KR20210005060A - 탄화수소 생산 - Google Patents

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KR20210005060A
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acid decarboxylase
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나이젤 스크루턴
헬렌 투굿
로빈 호에벤
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씨3 바이오-테크놀로지스 리미티드
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Abstract

지방산 데카복실라제가 개시되어 있으며, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2에 대해 적어도 40% 서열 동일성, 및 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.

Description

탄화수소 생산
본 출원은 2018년 4월 20일자로 출원된 제GB 1806483.2호로부터의 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 구성요소는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 탄화수소의 효소적 생산 및 이러한 공정에 사용하기에 적합한 효소, 작제물(construct) 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바이오매스 공급원료(biomass feedstock)로부터 경질 알칸, 예를 들면, 부탄, 프로판 및 이소부탄의 효소적 생산 물질 및 방법에 관한 것이다.
배경
경제적으로 실현가능한 미생물 바이오연료의 개발로의 집중적인 연구는 탄소 배출을 감소시키고, 화석 연료 공급을 줄이는 세계적인 관심과 재생가능하고 지속가능한 대안적 전략을 개발할 필요성의 반영이다[1,2]. 에너지 안보 및 기후 변화에 대한 관심은 온실 가스 배출을 제한하고 폐 생물재료 재순환 및 보다 더 바이오-기반한 경제를 향한 추진력을 증가시키는 정부 정책을 유도하였다[3,4]. 이는 광범위한 최근 연구를 바이오-알코올(bio-alcohol)과 같은 바이오연료(biofuel) 생산, 광범위한 미생물 숙주의 활용으로 유도하였다[5].
현재의 수송 화석 연료(예컨대, 무연 가솔린)는 30개 이상의 지방족 및 방향족 탄화수소, 주로 펜탄, 프로판 및 노난으로 구성되어 있다[6]. 화석 연료의 소비는 온실가스 배출, 산성비 및 궁극적으로 기후 변화에 기여하는, 주요 오염원이다. 대조적으로, 프로판은 저 탄소 족적(low carbon footprint) 및 조 오일(crude oil)보다 일산화탄소 및 탄화수소 배출에 있어서의 유의적인 감소를 지닌 고 효율적이고 깨끗하게 불타는(clean-burning) 연료이다. 이는 액화 석유 가스(LPG)의 주요 구성성분이며, 천연 가스 또는 석유 정제로부터 공급된다[7]. 이는 제3의 가장 광범위하게 사용된 수송 연료(1년당 2000 만톤)이며, 가정용 열, 에너지 및 친환경 냉각제 및 에어로졸 추진제용의 인기있는 공급원이다[7,8]. 이는 오염되는 탄화수소로부터 이의 용이한 분리 및 액화 및 저장을 위한 보다 낮은 에너지 요건으로 인하여 대안적인 가스 연료를 능가하는 이점을 갖는다[8].
미생물 원천의 프로판에 대한 경로는 이의 생산에 대한 임의의 공지된 천연 물질대사 경로의 부재에 의해 제한된다. 그러나, 프로콜로로코쿠스 마리누스 균주(Procholorococcus marinus st.) MIT9313으로부터 시아노박테리아 알데하이드 탈포밀화 효소(cyanobacterial aldehyde deformylating enzyme: ADO)의 발견은 탄화수소로의 미생물 경로가 가능하였음을 입증하였다[9]. 이러한 효소는 1차의 장쇄 지방 알데하이드의 알칸 탄화수소 및 포르메이트로의 페레독신(ferredoxin) 및 산소-의존성 탈카보닐화를 촉매한다(도 1a)[9]. ADO의 기질 접근 채널의 구조-기반 가공은 프로판 생산이 향상된 변이체 A134F를 생성하였다[10]. ADO를 이용하는 이. 콜라이(E. coli)내 미생물 프로판 생산에 대한 합성 생물학 접근법이 기술되었으며, 여기서 전구체 부티르알데하이드의 생성은 지방산 생합성[11], 역 b-산화[6], 발린 생합성(이소부티르알데하이드 전구체)[7] 또는 클로스트리디움성 부탄올 생산 경로(clostridial butanol production pathway)[8]를 통한다. 그러나 각각의 경로는 극도로 낮은 ADO의 턴오버 수(turnover number)(~ 3-5 h-1)와 함께, 헵탄알을 사용하여 보고된 단지 ~1 min-1의 k cat 값의 병목현상(bottleneck)을 겪는다[12]. 따라서 보고된 미생물 바이오프로판 수율은 단지 32 mg/L 이하이다[6,8,11].
바이오프로판으로의 이러한 경로가 상업적으로 실현가능해지기 전에 부티르알데하이드를 사용하여 ADO의 촉매율에 있어서의 고려할만한 개선이 요구되고 있다.
최근에 새로운 부류의 광효소가 기술되었으며, 이는 유리 지방산의 n-알칸 또는 알켄으로의 청색광 의존적인 탈카복실화를 촉매한다[13]. 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis) NC64A로부터의 이러한 지방산 광데카복실라제, 또는 광알칸 신타제(PAS 또는 FAP)는 당-메탄올-콜린 옥시도리덕타제 계열의 구성원이며, 양자 수율이 >80%(0.86 ± 0.13 s-1)인 결합된 광여기성 FAD 보조인자(bound photoexcitable FAD cofactor)를 함유한다[13]. 이러한 발견은 촉매적으로 느린 ADO 효소에 대한 필요성을 무시하므로 바이오촉매적으로 생성된 탄화수소 연료 분야가 가능해지도록 한다. 장쇄 지방산이 PAS의 바람직한 기질(substrate)이지만, 효소를 가공하여 부티르산을 사용한 성능을 증가시키는 것은 프로판으로의 생합성 경로를 제공할 수 있다.
씨. 바리아빌리스(C. variabilis)로부터의 지방산 데카복실라제(CvPAS 또는 CvFAP)를 사용하는, 생체내(in vivo) 바이오프로판 생산 생물공장(biofactory)의 개발이 본원에 기술되어 있다. 본 발명자들은 기질 접근 채널내에 부위 지시된 돌연변이를 수행하여 부티르산에 대해 개선된 성능을 지닌 변이체 G462V(G402V 성숙 서열)를 생성하였다. 연구는 폴리하이드록시알카노에이트 바이오플라스틱의 생산을 위한 공지된 견고한 저 비용 생산 숙주인, 호염성(halophillic) 할로모나스(Halomonas) 균주 내에서 수행하였다[14,15]. 이러한 유기체는 유의적인 미생물 오염없이 비-멸균 조건 하에서 고 pH 및 고 염 농도 둘 다에서 성장할 수 있다[14]. 본 발명자들이 아는 바로는, 이는 할로모나스를 가스성 바이오연료 생산 숙주로서 사용한 최초 보고된 예이며, 향상된 프로판-생산 CvPAS 변이체와의 조합은 상업적으로 실행가능한 바이오프로판 생산의 실현에 있어 주요한 개발이다.
발명의 요약
제1 구현예에서, 서열 번호: 1 또는 2로부터 선택된 참고 서열(reference sequence)에 대해 적어도 40% 서열 동일성, 및 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제가 본원에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 G462V, G462F, G462I, G462L, G462A, G462Y, G462C, G462H, G462N, G462Q, 및 G462W로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 치환은 G462V 또는 G462I일 수 있다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1의 V453, 서열 번호: 1의 G455, 서열 번호: 1의 A457, 서열 번호: 1의 Y466, 또는 서열 번호: 1의 T484 중 적어도 하나에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 V453F, V453I, V453L, V453W, V453E, V453A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 V453F, V453I, V453L, V453W 중 하나일 수 있다. 임의로, 치환은 V453I일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 G455F, G455I, G455V, G455W, G455L, G455E, G455A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 G455F, G455I, G455V, G455W, G455L 중 하나일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 A457F, A457I, A457L, A457V, A457W, A457E로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 A457F, A457I, A457L, A457V 중 하나일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 Y466W, Y466F, Y466I, Y466V, Y466L, Y466E, Y466A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 Y466W일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 T484A, T484E, T484I, T484L, T484F, T484V, T484W 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 T484A, T484E, T484I, T484L 중 하나일 수 있다.
일 구현예에서 지방산 데카복실라제는 아미노산 치환 G462V 및 V453I를 포함한다.
일 구현예에서 지방산 데카복실라제는 아미노산 치환 G462I 및 V453I를 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1의 425 내지 429번 잔기에 상응하는 위치에서 아미노산 컨센서스 서열(consensus sequence)을 포함하며, 여기서 컨센서스 서열은 서열 번호: 3에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1의 398 내지 575번 잔기에 상응하는 위치에서 활성 부위를 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 활성 부위는 서열 번호: 4 내지 7로부터 선택된 하나 이상의 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1 또는 2에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 기질로서 8개 탄소 이하의 쇄 길이(chain length)를 갖는 지방 산을 수용한다. 바람직하게는, 지방산 데카복실라제는 기질로서 2 내지 5개 탄소의 쇄 길이를 갖는 지방산을 수용한다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 지방산 데카복실라제에 대한 결합으로부터 8개 이상의 탄소의 쇄 길이를 지닌 지방산을 입체적으로 방해한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 기질로서 Cn+1 지방산을 사용하여 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 치환을 결여한 지방산 데카복실라제를 사용하여 수득된 동일한 Cn 알칸의 수율과 비교하여 보다 높은 수율의 Cn 알칸을 제공하며, 여기서 n ≤ 5이다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1을 포함하는 지방산 데카복실라제와 비교하여 증진된 부티르산 대 프로판 데카복실라제 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 광-의존성 데카복실라제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 청색광-의존성 데카복실라제 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 활성은 파장이 400 내지 520nm인 광에 의존적이다.
본원에 개시된 다른 양태는 서열 번호: 1 또는 2로부터 선택된 참고 서열에 대해 적어도 40% 서열 동일성, 및 서열 번호: 1의 V453, 서열 번호: 1의 G455, 서열 번호: 1의 A457, 서열 번호: 1의 Y466, 또는 서열 번호: 1의 T484 중 적어도 하나에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제이다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 V453F, V453I, V453L, V453W, V453E, V453A로부터의 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 V453F, V453I, V453L, V453W 중 하나일 수 있다. 임의로, 치환은 V453I일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 G455F, G455I, G455V, G455W, G455L, G455E, G455A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 G455F, G455I, G455V, G455W, G455L 중 하나일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 A457F, A457I, A457L, A457V, A457W, A457E로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 A457F, A457I, A457L, A457V 중 하나일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 Y466W, Y466F, Y466I, Y466V, Y466L, Y466E, Y466A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 Y466W일 수 있다.
일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 T484A, T484E, T484I, T484L, T484F, T484V, T484W 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 치환은 바람직하게는 T484A, T484E, T484I, T484L 중 하나일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 지방산 데카복실라제를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 세균 세포이다. 바람직한 구현예에서, 세포는 할로모나스(Halomonas) 세포이다.
또한, 지방산 데카복실라제를 사용한, Cn+1 지방산의 Cn 알칸/알켄으로의 전환, 또는 Cn+1 지방산의 혼합물의 Cn 알칸/알켄의 혼합물로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 n ≤ 5이다.
일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 부티르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 프로판이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 발레르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 부탄이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 이소발레르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 이소부탄이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 본원에 기술된 지방산 데카복실라제, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체이다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 청구범위의 제11항에 따른 세포 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 방법은 Cn+1 지방산을 청구범위의 제11항에 따른 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 프로판을 회수하는 단계를 포함한다.
또한 지방산 데카복실라제를 사용하여 Cn+1 지방산의 Cn 알칸으로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하여, Cn 알칸/알켄, 또는 Cn 알칸/알켄의 혼합물을 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 n ≤ 5이다.
일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 부티르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 프로판이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 발레르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 부탄이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cn+1 지방산은 이소발레르산이거나 이를 포함하고, Cn 알칸/알켄은 이소부탄이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, Cn 알칸/알켄을 생산하는 방법은 지방산 데카복실라제를 사용한 Cn+1 지방산의 Cn 알칸으로의 전환 단계 전에 아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제를 사용한 Cn+1 아실-CoA의 Cn+1 지방산으로의 전환을 촉매하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, Cn+1 아실은 부티릴-CoA이고, Cn+1 지방산은 부티르산이며, Cn 알칸은 프로판이다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 본원에 기술된 지방산 데카복실라제, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체이다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 본원에 기술된 지방산 데카복실라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 Cn+1 지방산, 또는 Cn+1 지방산을 포함하는 조성물을 본원에 기술된 바와 같은 지방산 데카복실라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 알칸/알켄을 회수하는 단계를 포함한다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 알칸/알켄을 생산하는 방법에서의 지방산 데카복실라제의 용도가 제공된다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은:
알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 사용하여 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 개시내용은 또한:
알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 단계, 및 이후에
알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 사용하여 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매하는 단계를 포함한다.
또한, 알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 단계를 포함하는, 프로판의 생산 방법이 제공된다.
또한, 다음의 단계를 포함하는, 프로판의 생산 방법이 제공된다:
a. 알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 단계, 및
b. 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 사용하여 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매하는 단계.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 프로판을 전환시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나제는 클로스트리디움 베이제린크키이(Clostridium beijerinckii)로부터의 알데하이드 데하이드로게나제 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체이다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나제는 서열 번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 서열 번호: 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하기 전에 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 사용하여 부티르산의 부티릴-CoA로의 촉매적으로 전환시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제는 서열 번호: 22에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노 서열을 포함한다.
또한 알데하이드 데하이드로게나제 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 본원에 제공된다.
또한 이종 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 알데하이드 데하이드로게나제 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터(본원에 정의된 바와 같은)를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현은 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산 및/또는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 하나 이상의 프로모터(promoter)를 포함한다.
일부 구현예에서, 알데하이드 데하이드로게나제는 서열 번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 서열 번호: 21에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 부티릴-CoA, 또는 부티릴-CoA를 함유하는 조성물을, 이종 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포, 또는 본원에 기술된 바와 같은, 이종 알데하이드 데하이드로게나제 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 부탄을 생산하는 방법에서의, 알데하이드 데하이드로게나제의 용도가 제공된다.
본 발명은 기술된 양태 및 바람직한 특징의 조합을 포함하며 여기서 이러한 조합은 명확하게 허용불가능하거나 분명히 피해진다.
서열
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본 발명의 원리를 나타내는 구현예 및 실험을 이제 첨부되는 도면을 참고로 논의할 것이며, 여기서:
도 1. 알칸 형성에 대한 효소적 경로. (A) 피. 마리누스(P. marinus) 균주 MIT9313으로부터의 알데하이드 탈포르밀화 효소(ADO)에 의한 지방 알데하이드의 NAD(P)H-의존성 탈카복실화. (B) 지방산 데카복실라제(FAD)에 의한 지방산의 탈카복실화의 일반적인 개략도. (C) 씨. 바리아빌리스(C. variabilis) NC64A로부터의 광-의존성 지방산 데카복실라제 광알칸 신타제(CvPAS)에 의한 지방산의 탈카복실화.
도 2. 변이체 G462V 잔기 및 모델화된 부티르산의 위치를 나타내는, 팔미트산-결합된 CvPASWT의 활성 부위. 전체 구조(PDB: 5NCC)는 제2 구조 착색된 카툰(cartoon)으로서 나타낸다. FAD 및 팔미트산은 각각 원자 스틱(atom stick) 및 라인으로 나타낸다. 부티르산 및 G462V 변이체 잔기의 모델은 원자 스틱으로 나타낸다. 당해 모델에서, V462는 팔미트산의 C5 원자와 충돌하지만, 부티르산 결합을 허용하여 안정화시킨다.
도 3. 예시적인 지방산 데카복실라제 CvPAS G462V의 반응 경로: (A) CvPAS G462V에 의한 부티르산의 프로판으로의 전환의 촉매작용; YciA에 의해 부티릴-CoA를 부티르산으로 전환시키는 예비-단계는 선택적이다. (B) CvPAS G462V에 의한 발레르산의 부탄으로의 전환의 촉매작용. (C) CvPAS G462V에 의한 이소발레르산의 이소부탄으로의 전환의 촉매작용.
도 4. 다양한 종(species): (상단으로부터 하단까지) 볼복스 카르테리 에프. 나가리엔시스(Volvox carteri f. nagariensis)(서열 번호: 19), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)(서열 번호: 12), 고니움 펙토랄레(Gonium pectorale)(서열 번호: 14), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis)(Cva-APS; 서열 번호: 1), 콕코믹사 수벨립소이데아(Coccomyxa subellipsoidea)(서열 번호: 13), 아우레오콕쿠스 아노파게페렌스(Aureococcus anophagefferens)(서열 번호: 8), 파에오닥틸룸 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)(서열 번호: 15), 크리소크로물리나 종(Chrysochromulina spp.)(서열 번호: 10), 에밀리아니아 훅슬레이이(Emiliania huxleyi)(서열 번호: 16), 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus)(서열 번호: 9), 시아니디오스키존 메롤라에(Cyanidioschyzon merolae)(서열 번호: 11)으로부터의 지방산 데카복실라제의 집단적 정렬(clustal alignment). 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치는 굵은 활자체 및 밑줄로 나타낸다. 서열 번호: 1의 V453에 상응하는 위치는 밑줄로 나타낸다. 서열 번호: 1의 G455에 상응하는 위치는 이중 밑줄로 나타낸다. 서열 번호: 1의 A457에 상응하는 위치는 점선-점 밑줄(das-dot underline)로 나타낸다. 서열 번호: 1의 Y466에 상응하는 위치는 굵은 활자체 및 점 밑줄로 나타낸다. 서열 번호: 1의 T484에 상응하는 위치는 굵은 활자체 및 이중 밑줄로 나타낸다. 콘센서스 서열 서열 번호: 3에 상응하는 위치는 점 밑줄로 나타낸다. 활성 부위 서열 서열 번호: 4에 상응하는 위치는 굵은 활자체로 강조한다.
도 5. 야생형 및 G462V 변이체 CvPAS를 과발현하는 이. 콜라이(E. coli)의 세포 분해물의 SDS PAGE 분석. 박스는 CvPAS 발현 밴드(63 kDa)를 나타낸다.
도 6. 일정한 광 조건 하에서 야생형 및 G462V 변이체 CvPAS 활성에 대한 부티레이트 농도의 효과를 나타내는 챠트. 반응물(200 μL)은 밀봉된 유리 GC 바이알(vial) 속에 세포-유리된 분해물(180 μL) 및 부티르산(0.36 내지 4.5 mM)으로 구성되었다. 반응물을 청색 LED(455 nm)의 존재하에서 180 rpm에서 24시간 동안 30℃에서 항온처리하였다. 상부 빈공간(headspace) 가스를 Micro GC(100 ms 투입)를 사용하여 프로판 함량에 대해 분석하였다.
도 7. 알데하이드 데하이드로게나제(BALDH), 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제(ADO, 플러스(plus) 전자 전달 파트너 단백질 페레독신)의 작용을 통해 부티르알데하이드 중간체를 경유한 부티릴-CoA의 프로판으로의 반응 경로. 이러한 공정은 또한 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제(CoAT)를 사용하는 작용을 통해 부티르산에서 시작할 수 있다.
도 8. 문헌: Menon et al 2015 [8]로부터 YciA/CAR/SFP/ADO의 작용을 통해 부티르산 및 부티르알데하이드를 경유한 글루코즈로부터 프로판으로의 반응 경로.
도 9. CvPAS의 작용을 통해 부티르산을 경유한 글루코즈로부터 프로판으로의 반응 경로.
도 10. BALDH/ADO의 작용을 통해 부티르알데하이드를 경유한 글루코즈로부터 프로판으로의 반응 경로.
도 11. 기존 폐기물 공급 원료, 운송 및 유통 인프라와 함께 신규 광생물반응기 설계를 통합한, 바이오-LPG 전략의 다이아그램 개관.
도 12. CvFAP의 변이체의 시험관내(in vitro) 프로판 생산에 있어서의 비교를 나타내는 챠트. 배양물(20 mL)을 가나마이신(30 μg/mL)을 함유하는 LB 배지 속에서 OD600이 약 0.6-0.8이 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)로 유도하고 배양물에 10 mM 부티르산을 보충하였다. 배양물의 3배의 분취량(1 mL)을 4 mL의 유리 바이알 내로 밀봉하고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm에서 항온처리하고, 청색 LED 패널(panel)로 조명하였다. 상부 빈공간 가스를 Micro GC를 사용하여 가스성 탄화수소 함량에 대해 분석하였다. 반응을 3배의 생물학적 복제물 속에서 수행하였다. 프로판 수율(mg/L의 분해물)을 야생형(WT) 효소와 비교한 상대적인 단백질 농도로 나누어 표준화된 데이타를 계산하였다(도 18). 표준화된 활성은 CvFAPWT와 비교하여 분해물 속에서 각각의 변이체의 상대적인 단백질 농도를 고려함으로써 계산하였다. 삽화: 2차 구조 착색된 카툰으로 나타낸 CvFAP(PDB: 5NCC)의 팔미트산 결합 영역의 구조. 팔미트산 및 돌연변이유발에 대해 표적화된 잔기는 2차 구조 착색된 스틱으로 나타낸다.
도 13a 및 13b. a) 야생형 및 b) CvFAP의 G462V 변이체의 활성 부위에서 부티레이트 및 팔미테이트의 다이아그램 모델. 야생형 효소에서 팔미테이트의 위치는 결정학적으로 측정한다(PDB:5NCC). 나머리 리간드의 위치는 Autodock Vina로 측정하였고,16 부위 지시된 돌연변이유발(G462V)은 SwissPDBViewer 4.10을 사용하여 수행하였다.48 패널 둘 다에서, 단백질은 2차 구조 음영법을 사용한 카툰으로 나타낸다. 점선은 팔미테이트와 야생형 효소 사이의 수소 결합을 나타낸다. 점선은 모델화된 리간드-G/V462 잔기 거리를 강조한다.
도 14a 및 14b. 이. 콜라이(E. coli) 균주 BL21(DE3)△yqhD/△yjgB에서 야생형 및 변이체 CvFAP에 의한 생체내 가스성 탄화수소 생산을 나타내는 챠트. 탄화수소 생산에 대한 a) CvFAP-pETM11 변이체a 및 b) CvFAPG462V-pBbA1c와 부티르산:발레르산 배합물(blend)의 효과. 배양물(20 mL)을 가나마이신(50 μg/mL)을 함유하는 LB 배지 속에서 OD600이 대략 0.6 내지 0.8이 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)를 사용한 다음 30℃에서 1시간 후 산 기질(총 10 mM)로 배양물을 보충함으로써 유도하였다. 3배의 분취량(1 mL)의 배양물을 4 mL의 유리 바이알 내로 밀봉하고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm에서 항온처리하고, 청색 LED 패널로 조명하였다. 상부 빈공간 가스를 Micro GC를 사용하여 가스성 탄화수소 함량에 대해 분석하였다. a부탄 및 이소부탄을 생성하도록 설계된 모든 반응물은 또한 ~2% 프로판을 생산하였다.
도 15a 및 15b. 생체 내 부티르산 생산의 상향 조절을 통한 CO2의 프로판으로의 전환을 가능하도록 하는 대사 가공의 다이아그램 도해. a) 가공 개략도 및 b) CO2 또는 부티레이트 공급원으로부터 시네초키스티스(Synechocystis) △aas의 플라스미드 작제물(plasmid construct)로부터의 프로판 생산. CBB 주기 = 칼빈-벤슨-바샴 주기(Calvin-Benson-Bassham cycle); 3-PGA = 3-포스포글리세레이트; ACP = 아실 담체 단백질; aas = 아실-아실 담체 단백질 신타제; Tes4 = 아실-ACP 티오에스테라제; EryR = 에리쓰로마이신 내성 유전자.
도 16c 내지 16c. CvFAP 작제물을 발현하는 할로모나스(Halomonas) 균주 XV12에 의한 프로판 생산. a) 유전자 발현 작제물의 개략도. b) 할로모나스 작제물의 프로판 생산을 나타내는 챠트. c) pHal2G462V에 의한 프로판 생산에 대한 부티르산 농도의 효과를 나타내는 챠트. 삽화 = 동일한 작제물에 의한 프로판 생산에 대한 광 강도의 효과. 작제물(모두 비-His6-태그(tag)됨)을 다음의 변형된 플라스미드 속에서 생성시켰다: pSEVA321(pHaM-FAPWT 및 pHal3-FAPG462V 및 pSEVA441(pHal2-FAPWT 및 pHal2-FAPG462V). 배양물을 포스페이트 완충된 YTN6 배지 스펙티노마이신(pHal2-FAPG462V; 50 μg/mL) 또는 클로람페니콜(pHaM- 및 pHal3 작제물; 34 μg/mL) 속에서 37℃ 및 180 rpm에서 5시간 동안 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)를 사용하여 OD600 ~ 1.6에서 유도하고, 배양물에 부티르산(0 내지 100 mM)을 보충하였다. 3배 분취량(1 mL)의 배양물을 4 mL의 유리 바이알에 밀봉하고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm에서 항온처리하고, 청색 LED 패널로 조명하였다. 상부 빈공간을 Micro GC를 사용하여 가스성 탄화수소 함량에 대해 분석하였다.
