KR20210020092A - 크릴 새우-유래 키틴 생산물 및 그 제조 방법 - Google Patents

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림프로스트 테크놀로지스 에이에스
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Abstract

분자량 (사슬 길이) 및 아세틸화도와 같은 크릴 새우 유래 키틴 조성물의 특성을 재현할 수 있는 키틴 조성물의 제조 방법을 개시한다. 이러한 재현가능한 제조 방법으로 키틴 조성물 최종 생산물을 약제학적 및 생의학적 용도로 널리 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 키틴의 본래의 상태가 유지되는 키틴 조성물을 제조할 수 있다.

Description

크릴 새우-유래 키틴 생산물 및 그 제조 방법
본 발명은 정제된 키틴 조성물 제공 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 크릴 새우 껍질로부터 고도로 정제된 키틴 조성물을 추출하는 분야에 관한 것이다.
바이오폴리머 키틴 또는 폴리(β-(1->4)N-아세틸-d-글루코사민)은 매우 중요한 천연 다당류이다. 키틴은 수많은 살아있는 유기체들에 의해 합성되며, 셀룰로스 다음으로 가장 풍부한 천연 폴리머이다. 키틴은 천연 상태에서 절지동물의 외골격 또는 진균 및 효모의 세포벽에서 구조 요소를 구성하는, 정렬된 결정질형 미세원섬유로서 합성된다. 키틴의 주된 상업적인 공급원은 게와 새우의 껍질이다. 산업 공정에서, 키틴은 산 처리에 의해 추출하여 탄산칼슘에 용해한 후 염기성 용액으로 단백질 용해한다. 전형적으로, 탈색 단계가 추가된다. 이러한 처리는 초기 물질의 차이로 인해 키틴 공급원에 맞게 조정하여, 키틴 생산물을 생산하고, 이후 탈아세틸화를 거쳐, 키토산 생산물을 수득하게 된다. 키틴의 낮은 용해성은 이의 가공 처리, 이용 및 특정화에 중대한 문제이다.
키틴은 천연 폴리머일 뿐 아니라 신체에서 생체적합하고 생분해성이므로, 생의학적 및 약제학적 용도로 사용할 수 있다. 그 예로는 약물 방출 및 상처 드레싱이 있다. 또한, 키틴의 양호한 막 형성 특성은 생물막, 인공 피부 및 포장에 유용할 수 있다.
과거, 남극 크릴 새우의 효소적 가수분해 수행 방법들이 언급된 바 있다. 크릴 새우의 껍질을 크릴 새우의 가수분해물로부터 분리할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 그러나, 껍질을 추가적으로 가공 처리하진 않는다. 그래서, 생산물은 수분으로 인해, 미생물 측면에서 안정적이지 않으며, 가치가 낮다. 전형적으로, 이러한 생산물은 가공 처리 후 폐기된다. 따라서, 경제적이고 환경적인 관점에서 크릴로부터 유래되는 모든 분획들을 활용하고자 하는 요구가 존재한다.
크릴 새우 껍질은 과거 탈지 처리되었으며, 키틴 추출에 활용되었다. 탈지 처리된 크릴 새우 껍질로부터 수득되는 키틴 생산물의 수율은 27.80±1.48%이었다. 이처럼 전체 수율이 낮고, 상업적인 잠재성도 떨어진다.
지금까지 재현가능한 품질의 키틴을 수득하기 어려웠다. 표준화된 제품 부족은 키틴의, 특히 생의학적 및/또는 약제학적 분야에서의, 충분한 치료학적 이용 가능성을 가로막고 있다.
따라서, 순도, 결정화 지수 및 분자량이 모두 우수한 키틴을 제조하기 위한 비용-효율적이고, 신속하고, 쉽게 제어가능한 산업 공정으로 크릴 새우로부터 키틴을 분리하기 위한 개선된 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 크릴 새우로부터 유래되는 키틴 조성물의 특성을 재현할 수 있는 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 분자량 (사슬 길이) 및 아세틸화 수준 등의 특성을 재현할 수 있다. 이러한 재현가능한 제조 방법은 약제학적 및 생의학적 활용에서 키틴 조성물 최종 생산물의 광범위한 이용을 가능하게 한다. 또한, 본 방법으로 키틴이 천연 상태로 보존된 키틴 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 측면은, a) 크릴 새우 생산물에 대해 단백질 제거 처리를 수행하여 단백질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계; 및 b) 적어도 약 30% 내지 약 99%가 아세틸화되고, 크릴 새우 키틴의 평균 분자량이 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 키틴 조성물을 분리하는 단계를 포함하는, 크릴 새우 키틴의 탈아세틸화 및 해중합이 최소화된, 키틴 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 크릴 새우 생산물은 크릴 새우 전체 (whole krill)를 포함한다. 이 방법은 바람직하게는 크릴 새우 생산물을 무기질 제거 처리하여 무기질 제거 처리된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 무기질 제거 단계는 단백질 제거 단계 이전에 수행될 수 있다.
키틴 조성물은 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 가질 수 있다. 크릴 새우 키틴의 평균 분자량은 약 400 kDa 내지 약 600 kDa일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 키틴 조성물은 결정화도 지수 (CI)가 약 85% 내지 약 95%이고, 크릴 새우 키틴의 평균 분자량은 약 400 kDa 내지 약 600 kDa이다. 바람직한 구현예에서, 키틴 조성물은 90% 이상의 동질성을 가진다.
본 발명의 다른 측면은, a) 크릴 새우 생산물을 단백질 제거 처리하여 단백질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계; 및 b) 키틴 조성물의 아세틸화가 약 95% 이상이고 키틴 조성물의 평균 분자량이 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 생활성 크릴 새우-키틴 조성물을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 생활성 크릴 새우-키틴 조성물에 관한 것이다.
생활성 크릴 새우-키틴 조성물은, 또한, 크릴 새우 생산물을 무기질 제거 처리하여 무기질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 부가적인 무기질 제거 단계를 이용해, 제조할 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 생활성 크릴 새우-키틴 조성물은 약 80% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 가진다.
본 발명의 다른 측면은, a) 크릴 새우 생산물을 1차 효소적 가수분해하여 크릴 새우 가수분해물을 제조하는 단계; b) 크릴 새우 가수분해물에서 고형물을 분리하는 단계; c) 고형물에 대해 화학적 단백질 제거 및 화학적 무기질 제거를 실시하여, 키틴 조성물을 제조하는 단계; 및 d) i) 결정화도 지수 (CI) 약 85% 초과; ii) 순도 약 80% 초과; 및 iii) 평균 분자량 약 300 kDa 내지 약 700 kDa을 포함하는 키틴 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 키틴 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 1차 효소적 가수분해는 메탈로프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 1차 효소적 가수분해는 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 것을 더 포함한다. 바람직한 구현예에서, 1차 효소적 가수분해는 제1 프로테아제 혼합물과 접촉하는 단계; 및 제2 프로테아제 혼합물과 접촉하는 단계를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 방법은 제1 프로테아제 혼합물과 접촉하는 것을 포함하는 2차 효소적 가수분해를 포함한다. 1차 효소적 가수분해는 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
제1 프로테아제 혼합물은 하나 이상의 염기성 프로테아제를 함유할 수 있으며; 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제를 함유할 수 있다. 제1 프로테아제 혼합물은 포획 갑각류 분해물 (disintegrated crustacean catch)의 총 중량에 대해 0.3-0.5%일 수 있으며; 제2 프로테아제 혼합물은 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대해 0.03-0.05%일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 바실러스 리체니포르미스 (Licheniformis)로부터 유래된다. 1차 효소적 가수분해는 세포벽 분해 효소와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 화학적 단백질 제거를 무기질 제거 처리 전에 수행한다.
바람직하게는, 크릴 새우 가수분해물의 고형물은 지질 약 10% 내지 약 25% 및 단백질 약 35% 내지 약 55%를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 크릴 새우 가수분해물의 고형물은 지질 약 13% 내지 약 18% 및 단백질 약 40% 내지 약 50%를 포함한다.
화학적 단백질 제거는 고형물을 NaOH에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. NaOH는 몰 농도 약 1M 내지 약 4M일 수 있다. 화학적 단백질 제거는 약 80℃에서 이루어질 수 있다. 화학적 단백질 제거는 약 1일 내지 약 7일 또는 약 1일 내지 약 4일간 지속할 수 있다.
무기질 제거 처리는 고형물을 HCl에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. HCl은 몰 농도 약 1M일 수 있다. 무기질 제거 처리는 약 95℃에서 이루어질 수 있다. 무기질 제거 처리는 약 30분간 지속할 수 있다.
임의의 가공 단계에서, 온도는 60℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃ 또는 100℃를 넘지 않는 것이 바람직하다.
