KR20210010697A

KR20210010697A - 성장판 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20210010697A
Application number: KR1020190086412A
Authority: KR
Inventors: 민병현
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-01-28
Also published as: EP4000625A1; KR102334886B1; US20230048106A1; EP4000625A4; JP2022541227A; WO2021010702A1

Abstract

본 발명은 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 성장판 재생용 조성물을 제공한다.
상기 성장판 재생용 조성물은 지지체없이 성장판 손상 부위의 골 가교를 억제하고 성장판 연골 조직으로 분화하여 손상 부위를 효과적으로 충전 및 재생시킬 수 있으며, 재생된 성장판 조직은 성장능을 회복할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 생체 조직에 적합하고 안전하며, 재현성 및 균질성이 높은 특징을 가진다.

Description

성장판 재생용 조성물{COMPOSITION FOR REGENERATION OF GROWTH PLATE}

본 발명은 성장판 재생용 조성물에 관한 것이다.

성장판(Growth Plate)이란, 팔다리뼈의 가운데 부분과 양 끝 부분의 사이에 남아 있는 연골조직으로, 골의 길이 성장이 일어나는 부분이다. 골단 연골이라고도 하는데, 팔다리뼈가 모두 연골인 태아가 성장하면서 연골의 한가운데 부분이 뼈로 바뀌면서 양쪽 끝으로 점차 퍼져나가게 되고(일차 골화중심), 팔다리뼈의 양쪽 끝에 아직 뼈로 바뀌지 않은 연골 부위에 자체적으로 또 뼈로 바뀌는 부분이 나타난다(이차 골화중심). 이렇게 뼈로 바뀌고 그 사이에 남은 연골 부분이 성장판이 되며, 사춘기쯤 되면 성장판도 모두 뼈로 바뀌게 되면서 길이 성장이 끝나게 된다.

성장판 골절 형태를 다섯 가지로 분류한 솔터-해리스(Salter-Harris) 분류법에 따르면, 제1 형은 골절이 가장 경한 경우로, 엑스레이로도 관찰되지 않는 경우가 많고, 빠르면 3주 이내 회복되며 다른 문제를 남기지 않는 편이다. 제2 형은 골절이 성장판 위에 있는 형태로, 성장판 손상 부분 및 성장판 손상이 없는 부분이 형성되며, 필요시 수술적 치료를 할 수 있다. 제3, 4 형 및 제5 형은 제1, 2 형에 비해 중한 경우로, 먼저, 제3 형은 골절이 성장판 아래 관전면까지 퍼져있는 형태로, 부분적인 성장 장애를 나타낼 수 있다. 제4 형은 골절이 성장판을 통과하여 관절까지 진행된 경우로 수술적 치료가 필요하며, 처치 없이 그냥 둘 경우 뼈의 변형 등이 생길 수 있다. 제5 형은 수직으로 힘이 가해져서 생기는 골절로, 성장판 골절 중에서 성장 장애 등의 가장 나쁜 예후를 가져올 수 있다. 제1 형 및 제2 형은 2-40% 정도 발생되고, 제3 형 및 제4 형은 8-50% 정도 발생된다.

일반적으로 손상된 성장판의 40-70%에서 골 가교가 형성되며, 이로 인한 골 성장에 문제가 생겨 길이 성장 장애, 각변형 등의 심각한 문제가 발생한다. 현재, 이러한 문제를 해결하기 위한 치료 방법으로 장애 발생 이후 성장판이 닫힐 때가지 기다려서 시행되는 변형 교정술이 있으나, 이는 여러 차례의 수술이 필요하고, 변형 잔존, 신경 손상, 필러 등 많은 후유증을 동반하는 문제점이 있다. 변형 초기에 시행할 수 있는 수술로는 골 형성 부위 제거술이 있는데, 성장판에서 골화가 일어난 부위를 제거한 뒤, 자가 지방조직, 실리콘, 본 왁스(bone wax) 등의 골화 차폐 재료를 삽입하나, 상기 골화 차폐 재료는 성장판 기능을 수행하지는 못하는 한계가 있다. 따라서 성장판 손상의 근본적인 치료를 위한 새로운 치료제가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1229436호(2013년01월29일)

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 성장판 재생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 성장판 재생용 조성물을 포함하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 성장판 재생용 조성물은 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 성장판 손상 치료용 약학 조성물은 상기 성장판 재생용 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 생체 조직에 적합하고 재현성 및 균질성이 높으며, 인공 지지체 없이 조직 공학적으로 젤 형태의 성장판 유사 조직으로 분화될 수 있다.