도 17a 및 17b. 평판 광바이오반응기(flat bed photobioreactor) 속에서 pHal2-FAPG462V를 발현하는 할로모나스의 발효. a) 배양물 성장(OD 680 nm)을 나타내는 챠트 및 b) 프로판 생산을 나타내는 챠트. 배양물(400 mL)을 50 μg/mL 스펙티노마이신 및 0.2 mL/L 소포제(antifoam)를 함유하는 고 염 글리세롤 배지 속에서 pH 6.8에서 성장시켰다. '클린(Clean)' 발효는 정제된 글리세롤/NaCl를 포함한 반면, "조(Crude)' 발효는 추가의 NaCl(6% 이하의 총 염도)이 보충된 해수가 포함된 바이오디젤 폐 글리세린을 함유하였다. 조건은 중간 로그 상(log phase)까지(4 내지 5시간) 1.21 L/min의 공기 유동 속도(airflow rate), 자동화된 pH 유지, 배양 광학 밀도 모니터링 및 주위 룸 조명(ambient room lighting)으로 최대 교반하면서 30℃에서 유지시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)에 이어서 부티르산나트륨(80 내지 100 mM pH ~6.8)을 첨가하고 청색 광 노출(1625 μE) 하에 유도하고, ~100시간 동안 유지하였다. 프로판 생산은 Micro GC를 사용하여 자동화된 상부 빈공간 샘플링에 의해 15 내지 20분 간격에서 모니터링하였다.
도 18. 이. 콜라이 내에서 CvFAPWT의 변이체 및 28개의 변이체의 발현을 나타내는 현미경사진 및 표. 이. 콜라이 내에서 가용성 CvFAPWT 밴드 및 28개 변이체의 SDS PAGE 분석 및 상대적인 정량화. L = 분자 질량 래더(molecular mass ladder); WT = CvFAPWT. 단백질 겔은 BioRad Gel Doc™ EZ 영상화기(imager)를 사용하여 영상화하고 상대적인 단백질 밴드 강도는 BioRad ImageLab™ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
도 19. 포스페이트 염 완충제의 부재하에서 이. 콜라이내 프로판의 생체내 생산에 대한 부티르산 농도의 효과를 나타내는 챠트. 배양물(20 내지 100 mL)을 가나마이신(50 μg/mL)을 함유하는 LB 배지 및 오버나잇 스타터 배양물(overnight starter culture)(1% 용적; 동일한 배지) 속에서 37℃에서 6시간 동안 및 180 rpm으로 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)로 유도하고 배양물에 부티르산(1 내지 25 mM)을 보충하였다. 3배의 분취량(5 mL)의 배양물을 20 mL의 유리 바이알 속에 밀봉하고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm으로 항온처리하고, 청색 LED 패널을 사용하여 연속적으로 조명하였다. 상부 빈공간 가스를 Al2O3/KCl 컬럼이 장착된 Micro GC(100 ms 주입)를 사용하여 프로판 함량에 대해 분석하였다.
도 20a 내지 20d. a) pHal1-FAPWT, b) pHal2-FAPWT/G462V 및 c) pHal3-FAPG462V의 개략적인 CvFAP 할로모나스 작제물 조직화를 나타내는 챠트. d) pHal3-FAPG462V를 작제하는데 사용된 삽입체의 프로모터 영역의 DNA 서열. 음영은 C 부분에서와 같이 이것이 규정하는 프로모터 영역의 부위를 반영한다. LacO = lac 오퍼레이터; SD1-3 = 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence); ori = 복제 오리진(origin of replication); ChlR 및 SpecR = 각각 클로람페니콜 및 스펙티노마이신 내성; RiboJtr = 트렁케이트된(truncated) RiboJ(담배 모자이크병 바이러스(tobacco ringspot virus) 새틀라이트(satellite) RNA로부터의 해머헤드 리보자임).1
도 21. 배양물 성장(OD 680 nm) 및 프로판 생산을 나타내는 평판 광바이오반응기내에서 pHal2-FAPG462V를 발현하는 할로모나스의 발효를 나타내는 챠트. 배양물을 pH 6.8에서 고 염 글리세롤 배지(5 g/L 효모 추출물, 1 g/L 글리세롤, 60 g/L NaCl, 50 μg/mL 스펙티노마이신 및 0.2 mL/L 소포제; 400 mL) 속에서 30℃에서 최대 교반 및 1 L/min 통기로 성장시켰다. 조 배지의 경우, NaCl 및 바이오디젤 폐 글리세롤이 보충된 해수를 실험실 등급의 시약 대신에 사용하였다. FAPG462V 발현을 IPTG(0.1 mM)를 사용하여 중간-로그 상(별표로 나타냄)에서 유도한 다음, 부티르산나트륨(60 mM pH ~6.8) 및 청색 광 노출(1625 μmol/s/m2 양성자)을 48시간 이하 동안 첨가하였다. 배양물 성장을 자동화된 공급물 첨가에 의해 1.0의 OD 680에서 유지하였다. 프로판 생산을 20분마다 Micro GC를 사용한 자동화된 상부 빈공간 샘플링에 의해 모니터링하였다.
도 22. 표 S1: 이. 콜라이내에서 추정된 FAP 동족체의 발현 및 활성.
도 23. 표 S2: 이. 콜라이 내에서 발현된 CvFAPWT 및 28 변이체의 세포 분해물의 프로판 생산.
도 24. 표 S3: 부티레이트 및 팔미테이트를 사용한 CvPAS 야생형 및 변이체의 분자 도킹 시뮬레이션(Molecular docking simulation).
도 25. 표 S4: 이. 콜라이 BL21(DE3) 내에서 CvFAPG462V 변이체에 의한 생체내 프로판 생산.
도 26. 표 S5: 이. 콜라이 내에서 발현한 pET21b에서 N-His6-CvFAPG462V에 의한 생체내 프로판 생산.
도 27. 표 S6: 단쇄 유기 산의 존재하에서 이. 콜라이 내에서 변이체 CvFAP에 의한 가스성 탄화수소의 생체내 생산.
도 28. 표 S7: 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)△yqhD/△yjgB 내에서 야생형 CvFAP에 의한 가스성 탄화수소 생산에 대한 부티르산/발레르산 배합물의 효과.
도 29. 표 S8: 할로모나스 균주 XV12에서 CvFAPG462V 변이체에 의해 생산된 생체내 프로판 생산.
도 30. 표 S9: 이. 콜라이 및 할로모나스 내에서 올리고뉴클레오타이드 및 다른 DNA 서열.
도 31. 표 S11: DNA 조립에 사용된 접두사 및 접미사.
도 32. 표 S12: 접두사 및 접미사 링커.
발명의 상세한 설명
본 발명의 양태 및 구현예를 이제 첨부하는 도면을 참고로 논의할 것이다. 추가의 양태 및 구현예는 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 당해 내용에서 언급된 모든 문서는 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 본 발명자들에 의한 단쇄 지방산 및 조효소(coenzyme) A 활성화된 지방산으로부터 단쇄 탄화수소, 예를 들면, 부탄, 이소부탄 및 프로판을 생산할 수 있는 효소의 확인을 기반으로 한다. 단쇄 지방산은 생물량(biomass)의 미생물 파괴 동안에 일반적으로 생산되므로, 이는 용이하게 접근가능한 공급원료로부터 바이오연료로서 유용한 단쇄 탄화수소를 생성하는 수단을 제공한다.
일반적인 정의
본원에 사용된 바와 같은, 단백질의 "단편", "변이체" 또는 "동족체"는 임의로 참고 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 참고 단백질의 단편, 변이체, 동형 및 동족체는 참고 단백질에 의해 수행된 기능을 수행하는 능력에 의해 특징화될 수 있다.
2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 동일성 퍼센트를 측정할 목적을 위한 쌍식(pairwise) 및 다중 서열 정렬은 당해 분야의 기술자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, ClustalOmega(Soding, J. 2005, Bioinformatics 21 , 951-960), T-coffee(Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217), Kalign(Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)) 및 MAFFT(Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예컨대, 갭 패널티(gap penalty) 및 연장 패널티(extension penalty) 소프트웨어의 경우, 디폴트 매개변수(default parameter)가 바람직하게 사용된다.
"단편"은 일반적으로 참고 단백질의 분획을 지칭한다. "변이체"는 일반적으로 참고 단백질의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 다른 변형을 포함하지만, 참고 단백질의 아미노산 서열에 대해 고려할 수 있는 정도의 서열 동일성(예컨대, 적어도 60%)을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. "동형"은 일반적으로 참고 단백질의 종과 동일한 종에 의해 발현된 참고 단백질의 변이체를 지칭한다. "동족체"는 일반적으로 참고 단백질의 종과 비교하여 상이한 종에 의해 생산된 참고 단백질의 변이체를 지칭한다.
참고 단백질의 "단편"은 참고 단백질(즉, 단편이 유래되는 단백질)의 길이의 적어도 25%일 수 있고 참고 단백질의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있지만, 임의의 길이(아미노산의 수에 의해)일 수 있다.
폴리펩타이드의 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있고, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 1 10, 120 또는 130개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "탄화수소"는 수소 및 탄소로 이루어진 골격을 포함하는 유기 화합물이다. 탄화수소는 알칸, 알켄, 아렌, 사이클로알칸 및 알킨을 포함한다. 알칸은 화학식 CnH2n+2의 포화된 탄화수소이다. 본원의 알칸은 직쇄(즉, 불포화된) 및 측쇄 알칸을 포함한다. 알켄은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 지닌 불포화된 탄화수소이다. 이소부탄, 부탄 및 프로판, 또는 "액화 석유 가스"로서 일반적으로 지칭된 이의 배합물이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, "CX" 탄화수소 또는 지방산은 X의 총 탄소 수를 갖는 것이다. 예를 들면, 부탄 및 이소부탄은 둘 다 C4 탄화수소이다. "CX" 탄소는 X번째 위치에서의 탄소이다. 예를 들면, 스테아르산의 C5 탄소는 5번째 위치에서의 탄소이다.
본원에 사용된 바와 같은, "쇄 길이"는 가장 긴 연속 쇄 내 탄소의 수를 지칭한다. 예를 들면, n-펜탄은 5의 쇄 길이를 가지고, n-부탄은 4의 쇄 길이를 가지는 반면, 이소부탄 및 프로판은 3의 쇄 길이를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "지방산"은 지방족 탄화수소 쇄를 지닌 카복실산(-COOH) 분자를 지칭한다. "지방산"은 지방산의 염 및 이온을 포함한다. 예를 들면, 지방산 "부티르산"은 유리 산 부티르산 뿐만 아니라 부티레이트 등도 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, "단쇄" 지방산은, 달리 언급하지 않는 한, 2 내지 8 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산을 지칭한다. 단쇄 지방산은 쇄 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 탄소, 예를 들면, 길이가 2 내지 7개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개 또는 2개의 탄소일 수 있다. "장쇄" 지방산은 단쇄 지방산보다 더 긴 쇄를 갖는 지방산을 지칭한다. 예를 들면, 장쇄 지방산은 13개 이상의 쇄 길이, 바람직하게는 13 내지 21개, 13 내지 20개, 13 내지 19개, 13 내지 18개, 13 내지 17개, 13 내지 16개, 13 내지 15개, 13 내지 14개, 14 내지 21개, 14 내지 20개, 14 내지 19개, 14 내지 18개, 14 내지 17개, 14 내지 16개, 14 및 15개, 14개, 15 내지 21개, 15 내지 20개, 15 내지 19개, 15 내지 18개, 15 내지 17개, 15 및 16개, 15개, 16 내지 21개, 16 내지 20개, 16 내지 19개, 16 내지 18게, 16 및 17개, 16개, 17 내지 21개, 17 내지 20개, 17 내지 19개, 17 및 18개, 17개, 18 내지 21개, 18 내지 20개, 18 및 19개, 18개, 19 내지 21개, 19 및 20개, 19개, 20 및 21개, 20개, 또는 21개의 탄소의 쇄 길이의 것을 지칭할 수 있다.
지방산 데카복실라제
본원에 사용된 바와 같은, "지방산 데카복실라제"는 지방산 데카복실라제 활성을 지닌, 즉, n-지방산으로부터 카복실산을 제거하여 n-알칸 또는 -알켄을 생산하는, 특히 알데하이드 중간체의 부재하에서 및 말단 불포화를 유도하지 않고 직접적인 제거를 촉매할 수 있는 지방산 데카복실라제 활성을 지닌 효소를 지칭한다. 이러한 반응식은 도 1c에 나타나 있다. 지방산 데카복실라제 활성은 기술자에에 이용가능한 임의의 방법에 의해서 측정할 수 있다.
예시적인 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1, 2, 및 8 내지 19 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 의해 암호화된다. 특히, 서열 번호: 1은 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis) NC64A로부터의 광알칸 신타제(CvPAS)를 암호화하며, 이는 유리 지방산을 n-알칸 또는 알켄으로 청색 광 의존적 탈카복실화할 수 있다(도 1c)[13]. CvPAS는 글루코즈-메탄올-콜린 옥시도리덕타제 계열의 구성원이며, >80%(0.86 ± 0.13 s-1)의 양자 수율을 지닌 결합된 광여기가능한 fad 보조인자를 함유하며, 장쇄 지방산, 특히 팔미트산(C16)에 대한 선호를 나타낸다[13].
654개 아미노산 서열 번호: 1은 CvPAS(UniProt: A0A248QE08)에 대한 전체 길이 폴리펩타이드 서열에 상응한다. 이러한 서열은 하기 나타나 있다:
Figure pct00012
서열 번호: 1의 G462 위치는 굵을 활자체 및 실선 밑줄로 강조되어 있다.
천연 서열은 N 말단에서 61개 아미노산 엽록체 표적화 서열을 포함하며(점 밑줄), 트래피킹(trafficking) 동안에 절개된다. 이러한 서열은 제거되고 서열 번호: 2의 594번 아미노산에서 메티오닌으로 대체된다:
Figure pct00013
서열 번호: 1의 G462번 위치에 상응하 서열 번호: 2의 G402번 위치는 굵은 활자체 및 실선 밑줄로 강조되어 있다.
본 명세서에서, "서열 번호: 1의 G462번 위치"는 또한 "서열 번호: 2의 G402번 위치"를 지칭한다. "서열 번호: 1의 G462번 위치"는 "서열 번호: 2의 G402번 위치"와 등가이며 상호교환가능한 것으로 고려될 수 있다.
유사하게, 서열 번호: 1의 V453, G455, A457, Y466, T484번 위치는 서열 번호: 2의 V393, G395, A397, Y406 및 T424번 위치와 상호교환적으로 기술될 수 있다.
서열 번호: 8 내지 19는 아우레오코쿠스 아노파게페렌스(Aureococcus anophagefferens)(서열 번호: 8), 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus)(서열 번호: 9), 크리소크로물리나 종(Chrysochromulina spp.)(서열 번호: 10), 시아니디오스키존 메롤라에(Cyanidioschyzon merolae)(서열 번호: 11), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)(서열 번호: 12), 콕코믹사 수벨립소이데아(Coccomyxa subellipsoidea)(서열 번호: 13), 고니움 펙토랄레(Gonium pectorale)(서열 번호: 14), 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)(서열 번호: 15), 에밀리아니아 훅슬레이이(Emiliania huxleyi)(서열 번호: 16 및 17), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana)(서열 번호: 18), 및 볼복스 카르테리 애프. 나가리엔시스(Volvox carteri f. nagariensis)(서열 번호: 19)에서 발견된 서열 번호: 1에 대해 상동성이다. 기술자는 서열 정렬을 수행하여 어느 잔기가 서열 번호: 1의 G462와 등가인지를 측정하는 방법을 인식할 것이다. 이러한 잔기는 도 4에 강조되어 있다.
본 명세서에서, "지방산 데카복실라제"는 임의의 종으로부터의 지방산 데카복실라제를 지칭하며 임의의 종으로부터의 지방산 데카복실라제의 동형(isoform), 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 동족체는 상동유전자(orthologue)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 원핵세포 지방산 데카복실라제, 예컨대, 세균 지방산 데카복실라제이다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 미세조류, 예를 들면, 볼복스(Volvox), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 고니움(Gonium), 클로렐라(Chlorella), 콕코믹사(Coccomyxa), 아우레오코쿠스(Aureococcus), 파에오닥틸룸(Phaeodactylum), 크리소크로물리나(Chrysochromulina), 에밀리아니아(Emiliania), 콘드루스(Chondrus), 또는 시아니디오스키존(Cyanidioschyzon) 속(genus) 내의 종으로부터 유도되거나 또는 이로부터 기원한다. 예시적인 지방산 데카복실라제는 볼복스 카르테리 에프. 나가리엔시스, 클라미도모나스 레인하르드티이, 고니움 펙토랄레, 클로렐라 바리아빌리스, 콕코믹사 수벨립소이데아, 아우레오콕쿠스 아노파게페렌스, 파에오닥틸룸 트리코르누툼, 크리소크로물리나 종, 에릴리아니아 훅슬레이이, 콘드루스 크리스푸스, 또는 시아니디오스키존 메롤라에에서 발견된 것이다.
본원에 제공된 지방산 데카복실라제는 천연적으로 존재하는 야생형 효소에 대해 아미노산 서열의 측면에서 동일하지 않은 야생형의 변이체인 것으로 의도된다. 따라서, 이들은 "돌연변이체", "비-천연적으로 존재하는" 또는 "변형된"으로 기술될 수 있다. 대상 효소(예컨대, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 서열)를 변형시켜 상이한 효소의 야생형 서열, 예컨대, 서열 번호: 8 내지 19 중 하나와 같은 동족체(또는 엽록체 표적화 서열을 결여하는 이의 성숙한 아미노산 서열)를 생성하는 효과를 가질 수 있는 임의의 아미노산 치환이 본 개시내용으로부터 임의로 배제되며 청구된 발명으로부터 임의로 포기될 수 있다.
지방산 데카복실라제의 단편, 변이체, 동형 및 동족체는 지방산의 알칸 또는 알켄으로의 전환, 특히 단쇄 지방산의 단쇄 알켄 또는 알칸으로의 전환을 촉매하는 능력에 의해 임의로 특성화될 수 있다.
본 발명의 다양한 양태의 지방산 데카복실라제는 참고 지방산 데카복실라제의 측면에서 기술될 수 있다. 예를 들면, 지방산 데카복실라제는 참고 서열에 대해 적어도 40%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 본 발명의 다양한 양태의 지방산 데카복실라제는 참고 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 참고 서열은 임의의 지방산 데카복실라제일 수 있으며, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 또는 서열 번호: 8 내지 19 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 참고 서열은 서열 번호: 1 또는 2로부터 선택된다. 본 발명의 지방산 데카복실라제는 증진된 데카복실라제 활성을 가질 수 있고/있거나 참고 지방산 데카복실라제와 비교하여 더 높은 수율을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 참고 지방산 데카복실라제(예컨대, 서열 번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 지방산 데카복실라제)의 아미노산 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 참고 지방산 데카복실라제의 아미노산 서열에 대해 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 예컨대, 참고 지방산 데카복실라제의 아미노산 서열에 대해 예컨대, 1 내지 3개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개 또는 1 내지 20개의 아미노산 치환을 포함한다.
팔미트산(C16)에 대한 야생형 지방산 데카복실라제의 보다 높은 선호도는 이것이 곡선의 협소한 용매-노출된 기질-결합 채널 주변을 둘러싸므로 소수성 단쇄의 안정화에 기인하는 것으로 고려된다(도 2). 결과적으로, 단쇄 지방한에 대한 선호도는 G462번에 대해 등가의 위치에 치환을 도입함으로써 용매 노출된 기질-결합 채널에 대한 접근을 입체적으로 차단함으로써 가공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 입체적 차단은 G462의 비교적 작은 글리신 측쇄를 보다 큰 측쇄로 치환함으로써 도입할 수 있다. 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환은 야생형 서열 내 이러한 위치에서 발견되지 않은 임의의 다른 아미노산을 사용하여 제조할 수 있다. 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산을 본원에 명시된 바와 같이 야생형 서열내 이러한 위치에서 발견되지 않는 임의의 다른 아미노산으로 치환시키는 방법이 본 개시내용에 포함된다.
바람직하게는, 치환은 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산을 이의 측쇄가 용매 노출된 기질-결합 채널에 대한 접근(access)을 입체적으로 차단하는 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대, 본원에 정의된 바와 같은 장쇄 지방산의 결합을 방지하기 위하여 채널을 물리적으로 방해한다. 입체 블록은 하나에 대한 아미노산을 크고, 부피가 크고, 하전되지 않고/않거나 비-극성인 측쇄로 치환함으로써 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 입체 블록은 서열 번호: 1의 G462의 비교적 작은 글리신 측쇄(H)를 보다 크고, 부피가 보다 크며, 하전되지 않고/않거나 비-극성인 측쇄로 치환함으로써 도입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, V, F, I, L, A, Y, C, H, N, Q, 및 W로부터 선택된 부피가 큰 잔기를 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산으로 치환한다. 일부 구현예에서, V, F, I, L, A, Y, C, N, Q, 및 W로부터 선택된 하전되지 않은 잔기를 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산으로 치환한다. 일부 구현예에서, V, F, I, L, A, 및 W로부터 선택된 비-극성 잔기를 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산으로 치환한다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 G462V이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462F이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462I이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462L이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462A이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462W이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462Y이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462C이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462H이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462N이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 G462Q이다.
기술자는 참고 서열인 서열 번호: 1에 의해 제공된 것 이외의 지방산 데카복실라제 내에 나타낸 위치에 대한 상응하는 위치를 잘 확인할 수 있다. 상응하는 위치는 예컨대, 주어진 지방산 데카복실라제의 아미노산 서열을 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 대해 정렬함으로써 확인할 수 있다. 이러한 목적을 위한 서열 정렬은 당해 분야의 기술자에게 공지된 다양한 방법으로, 예를 들면, 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, ClustalOmega (Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960)를 사용하여 달성할 수 있다. 예로써, 다수의 지방산 데카복실라제의 아미노산 서열과 서열 번호: 1의 정렬은 도 4에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 컨센서스 서열을 추가로 포함한다:
Figure pct00014
(서열 번호: 3),
여기서, X는 임의의 아미노산이다.
바람직하게는, X1은 P, L 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X2는 T 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 T, S 및 C로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X4는 P, T 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X5는 G 및 A로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X6은 H, N 및 R로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X7은 L, V A 및 F로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 컨센서스 서열은 서열 번호: 3에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 컨센서스 서열은 서열 번호: 3에 대해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 컨센서스 서열은 서열 번호: 3에 대해 0, 1, 또는 2개의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
컨센서스 서열은 서열 번호: 1의 425 내지 429번 잔기에 상응하는 위치에 존재할 수 있거나, 당해 위치로부터 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 잔기 내 위치에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 활성 부위 서열을 포함한다:
Figure pct00015
(서열 번호: 4)
여기서 X는 임의의 아미노산이고, [Z]는 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 잔기이다. 바람직한 구현예에서, 활성 부위 서열은 임의의 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6을 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이고 [Z]는 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 잔기이다. 구체적인 구현예에서, 활성 부위는 다음의 서열을 포함한다:
Figure pct00016
여기서 [Z]는 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 잔기이다.
활성 부위 서열은 서열 번호: 1의 393 내지 575번 잔기에 상응하는 위치에 존재할 수 있거나, 당해 위치로부터 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 잔기로 떨어진 위치에 존재할 수 있다.
활성 부위 서열은 본원에 기술된 바와 같이, 서열 번호: 1의 V453, G455, A457, Y466, T484 중 하나 이상에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 4 내지 7로부터 선택된 하나 이상의 컨센서스 서열에 대해 적어도 40% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열을 갖는 활성 부위를 포함한다.
본원에 기술된 지방산 데카복실라제는 지방산의 알칸 또는 알켄으로의, 특히 단쇄 지방산의 단쇄 알켄 또는 알칸으로의 전환을 촉매할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 부티르산의 프로판으로의 전환(도 3a), 발레르산의 부탄으로의 전환(도 3b) 및/또는 이소발레르산의 이소부탄으로의 전환(도 3b) 중 1개, 2개, 또는 3개 모두를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 부티르산의 프로판으로의 전환 및 발레르산의 부탄으로의 전환을 촉매할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 부티르산의 프로판으로의 전환을 촉매할 수 있다.
본 발명의 지방산 데카복실라제는 기질로서 지방산을 수용한다. 기질로서 수용된 지방산은 결합될 수 있고 지방산 데카복실라제에 의해 탄화수소로 촉매적으로 전환될 수 있는 것이다. 더욱이, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 기질로서 단쇄 지방산의 사용을 위해 가공된다. 이는 단쇄 알켄/알킨, 예를 들면, 휘발성 알켄/알칸, 예를 들면, 부탄, 이소부탄 및 프로판의 생성을 야기한다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 기질로서 단쇄 지방산, 예를 들면, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 및/또는 C8 지방산을 수용한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 C3 내지 C5 지방산을 수용한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 C3 및/또는 C4 지방산을 수용한다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 탄소의 쇄 길이를 갖는 지방산을 기질로서 수용할 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 C1-C8, C1-C7, C1-C6, C1-C5, C1-C4, 또는 C1-C3 지방산을 수용할 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 C2-C8, C2-C7, C2-C6, C2-C5, C2-C4, 또는 C2-C3 지방산을 수용할 수 있다.