키틴 조성물의 바람직한 결정화도 지수 (CI)는 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과이다. 바람직하게는, 키틴 조성물의 결정화도 지수 (CI)는 약 85% 내지 약 95%이다.
바람직하게는, 키틴 조성물은 미량 무기질의 총량이 5 ppm 미만, 1 ppm 미만 및 0.1 ppm 미만이다. 바람직하게는, 미량 무기질들의 각각의 함량은 5 ppm 미만, 1 ppm 미만 및 0.1 ppm 미만이다. 미량 무기질은 철, 칼슘, 인, 마그네슘, 포타슘, 아연, 니켈, 셀레늄 및 구리를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 키틴 조성물의 순도는 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다. 또한, 바람직하게는, 키틴 조성물은 90% 이상의 동질성을 가진다.
본 발명의 다른 측면은 결정화도 지수가 80% 초과이고; 분자량이 700 kDa 미만이고; 순도가 90% 초과인 키틴 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 키틴 조성물은 크릴 새우 키틴 조성물이다.
키틴 조성물은, 바람직하게는, 결정화도 지수 (CI)가 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과이다. 바람직하게는, 키틴 조성물의 결정화도 지수 (CI)는 약 85% 내지 약 95%이다.
또한, 바람직하게는, 키틴 조성물의 순도는 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%이다. 가장 바람직하게는, 키틴 조성물에는 불순물이 실질적으로 없다. 불순물은 단백질, 지질, 미량 무기질 및 이들의 조합물일 수 있다. 실질적으로 없다는 것은 불순물이 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만이라는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 키틴 조성물에서 미량 무기질의 총 함량은 5 ppm 미만, 1 ppm 미만, 0.1 ppm 미만이다. 바람직하게는, 미량 무기질들의 각각의 함량은 5 ppm 미만, 1 ppm 미량, 0.1 ppm 미량을 포함한다. 미량 무기질은 철, 칼슘, 인, 마그네슘, 포타슘, 아연, 니켈, 셀레늄 및 구리를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 키틴 조성물은 단백질을 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 또는 0.1% 미만으로 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 키틴 조성물은 지질을 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 0.1% 미만으로 포함한다.
바람직하게는, 키틴 조성물은 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa의 평균 분자량을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 결정화도 지수가 약 80% 내지 약 90%이고; 평균 분자량이 약 400 kDa 내지 약 600 kDa이고; 순도가 약 90% 내지 약 98%인 키틴 조성물에 관한 것이다.
도면에 대한 설명
도 1은 크릴 새우 생산물과 같은 원료로부터 키틴 조성물을 분리하는 단계들을 나타낸 흐름도이다. 제1 단계는 1차 가수분해를 포함한다. 제2 단계는 크릴 새우 껍질 준비를 포함한다. 제3 단계는 2차 가수분해를 포함한다. 제4 단계는 키틴을 추출하여 키틴 조성물을 제조하는 것을 포함한다.
크릴 새우 껍질에서 발견되는 키틴은 단백질과 형성된 복잡한 네트워크 (즉, 다당류-단백질 복합체)에 미량 무기질이 침착된 딱딱한 껍질을 형성하는 구성 요소이다.
일 측면에서, 본 발명은, 키틴의 본래의 구조 (예, 분자량 및 아세틸화도)를 보존하면서, 크릴 새우 껍질로부터 유래된 키틴으로부터 단백질 및 기타 유해 성분 (예, 플루오라이드)을 제거하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 크릴 새우 키틴의 본래의 상태를 실질적으로 유지하므로, 최종 생산물은 재현가능하고, 예측가능하다. 예를 들어, 분자량 (사슬 길이) 및 아세틸화도와 같은 특성을 재현할 수 있다. 이러한 재현가능한 제조 방법으로, 최종 생산물 크릴 새우 키틴 조성물을 전형적으로 표준화가 요구되는 약제학적/생의학적 용도로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 크릴 새우에서 전체 추출가능한 키틴; 및 크릴 새우에서 키틴과 단백질 간의 결합 강도 및 특성을 확인하는 분석 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 최종 생산물에서 분자의 특성을 보존하는, 환경적인 측면에서 지속가능한 크릴 새우로부터의 키틴 추출 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 크릴 새우 수거 용기와 같은 해상 운송 용기에서 선상에서 수행할 수 있다.
본 명세서 전체에서, 양은 범위로, 범위의 하한 및 상한으로 정의된다. 각각의 하한은 각각의 상한과 조합되어 범위를 규정할 수 있다. 하한과 상한은 각각 별개의 요소로서 취급하여야 한다.
크릴 새우 생산물
본 발명에서는 임의의 다양한 크릴 새우를 이용할 수 있다. 바람직한 크릴 새우는 남극 크릴 새우 (유파우시아 수페르바 (Euphausia Superba))이다. 유파우시아 팍시피카 (Euphausia pacifica)의 사용도 고려된다. 또한, 크릴 새우는 크릴 새우 전체 (whole krill), 크릴 새우 분말 또는 크릴 밀 (krill meal)일 수 있다. 크릴 새우 전체는 생물이거나 또는 사전 냉동된 것일 수 있다. 그러나, 60분 이내, 바람직하게는 30분 이내에 포획한 생물 크릴 새우 전체가 바람직하다. 크릴 새우 분말은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 크릴 새우 생산물은 EP2334199B1에 기술된 방법을 이용해 제조한다.
일 구현예에서, 크릴 새우 생산물은 크릴 새우 분해물을 제1 프로테아제 혼합물 및 제2 프로테아제 혼합물과 접촉시켜 제조한다.
포획 갑각류의 분해
포획 갑각류를 (금방 포획한 크릴 새우의 경우 즉시) 분해하여, 포획 갑각류 분해물을 제조한다. 분해는 포획 갑각류를 후속적인 가공 처리 단계들에 더 유용한 더 작은 조각 또는 더 작은 입자 크기로 기계적으로 분쇄하는 과정을 수반한다. 다음과 같은 값들을 임의 방식으로 조합하여, 포획 갑각류 분해물의 입자 크기에 대한 최소값, 최대값 또는 범위를 규정할 수 있다: 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm 및 25 mm. 예를 들어, 포획 갑각류 분해물은 대략 1-25 mm, 더 바람직하게는 대략 3-15 mm, 가장 바람직하게는 대략 3-6 mm의 입자 크기를 가질 수 있다.
포획 갑각류는 임의의 통상적인 수단을 이용해 분해하여, 특정 범위의 입자 크기로 만들 수 있다. 예를 들어, 분해 장치는 포획 갑각류를 빻고, 으깨고, 갈고 및/또는 파쇄할 수 있다. 분해 장치의 예로는, 비-제한적으로, 나이프 파쇄기, 블렌더 및 호모게나이저 등이 있다.
분해 공정이 이루어지는 온도는, 포획 갑각류가 생물일 경우, 예를 들어 크릴 새우가 60분 이내에 포획된 경우, 포획 갑각류를 포획한 물의 대략적인 주위 온도이다. 따라서, 온도는 약 -2℃ 내지 약 +1℃, 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 +6℃일 것이다.
가수분해
제2 단계는 포획 갑각류 분해물을 하나 이상의 단백질분해 효소와 접촉시켜 포획 갑각류 가수분해물을 제공하는 것을 포함한다. 포획 갑각류 분해물을 가수분해하면, 포획 갑각류 가수분해물이 수득된다. 가수분해는, (즉, 예를 들어, 아미노산 서열 1차 구조의 펩타이드 결합을 파괴함으로써) 천연 단백질 서열이 짧아져 더 작은 펩타이드 및 유리형 아미노산이 되는, 단백질분해 효소와 같은 생물 제제에 의해 유발 또는 매개될 수 있는 화학적 반응 또는 공정이다.
포획 갑각류 분해물은, 생물이 죽었을 때 포획 갑각류로부터 분비되는 리파제 및 포스포리파제와 같은 소화 효소가 불활성화될 수 있도록, 가수분해 처리하여야 한다. 소화 효소 분비시 불활성화 처리되지 않으면, 포획 갑각류의 인지질과 지방산이 파괴될 것이다. 소화 효소를 불활성화하기 위해, 포획 갑각류의 가수분해물을 제조하기 위해 특정 조건에서 포획 갑각류 분해물을 단백질분해 효소와 접촉시킨다. 단백질분해 효소는, 포획 갑각류 분해물의 외골격으로부터 일부 인지질과 펩타이드를 분해하면서, 특히 소화 효소를 표적으로 하고, 후속 단계에서 이용될 수 있는 크릴 새우의 다른 단백질의 손상은 최소화하도록 선택된다.
