KR20200138570A - 조류 대장균증 예방을 위한 내독소가 감소된 대장균 3가 불활화 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균 감염증 예방용 백신 조성물에 관한 것으로서, msbB　유전자가 결손된 E. coli O1, E. coli O2 및 E. coli O78 균주를 혼합하여 포함하는 조류 대장균증 예방용 3가 불활화 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은, 상기 3가지 혈청형의 감염을 동시에 방어할 수 있고, 지질 A(lipid A)를 저감시킴으로써 내독소 관련 백신 부작용을 감소시켰으며, 기존 오일성 백신 조성물의 부작용 또한 보완하므로, 조류 대장균증의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조류 대장균증 예방을 위한 내독소가 감소된 대장균 3가 불활화 백신 조성물 {Endotoxin-reduced Escherichia coli trivalent inactivated vaccine composition for preventing Avian colibacillosis}

본 발명은 조류 대장균(Avian Pathogenic Escherichia coli; APEC) 감염증 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 msbB　유전자가 결손된 E, coli O1, O2 및 O78 혈청형에 대한 균주를 혼합하여 포함하는 조류 대장균 감염증 예방용 3가 불활화 백신 조성물에 관한 것이다.

조류 대장균은 단독 감염 또는 바이러스 및 마이코플라즈마 감염 후 이차감염을 통해 봉와직염, 간포막염, 다발성 장막염, 패혈증, 수란관염등으로 다양한 피해를 일으키며 국내에서는 가장 큰 발병사례를 보이고 있고 대다수의 대장균의 혈청형은 가축뿐만 아니라 사람에게도 감염되는 인수 공통전염병으로, 전 세계적으로 경제적·산업적 및 공중보건학적으로 문제가 되고 있는 질병이다. 미국의 경우 조류 대장균에 의한 봉와직염으로 인해, 매년 4,000만불 이상의 피해를 입는 것으로 추정하고 있고, 국내 육계산업에서 5%의 생산성 저하를 가정해도 년간 약 300억원의 손실이 발생하는 것으로 추산될 정도로 전 세계적으로 공중보건학적 문제가 되고 있다.

따라서, 조류 대장균증은 경제적 손실 및 공중보건학적인 문제를 야기하기 때문에 현재까지 대장균을 예방하기 위한 백신 개발 및 연구가 활발히 진행되고 있다. 조류 대장균의 치료전략은 항생제를 조기 사용하는 것인데 현재 대장균 분리주에 대한 항생제 감수성 조사 결과 테트라싸이클린, 카나마이신, 네오마이신, 세팔로틴, 스트렙토마이신 및 에리스로마이신에 대한 내성이 자주 나타나는 것으로 보고되고 있고, 앰피실린, 클로르암페니콜에 대한 광범위한 내성(저항성)이 발견되어 치료효과가 상당히 떨어지고 있는 실정이다. 지금까지 조류 대장균의 백신은 대장균이 발생한 농장에서 균을 분리하여 불활화 시켜 백신을 제조한 후 발생 농장에 접종하는 자가백신의 형태로 공급되고 있지만 이러한 방법은 발병 후 사후 대책이므로 피해를 사전에 예방할 수 없고, 상기 자가백신의 효과 및 안전성은 전혀 검증되지 않고 있다. 특히 오일(oil) 부형제를 사용하고 있어 접종 후 접종부위의 증대 등으로 인한 활동성 감소, 증체율의 저하등 부작용이 관찰되고 있다.

조류 대장균은 다양한 혈청형으로 분류되고 있고, 최근까지 국내외의 유행 대장균 혈청형은 O1, O2, O78로 알려져 있으나, 이를 예방하기 위한 효과적인 백신의 개발은 아직까지 초보적인 기술단계에 있다.

한편, aroA 유전자를 결실시킨 E. coli O78을 항원으로 하여 제조된 백신이 상용화 되어 있으나, 이러한 백신은 다양한 혈청형의 감염 방어를 하지 못하기 때문에 광범위한 방어능을 나타내는데 제한적이다.

따라서, 상기와 같은 종래의 조류 대장균 백신이 가지는 단점을 극복하고, 백신접종의 부작용을 최소화한 조류대장균증 예방 백신에 대한 새로운 연구가 필요하다.

본 발명자들은 조류 대장균 감염증 예방용 백신 조성물에 대하여 연구하던 중, 내독소와 관련된 msbB 유전자가 결손된 E. coli O1, O2 및 O78 균주를 혼합하여 적용할 경우 세 균주로부터의 감염을 동시에 방어가 가능하며, 내독소 관련 부작용이 현저히 감소되어, 조류 대장균 감염증의 예방에 유용하다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명은 msbB 유전자가 결손된 E. coli O1, O2 및 O78 균주를 포함하는 조류 대장균 감염증 예방용 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O1 균주, msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O2 균주 및 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O78 균주를 포함하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 대장균 감염증 예방용 백신 조성물을, 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장균 감염증 예방 방법을 제공한다.