상기 조성물은 성장판 손상 부위의 골 가교를 억제하고 성장판 연골 조직으로 분화하여 손상 부위를 효과적으로 충전 및 재생시킬 수 있으며, 이에 따라 재생된 성장판은 성장능 등의 기능이 회복될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 안전하고, 수술 시 특별한 수술 기기를 요하지 않으며, 손상 부위의 크기 및 모양에 관계없이 쉽게 이식함으로써 보다 간편하게 손상된 성장판을 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 성장판 젤을 이용한 성장판 치료 방법을 간략하게 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 토끼의 손상된 성장판 내에 상기 실시예 2에 따라 제조된 성장판 젤을 이식하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에 따른 토끼 성장판 손상 모델의 마이크로-CT(micro-CT) 이미지 및 조직 분화를 확인한 이미지이다.
도 4는 도 2에 따른 토끼 성장판 손상 모델 실험의 면역 염색 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 길이 및 각변형 측정 결과 그래프이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 조직 분화를 확인한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 4, 14, 21, 28주의 사프라닌-O(Safranin-O) 및 u-CT 이미지이다.
도 10은 배양 방법에 따른 성장판 젤의 특징을 관찰한 것이다.
도 11은 원심분리(centrifuge) 조건에 따른 성장판 젤의 특징을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 성장판 젤의 모습이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 성장판 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "태아연골조직 유래 세포"는 태아연골조직으로부터 분리된 세포를 총칭하며, 바람직하게는 콜라게나제(collagenase) 등을 이용하여 연골 조직을 완전히 소화시킨 후 분리된 연골전구세포(chondrocytes)이다.

본 발명에서, "태아연골조직 유래 세포외기질(Extracellular Matrix)"은 태아연골조직 유래 세포로부터 세포에 의해 합성되고 세포 외에 분비, 축적된 분자로 구성되어 있는 생체 고분자의 집합체로, 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 복합 단백질, 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 등의 세포 부착성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 세포외기질은 상기와 같은 단백질로 조직의 모양을 이루면서 조직의 물리적 성질을 결정하며, 세포의 환경을 유지하는데 중요한 역할을 한다.

본 발명에서, "성장판(growth plate)"은 동물의 길이 생장을 담당하는 부위이자 사람의 키가 자라게 하는 신체 부위로, 장골(long bone)의 끝부분에 존재하는 일종의 연골(cartilage)이다. 조직학적으로는 유리연골(초자연골, hyaline cartilage)에 속하며, 뼈끝판, 골단판이라고도 한다.

본 발명에서, "재생(regeneration)"은 여러 가지 원인으로 조직 또는 기관의 결손 등이 일어났을 경우, 이전과 똑같은 조직 또는 기관으로 그 결손부를 보충, 복구, 회복하려는 작용을 말한다.

본 발명에 따른 성장판 재생용 조성물은 물, 콜라겐, 글리코사미노글리칸(GAG) 및 DNA로 이루어지며, 젤(gel) 형태일 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 조성물 전체 100 중량부에 대하여, 상기 물 60 내지 98 중량부, 상기 콜라겐 5 내지 15 중량부, 상기 글리코사미노글리칸 1 내지 5 중량부 및 상기 DNA 0.5 내지 3.5 중량부일 수 있다.

본 발명에서, "젤(gel)"은 젤리와 유사한 물질로서 부드럽고 약한 범위로부터 강하고 거친 범위까지의 물성을 가지며, 젤의 대부분 중량은 액체(liquid)이나 3차원 네트워크 구조로 인해 전체적으로는 고체와 같이 행동하며, "겔"과 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 성장판 재생용 조성물을 포함하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 "성장판 손상"은 성장판, 성장판 조직 등이 기계적 자극이나 염증 반응에 의한 손상, 결함, 결손이 발생한 것으로, 이로 인한 질환도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 침습점 절개 또는 외상 수술 시 수술 절개부를 통해 삽입되어, 성장판 손상 또는 결손 부위를 재생시킬 수 있다. 성장판이 손상된 후 4주 이내 골 가교가 형성될 수 있는데, 상기 약학 조성물은 성장판에 이식된 후 3 내지 5주, 바람직하게는 4주까지 잔존하여 골 가교 형성을 억제하고, 이후 성장판 유사 조직으로 분화될 수 있다. 또한, 상기 성장판 유사 조직으로 재생된 후, 상기 조직은 성장판으로써의 그 기능이 회복될 수 있고, 성장능 등이 계속적으로 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 성장판 손상 또는 결손 부위에 직접 주입 가능한 형태로 제형화될 수 있고, 예를 들어, 지지체없이 상기 세포 및 세포외기질을 포함하는 젤 형태일 수 있다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 성장판 젤을 이용한 성장판 치료 방법을 간략하게 나타낸 것으로, 상기 조성물은 바람직하게는 도 1과 같이 상기 젤을 포함하는 주사제 형태로 제조되어 이식될 수 있다.