효소, 온도, pH 및 기간 선정과 같은 가수분해 조건은 특정 수준으로 가수분해된 포획 갑각류의 부분 가수분해물이 수득되도록 선택된다. 포획물의 부분 가수분해물이 바람직하며, 그래서 소화 효소는 불활성화하고, 기타 단백질은 작은 펩타이드 및 유리형 아미노산으로 파괴할 수 있다. 이와는 대조적으로, 포획 갑각류의 완전 가수분해물은 바람직하지 않은데, 이는 갑각류의 모든 단백질이 유리형 아미노산으로 분해되는 것을 의미한다.
가수분해 수준은 pH-stat, 트리니트로벤젠설폰산 (TNBS), o-프탈다이알데하이드 (OPA), 트리클로로아세트산 용해성 질소 (SN-TCA) 및 포르몰 적정 방법과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 확인할 수 있다. 다음과 같은 %는 조합하여 가수분해의 수준을 명시하기 위한 범위를 규정하거나, 또는 각각 최소값 또는 최고값으로 사용할 수 있다: 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%. 예를 들어, 포획 갑각류에서 약 30% 이상의 단백질을 가수분해한다. 더 바람직하게는, 포획 갑각류에서 약 40% 이상의 단백질을 가수분해한다. 다른 구현예에서, 가수분해가 거의 완전하게 이루어진다는 것을 명시하기 위해 가수분해 수준은 최대 90%일 수 있다.
아울러, 부분 가수분해된 단백질은 특성상 단백질의 소화율을 높인다. 예를 들어, 부분 가수분해된 단백질의 펩신 소화율 (pepsic digestibility)은 대략적으로 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%일 수 있다. 가장 바람직하게는, 부분 가수분해된 단백질의 펩신 소화율은 약 91%이다. 소화율 증가는, 부분 가수분해된 단백질이 필수 아미노산을 합성할 수 없는 동물에게 영양분이 된다는 것을, 의미한다. 부분 가수분해된 단백질은 수생 종 및/또는 애완동물에서 사료 보충제로서 제품으로 사용하는데 유용하다.
펩신 소화율은 생체내 표준 실무에 따라 또는 시험관내 수행되는 새로운 실무에 따라 측정할 수 있다. 종래에, 연구자들은 동물이 단백질-함유 컴파운드를 섭취하였을 때 소화되는 단백질의 양을 측정하기 위해 랫, 수탉 및/또는 닭을 이용해 생체내 펩신 소화율을 측정하였다. 동물 변에서 생산물 내 소화가능한 단백질 양의 지표가 되는 질소-함량을 분석한다. 단백질 소화율을 결정하는 새로운 방법은, 효소 소화 중에 해리되는 아미노산의 양을 광학적으로 평가할 수 있도록, 가수분해된 단백질 용액에 아민 관능기 또는 카르복시산 관능기와 반응하는 분광 측정 시약을 첨가함으로써 시험관내에서 수행할 수 있다.
아울러, 단백질분해 효소(들), 조건 및 가수분해 기간은, 소화 효소 및 기타 단백질 (소화 효소와는 별개의 단백질) 등의 크릴 새우에서 임의의 단백질들은 실질적으로 변성시키지 않으면서, 소화 효소를 불활성화하도록 특이적으로 선택된다. 변성은, 단백질이 천연 상태에서 존재하는 4차, 3차 및/또는 2차 구조를 상실하였을 때, 발생한다.
다른 구현예에서, 소화 효소는 변성되지 않거나 또는 기타 단백질은 변성되지 않는다. 변성되지 않은 부분 가수분해된 단백질은, 생물학적 증식에 이용가능하지 않은 형태의 상당량의 물을, 생물 증식에 이용가능하지 않은 형태의 물을 적게 보유한 변성된 단백질에 비해, 최대 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 오래 보유하는 것으로 밝혀진 바, 변성되지 않은 부분 가수분해된 단백질이 바람직하다. 물 보유력은 생산물의 유동성 및 저장성 증가에 의해 PPC의 유용성을 상승시킨다. 따라서, 부분 가수분해된 단백질을 함유한 임의의 기타 하류 생산물 및 PPC는, 장기간 생물 증식을 촉진하지 않으면서 상당량의 물을 보유할 수 있는 것이 유익할 것이다.
기타 단백질이 실질적으로 변성되지 않는다는 것은 크릴 새우에서 기타 단백질들 중 0%, 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 20% 미만, 25% 미만 또는 30% 미만이 변성되는 것으로 정의된다.
가수분해는 바람직하게는 포획 갑각류 분해물을 단백질분해 효소와 접촉시켜 인큐베이션하였을 때 발생한다. 최적의 인큐베이션 온도는, 포획 갑각류에서 다른 단백질은 변성시키지 않고 소화 효소를 가수분해하는데 유익한 특정 효소(들)를 활성화하기 위한 온도이다. 온도는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 가공 처리하는 중에 달성될 수 있다. 바람직하게는, 단백질분해 효소를 뜨거운 물에 첨가한 다음 포획 갑각류 분해물과 교반하면서 혼합한다. 대안적으로, 단백질분해 효소를 물에 첨가한 다음 혼합물을 가열하거나, 또는 효소, 물 및 포획 갑각류 분해물을 함께 혼합한 다음 가열할 수 있다.
다음과 같은 % 값들을 조합하여, 포획물 분해물의 중량을 기준으로 접촉 단계 중에 첨가되는 물의 양에 대한 최저값, 최대값 또는 범위를 규정할 수 있다: 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54% 및 55%. 예를 들어, 물은 포획물 분해물의 중량에 대해 최대 약 50%의 양으로 첨가된다. 다른 예로, 포획물 분해물의 중량에 대해 물을 약 45% 내지 약 50%로 첨가된다.
다음과 같은 값들을 조합하여, 포획 갑각류 분해물의 최적 가수분해 온도, 즉 인큐베이션 온도에 대한 최저값, 최대값 또는 범위를 규정할 수 있다: 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃ 및 75℃. 예를 들어, 접촉 단계는 포획 갑각류 분해물을 약 45℃ 내지 약 75℃의 온도 범위에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이들 온도는 물 온도 또는 물, 효소(들) 및/또는 포획 갑각류 분해물로 된 혼합물의 온도에 적용될 수 있다. 예를 들어, 단백질분해 효소(들)와 혼합하기에 전에 물을 미리 약 60℃의 온도까지 가열할 수 있다. 다른 예로, 효소(들)는 약 45℃ 내지 약 65℃에서 최적으로 작동할 수 있다.
사용되는 효소의 특성은, 크릴 새우에서 기타 단백질은 실질적으로 변성시키지 않으면서 소화 효소만 충분히 불활성화하고 포획 갑각류 분해물의 외골격으로부터 일부 인지질과 펩타이드를 분리하기 위해, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 확인할 수 있다.
예를 들어, 단백질분해 효소는 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대해 약 0.1% 미만의 함량으로 사용될 수 있다. 다음의 값들을 임의 방식으로 조합하여, 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대한 %로서 단백질분해 효소의 양에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 0.3%, 0.29%, 0.28%, 0.27%, 0.26%, 0.25%, 0.24%, 0.23%, 0.22%, 0.21%, 0.2%, 0.19%, 0.18%, 0.17%, 0.16%, 0.15%, 0.14%, 0.13%, 0.12%, 0.11%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02% 및 0.01%. 일 구현예에서, 단백질분해 효소는 단계 b)에서 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대해 약 0.01% 내지 0.1%의 함량으로 사용될 수 있다.
용액의 pH는 사용되는 구체적인 단백질분해 효소(들)를 기반으로 가수분해가 최적으로 진행되도록 적정할 수 있다.
가수분해 단계는 포획 갑각류 가수분해물을 제조하는데 임의의 적정 시간을 소요할 수 있다. 가수분해에 소요되는 시간에 영향을 미치는 인자로는 혼합물의 온도와 pH 뿐 아니라 반응이 교반 하에 이루어지는 지의 유무 및 교반의 세기 등이 있다.
예를 들어, 가수분해는 100분 미만 동안 이루어질 수 있다. 하기 분 (min)으로 나타낸 값들을 임의 방식으로 조합하여, 가수분해에 소요되는 시간에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분, 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분 및 40분. 예를 들어, 가수분해에는 약 15-18분이 소요되거나, 또는 가수분해에서 약 45분 미만이 소요될 수 있다.
다른 구현예에서, 가수분해에는 100분 이상이 소요될 수 있다. 하기 분으로 나타낸 값들을 임의 방식으로 조합하여, 가수분해에 소요되는 시간에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분, 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 120분, 125분, 130분, 135분, 140분, 145분, 150분, 155분, 160분, 165분, 170분, 175분, 180분, 185분, 190분, 195분, 200분, 205분, 210분, 215분, 220분, 225분, 230분, 235분 및 240분. 예를 들어, 가수분해에는 약 100-180분이 소요될 수 있거나, 또는 가수분해에는 약 180분 미만으로 소요될 수 있다.