일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 장쇄 지방산과 비교하여 단쇄 길이 지방산에 대한 선호도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 대부분 또는 전체적으로 단쇄 지방산 이외의 기질로서 지방산을 수용할 수 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 지방산 데카복실라제는 대부분 또는 전체적으로 특정의 역치(threshold)를 초과하는 쇄 길이를 지닌 지방산을 기질로서 수용할 수 없을 수 있다. 이러한 선호도 및/또는 불능은 8개 이상의 탄소의 쇄 길이를 지닌 지방산의 결합과 입체적으로 충돌하고 방해하는 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환의 결과일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 또는 22개 이상의 탄소의 쇄 길이 또는 총 탄소 수를 지닌 것과 같은 장쇄 지방산을 기질로서 수용할 수 없을 수 있다.
본 발명의 지방산 데카복실라제의 특성은 참고 지방산 데카복실라제를 참고로 기술될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "참고 지방산 데카복실라제"는 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하지 않는 임의의 지방산 데카복실라제일 수 있다. 참고 지방산 데카복실라제는 야생형 지방산 데카복실라제일 수 있다. 참고 지방산 데카복실라제는 본 발명의 지방산 데카복실라제와 기타의 경우에 동일한 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 치환을 결여하고 있는 등가의 지방산 데카복실라제일 수 있다. 참고 지방산 데카복실라제는 서열 번호: 1, 2, 및 8 내지 19, 및 이의 동족체, 변이체 및/또는 활성 단편을 포함한다.
지방산 데카복실라제는 단쇄 지방산의 탈카복실화(decarboxylation)로부터 보다 높은 수율의 단쇄 알칸/알켄을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제는 기질로서 단쇄 지방산을 사용한 지방산 데카복실라제 활성의 비교가능한 검정에서 참고 지방산 데카복실라제를 사용하여 수득된 동일한 알칸/알켄의 수율과 비교하여 보다 높은 수율의 단쇄 알칼/알켄을 제공한다. 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제에 의해 수득된 단쇄 알칸/알켄의 수율은 기질로서 단쇄 지방산을 사용하는 지방산 데카복실라제 활성의 비교가능한 검정에서 참고 지방산 데카복실라제를 사용하여 수득된 동일한 단쇄 알칸/아켄의 수율의 ≥5배, ≥4.5배, ≥4 배, ≥3.5배, ≥3배, >2.5배, ≥2배, ≥1.9배, ≥1.8배, ≥1.7배, ≥1.6배, ≥1.5배, ≥1.4배, ≥1.3배, ≥1.2배, 또는 ≥1.1배일 수 있다.
일부 구현예에서, 보다 높은 수율은 Cn 알칸/알켄의 수율이고 단쇄 지방산 기질은 Cn+1 지방산이며, 여기서 n ≤ 8이다. 예를 들면, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 보다 높은 수율은 Cn 알칸/알켄의 수율이고 단쇄 지방산 기질은 Cn+1 지방산이며, 여기서 n ≤ 5이다. 예를 들면, n은 1, 2, 3, 4, 또는 5로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, n = 3이다. 일부 구현예에서, 지방산 기질은 발레르산이고 보다 높은 수율은 부탄의 수율이다. 일부 구현예에서, 지방산 기질은 이소발레르산이고 보다 높은 수율은 이소부탄의 수율이다. 일부 구현예에서, 지방산 기질은 발레르산, 이소발레르산 및/또는 부티르산의 조합이고, 보다 높은 수율은 부탄, 이소부탄 및/또는 프로판의 각각의 혼합물의 수율이다. 바람직한 구현예에서, n = 3이고, 지방산 기질은 부티르산이며 보다 높은 수율은 프로판의 수율이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 장쇄 지방산과 비교하여 단쇄 지방산에 대해 기질 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 참고 지방산 데카복실라제의 기질 선호도에 대해 장쇄 지방산보다 단쇄 지방산에 대해 보다 높은 기질 선호도를 가질 수 있다. 기질 선호도는 특이성 상수(kcat/KM)를 참고하여 기술될 수 있다. 단쇄 지방산 기질 선호도는 장쇄 지방산에 대한 선호도보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 또는 1000배 더 높을 수 있다. 본 발명의 효소의 단쇄 지방산 기질 선호도는 참고 지방산 데카복실라제의 선호도보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 또는 1000배 더 높을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 장쇄 지방산과 비교하여 단쇄 지방산에 대해 보다 높은 친화성을 가질 수 있다. 보다 높은 친화성은 KM 값을 참고로 기술될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 단쇄 지방산에 대해 보다 높은 친화도 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 참고 지방산 데카복실라제와 비교하여 장쇄 지방산에 대해 보다 낮은 친화도를 가질 수 있다. 보다 높은 친화도는 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 또는 1000배 더 높은 친화도일 수 있다. 기술자는 효소 동력학을 계산하는 방법을 인식할 것이며, 이는 예를 들면, 문헌: "The Chemical Kinetics of Enzyme Action", KJ Laidler 및 PS Bunting, Clarendon Press, 1973에서 검토되며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 지방산 데카복실라제는 치환을 결여하는 등가의 지방산 데카복실라제를 사용하여 수득된 수율의 1배 초과, 예컨대, 1.1배, 1.2배, 1 .3배, 1 .4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 5.0배, 6.0배, 7.0배, 8.0배, 9.0배 이상, 또는 10.0배 이상인 수율의 알켄/알칸을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 치환(들)을 포함하는 지방산 데카복실라제는 참고 단백질과 비교하여 단위 효소 당, 단위 시간 당 증가된 양의 알켄/알칸을 생산한다. 일부 구현예에서 지방산 데카복실라제는 비교가능한 검정에서 치환(들)을 결여한 등가의 지방산 데카복실라제의 특이적인 활성의 1배 이상, 예컨대, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1 .7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 5.0배, 6.0배, 7.0배, 8.0배, 9.0배 이상, 또는 10.0배 이상인 지방산의 알켄/알칸으로의 전환(예컨대, nmmol.min-1.mg-1로 나타냄)을 위한 특이적인 활성을 갖는다.
적합한 비교 검정은 실시예 3에 기술된 세포 유리된 검정, 실시예 4에 기술된 이. 콜라이 발현 검정, 및/또는 실시예 6에 기술된 할로모나스 검정으로부터 선택된 하나 이상의 검정을 포함한다.
일부 구현예에서, 치환(들)을 포함하는 지방산 데카복실라제는 검정에서 반응물, 예를 들면, 본 발명의 지방산 데카복실라제를 포함하는 세포의 배양물의 리터당 0.01 mg/L, 0.02mg/L, 0.03 mg/L, 0.04 mg/L, 0.05 mg/L, 0.06 mg/L, 0.07 mg/L, 0.08 mg/L, 0.09 mg/L, 0.1 mg/L, 0.2 mg/L, 0.3 mg/L, 0.4 mg/L, 0.5 mg/L, 0.6 mg/L, 0.7 mg/L, 0.8 mg/L, 0.9 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 1 1 mg/L, 12 mg/L, 13 mg/L, 14 mg/L, 15 mg/L, 16 mg/L, 17 mg/L, 18 mg/L, 19 mg/L, 20 mg/L 이상과 등가인 알켄/알칸 수율을 생산한다. 일부 구현예에서, 수율은 지방산 데카복실라제 또는 지방산 데카복실라제를 포함하는 세포의 총 중량에 대해 표준화될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응은 최적의 조건(예컨대, 온도, pH, 염도, 및 기질의 포화 농도, 보조 인자, 광 등)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 검정은 실시예 2 내지 4 및/또는 6 내지 8에 기술된 바와 같다.
지방산 데카복실라제는 광 의존적일 수 있는데, 즉, 이의 활성을 위해 광에 대한 노출을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 미세조류 클로렐라 바리아빌리스 NC64A는 청색 광에 대한 반응시 유리 지방산의 n-알칸 또는 n-알켄으로의 탈카복실화를 촉매하는 글루코즈-메탄올-콜린 옥시도리덕타제를 지닌다. 광은 임의의 파장 및/또는 색상 또는 이의 조합(예컨대, 백색 광)일 수 있지만, 특히 청색(400 내지 520nm) 또는 적색(620 내지 750nm 파장) 광일 수 있고, 가장 바람직하게는 청색 광일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 광은 400 내지 520 nm, 바람직하게는 450 nm 내지 495 nm, 특히 약 450 nm 또는 470nm의 파장을 갖는다. 제공된 광의 양은 예를 들면, 10 내지 3000 μmole.광자(photon).m-2.s-1, 바람직하게는 약 2000 μmole.광자.m-2.s-1일 수 있다. 지방산 데카복실라제는 작용하기 위하여 하나 이상의 보조효소를 필요로 할 수 있다. 예시적인 보조인자는 FAD(플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드)를 포함하며, 이는 효소에 대해 제공될 수 있거나, 세포 발현 시스템의 경우, 이종 또는 종종 유전자(들)로부터 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 지방산 데카복실라제 또는 이를 생산하는 세포를 적절한 파장의 광에 노출시키도록 수행할 수 있다.
알데하이드 데하이드로게나제
본원에 사용된 바와 같은, "알데하이드 데하이드로게나제"는 아실-CoA의 알데하이드로의 전환, 예를 들면, 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다.
일부 알데하이드 데하이드로게나제, 예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC 824 효소 AdhE2(알데하이드/알코올 데하이드로게나제; GenBank 번호: Q9ANR5)는 부티릴-CoA를 부티르산으로 전환시키는 것 외에도, 또한 부티릴-CoA를 독성이고 바람직하지 않은 부산물인 부탄올로 전환시키는 이-작용성 효소이다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 사용된 바와 같은 알데하이드 데하이드로게나제는 알코올-형성 반응을 촉매하지 않는다.
예시적인 알데하이드 데하이드로게나제는 클로스트리디움 베이제링키이(Clostridium beijerinckii)(BALDH)로부터 유래된 것이며, 이의 아미노산 서열은 서열 번호: 20에 의해 제공된다. 다른 알데하이드 데하이드로게나제는 서열 번호: 32 내지 37로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 부티르알데하이드 데하이드로게나제는 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 32 내지 37 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 32 내지 37 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
알데하이드 데하이드로게나제의 단편, 변이체, 동형 및 동족체는 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매하는 능력에 의해 임의로 특징화될 수 있다.
알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제
본원에 사용된 바와 같은, "알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제"는 알칸 생합성을 위한 지방족 알데하이드의 탈포르밀화를 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다(도 1a). 특히, 본 사용은 부티르알데하이드의 프로판으로의 탈포르밀화를 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다.
예시적인 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 문헌: Menon N, et al Biotechnol Biofuels 2015;8:61-12에 기술된 바와 같은 프로콜로로코쿠스 마리누스 균주(Procholorococcus marinus st.) MIT9313(ADO)로부터의 것이다. 당해 효소는 주로 장쇄(C17-C19) 지방 알데하이드의 알칸 탄화수소(C15-C17) 및 포르메이트로의 페레독신 및 산소-의존성 탈카보닐화를 촉매한다[9]. ADO의 기질 접근 채널의 구조-기반한 가공은 향상된 프로판 생산을 지닌 변이체 A134F 및 V41Y를 생성하였다[10].
ADO의 아미노산 서열은 서열 번호: 21에 제공된다. 일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 서열 번호: 21의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 21의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 서열 번호: 21의 A134번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 A134F이다. 일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 서열 번호: 21의 V41 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 부티르알데하이드의 탈포르밀화로부터 보다 높은 수율의 프로판을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환을 포함하는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 기질로서 부티르알데하이드를 사용하는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제 활성의 비교가능한 검정에서 서열 번호: 21을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 프로판의 수율과 비교하여 보다 높은 수율의 프로판을 제공한다. 치환을 포함하는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제에 의해 수득된 프로판의 수율은 기질로서 부티르알데하이드를 사용한 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제 활성의 비교가능한 검정에서 서열 번호: 21을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 프로판의 수율의 ≥ 5 배, ≥4.5 배, ≥4 배, ≥3.5 배, ≥3배, >2.5 배, ≥2 배, ≥1.9 배, ≥1.8 배, ≥1.7 배, ≥1.6 배, ≥1.5 배, ≥1.4 배, ≥1.3 배, ≥1.2배, 또는 ≥ 1.1배일 수 있다.
알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제의 단편, 변이체, 동형 및 동족체는 부티르알데하이드의 부탄으로의 전환을 촉매하는 능력에 의해 임의로 특징화될 수 있다.
일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 전자 전달 파트너 단백질, 예를 들면, 페레독신을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 조효소, 예를 들면, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+/NADH) 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADP+/NADPH)를 사용할 수 있다.
기타 효소
본원에 사용된 바와 같은, "아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제"는 아세틸 CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제는 서열 번호: 28의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "아세토아세틸 CoA 신타제"는 말로닐-CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아세토아세틸 CoA 신타제는 서열 번호: 24의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "클로스트리디알 3-하이드록시 부티릴-CoA 데하이드로게나제"는 아세틸아세틸-CoA의 3-하이드록시 부트리릴-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 클로스트리디알 3-하이드록시 부티릴-CoA 데하이드로게나제는 서열 번호: 29의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "3-하이드록시 부티릴-CoA 데하이드라타제"는 3-하이드록시 부트리릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 클로스트리디알 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제는 서열 번호: 30의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "트랜스-에노일-CoA 리덕타제"는 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 클로스트리디알 3-하이드록시 부티릴-CoA 데하이드로게나제는 서열 번호: 31의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, "아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제"는 부티릴-조효소 A의 부티르산으로의 전환을 촉매작용할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 클로스트리디알 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제는 서열 번호: 23의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 23의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
핵산
본원에 기술된 효소를 암호화하는 아미노산 서열외에도, 본 개시내용은 상기 서열을 암호화하는 핵산을 제공한다.
일부 구현예에서 핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서 핵산은 RNA이다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 단리된/정제된 형태로, 또는 숙주 세포 내에 제공될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 효소를 암호화하는 핵산은 이종 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 예를 들면, 구성적, 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 뉴클레오타이드 서열의 발현이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 놓이도록(이에 의해 발현 카세트를 형성함)하는 방식으로 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절성 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer))가 작동적으로 연결된 상황을 포함할 수 있다. 따라서, 조절 서열이 뉴클레오타이드 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우, 조절 서열은 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 적절한 경우, 수득되는 전사체는 이후에 목적한 단백질 또는 폴리펩타이드로 전사될 수 있다.
"프로모터"는 암호화 서열의 개시 및 전사율을 지시하는 천연의, 가공된, 또는 합성의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 많은 적합한 프로모터가 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제가 결합하는 부위를 함유하고 또한 다른 조절 성분(예를 들면, 전사 인자)의 결합을 위한 부위를 함유한다. 전형적으로, 프로모터는 프리브나우 박스((Pribnow box)(TATAAT), 및 조절 성분이 발현의 제어를 위해 첨가된, 전사 개시 부위를 규정하기 위해 제공되는 다른 서열로 구성된 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터를 포함한다.
효소를 암호화하는 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터, 특히 발현 벡터 상에 함유될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "벡터"는 세포 내로 외부 유전 물질을 전달하기 위한 비히클(vehicle)로서 사용된 올리고뉴클레오타이드 분자(DNA 또는 RNA)이다. 벡터는 특히 자가-전달 또는 가동화가능(mobilisable)하거나 자가-전달 또는 가동화가능하지 않을 수 있고, 세포 게놈 내로의 통합에 의해 원핵세포 또는 진핵세포 숙주, 특히 세균 숙주를 형질전환시킬 수 있거나 염색체-외적으로 존재하는(예컨대, 복제 오리진을 지닌 자가 복제하는 플라스미드), 이중 가닥 또는 단일 가닥 선형 또는 환형의 임의의 플라스미드, 코스미드, 파아지 등을 포함한다.
벡터는 세포 내에서 외부 유전 물질의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현될 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 및/또는 리보소옴 결합 부위(RBS) 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈(termination codon) 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일상적으로 작제되며 예를 들면, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시인자, 프로모터, RBS, 인핸서 및, 필수적일 수 있고 정확한 배향으로 위치하여 단백질 발현을 허용하는 다른 성분, 예를 들면, 폴리아데닐화 신호(signal)의 사용을 포함할 수 있다.
벡터는 양립가능한(compatible) 숙주 세포 내에서 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 폴리뉴클레오타이드를 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 벡터를 양립가능한 숙주 세포 내로 도입하며 숙주 세포를 벡터의 복제를 일으키는 조건 하에서 성장시킴에 의해 생산될 수 있다.
벡터는 발현될 유전자 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 본 발명에 따른 벡터로부터 효소를 발현시킬 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드, 이원 벡터(binary vector), 바이러스 벡터 및 인공 염색체(예컨대, 효모 인공 염색체)를 포함한다.
상기 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 작제물 또는 벡터는, 특히 벡터가 핵산을 게놈 내로의 재조합을 위해 세포 내로 도입시키는데 사용되어야 하는 경우 프로모터 또는 다른 조절 서열을 포함할 필요가 없다.
작제물 및 벡터는 또한 선택가능한 표현형, 예를 들면, 항생제에 대한 내성, 예를 들면, 가나마이신, 하이드로마이신, 포스피노트리신, 클로르설푸론, 메토트렉세이트, 겐타마이신, 스펙티노마이신, 클로람페니콜, 암피실린 등을 부여하는 유전자로 이루어진 선택가능한 유전 마커를 추가로 포함할 수 있다.
당해 분야의 기술자는 예를 들면, 벡터를 작제하고 미생물 세포 내에서 재조합 유전자 발현을 위한 프로토콜을 설계할 수 있다. 적절한 조절 서열, 예를 들면, 프로모터 서열, 터미네이터 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절하게는 다른 서열을 함유하는, 적합한 벡터를 선택하거나 작제할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들면, 문헌: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook et al, 2001 , Cold Spring Harbor Laboratory Press 및 Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992를 참고한다.
당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈도 사용하여 본 발명에 따른 벡터로부터 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 파아지(phage), MAC, 바이러스 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 진핵세포 발현 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 진핵세포 발현 벡터, 예컨대, 진핵 세포 내에서 벡터로부터 단백질의 발현에 필수적인 성분을 포함하는 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 예컨대, 단백질 발현을 진행하기 위한 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 SV40 프로모터를 포함하는, 포유동물 발현 벡터일 수 있다.
다른 적합한 벡터는 당해 분야의 기술자에게 명백할 수 있다. 이와 관련하여 추가의 예로서, 본 발명자들은 문헌: Sambrook et al., 2001 , Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Harbour Laboratory Press를 지칭한다.
용어 "작동적으로 연결된"은 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)이 조절 서열의 영향 또는 제어하에서 뉴클레오타이드 서열의 발현이 위치하도록 하는 방식으로 공유결합으로 연결되어 있는 상황을 포함할 수 있다. 따라서, 조절 서열이 뉴클레오타이드 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 조절 서열은 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 수득되는 전사체는 이후에 목적한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내로 해독될 수 있다. 프로모터는 T7 프로모터일 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 작제물로부터 전사된 mRNA로부터 암호화된 단백질의 해독을 촉진시키기 위한 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 작제물은 리보소옴 결합 부위(RBS), 예를 들면, 출발 코돈의 상부의 샤인-델가노(Shine-Delgarno)(SD) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RBS 서열은 암호화된 단백질의 상이한 발현 수준을 제공하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 암호화된 단백질(들)의 발현을 조절하기 위한 하나 이상의 반응 성분을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응 성분은 특수한 제제(agent)를 사용한 치료에 대한 반응시 유전자 또는 단백질 발현을 상향조절하도록 하는 성분이다. 예를 들면, 제제는 제제에 대한 반응 성분을 포함하는 벡터로부터 단백질(들)을 암호화하는 DNA의 전사를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서 제제는 이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노시드(IPTG)일 수 있으며, 벡터는 lac 오퍼레이터(operator)를 포함할 수 있다. 다른 유도제/반응 성분 조합은 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 암호화된 단백질(들)의 구성적 발현을 위한 하나 이상의 반응 성분을 암호화함으로서 유도가 필수적이지 않도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 목적한 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 서열의 하부의 전사 터미네이터 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 터미네이터는 T7 터미네이터 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 목적한 단백질을 암호화하는 서열과 프레임 내(in-frame)로 검출가능한 마커를 암호화하는 서열을 포함함으로써 단백질의 발현의 검출, 및/또는 단백질(예컨대, 임의로 N- 또는 C-말단에서 His, (예컨대, 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 바이오틴 태그(Biotin tag))의 정제 또는 단리의 검출을 촉진할 수 있다.
핵산/발현 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며, 이는 기술자에게 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서 핵산/발현 벡터는 형질전환, 형질도입, 접합, 형질감염 또는 전기천공(electroporation)에 의해 세포 내로 도입된다.
T7 및 T7-유사 프로모터 시스템이 특히 바람직하다. T7 RNA 폴리머라제는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 이는 이. 콜라이(E. coli) RNA 폴리머라제의 활성보다 수배 높은 속도에서 RNA를 합성하는 매우 활성인 효소이다. 또한, 이는 보다 낮은 종결 빈도를 가지며, 이의 전사는 플라스미드를 일주(circumnavigate)하여, 크기가 플라스미드 길이의 수배인 RNA를 생성한다. T7 RNA 폴리머라제는 또한 이의 자체의 프로모터 서열에서의 개시를 위해 매우 선택적이며 이. 콜라이 RNA 폴리머라제를 억제하는 리팜피신과 같은 항생제에 대해 내성이다.
"T7-유사" 시스템은 바이러스 폴리머라제 T7(IPTG-유도성: pET 시스템 벡터 내에서 발견됨)과 같이 작업하지만 다른 세균 종, 예컨대, 할로모나스 내에서 양립가능한 시스템인 IPTG-유도성 시스템이다. 유전자 MmP1은 할로모나스 내에서 재조합 단백질의 IPTG-유도성 발현을 가능하도록 하는 T7-유사 프로모터이다(Zhao H et al 2017 Novel T7-like expression systems used for Halomonas. Metabolic Engineering 39: p. 128-140, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다). 바람직하게는, 할로모나스 균주는 염색체적으로 통합되거나 벡터 또는 플라스미드 상에 있는 MmP1 유전자이다.
일부 구현예에서, 유도성 시스템은 T7-유사 MmP1 또는 유사 시스템(예컨대, K1F, VP4 또는 RiboJ), 또는 proD를 기반으로 한 구성적 시스템을 사용할 수 있다.
다음은 할로모나스 내에서 효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상부에 사용될 수 있는 T7-유사 프로모터 서열이다:
>MmP1_고 (Ih)(서열 번호: 38)
Figure pct00017
>MmP1_중간 (Im)(서열 번호: 39)
Figure pct00018
>MmP1_저 (II)(서열 번호: 40)
Figure pct00019
이는 할로모나스 균주내에서 MmP1 유전자를 필요로하며, 여기서 MmP1 유전자는 염색체적으로 또는 벡터 또는 플라스미드 내에 혼입된다.
프로모터는 또한 구성적일 수 있다. "구성적"은 재조합 단백질을 발현하는데 요구되는 유도가 없음(IPTG와 같은 특이적인 화학적 첨가)을 의미한다. 다음의 프로모터 서열을 할로모나스내 효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 상부에 사용할 수 있으며, 다양한 수준의 발현을 제공할 수 있다.
>P40-1 저(Cl)(서열 번호: 41 )
Figure pct00020
>P40_중간(Cm)(서열 번호: 42)
Figure pct00021
>P40-9_고(Ch)(서열 번호: 43)
Figure pct00022
>P40-58_v고(Cvh) (서열 번호: 44)
Figure pct00023
세포
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 세포는 본원에 기술된 효소를 발현할 수 있다. 세포는 본원에 기술된 효소를 생산하거나, 함유하거나, 분비할 수 있다.
세포는 단리된 형태로 및/또는 배양물 속에 제공될 수 있다. 세포는 시험관내(in vitro)에서 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 효소를 포함하는 세포는 세포 내로 도입된 본 발명에 따른 핵산/발현 벡터로부터의 발현을 통해 그와 같이 할 수 있다.
본 발명과 함께 사용하기 위해 고려된 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 원핵 세포는 세균 또는 고세균(archaea)일 수 있고, 진핵 미생물은 진균, 원생생물, 또는 현미경 동물 또는 현미경 식물 유기체일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 다세포 유기체로부터의 단리된 세포이다.
