접착단백질-아스코르브산의 코팅막은 홍합접착단백질 및 아스코르브산이 치과용 임플란트의 표면에 분산되어 물리적으로 흡착된 것, 화학적으로 결합된 것 또는 이들 모두일 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 (2) 단계는 임플란트를 코팅 수용액에 6 내지 18시간, 바람직하게는 9 내지 15시간, 예컨대 12시간 동안 침지시키는 것일 수 있으며, 침지 온도는 상온 또는 20 내지 37℃인 것이 바람직하다. 침지 온도가 상기 범위 미만이면 코팅층 형성에 시간이 많이 소요되고, 상기 범위를 초과하면 단백질의 변성이 일어날 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염을 포함하는 pH 8~9의 완충용액에 상기 (2) 단계의 코팅막이 형성된 임플란트를 침지시키는 단계는 홍합접착단백질 및 아스코르브산을 임플란트의 표면에 고밀도로 강력하게 흡착시키기 위해 수행되는 것일 수 있다. 상기 pH 범위에서의 처리는 코팅막 중의 홍합접착단백질 및 아스코르브산의 밀도를 더욱 높일 수 있으므로, 코팅막의 두께가 얇으면서도 내구성이 우수하며, 친수성 및 혈액친화성이 뛰어나고, 골형성 및 골유착 특성이 뛰어난 치과용 임플란트를 제공할 수 있으므로 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 (3) 단계는 완충용액에 6 내지 18시간, 바람직하게는 9 내지 15시간, 예컨대 12시간 동안 침지시키는 것일 수 있으며, 침지 온도는 상온 또는 20 내지 37℃인 것이 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 (3) 단계의 완충용액 중의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염의 농도는 2 내지 200 mM일 수 있으며, 치과용 임플란트 코팅막 중의 홍합접착단백질의 농도에 따라 완충용액 중의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염의 농도를 조절할 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 방법은 치과용 임플란트의 표면 상에 홍합접착단백질을 1 내지 500 μg/cm²의 농도로 코팅시키기 위함일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 홍합접착단백질 및 아스코르브산 코팅막을 포함하는 치과용 임플란트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 코팅막은 친수성, 바람직하게는 초친수성일 수 있다. 코팅막의 우수한 친수성은 혈액 친화성을 향상시킬 수 있으며, 이를 통해 세포 부착능이 향상되고, 임플란트 표면에서 세포 활성도가 증가되어 빠른 골형성 및 골분화가 유도되므로 바람직하다.

본 발명에 의하면, 상기 코팅막은 홍합접착단백질 대 아스코르브산이 1 : 10 내지 200 몰비, 바람직하게는 1 : 10 내지 25 몰비로 포함된 것일 수 있으며, 코팅막 중의 홍합접착단백질의 함량은 1 내지 500 μg/cm² 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 소수성 SLA법으로 처리된 임플란트 표면에 홍합접착단백질을 코팅함으로써, 기존의 SLA법으로 처리된 표면의 단점으로 제시되고 있는 소수성 표면을 친수성 표면으로 바꾸며, 혈액 친화성 및 표면 접착력이 향상된 표면으로 개질하는 치과용 임플란트 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 홍합접착단백질 및 아스코르브산의 코팅막을 포함하는 치과용 임플란트의 제조방법은 기존의 SLA표면이 지니는 기계적 성능은 유지하면서도 친수성과 혈액친화성이 뛰어나 골과 임플란트 계면 사이의 친화성이 향상되고, 뛰어난 표면 접착력으로 임플란트 식립 후 초기 골 고정력을 개선시키는 효과가 있다. 뿐만 아니라, 조골세포의 분화와 증식을 유도 및 촉진하여 임플란트의 골형성 및 골유착을 크게 향상시킬 수 있으며, 임플란트 표면의 소수화를 일으키는 오염원의 흡착을 억제하여 초친수성이 장시간 유지되므로 산업상 유리하다.