단백질분해 효소
본 발명에서 이용가능한 단백질분해 효소는 단백질 백본을 따라 펩타이드 결합을 가수분해함으로써 큰 단백질 분자를 더 작은 분자로 절단하는 식품 등급의 효소이다. 본원에서, 용어 "단백질분해 효소", "프로테아제", 및 "펩티다제"는 상호 호환적으로 사용된다. 본원에서, 용어 "엑소펩티다제"는 펩타이드 결합을 절단하여 펩타이드 또는 단백질의 말단 아미노산을 제거하는 하이드롤라제 효소를 지칭한다. 말단 아미노산은 단백질 또는 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산 약 10개 이내의 아미노산이다. 본원에서, 용어 "엔도펩티다제"는 폴리펩타이드 또는 단백질 내부의 펩타이드 결합의 절단을 촉매하는 효소를 지칭한다. 펩티다제는 펩타이드 결합에 작용하는 것을 의미하는 것이며, 엔도펩티다제는 내부 결합에 작용하는 것을 의미하는 것이다.
단백질분해 효소로는, 비-제한적으로, 에스테라제 효소, 예를 들어 카르복실릭-에스테르 하이드롤라제, 티오에스테르 하이드롤라제, 포스포릭-모노에스테르 하이드롤라제, 포스파타제, 포스포릭-다이에스테르 하이드롤라제, 트리포스포릭-모노에스테르 하이드롤라제, 설푸릭-에스테르 하이드롤라제, 설파타제, 다이포스포릭 모노에스테라제 및 포스포릭-트리에스테르 하이드롤라제; 글리코실라제, 예를 들어, 글리코시다제, 즉 O- 및 S-글리코실 화합물을 가수분해하는 효소와 N-글리코실 화합물을 가수분해하는 효소; 티오에테르 및 트리알킬설포늄 가수분해와 같이 에테르 결합에 작용하는 효소; 엑소펩티다제 등의 펩티다제, 예를 들어, 아미노펩티다제, 다이펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜-펩티다제, 카르복시펩티다제 (세린-타입 카르복시펩티다제, 메탈로카르복시펩티다제, 시스테인-타입 카르복시펩티다제), 다이펩티다제, 오메가 펩티다제 및 펩티딜-다이펩티다제, 및 엔도펩티다제, 예를 들어, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르틱 엔도펩티다제, 메탈로엔도펩티다제, 예를 들어 Ab Enzymes 사의 Corolase® 7089, CAS 9001-92-7, 및 트레오닌 엔도펩티다제; 싱글 서브-서브클래스의 카본-할라이드 화합물을 가수분해하는 효소; 인-질소 결합에 작용하는 효소; 황-질소 결합에 작용하는 효소; C-포스포노-기를 가수분해하는 효소; 황-황 결합에 작용하는 효소; 및 탄소-황 결합에 작용하는 효소 등이 있다.
일 구현예에서, 프로테아제 혼합물이 사용될 수 있다. 적절한 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 또는 염기성 프로테아제 중 하나 이상을 포함한다.
산성 프로테아제는 산성 조건 (예를 들어, pH 2.0-5.0, 2.0-3.0, 2.0-4.0, 또는 3.0-5.0)에서 최대 활성 및 안정성을 나타내며, pH 6.0 이상에서 불활성화되는, 단백질-소화 효소이다. 산성 프로테아제는 일반적으로 등전점이 낮고, 염기성 아미노산의 함량이 낮다.
중성 프로테아제는 좁은 pH 범위 (pH 5 - 8)에서 활성을 나타내며, 상대적으로 낮은 열 관용성을 나타낼 수 있다. 중성 프로테아제로는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 및 일부의 세린 프로테아제 등이 있다.
염기성 프로테아제는 염기성 pH에서, 예를 들어, 적어도 pH 9, 적어도 pH 10, 적어도 pH 11에서 높은 활성을 발휘하는 것을 특징으로 한다. 염기성 프로테아제의 예로는 세린 프로테아제가 있다. 염기성 프로테아제는 에스테르분해 활성 및 아미다제 활성 등의 넒은 기질 특이성을 가진다. 세린 프로테아제의 등전점은 일반적으로 pH 4 내지 6이다. 높은 염기성 pH에서 활성을 나타내는 세린 염기성 프로테아제는 세린 프로테아제의 가장 큰 하위군이다.
일 구현예에서, 프로테아제 혼합물은 바실러스 리체니포르미스 유래 프로테아제를 포함한다. 바실러스 리체니포르미스로부터 유래된 산성, 중성 및 염기성 프로테아제들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Yilmaz et al., J Enzyme Inhib Med Chem, 2016, 31(6):1241-1247; Rao et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62(3): 597-635; 및 Jellouli et al., Process Biochemistry, 2011, 46(6): 1248-1256을 참조한다.
일 구현예에서, 프로테아제 혼합물은 속명 아스퍼질러스 유기체로부터 수득되는 식품 등급의 세포벽 분해 효소를 포함한다. 아스퍼질러스 유래의 세포벽 분해 효소에 대한 예로는 밀라제 (mylase), 펙티나제, 자일라나제 및 셀룰로스 효소 등이 있다. 구체적인 예로는 β-글루코시다제, 엔도글루카나제, 필테르파페라제 (filterpaperase), 폴리갈락투로나제 (polygalacturonase) 및 펙테이트 리아제 (pectate lyase) 등이 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 염기성 프로테아제를 포함하는 제1 프로테아제 혼합물; 및 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제 중 하나 이상을 포함하는 제2 프로테아제 혼합물을 첨가하는 것을 포함한다.
제1 프로테아제 혼합물은 하나 이상, 2종 이상, 3종 이상 또는 4종 이상의 염기성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 염기성 프로테아제(들)는 바실러스 리체니포르미스로부터 유래된다. 일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물은 엔도프로테아제만 포함한다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물은 염기성 프로테아제 한종만 포함한다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물은 2종의 염기성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제와 제2 염기성 프로테아제는 제1 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-80%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-80%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 70-99%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-10%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 9-99%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제와 제2 염기성 프로테아제는 제1 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물은 염기성 프로테아제 3종을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제, 제2 염기성 프로테아제 및 제3 염기성 프로테아제는 제1 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-80%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-80%이고, 제3 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-80%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 제3 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 50-98%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-10%이고, 제2 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 제3 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 10-98%이다. 일 구현예에서, 제1 염기성 프로테아제, 제2 염기성 프로테아제 및 제3 염기성 프로테아제는 제1 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제 중 하나 이상을 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 또는 염기성 프로테아제는 바실러스 리체니포르미스로부터 유래된다. 제2 프로테아제 혼합물의 프로테아제는 엑소프로테아제 및 엔도프로테아제를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제와 중성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제와 중성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제를 1-80%로, 중성 프로테아제를 1-80%로 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 중성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 70-99%이다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-10%이고, 중성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 9-99%이다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제와 중성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제와 염기성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제와 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제를 1-80%로, 염기성 프로테아제를 1-80%로 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 70-99%이다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-10%이고, 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 9-99%이다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제와 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 중성 프로테아제와 염기성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 중성 프로테아제를 1-80%로, 염기성 프로테아제를 1-80%로 포함한다. 일 구현예에서, 중성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-30%이고, 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 70-99%이다. 일 구현예에서, 중성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 1-10%이고, 염기성 프로테아제는 프로테아제 혼합물의 9-99%이다. 일 구현예에서, 중성 프로테아제와 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제를 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물의 프로테아제 총 100%를 구성한다. 일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제를 1-80%로, 중성 프로테아제를 1-80%로, 염기성 프로테아제를 1-80%로 포함한다. 일 구현예에서, 제2 프로테아제 혼합물은 산성 프로테아제를 1-10%로, 중성 프로테아제를 1-30%로, 염기성 프로테아제를 60-98%로 포함한다. 일 구현예에서, 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물에 동일한 비율로 존재한다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물의 염기성 프로테아제는 제2 프로테아제 혼합물에 존재하지 않는다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물의 함량 / 제2 프로테아제 혼합물의 함량은 제1 프로테아제 혼합물 0.2-0.6% 및 제2 프로테아제 혼합물 0.02-0.06%이다. 일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물의 함량 / 제2 프로테아제 혼합물의 함량은 제1 프로테아제 혼합물 0.3-0.5% 및 제2 프로테아제 혼합물 0.03-0.05%이다. 일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물의 함량은 약 0.4%이고, 제2 프로테아제 혼합물의 함량은 약 0.04%이다.