바람직한 양태에서, 세포는 세균의 세포이다. 일부 구현예에서, 세균은 그람양성 세균이다. 그람-양성 세균은 바실러스(Bacillus) 속으로부터의 세균, 리스테리아(Listeria), 클로스트리디움(Clostridium)(예컨대, 씨 디피실레(C. difficile)), 또는 코쿠스(coccus), 예를 들면, 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예컨대, 에스. 아우레우스(S. aureus)), 또는 스트렙토코쿠스(Streptococcus)로부터의 세균을 포함한다. 일부 구현예에서 세균은 그람-음성 세균일 수 있다. 그람-음성 세균은 세균 분화의 그람 염색 방법에서 사용된 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 보유하지 않아서, 양성 확인이 가능하도록 하는 세균의 부류로서 정의될 수 있다. 그람-음성 세균은 프로테오세균(proteobacteria) 또는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 계열의 세균, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 종(Salmonella sp), 시겔라 종(Shigella sp), 또는 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 나이세리아(Neisseria), 레지오넬라(Legionella), 할로모나스(Halomonas), 크렙시엘라(Klebsiella) 또는 예르시니아(Yersinia) 속 세균으로부터 선택된 세균을 포함한다.
임의의 세균, 예를 들면, 실험실 균주(예를 들면, 이. 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 또는 필드 균주(field strain)를 사용할 수 있다. 바람직한 세균은 에너지 원으로서 생물량(biomass) 또는 이로부터 기원한 화합물을 사용할 수 있는 종속영양성인 세균, 예컨대, 화학합성유기영양성(chemoheterotrophic) 세균인 것일 것이다.
바람직한 세균은 견고한(robust) 세균, 예를 들면, 토양 세균 및/또는 극한성(extremophilic) 세균이다. 극한성 세균은 경미한 호염균(slight halophile)(1.7 내지 4.8% NaCl 속에서 성장가능), 중간 호염균(moderate halophile)(4.7 내지 20% NaCl 속에서 성장가능), 극도의 호염군(extreme halophile)(20 내지 30% NaCl 속에서 성장가능), 호산균(낮은 pH, 예를 들면, pH 5.0 이하, 예컨대, pH 2 이하에서 성장가능), 호알칼리 세균(alkaliphile)(pH 8.5 이상의 조건에서 성장가능), 금속내성 세균(metallotolerant bacteria)(고 농도의 용해된 중금속을 함유하는 환경에서 생존가능), 호열성 세균(thermophile)(약 41 내지 122℃의 최적 성장 온도를 지님, 예컨대, 칼디셀룰로시룹토르(Caldicellulosiruptor), 써모토가(Thermotoga), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 피로코쿠스(Pyrococcus), 및 아에로피룸(Aeropyrum)), 또는 다중극한성 세균(polyextremophile)(2개 이상의 극한성 특성을 지닌 세균)을 포함한다. 이러한 세균은 탄화수소를 생산하기 위한 생물량 발효기 속에서 세균 배양시 특수한 유용성을 찾을 수 있다.
호염성 세균이 특히 바람직하다. 이는 개방된 비-멸균 조건에서 성장할 수 있다. 이러한 균주는 염 내성(salt tolerant)이므로, 이들은 고 염 함량이 존재하는 한 우월하지 않을 것이다. 더욱이, 고 염 완충제(예컨대, 적어도 3% 염 용액)의 첨가를 사용하여 경쟁하는 세균을 제어할 수 있다. 호염성 세균은 할로모나스 속의 것을 포함한다. 예시적인 할로모나스 종, 예를 들면, 에이치. 알리멘타리아(H. alimentaria), 에이치, 알칼리안타크티카(H. alkaliantarctica), 에이치. 알칼리필라(H. alkaliphila), 에이치. 알메리엔시스(H. almeriensis), 에이치. 안데센시스(H. andesensis), 에이치. 안티카리엔시스(H. anticariensis), 에이치. 아쿠아마리나(H. aquamarina), 에이치. 아르시스(H. arcis), 에이치, 악시알렌시스(H. axialensis), 에이치. 베이메넨시스(H. beimenensis), 에이치. 블루파게네시스(H. bluephagenesis), 에이치. 볼리비엔시스(H. boliviensis), 에이치. 캄파니엔시스(H. campaniensis), 에이치. 캄피살리스(H. campisalis), 에이치. 카세이닐리티카(H. caseinilytica), 에이치. 세리나(H. cerina), 에이치. 시비마리스(H. cibimaris), 에이치. 쿠피다(H. cupida), 에이치. 다퀴아노넨시스(H. daqiaonensis), 에이치. 다퀸겐시스(H. daqingensis), 에이치. 데니트리피칸스(H. denitrificans), 에이치. 데시데라타(H. desiderata), 에이치. 엘롱가타(H. elongata), 에이치. 유리할리나(H. eurihalina), 에이치. 플라바(H. flava), 에이치. 폰틸라피도시(H. fontilapidosi), 에이치. 가리콜라(H. garicola), 에이치. 곰세오멘시스(H. gomseomensis), 에이치. 구다오넨시스(H. gudaonensis), 에이치. 할모필라(H. halmophila), 에이치. 할로신티아에(H. halocynthiae), 에이치. 할로데니트리피칸스, 할로필라(H. halodenitrificans, halophila), 에이치. 할밀토니이(H. hamiltonii), 에이치. 헤일롱지안겐시스(H. heilongjiangensis), 에이치. 후앙헨시스(H. huangheensis), 에이치. 하이드로써말리스(H. hydrothermalis), 에이치. 일리키콜라(H. ilicicola), 에이치. 장고켄시스(H. janggokensis), 에이치. 제오트갈리(H. jeotgali), 에이치. 존소니아에(H. johnsoniae), 에이치. 케니엔시스(H. kenyensis), 에이치. 코레엔시스(H. koreensis), 에이치. 코를렌시스(H. korlensis), 에이치. 크립벤시스(H. kribbensis), 에이치. 루테아(H. lutea), 에이치. 루테스센세(H. lutescence), 에이치. 마가디엔시스(H. magadiensis), 에이치. 마우라(H. maura), 에이치. 메리디안(H. meridian), 에이치. 몬골리엔시스(H. mongoliensis), 에이치. 무랄리스(H. muralis), 에이치. 난하이엔시스(H. nanhaiensis), 에이치. 넵투니아(H. neptunia), 에이치. 니트로레두센스(H. nitroreducens), 에이치. 올리바리아(H. olivaria), 에이치. 오르가니보란스(H. organivorans), 에이치. 파시피카(H. pacifica), 에이치. 판텔레리엔시스(H. pantelleriensis), 에이치. 퀴아오하우엔시스(H. qiaohouensis), 에이치. 키지아오진겐시스(H. qijiaojingensis), 에이치. 람블리콜라(H. ramblicola), 에이치. 리펜시스(H. rifensis), 에이치. 삽크하에(H. sabkhae), 에이치. 사카레비탄스(H. saccharevitans), 에이치. 살리캄피(H. salicampi), 에이치. 살리포디나에(H. salifodinae), 에이치. 살리나(H. salina), 에이치. 세디미니콜라(H. sediminicola), 에이치. 쉔글리엔시스(H. shengliensis), 에이치. 시나이엔시스(H. sinaiensis), 에이치. 스미르넨시스(H. smyrnensis), 에이치. 손그네넨시스(H. songnenensis), 에이치. 스테노필라(H. stenophila), 에이치. 스테벤시이(H. stevensii), 에이치. 섭글라시에스콜라(H. subglaciescola), 에이치. 섭테라네안(H. subterranean), 에이치. 술피다에리스(H. sulfidaeris), 에이치. 타에아넨시스(H. taeanensis), 에이치. 티타니카에(H. titanicae), 에이치. 우룸퀴엔시스(H. urumqiensis), 에이치. 바리아빌리스(H. variabilis), 에이치. 벤토사에(H. ventosae), 에이치. 베누스타(H. venusta), 에이치. 빌라멘시스(H. vilamensis), 에이치. 크시안헨시스(H. xianhensis), 에이치. 크신지안겐시스(H. xinjiangensis), 에이치. 장지안겐시스(H. zhangjiangensis) 및 에이치. 징시두란스(H. zincidurans)가 기술되어 있다.
바람직한 할로모나스 균주는 할로모나스 균주 TQ10 및 할로모나스 균주 TD01을 포함한다. 균주 TQ10은 TD01 균주의 유전적으로 변형된 버젼이며 여기서 유전자 암호화 MmP1은 세균 내로 염색체적으로 통합되었다. 유전자 MmP1은 할로모나스 내에서 재조합 단백질의 IPTG-유도성 발현을 가능하도록 하는 T7-유사 프로모터이다(참고: 본원에 이의 전문이 참고로 포함된, Zhao H et al 2017 Novel T7-like expression systems used for Halomonas. Metabolic Engineering 39: p. 128-140). 바람직하게는, 할로모나스 균주는 염색체적으로 통합되거나 벡터 또는 플라스미드 상의 MmP1 유전자이다.
본 발명에서 사용하기 위한 세균은 생물량 원료로부터 지방산, 예를 들면, 단쇄 지방산, 예를 들면, 부티르산을 생산할 수 있다. 예를 들면, 세균은 도 9에 나타낸 바와 같이, 글루코스 또는 셀룰로즈를 지방산으로, 및 지방산을 탄화수소로 전환시킬 수 있다. 세균은 글루코즈 또는 셀룰로즈의 지방산으로의 전환에 요구되는 내인성 유전자를 지닐 수 있거나, 이러한 능력은 하나 이상의 이종 유전자에 의해 부여될 수 있다. 지방산을 생산할 수 있는 세균은 임의의 수의 서열 번호: 23 내지 31에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
특수한 구현예에서, 에스케리키아 세균, 예를 들면, 이. 콜라이, 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 및 시나오박테리아(cyanobacteria)가 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다.
일부 구현예에서 폴리펩타이드는 예컨대, 본원에 이의 전문이 참고로 포함된, 문헌: Zemella et al. Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431에 기술된 시스템을 사용하여 세포-유리된-단백질 합성(CFPS)에 의해 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명에 따른 세포를 암호화된 단백질(들)의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 조성물의 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서 이러한 방법은 (ii) 상기 발현된 단백질(들)을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 생산된 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포, 핵산, 발현 벡터, 및 효소/효소의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 예컨대, 본 발명에 따른 탄화수소 생합성을 위한 방법에서의 용도를 찾는다.
본 발명은 또한 이종 지방산 데카복실라제를 포함하는 세포, 예를 들면, 세균 세포를 제공한다.
효소를 암호화하는 폴리펩타이드의 재조합 생산
본 개시내용에 따른 효소를 암호화하는 폴리펩타이드는 기술자에게 공지된 재조합 단백질 생산 방법에 따라 제조될 수 있다. 재조합 생산에 적합한 분자 생물학 기술, 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Harbor Press, 2012에 잘 공지되어 있다.
발현은 핵산 서열 및/또는 발현 벡터, 예컨대, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 발현 벡터로부터 유래할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여 본 발명에 따른 발현 벡터로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 발현은 본 발명에 따른 세포로부터 유래할 수 있다. 효소를 암호화하는 폴리펩타이드의 발현에 적합한 임의의 세포를 사용할 수 있다.
생산은 관련 폴리펩타이드(들)을 발현하도록 변형된 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양물, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급물이 제공된 생물반응기 속에서 수행할 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배양 배지/발효 브로쓰(broth)를 분배하고, 단백질 내용물을 추출하며, 개개 단백질을 분리하여 분리되거나 발현된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 단리함으로써 수집할 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기술은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌: Green 및 Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4th Edition; 상기 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
생물반응기는 하나 이상의 용기를 포함하며 여기서 세포가 배양될 수 있다. 생물반응기 속에서의 배양은 반응기 내로 반응물의 연속적인 유동, 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속적인 유동으로, 연속적으로 일어날 수 있다. 대안적으로, 배양은 배치식(batch)으로 일어날 수 있다. 생물반응기는 환경 조건, 예를 들면, pH, 산소, 광 파장 및 강도, 용기 내 및 밖으로의 유동 속도, 및 용기 내에서 교반을 모니터하고 제어함으로써 최적의 조건이 배양되는 세포에 대해 제공되도록 한다.
배양에 이어서 목적한 폴리펩타이드(들)를 발현하는 세포를 단리할 수 있다. 당해 분야에 공지된 세포로부터 단백질을 분리하는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 폴리펩타이드를 단리하기 위하여, 영양 배지로부터 세포를 분리하는 것이 필수적일 수 있다.
폴리펩타이드(들)이 세포로부터 분비되는 경우, 세포는 원심분리에 의해 목적한 분비된 폴리펩타이드(들)을 함유하는 배양 배지로부터 분리할 수 있다.
목적한 폴리펩타이드(들)가 세포 내에서 수집되는 경우, 단백질 단리는 세포 배양 배지로부터 세포를 분리하기 위한 원심분리, 분해 완충제를 사용한 세포 펠렛(pellet)의 처리, 및 예컨대, 초음파처리, 신속한 동결-해동 또는 삼투압 분해에 의한 세포 파괴를 포함할 수 있다.
이는 이후 상층액 또는 영양 배지로부터 목적한 폴리펩타이드(들)를 단리하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 다른 단백질 및 비-단백질 구성성분을 함유할 수 있다.
상층액 또는 배양 배지로부터 단백질 구성성분을 분리하기 위한 한가지 접근법은 침전에 의한 것이다. 상이한 용해도의 단백질은 상이한 농도의 침전제, 예를 들면, 황산암모늄에서 침전된다. 예를 들면, 저 농도의 침전제에서는, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 상이한 증가하는 농도의 침전제를 가함으로써, 상이한 용해도의 단백질을 구별할 수 있다. 투석을 후속적으로 사용하여 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거할 수 있다. 단백질 구성성분을 분리하기 위한 다른 방법은 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 이는 침전에 대한 대안으로서 사용될 수 있거나, 침전에 대해 후속적으로 수행될 수 있다.
일단 목적한 폴리펩타이드(들)이 배양물로부터 단리되면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 농축시키는 것이 바람직하거나 필수적일 수 있다. 단백질을 농축시키는 다수의 방법, 예를 들면, 한외여과 및 동결건조가 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 효소를 암호화하는 폴리펩타이드는 효소를 암호화하는 보다 큰 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체의 구성성분으로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 효소를 암호화하는 폴리펩타이드는 효소를 암호화하는 융합 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서 효소를 암호화하는 폴리펩타이드는 발현, 폴딩(folding), 트래피킹(trafficking), 프로세싱(processing) 또는 정제를 촉진시키는 아미노산 서열(들), 예컨대, His (예컨대, 6XHis), Myc GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 바이오틴 태그를, 임의로 N- 또는 C-말단에서 포함할 수 있다.
탄화수소의 생산
본 개시내용은 또한 하나 이상의 효소를 사용하여 공급 스톡 원료(feed stock)의 알켄 및/또는 알칸으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 연료로서 유용한, 단쇄 알칸, 예를 들면, 프로판, 부탄 및 이소부탄을 생산하는 방법일 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 전환용 기질을 제공하는 단계를 포함한다. 방법은 기질 또는 물질대사 전구체를 효소를 함유하는 용기에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 방법은 전환 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 생성물은 후속적인 방법 단계에 따라서 전환시 기질로서 회수되고 사용될 수 있다. 일부 구현예에서 생성물은 방법의 최종 생성물로서 회수된다. 회수된 생성물은 단리/정제될 수 있다. 반응 생성물은 예컨대, 가스 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분광법으로 분석할 수 있다.
촉매 기질을 함유하는 임의의 적합한 물질을 공급원료로서 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 방법은 생물량-유래된 공급원료, 예를 들면, 미생물 소화/발효에 의한 생물량의 미생물 가공 생성물을 사용한다. 이러한 공급 원료는 전형적으로 부티르산, 이소발레르산, 및/또는 발레르산 뿐만 아니라, 이의 전구체가 풍부하다.
"효소 Z를 사용하여 기질 X의 생성물 Y로의 전환을 촉매작용함을 포함하는 방법"은 암시적으로 기질 X의 생성물 Y로의 전환에 적합한 조건 하에서 효소 Z를 사용하여 기질 X를 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 항온처리 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서 효소는 연속적으로 제공된다. 일부 구현예에서 효소는 동시에(즉, 함께) 제공된다. 일부 구현예에서 효소는 효소/효소들을 연속적으로 가함으로써(즉, 차례로) 동시에 제공된다.
본 발명의 방법에 따른 관련된 전환 또는 전환들에 적합한 조건과 관련된 인자는 효소(들), 기질(들), 효소(들)의 활성, 효소(들)의 농도, 기질(들)의 농도, 효소 보조-인자 농도/이용능, 온도, 염도, pH, 교반, 이산화탄소 수준, 산소 수준, 영양물 이용능, 반응 용적, 가시광(특히, 청색광, 예컨대, 대략 470 nm)의 존재를 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 주어진 전환 또는 전환의 조합에 적합한 조건은 예컨대, 목적한 반응 생성물에 대해 적절한 것으로서, 본 출원 및 본원에 확인된 참고문헌의 실험 실시예를 참고하여 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 보조-인자 또는 전자 전달 파트너를 반응물(들)에 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 보조-인자 또는 전자 전달 파트너의 하나 이상의 공급원이 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보조-인자 또는 전자 전달 파트너 또는 보조인자/전자 전달 파트너의 공급원을 생산/재순환시키기 위한 시스템이 제공된다. 일부 구현예에서 보조인자 또는 전자 전달 파트너는 NADH, NAD+, NADPH, NADP+, FAD, 페레독신 및/또는 디-철(di-iron) 또는 망간-철 보결 그룹(prosthetic group)으로부터 선택된다. 전자 전달 파트너가 페레독신인 경우, 페레독신은 철 황 보결 그룹을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 시험관내, 생체외(ex vivo), 또는 생체내에서 수행할 수 있거나 생성물이 존재할 수 있다. 용어 "시험관내"는 실험실 조건에서 물질, 생물학적 물질, 세포 및/또는 조직을 사용한 실험을 포함하는 것으로 의도되는 반면 용어 "생체내"는 완전한 다-세포 유기체를 사용한 실험 및 과정을 포함하는 것으로 의도된다. "생체외"는 조직(예컨대, 전체 유기체) 또는 유기체로부터 취한 세포 상에 존재할 수 있는, 유기체 밖, 예컨대, 사람 신체 또는 동물체 밖에 존재하거나 일어나는 것을 지칭한다.
본 발명에 따른 방법은 사람 신체 또는 동물체 밖에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 방법은 용기, 생물반응기, 발효기 또는 유사 장치 속에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있거나, 생성물은 시험관내 또는 생체외에 존재할 수 있다. 용어 "시험관내"는 실험실 조건 또는 배양물 속에서 물질, 생물학적 물질, 세포 및/또는 조직을 사용한 실험을 포함한 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체내"는 완전한 다세포 유기체를 사용한 실험 및 과정을 포함하는 것으로 의도된다. "생체외"는 조직(예컨대, 전체 기관) 또는 유기체로부터 취한 세포상에 존재할 수 있는, 유기체 밖, 예컨대, 사람 신체 또는 동물체 밖에서 존재하거나 일어나는 유기체를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단리된/정제된 효소(들)를 사용하여 수행한다. 일부 구현예에서 효소(들)은 시판 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서 효소(들)은 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 재조합적으로 발현될 수 있거나 발현될 수 있었고, 후속적으로 단리/정제될 수 있거나 단리/정제될 수 있었다. 일부 구현예에서 효소(들)은 유기체(예컨대, 미생물) 또는 효소(들)를 발현하는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소(들)은 유기체에 대해 내인성인 핵산의 발현의 결과로서 효소(들)를 발현하는 유기체 또는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소(들)은 유기체에 대해 비-내인성인 이종 핵산(예컨대, 본 발명에 따른 핵산/발현 벡터)에 대해 비-내인성인 이종 핵산의 발현 결과로서 효소(들)를 발현하는 유기체로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소(들)를 발현하는 유기체 또는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관은 효소(들)를 분비할 수 있다. 일부 구현예에서, 효소(들)를 수득하는 것은 유기체(예컨대, 미생물) 또는 효소(들)를 발현하는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관, 또는 이의 분비된 생성물로부터 효소(들)을 단리/정제함을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 유기체(예컨대, 미생물) 또는 효소(들)을 발현하는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관의 추출물(들)을 사용하여 수행된다. 추출물은 효소(들)가 관련 활성을 보유하도록 제조된다. 일부 구현예에서, 추출물(들)은 유기체 또는 유기체에 대해 내성인 핵산의 발현의 결과로서 효소(들)을 발현하는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 추출물(들)은 유기체 또는 유기체에 대해 비-내인성인 이종 핵산(예컨대, 본 발명에 따른 핵산/발현 벡터)의 발현의 결과로서 효소(들)을 발현하는 다세포 유기체의 세포, 조직 또는 기관으로부터 제조될 수 있다. 추출물의 제조는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 기관/조직/세포(예컨대, 세포 파괴 또는 초음파처리를 통해)를 균질화하는 단계, 세포를 분해하는 단계(예컨대, 분해 완충제 사용), 세포 부스러기를 제거하는 단계 등.
일부 구현예에서 본 발명의 방법은 살아있는 세포 또는 전체 세포(예컨대, 완전한 호흡하는 세포)를 사용하여 수행한다. 일부 구현예에서, 효소(들) 및 기질(들)은 세포 내부에서 서로 접촉할 수 있다. 일부 구현예에서 기질은 세포에 의해 생산될 수 있다. 일부 구현예에서 기질/이의 전구체는 세포 내로 확산될 수 있다. 일부 구현예에서 기질/이의 전구체는 세포에 의해, 예컨대, 세포막을 가로지르는 활성 수송에 의해 취할 수 있다. 일부 구현예에서 효소(들)는 살아있는 세포로부터 분비될 수 있고, 효소(들) 및 기질(들)은 세포의 밖에서 서로 접촉할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 비-멸균 조건에서 수행된다.
다수의 촉매 단계를 필요로 하는 방법에서, 다수의 효소를 제공하는 조성물이 바람직할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 개시내용은 다수의 효소, 예를 들면, 주어진 방법을 위해 나타낸 모든 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 주어진 방법에 필요한 다수의 효소를 암호화하는 핵산이 본원에 제공된다. 이러한 암호화된 효소는 예를 들면, 프로모터의 통합된 제어 하에서, 단일 발현 카세트로서 포함될 수 있다. 또한, 주어진 방법을 위해 나타낸 모든 효소를 암호화하는 다수의 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 하나 또는 각각의 개개 핵산은 주어진 방법을 위해 나타낸 효소를 암호화하지 않거나, 하나 또는 다수를 암호화한다. 바람직한 구현예에서, 주어진 방법을 위해 나타낸 다수의 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포, 예를 들면, 세균 세포가 제공된다. 또한 다수의 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은 주어진 방법을 위해 나타낸 다수의 효소를 포함하고, 여기서 하나 또는 각각의 세포는 주어진 방법을 위해 나타낸 효소를 암호화하지 않거나, 하나 또는 다수를 암호화하는 핵산을 포함한다. 조성물은 하나 이상의 나타낸 효소를 암호화하는 상이한 핵산을 수반하는 다수의 균주를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 생물량 공급원료의 탄화수소, 특히 가스성 연료로의 생물전환(bioconversion)에 적용가능하다. 이러한 방법에서, 본 발명의 세균 세포, 또는 이의 배양물은 생물량 공급원료에 첨가될 수 있다. 세균 세포는 개별적으로 공급원료 속의 글루코즈 및/또는 셀룰로즈를 탄화수소로 전환시킬 수 있는데, 예컨대, 이는 도 8, 도 9 또는 도 10에 나타낸 전체 반응 도식을 수행할 수 있다. 대안적으로, 세포는 글루코즈/셀룰로즈 하부의 중간체를 탄화수로로 단지 가공할 수 있다. 이러한 방법은 생물량 공급원료를 본 발명의 세균 세포에 의해 수용된 중간체로 전환시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이는 중간체를 탄화수소로 전환시킴과 동시에 또는 전환시키기 전에 수행될 수 있다. 전환은 세균의 하나 이상의 추가의 균주에 의해 수행될 수 있다. 방법은 원치않는 세균을 예컨대, 오토클레이빙(autoclaving) 또는 원치않는 세균에 대해 독성이지만 본 발명의 세포에 의해 견디어지는 물질의 첨가를 통해 사멸시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 독성 물질은 항생제, 염 용액, 과산화수소 용액, 및/또는 pH를 변경시키는 제제이다.
일부 구현예에서 효소를 암호화하는 폴리펩타이드는 세포-유리된 단백질 합성(CFPS)에 의해, 예컨대, 이의 전문이 본원에 의해 참고로 포함된 문헌: Zemella et al. ChemBioChem (2015) 16(17): 2420-2431에 기술된 시스템을 사용하여 제조할 수 있다.
지방산 데카복실라제를 사용하여 지방산의 알칸 및/또는 알켄으로의 전환을 촉매작용함을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 바람직하게는, 방법은 지방산 데카복실라제를 사용한 단쇄 지방산의 알칸 및/또는 알켄으로의 전환을 촉매작용함을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 지방산 데카복실라제를 사용하여 Cn+1 지방산의 Cn 알칸으로의 전환을 촉매작용함을 포함하며, 여기서 n ≤ 8, 또는 n ≤ 5이다. 지방산 데카복실라제는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 이러한 효소일 수 있다.