도 1은 홍합접착단백질이 코팅된 SLA disc 표면의 혈액 친화성을 평가한 결과이다.
도 2는 40 ℃에서 1년의 가속 노화된 홍합접착단백질이 코팅된 치과용 임플란트의 표면 접촉각을 평가한 결과이다.
도 3은 홍합접착단백질이 코팅된 치과용 임플란트의 X-선 광전자 분광법 (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 통해 표면 홍합접착단백질 코팅층의 형성을 확인한 결과를 나타낸 결과이다.
도 4는 홍합접착단백질 코팅에 따른 SLA disc 표면의 조골세포 부착성 및 부착 형태를 형광현미경 이미지 및 이의 조합 이미지로 나타낸 것이다.
도 5는 홍합접착단백질 코팅에 따른 조골세포 부착 능력 및 세포 증식 정도를 나타낸 결과이다.
도 6은 홍합접착단백질 코팅에 따른 조골세포의 분화정도를 분석하기 위한 alizarin red S 염색 및 분화 결과 세포 내 칼슘 침착 능력을 분석하기 위한 침착 칼슘의 정량 결과이다.
도 7은 홍합접착단백질이 코팅된 치과용 임플란트의 혈액 친화성을 평가한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 치과용 임플란트 표면의 홍합접착단백질 코팅

(1) 임플란트 세척

홍합접착단백질을 표면에 코팅하기 전, SLA(입자 분사후 산처리법)공정을 거친 치과용 임플란트를 에탄올로 10분간, 그리고 멸균 증류수로 10분간 2회 초음파세척 한 후, 건조시켰다.

(2) 홍합접착단백질 코팅

본 발명의 홍합접착단백질의 코팅은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 홍합접착단백질이 포함된 산성 코팅 수용액을 사용하여 임플란트 면에 홍합접착단백질을 코팅하는 단계 및 홍합접착단백질이 코팅된 임플란트를 금속염의 중성 완충용액에 침지하여 표면의 홍합접착단백질을 집적시키는 단계를 포함한다.

먼저, 코팅 단계는 0.8 mM 농도의 홍합접착단백질 및 10 mM 농도의 아스코르브산을 혼합하여 증류수에 pH 2~3으로 용해하여 코팅 수용액을 제조하고, 치과용 임플란트를 상기 수용액 2 ml에 12시간 동안 침지한 후 상온에서 2시간 동안 건조하여 수행하였다.

2차 코팅은 소듐바이카보네이트를 26 mM의 농도범위로 포함하는 pH 8~9의 완충용액 2 ml에 상기 1차 코팅된 임플란트를 12시간 동안 침지함으로써 표면의 단백질의 흡착(adsorption)을 진행시켜 수행하였으며, 치과용 임플란트 표면에 제대로 흡착되지 않은 홍합접착단백질의 제거를 위해 증류수로 세척하고, 상온에서 3시간 동안 건조하였다.

실시예 2. SLA 디스크 표면의 홍합접착단백질 코팅

(1) 디스크(disc) 세척

홍합접착단백질을 코팅하기 전, SLA(입자 분사 후 산처리법) 공정을 거친 지름이 8mm인 디스크를 에탄올로 10분간, 그리고 멸균 증류수로 10분간 2회 초음파 세척한 후 건조시켰다.

(2) 홍합접착단백질 코팅

본 발명의 코팅은 디스크 표면에 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 홍합접착단백질을 포함하는 코팅 수용액을 이용하여 1차 코팅하는 단계, 및 1차 코팅된 임플란트를 완충용액에 침지하여 표면의 홍합접착단백질을 흡착시켜 2차 코팅하는 단계를 포함한다.

1차 코팅은 0.8 mM 농도의 홍합접착단백질 및 10 mM 농도의 아스코르브산을 혼합하여 증류수, 생리식염수 등에 pH 2~3으로 용해하여 코팅 수용액을 제조하고, 제조된 코팅 수용액 50 μl을 상기 디스크 표면위에 균일하게 도포하여 12시간 동안 건조하였다.