제1 프로테아제 혼합물에서 바람직한 상업적으로 이용가능한 프로테아제 혼합물은 Endocut-02L (TailorFood/Tailorzyme)을 포함한다. 제2 프로테아제 혼합물에서 바람직한 상업적으로 이용가능한 프로테아제 혼합물은 Exocut-BL (TailorFood/Tailorzyme)을 포함한다. Exocut-BL은, 하나 이상의 프로테아제 대신 또는 이와 더불어, 아스퍼질러스로부터 유래되는 세포벽 분해 효소를 포함할 수 있다.
하기 값들을 조합하여, 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대한 %로서 Exocut 프로테아제 혼합물에 대한 최소치 및 최대치를 가진 범위를 규정할 수 있다: 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.25% 또는 0.5%.
일 구현예에서, Endocut/Exocut의 함량은 Endocut 프로테아제 혼합물 0.2-0.6% 및 Exocut 프로테아제 혼합물 0.02-0.06%이다. 일 구현예에서, Endocut/Exocut의 함량은 Endocut 프로테아제 혼합물 0.3-0.5% 및 Exocut 프로테아제 혼합물 0.03-0.05%이다. 일 구현예에서, Endocut의 함량은 약 0.4%이고, Exocut의 함량은 약 0.04%이다.
일 구현예에서, 제1 프로테아제 혼합물과 제2 프로테아제 혼합물은 포획 갑각류 분해물에 동시에 첨가된다.
일 구현예에서, 가수분해 단계는 포획 갑각류를 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시킨 다음 포획 갑각류를 제2 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 구현예에서, 하기 분으로 나타낸 값들을 임의 방식으로 조합하여, 제2 프로테아제 혼합물을 첨가하기 전 제1 프로테아제 혼합물을 이용한 가수분해에 소요되는 시간에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분, 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 120분, 125분, 130분, 135분, 140분, 145분, 150분, 155분, 160분, 165분, 170분, 175분, 180분, 185분, 190분, 195분, 200분, 205분, 210분, 215분, 220분, 225분, 230분, 235분 및 240분. 예를 들어, 포획 갑각류 분해물은 제2 프로테아제 혼합물을 첨가하기 전에 제1 프로테아제 혼합물을 이용해 1-10분간 가수분해 처리된다.
일 구현예에서, 가수분해 단계는 포획 갑각류를 제2 프로테아제 혼합물과 접촉시킨 다음 포획 갑각류를 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 구현예에서, 하기 분으로 나타낸 값들을 임의 방식으로 조합하여, 제1 프로테아제 혼합물을 첨가하기 전 제2 프로테아제 혼합물을 이용한 가수분해에 소요되는 시간에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 16분, 17분, 18분, 19분, 20분, 21분, 22분, 23분, 24분, 25분, 26분, 27분, 28분, 29분, 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 120분, 125분, 130분, 135분, 140분, 145분, 150분, 155분, 160분, 165분, 170분, 175분, 180분, 185분, 190분, 195분, 200분, 205분, 210분, 215분, 220분, 225분, 230분, 235분 및 240분. 예를 들어, 포획 갑각류의 분해물은 제1 프로테아제 혼합물을 첨가하기 전에, 제2 프로테아제 혼합물을 이용해 1-10분간 가수분해 처리된다. 다른 구현예에서, 키티나제 또는 콜라게나제를 포함하는 제2 효소가 사용된다. 이 효소는 제1 효소 또는 효소 조합물과 조합하여 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 가수분해에 사용되는 효소(들)는 엑소펩티다제를 포함하지 않는다.
또한, 접촉 단계는 유기 용매의 사용을 포함할 수 있다. 사용가능한 유기 용매의 예로는, 비-제한적으로, 에탄올, 아세톤 및 에틸아세테이트 등이 있다.
가수분해 정지
가수분해는 효소(들)를 불활성화함으로써 중단시킬 수 있다. 효소(들)는 저해제 첨가, 조인자 제거 (예, 투석을 통한 중요한 이온), 열에 의한 불활화 및/또는 임의의 기타 비활성화 수단 등의 여러가지 방식으로 비활성화할 수 있다.
각각의 효소가 불활성화되는 조건은 다양할 수 있지만, 일반적으로는 용질의 pH 증가 및 온도 상승이다. 예를 들어, Corolase® 7089의 비활성화는 pH 값 > 7.5 및 온도 > 55℃에서 개시된다. 조건은 포획 갑각류 분해물 내 단백질이 변성되지 않는 온도에서 효소의 불활성화가 이루어지도록 선택된다. 다음과 같은 온도 값들을 임의 수단으로 조합하여, 포획 갑각류 내 단백질은 변성시키지 않으면서 효소(들)를 불활화하는 온도에 대한 최저값, 최고값 또는 범위를 규정할 수 있다: 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃ 및 100℃. 예를 들어, 효소 A는 약 90℃ 이상의 온도에서, 바람직하게는 약 92℃ 내지 약 98℃에서 불활성화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 가수분해는, 포획 갑각류가 바람직하게는 부분적으로 가수분해되어 단백질이 특정 수준으로 가수분해된 포획 갑각류 가수분해물이 만들어지도록 정확한 시점에 중단된다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자라면, 특정 효소(들)를 이용한 가수분해 조건과 기간, 및 포획 갑각류가 일정 비율로 가수분해된 포획 갑각류 가수분해물을 만들기 위한 조건을 알 수 있을 것이다.
2차 가수분해 단계
키틴은 전술한 방법 등의 통상적인 방법을 이용해 크릴 새우로부터 추출할 수 있다. 그러나, 지질이 이러한 과정을 방해하는 것으로 알려져 있다. 검사한 크릴 새우 재료에는 잔류하는 총 지질의 양이 상당하였다 (지질은 총 중량의 16%에 달하였음). 지질은 추출 과정에 상당한 영향을 미친다. 단백질 제거 단계 중에 사포닌화 공정에 주목하게 되었다. 분석을 통해, 이는, 화합물이 단백질을 공격하여 일부 지질과 반응해, 인지질 복합체를 형성하는 인을 방출하면서 발생되는, 가교 반응의 결과인 것으로 확인되었다. 이는 혼합물이 젤 유형 (실제 치약과 매우 비슷함)이 되게 만들고, 그래서 추출 효율이 떨어져, 교반 속도를 높이게 할 것이다. 이 젤은 온도에 매우 민감하다. 이의 점성은 온도 증가에 따라 증가하여, 어느 시점에는 배치에 대한 제어를 상실할 수 있는 지점까지 증가한다.
단백질은 크릴 새우 재료로부터 키틴을 추출할 때 집중하여야 하는 핵심 요소이다. 크릴 새우에서 키틴은 새우 또는 게 껍질과는 다르게 무기질보다는 단백질에 더 강하게 결합해 있는 것으로 보인다. 일부 지질은 이러한 단백질과 밀접하게 관련되어 있다. 그래서 지질을 미리 많이 제거하게 되면, 크릴 새우의 전체 부분인 키틴/단백질 복합체가 일부 제거될 가능성이 있다. 지질이 너무 많으면, 추출 공정에서 젤이 형성된다. 젤은 추출시 가동할 수 있는 온도를 제한한다. 또한, 공정 반응조 밖에서 액체/고체 분리를 매우 복잡하게 만들어, 최종 순도에 영향을 미친다.
예상치 못하게도, 2차 가수분해 단계가 키틴 수율과 결정화도 지수를 증가시키는 것으로, 밝혀졌다.
일 구현예에서, 전술한 제1 프로테아제 혼합물을 이용한 2차 가수분해 단계를 전술한 크릴 새우 생산물에 대해 수행한다.
하기 값들을 조합하여, 키틴을 추출하기 위해 가공 처리된 크릴 새우 생산물의 총 중량에 대한 %로서 제1 프로테아제 혼합물의 함량에 대한 최소치 및 최대치를 가진 범위를 규정할 수 있다: 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 또는 0.5%.
하기 값들을 조합하여, 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대한 %로서 Endocut 프로테아제 혼합물의 함량에 대한 최소치 및 최대치를 가진 범위를 규정할 수 있다: 0.01%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0% 또는 1.5%.
이러한 구현예에서, 하기 분으로 나타낸 값들을 임의 방식으로 조합하여, 2차 가수분해 단계에서 가수분해에 소요되는 시간에 대한 최소값과 최고값을 가진 범위를 규정할 수 있다: 30분, 31분, 32분, 33분, 34분, 35분, 36분, 37분, 38분, 39분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분 또는 120분. 예를 들어, 포획 갑각류 분해물은 제1 프로테아제 혼합물을 사용해 50-80분간 또는 55-65분간 가수분해한다.