또한, 상기 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조될 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질 방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알콜 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 주사제는 3 내지 5℃, 바람직하게는 4℃의 냉장 상태에서 24시간 보관될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 성장판의 손상을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 성장판 손상 또는 결손 부위의 크기에 따라 적절한 용량으로 이식될 수 있다.

또한, 본 발명은 성장판 재생용 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 성장판 재생용 조성물 제조방법은 사람 태아연골조직으로부터 분리된 연골전구세포를 배양하는 제1 단계; 상기 배양된 연골전구세포로부터 상기 세포 및 이의 세포외기질을 포함하는 세포막을 수득하는 제2 단계; 상기 수득된 세포막을 연골분화배지에 넣고 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는 제3 단계; 및 상기 얻은 세포 펠릿을 상기 연골분화배지에서 배양하여 성장판 젤을 제조하는 제4 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 제1 단계는 사람 태아연골조직으로부터 분리된 연골전구세포를 배양하는 단계로, 상기 연골전구세포는 태아의 관절 부위로부터 분리된 연골조직으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 12 내지 15주 된 태아의 무릎관절로부터 연골조직을 분리하였다.

상기 연골조직은 콜라게나제, 펩신 등과 같은 프로테아제(protease)로 처리될 수 있고, 이에 따라 방출된 세포들을 취합하여 원심분리한 후, 침전된 연골전구세포를 배양배지에 접종할 수 있다. 상기 연골전구세포는 항생제가 첨가된 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Egle Medium; DMEM)에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 이외의 통상적으로 사용되는 배양 배지에서 배양될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 연골전구세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 units/mL 페니실린(penicillin) 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM에서 15 내지 18일 동안 단층 배양되었다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 제2 단계는 상기 제1 단계에서 배양된 연골전구세포로부터 상기 세포 및 이의 세포외기질을 포함하는 세포막을 수득하는 단계로, 일반적인 세포의 취득 방법과는 다르게, 본 발명에서는 상기 세포 및 세포외기질을 모두 포함하는 세포막을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 배양 후 배지를 제거하고 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하여 처리 후 세포들을 파이펫으로 분리하지 않고 세포 및 세포외기질을 포함하는 세포막 전체를 한 번에 수득하였다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 제3 단계는 상기 제2 단계에서 수득된 세포막을 연골분화배지에 넣고 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는 단계로, 상기 "연골분화배지"는 시험관 내 성장 및 생존을 지지하며 성장판 재생용 조성물로 제조될 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지를 의미하며, 배양 기간 동안 세포로부터 분비된 기질 등과 세포 배양에 소모되고 남은 영양성분 등을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 연골분화배지로 1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β를 포함하는 둘베코 수정 이글 배지-고당(Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose; DMEM-HG)을 사용하였다.

상기 제3 단계의 원심분리는 200 내지 1500×g의 회전수로 10 내지 30분간 수행될 수 있다. 바람직하게는 1000×g의 회전수로 20분간 수행될 수 있다. 상기 원심분리 조건에 따른 조직의 모양 및 물성의 변화는 없지만, 상기 회전수와 수행 시간에서 가장 안정적인 재현성이 나타날 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 제4 단계는 상기 제3 단계에서 얻은 세포 펠릿을 상기 연골분화배지에서 배양하여 성장판 젤을 제조하는 단계로, 상기 배양 방법에 따라 성장판 젤의 특성이 달라질 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 웰 플레이트에서 고밀도 배양 시, 배양 기간이 길어질수록 멤브레인이 두꺼워지면서 전체적인 조직의 크기가 커지고 물성이 부드러워지는 경향이 나타났다. 또한, 웰 수가 많아질수록 멤브레인이 얇아지고 크기가 작아지는 경향이 나타났다. 이에 따라, 상기 배양은 6 내지 24웰(well) 플레이트에서 1 내지 3일간 수행될 수 있고, 바람직하게는 6웰 플레이트에서 3일간 고밀도(High density, HD)로 배양될 수 있으며, 이때, 조직 제작 재현성 및 제작 균질성이 보다 높아질 수 있다. 이렇게 제조된 성장판 젤은 지지체없이 상기 세포 및 세포외기질로만 이루어질 수 있고, 보다 상세하게는 물, 콜라겐, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 및 DNA로 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포의 분리 및 배양