본 발명의, 내독소 관련 msbB　유전자가 결손 된 E. coli O1, E. coli O2 및 E. coli O78를 포함하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물은, 상기 3가지 혈청형의 감염을 동시에 방어할 수 있고, 내독소인 지질 A(lipid A)에 의한 백신의 부작용을 현저히 감소시켰다. 또한, 기존 오일성 백신 조성물의 부작용 또한 보완할 수 있으므로, 대장균 감염증의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 자살벡터(Suicide vector)로 형질전환된 E. coli (WM3064 pRE112△msbB)를 나타낸 도이다.
도 2는 msbB유전자를 접합(conjugation)하여 결손시키는 것을 도식화한 도이다.
도 3은 E. coli O1 msbB 변이주를 전기영동 하여 확인한 도이다. WT는 Wild Type E. coli O1을 나타낸 것이고 1~14번 레인은 msbB 변이주를 나타낸 것이다.
도 4는 E. coli O2 msbB 변이주를 전기영동 하여 확인한 도이다. WT는 Wild Type E. coli O2를, 1~14번 레인은 msbB 변이주를 나타낸 것이다.
도 5는 E. coli O1 msbB 변이주의 염(salt)에 대한 감수성을 확인한 도이다.
도 6은 E. coli O2 msbB 변이주의 염(salt)에 대한 감수성을 확인한 도이다.
도 7은 람다 레드 재조합 방법을 통해 유전자를 결손시키는 방법을 도식화한 도이다.
도 8은 E. coli O78 msbB 변이주를 전기영동 하여 확인한 도이다. WT는 Wild Type E. coli O78을, 1~12번 레인은 msbB 변이주를 나타낸 것이다.
도 9는 E. coli O78 msbB 변이주의 염(salt)에 대한 감수성을 확인한 도이다.
도 10은 E. coli O1, O2, O78 야생형주와 msbB 변이주의 LPS 차이를 확인한 도이다.
도 11은 E. coli O1 불활화 항원에 대한 E. coli O1의 특이적인 IgG 항체가를 비교한 도이다. (시험백신 접종군과 상용백신 접종군의 유의도를 표시함. ***= p<0.001)
도 12는 E. coli O2 불활화 항원에 대한 E. coli O2의 특이적인 IgG 항체가를 비교한 도이다. (시험백신 접종군과 상용백신 접종군의 유의도를 표시함. *= p<0.05, ***= p<0.001)
도 13은 E. coli O78 불활화 항원에 대한 E. coli O78의 특이적인 IgG 항체가를 비교한 도이다. (***= p<0.001)
도 14는 E. coli O1 불활화 항원에 대한 면역 지속능을 나타낸 도이다. (시험백신 접종군과 상용백신 접종군의 유의도를 표시함. *=P<0.05, **= p<0.01)
도 15는 E. coli O2 불활화 항원에 대한 면역 지속능을 나타낸 도이다.
도 16은 E. coli O78 불활화 항원에 대한 면역 지속능을 나타낸 도이다. (시험백신 접종군과 상용백신 접종군의 유의도를 표시함. *=P<0.05, **= p<0.01)

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O1 균주, msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O2 균주 및 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O78 균주를 포함하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.

상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O1는 수탁번호 KCTC 18719P일 수 있고, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O2는 수탁번호 KCTC 18718P일 수 있고, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O78 균주는 수탁번호 KCTC 18717P 일 수 있다.

본 발명의 용어 '예방'이라 함은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 대장균 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

또한 본 발명의 용어 '백신'이라 함은 항원, 즉 병원체를 약하게 만들어 인체 또는 동물에 주입하여 항체를 형성하게 하여 그 질병에 방어, 면역성을 가지게 하는 의약품을 총칭하는 것으로, 백신의 종류는 완전히 병원체를 죽여 만드는 불활화 백신과 병원성을 약독화시킨 생백신이 있다.

이 중 불활화 백신은 병원체를 정제한 후 가열하거나, 자외선 조사 또는 포르말린이나, 알킬화 시약 등의 약품을 이용하여 병원성 미생물을 죽여서 만든 백신으로, 불활성화 할 때에 세균이 복제될 수 없게 만들지만 생물체 표면에 존재하는 항원의 구조를 그대로 유지시키는 것이 중요하다. 불활성화 백신은 주로 체액성 면역만을 유도하지만 안전성이 높아서 백신 접종의 부작용이 거의 없으며 다가 백신으로서 응용 가능성이 있다.

본 발명의 대장균 감염증 예방용 백신 조성물은 불활화 백신 조성물일 수 있다.

본 발명에서 유전자를 결손하는 방법은 유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다. 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화 시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 병원성 유전자를 가장 확실하게 불활성화하기 위해 마지막 방법인 염색체내의 염기서열을 모두 결손하는 방법을 사용하였다. 유전자군을 결손하는 방법은 대장균 유전자 결손 방법으로 널리 알려진 Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소(lamda Red recombinase)를 이용한 1 단계 불활성화방법(Onestep deletion method)을 이용할 수 있고, 병원성 유전자를 결손시킨 플라스미드로 형질전환한 E. coli주와 접합(conjugation)하는 방법 일 수 있다.

상기 msbB 유전자는 대장균 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)합성과 관련된 유전자이며, 아실전이효소(acyltransferase)로서 지질 A(lipid A)전구체에 미리스트산(myristic acid)를 첨가하는 역할을 한다. 이 효소의 결핍시 숙주의 톨-유사수용체(Toll-like receptor, TLR)와의 상호작용에 영향을 주어, 세균의 세포 내 생존 및 병원성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 세균의 생존 또는 병원성에 필수적인 유전자를 결실시켜 숙주 세포내에서의 생존율을 감소시키는 효과를 달성할 수 있다.