2차 코팅은 알칼리 또는 알칼리토금속이 혼합된 중탄산염, 탄산염, 인산염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나 이상의 물질을 26 mM의 농도범위로 포함하는 pH 8 ~ 9의 완충용액 1 ml에 상기 1차 코팅된 디스크를 12시간 동안 침지함으로써 표면의 단백질의 흡착(adsorption)을 진행시켜 수행하였으며, 디스크 표면에 제대로 흡착되지 않은 홍합접착단백질의 제거를 위해 증류수로 세척하고, 상온에서 3시간 동안 건조하였다.

실시예 3. 혈액 친화성 평가

실시예 2에서 제조된 홍합접착단백질이 코팅된 SLA 디스크 표면의 혈액 친화성을 확인하기 위하여 래빗(Rabbit) 혈액 5 μl을 디스크 중앙에 투하한 후, 측면 사진 분석을 통해 혈액과 디스크 표면과의 접촉각을 측정하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 홍합접착단백질 코팅을 하지 않은 디스크를 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 디스크의 접촉각은 약 20°이고, 대조군 디스크의 접촉각은 약 110°로 측정되었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따라 홍합접착단백질의 코팅은 대조군에 비해 디스크의 접촉각을 현저하게 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 이러한 표면처리 공정은 혈액친화성이 높음을 시사한다.

실시예 4. 가속노화 실험을 통한 친수성 표면 형성 평가

실시예 1의 홍합접착단백질 코팅된 치과용 임플란트를 가속노화 조건(약 40℃)에서 18주간 방치하여 보관기간 1년의 조건을 조성한 후, 젖음성을 확인하기 위해 증류수 5 μl를 임플란트 중앙에 투하한 후, 측면 사진 분석을 통해 증류수와 SLA 표면과의 접촉각을 측정하였다. 이때, 음성 대조군으로는 SLA 임플란트를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 가속노화 조건을 거치지 않은 홍합접착단백질 코팅 임플란트를 사용하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군의 경우 접촉각이 110°인 것에 비하여 18주간 가속노화 처리된 경우 접촉각이 0°로 낮아졌다. 이러한 보관기간 1년의 가속노화 조건을 거친 후에도 여전히 가속노화 이전과 동등 수준 이상으로 접촉각을 유지시키는 결과는 본 발명의 홍합접착단백질로 코팅된 표면처리 공정이 초친수성 표면 형성에 우수한 효과가 있음을 보여준다.

실시예 5. 표면 성분 분석

실시예 1의 홍합접착단백질로 코팅된 치과용 임플란트의 화학적 특성 분석 및 코팅에 따른 임플란트 표면의 성분 변화를 확인하기 위하여 X-선 광전자 분광법 (X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)을 수행하였다. XPS 분석은 임플란트 소재와 코팅물질에 대한 Ti, C, O, N 원소에 대해 시편의 중앙부를 측정하였으며, Survey scan, atomic %, 각 원소에 대한 Narrow scan 결과를 토대로 해석하였다. 이때, 대조군으로는 홍합접착단백질 코팅을 하지 않은 임플란트를 사용하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군의 표면은 평균적으로 Ti 17.3%, C 29.6%, N 0.6%, O 48.6%의 조성을 갖는 것으로 측정되었다. 반면, 실시예 1의 홍합접착단백질로 코팅된 임플란트 표면은 평균적으로 C 62.1%, N 8.62%, O 25.3%의 조성을 갖는 표면이 형성되는 것이 관찰되었고, 특히, 홍합접착단백질로 코팅으로 인하여 Ti 피크는 검출되지 않고, C, N 피크의 강도(intensity) 및 영역(Area)이 증가하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 치과용 임플란트 표면에 홍합접착단백질 코팅층이 잘 형성되었음을 보여준다.