태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 포함하는 성장판 젤의 제조를 위하여, 12~15주된 태아의 무릎관절로부터 연골전구세포를 분리하였다. 상기 무릎관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충용액(phosphated buffered saline; PBS)으로 세척한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)를 포함하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Egle Medium; 이하, DMEM, Gibco, Grand Island, NY)로 4시간 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골 세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 다음, 침전된 연골전구세포를 조직 배양접시(배양 접시 당 1×10⁶cells의 밀도에 150mm(dia.)×20mm(h))에 접종하였다.

<실시예 2> 성장판 젤의 제작

상기 실시예 1에서 수득한 연골전구세포(chondrocytes)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 units/mL 페니실린(penicillin) 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM에 2×10⁵cells로 희석한 다음, 15~18일 동안 단층 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 0.05% 트립신-EDTA(Gibco)를 첨가하여 세포외기질과 결합된 세포막을 수득하였다. 세포 및 세포외 기질이 결합된 세포막의 수득은 0.05% 트립신-EDTA(Gibco) 처리 후 세포들을 파이펫으로 분리하지 않고 세포 및 세포외기질을 포함하는 세포막 전체를 한 번에 수득하였다.

수득한 세포 및 세포외기질을 포함하는 세포막을 연골분화 배지(1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β를 포함하는 Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose; DMEM-HG)가 포함된 50 ml 튜브에 넣고 250×g에서 20분 동안 원심분리하여 펠릿 형태의 구조체를 제조하였다.

제조된 세포 펠릿을 상기 조성과 동일한 연골 분화 배지가 담긴 배양접시에 넣고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 1주, 2주 및 3주 동안 배양하여 성장판 젤을 제조하였다.

<실험예 1> 토끼 성장판 손상 모델에서 성장판 젤 주입에 따른 조직 특성 변화 및 성장판 조직으로의 활성 확인

도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 토끼의 손상된 성장판 내에 상기 실시예 2에 따라 제조된 성장판 젤을 이식하는 과정을 나타낸 것이다. 토끼는 성장판의 직접적인 역할인 골 길이와 각변형에 대한 결과를 확인할 수 있어, 본 발명의 치료 기전으로 타겟하는 성장판 젤 개발의 역할을 정확히 확인 가능한 모델이다.

도 2를 참조하면, 토끼에서 성장판 부분을 2mm 펀치로 두 번 비스듬히 뚫은 후, 본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 성장판 젤을 이식한 뒤, 이식 부위를 분리하고 동결 절편기를 사용하여 4 ㎛ 두께로 절편하여 슬라이드를 제작하여 골 성장 형태 및 이식한 성장판 젤의 동태를 확인하였다. 그룹 1(group 1)은 성장판을 손상시킨 음성 대조군(negative control)이고, 그룹 2는 현재 임상에서 가장 많이 사용되고 있는 본 왁스(bone wax)를 이식한 양성 대조군(positive control)이다.

도 3은 도 2에 따른 토끼 성장판 손상 모델의 마이크로-CT(micro-CT) 이미지 및 조직 분화를 확인한 이미지이다.

도 3을 참조하면, 상기 토끼 성장판 손상 모델의 마이크로-CT(micro-CT) 이미지를 확인한 결과, 4주차에서는 각 그룹(normal(성장판 정상 모델), group 1(성장판 손상 모델/음성 대조군), group 2(본 왁스 이식 모델/양성 대조군), group 3(성장판 젤 이식 모델))에서 확연한 차이가 나지 않았지만, 8주 후의 경우, 각 그룹마다 확연한 차이가 나타났다. 음성 대조군(그룹 1)과 양성 대조군(그룹 2)에서 골의 각변형이 일어나고 있었고, 양성 대조군(그룹 2)의 본 왁스는 이식 공간을 채우는 효과는 있으나, 이식재가 골 조직으로 유지되는 한계가 있었다. 반면에, 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)의 경우 연골을 형성시켜 육안으로 관찰하였을 때에도 이식한 부위가 보이지 않을 만큼 성장판 정상 모델(normal)의 골 각도와 동일한 정상 연골로 재생되어 성장판 젤의 유효성을 확인할 수 있었다.