상기 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 lipid A와 폴리사카라이드(polysaccharide)가 주체를 이루는 대형 분자로, 그람 음성 박테리아의 외막에서 발견되고, 인간을 포함한 개체에 대하여 면역반응을 유도함으로써 내독소로 작용한다.

본 발명에서 '지질 A (lipid A)'는 지질다당류의 주요 구성요소로서, 백신 균주의 lipid A의 생성이 감소되면, 내독소(endotoxin)인 LPS가 저감되어 내독소 LPS로 인한 백신의 부작용이 감소한다.

본 발명의 msbB 유전자가 결손된 E. coli 균주는 지질 A의 생성이 저감된 E. coli 균주로서, 숙주 세포 내에서 생존율 및 병원성이 감소된 균주이며, 본 발명의 대장균 감염증 예방용 백신 조성물은 지질 A를 생산하는 msbB 유전자가 결손된 E. coli균주를 백신균주로 사용하여 내독소인 LPS가 저감된 바, 기존 E. coli 백신의 부작용을 일으키지 않아 종래 백신보다 우수한 효과를 나타낸다.

본 발명의 상기 대장균 감염증은 E. coli O1, E. coli O2, E. coli O78으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세균에 의해 감염되는 것일 수 있으며, 상기 대장균 감염증은 조류 대장균증(avian colibacillosis)일 수 있다. 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아, 거위 및 꿩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있고, 상기 조류 대장균증은 국소적 또는 전신적 감염증으로서 패혈증, 육아종, 기낭염, 수란관염, 관절염 등의 다양한 질병을 유발할 수 있다. 상기 대장균 감염증을 예방함으로써, 조류에게서는 소화계통 질병 및 질병으로 인한 폐사를 예방하고, 사람에게서는 인체 대장균 감염증 및 식중독을 예방할 수도 있다.

본 발명의 상기 백신 조성물은 msbB　유전자가 결손된 E. coli O1, E. coli O2 및 E. coli O78 균주를 다양한 비율로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1:0.5 내지 2:0.5 내지 2의 CFU 비율로 포함할 수 있고, 더욱 바람직 하게는 1:1:1의 CFU 비율로 포함할 수 있다. 각 돌연변이 균주는 백신 조성물 내에 1×10⁷ 내지 1×10¹¹ (colony forming unit, CFU)/dose씩 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1×10⁸ 내지 1×10¹⁰ (colony forming unit, CFU)/dose씩 포함될 수 있고, 더욱 바람직하게는 1×10⁹ (colony forming unit, CFU)/dose씩 포함 될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역보조제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 백신 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다.

상기 부형제는 애쥬번트(adjuvant)라고도 불리며, 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다. 불활화 백신의 제작시 부형제의 선발은 백신 효능의 중요한 원인이 된다.

일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 당분야에 공지된 부형제를 제한없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 오일 및 겔을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 오일 및 수산화 알루미늄 겔을 포함할 수 있다. 상기 오일과 겔의 혼합 비율은 겔의 함유량이 많을 수록 부형제의 성상이 안정되고, 백신 부작용이 적어지며, 세포 응집도 약하게 나타나는 것을 특징으로 한다. 상기 오일과 수산화 알루미늄 겔은 바람직하게는 오일 및 수산화 알루미늄 겔을 1:3 내지 5의 부피비로 하여 추가적으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 오일 및 수산화 알루미늄 겔을 1:4의 부피비로 하여 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 msbB 유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이 균주와 부형제의 부피비는 3:5 내지 9의 부피비로 설정하여 바람직하게 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3:7의 부피비로 설정하여 수행될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.

경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다.

경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따라, 상기 백신 조성물을, 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장균 감염증 예방 방법이 제공된다.

상기 제작한 백신 및 백신을 포함하는 백신조성물은 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 점막 내 투여할 수 있으며, 바람직하게는 1차 접종 후, 일정 기간 경과 후 2차 접종하여, E. coli O1, E. coli O2, E. coli O78에 대한 체액성 면역(humoral immunity)반응을 유도할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예1. 조류 대장균(APEC)의 분리주 동정 및 백신 균주의 선정.

국내 양계장의 대장균증에 감염된 닭에서 각각의 장기에서 면봉을 이용하여 샘플을 채취하고, 1차적으로 맥콘키(MacConkey) 고체배지에 배양한 후 각 콜로니를 API 20E kit 및 PCR(polymerase chain reaction)로 동정하여 조류 대장균(APEC)으로 동정된 균주를 확보하였다.

확보한 조류 대장균 분리주를 대상으로 PCR을 통한 혈청형 분석, 항생제 감수성 시험 및 병원성 유전자 시험을 진행하여, Lipid A 저감 변이주를 제작하기에 적합한 백신 균주를 선정하였다. 선정된 백신 균주에 대한 것을 표 1에 나타내었다. 선정된 하기 표 1의 균주를 이용하여 이하 실시예를 수행하였다.

실시예 2. E. coli O1, O2 및 O78 혈청형에 대한 Lipid A 저감 변이주의 제작.