실시예 6. 홍합접착단백질 코팅 SLA 디스크의 In vitro 세포 부착성 및 부착 형태 확인

in vito 에서 홍합접착단백질 코팅 여부에 따른 세포 부착성 및 부착 형태를 확인하였다. 이를 위해 실시예 2의 홍합접착단백질로 코팅된 SLA 디스크 표면에 쥐 조골세포(MC3T3-E1)를 배양하였다. 실험에 사용된 세포의 농도는 2×10³ cell/cm² 이었으며, 1시간 동안 배양한 후 파라포름알데히드 (4%)를 이용하여 고정화 하였다. 고정화된 세포는 DAPI 및 팔로이딘(phalloidin)을 이용하여 각각 세포질과 핵을 염색한 후 형광 염색을 진행하였다. 염색된 세포의 형상은 공초점 레이저 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 홍합접착단백질 코팅을 하지 않은 SLA 디스크를 사용하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 홍합접착단백질이 코팅된 표면에서 조골세포의 morphology가 길쭉하게 뻗어 근접한 세포끼리 붙어있는 경향이 보였다. 또한 세포핵(nucleus) 염색 결과, 부착된 세포의 수가 훨씬 더 많이 관찰되는 경향을 확인할 수 있었다. 이는 SLA 표면에 도입된 홍합접착단백질이 안정적으로 조골세포의 부착능을 향상시킨 것을 시사한다. 상기와 같은 결과로부터, 홍합접착단백질이 코팅된 SLA 디스크 표면은 대조군인 홍합접착단백질이 코팅되지 않은 SLA 디스크 표면에 비해 활성이 유지되고, 세포의 부착능이 향상되는 것을 확인하였다.

실시예 7. 홍합접착단백질의 In vitro 세포 부착성 및 증식능 확인

임플란트 코팅 물질인 홍합접착단백질의 in vitro 단계에서 세포 기능 향상 능력을 분석하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 표면처리되지 않은 폴리스티렌(PS) 플레이트에 홍합접착단백질을 0, 10, 25, 50 μg/cm²의 농도로 코팅하고, 쥐 조골세포(MC3T3-E1)를 배양하였다. 실험에 사용된 세포의 농도는 2×10⁴ cell/cm² 이었으며, 3시간 동안 배양한 후 CCK-8 분석으로 세포 부착 및 증식을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 홍합접착단백질을 코팅한 폴리스티렌 표면에서 표면 처리하지 않은 표면에 비해 높은 세포 부착 및 증식을 확인하였다. 홍합접착단백질은 초기 세포 부착능을 향상시켜 홍합접착단백질로 표면처리되지 않은 표면에 비하여 세포를 효과적으로 증식시키는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 홍합접착단백질은 세포 활성도를 증가시키는데 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 8. 홍합접착단백질의 In vitro 조골세포 분화능 확인

임플란트 코팅 물질인 홍합접착단백질의 in vitro 단계에서 조골세포의 분화능을 확인하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 표면처리되지 않은 폴리스티렌(PS) 플레이트에 홍합접착단백질을 0, 10, 50 μg/cm²의 농도로 코팅하고, 쥐 조골세포(MC3T3-E1)를 7일 동안 배양하였다. 조골세포의 골분화능 지표인 석회질(calcium deposit)을 색상으로 확인할 수 있는 ARS 염색(Alizarin red S staining) 수행을 위해 배양된 조골세포를 PBS로 세척하고 파라포름알데히드 (4%)로 15분간 고정하였다. 40 mM alizarin red S 용액으로 20분간 염색한 후 증류수로 여러 번 세척하여 여분의 염색액을 제거하고 염색 양상을 관찰하였다. 다음으로, 정량적으로 확인하기 위하여 10% 아세트산을 처리하여 칼슘을 얻고, 칼슘량을 측정하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 홍합접착단백질이 코팅되지 않은 폴리스티렌 표면에 비하여 홍합접착단백질을 코팅한 폴리스티렌 표면은 진한 붉은색으로 염색되었다. 다음으로 염색 정도를 정량화하기 위해 기질 내 칼슘량을 비교하였으며, 홍합접착단백질의 경우 홍합접착단백질이 코팅되지 않은 경우(대조군) 대비 흡광값이 약 97% 증가하는 것으로 관찰되었다. 이를 통해 홍합접착단백질이 조골세포의 골분화능이 있음이 확인되었다. (*P<0.05, ***P<0.005)