방법은 다양한 기질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 지방산 기질은 각각 프로판, 부탄 및 이소부탄을 생산하는, 부티르산, 발레르산, 또는 이소발레르산일 수 있다. 그러나, 방법은 지방산 데카복실라제에 의해 전환될 수 있는 기질의 혼합물을 활용할 수 있다. 예를 들면, 지방산 데카복실라제는 프로판, 부탄 및 이소부탄의 혼합물을 생산하는, 부티르산, 발레르산, 및 이소발레르산의 혼합물을 사용하여 제공될 수 있다. 지방산 데카복실라제는 프로판과 이소부탄의 혼합물을 생산하는, 부티르산과 이소발레르산의 혼합물을 사용하여 제공될 수 있다. 지방산 데카복실라제는 프로판과 부탄의 혼합물을 생산하는, 부티르산과 발레르산의 혼합물을 사용하여 제공될 수 있다. 지방산 데카복실라제는 부탄과 이소부탄의 혼합물을 생산하는, 발레르산과 이소발레르산의 혼합물을 사용하여 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 촉매적 기질의 알켄/알칸으로의 전환 전 단계를 포함한다.
예를 들면, 방법은 지방산 데카복실라제를 사용한 지방산의 알켄/알칸으로의 전환을 촉매작용시키기 전에 아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제를 사용하여 아실-조효소 A(아실-CoA)의 지방산으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함할 수 있다. 이는 전환을 위해 보다 많은 지방산을 제공하여, 증가된 수율의 알켄/알칸을 생성한다. 아실-조효소 A(아실-CoA)는, 예를 들면, 부티르산을 생성하는 부티릴-CoA일 수 있지만 1, 2, 3, 4 또는 5개의 탄소의 쇄 길이를 지닌 임의의 다른 아실-CoA일 수 있다. 바람직한 아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제는 YciA(서열 번호: 23), 또는 이의 유도체, 단편 또는 변이체(예컨대, 서열 번호: 23에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 서열)일 수 있다. 또한 알데하이드 데하이드로게나제, 예를 들면, 부티르알데하이드 데하이드로게나제를 사용한 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용한 후, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 사용하여 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함한다. 방법은 프로판을 생산하는 방법일 수 있다.
방법은 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii)로부터의 알데하이드 데하이드로게나제, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체를 활용할 수 있다. 방법은 본원에 기술된 바와 같은 서열 번호: 20에 따른 알데하이드 데하이드로게나제, 또는 이의 변이체, 단편 또는 동족체를 활용할 수 있다. 방법은 본원에 기술된 바와 같은, 서열 번호: 21에 따른 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제, 또는 이의 변이체, 단편 또는 동족체를 활용할 수 있다. 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제는 보조인자 또는 전자 전달 파트너, 예를 들면, 페레독신 및/또는 NADH/NADPH와 함께 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 부티르산의 부티릴-CoA로의 전환을 포함하는, 예비-농축 단계를 포함한다. 많은 적합한 공급 원료에는 부티르산이 높으므로, 이는 당해 효소 경로의 전체적인 생산량을 증가시킨다. 부티르산의 부티릴-CoA로의 촉매적 전환은 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 사용하여 수행할 수 있다. 이후에, 알데하이드 데하이드로게나제를 사용한 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환은 앞서와 같이 진행한다. 예시적인 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제는 서열 번호: 22에 의해 제공된 것, 또는 이의 변이체, 단편 또는 동족체를 포함한다.
방법은 다수의 단계를 필요로 하므로, 다수의 효소를 제공하는 조성물이 바람직할 수 있음은 인식할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 알데하이드 데하이드로게나제, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제 및 (임의로) 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 알데하이드 데하이드로게나제 및 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산이 본원에 제공된다. 이러한 2개의 암호화된 효소는 단일 발현 카세트로서, 예를 들면, 프로모터의 통합된 제어 하에 포함될 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 발현된 효소당 1개 이상의 프로모터, 예를 들면, 1개 이하의 프로모터를 함유함으로써 '카세트'가 다수의 효소 및 효소와 동일한 수 이하의 프로모터를 함유할 수 있도록 할 수 있다. 핵산은 동일한 발현 카세트 속에 또한 존재할 수 있는, 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 임의로 추가로 포함할 수 있다.
또한, 알데하이드 데하이드로게나제, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제 및 (임의로) 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 암호화하는 다수의 핵산의 본원에 제공된다. 복수내 개개의 핵산은 효소를 포함하지 않거나, 1개, 2개, 또는 모든 3개의 효소를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 효소는 세포, 예를 들면, 세균 세포내에 제공된다. 예를 들면, 이종 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포가 제공될 수 있다. 세포는 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산 및/또는 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 또한 다수의 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 조성물은 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 세포, 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제를 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 세포, 및 임의로 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 세포를 포함한다. 적어도 하나의 세포는 2개 또는 3개의 효소를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소를 암호화하는 핵산은 별도의 세포 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 글루코즈의 프로판으로의 전환을 포함한다. 이러한 반응을 위한 공지된 경로는 부티르산 및 부티르알데하이드를 통해 부티릴-CoA로부터 프로판으로 진행된다(도 8). 그러나, 이러한 반응 경로는 낮은 수율을 갖는다. 또한, 부탄올은 CAR/SFP의 작용에 의해 생성된 부티르알데하이드의 농축된 농도에서 작용하는 다른, 천연 효소에 의해 부산물로서 생산된다. 본원에 제공된 방법은 보다 낮은, 무시할만한, 부탄올 생산과 함께 보다 높은 수율의 프로판을 제공한다.
하나의 이러한 방법은 부티르산/지방산 데카복실라제 경로를 통해 진행한다. 반응식은 도 9에서 알 수 있다. 글루코즈는 당분해에 의해 아세틸 CoA 및/또는 말로닐-CoA로 전환될 수 있다. 이후에 방법은 순서대로 수행된 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(예컨대, 서열 번호: 28, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 아세틸 CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용시키고/시키거나 아세토아세틸 CoA 신타제(예컨대, 서열 번호: 24, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 말로닐-CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(b) 클로스트리디알 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(예컨대, 서열 번호: 29, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 아세틸아세틸-CoA의 3-하이드록시부트리릴-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(c) 3-하이드록시 부티릴-CoA 데하이드라타제(예컨대, 서열 번호: 30, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 3-하이드록시 부트리릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(d) 트랜스-에노일-CoA 리덕타제(예컨대, 서열 번호: 31, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(e) 아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제(예컨대, 서열 번호: 23, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 부티릴-조효소 A(아실-CoA)의 부티르산으로의 전환을 촉매작용시키는 단계, 및
(f) 상술한 바와 같은 지방산 카복실라제를 사용한 부티르산의 프로판으로의 전환을 촉매작용시켜 프로판을 생산하는 단계.
일부 구현예에서, 글루코즈를 프로판으로 전환시키는 방법은 부티르알데하이드 및 알데하이드 데하이드로게나제/알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제의 작용을 통해 진행한다. 글루코즈는 당분해에 의해 아세틸 CoA 및/또는 말로닐-CoA로 전환될 수 있다. 이러한 반응식은 도 10에서 알 수 있다.
방법은 이후에 순서대로 수행된 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제(예컨대, 서열 번호: 28, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 아세틸 CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계, 및/또는 아세토아세틸 CoA 신타제(예컨대, 서열 번호: 24, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 말로닐-CoA의 아세틸아세틸-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(b) 클로스트리디알 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(예컨대, 서열 번호: 29, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 아세틸아세틸-CoA의 3-하이드록시 부트리릴-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(c) 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(예컨대, 서열 번호: 30, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 3-하이드록시 부트리릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(d) 트랜스-에노일-CoA 리덕타제(예컨대, 서열 번호: 31, 또는 이의 변이체의 단편, 동족체)를 사용한 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 전환을 촉매작용시키는 단계,
(e) 상술한 바와 같은 알데하이드 데하이드로게나제를 사용한 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용시키는 단계, 및
(f) 상술한 바와 같은, 알데하이드 탈포르밀화옥시게나제를 사용한 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매작용시키는 단계.
효소가 대사 경로에서 순차적으로 작용하는 경우, 방법은 제1 단계를 위한 기질 및 후속적인 전환을 촉매하기 위한 효소를 제공하는 단계를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 방법은 순서대로 나머지 단계를 진행하기 전에 정확한 기질 및 효소와 함께 제공된, 임의의 단계 (a) 내지 (f)로부터 시행될 수 있다. 단계는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 상기 반응식에 필요한 효소는 예를 들면, 임의의 주어진 단계로부터 시작하는 방법에 의해 명시된 모든 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 단일 세포내에서, 또는 각각의 핵산이 임의의 주어진 단계로부터 시작하는 방법에 의해 명시된 하나 이상의 효소를 암호화하는 다수의 핵산을 포함하는 다수의 세포 내에서 단일 조성물 또는 다수의 조성물로 제공될 수 있다.
이의 구체적인 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단 또는 적절하게는 개시된 결과를 수득하기 위한 방법 또는 공정의 측면에서 나타낸, 앞서의 설명에, 또는 다음의 청구범위에, 또는 첨부된 도면에 개시된 특징은 별도로, 또는 이러한 특징의 임의의 조합으로, 이의 다양한 형태에서 본 발명을 실현시키기 위해 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 예시적인 구현예와 함께 기술되었지만, 본 개시내용을 고려할 때 많은 등가의 변형 및 변화가 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 예시적인 구현예는 나타내기 위해 고려되며 제한되지 않는다. 기술된 구현예에 대한 다양한 변화는 본 발명의 취지 및 영역으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
어떠한 의심도 피하기 위해, 본원에 제공된 임의의 이론적인 설명이 판독자의 이해를 증진시키기 위한 목적을 위해 제공된다. 본 발명자들은 임의의 이러한 이론적 설명에 의해 구속되는 것을 원치 않는다.
본원에 사용된 임의의 단락 제목은 단지 구조화 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
내용이 달리 요구하지 않는 한, 다음의 청구범위를 포함하는, 본 명세서 전반에 걸쳐서, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포괄하다(include)", 및 변화, 예를 들면 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", 및 "포괄하는(including)"은 기술된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 내포하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수형("a", "an", 및 "the")는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 다수의 지시대상을 포함한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특수 값, 및/또는 "약" 다른 특수한 값으로 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시되는 경우, 다른 구현예는 하나의 특수한 값 및/또는 다른 특수한 값을 포함한다. 유사하게, 값이 선행사 "약"의 사용에 의해 근사치로 표현되는 경우, 특수한 값이 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치와 관련하여 용어 "약"은 선택적이며 예를 들면 +/- 10%를 의미한다.
실시예
모든 화학물질 및 용매는 시판 공급업자로부터 구입하였으며, 분석 등급이거나 이보다 우수하였다. 프로판 가스 표준(99.95%)은 Sigma Aldrich로부터 수득하였다. 배지 구성성분은 Formedium(영국 노르폴크)로부터 수득하였다. 유전자 서열분석 및 올리고뉴클레오타이드 합성 둘 다는 Eurofins MWG(독일 Ebersberg)에 의해 수행되었다. 할로모나스 균주 TD01[17] 및 TQ10과 플라스미드 p321 및 p341은 전문가 구아-쳉 첸(Guo-Qiang Chen)(중국 베이징의 칭화대학교(Tsinghua University))에 의해 친절히 공급되었다. 455 nm(1020 mW 출력) 및 470 nm(253 mW)에서의 파장을 지닌 탑재된 하이-파워 청색(Hi-Power blue) LED 및 LED 드라이버는 Thorlabs(미국 뉴저지주 소재)로부터 구입하였다. 사용된 백색 광 LED(Integral)는 25W 전력(2060 루멘(lumens))을 가졌다.
실시예 1: 초기 특성화 및 돌연변이유발
클로렐라 바리아빌리스 NC64A로부터의 성숙한(nature) CvPAS 서열을 암호화하는 유전자(진뱅크 확인번호: A0A248QE08; 트렁케이트된(truncated) N-말단 61개 아미노산)[13]는 이. 콜라이내에서 최적 발현을 위해 드믄 코돈 제거의 코돈 최적화 기술을 혼입시킨, GeneArt(독일)에 의해 설계되고 합성되었다. 유전자를 pETM11 내로 서브 클로닝(Ncol-Xhol)시켜, 신속한 단백질 정제를 위해 헥사히스티딘 서열을 함유하는 78 bp N-말단 태그(tag)를 혼입시켰다. 작제물(CvPASWT)을 제조업자의 프로토콜에 따라 이. 콜라이 BL21(DE3)(Merck) 내로 형질전환시켰다.
CvPAS의 N-말단 트렁케이트된(성숙한) 및 His6-태그된 버젼은 이. 콜라이 내에서 가용성 형태로 고도로 발현되었다(도 5). 그러나 정제 시도는 낮은 정도의 플라빈화를 지닌 단백질을 생성하였으므로, 초기 특성화 연구는 세포-유리된 분해물을 사용하여 수행하였다.
변이체 CvPASG462V는 Stratagene QuickChange 전체 플라스미드 합성 프로토콜을 사용하여 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. PCR 반응은 CloneAmp HiFi PCR 예비혼합물(Clontech) 및 올리고뉴클레오타이드 5'- GCACTGGATCCGGATGTTGTTAGCACCTATG TG-3' 및 5'-CACATAGGTGCTAACAACATCCGGATCCAGTGC-3'를 사용하여 수행하였다. 주형 제거(template removal)는 선택적인 제한 분해(Dpnl)를 사용하여 수행하고, PCR 생성물은 플라스미드 재환화(recirculation) 및 회수를 위해 이. 콜라이 균주 NEB5α(New England Biolabs) 내로 형질전환시켰다. 콜로니를 가나마이신(15 μg/mL)을 함유하는 루리아 브로쓰(Luria broth)(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물 및 10 g/L NaCl) 속에서 밤새 37℃에서 성장시킨 다음, 플라스미드를 추출하고 NucleoSpin® 플라스미드 키트(Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하였다. 돌연변이의 존재는 유전자 서열분석에 이은, 단백질 발현을 위해 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 확인하였다.
실시예 2: 단백질 발현 및 분해물 생성
이. 콜라이 균주 BL21(DE3) 내에서 야생형 및 변이체 CvPAS의 배양물을 가나마이신(30 μg/mL)을 함유하는 LB 배지 및 밤새 스타터 배양물(starter culture)(1 용적%)을 사용하여 37℃ 및 200 rpm에서 OD600 nm = 0.2가 될 때까지 성장시켰다. OD600 nm = 0.6이 될 때까지 온도를 25℃로 강하시킨 후, IPTG(0.5 mM)로 재조합 단백질 발현 유도를 수행하였다. 배양물을 17℃에서 추가로 17시간 항온처리한 다음 26600 xg에서 원심분리함으로써 수거(harvesting)하였다.
세포 펠렛(cell pellet)을 분해 완충액(25 mL; 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.25 mg/mL 라이소자임, 10 μg/mL DNase I 및 1 x 프로테아제 억제제를 함유하는 50 mM 트리스 pH8) 속에 재현탁시키고 20분 동안 초음파처리하였다(20초 켜고, 60초 끔; 30% 진폭). 세포 유리된 분해물은 26600 xg에서 30분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 제조하였다. 분해물 샘플을 SDS PAGE(12% Mini-PROTEAN-TGX 염색-유리된 겔; Bio-Rad)에 의해, 정밀 플러스 염색되지 않은 단백질 래더(Precision Plus unstained protein ladder)(Bio-Rad)를 사용하여 300 V에서 20분 동안 재조합 단백질 발현에 대해 분석하였다. 단백질 함량을 Gel Doc EZ 영상기(Bio-Rad)를 사용하여 가시화하였다.
실시예 3: 세포-유리된 분해물 속에서 프로판 생산
프로판 생산을 위한 시험관내 반응(200 μL)은 밀봉된 유리 GC 바이알 속에서 세포 유리된 분해물(180 μL) 및 부티르산(0.36 내지 4.5 mM)으로 구성되었다. 반응물을 30℃에서 24시간 동안 180 rpm에서 청색 LED(455 nm)의 존재 또는 부재하에서 항온처리하였다. 상부빈공간 가스를 Al2O3/KCl 컬럼이 장착된 Micro GC(100 ms 주입)를 사용하여 프로판 함량에 대해 분석하였다.
프로판 수준은 Al2O3/KCl 컬럼 및 열 전도도 검출기(thermal conductivity detector: TCD)를 함유하는 Agilent 490 Micro GC를 사용하여 수동 상부 빈공간 주입으로 측정하였다. 상부 빈공간 샘플은 가열된 주입기(110℃) 속으로 100 ms의 주입 시간을 사용하여 캐리어 가스(carrier gas)로서 헬륨(10.2 psi)과 함께 수동으로 주입하였다. 화합물을 등온적(100℃)으로 120초에 걸쳐 정적 압력 조건(static pressure condition)에서 100 Hz의 샘플링 주파수(sampling frequency)를 사용하여 분리하였다. 프로판 농도는 동일한 조건 하에서 생성된 표준 곡선에 대해 피크 면적(peak area)을 비교함으로써 계산하였다.
야생형 CvPAS에 대한 프로판 수율은 중간(1.65 + 0.61 mg/L의 분해물)이었지만, 대안의 ADO 데카보닐화 효소(0.4 내지 3.4 mg/L)를 사용한 생체내 생산 수준과 비교가능하였다. 변이체 CvPAS.G462V를 사용한 세포-유리된 분해물의 생물형질전환은 프로판 수율에 있어 명백하게 4배 증가를 나타내었다(6.45 ± 1.4 mg/L의 분해물).
흥미롭게도, 예비 농도 의존성 연구는 야생형 효소와 비교하여 4.5 mM에서 포화의 결여에 의해 관찰되는 바와 같이, 돌연변이가 부티르산 결합에 대하여 영향을 미쳤음을 시사하였다(도 6). 또한 비교 동역학 연구는 정제된 효소를 사용하여 활성에 대한 G462V 돌연변이의 효과를 보다 충분히 시험하는 것을 필요로한다.
실시예 4: 이. 콜라이에서의 프로판 생산
이. 콜라이에서의 CvPASWT 및 변이체 G462V의 비교되는 생물촉매 생체내 프로판 생산을 다음의 프로토콜로 수행하였다: 스타터 배양물(5 mL)을 37℃에서 가나마이신(50 μg/mL)을 함유하는 LB 속에서 200 rpm에서 밤새 성장시켰다. 배양물(20 mL)을 가나마이신(50 μg/mL) 및 스타터 배양물(1%)을 함유하는 LB 속에서 37℃ 및 180 rpm에서 6시간 동안 성장시켰다. IPTG(0.1 mM), 부티르산(1 mM) 및 ± 트리톤 X-100(2%)을 가하고 5 mL의 배양물 분취량(aliquot)을 20 mL 튜브 속에 밀봉하고 30℃에서 추가로 1.5 또는 18시간 동안 청색 LED(455 nm)의 존재하에서 항온처리하였다. 상부 빈공간 가스를 Micro GC(100 ms 주입)에 의해 Al2O3/KCl 컬럼을 사용하여 프로판에 대해 분석하였다.
본 실험의 결과는 표 1에서 알 수 있다. 2개의 데이타 세트 사이의 불일치는 상이한 유도 후 시간 및 광원으로부터의 거리에 기인하였지만, 변이체가 야생형보다 상부 빈공간 내에서 프로판을 현저하게 더 생산함은 명백하다. 보다 높은 농도의 부티르산(10 mM)은 프로판 생산에 있어서의 증가를 나타내었지만, 100 mM 농도는 세포를 분해하였다.
[표 1]
Figure pct00024
다음에, 프로판 생산에 대한 다양한 첨가제의 효과를 시험하였다.
배양물(20 내지 100 mL)을 가나마이신(50 μg/mL) 및 밤샘 스타터 배양물(1 용적% ; 동일한 배지)을 함유하는 LB 배지 속에서 6시간 동안 37℃ 및 180 rpm에서 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)로 유도하고 배양물을 부티르산(1 내지 25 mM) ± 트리톤 X-100(1 %), 슈크로즈(1%) 및/또는 에틸 아세토아세테이트(0 내지 30 mM)로 보충하였다. 3개의 배양물 분취량(5 mL)을 20 mL의 유리 바이알 내로 밀봉하고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm에서 항온처리하고, LED(백색 또는 청색(455 nm 또는 470 nm))로 연속적으로 조명하였다. 상부 빈공간 가스를 Al2O3/KCl 컬럼이 장착된 Micro GC(100 ms 주입)을 사용하여 프로판 함량에 대해 분석하였다.
이러한 실험의 결과는 표 1 및 표 2에 나타낸다. 세균 배양물에 대한 트리톤 X-100 및 슈크로즈 첨가는 세포를 투과하는 것으로 알려져 있으며, 이는 효과적으로 이를 보다 '누수되도록(leaky)' 만든다[20]. 이는 배양물 상층액 내로 세포의 증가된 CvPAS 유출 경향성을 허용함으로써, 광에 대한 이의 노출을 증가시키고 보다 높은 프로판 수율을 생성한다. 이러한 결과는 CvPAS 변이체 G462V의 경우, 트리톤 X-100 및 슈크로즈(이. 콜라이에 의해 대사되지 않음)의 첨가가 프로판 생산에 있어서의 현저한 증가를 초래함을 나타낸다. 그러나, 이러한 효과는 야생형 효소를 사용하여서는 관찰되지 않았다.
[표 2]
Figure pct00025
추가의 실험을 이. 콜라이내에서 부티레이트 수송인자의 자극인자로 제시된, 추가의 에틸 아세토아세테이트를 사용하여 수행하였다[21]. 이 경우에, 10 mM 에틸 아세토아세테이트의 존재는 CvPAS의 G462V 변이체로 32.0 ± 3.2 mg/L 프로판을 생성하였다.
실시예 5: 할로모나스 벡터 작제물 및 접합
공정의 상업적 적용은 흔히 생산 수율의 최대화와 비용의 최소화 사이의 균형이다. CvPAS-매개된 프로판 생산의 경우, 이는 정제된 효소보다는 생체내 생물인자의 사용을 필요로 한다. 이는 광 접근이 생체내에서 상충될 것이고 고 농도의 부티르산의 존재가 배양물에서 pH 및 세포 생존능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 프로판 생산 속도에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 견고한 호염성 세균 할로모나스를 생물공장 숙주(biofactory host)로서 선택하였다.
CvPASWT 및 변이체 CvPASG462V를 암호화하는 유전자를 인-퓨전 클로닝(In-Fusion cloning)(Clontech)을 사용하여 할로모나스 접합을 위해 벡터 p321[18] 내로 클로닝하였다. 벡터 및 유전자 둘 다는 후발 벡터(later vector):유전자 어닐링(올리고뉴클레오타이드: p321 - 5'-TGCCACCGCTGAGCAATAAAA-3' 및 5'-CATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTA-3'; CvPAS - 5'-GAGAAATACTAGATGGGGAGGGGAGTT GAAGATATT -3' 및 5'- TGCTCAGCGGTGGCATTATGCTGCAACGGTTGCCG-3')에 대해 각각의 말단에서 오버행 염기(overhanging base)를 혼입함으로써, PCR 증폭에 의해 어닐링하였다. 유전자를 pETM11 - 유래된 78 bp N-말단 태그 서열의 부재하에서 증폭시켰다. 각각의 PCR 생성물을 DpnI 분해하고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하며 정확한 크기의 밴드를 추출하고 단리체 II 플라스미드 키트(Isolate II plasmid kit)(Bioline)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 정제하였다. 인-퓨전 클로닝(In-Fusion cloning)을 선형화된 p321과 CvPAS 변이체 사이에서 수행한 후, 이. 콜라이 균주 스텔라(Stellar)(Clontech)내로 플라스미드 재환화 및 회수를 위해 형질전환에 의해 수행하였다. 플라스미드 생산, 정제 및 서열분석을 상기와 같이 수행하여 유전자 삽입을 확인하였다.
작제물 pHPASWT 및 pHPASG462V을 CvPAS 플라스미드 및 T7-유사 프로모터[23]와 스펙티노마이신 내성에 대한 클로람페니콜 내성 카세트의 치환을 함유하는 pSEVA431의 변이체 형태[22]의 제한된 NcoI/XhoI 이중 분해에 의해 생성시켰다. 유전자 및 벡터를 퀵 연결 키트(Quick Ligation kit)(NEB)를 사용하여 함께 연결시키고, 완전한 작제물을 적격(competent) 이. 콜라이 균주 S17-1(λpir; [24])내로 가나마이신-선택적인 아가(agar) 플레이트를 사용하여 형질전환시켰다. 플라스미드 생산, 정제 및 서열분석을 상기와 같이 수행하여 유전자 삽입을 확인하였다.