백신 부작용을 감소시키기 위해, E. coli의 lipid A 생합성 관련 유전자인 msbB를 결손시키면 내독소 관련 부작용이 현저히 감소할 것이라는 가설 하에, E. coli O1, O2 및 O78 혈청형에 대한 Lipid A 저감 변이주를 제작하였다. 이를 위한 대상 E. coli O1, O2 및 O78 혈청형은 상기 표 1의 균주를 사용하였다.

2.1 E. coli O1 및 E. coli O2의 Lipid A 저감 변이주 제작을 위한 msbB 유전자 결손 변이주의 제작.

Lipid A 저감변이주는 람다 레드 재조합 시스템(λ Red-recombinase system)을 이용하여 제작하는 것을 계획하였으나, 이 방법을 통해 재조합하기 위해서는 분리주가 모두 Kanamycin과 Tetracycline에 감수성을 나타내야 하는데 대부분의 균주가 두 항생제에 저항성을 나타내 사용할 수 없었다. 따라서 일부 E. coli O1 및 O2 균주가 Chloramphenicol항생제에 감수성을 나타내는 것을 활용하여 접합(Conjugation) 방법으로 E. coli O1 msbB 변이주 및 E. coli O2 msbB 변이주를 제작하였으며, 제작과정에서 사용된 프라이머 서열 및 정보를 표 2에 나타내었다.

2.1.1 msbB가 결손된 자살벡터 및 자살벡터로 형질전환한 대장균주(WM3064) 제작.

msbB 유전자 결손을 위한 자살 벡터를 제작하였다. msbB 유전자를 변이시킨 벡터인 pBluescriptIIKS(+)△msbB에서 제작한 2.1 kb 크기의 SalI-NotI cassette를 pRE112의 SalI과 NotI sites에 클로닝한 후 만들어진 자살벡터 pRE112△msbB를 WM3064라고 불리는 λpir lysogen of strain에 형질전환하였다. 형질전환한 WM3064주를 프라이머 P12-pRE-F와 P13-pRE-R을 사용하여 집락(colony) PCR수행하여 스크리닝하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 형질 전환된 WM3064주는 2042bp DNA 밴드가 확인되었으며, 형질전환되지 않은 야생형 WM3064주는 104bp의 DNA 밴드가 확인되었다.

2.1.2 E. coli O1 msbB 변이주 및 E. coli O2 msbB 변이주 제작 및 동정.

2.1.1에서 제작한 형질 전환된 WM3064주와 E. coli 01 또는 E. coli 02를 접합(conjugation)하는 방법으로 E. coli O1과 E. coli O2의 msbB 유전자를 결손 시켰다. 구체적으로 제작된 플라스미드 pRE112△msbB를 E. coli O1과 O2의 msbB 유전자와 동종교환(allelic replacement) 시키기 위해 대장균 WM3064내에 있는 pRE112△msbB 자살벡터를 E. coli O1과 O2에 접합(conjuation) 하기 위한 plate filter mating method 수행하였으며 그 과정을 도 2에 도식화하여 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 2회의 교잡(crossover)을 거쳐 E. coli O1 msbB 변이주 및 E. coli O2 msbB 변이주가 제작되었다. msbB 변이주 만을 선별하기 위해, 클로람페니콜에는 감수성이 있고, primers P5-P7을 사용한 PCR에는 증폭이 되는 콜로니를 선발하였으며, E. coli O1 msbB 변이주의 PCR 결과를 도 3에 나타내었으며, E. coli O2 msbB 변이주의 PCR 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 2.2kb에서 E. coli O1 msbB 변이주의 DNA 밴드를 확인하여, E. coli O1 msbB 변이주의 제작을 완성하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 2,191bp에서 E. coli O2 msbB 변이주의 DNA 밴드를 확인하여, E. coli O2 msbB 변이주의 제작을 완성하였다.

2.1.3 E. coli O1 msbB 변이주 및 E. coli O2 msbB 변이주의 염 감수성 조사.

msbB 결손변이주의 특성을 확인하고자 염(salt)이 첨가된 LB agar와 염 부재 (salt-free) LB agar에서 증식성의 차이를 확인하였다. 구체적으로, E. coli O1 msbB 변이주와 E. coli O2 msbB 변이주를 37℃에 18시간 배양하였으며, E. coli O1 msbB 변이주에 대한 결과를 도 5에 나타내었으며, E. coli O2 msbB 변이주에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 5와 도 6에 나타난 바와 같이, E. coli O1 msbB 변이주와 E. coli O2 msbB 변이주 모두 염(salt)이 첨가되지 않은 배지에서 자란 집락에 비해 염이 첨가된 배지에서 자란 집락의 크기가 다소 작았다. 이에 비해 야생형 (wild type)의 E. coli O1 및 O2는 동일한 염농도가 첨가된 배지에서 집락의 크기의 변화가 없었다. 이러한 결과를 통해 E. coli O1 msbB 변이주 및 E. coli O2 msbB 변이주가 염에 대해 감수성이 있음을 확인하였다.