실시예 9. 혈액 친화성 평가

실시예 1의 홍합접착단백질이 코팅된 치과용 임플란트 표면의 혈액친화성을 확인하였다. 토끼(Rabbit) 혈액에 실시예 1의 임플란트를 15초 동안 약 6 mm를 담지한 후, 임플란트 표면을 타고 올라오는 혈액의 높이를 측정하여 혈액 친화성을 평가하였다. 대조군으로는 홍합접착단백질을 코팅하지 않은 임플란트를 사용하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 홍합접착단백질 코팅을 하지 않은 대조군보다 실시예 1의 임플란트에서 표면에 달라붙은 혈액의 높이가 높아진 것이 육안으로 관측되었다. 대조군의 임플란트에서는 혈액이 표면을 타고 올라오지 않은 반면, 실시예 1의 홍합접착단백질이 코팅된 임플란트의 경우 침지 5초 경과 시점에서 이미 임플란트의 끝까지 혈액이 상승하였다. 이를 통해 본 발명에 따라 홍합접착단백질의 코팅이 임플란트 표면의 혈액 친화성을 크게 향상시키는 것을 확인하였다.

<110> Nature Gluetech Co., Ltd. <120> Dental implant coated with mussel adhesive protein <130> NATUREGLUETECH1-1P <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 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Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys 20 25 30 Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 Pro Trp Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr 50 55 60 Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys 85 90 95 Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr 100 105 110 His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ala 115 120 125 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 130 135 140 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 165 170 175 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 180 185 <210> 14 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 15 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 variant <400> 15 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly 65 70 75 80 Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys 100 105 110 Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys 115 120 125 Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 16 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mgfp-5 <400> 16 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75

Claims

(1) 임플란트를 입자 분사 후 산처리법으로 표면처리하는 단계;
(2) 홍합접착단백질 및 아스코르브산을 포함하는 코팅 수용액에 상기 (1) 단계의 임플란트를 침지시켜 임플란트 표면에 홍합접착단백질-아스코르브산 코팅막을 형성시키는 단계; 및
(3) 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염을 포함하는 pH 8~9의 완충용액에 상기 (2) 단계의 코팅막이 형성된 임플란트를 침지시키는 단계;를 포함하는 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제2항에 있어서,
홍합접착단백질은 티로신잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제3항에 있어서,
카테콜 화합물은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 코팅 수용액은 pH가 2 내지 3인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
코팅 수용액 중의 홍합접착단백질 대 아스코르브산의 함량비는 1 : 10 내지 200 몰비로 포함되는 것인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
코팅 수용액 중의 홍합접착단백질 대 아스코르브산의 함량비는 1 : 10 내지 25 몰비로 포함되는 것인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
알칼리금속 또는 알칼리토금속의 무기염은 소듐카보네이트, 소듐바이카보네이트, 쇼듐포스페이트, 칼슘 카보네이트, 포타슘카보네이트, 마그네슘카보네이트, 칼슘포스페이트, 포타슘포스페이트 및 마그네슘포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항에 있어서,
홍합접착단백질은 임플란트 표면 상에 1 내지 500 μg/cm²의 농도로 코팅되는 것인, 치과용 임플란트의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 홍합접착단백질 및 아스코르브산의 코팅막을 포함하는 치과용 임플란트.
제10항에 있어서,
상기 코팅막은 친수성인, 치과용 임플란트.
제10항에 있어서,
상기 코팅막은 홍합접착단백질 대 아스코르브산이 1 : 10 내지 200 몰비로 포함되는 것인, 치과용 임플란트.
제10항에 있어서,
상기 코팅막은 홍합접착단백질 대 아스코르브산이 1 : 10 내지 25 몰비로 포함되는 것인, 치과용 임플란트.
제10항에 있어서,
홍합접착단백질은 임플란트 표면에 1 내지 500 μg/cm²의 양으로 코팅된 것인, 치과용 임플란트.