하기 값들을 조합하여, 2차 가수분해 단계에서 온도, 즉 인큐베이션하는 온도에 대한 최소치 및 최대치 또는 범위를 규정할 수 있다: 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃ 및 75℃. 예를 들어, 온도 범위는 약 45℃ 내지 약 75℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 50℃ 내지 약 60℃이다. 이들 온도는 물 온도, 또는 물, 효소(들) 및/또는 추출하기 위해 가공 처리된 크릴 새우 생산물로 된 혼합물의 온도에 적용될 수 있다. 예를 들어, 단백질분해 효소(들)와 혼합하기 전에 물을 미리 약 55℃ 또는 약 60℃의 온도까지 가열할 수 있다. 다른 예로, 효소(들)는 약 50℃ 내지 약 60℃에서 최적으로 작동할 수 있다.
일 구현예에서, 물을, 키틴 추출을 위해 가공 처리된 크릴 새우 생산물에, 약 1:1.5 비율로, 0.07% 내지 0.2%로, 제1 프로테아제 혼합물에, 약 50℃ - 60℃ 온도 범위에서 첨가한다.
키틴 조성물의 분리
키틴 조성물의 분리는 단백질 제거 단계 및 무기질 제거 단계를 포함한다.
크릴 새우 키틴의 본래의 구조를 보존하면서 단백질의 제거
크릴 새우의 키틴 함량은 전형적으로 크릴 새우 총 중량의 약 12-16%이다. 크릴 새우에 대한 단백질 제거 공정은 키틴과 단백질 간의 화학 결합의 파괴를 포함하며, 따라서 키틴으로부터 단백질을 분리할 수 있다.
본 발명은 크릴 새우 키틴의 본래의 구조를 실질적으로 보존하는 단백질 제거 방법을 제공한다. 크릴 새우 키틴의 분자량 (MW)은 약 250-350 kDa이다. 크릴 새우 키틴은 α-타입이며, 결정화도 수준이 높다 (약 90%).
일 측면에서, 천연 크릴 새우 키틴 구조는, 단백질 제거 공정 중에 키틴의 탈아세틸화 및 해중합을 최소화하거나 또는 완전히 회피함으로써, 보존된다. 예를 들어, 키틴의 적어도 약 50% 내지 약 99%는 아세틸화된 형태이다. 이 범위에서 하한에 대한 다른 예는 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70% 및 약 75%이다. 이 범위에서 상한에 대한 다른 예는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및 약 98%이다. 예를 들어, 키틴 조성물의 평균 분자량은 약 300 kDa 내지 약 400 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa이다. 이 범위에서 하한에 대한 다른 예는 약 300 kDa, 약 325 kDa, 약 340 kDa, 약 350 kDa 및 약 375 kDa이다. 이 범위에서 상한에 대한 다른 예는 약 300 kDa, 약 325 kDa, 약 350 kDa, 약 375 kDa, 약 380 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa 및 약 800 kDa이다.
일 구현예에서, 키틴 생산물은 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%로 동질적이다. 예를 들어, 키틴 생산물은, 키틴 생산물의 99%가 MW, 탈아세틸화, 순도 또는 결정화도 지수 등의 명시된 특징을 가지는 경우, 99%로 동질적인 것이다.
또한, 일부 구현예에서, 테르펜 (예를 들어, 아스타잔틴 (astaxanthin) 및 칸타잔틴 (canthaxanthin)) 역시 최종 생산물 키틴 조성물에 포함된다.
이러한 본래의 구조와 영양 요소의 보존으로, 생의학적 및 약제학적 용도에서 중요한 재현성을 가진 키틴 조성물 최종 생산물을 제조할 수 있다.
화학적 단백질 제거는 크릴 새우에 하나 이상의 단백질 제거 시약을 처리하는 것을 수반하며, 단백질 제거 시약으로는, 비-제한적으로, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO3, NaHSO3, CaHSO3, Na3PO4 및 Na2S 등이 있다. 화학적 시약을 특히 농도, 온도 및 시간의 더 높은 말단 값으로 사용하는 경우, 단백질 제거와 더불어, 키틴의 부분적인 탈아세틸화가 발생하고, 바이오폴리머가 가수분해되어 분자량이 감소되고, 즉 키틴의 본래의 구조가 파괴된다.
그러나, 본 발명의 일부 구현예에서, 온화한 조건 및/또는 낮은 농도에서 화학적 시약을 이용한 단백질 제거를, 다른 단백질 제거 방법과 조합할 수 있다. 예를 들어, 화학적 시약의 농도는 약 0.5M을 넘지 않으며, 온도는 약 50℃를 넘지 않고, 처리 기간은 약 1시간을 넘지 않는다. 예를 들어, 단백질을 제거하기 위해 25℃에서 45분간 0.3M NaOH 처리할 수 있으며, 동시에 탈아세틸화 및 해중합은 최소화된다.
일 구현예에서, 효소적 가수분해는 미리 냉동된 크릴 새우에 대해 수행하여, 가수분해된 크릴 새우 생산물을 제조할 수 있다. 가수분해된 크릴 새우 생산물은 디캔터 또는 세디캔터 (sedecanter)를 거쳐, 용해성 분획 (액체 상)으로부터 껍질 (고상)을 분리한다. 껍질은 이후 건조시키고, 전술한 염기들 중 한가지를 사용해 화학적 단백질 제거를 실시할 수 있다.
크릴 새우 가수분해물의 고상 또는 고체 분획은 지질은 다음과 같은 수치로 또는 다음과 같은 수치의 최저량 또는 최대량으로, 또는 다음과 같은 수치들로 구축된 범위로 포함한다: 고체 분획의 총 %를 기준으로, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%. 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 및 25%. 예를 들어, 크릴 새우 가수분해물의 고체 분획은 지질을 약 10% 내지 약 25%로 또는 약 13% 내지 약 18%로 포함할 수 있다.
크릴 새우 가수분해물의 고상 또는 고체 분획은, 단백질을, 다음과 같은 수치로 또는 다음과 같은 수치의 최저량 또는 최대량으로, 또는 다음과 같은 수치로 구축된 범위로 포함한다: 고체 분획의 총 %를 기준으로, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%. 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54% 및 55%. 예를 들어, 수득되는 크릴 새우 가수분해물의 고체 분획은 단백질을 약 35% 내지 약 55% 또는 약 40% 내지 약 50%로 포함한다.
예를 들어, 화학적 단백질 제거는 NaOH를 1M, 2M, 3M, 4M 또는 5M의 농도로, 상기한 수치의 최저 또는 최고 농도로 또는 상기한 수치들로 된 농도 범위로 사용해, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃ 및 100℃와 같은 승온된 온도, 상기한 수치의 최저 또는 최고 온도 또는 상기한 수치들로 된 온도 범위에서, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 및 10일과 같은 기간 동안, 상기한 수치의 최단 또는 최장 기간 동안 또는 상기한 수치로 된 기간 범위 동안, 수행할 수 있다.
크릴 새우의 무기질 제거
본 발명의 일부 구현예에서, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 탄산칼슘을 제거하여, 크릴 새우에서 무기질을 제거할 수 있다. 크릴 새우에 대한 무기질 제거는 바람직하게는 크릴 새우를 산 처리에 노출시켜 수행한다. 무기질 제거 시약의 예로는, 비-제한적으로, HCl, HNO3, H2SO4, CH3COOH 및 HCOOH 등이 있다. 바람직한 시약은 희석한 HCl이다. 산은 반응하여 탄산칼슘을 분해시키고, 이로써 수용성 칼슘 염, 물 및 이산화탄소가 생성된다. 크릴 새우에 존재하는 기타 무기질도 비슷하게 반응하여, 산의 존재 하에 용해성 염이 생성된다. 염은 여과 제거하고, 물로 세척한다. 무기질 제거 공정에서 산, 농도, 기간 및 온도는 당해 기술 분야의 당업자들에 의해 결정될 수 있다. 크릴 새우에서 무기질을 제거하기 위한 전형적인 조건에 대한 일 예는 20℃에서 1.5시간 동안 3.5% HCl을 처리하는 것이다.
예를 들어, 무기질을 제거하기 위한 산은, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 1 M, 1.1M, 1.2M, 1.3M, 1.4M, 1.5M, 2M, 2.5M, 3M, 3.5M, 4M, 4.5M 및 5M과 같은 농도, 상기한 수치의 최저 농도, 최고 농도 또는 상기한 수치로 된 농도 범위의, HCl일 수 있다. 무기질 제거 온도는 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 100℃, 105℃ 및 110℃와 같은 승온된 온도, 상기한 수치의 최저 온도, 최고 온도 또는 상기한 수치들로 된 온도 범위일 수 있다. 무기질 제거 기간은 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분 및 60분과 같은 기간, 상기한 수치의 최소 기간, 최대 기간 또는 상기한 수치들로 된 기간 범위일 수 있다.