2.2 E. coli O78의 Lipid A 저감 변이주 제작을 위한 msbB 유전자 결손 변이주의 제작.

2.2.1 E. coli O78 msbB 변이주 제작 및 동정.

E. coli O78의 경우, 테트라사이클린(Tetracytlcine), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 카나마이신(Kanamycin)과 암피실린(Ampicillin)에 감수성이 있기 때문에 람다 레드 재조합(λ Red recombination) 방법으로 E. coli O78 msbB 변이주를 제작하였다. 람다 레드 재조합 과정에 대해 도식화한 것을 도 7에 나타내었으며, 람다 레드 재조합 과정에 사용한 플라스미드는 표 3에 나타내었다. 또한, E. coli O78 msbB 변이주 확인에 사용된 프라이머 서열 및 정보를 표 4에 나타내었다. 대상 E. coli O78주로는 국내 분리주인 HID 5013주를 이용하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 람다 레드 재조합을 통해 E. coli 078 msbB 변이주를 제작하였다. 구체적으로 레드 헬퍼 플라스미드를 운반하는 형질전환주를 테트라사이클린이 첨가된 5-ml SOB(super optimal broth)배지에 접종한 후, 37℃에서 배양한 뒤 OD₆₀₀에서 흡광도 0.6이 될 때 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가한 뒤 냉동한 10% 글라이세롤로 3회 세척을 하고 100배로 농축시켜 수용성 세포(competent cell. CP cell)를 제작하였다. msbB 유전자를 PCR 증폭한 후 겔(gel) 정제하고, DpnI으로 소화 후 다시 재 정제하여 용리 완충액(elution buffer, 10 mM Tris, pH 8.0)에 부유시켰다. 상기 수용성 세포(CP cell) 60μl와 정제한 10-100ng의 PCR산물을 혼합한 뒤 마이크로펄서(MicroPulser)를 사용하여 전기천공(Electroporation)하여 PCR 산물을 수용성 세포내로 삽입하였다. 1ml SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression)를 첨가한 뒤 37℃ 1시간 배양한 후 클로람페니콜 또는 카나마이신을 첨가한 LB배지에 접종한 후 클로람페니콜 또는 카나마이신 저항성이 있는 형질전환주를 선발하였다. 형질전환주들은 msbB-con-F와 msbB-con-R 프라이머를 사용하여 집락(colony) PCR을 실시하였다. 집락을 20μl 증류수에 부유한 뒤 5μl를 PCR에 사용하였다. 형질전환주의 항생제 내성유전자의 제거를 실시하였다. 구체적으로, pCP20는 암피실린 내성 유전자와 클로람페니콜 내성 유전자가 있는 플라스미드이며, 온도감수성 증식능 (Temperature-sensitive replication)을 지니고 있고 FLP 합성를 위해 온도를 높여야 한다. 클로람페니콜 내성 유전자(CmR)와 카나마이신 내성 유전자(KmR) 변이주에 pCP20를 형질전환 시킨 후, 암피실린 저항성을 지닌 형질전환주를 30℃에서 배양 후, 임의로 배양된 집락을 선발하여 43℃에서 배양을 한 후 항생제 내성이 소실되는지를 확인한다. FRT-flanked resistance 유전자와 FLP 헬퍼 플라스미드가 동시에 소실된 형질전환주를 msbB-con-F와 msbB-con-R를 사용한 집락(colony) PCR을 사용하여 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 373bp의 DNA 밴드가 형성된 것을 통해 항생제 내성 유전자가 제거된 E. coli O78 msbB 변이주가 제작된 것을 확인하였으며, 항생제 내성 유전자가 제거되지 않은 E. coli O78 msbB 변이주는 1336bp의 DNA 밴드가 형성되고, 야생형의 E. coli O78은 1037bp의 DNA 밴드가 형성된 것을 확인하였다.

2.2.2 E. coli O78 msbB 변이주의 염 감수성 조사.

제작된 msbB 결손변이주의 특성을 확인하고자 염(salt)이 첨가된 LB agar와 염부재 (salt-free) LB agar에서 증식성의 차이를 확인하기 위해 선정된 변이주를 37℃에 18시간 배양하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, E. coli O78 msbB 변이주의 경우, 염(salt)이 첨가되지 않은 배지에서 자란 집락에 비해 염이 첨가된 배지에서 자란 집락의 크기가 다소 작은 것을 확인하였으나, 야생형(wild type)의 대장균은 동일한 염농도가 첨가된 배지에서 집락의 크기의 변화가 없음을 확인하여, E. coli O78 msbB 변이주가 염에 대해 감수성이 있음을 확인하였다.

최종적으로 실시예 2.1 및 실시예 2.2에서 E. coli 01 msbB 변이주(HID 5775), E. coli O2 msbB 변이주(HID 5754), E. coli 078 msbB 변이주(HID 5726)를 제작하였으며, 이를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였고, 수탁번호를 표 5에 나타내었다.

2.3 E. coli O1 msbB 변이주, E. coli O2 msbB 변이주 및 E. coli O78 msbB 변이주의 LPS (lipopolysaccharide) 패턴 분석.

상기 제작한 E. coli O1 msbB 변이주, E. coli O2 msbB 변이주 및 E. coli O78 msbB 변이주에서 msbB 유전자 변이에 따라 Lipid A의 생성이 줄어들었는지 확인하기 위하여 LPS 패턴을 분석하였다.