또한, 사프라닌-O(Safranin-O; SO), 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin; H&E, HE) 염색을 통해, 음성 대조군(그룹 1)과 양성 대조군(그룹 2)의 경우에는 손상 부위에 골 조직이 형성되는 반면, 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)의 경우에는 얇지만, 연골조직이 성장판 위치에 자리하고 있는 것을 확연하게 확인할 수 있었다.

도 4는 도 2에 따른 토끼 성장판 손상 모델 실험의 면역 염색 이미지로, A는 토끼 성장판 정상 모델의 면역 염색 이미지이고, B는 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)의 면역 염색 이미지이다.

도 4를 참조하면, 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)에서 성장판 정상 모델(normal)의 경우와 유사하게 콜라겐과 당단백을 형성하고 있음이 확인되었고, 골 형성 단계인 콜라겐 X(col X)의 경우 8주 이후에 형성되어 골화가 늦게 일어나거나 방지될 것으로 예상되었다.

<실험예 2> 레트(rat) 성장판 손상 모델에서 성장판 젤 주입에 따른 변화 확인

도 5는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델이다. 상기 실험예 1에 따른 토끼 모델의 경우, 성장판의 역할을 임상적 효과로 확인 가능한 반면, 대량의 동물 시험 및 작용 기전을 연구하기에는 한계가 있기에, 레트(rat) 모델에서 성장판 손상 및 치료 효과에 대해서 실험하였다.

도 6은 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 길이 및 각변형 측정 결과 그래프이다. 음성 대조군인 레트 성장판 손상 모델(그룹 1), 양성 대조군인 본 왁스 이식 모델(그룹 2) 및 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)의 4주 후의 길이 성장 및 각변형을 측정하였다.

도 6을 참조하면, 길이 성장의 경우에는 레트 성장판 손상 모델(그룹 1)에서만 길이 성장에 대한 차이가 관찰되었고, 각변형의 경우에는 레트 성장판 손상 모델(그룹 1)에서 가장 크게 관찰되었고, 본 왁스 이식 모델(그룹 2)에서도 그룹 1만큼은 아니지만, 각변형이 관찰되었다.

도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 조직 분화를 확인한 이미지이다.

도 7 및 도 8을 참조하면, 사프라닌-O 및 헤마톡실린&에오신 염색 결과, 4주 후 레트 성장판 손상 모델(그룹 1) 및 본 왁스 이식 모델(그룹 2)에서는 손상 부위에 골 조직이 형성되었으나, 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)의 경우에는 골 분화는 일어나지 않고 연골조직으로 유지되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 성장되는 부위에 비대성 마커(hypertrophic marker)가 발현됨으로써 길이 성장의 가능성을 확인할 수 있었다.

또한, 성장판 젤 이식 모델(그룹 3)에서 성장판 젤이 이식되었을 것으로 예상되는 부위를 HuNA(humen cell marker) 염색함으로써 이식된 조직을 확인하였고, PCNA(proliferating cell marker) 염색을 통해 증식 세포를 확인하였다.

도 9는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트 모델의 4, 14, 21, 28주의 사프라닌-O(Safranin-O) 및 u-CT 이미지이다.

도 9를 참조하면, 이식 후 4, 14, 21, 28주에 사프라닌-O와 u-CT를 수행한 결과, 동일한 경향성이 나타나는 것을 확인하였다. 레트 성장판 손상 모델(그룹 1) 및 본 왁스 이식 모델(그룹 2)에서는 성장판 손상 부위의 연골 조직이 발견되지 않았고, u-CT 결과에서 골이 형성되었음을 확인하였다. 특히, 레트 성장판 손상 모델(그룹 1)은 모든 주령에서 각변형이 관찰되었다.

<실험예 3> 배양 방법에 따른 성장판 젤의 특성 확인

도 10은 배양 방법에 따른 성장판 젤의 특징을 관찰한 것으로, 조직 배양 용기 및 고밀도(High density, HD) 배양 기간에 따른 조직 크기, 물성(Handling test)을 확인하였다.