일 구현예에서, 무기질 제거 조건은 0.5M - 2.0M HCl, 80℃ - 100℃ 및 20-45분을 포함한다. 일 구현예에서, 무기질 제거 단계는 90℃에서 30분간 1M HCl을 사용해 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 껍질에 1.7 M HCl을 주위 온도에서 6시간 동안 처리한 다음 2.5 M NaOH를 75℃에서 1시간 동안 처리한다.
1% 과망간산칼륨을 사용해 색소를 분해할 수 있다. 정제된 키틴 생산물은 동결건조한다.
일 구현예에서, 최종 키틴 생산물은 미량 무기질을 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, 최종 키틴 생산물은 미량 무기질을 5 ppm 미만, 4 ppm 미만, 3 ppm 미만, 2 ppm 미만, 1 ppm 미만, 0.9 ppm 미만, 0.8 ppm 미만, 0.7 ppm 미만, 0.6 ppm 미만, 0.5 ppm 미만, 0.4 ppm 미만, 0.3 ppm 미만, 0.2 ppm 미만 또는 0.1 ppm 미만으로 함유한다. 미량 무기질은 철, 칼슘, 인, 마그네슘, 포타슘, 아연, 니켈, 셀레늄 및 구리를 포함한다.
일 구현예에서, 무기질 제거는 단백질을 제거하기 전에 수행된다. 단백질 제거하기 전에 무기질 제거를 수행함으로써, 후속적인 키틴 조성물은, 무기질 제거 전 단백질 제거를 수행한 경우와 비교해, 최종 키틴의 순도는 높아지고, 짧아지고, 중량 소실은 많아진다.
일 구현예에서, 단백질 제거는 무기질 제거 전에 수행한다.
지질 제거
지질 제거 단계는 분리된 키틴을 "정제 (polish)"하기 위해 선택적으로 적용할 수 있다. 임의의 지질 제거 방법, 예를 들어 에탄올 또는 메탄올과 같은 유기 용매를 이용한 추출을 이용할 수 있다. 에탄올 또는 메탄올은 증류에 의해 추출물로부터 제거할 수 있다. 수득되는 정제된 키틴은 맑은 백색을 띤다.
결정화도 지수
결정화도 지수 (CI)는 결정질 상태로 존재하는 물질의 비율을 의미한다. 다시 말해, CI는 결정화도를 나타내는 정량적인 지표이다. 일반적으로, 키틴 및 이의 올리고머의 결정화도는 X선 회절 측정으로 평가할 수 있다. 키틴의 피크 세기를 4.5°-50°의 산란 범위에서, 스캔 증가폭 0.02° 및 속도 4.0°min- 1으로 기록한다. CI는 일반적으로 110의 최고 세기 (I110) 및 비정질 할로 기여 세기 (Iam)를 하기와 같이 이용하는 방법으로 계산한다:
CI = ((I110 - Iam)/ I110) x 100 (7)
결정화도 지수는 키틴 및 이의 유도체에서 결정질 분획에 대한 개념을 제공해준다.
키틴 생산물의 CI는 더 높은 CI를 달성하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 합성 샘플의 CI는 산/염기 농도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 더 높은 결정화도는 중간 염기 농도 및 낮은 산 농도를 적용해 달성할 수 있다. 다른 예로, CI는 진한 HCl로 분자의 비정질 부분을 산화시켜 높일 수 있다.
본 발명의 방법은, 부가적인 결정화 또는 재결정화 단계 또는 공정이 불필요한, CI가 적어도 80, 85, 90 또는 95인 크릴 새우 키틴을 제공해준다.
바람직하게는, CI는 다음과 같은 값보다 크거나, 또는 다음과 같은 값들을 이용해 CI 범위를 규정할 수 있다: 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 92, 93, 94 또는 95. 예를 들어, CI는 약 85% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과이다. 다른 예로, CI는 약 85 내지 약 95이다.
순도
최종 키틴 생산물의 순도는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 바람직하게는, 키틴 조성물은 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 순도를 가진다. 불순물은 단백질, 지질 및 무기질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 순도 95%인 본 발명에 따른 키틴 조성물은, 조성물이 키틴을 95%로 포함하고, 단백질, 지질, 무기질 및 이들의 조합을 5%로 포함하는 것을 의미한다.
크릴 새우-유래의 키틴 조성물 최종 생산물
최종 생산물을 제조하는데 있어 크릴 새우 껍질의 사용은, 크릴 새우가 예를 들어 항생제와 같은 합성 구성성분을 함유하지 않는다는 점에서, 기타 해양 자원과 비교해 유리하다.
생의학/약제학적 활용을 위해, 키틴에서 단백질을 완전히 제거하는 것이 중요한데, 그 이유는 인간 집단의 상당 비율이 갑각류 단백질에 알레르기 반응을 나타내기 때문이다. 최신 방법과는 달리, 본 발명의 단백질 제거 방법은 크릴 새우 키틴의 본래의 상태를 실질적으로 보존시켜, 최종 생산물을 재현 및 예측할 수 있다. 예를 들어, 분자량 (사슬 길이) 및 아세틸화 수준 (DA)과 같은 특성들을 재현할 수 있다. 이러한 재현가능한 제조 방법으로, 키틴 조성물 최종 생산물은 전형적으로 표준화가 필요한 약제학적 생의학적 용도로 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은, a) 본 발명의 방법에 의해 제조된 크릴 새우-유래 키틴 조성물, 및 b) 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 그대로 약제학적 제제로 제형화하거나, 또는 적절한 약제학적 담체 (비히클) 또는 부형제와 함께, 당해 기술 분야의 실무자들에게 이해되는 바와 같이, 제형화할 수 있다.
경구용 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분 등이 있으며, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 통상적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여용인 경우, 사용가능한 담체로는 락토스 및 옥수수 전분 등이 있다. 담체 및 부형제에 대한 추가적인 예로는 밀크, 당, 특정 타입의 클레이, 젤라틴, 스테아르산 또는 이의 염, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검류 및 글리콜 등이 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 크릴 새우-유래의 키틴 조성물을 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 크릴 새우-유래의 키틴 조성물을 포함하는 생의학적 기구를 제공한다. 이러한 기구에 대한 예로는 상처 드레싱, 생물막, 인공 피부, 포장재 및 백신 보강제 등이 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 나노결정을 제조하는데 이용하기 위한 키틴을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 키틴의 탈색 단계를 제공한다. 탈색은 키틴을 1% 옥살산에 적어도 10분, 적어도 20분 또는 적어도 30분간 침지하여 달성할 수 있다. 다른 구현예에서, 침지는 최대 45분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 수행한다. 탈색은 전술한 임의의 키틴 가공 또는 분리 단계에서 수행할 수 있다.
실시예
실시예 1
냉동된 남극 크릴 새우 (Euphausia Superba)를 해동하여, WO2010/030193에 기술된 바와 같이 효소적 가수분해 공정을 수행하였다. 크릴 새우 껍질을 디캔터를 사용해 분리하고, 그 함량을 분석하였다. 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1. 크릴 새우 껍질의 조성.
매개변수 함량
지질 16.2%
단백질 45.7%
회분 21.4%
키틴 13.7%
물 3.1%
껍질을 건조한 후 키틴 추출 공정의 원료로 사용하였다. 분리 공정을 표 2에 나타낸 바와 같이 4가지 방식으로 수행하였다.
표 2. 크릴 새우 껍질로부터 키틴 분리 공정.
샘플 ID# 1차 2차
1 1 M NaOH, 80℃, 24시간 1M HCl, 95℃, 30분
2 2M NaOH, 80℃, 7일 1M HCl, 95℃, 30분
3 4 M NaOH, 80℃, 7일 1M HCl, 95℃, 30분
4 1M HCl, 95℃, 30분 1 M NaOH, 80℃, 24시간

결과
샘플 ID# 단백질 % 키틴 % 지질 % 결정화도 지수 수율
1 0 84.6 15.4 82 21.5
2 0 82.4 17.6 82 13.0
3 0 82.5 17.5 84 18.9
4 97.1 2.9 85 15.6
시판 키틴은 결정화도 지수가 약 75%이다.
최종 키틴 생산물에는 미량 무기질이 없으며, 즉 무기질 함량은 1 ppm 미만이다.
실시예 2
실시예 2A - 크릴 새우의 가수분해.
크릴 새우 껍질을 EP2334199B1에 따라 준비하였다. 건조물 중량 40%가 수득되었으며, 껍질을 건조시켰다.
표 3. 건조된 껍질의 건조물 조성.