2.3.1 E. coli O1 msbB 변이주, E. coli O2 msbB 변이주 및 E. coli O78 msbB 변이주의 LPS 추출.

각 변이주의 LPS를 Hot phenol-water 추출법(Westphal & Jann, 1965)을 이용하여 추출하였다. 각 msbB 변이주를 LB배지에 1/100비율로 배양한 후 4℃에서 25분간 12,000rpm으로 원심분리하였고, TAE(40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 8.0)용액으로 원심분리 후 형성된 펠렛을 풀어주었다. 이후에 lysis(0.1 M SDS, 50 mM Tris, 0.128 M NaOH)용액을 첨가하여 5분간 실온에서 반응하였다. LPS를 분리하기 위해, 65℃에서 15분간 가열된 페놀, 클로로포름, 이소아밀알콜을 25:24:1로 혼합한 용액을 첨가하였고, 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였다. LPS를 침전시키기 위해, 3M sodium acetate (pH 5.6)와 차가운 95% 에탄올을 첨가하였고, -20℃에서 하루 보관하였다. 그 후, 원심분리하여, LPS침전물을 얻은 후, RNase, DNase 그리고 proteinase K를 첨가하여, 순수한 LPS를 정제 추출하였다.

2.3.2 E. coli O1 msbB 변이주, E. coli O2 msbB 변이주 및 E. coli O78 msbB 변이주의 LPS 분석.

각 msbB 변이주에서 추출한 LPS의 구조를 관찰하기 위하여 16% 디옥시콜레이트-폴리아크릴아마이드젤(DOC-page gel)법을 사용한 전기영동법 및 silver staining법으로 LPS 구조를 관찰하였으며(Komuro & Galanos, J.Chromatogr. 1988), 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, core의 크기가 msbB-변이주에서 적은 것으로 나타났고, 래더(ladder) 모양으로 나타나는 O-saccharide도 줄어든 것을 확인하여, E. coli O1, E. coli O2, E. coli O78의 야생형과 msbB 변이주간에 LPS의 코어(core)부분에서 차이가 발생하여, 야생형에 비해 msbB 변이주에서 lipid A가 저감되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 백신 시제품의 제작 및 백신의 불활화 확인.

실시예 2에서 제작한 E. coli O1 msbB 변이주(HID 5775), E. coli O2 msbB 변이주(HID 5754) 및 E. coli O78 msbB 변이주(HID 5726)를 MSB(Mitis-Salivarius-Bacitracin) 배지에 활성배양한 후 2회 계대배양하였다. 각 변이주를 1L MSB배지에 1/100 비율로 접종한 후, 37℃에서 18시간이상 진탕 배양하였다. 각 변이주 용액을 PBS(pH 7.2)버퍼로 3회 세척하여, 최종 1 Ｘ 10⁹ CFU/ml로 항원양을 맞췄다. 그 후, 각 균을 불활화시키기 위해, 포르말린(formalin)을 0.3%가 되도록 첨가한 후 48시간동안 상온에서 불활화 하였다.

균주의 불활화를 확인하기 위해, 포르말린 처리 후 24시간, 48시간째 0.1ml씩 MSB 또는 Blood 고체배지에 접종하여 불활화 여부를 확인하였다.

MSB 또는 Blood 고체배지에 접종하여 37℃로 24시간 배양한 결과 집락이 형성되지 않은 것을 확인하여, 불활화 되었음을 확인하였다.

균주 불활화 확인 후, 사용직전까지 4℃에서 보관하였으며, 사용직전에 오염여부를 확인하였다. 백신 제작을 위한 부형제로 오일과 겔(Aluminium hydrogel)을 1:4의 비율로 혼합한 유중수(oil in water) 부형제를 사용하였다. 또한, 표 6에 나타난 바와 같이 최적의 시제품을 제조하기 위하여 E. coli O1 msbB 변이주(HID 5775), E. coli O2 msbB 변이주(HID 5754) 및 E. coli O78 msbB 변이주(HID 5726)를 각각 1:1:1 (CFU 기준)의 비율로 혼합하였으며, 항원과 부형제는 3:7 (v/v)의 비율로 하여, 임상시험용 E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 시제품을 제작하였다.

실시예 4. E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 안전성 평가.

백신 개발 시 가장 주요시되는 요인인 백신 안전성 평가를 위해, 닭에 상기 방법에서 제조한 시제품백신을 2배 접종한 후, 닭의 체온 측정 및 활동성을 평가하였다. 3주령 병아리 26수를 구입하여 사용하였다. 동물 실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KW-180517-1)하에 실시하였고, 모든 실험은 동물실험윤리지침을 준수하였다. 실험을 위해 실험동물을 총 3군으로 분류하였으며, 각각의 시험군은 표 7에 나타내었다.

시험백신 및 각각의 대조군의 접종은 병아리 3주령에 0.5 ml씩 1회 다리근육 접종을 수행하였다. 시험 백신 접종 후 접종 전과 접종 후 3일 후 체온을 측정하였고 기립불능과 운동성 저하, 폐사 등은 2주간 꾸준히 관찰하였다. 시험백신 안전성 평가를 위해, 시제품백신을 2도스 접종군과 부형제 접종군, 비접종 대조군의 체온 측정과 기립불능과 운동성 저하, 폐사를 모니터링한 결과를 표 8에 나타내었다.