이. 콜라이 균주 S17-1내 pHPASWT 및 pHPASG462V 작제물을 변형된 접합 프로토콜에 의해 할로모나스 균주 TQ10 내로 형질전환시켰다. 이. 콜라이 공여체 균주 및 할로모나스 균주 TQ10 수용체를 가나마이신-선택적인 LB 아가 및 YTN6 아가 각각에서 예비-성장시켰다. 공여체 각각의 콜로니 및 수용체 균주를 YTN2 아가(pH 조절하지 않은 0.5% 효모 추출물, 1% 트립톤, 2% NaCl 및 1.5% 아가)에서 함께 혼합하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 혼합된 배양물을 pHPASWT 또는 pHPASG462V 작제물 만을 함유하는 할로모나스의 성장에 대해 선택적인, 10 μg/mL의 스펙티노마이신을 함유하는 YTN6 아가 플레이트(pH 9.0) 위에 스트리킹(streaking)하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 할로모나스 내에서 플라스미드의 흡수를 플라스미드 제조 및 서열분석에 의해 확인하였다.
실시예 6: 할로모나스 내에서의 CVPAS G462V 에 의한 프로판 생산
할로모나스 균주내에서의 프로판 생산을 다음과 같이 이. 콜라이 일반 프로토콜의 변형으로 수행하였다: 배양물을 스펙티노마이신(50 μg/mL)과 보다 많은 접종물(5%; OD600 = 0.1 내지 0.3)을 함유하는 YTN6 배지 속에서 5시간 동안 37℃ 및 180 rpm에서 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 이. 콜라이 배양물보다 더 높은 세포 밀도(OD ~ 1.6)에서 IPTG(0.1 mM)를 사용하여 유도하였다. 나머지 생체내 프로판 생산 공정은 상기와 같이 수행하였다.
본 실험의 결과는 표 3에 제공한다.
[표 3]
Figure pct00026
생산된 프로판의 수준이 초기에 이. 콜라이의 수율보다 더 낮지만, 수율은 여전히 G462V 변이체의 경우보다 더 높았다.
실시예 7: 다양한 광 강도를 사용한 할로모나스 내에서 CvPAS-G462V에 의한 프로판 생산
변이체 효소로부터 프로판 생산에 대한 다양한 광 강도의 효과를 시험하였다.
스타터 배양물(5 mL)을 37℃에서 스펙티노마이신(50 μg/mL)을 함유하는 YTN6(0.5% 효모 추출물 + 1% 트립톤 + 6% NaCl pH 9.0) 속에서 200 rpm에서 밤새 성장시켰다. 배양물(20 mL)을 동일한 항생제 및 스타터 배양물 (5%; OD600 = 0.1 내지 0.3)을 함유하는 YTN6 속에서 30℃ 및 200 rpm에서 5시간(OD ~ 1.6) 동안 성장시켰다. IPTG(0.1 mM) 및 부티르산(1 mM)을 가하고 분취량(5 mL)을 20 mL의 반응 바이알(vial) 속에 밀봉시키고 30℃에서 18시간 동안 200 rpm에서 상이한 정도로 차폐된 담백색 광(진탕기 상에 편평하게 놓임)의 존재하에서 항온처리하였다. 상부 빈공간 가스를 Micro GC(100 ms 주입)에 의해 Al2O3/KCl 컬럼을 사용하여 프로판에 대해 분석하였다.
본 실험의 결과는 표 4에 제공한다. 프로판 생산은 광 강도에 강력하게 의존하는 것으로 여겨지지만, 사용된 광의 수준은 효소의 발현 수준에 대해 포화되는 것으로 여겨지지 않는다. 보다 높은 수주의 광이 심지어 더 높은 수율을 야기할 수 있는 것으로 예측된다.
[표 4]
Figure pct00027
실시예 8: 다양한 부티레이트 수준을 사용한 할로모나스 내에서 CvPAS-G462V에 의한 프로판 생산
변이체 효소로부터 프로판 수율에 대한 다양한 부티레이트 이용가능성의 효과를 시험하였다.
스타터 배양물(5 mL)을 37℃에서 스펙트로마이신(50 μg/mL)을 함유하는 YTN6(0.5% 효모 추출물 + 1% 트립톤 + 6% NaCl pH 9.0) 속에서 200 rpm에서 밤새 성장시켰다. 배양물(20 mL)을 동일한 항생제 및 스타터 배양물(5%; OD600 = 0.1 내지 0.3)을 함유하는 YTN6 속에서 30℃ 및 200 rpm에서 5시간(OD ~ 1.6) 동안 성장시켰다. IPTG(0.1 mM) 및 부티르산(1 mM)을 가하고 분취량(5 mL)을 20 mL 반응 용기 속에 밀봉하고 30℃에서 18시간 동안 200 rpm에서 담백색 광(진탕기 상의 편평하게 놓음)의 존재하에서 항온처리하였다. 상부 빈공간 가스를 Micro GC(100 ms 주입)에 의해 Al2O3/KCl 컬럼을 사용하여 프로판에 대해 분석하였다.
결과는 표 5에서 알 수 있다. 프로판 생산은 부티레이트 농도에 강력하게 의존하는 것으로 여겨지며, 최대 대략 20 mM이다. 1 M 부티르산의 존재하에서 성장한 배양물은 세포 분해를 겪었다.
[표 5]
Figure pct00028
실시예 9: 광, 해수 및 폐 공급원료를 활용한 드롭-인(drop-in) 바이오-LPG 기술
경제적으로 가치있는 미생물 바이오연료1를 개발하기 위한 탄소 방출을 감소시키고, 공기 질을 개선시키며 재생가능하고 지속가능한 연료 전략을 시행하기 위한 압축 필요성의 결과이다.2,3 화석 연료에 대한 현재의 과도한 의존은 에너지 안보 및 기후 변화에 대한 관심을 이끌었다. 결국 이는 온실 가스 방출을 제한하는 새로운 정책을 가동시켜, 폐 생체물질(biomaterial)의 재순환을 증가시키고 바이오경제의 전달을 가속화하였다.4,5 효과적인 바이오연료 전략은 수송가능하고 미생물 체(microbial chassis)로부터 기원하고 기존의 재생가능한 폐 생체물질로부터 기원한 청정 연소 연료의 조절가능한 생산을 포함할 수 있다. 이는 최소의 하부 공정 및 신선한 물 사용의 회피를 필요로 할 수 있다. 지역화된 폐 가공 및 연료 분산을 위한 기존의 사회기반시설내에 이러한 기술을 도입하는 것은 자본 지출을 최소화하고 폐 생물량의 정정 연소 연료의 전환을 촉진한다. 이러한 '드롭-인' 기술은 수반되는 사회적, 환경적 및 경제적 이익과 함께 선택된 위치에서 구체적인 폐 스트림으로 조율할 수 있다. 분산된 생산은 지역 경제를 뒷받침하고 낮은/중간 기술의 일을 창조하며, 보다 효과적인 폐기물 관리를 가능하게 하고 세계의 선진국 및 개발도상국 둘 다에서 지방 공공체내 에너지 자급자족을 제공할 수 있다.
프로판은 이상적인 바이오연료이다. 이러한 탄화수소 가스는 저 탄소 풋프린트(footprint)를 지닌 매우 효율적이고 깨끗한 연소 연료이다. 이는 천연 가스 및 석유 정제로부터 현재 공급된다.6 프로판은 제3의 가장 광범위하게 사용된 수송 연료이다(매년 세계적으로 2천만 톤). 이는 또한 가정 난방 및 요리, 비-온실 가스 냉매제 및 에어로졸 추진제로 사용된다.6,7 이의 '드롭-인' 특성은 액화 및 저장을 위한 보다 낮은 에너지 요구와 함께 현재의 메탄/바이오가스 공급의 발열량 값(calorific value)을 증강시킨다.7 현재, 이의 생산에 대해 유일하게 존재하는 시판 바이오-유래된 경로는 바이오디젤 폐기물(글리세롤)의 에너지 집약적이고, 촉매 화학적 전환인, 네스트 공정(Neste process)이다.8 프로판으로의 천연 생합성 경로는 알려져 있지 않지만, 가공된 생물학적 경로가 NAD(P)H- 및 페레독신-의존성 알데하이드 탈포르밀화 옥시게나제(ADO)9의 천연 및 가공된 변이체를 혼입하는 부티르알데하이드의 탈카보닐화를 기반으로 개발되었다. 이러한 대사 경로는 9개의 유전자를 이용하는 이. 콜라이내에서 지방산 생합성10, 역 β-산화11, 발린 생합성6 및 가공된 드 노보(de novo) 경로를 기반으로 하며 발효 클로스트리디알 부탄올 경로를 기반으로 한다.7 그러나, ADO(~ 3-5 h-1)의 극도로 낮은 턴오버 수(turnover number)는 규모화된 바이오-프로판 생산(바이오-프로판은 전형적으로 약 30 내지 50 mg/L로 생산된다)시 이러한 경로의 시행을 제한한다.7,10,11
ADO의 불량한 촉매 특성은 대안의 생물촉매에 대한 연구를 자극시켰다. 지방산의 n-알칸 또는 n-알켄으로의 청색 광-의존성 탈카복실화를 촉매하는 광효소의 신규한 지방산 광데카복실라제(FAP) 부류가 최근에 기술되었다.12,13 이는 > 80%(0.86 ± 0.13 s-1)의 반응 양자 수율을 지닌 비-공유결합으로 결합된 광-여기성 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD) 보조인자 및 장쇄 지방산(C14-C18)에 대해 보고된 특이성을 함유한다.12-14 장쇄 특이적인 ADO가 부티르알데하이드(C4)의 탈카보닐화를 촉매하고 이것이 효소 가공에 의해 개선될 수 있음을 고려할 때,10 본 발명자들은 FAP가 또한 C4 기질 부티르산을 탈카복실화하여 규모로 프로판(및 다른 탄화수소 가스)를 형성할 수 있도록 가공될 수 있었다고 추정하였다.
광활성 FAP의 가공된 변이체를 활용하는 '현장에서의(in-the-field)' 바이오-프로판 생산 기술의 증명의 설계 및 시행이 기술되어 있다. 이러한 기술은 바이오물질 폐 공급 원료 및 해수 속에서 비-멸균 조건 하에 증식될 수 있는 미생물 가스-생산 체를 사용한다. 이러한 특징은 '현장에서' 지역화된, 저 비용 생산에 바람직하다. 본 발명자들은 효소 설계, 체 선택, 및 공정 개발 및 최적화를 다루어 생산성을 증가시키고, 작동을 위한 자본 및 작동 비용을 감소시켰다. 본 발명자들의 접근법은 바이오부탄 및 다른 가스성 탄화수소를 생산하기 위해 확장시켜 완전한 생물학적 경로를 바이오-프로판 및 조율가능한 연료 배합물(바이오-LPG)로 가공될 수 있는 방법을 입증하였다. 바이오-기반 연료는 궁극적으로 석유화학-기원한 프로판, 부탄 및 액화 석유 가스(LPG) 혼합물을 교체시킬 수 있었다. 이는 특히 지방 및/또는 건조한 지역에서 매력적일 수 있으며, 여기서 지역 연료 생성은 석유화학적 및 정제공장-공급된 LPG 공급을 대체할 수 있었다.
바이오-LPG 생산을 위한 광-활성화된 바이오촉매
클로렐라 바리아빌리스 NC64A(CvFAP) 및 7개의 다른 시아노박테리아 동족체로부터 유도성의, 성숙한 N-말단 His6-태그된 FAP 효소를 발현하는 재조합 이. 콜라이 균주(표 S1)를 생성하였다.12 세포-유리된 추출물 바이오형질전환은 가장 높은 수준의 프로판이 CvFAPWT(1.65 ± 0.61 mg/L 분해물; 455 nm 광)를 사용하여 검출되었음을 나타내었다. 바이오-LPG 생산을 위한 CvFAPWT의 적합성은 또한 발레르산 및 이소발레르산을 사용한 활성에 대해 분해물을 시험함으로써 탐구하였다. 이러한 시험은 앞서 검출한 바와 같이, 부탄(1.31 mg/L) 및 이소부탄(0.07 mg/L)을 각각 생성하였다.13 프로판 또한 이러한 시험에서 검출되었으며(각각 0.014 및 0.022 mg/L), 세포-유리된 추출물 속의 부티르산의 존재에 기여하였다. 원칙적으로, 이러한 초기의 활성은 바이오-LPG 배합물(blend)의 생산이 이러한 효소를 사용하여 실현가능함을 나타낸다. 조율가능한 프로판/부탄 비는 상대적인 부티르산/발레르산 수준을 조절함으로써 달성할 수 있었다. 그러나, 잠재적인 제한은 이러한 휘발성의 단쇄 카복실산 기질을 사용한 CvFAPWT의 낮은 가스 생산 수준이다.
CvFAP15 및 ADO15에서 기질 결합 채널은 협소하고 굽혀진 구조물(curved architecture)을 채택한다. 이러한 협소한 채널은 C16/C18 지방산(CvFAP) 및 C16/C18 알데하이드(ADO)의 긴 지방족 쇄를 수용하기 위해 이상적으로 형성된다. 모든 다른 측면에서, 2개의 효소는 구조적으로 관련되어 있지 않다. 특히 CvFAPWT에서 주목하는 것은 이러한 접근 채널의 부분을 형성하는 잔기 G462-Y484이다(도 12 삽화). 부티레이트의 결합을 증가시키는 한가지 전략은 C4보다 더 큰 쇄 길이의 지방산의 결합을 손상시키기 위한 입체 블록을 도입함으로써 활성 부위에 대한 경쟁을 감소시키는 것이다. 이러한 전략은 ADO를 사용하는 것과 유사하며, 이는 보다 짧은 쇄 알데하이드를 사용한 향상된 ADO 촉매를 야기하였다.15 본 발명자들은 치환을 위해 잔기 G462, G455, Y466, V453, T484 및 A457을 표적화하는, 28개의 CvFAP 변이체의 카탈로그를 제작하였다. 각각의 선택된 잔기의 측쇄는 CvPASWT의 결정 구조내 결합된 팔미테이트와 매우 근접하다(도 12 삽화).12
초기 표적은 잔기 G462이며, 이는 10개의 다른 아미노산(V, N, W, L, C, I, F, A, H 및 Y)으로 돌연변이되었다. 프로판 생산 연구는 상이한 변이체를 발현하는 성장하는 세포를 사용하여 수행하였다.
이는 동일한 조건 하에서 야생형과 비교하여, CvFAPG462V(5.07 ± 1.12 mg/L의 배양물; 도 12)를 사용한 프로판 수율에 있어서의 7배 증가를 나타내었다. 표준화된 데이타는 추출물 속의 각각의 변이체의 발현 수준에 있어서의 차이에 대해 교정하였다(도 18). (이소)발레르산(C5)을 사용하여, CvFAPG462V (이소)부탄 생산은 CvFAPWT의 경우보다 2배 더 높았다(각각 2.52 및 1.31 mg/L의 배양물). 프로판 생산에 있어서 추가의 증가는 변이체 G462I, G462F 및 G462A(G462V보다 1.9 내지 3.5배 더 높음)를 사용하여 달성되었다. 전체적으로, 사용된 가스 생산 조건 하에서, 잔기 G462의 돌연변이유발은 가스성 탄화수소 생산을 위한 범위의 바이오촉매를 제공하는 부티르산으로부터 프로판 생산에 있어서 25배까지의 증가를 이끌 수 있다. 흥미롭게도, G455I를 제외한, 아미노산 G455, Y466, V453, T484, G455 또는 A457의 모든 변이체는 CvFAPWT보다 프로판을 덜 생산하였다(도 12). 이는 이러한 잔기가 활성 부위 터널로의 부티레이트 접근을 매개하는데 있어서 역할을 함을 시사한다.
CvPASWT 및 변이체(G462V/I/L, V453I, G455I, Y466W, T484I 및 A457V)를 Autodock Vina16 분자 도킹 시뮬레이션(molecular docking simulation)을 사용하여 장쇄(팔미테이트) 및 단쇄(부티레이트) 리간드를 사용하여 도킹함으로써 각각의 결합 유리 에너지(-△G; kcal/mol) 및 결합 상수(Kb)를 평가하였다. 이러한 잔기의 측쇄 크기의 증가는 기질 접근 터널의 용적 및 팔미테이트의 결합을 위한 효과적인 유리성(favourability) 둘 다를 감소시켜야 하므로, 이러한 돌연변이가 부티레이트의 상대적 결합 강도에 유리하게 영향을 미치는지를 알기 위해 수행되었다(도 13; 표 S3 (도 24)). 예측된 팔미테이트 결합 상수에 있어서의 가장 놀라운 차이는 변이체 G462I 및 G462V를 사용하는 것이었으며, 이는 야생형으로부터 30 내지 50배 감소를 나타내었다(1.4 내지 1.5배의 상대적인 -△G 변화; 표 S3). 부티레이트 결합에 있어서의 작은 전체적인 증가가 이러한 변이체에 대해 예측되었으며(~1.4배), 이는 시험관내 연구 동안 프로판 생산에 있어서의 유의적인 증가와 관련된다. 팔미테이트 및 부티레이트를 사용하여 도킹된 변이체의 모델은 수소 대신에 발린의 이소프로필 그룹의 존재로 인하여, G462V의 Ca-원자와 기질의 C4 원자 사이의 거리가 유의적으로 증가되어 있음을 나타낸다(도 13). 야생형 복합체와 관련하여 덜 양호한 배향으로의 팔미테이트의 이러한 재위치화는 변이체에 대해 예측된 K b에 있어서의 감소를 설명할 수 있다. 예외는 팔미테이트 K b에 있어서 거의 2배 증가를 나타낸 변이체 G455I이다. 이는 이러한 변형이 장쇄 지방산에 대해 CvFAP의 효소 친화성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, 잔기 G462는, 단쇄 대 장쇄 기질의 상대적인 친화도에 영향을 미치는 이의 특성과 함께, 주요 식별가능한 잔기인 것으로 여겨진다.
궁극적으로, 규모화된 생산 시설은 발효 조건 하에서 살아있는 세포의 사용을 필요로 할 것이며, 물리적 매개변수, 예를 들면, 사용된 바이오촉매에 대한 광 강도 및 파장의 검사가 중요하다. FAP는 광 활성화되므로, 효소에 노출된 광의 파장 및 정도는 가스의 생산에 영향을 미칠 것이다. 다양한 광원의 프로판 생산에 있어서의 영향은 유리 바이알 속에 또한 함유된 이. 콜라이 생 세포 내에서 시험되었다. 사용된 광원은 차가운 백색(25 W; 2060 루멘) 및 청색 LED(1020 mW에서 455 nm 또는 253 mW에서 470 nm)을 포함하였다. 이러한 생 세포 측정에서, 최고의 프로판 수준은 455 nm(0.13 ± 0.03 mg/L) 및 백색 LED(0.07 ± 0.01 mg/L)와 비교된 이의 보다 낮은 광 강도에도 불구하고, 470 nm(0.32 ± 0.10 mg/L의 배양물)에서 검출되었다. 이는 CvFAPWT(467 nm에서 청색 피크 흡수)의 공지된 플라빈 최대 흡광도와 일치한다.12 480개의 개개 청색 LED로 구성된 LED 배열을 통상적으로 설치하여 광 노출의 일관성을 증가시켰다. 이는 G462V 변이체 CvFAP를 지닌 실험실 시험체로서 이. 콜라이를 사용하는 상이한 배양 조건 하에서 증가된 재생산능으로 비교 연구를 허용하였다.
생 세포 배양 가스 생산에서 잠재적인 제한은 외부 공급된 부티르산에 대한 세포내 CvFAPG462V의 접근이다. 최대의 프로판 수준은 10 mM 부티르산(7.53 ± 0.29 mg/L의 배양물)을 함유하는 배양물 속에서 검출되었다. 10 mM 초과의 부티르산 농도에서, 배양물 pH 및 수득되는 세포독성이 관찰되었으며(25 mM 이하, 도 19), 높은 산 농도에서 완충능의 결여에 기여하였다. 트리톤 X-100 및 슈크로즈는 이. 콜라이 세포의 투과능을 증가시키고 프로판 수율에 있어서의 보통의 증가는 (1.6배; 표 S4(도 25))의 존재하에서 검출되었다.17 이. 콜라이 내에서 부티레이트 흡수는 atoE 수송인자에 의해 촉진되며, 이는 작은 쇄 지방산 이화작용 오페론 atoDAEB의 일부이다.18,19 아세토아세테이트는 atoE에 의한 단쇄 지방산 흡수를 자극하는 것으로 알려져 있다.18 10 mM 에틸- 및 메틸 아세토아세테이트가 보충된 배양물은 프로판 생산에 있어서 각각 거의 2배 및 2.8배(17.51 ± 0.98 mg/L; 표 S5(도 26)) 및 2.8배(26.91 ± 6.59 mg/L) 증가를 생산하였다. 그러나, CvFAPG462V와 재조합 atoE 수송인자의 이중 작제물을 생성함으로써 부티레이트의 세포내 농도를 증가시키려는 시도는 효과적이지 않았다(1.3배; 표 S5(도 26)).18
흥미로운 면은 플라스미드 골격의 관찰된 영향(pETM11 대 pET21b), 생체내 프로판 생산에 있어서 His6-태그의 위치화 및 크기이었다. 플라스미드 둘 다는 동일한 ColE1 복제 오리진 및 T7 lac 프로모터를 함유한다. 그러나, pETM11은 TEV 프로테아제-절단가능한 N-His6-태그를 함유한 반면, pET21b는 보다 짧은 C-말단 His 태그를 함유한다. 고무적으로, pETM11과 비교하여 플라스미드 pET21b에 함유된 경우(48.31 ± 2.66 대 7.53 ± 0.29 mg/L의 배양물), CvFAPG462V에 의한 프로판 생산에 있어서 6.4배 증가가 존재하였다. 이는 에틸 아세토아세테이트의 첨가시 추가로 증가하였다(97.1 ± 10.3 mg/L). 이는 생체내에서 최적의 바이오촉매 발현 및 활성을 측정하기 위한 다수의 플라스미드 골격 및 단백질 태그의 위치/크기의 탐험의 중요성을 강조한다. 이러한 새로운 작제물(pET21b내 CvFAPWT 및 변이체)을 사용하여 바이오-LPG를 생산하기 위한 전략의 개발을 위한 다른 휘발성 단쇄 산을 사용한 데카복실화 활성을 살폈다.
다양한 단쇄 지방산(부티르산/이소부티르산, 발레르산/2-메틸부티르산 및 이소발레르산)은 프로판, 부탄 및/또는 이소부텐 생산 각각에 대해 CvFAPWT 및 4개의 변이체(G462V/A/I/F)를 사용하여 시험하였다(도 14a). 탄화수소 수준은 특히 측쇄 기질 이소발레르산 및 2-메틸부티르산을 사용하여, G462V와 비교하여, 변이체 G462I를 사용하여 더 높았다(5 내지 8배 더 높음; 표 S6(도 27)). 비교시, 선형 기질 부티르산 및 발레르산으로부터 FAPG462I에 의한 프로판 및 부탄 생산은 CvFAPG462V보다 2배 미만으로 더 높았다. 변이체 G462V 및 G462A 둘 다는 유사한 수준의 프로판 및 부탄을 생성한 반면, 탄화수소 수율에 있어서 보다 높은 변화는 알라닌 치환된 변이체를 사용하여 관찰되었다(도 14a; 표 S6). 따라서, G462 위치는 LPG-배합물을 제조하는데 필요한 단쇄 범위의 휘발성 카복실산을 사용하여 활성을 부여하는데 있어서 중요하다. 변이체 CvFAPG462V는 CvFAPWT와 비교하여 프로판 수율의 증가된 생산을 나타내며 이는 유사한 프로판 및 부탄 수준을 갖는다. 이러한 이유로, 이는 보다 풍부한 체 내에서 바이오-LPG 생산을 위해 가장 적합한 바이오촉매로서 미래지향적이다.
바이오-LPG 전략의 개발
LPG 배합물에서 발견된 가장 일반적인 가스는 프로판 및 n-부탄이지만, 배합물은 또한 이소부탄, 에탄, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌 및 이소부틸렌을 함유할 수 있다. LPG 가스의 정확한 조성은 국가 특이적이며, 또한 계절별로 변할 수 있다.20 예를 들면, 영국에서는 LPG가 100% 프로판인 반면, 이탈리아에서는, 프로판:부탄 비가 90:10 내지 20:80으로 변한다(도 14b). CvFAPG462V가 프로판 및 부탄을 효율적으로 생성할 수 있음을 감안할 때, 본 발명자들은 외부 공급된 부티르산:발레르산의 비를 변화시킴으로써 국가-특이적인 바이오-LPG 배합물의 생체내 생산 가능성을 시험하였다. 부티르산:발레르산 공급 원료와 배양물 상부 빈공간내 각각의 프로판:부탄 농도 사이에 현저하게 밀접한 상관관계가 존재하였다(도 14b; 표 S7(도 28)).
고도로 조율가능한 바이오-LPG 배합물이 생성되는 상대적인 용이성은, 국가-특이적인 요건이 휘발성 지방산 공급 비의 단순한 조작에 의해 충족될 수 있으므로, 이러한 목적의 잠재적인 적용능을 나타낸다.