지질 5.2 %
단백질 21%
키틴 18.3%
회분 40.2 %
실시예 2B - 복수의 효소를 이용한 크릴 새우의 가수분해.
냉동된 크릴 새우를 동결건조한 후 껍질을 분리하였다. 40%의 건조물을 수득하였으며, 껍질을 건조하였다.
식품 등급의 효소 Endocut 및 Exocut (Tailorzymes 사에서 구입) 조합을 각각 약 0.4% 내지 약 0.04% 농도로 사용해 효소적 가수분해를 수행하였다. 온도는 55℃였으며, 반응 시간은 약 2시간이었다.
표 4
지질 23 %
단백질 10.8%
지질 37.6%
회분 19.2 %
실시예 2C - 이중 가수분해/재-가수분해
실시예 2B의 물질에 물 (1:1.5), 0.1% Endocut를 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
표 5. 건조물 기준.
지질 13.9 %
단백질 22.1%
키틴 44.8%
회분 19.2 %
실시예 2D - 실시예 2A 및 2B의 물질로부터 키틴 추출.
실시예 2A 및 2B에서 수득한 크릴 껍질로부터, 전술한 바와 같이, 화학적 무기질 제거 및 화학적 단백질 제거를 실시하여, 키틴을 추출하였다.
표 6. 추출된 키틴에 대한 특징 요약.
2A 2C
수율 60% 80%
결정화도 지수 85% 85%
순도 95% 95%
MW 650 kDa 650 kDa

Claims (70)

  1. 크릴 새우 키틴의 탈아세틸화 및 해중합이 최소화된 키틴 조성물의 제조 방법으로서,
    a. 크릴 새우 생산물에서 단백질을 제거하여 단백질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계; 및
    b. 아세틸화가 적어도 약 30% 내지 약 99%이고, 크릴 새우 키틴의 평균 분자량이 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 키틴 조성물을 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 크릴 새우 생산물이 크릴 새우 전체 (whole krill)를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 크릴 새우 생산물에서 무기질을 제거하여 무기질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 제거 후 무기질 제거가 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 80% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 90% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크릴 새우 키틴의 평균 분자량이 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85% 내지 약 95%의 결정화도 지수 (CI)를 포함하고, 상기 크릴 새우 키틴의 평균 분자량이 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 90% 이상의 동질성 (homogenous)을 가지는, 방법.
  11. 하기 단계 a 및 b를 포함하는 방법에 의해 제조되는 생활성 크릴 새우-키틴 조성물:
    a. 크릴 새우 생산물에서 단백질을 제거하여 단백질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계; 및
    b. 아세틸화가 적어도 약 95%이고, 키틴 조성물의 평균 분자량이 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa인, 생활성 크릴 새우-키틴 조성물을 분리하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 크릴 새우 생산물에서 무기질을 제거하여 무기질 제거된 크릴 새우 생산물을 제공하는 단계를 더 포함하는, 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 80% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 조성물.
  14. 키틴 조성물의 제조 방법으로서,
    a) 크릴 새우 생산물에 대해 1차 효소적 가수분해를 수행하여 크릴 새우 가수분해물을 제조하는 단계;
    b) 상기 크릴 새우 가수분해물에서 고형물을 분리하는 단계;
    c) 상기 고형물에 대해 화학적 단백질 제거 및 화학적 무기질 제거를 수행하여, 키틴 조성물을 제조하는 단계; 및
    d) i) 결정화도 지수 (CI)가 약 85% 초과이고;
    ii) 순도가 약 80% 초과이고; 및
    iii) 평균 분자량이 약 300 kDa 내지 약 700 kDa인, 키틴 조성물을 제공하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 1차 효소적 가수분해가 메탈로프로테아제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 1차 효소적 가수분해가 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 것을 더 포함하는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 효소적 가수분해가 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 단계 및 제2 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 제1 프로테아제 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하는 2차 효소적 가수분해를 포함하는, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 효소적 가수분해가 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 프로테아제 혼합물이 하나 이상의 염기성 프로테아제를 포함하고;
    상기 제2 프로테아제 혼합물이 산성 프로테아제, 중성 프로테아제 및 염기성 프로테아제를 포함하는, 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 프로테아제 혼합물이 포획 갑각류 분해물 (disintegrated crustacean catch)의 총 중량에 대해 0.3-0.5%를 구성하고, 상기 제2 프로테아제 혼합물이 포획 갑각류 분해물의 총 중량에 대해 0.03-0.05%를 구성하는, 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제가 바실러스 리체니포르미스 (Licheniformis)로부터 유래되는, 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 효소적 가수분해가 세포벽 분해 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학적 단백질 제거가 무기질 제거 전에 수행되는, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크릴 새우 가수분해물에서 고형물은 지질 약 10% 내지 약 25% 및 단백질 약 35% 내지 약 55%를 포함하는, 방법.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 크릴 새우 가수분해물에서 고형물은 지질 약 13% 내지 약 18% 및 단백질 약 40% 내지 약 50%를 포함하는, 방법.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학적 단백질 제거가 상기 고형물을 NaOH에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NaOH가 몰 농도로서 약 1M 내지 약 4M인, 방법.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학적 단백질 제거가 80℃에서 이루어지는, 방법.
  30. 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학적 단백질 제거가 약 1일 내지 약 7일간 이루어지는, 방법.
  31. 제14항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학적 단백질 제거가 약 1일 내지 약 4일간 이루어지는, 방법.
  32. 제14항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무기질 제거가 상기 고형물을 HCl에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 HCl이 몰 농도 약 1M인, 방법.
  34. 제14항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무기질 제거가 95℃에서 이루어지는, 방법.
  35. 제14항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무기질 제거가 약 30분간 이루어지는, 방법.
  36. 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    온도가 60℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃ 또는 100℃를 넘지 않는, 방법.
  37. 제14항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  38. 제14항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 90% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  39. 제14항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 95% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  40. 제14항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85 내지 약 95%의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 방법.
  41. 제14항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물은 미량 무기질의 총 함량이 5 ppm 미만, 1 ppm 미만, 및 0.1 ppm 미만인, 방법.
  42. 제14항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    미량 무기질의 각각의 함량이 5 ppm 미만, 1 ppm 미만 및 0.1 ppm 미만을 포함하는, 방법.
  43. 제14항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    미량 무기질이 철, 칼슘, 인, 마그네슘, 포타슘, 아연, 니켈, 셀레늄 및 구리를 포함하는, 방법.
  44. 제14항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물은 순도가 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 90% 이상 동질적인, 방법.
  46. 키틴 조성물로서,
    상기 키틴은 결정화도 지수가 80% 초과이고; 분자량이 700 kDa 미만이고; 순도가 90% 초과인, 키틴 조성물.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 크릴 새우 키틴 조성물인, 키틴 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 키틴 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 90% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 키틴 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 95% 초과의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 키틴 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 85 내지 약 95%의 결정화도 지수 (CI)를 포함하는, 키틴 조성물.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물은 순도가 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인, 키틴 조성물.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물에는 불순물이 실질적으로 없는, 키틴 조성물.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    불순물이 단백질, 지질, 미량 무기질 및 이들의 조합물을 포함하는, 키틴 조성물.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 없다는 것은 10% 미만을 포함하는, 키틴 조성물.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 없다는 것은 5% 미만을 포함하는, 키틴 조성물.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    실질적으로 없다는 것은 1% 미만을 포함하는, 키틴 조성물.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물은 미량 무기질의 총 함량이 5 ppm 미만, 1 ppm 미만 및 0.1 ppm 미만인, 키틴 조성물.
  59. 제46항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    미량 무기질의 각각의 함량이 5 ppm 미만, 1 ppm 미만 및 0.1 ppm 미만인, 키틴 조성물.
  60. 제46항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    미량 무기질이 철, 칼슘, 인, 마그네슘, 포타슘, 아연, 니켈, 셀레늄 및 구리를 포함하는, 키틴 조성물.
  61. 제46항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 단백질을 10% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 단백질을 5% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  63. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 단백질을 1% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  64. 제46항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 단백질을 0.1% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  65. 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 지질을 10% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  66. 제46항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 지질을 5% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  67. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 지질을 1% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  68. 제46항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 지질을 0.1% 미만으로 포함하는, 키틴 조성물.
  69. 제46항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴 조성물이 약 300 kDa 내지 약 800 kDa, 약 400 kDa 내지 약 700 kDa, 또는 약 400 kDa 내지 약 600 kDa의 평균 분자량을 포함하는, 키틴 조성물.
  70. 제46항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키틴이 약 80% 내지 약 90%의 결정화도 지수; 약 400 kDa 내지 약 600 kDa의 평균 분자량; 및 약 90% 내지 약 98%의 순도를 포함하는, 키틴 조성물.
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