도 10을 참조하면, 기존에 구축된 60mm 디쉬(dish)에서 고밀도(High density, HD)로 5-6일간 배양하던 방법을 6웰(well), 12웰, 24웰에서 고밀도로 1, 2, 3일 배양하는 방법을 시행하였다. 배양 플레이트에서 고밀도로 배양 시, 1일째에도 멤브레인(membrane)이 잘 형성되었고, 고밀도 배양 기간이 길어질수록 멤브레인이 두꺼워지면서 전체적인 조직의 크기가 커지고 물성도 부드러워지는 경향이 나타났다. 또한, 6웰, 12웰, 24 웰로 갈수록 멤브레인은 얇아지고 크기도 작아지는 경향이 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로, 성장판 젤 제조시, 조직 제작 재현성 및 제작 균질성이 높은 6웰 플레이트에서 3일의 고밀도 배양 기간을 최적화된 공정으로 확립하였다.

도 11은 원심분리(centrifuge) 조건에 따른 성장판 젤의 특징을 나타낸 것으로, 2차원 배양 후 3차원 배양으로 넘어가기 전 단계인 원심분리 조건을 조정하였을 때, 상기 성장판 젤의 물성(Handling test)에 어떤 영향을 주는지 확인하였다.

도 11을 참조하면, 이전에 확립된 원심분리 조건인 1000×g, 20분에서, 500×g, 20분, 250×g, 20분으로 설정하여 시행한 결과, 원심분리 조건에 따른 조직의 모양과 물성 변화는 없는 것으로 나타났고, 조직의 크기는 1000×g에서 250×g로 갈수록 작아지는 경향을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로, 250×g, 20분의 조건에서 조직의 부피가 가장 크나, 고밀도 배양된 막이 말리는 과정에서 1000×g, 20분 조건의 경우에 가장 안정적인 재현성이 나타나므로 1000×g, 20분을 최적화된 공정으로 확립하였다.

<제조예 1> 성장판 젤

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 성장판 젤의 모습이다.

도 12를 참조하면, 상기 성장판 젤은 무색의 원(구)형 인공 연골젤로, 20±15 ㎍/㎎(또는 2±1.5 %)의 DNA, 800±180 ㎍/㎎(또는 80±18 %)의 수분, 30±20 ㎍/㎎(또는 3±2 %)의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 및 100±50 ㎍/㎎(또는 10±5 %)의 콜라겐으로 이루어짐이 확인되었다.

또한, 4×10⁶ cells 이상의 연골세포로 완제의약품을 만들었을 때 무게는 50±20 ㎎으로 측정되고, 젤 타입의 인공연골의 완제의약품 물성은 10±8 kPa로 측정되었다.

<비교예 1> 본 왁스(bone wax), 실라스틱(silastic)과의 비교

기존 제품인 본 왁스 및 실라스틱(실리콘)과 본 발명의 일 실시예에 따른 성장판 젤을 비교하였을 때, 기존 제품은 골 차폐 기능이 우수한 치밀 젤이나, 단순 차폐 기능의 재료들로 오히려 성장판 결손 부위를 발생시키는 문제점을 가진다.

반면에, 상기 성장판 젤은 조직 공학 제제로서 차폐 기능이 우수하고, 세포 분화 및 세포외기질 재생성으로 조직 복원이 가능하며, 나아가 리모델링 및 성장도 가능한 특징을 가진다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 성장판 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은,
물, 콜라겐, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 및 DNA로 이루어지며, 젤(gel) 형태인 것을 특징으로 하는 성장판 재생용 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 조성물은,
상기 조성물 전체 100 중량부에 대하여,
상기 물 60 내지 98 중량부, 상기 콜라겐 5 내지 15 중량부, 상기 글리코사미노글리칸 1 내지 5 중량부 및 상기 DNA 0.5 내지 3.5 중량부인 것을 특징으로 하는 성장판 재생용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 조성물은,
침습점 절개 또는 외상 수술시 수술 절개부를 통해 삽입되어, 성장판 손상 또는 결손 부위를 재생시키는 것을 특징으로 하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 조성물은,
성장판에 이식된 후 3 내지 5주까지 잔존하여 골 가교 형성을 억제하고, 이후 상기 성장판의 조직으로 분화되는 것을 특징으로 하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 조성물은,
주사제 형태로 제조되어, 3 내지 5℃의 냉장상태에서 24시간 보관이 가능한 것을 특징으로 하는 성장판 손상 치료용 약학 조성물.