표 8에 나타난 바와 같이, 체온 측정은 접종 전과 접종 후 차이가 없었고 시험군 간의 차이도 없었다. 활동성에 있어서도 시험군 간의 차이점이 전혀 없는 것을 확인하였다.

실시예 6. E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 평가시, 비교군으로 사용하기 위한 세포 전체 단백질 항원(Whole bacterin, WB)의 추출

E. coli O1, O2, O78 혈청형의 균주를 LB(Luria-Bertani, USA) 한천배지에 배양(37 ℃, 18h) 후 단일 집락(single colony)을 LB 배양액(broth)에 접종한 후 37 ℃에서 18시간 배양을 실시하였다. 이 배양액을 1L LB 배양액(broth)에 접종한 후 37 ℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 0.3% 포르말린으로 48시간 불활화 하여 하였으며, 6,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 PBS로 3회 세척하여 침전된 펠렛을 PBS로 부유시킨 후 -20 ℃에서 보관하였다. 항원 농도를 측정하기 위하여, BCA protein assay kit(Pierce, U.S.A)을 사용하였고 제조회사에서 제공하는 실험방법대로 진행하였다.

실시예 7. E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 생산성 평가.

7.1 E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 접종에 따른 증체율 평가.

백신 개발시 중요시되는 요인인 백신 생산성 평가를 위해, 3주령의 병아리에 제조한 시험백신 접종군 (E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신), 상용백신 접종군 (포울백 이콜라이(Poulvac E. coli, ㈜조에티스, 한국)), 실시예 6에서 제작한 세포 전체 단백질 항원 (Whole bacterin, WB) 백신 접종군, 비접종 음성 대조군 사이의 증체량을 측정하였다. 동물 실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KW-180517-1)하에 실시하였고, 모든 실험은 동물실험윤리지침을 준수하였다.

실험을 위해 실험동물을 총 4군으로 분류하였으며, 각각의 시험군은 표 9에 나타내었다.

백신 접종은 3주령과 5주령에 2회 다리근육 접종하는 방법으로 수행하였으며, 체중 측정은 백신 접종 전후로 3, 5, 7, 10, 13, 16 주 동안 측정하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다

표 10에 나타난 바와 같이, 비접종 음성 대조군에 대비하여 증체율을 계산 한 결과, 시험 백신 접종군은 비접종 음성 대조군에 비해 약간 증체가 된 것으로 확인되었다. 그러나, 단지 개체별에 대한 차이가 크기 때문에 시험군 간의 비교는 유의적이지 않은 것으로 판단되었다. WB백신 접종군은 지당체(LPS)의 존재로 부작용이 관찰되었고, 그로 인해 식욕 감소가 나타나 음성대조군에 비해 87.2%의 증체율이 확인되었다. 이러한 결과는 현재 자가백신의 형태로 사용하는 대부분의 백신에서 나타나는 부작용을 WB 백신 접종군에서 확인한 것에 해당한다. 따라서, msbB 유전자 결실을 통해 lipid A 저감시킨 불활화 백신이 종래 상용 백신 대비 부작용을 해소 가능한 것을 확인하였다.

상용백신 접종군과 시험백신 접종군은 거의 동일한 증체율을 보이는 것으로 나타났으며 음성대조군에 비해 증체율이 유의성있는 차이는 보이지 않았지만 증가된 경향을 확인하였다.

7.2 E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 접종에 따른 사료섭취율 비교.

닭에서 백신 안전성 평가를 위해, 백신 접종 후 사료섭취율을 평가하였다. 시험백신 접종 전 (3주령)과 시험 백신 2차 접종 10주 후(16주령)까지 매주 제공되었던 사료량을 계산을 한 결과, 체중에 따라 필요한 사료량이 달라지기 때문에 사료 섭취율에 대해서 유의적인 차이는 없는 것을 확인하였다.

실시예 7.1과 7.2를 종합하면, E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 접종은 증체율과 사료 섭취율의 감소가 확인되지 않고, E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 접종에 의한 부작용은 없으며, 생산성은 증대되는 것으로 확인하였다.

실시예 8. E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 방어능 평가.

8.1 E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 방어능 평가를 위한 실험군 설정.

8.1.1 상용백신(Poulvac E.coli) 접종군.

E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 방어능 평가를 위해, 대조군 중 하나로 E.coli O78 예방 백신으로 사용되는 포울백 이콜라이(Poulvac E.coli, ㈜조에티스, 한국)을 설정하였다. 포울백 이콜라이는 aroA 유전자를 결손시킨 E.coli O78 균주(EC34195주)로 제작한 약독화 백신이다. 상용백신 접종군은 상용백신을 제조회사의 권장용량대로, 3주간격으로 1수분 용량을 안와 접종 하였다.

8.1.2 세포 전체 단백질 항원(Whole bacterin, WB)백신 접종군.

E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신 방어능 평가를 위해, 대조군 중 하나로 실시예 6에서 추출한 방법으로 WB를 추출하고, WB와 실시예 3의 부형제를 3:7의 비율로 혼합하여 WB 백신을 제조하였다.

WB 백신 접종군은 0.5ml/dose씩 근육 내 접종을 3주령 및 5주령에 실시하였다.

8.1.3 백신 비접종 공격군

백신 비접종 공격군은 백신 접종 없이 공격 접종만 실시하였다.