탄소 중성 광합성 바이오-프로판 생산
이상적인 에너지 전략은 지속가능한 탄소 중립 연료의 개발일 수 있으며, 이에 의해 이의 연소 배출물(CO2)은 추가의 바이오연료의 생산을 위한 탄소원으로서 재순환될 수 있다. 이는 다수의 유리한 전세계 환경 영향, 예를 들면, i) 보다 낮은 유해한 온실 가스 방출을 초래하는 화석 연료 소비의 감소; ii) 순 CO2 방출없이(주요 온실 가스) 지속가능한 연소 연료를 이용하는 능력 및 iii) 가치있는 상품의 생산에 대한 탄소 포획 기술의 결합을 가질 수 있다. 탄소 포획 및 저장(CCS)의 기존 기술이 산업, 예를 들면, 화석 연료 전기 생성 플랜트, 시멘트, 강철 및 화학 회사에서 시행되어 배출을 유의적으로 감소시켜 왔다. 국제 에너지 기구(International Energy Agency)는 CCS가 2050년까지 CO2 방출에 있어서 19% 감소에 잠재적으로 기여할 수 있다고 추정하였다.21
천연(미생물) 탄소 포획 용액은 CO2를 유기 탄소로 고정시키는 시아노박테리아의 광합성 능력의 장점을 취하기 위한 것이다.22 시나노박테리움 시네크코키스티스(cyanobacterium Synechcocystis) PCC 6803은 신속하게 성장하고, 유전적으로 추적가능하고,23,24 항생제 스트레스에 대해 내성이며,25 이의 성장 조건이 잘 최적화되어 있으므로26,27 이상적인 표적 체이다. 재조합 균주는 다양한 생성물, 예를 들면, 이소부티르알데하이드28 및 에탄올29,30을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 최근에 시네크코키스티스 PCC 6803에서 CO2의 중쇄-길이 지방산31 및 장쇄 탄화수소32로의 광생물학적 전환을 기술하였으며, 후자는 ADO- 또는 FAP-기반 효소 시스템의 혼입에 의한다. 이러한 균주는 이. 콜라이(Tes4)로부터 티오에스테라제 A를 혼입시키기 위해 가공되었으며, 이러한 효소는 지방 아실-ACP의 유리 지방산으로 직접적인 전환을 촉매한다. 또한, 천연 지방 아실 ACP 신타제 유전자(△aas)는 녹 아웃(knock out)시킴으로써 역 반응을 최소화하였다(도 15a).32 이와 함께, 변화는 탄화수소 생합성을 위한 유리 지방산 전구체의 이용가능성을 증가시켰다.32
CO2로부터의 프로판 생산 효능을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 IPTG 유도성(Ptrc) 또는 구성적(Pcoa) 제어 하에 CvFAPG462V +/- Tes4를 발현하는 시네크코키스티스의 △aas 균주를 작제하였다( 도 15b ). 프로모터 시스템 둘 다를 지닌 활성 CvFAPG462V의 존재에 대한 초기 시험을 헥사데카노산(C16:0)이 보충된 광합성 배지 속에서 성장시켜 수행하였다. CvFAPG462V 만을 함유하는 배양물 속에서 펜타데칸의 검출은 시네크코키스티스 내에서 활성 효소의 생산을 확인하였다. Tes4를 발현하는 균주는 야생형 시네크코키스티스 및 △aas 균주와 비교하여 상승된 수준의 부티레이트(농도)의 존재를 나타내었다. 프로판 생산을 위한 시험은 표준 광합성 조건 하에서 초기 성장에 이어, 밀봉된 유리 바이알 속에서 청색 광 조사(750 μmol/s/m2 또는 μE)에 의해 상부 빈공간내에 프로판이 축적하도록 하였다. 생체내에서 증가된 부티레이트 생산에도 불구하고, 프로판 생산은 보충된 부티르산의 존재하에서 유도성 Tes4-CvFAPG462V 작제물을 사용하여서만 검출되었다(48 h; 0.012 + 0.001 mg/L의 배양물; 도 15b). 이는 전구체 분자의 공급에 필요한 프로판의 생산을 나타낸 앞서의 연구와 유사하다.33 또한 구성적 Pcoa의 존재는 이의 비교적 높은 프로모터 강도로 인하여32, 배양물 성장에 부정적인 영향을 나타내었다(결과는 나타내지 않음). 추가의 연구를 자동화된 편평층(flatbed) 광바이오반응기(400 mL) 속에서 수행하여 프로판 생산이 광합성 유도된 부티르산으로부터 단독으로 수득될 수 있는지를 알고자 하였다. 초기 성장은 pH 유지, 통기(1.2 L/min의 공기) 및 중탄산염 첨가(CO2 공급)로 백색광(30 μE) 하에서 수행하였다. 세포 밀도 축적 후, 프로판 생산은 필수적인 청색 LED(460 내지 485 nm; 750 μE)를 사용하여 가속화하였다.
가스성 탄화수소로의 규모화된 광합성-생물학적 경로는 고려할만한 수준의 폐 생물량을 생성할 것이며, 이는 궁극적으로 바이오연료(에탄올) 생산을 위한 공급원료로서 사용될 수 있었다. 그러나, 현재의 추정은 시험된 에너지의 회수(energy return on energy invested: EROEI)가 양호하지 않으므로, 후자의 공정이 경제적으로 이상이 없지 않음을 시사한다.34 이는 추가의 하부 프로세싱을 사용한 이상적인 조건(태양광, 비료 및 CO2 공급원) 하에서 협기성 폐쇄된 루프 바이오반응기를 작동시키는 에너지 요건이 바이오연료 생산으로부터 획득된 에너지보다 크기 때문이다. 그러나, 고-가치 화학물질 또는 연료 생산에 대한 '조류-유사(algal-like)' 생물량 생성의 커플링은 경제적으로 가치있는 바이오공정을 향한 균형을 예상할 수 있었다.34 이를 보다 지속가능한 공정으로 만들기 위하여, 에너지 공급을 화석 연료-주입된 전기 생성 플랜트로부터 대안의 에너지원, 에를 들면, 수력, 풍력 또는 태양 에너지로 전환시킬 수 있었다. 따라서, 역가를 유의적으로 증가시키기 위한 광합성-유도된 가스성 탄화수소 생산의 추가의 최적화는 이러한 개념-증명 접근법 시도가 청정 바이오연료 생산에 대해 미래지향적이고 경제적 및 환경적으로 지속가능한 해결책을 취하기 위해 요구된다.
견고한 종속영양 체(chassis) 개발
상업적으로 이용가능한 프로판의 현재의 가격은 비교적 저렴하므로(2018년 1월 1일자에 ~$3.34/갤론(gallon) USD), 임의의 상업적인 바이오-전략의 성공은 유의적으로 증가하는 수율 및 감소하는 자본 및 작동 비용에 의존한다. 자가영양 CO2유래된 바이오-LPG에 대한 대안은 비용-효율적인 최소의 바이오공정 비용으로 폐 공급 원료의 종송영양성 성장(발효)할 수 있는 견고한 미생물 체를 이용하는 것이다. 이는 다른 전세계 환경 문제, 즉, 폐 바이오물질 축적에 초점을 맞출 수 있다. 이는 특히 개발도상국에서 우세하며, 여기서 농업 및 다른 에너지가 높은 생물학적 폐기물은 에너지 포획없이 연소에 의해 흔히 배치됨으로써, CO2 수준에서의 전세계적 증가에 기여한다. 개발도상국들은 흔히 수송, 가열 및 요리를 위해 가스성 탄화수소 연료에 의존하므로, 불리한 조건의 사회내에서 바이오-LPG 생산을 위해 단순화된 저 비용의 반응기의 개발은 에너지 공급 문제에 초점을 맞추고, 폐 바이오-물질로부터의 수입을 생성하며 심지어 지역 사회의 환경 조건(예컨대, 공기 질)을 개선시킨다.
미생물-유래된 (바이오)화학물질의 주요 비용-집약적인 요인은 자본 비용(예컨대, 복잡한 모니터링 시스템이 장착된 강철-기반 바이오반응기), 미생물 오염의 방지(멸균 장치 및 무균 조건) 및 작동 비용(에너지-집약적인 통기, 혼합 및 하부 가공)이다. 폐기물 가공/폐기에 대한 환경 문제 및 대량의 깨끗한 물에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 쟁점에 초점을 맞추기 위하여, 본 발명자들은 세균 할로모나스가 미생물 오염 부재시에 비-멸균 조건 하에서 성장하는 것으로 입증되어 있으므로 차세대 바이오-프로판 체로서 세균 할로모나스를 선택하였다.35 이러한 유기체는 호염기성 및 호알칼리성(6 내지 20% NaCI, pH 8 내지 12) 둘 다이며, 연속적인 배양물을 1년에 걸쳐 성장 가능성에 있어서 감소없이 산업적 규모의 용기 속에서 성장시켰다. 해수 및 재순환 수는 멸균없이 활용함으로써, 신선한 물을 보존할 수 있다. 이는 바이오반응기가 저 비용 물질(예컨대, 플라스틱, 세라믹 및 시멘트)을 사용하여 구축될 수 있으므로 주요 자본 비용 절약을 가능하도록 한다. 할로모나스의 산업적 잠재능은 >10,000 톤 규모에서 폴리하이드록시알카노에이트의 생산시 이의 사용에 의해 입증되었다.36 이러한 장점을 고려할 때, 이. 콜라이로부터 할로모나스로의 전환을 평가하여 바이오-프로판 생산 비용을 65% 이하까지 감소시킨다.37,38
할로모나스-양립성 작제물(pHal1-3)을 IPTG-유도성 T7-유사 프로모터(MmP1-lacO-RiboJ-SD; 도 16a)40 또는 변형된 배지 강도 T7-유사 프로모터(도 20)41를 함유하는 다수의 유기체 특이적인 pSEVA 플라스미드39를 사용하여 생성시켰다. 연구는 등가의 T7-유사 RNA 폴리머라제의 염색체 카피를 함유하는, 할로모나스 균주 XV12를 사용하여 인산염-완충된 고 염 배지(6% NaCl) 속에서 수행하였다.42 밀봉된 유리 바이알 속에서의 소 규모 생체내 연구(1 mL)는 할로모나스 내에서 CvFAPG462V 변이체 작제물(pHal2)이 최적화된 조건 하에서 이. 콜라이 작제물을 사용하여 관찰된 유사한 프로판 수준을 생성하였음을 나타내었다(78.9 ± 14.13 mg/L의 배양물; 도 16b). 고무적으로 이는 이. 콜라이로부터 할로모나스로의 체내 스위치(switch)는 pHal2 작제물을 사용하는 경우 프로판 역가를 유의적으로 약화시키지 않았음을 나타내었다. 등가의 야생형 작제물은 수율에 있어서 ~8배 감소를 나타내었지만, 보다 낮은 강도의 프로모터의 존재는 프로판 수율에 있어서 ~5배 감소를 나타내었다(16.8 ± 1.9 mg/L).
놀랍게도, 세포 투과성, 또는 atoB 수송인자 자극 시약을 사용한 비교 연구는 이. 콜라이 내에서의 생산과 반대로, 프로판 수율에 있어서 유의적인 효과를 나타내지 않았다(표 S8 (도 29)). 전자는 호염성 조건 하에서 성장을 위한 세포 벽 및 인지질 적응과 관련될 수 있다.43 에틸 아세토아세테이트에 의한 자극의 결여는 추정된 atoE 유전자가 할로모나스 게놈내에 존재한다는 것을 고려할 때 놀라운 것이다.
할로모나스 배양물은 완충 염의 존재하에서 80 mM의 최적 농도를 사용하여(157.1 ± 17.1 mg/L의 배양물; 도 16c), 이. 콜라이와 비교하여 부티르산에 대해 비교적 높은 내성을 나타내었다. 이는 지금까지 최고로 보고된 바이오-프로판 수율이며, CvFAPG462V 및 ADO-기반 물질대사 경로를 통해 이. 콜라이내에서보다 생체내 생산 수준의 ~9 내지 5배로 증가되었다.7,10,11 그러나, 광 접근은 광 '강도'(즉 140 □E 이하의 광합성 광자 플럭스 밀도(PPFD) 및 프로판 수율(도 16c 삽화) 사이에 비-포화 선형 관계로 알 수 있는 바와 같이, 제한 요인인 것으로 여전히 발견되었다. 따라서, 임의의 세포내 광 접근과 고 조명율에서의 세포 생존능 사이의 균형이 달성되면, 프로판 수율에 있어서의 현저한 증가를 위한 잠재능이 존재한다. 전체적으로, 할로모나스 균주에 대한 체내 이러한 변화는 공정 비용에 있어서의 잠재적인 주요 감소에 의해 생산 수율을 현저하게 증가시킴으로써 바이오-프로판의 개발 잠재능을 개선시켰다.
재생가능하고, 지속가능한 공급 원료 및 확장성
상업적으로 이용가능한 미생물 바이오공정의 개발에 대한 비결은 비용 효과적인 재생가능하고 지속가능한 공급 원료의 공급, 및 공정의 확장성의 입증이다. 할로모나스 균주내 프로판 생산은 광물, 비타민 및 부티르산을 함유하는 고 염(high salt) 속에서 단순한 탄소원(예컨대, 당, 글리세롤)에서의 호기성 성장을 필요로 한다. 해수는 비용 효과적인 천연 물질 및 염 브로쓰(3.5%)인 반면, 명확한 해수 스트림은 섬 지역을 위한 풍부한 대안을 제공한다. 요구된 염도에 대한 추가의 바다 염 보충 및 고 알칼리도에서의 광물 함량은 어떠한 멸균 요건도 없이 배지를 효과적으로 살균할 것이다. 비타민의 제공은 풍부한 폐 생성물인, 자가분해되어 소비된 양조 효모로부터 달성될 수 있다. 비용-효과적인 탄소 공급원은 주로 글리세롤(60 내지 70%), 염, 메탄올 및 잔류 식물성 오일로 구성된 저가 생성물인, 조(raw) 바이오디젤 폐기물,44이다(도 11).45 부티르산은 리그노셀룰로즈성 농업 생물량 및 식품 폐기물의 혐기성 소화(AD)로부터의 천연적으로 존재하는 부산물이다. 따라서, 풍부한 공급물이 AD 식물을 조정하여 부티르산 및/또는 다른 휘발성 지방산을 농축시킨 폐 스트림을 생성시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명자들은 시아노박테리아 편평층 광바이오반응기(400 mL)를 활용하여, 최고 성능 pHal2-FAPG462V 작제물을 발현하는 할로모나스를 사용한 실험실 규모의 표현형 전략을 개발하였다. 비교되는 비-멸균 호기성 발효를 '깨끗한'(실험실 등급 시약) 및 '조(crude)'(여과된 해수 및 바이오디젤 폐 글리세린) 배지 사이에서 배치 배양 방식으로 프로판 생산을 위한 온라인 상부 빈공간 모니터링으로 수행하였다.
고무적으로 해수 및 바이오디젤 폐 불순물의 존재는 배양물 성장에 있어서 약간의 부정적인 영향만을 나타내었으며(도 17a), 48시간까지 배양물 둘 다는 거의 동일한 세포 밀도를 달성하였다. 조 배지내 최대의 프로판 생산에 있어서 단지 작은 감소가 존재하였으며(82 대 100 mg/g 세포/일; 도 17b), 유도 후 8 내지 13시간 사이에 피크 생산에 도달하였다. 따라서, 프로판 생산에 있어서 단지 작은(1.2배) 차이가 존재하였음을 고려할 때, 본 발명자들은 재생가능한 바이오-프로판 생산에 대해 대규모 바이오반응기를 설계하는 경우 저렴하고 풍부한 폐 바이오물질 및 해수를 활용하는 비용 이점의 장점을 취할 수 있다.
미생물 체 및/또는 바이오공정의 견고성은 또한 연장된 기간에 걸쳐 생산성의 유지에 의존한다. 개념 증명 입증이 플라스미드-기원한 유도성 작제물을 사용하여 달성되면, 이러한 공정의 상업적 잠재능은 연장된 발효 시간에 걸쳐서 일정한 프로판 생산율을 유지할 수 있는 안정하고, 염색체적으로 통합되고 구성적으로 발현된 체의 개발에 의해 강화될 것이다. 이러한 연구에서, 본 발명자들은 플라스미드-유래된 IPTG-유도성 작제물을 활용하였으며, 이는 시간에 걸쳐 프로판 생산에 있어서 대표적인 점진적 쇠퇴를 나타내었다(도 17b). 따라서, 이러한 바이오-프로판/바이오-LPG의 추가의 적용은 구성적으로 발현된 CvFAP 변이체의 게놈성 통합을 필요로 할 것이며, 항생제 및 단백질 유도제 둘 다에 대한 필요성을 제거한다. 더욱이, 이러한 발효 전략과 기존의 상부빈공간 추출 및 프로판 액화 '드롭-인' 기술 및 분배 기반시설의 커플링은 가스성 탄화수소 연료의 생산을 위한 잠재적으로 획기적인 기술의 시행을 강화시킬 것이다.
결론
본 발명자들은 니코틴아미드 보조인자 대신에 광을 활용하여, 용이하게 이용가능한 지방산으로부터 다양한 바이오-LPG 탄화수소를 생산하는 CvFAP 변이체의 능력을 입증하였다. 이는 광 강도를 단순히 변화시킴으로써 긴 ADO-기반 경로 전략을 탄화수소 수율의 강력한 조절의 장점과 커플링된, 단일 광 활성화된 효소 단계로 치환시킴으로써 가스성 바이오연료 생산 분야를 열었다. 실험실 표준 이. 콜라이로부터 풍부하고 비용 효율적인 할로모나스 산업체로의 성공적인 이전은 이러한 신규 바이오-LPG 전략의 잠재적인 확장가능성을 입증한다.
가스 생산을 위한 광바이오반응기 전략의 '드롭-인' 특성은 다양한 탄소 및/또는 VFA 공급원을 사용한, 다양한 폐수 속에서 성장하는 할로모나스의 효율적인 가공 능력 및 고유의 견고성에 의존한다. 이는 기존의 지역적으로 공급된 물질로부터 효율적인 휘발성 탄화수소 생산을 가능하도록 하는 임의의 선택된 현지에서 광바이오촉매 공정 설계의 조율을 가능하도록 할 것이다. 이는 우리를 제5 세대 바이오연료 개발로 이끔으로써, 현지화된 견고한 비-멸균 발효는 기존의 제조 관행으로부터 폐 스트림을 활용하여 수행된다.
추가의 결과 및 논의
생체내 프로판 생산
평균 배양물 광 노출은 광 '강도'(예컨대, mol 광자/sec/m2의 광합성 광자 플럭스 밀도), 광원으로부터의 평균 거리, 배양물 밀도/불투명도, 교반 속도 및 반응 용기의 유형(원통형 대 편평층)과 같은 인자로 측정한다. 초기 생체내 연구는 심지어 수 밀리미터의 LED로부터의 거리 편차를 지닌 반복된 배양이 프로판 수율에 있어 유의적인 차이를 나타내어, 높은 계산 오차(예컨대, 1 mM 부티르산을 사용하여 야생형 CvFAP로부터 0.24 + 0.17 mg/L의 추출물 프로판; 455 nm LED)를 야기하였으므로 광 접근이 유의적인 제한 인자임을 나타내었다. 이는 배양물이 위치한(광원으로부터 8 cm) 각각의 LED 주변의 광 강도 차이를 측정함으로써 확인하였다. 470 nm LED의 경우 최고의 광 강도는 광원(615 μmol 양자/s/m2) 바로 아래의 협소한 구역(9 cm2) 내에 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 배양물은 보다 더 큰 구역을 점유하므로(360 cm2), 평균 PPFD는 허용불가능하게 높은 표준 편차(72 ± 119 μmol 광자/s/m2)로, 현저하게 더 낮은 것으로 밝혀졌다.
배양물 광 노출을 표준화하기 위하여, 본 발명자들은 480개 개개의 청색 LED로 구성된 통상의 구축된 LED 배열 광원을 조립하여 비교적 일관된 광 강도 및 고정된 평균 배양물-대-LED 거리(8 cm)의 396 cm2의 면적을 조립하였다. 평균 PPFD(78 ± 10 μmol 광자/s/m2)는 470 nm LED에 대한 평균과 유사하였지만, 중요하게도 이는 보다 넓은 면적에 걸쳐 보다 높은 광 일관성을 나타내었고, 이의 최대 파장은 CvFAPWT의 흡수 최대와 근접하였다. 이러한 새로운 광원은 반복된 샘플의 증가된 재생산성을 가능하도록 하여, 비교 연구가 수행되도록 하였다.
부티레이트 접근성
전통적인 효소 동역학적 연구와는 달리, 변이체 특성화에 대한 이러한 최적화 접근법은 생체내에서 각각의 변이체 단백질의 용해도 및 보조인자 함량에 있어서의 차이를 고려하지 않는다. 그러나, 이러한 접근법은 상이한 변이체가 전체적으로 발효 조건 하에서 가장 우수한 성능을 나타낸다는 통찰력을 제공한다.
CvFAPG462V를 사용한 생체내 연구를 수행하여 생체내 프로판 생산을 위한 최적의 부티르산 농도를 측정하였다(도 19). 흥미롭게도, 작은 수준의 프로판(0.04 ± 0.01 mg/L의 배양물)이 외부 부티르산이 첨가되지 않은 배양물 속에서 검출되었다. 이는 부티르산의 천연 세포내 수준 및/또는 배양 배지 속에 존재하는 소량을 반영한다. 프로판 생산에 대한 pH의 효과를 제거하기 위하여, 인산염의 첨가와 같은 배양물 pH의 조심스러운 제어가 요구된다.
할로모나스 내에서 생체내 프로판 생산
흥미롭게도, 할로모나스 작제물용 배지 속에서 최적의 부티레이트 농도는, 동일한 효소가 각각의 작제물 내에서 발현됨에도 불구하고, 이. 콜라이 작제물을 사용하는 경우 10 mM (17.51 ± 0.98 mg/L)과 비교하여, 대략 80 mM(157.1 ± 17.1 mg/L의 배양물; 표 S4)인 것으로 밝혀졌다. 최적의 기질 농도에 있어서 명백한 차이는 도입시 부티르산 첨가와 관련된 pH 변화를 상쇄하는, 배지 속의 인산염 완충 염의 혼입에 부분적으로 기인할 수 있다. 인산염 염의 부재하에서 수행된 비교 연구는 보다 높은 농도의 부티르산에서 ≤5.0 까지의 배양물 pH의 강하로 인하여, 대략 40 mM에서 최적임을 나타내었다. 영향을 미칠 수 있는 추가의 요인은 부티레이트 내성(IC50)과 2개의 유기체 사이의 흡수율 둘 다에 있어서의 차이일 가능성이 있다.
방법
물질 및 장치
모든 화합물질 및 용매는 상업 공급회사로부터 구입하였고, 분석 등급 또는 보다 우수하였다. 배지 구성성분은 Formedium(영국 노르폴크 소재)로부터 구입하였다. 유전자 서열분석 및 올리고뉴클레오타이드 합성은 Eurofins MWG(독일 에베르스베르크(Ebersberg) 소재)에 의해 수행되었다. 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표 S9에서 찾을 수 있다(도 30). 탑재된 하이-파워(Hi-Power) 청색 LED 및 LED 드라이버는 파장이 455 nm(1020 mW 출력) 및 470 nm(253 mW)인 Thorlabs(미국 뉴저지 주)로부터 구입하였다. 국내 공급된 백색 광 LED(Integral)는 25W 파워(2060 루멘)를 가졌다. 광바이오반응기는 필수적인 배양 모니터링(OD 680 nm), pH 및 공급 제어 및 LED 청색 광 패널(465 내지 470 nm; 최대 PPFD = 1648 μE 광자)를 지닌 열안정성 편평한 패널 FMT 150(400 mL; Photon Systems Instruments, 체코 공화국)이었다.
이. 콜라이 균주 BL21(DE3)를 앞서 기술한 바와 같이 2개의 알데하이드 리덕타제 유전자 yqhD 및 ahr/yigB(BL21(DE3)△yqhD/△yjgB/KanR; 각각 GenBank: ACT44688.1 및 AAA97166.1)의 염색체 결실에 의해 변형시켰다.46 가나마이신 선택 유전자는 Flp-매개된 절개 방법(BL21(DE3)△yqhD/△yjgB)을 사용하여 제거하였다.47 시네코시스티스 종 PCC 6803을 앞서 기술한 바와 같이 아실-ACP 신타제(aas)의 염색체 결실에 의해 변형시켰다.31,32 할로모나스 균주 TD0136 및 TQ10 및 변형된 pSEVA 플라스미드는 구오-챵 첸(Guo-Qiang Chen)(칭화 대학교, 중국 베이징 소재) 박사로부터 친절히 제공받았다42. 할로모나스 균주 XV12는 TQ10 균주의 변형된 버젼이며, 이는 기존의 재조합 플라스미드를 치유한 것이다(발표되지 않은 결과).
유전자 합성, 서브 클로닝(sub cloning) 및 돌연변이유발
다음의 N-말단적으로 트렁케이트된(△N) FAP 효소의 코돈 최적화된 유전자 합성을 GeneArt(Thermo Fisher)에 의해 수행하였다: 클로렐라 바리아빌리스 NC64A12(Genbank: A0A248QE08; △N-61)로부터의 CvFAPWT; 콘드루스 크리스푸스(UniProt: R7Q9C0; 트렁케이트된 △N-50 아미노산)으로부터의 CcFAP, 크리소크로물리나 종(UniProt: A0A0M0JFC3)으로부터의 ChFAP, 시아니디오키존 메롤라에(Cyanidioschyzon merolae)(UniProt: M1VK13; △N-64)로부터의 CmFAP, 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)(UniProt: A8JHB7; △N-31)로부터의 CrFAP, 콕코믹사 수벨립소이데아(Coccomyxa subellipsoidea)(UniProt: I0YJ13; △N-43)로부터의 CsFAP, 고니움 펙토랄레(Gonium pectorale)(UniProt: A0A150GC51; △N-38)로부터의 GpFAP 및 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)(UniProt: B7FSU6)12으로부터의 PtFAP. 각각의 유전자를 신속한 단백질 정제를 위해 TEV 프로테아제 절단가능한 78 bp N-His6-태그(초기 메티오닌(1번 잔기) 앞에 삽입된, MKHHHHHHPMSDYDIPTTENLYFQGA)를 혼입시키는, pETM11(NcoI-XhoI)내로 서브클로닝하였다. 추가의 코돈 최적화된 합성된 유전자, 즉, C-말단 His6-태그(www.oxfordgenetics.com)가 없는 pET21b내에 이의 천연 OXB1 프로모터를 지닌 이. 콜라이(UniProt: P76460)로부터의 단쇄 지방산 수송인자를 GeneArt에 의해 합성하였다.18,19 박테로이데스 프라길리스(UniProt: P0ADA1)로부터의 티오에스테라제 Tes4를 암호화하는 유전자를 앞서 기술한 바와 같이 플라스미드 pET-TPC4로부터 수득하였다.10
변이체 CvFAPG462V를 QuikChange 전체 플라스미드 합성 프로토콜(Stratagene)을 사용하여 CloneAmp HiFi PCR 예비혼합물(Clontech)로 pETM11 내에 야생형 작제물의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. 추가의 변이체 G462N/W/L/C/I/F/A/H/Y를 Q5® 부위 지시된 돌연변이유발 키트(kit)를 사용하여, 제조업자의 프로토콜(New England Biolabs)에 따라 생성시켰다. 각각의 경우에, PCR 생성물을 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하고 NucleoSpin® Gel 및 PCR 클린-업 키트(Clean-up kit)(Macherey-Nagel)를 사용하여 겔 정제하였다. 작제물을 플라스미드 재순환 및 생산을 위해 이. 콜라이 균주 NEB5□(Clontech) 내로 형질감염시켰다. 돌연변이의 존재는 유전자 서열분석에 이어, 기능적 발현 연구를 위해 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)△yqhD/△yjgB10 내로 형질전환시켜 확인하였다.
분자 모델링
기질 팔미트산 및 부티르산을 Autodock vina를 사용하여 팔미트산 결합된 CvPAS 구조 5NCC의 결정 구조의 A 쇄 내로 도킹(docking)하였다.16 AutoDock Tools 1.5.6을 사용하여 비-극성 수소를 지정하여 투입 파일(input file)을 제조하였다. 15Å 측면을 지닌 입방체 연구 체적을 중심으로서 팔미트산의 C6의 좌표를 사용하여 정의하고, 50의 완전성(exhaustiveness)을 사용하여 20개의 구조를 생성시켰으며, 이들 중에서 정확한 배향의 기질(FAD를 가리키는 카복실레이트)과의 최저-에너지 구조를 선택하였다. 돌연변이는 SwissPDBViewer 4.10,48 내에서 완전성 연구 기능을 사용하여 수행함으로써 돌연변이된 잔기에 대해 가장 우수한 로타머(rotamer)를 확인하였다.
에스케리키아 콜라이 다중-효소 작제물 생성
이중 유전자 작제물 CvFAPG462V-atoE를, PCR 증폭시킨 CvFAPG462V를 각각의 유전자가 이의 자체의 프로모터(각각 T7 및 OXB1)에 의해 조절되는, 기존의 atoE-pET21b 작제물 내로 인-퓨전 클로닝에 의해 연결시킴으로써 생성시켰다. N-His6-CvFAPG462V의 추가의 작제물을 플라스미드 pET21b 및 pBbAlc49 내에서 PCR-매개된 인-퓨전 클로닝에 의해 생성시켰다. 작제물을 기능적 발현 연구를 위해 이. 콜라이 균주 NEB5α, BL21(DE3) 및 BL21(DE3)△yqhD/△yjgB10 내로 형질전환시켰다.
시네초키스티스 작제물 생성
CvFAPG462V (pJET-FAPG462V; 이. 콜라이에 대해 코돈-최적화됨)를 암호화하는 시네초키스티스 특이적인 플라스미드의 생성을 앞서 기술된 주형 pJET-FAP(클라미도모나스 레인하르드티이로부터의 CrFAP)를 사용하여 수행하였다.32 Tes4를 평활-말단 pJET1.2 플라스미드 내로 서브-클로닝하여 프로모터의 제어 하에 pJET-Tes4를 생성하였다.32 Tes4 및 FAPG462V 둘 다를 함유하는 플라스미드를 Ptrc 또는 Pcoa 프로모터(각각 Ptrc-Tes4-FAPG462V 및 Pcoa-Tes4-FAPG462V)로 기술된 바와 같은 멱등 클로닝(Idempotent Cloning)(BASIC) 방법을 위한 Biopart Assembly 표준을 사용하여 작제하였다.31,32,50 플라스미드 조립을 DNA 서열분석으로 입증하였다.
플라스미드를 pRL623 가동화 플라스미드(mobilization plasmid)를 함유하는, 이. 콜라이 HB101 헬퍼/카고 균주(helper/cargo strain)내로 형질전환시켰다. 이를 pRL443 가동화 플라스미드51을 수반하는 접합(conjugal) 이. 콜라이 ED8654 균주와 결합시켜 앞서 기술한 바와 같은 삼중-모 접합(tri-parental conjugation) 방법을 사용하여 시네초키스티스 종 PCC 6803△ass 균주32를 형질전환하였다.31,32 접합 혼합물을 BG1152 아가 플레이트 상에서 성장시키고 2일 동안 30℃에서 백색 광(60 μmol μE)을 사용하여 항온처리하였다. 배양물을 플레이트로부터 회수하고, 500 μL의 BG1 1-공 배지32 속에 재-현탁시키고, 20 μg/ml의 에리트로마이신을 함유하는 BF11 아가 상에서 백색 광을 사용하여 30℃에서 성장시켰다. 콜로니가 1주 내에 나타났다.
할로모나스 작제물 생성
각각의 할로모나스 양립성 작제물에서, IPTG-유도성 PT7-유사-프로모터 카세트(MmP1-lacO-RiboJ-RBS; 도 S20a-b)42,53를 기존의 T7 프로모터로 대체하였다. 비-태그된 CvFAPWT를 암호화하는 유전자를 PCR-매개된 인-퓨전 클로닝에 의해 변형된 pSEVA32139 내로 클로닝하여 pHall-FAPWT를 생성하였다. 야생형 및 G462V 변이체 CvFAP 둘 모두를 pSEVA44139(각각 pHal2-FAPWT 및 pHal2-FAPG462V)를 기반으로 제2의 할로모나스 얄립성 플라스미드내로 클로닝하였다. 당해 플라스미드는 PT7-유사-프로모터, Ncol 제한 부위(밑줄침) 및 출발 코돈 상부의 pET21b-유사 샤인-델가노 서열(SD2)을 함유한다(굵은 활자체; TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGG; 도 S20b). 벡터 및 pETM11 유전자 둘 다를 이중 분해(NcoI 및 (부분) XhoI)하고, 겔 정제한 다음 연결하고 상기와 같이 이. 콜라이 균주 스텔라 내로 형질전환시켰다. 추가의 CvFAPG462V 작제물을 할로모나스 내에서 사전 프로모터 가공 연구를 기반으로 한 대안의 가공된 T7-유사 유도성 프로모터를 함유하는 pHaM-FAPWT를 기반으로 생성시켰다(pHal3-FAPG462V)(도 S20c-d).41 이는 유전자 및 벡터(pHaM -FAPWT)의 이중 분해(PacI/SmaI) 및 연결에 의해 생성되었으며, 벡터는 기존의 T7-유사 프로모터 및 CvFAPWT 유전자를 제거하였다. 전체 길이의 작제물을 선택한 후 플라스미드 재순환, 회수 및 서열분석을 위해 이. 콜라이 균주 스텔라 내로 형질전환시켰다.
이. 콜라이 유래된 플라스미드의 할로모나스 균주 XV12 내로의 삽입은 변형된 접합 프로토콜을 사용하여 수행하였다.41 할로모나스 작제물을 이. 콜라이 균주 S17-154 내로 형질전환시키고, 항생제 선택적인 LB 아가(pHal2 및 pHal1/3 플라스미드 각각에 대해 가나마이신 또는 클로람페니콜) 위에 플레이팅하였다. 할로모나스 균주 XV12를 YTN6 아가(10 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물; 60 g/L의 NaCl 및 15 g/L의 아가) 상에 플레이팅하고, 배양물 둘 다를 밤새 37℃에서 항온처리하였다. 이. 콜라이 S17-1(플라스미드 공여체) 및 할로모나스 균주 XV12(수용체) 둘 다의 콜로니를 함께 YTN3 아가(10 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물; 30 g/L의 NaCl 및 15 g/L의 아가) 상에 플레이팅하고 밤새 37℃에서 항온처리하였다. 개개의 콜로니를 할로모나스 성장에만 선택적인, 항생제-함유 YTN6 아가 상에 재-플레이팅하였다.
단백질 발현 및 분해물 생산
이. 콜라이 균주 BL21(DE3) 내에서 야생형 FAP-pETM11 동족체를 30 μg/mL의 가나마이신을 함유하는 LB 브로쓰 밀러(Broth Miller)(500 mL; Formedium) 속에서 37℃에서 180 rpm 진탕시키면서 OD600nm = 0.2까지 배양하였다. 온도를 OD600nm = 0.6가 될 때까지 25℃에서 유지시켰다. 재조합 단백질 생산을 50 μM IPTG로 유도하고, 17℃에서 밤새 유지시켰다. 세포를 원심분리(8950 xg, 4℃, 10분)로 수거하고, 단백질 함량에 대해 12% SDS-PAGE 겔(Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ Precast Gels, Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다. 단백질 겔을 BioRad Gel Doc™ EZ 영상기를 사용하여 영상화하고 상대적인 단백질 밴드 강도를 BioRad ImageLab™ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
세포 펠렛을 분해 완충액(1.2 내지 1.7 mL/g의 펠렛; 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.25 □g/mL의 라이소자임, 10 μg/mL의 DNase I 및 1 x 프로테아제 억제제를 함유하는 50 mM 트리스 pH 8) 속에 재현탁시키고 20분 동안 초음파처리하였다(20초 작동, 60초 비작동; 30% 진폭). 세포-유리된 분해물을 48000 xg에서 30분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 제조하였다. 분해물 샘플을 SDS PAGE(12% Mini-PROTEAN-TGX 염료-유리된 겔; Bio-Rad)에 의해, 정밀 플러스 염색되지 않은 단백질 래더(Precision Plus unstained protein ladder)(Bio-Rad)를 300 V에서 20분 동안 사용하여 재조합체 단백질 발현에 대해 분석하였다. 단백질 함량은 EZ Gel Doc(Bio-Rad)을 사용하여 가시화하였다.
탄화수소 생산
시험관내 프로판 생산 반응(200 μL)은 밀봉된 유리 GC 바이알 속에서 FAP-함유 세포-유리된 분해물(180 μL) 및 부티르산(0.36 내지 4.5 mM)으로 구성되었다. 반응물을 30℃에서 24시간 동안 180 rpm에서 조명(청색 LED; 455 nm) 하에 항온처리하였다. 상부 빈공간을 Micro GC를 사용하여 프로판 함량에 대해 분석하였다.
이. 콜라이 내에서 pETM11- 및 pET21b-함유 CvFAPWT 및 변이체의 생체내 프로판 생산을 다음의 일반적인 프로토콜에 의해 수행하였다: 가나마이신(50 μg/mL; pETM11) 또는 암피실린(100 μg/mL)을 함유하는 LB 배지 속의 배양물(20 내지 100 mL)을 4 내지 6시간(OD600 ~1) 동안 37℃ 및 180 rpm에서 항온처리한 후, IPTG(100 μM) 및 부티르산 보충(1 내지 1000 mM; pH 6.8)으로 유도하였다. 3개의 생물학적 반복물 배양물 각각의 3개의 분취량(1 내지 5 mL)을 유리 바이알(4 내지 20 mL) 내로 밀봉시키고 30℃에서 16 내지 18시간 동안 200 rpm에서 항온처리하고, LED(백색 또는 청색(455 nm 또는 470 nm))로 연속적으로 조사하였다. 상부 빈공간 가스를 프로판 함량에 대해 Micro GC를 사용하여 분석하였다. 10 mM 부티르산, 이소부티르산, 발레르산, 3-메틸부티르산 및 이소발레르산을 사용한 비교 생체내 연구를 0.6 내지 0.8의 OD600에서 배양 유도로, 상기와 같이 수행하였다.
시네초키스티스 내에서 CvFAPG462V의 기능성을 시험하기 위하여, 배양물(8 mL)을 30℃에서 헥사데칸산(C16:0)을 함유하는 BG11 배지 속에서 300 μE 백색 광 하에 알개트론(algaetron) 속에서 항온처리하였다. 펜타데칸의 생산은 GC로 측정하였다. 시네초키스티스 내에서 생체내 부티레이트 및 프로판 생산 연구에서의 광합성을 BG11 배지 속에서 변형된 프로토콜을 사용하여 다음과 같이 수행하였다: BG11 배지 속에서 초기 배양물을 30℃에서 30 μE 백색 광 하에 OD 720 nm가 1.0에 도달할 때까지(~4일) 항온처리하였다. 복제물 배양 분취량(2 mL)을 원심분리에 의해 수거하고 중탄산나트륨(150 mM), IPTG (단 Ptrc 배양물), 20 μg/ml 에리트로마이신이 보충된 1 mL의 BG11 배지 속에서 30℃ +/- 부티르산(10 mM)과 함께 재-현탁시켰다. 배양물을 4 mL의 가스 기밀 바이알 내에 밀봉하고 30℃에서 24 내지 48시간 동안 청색 광(평균 63 μE) 하에 밀봉하였다. 상부 빈공간 가스를 프로판 함량에 대해 Micro GC를 사용하여 분석하고, 세포-유리된 배양물 상층액 샘플(10 μL)을 HPLC로 Agilent Hi-Plex H 컬럼을 사용하여 부티르산 함량에 대해 분석하였다.
할로모나스 균주 내에서의 프로판 생산을 다음과 같이, 이. 콜라이 변형이 일반적인 프로토콜로 수행하였다: 배양물을 스펙티노마이신(pHal2-FAPG462V; 50 □g/mL) 또는 클로람페니콜(pHal1- 및 pHal3 작제물; 34 μg/mL)을 함유하는 인산염 완충된 YTN6 배지(50 mM K2HPO4 pH 6.6) 속에서 5시간 동안 37℃ 및 180 rpm에서 성장시켰다. 재조합 단백질 발현을 이. 콜라이 배양물(OD ~ 1.6)보다 더 높은 세포 밀도에서 IPTG(0.1 mM)로 유도시켰다. 생체내 프로판 생산 공정의 나머지를 상기와 같이, 10 내지 25 mM의 부티르산 농도를 사용하여 수행하였다. 세포 투과능의 효과를 배양물에 트리톤 X-100(2%) 및/또는 슈크로즈(1%)를 보충함으로써 조사하였다. 부티레이트 수송인자 자극 연구를 메틸 및 에틸 아세토아세테이트(0.1 내지 30 mM)의 존재하에서 수행하였다. 프로판 생산에 대한 광 포화의 효과는 배양물과 광원 사이의 거리를 변화시킴으로써 수행하였다.
할로모나스 발효
광바이오반응기를 배치 방식(batch mode)으로 고 염 글리세롤 배지를 사용하여 pH 6.8(5 g/L의 효모 추출물, 1 g/L의 글리세롤, 60 g/L의 NaCl, 50 μg/mL의 스펙티노마이신 및 0.2 mL/L의 소포제; 400 mL)에서 설정하고, 30℃에서 최대 교반하면서 예비-평형화시켰다. pHal2-FAPG462V의 밤샘 스타터 반응물(20 mL)을 가하고 배양물을 30℃에서 1.21 L/min의 기류 속도, 자동화된 pH 유지, 배양물 광학 밀도 모니터링 및 주위 실온 광으로 중간 로그 상(midlog phase)까지(4 내지 5시간) 유지시켰다. 재조합 단백질 발현을 IPTG(0.1 mM)로 유도한 다음, 부티르산나트륨(80 내지 100 mM pH ~6.8)을 첨가하고 청색 광에 노출(1625 μE)시키고, ~100시간 동안 유지시켰다. 연속 유동 방식 동안, 1.0의 OD680nm의 유지를 상기와 같은 배양 배지의 자동화된 첨가로 달성하였다. 프로판 생산을 수성 부티레이트 및 글리세롤 고갈을 HPLC로 검출하면서, Micro GC를 사용하여 자동화된 상부빈공간 샘플링에 의해 15분 간격으로 모니터링하였다.
시네초키스티스 발효
광바이오반응기(400 mL)를 배치 방식으로 pH 조절 및 CO2 공급(각각 공급 및 비-공급 배양물)을 위해 보충적 150 mM NaHC03의 존재/부재하에 신선한 BG11 배지 pH 8.08 속에서 3:1로 희석시킨 스타터 배양물을 사용하여 설정시켰다. 배양물을 30℃에서 최대 교반하면서 1.21 L/min의 기류 속도, 온화한 백색 광(30 μE)의 조명, 자동화된 pH 유지(1 M 아세트산) 및 광학 밀도 모니터링(720 nm)을 사용하여 유지시켰다. ~0.5의 광학 밀도에 도달한 후, 온화한 백색 조명을 60 μE로 증가시키고 필수적인 액틴성 청색 LED 광 패널을 활성화하여 750 μE 청색 광(460 내지 480 nm)을 제공하였다. 배양물을 30℃에서 수동 상부빈공간 샘플링 및 Micro GC에 의한 모니터링을 위해 유지시켜 프로판 생산을 정량화하였다.
분석 기술
프로판 수준을 Al2O3/KCl 컬럼 및 열 전도도 검출기(thermal conductivity detector: TCD)를 함유하는 Agilent 490 Micro GC를 사용하여 수동 상부 빈공간 주입으로 측정하였다. 상부빈공간 샘플을 가열된 주입기(110℃)를 통해 캐리어 가스(10.2 psi)로서 헬륨을 사용하여 100 ms의 주입 시간으로 수동 주입하였다. 연속적인 모니터링 방식 동안에, 발효기 배기 가스를 Micro GC 셀(cell)을 통해 100 ms에서 주기적으로 샘플링하면서 일정하게 유동시켰다. 화합물을 등온적으로(100℃) 120초에 걸쳐 정적 압력 조건 하에서 100 Hz의 샘플링 주파수로 분리하였다. 프로판 농도를 동일한 조건 하에 생성시킨 표준 곡선에 대해 피크 면적을 비교함으로써 계산하였다.
수성 배양물 대사산물(글리세롤 및 부티르산)을 HPLC로 1260 ALS 자동샘플러, TCC SL 컬럼 가열기 및 1260 굴절률 검출기(RID)가 장착된 Agilent 1260 Infinity HPLC를 사용하여 분석하였다. 세포-유리된 배양물 상층액 샘플(10 μL의 주입)을 Agilent Hi-Plex H 컬럼(300 x 7.7 mm; 5 mM H2SO4) 상에서 60℃에서 0.7 mL/min의 유동 속도로 40분 동안 등용매적으로 분석하였다. 분석물 농도를 피크 면적을 동일한 HPLC 조건 하에 생성된 표준 곡선과 비교함으로써 계산하였다.
참고 문헌
다수의 공보가 본 발명 및 본 발명이 속한 당해 분야의 기술 상태를 보다 완전하게 설명하고 개시하기 위해 상기 인용되어 있다. 이러한 참고 문헌에 대한 모든 인용이 하기 제공되어 있다. 각각의 이러한 참고 문헌 전문은 본원에 포함된다.
Figure pct00029
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실시예 9를 위한 참고문헌 목록
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Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
표준 분자 생물학 기술에 대해서는, 문헌: Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고한다.

Claims (27)

  1. 서열 번호: 1 또는 2에 대해 적어도 40% 서열 동일성(sequence identity), 및 서열 번호: 1의 G462번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제(fatty acid decarboxylase).
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 치환이 G462V, G462F, G462I, G462L, G462A, G462Y, G462C, G462H, G462N, G462Q, 및 G462W로부터 선택되는 지방산 데카복실라제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호: 1의 425 내지 429번 잔기에 상응하는 위치에서 컨센서스 서열(consensus sequence)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 지방산 데카복실라제로서, 여기서 컨센서스 서열이 서열 번호: 3에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 포함하는 지방산 데카복실라제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 1의 398 내지 757번 잔기에 상응하는 위치에서 활성 부위를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 지방산 카복실라제로서,
    여기서 활성 부위가 서열 번호: 4 내지 7로부터 선택된 하나 이상의 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 포함하는 지방산 데카복실라제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 1 또는 2에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 지방산 데카복실라제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기질로서 8개 이하의 탄소의 쇄 길이(chain length), 바람직하게는 2 내지 5개 탄소의 쇄 길이를 갖는 지방산을 수용하는 지방산 데카복실라제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 결합으로부터 8개 초과의 탄소의 쇄 길이를 지닌 지방산을 입체적으로 방해하는 지방산 데카복실라제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 기질로서 Cn+1 지방산(여기서 n≤5이다)을 사용하여 서열 번호: 1의 G462에 상응하는 위치에서 치환을 결여하고 있는 지방산 데카복실라제를 사용하여 수득된 동일한 Cn 알칸의 수율과 비교하여 보다 높은 수율의 Cn 알칸을 제공하는 지방산 데카복실라제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 서열 번호: 1을 포함하는 야생형 지방산 데카복실라제와 비교하여 보다 높은 부티르산 대 프로판 데카복실라제 수율을 갖는 지방산 데카복실라제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 광-의존성 데카복실라제 활성, 예를 들면, 청색 광-의존성 데카복실라제 활성을 갖는 지방산 데카복실라제로서, 여기서 바람직하게는 활성이 400 내지 520 nm의 파장을 지닌 광에 의존성인 지방산 데카복실라제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 서열 번호: 1의 V453, 서열 번호: 1의 G455, 서열 번호: 1의 A457, 서열 번호: 1의 Y466, 또는 서열 번호: 1의 T484 중 적어도 하나에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 지방산 데카복실라제.
  12. 제11항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 V453F, V453I, V453L, V453W, G455F, G455I, G455V, G455W, G455L, A457F, A457I, A457L, A457V, Y466W, T484A, T484E, T484I, T484L 중 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하는 지방산 데카복실라제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지방산 데카복실라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 세균 세포, 바람직하게는 할로모나스 종(Halomonas spp.)의 세포인 세포.
  15. 지방산 데카복실라제를 사용하여 Cn+1 지방산의 Cn 알칸으로의 전환을 촉매작용(catalysis)시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 여기서 n ≤ 5인 방법.
  16. 지방산 데카복실라제를 사용하여 Cn+1 지방산의 Cn 알칸으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함하는, Cn 알칸의 생산 방법으로서, 여기서 n ≤ 5인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, Cn+1 지방산이 부티르산이고 Cn 알칸이 프로판인 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, Cn+1 지방산이 발레르산이고, Cn 알칸이 부탄인 방법.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, Cn+1 지방산이 이소발레르산이고, Cn 알칸이 이소부탄인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    제16항에 인용된 단계 전에, 아실-CoA 티오에스테르 하이드롤라제를 사용하여 Cn+1 아실-CoA의 Cn+1 지방산으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, n이 3이고, Cn+1 아실이 부티릴-CoA이고, Cn+1 지방산이 부티르산이고, Cn 알칸이 프로판인 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 지방산 데카복실라제, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 데카복실라제가 제13항에 따른 세포 내에 포함되는 방법.
  24. 알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함하는, 프로판의 생산 방법.
  25. 알데하이드 데하이드로게나제를 사용한 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매작용시키는 단계에 이어서, 알데하이드 데포르밀화 옥시게나제를 사용한 부티르알데하이드의 프로판으로의 전환을 촉매작용시키는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 알데하이드 데하이드로게나제가 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 또는 이의 단편, 변이체, 또는 동족체인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 알데하이드 데하이드로게나제를 사용한 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환의 촉매작용 전에 부티레이트-아세토아세테이트 CoA 트랜스퍼라제를 사용한 부티르산의 부티릴-CoA로의 촉매적 전환을 포함하는 방법.
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