8.1.4 음성대조군

음성 대조군은 백신 접종 및 공격 접종 모두 실시하지 않았다.

8.1.5 시험백신 접종군

실시예 4에서 제작한 E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신을 0.5ml/dose씩 근육 내 접종을 3주령 및 5주령에 실시하였다.

8.2 공격 접종 후 E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 방어능 평가.

E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 목적동물에서의 방어능 평가를 위하여, 공격접종 후 목적동물인 닭의 표적 장기에서 균 양성율 및 생존율을 확인하고자, 3주령 병아리 188수를 구입하여 사용하였다. 동물 실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KW-180517-1)하에 실시하였고, 모든 실험은 동물실험윤리지침을 준수하였다. 실험동물을 총 5군으로 분류하였으며, 각각 시험군은 표 11에 나타내었다.

시험백신접종군과 WB 백신 접종군, 상용백신 접종군은 3주령 및 5주령에 백신 접종을 하고 2주 후(7주령)에 공격접종 하였다. 백신비접종공격군은 백신 접종 없이 7주령에 공격접종을 하였고 음성대조군은 백신접종 및 공격접종을 하지 않았다. 공격 접종 후, 각 시험군의 폐사수를 측정하여 폐사율을 측정하였으며, 공격 접종 2주 후, 간, 비장에서 멸균된 면봉을 이용하여 맥콘키(MacConkey) 고체배지에 접종하여 배양한 후 각각의 집락을 공격균주의 항생제 선택배지에 배양하여 양성율을 측정하여, 그 결과를 표 12에 나타내었다.

표 12에 나타난 바와 같이, 음성대조군에서는 병변/세균 양성율과 폐사율 모두 0%로 나왔고, E. coli O1을 공격접종한 시험군 중에서 백신 비접종 공격군과 상용백신 접종군은 양성율이 93.4%와 93.3%로 높게 나왔다. 반면 WB 접종군은 양성율이 80.7%이었고, 시험백신 접종군의 양성율이 73.3%로 가장 적게 나타났다. E. coli O2로 공격 접종한 시험군 중에서 백신 비접종 공격군과 상용백신 접종군은 양성율이 86.8%와 86.7%로 비슷하게 높게 나왔다. WB접종군은 양성율이 80.0%이었고 시험백신접종군의 양성율은 73.3%로 가장 적게 나타났다. E. coli O78으로 공격 접종한 시험군 중에서는 백신 비접종 공격군은 양성율이 100%로 관찰되었고 상용백신접종군은 양성율이 86.6%로 두 번째로 높았으며 시험백신 접종군의 양성율이 80.0%로 세 번째였으며 WB접종군이 66.7%로 가장 양성률이 낮은 것으로 확인되었다.

8.3 E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 면역능 평가.

실시예 8.1의 시험군에서 채혈한 혈청을 사용하여 IgG 항체가를 평가하였다. 구체적으로, 닭의 경정맥에서 격주 간격으로 채혈을 수행하였으며, 상기과정에서 얻은 혈액 샘플은 7000rpm으로 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하였으며, -20 ℃에서 ELISA로 분석할 때까지 보관하였다. 혈청에서 IgG수준을 평가하기 위해 Indirect ELISA를 실시하였다. 실시예 6에서 불활화 시킨 E. coli O1, O2, O78 혈청형을 코팅항원으로 사용하였고, 0.05M 중탄산나트륨 완충액(sodium bicarbonate buffer, pH 9.6)을 첨가하여, 2.5 ㎍/mL농도로 준비하였다. MaxiSorp 96-well plate(NUNC, Denmark)에 100 ㎕/well씩 분주 후 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 0.05% PBS-Tween20 (PBS-T)로 well을 3회 세척한 후 2% bovine serum albumin (BSA)/PBS 로 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 0.2% BSA/PBS로 희석한 닭 혈청(1차 항체)을 100 ㎕/well씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. IgG 2차 항체(goat anti-chicken HRP conjugated; Bethyl Laboratories, USA)는 35,000배로 희석하여 100 ㎕/well씩 분주하여, 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 각 플레이트를 3회 세척한 후, 3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB; SurModics, USA)를 첨가하여 3분간 암반응 하였으며, 효소-기질반응 종결을 위해 2N 황산(H2SO4)을 첨가하였다. 이후 ELISA microplate reader(Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여, well의 흡광도 (OD₄₅₀nm)를 측정하였다. 측정한 흡광도를 바탕으로, E. coli O1에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 11에 나타내었으며, E. coli O2에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 12에 나타내었고, E. coli O78에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 13에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, E. coli O1 불활화 항원(Whole bacterin)에 대한 E. coli O1의 특이적인 IgG 항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신 접종군의 IgG 항체가(OD₄₅₀값)가 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 3.5배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 4.0배 높게 나왔다. 그리고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 2.5배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 3.0배 높게 나왔다. 그리고 시험백신 접종군이 WB 접종군보다 1.4배 효과가 좋은 것으로 나타났다. 42일째 시험백신 접종군이 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 6.6배, 음성대조군보다 6.4배 높게 나타남을 확인하였고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 6.9배, 음성 대조군보다 6.7배 높게 나타남을 확인하였다. 그리고 시험백신 접종군을 WB 접종군과 비교하면 1.0배로 효과가 같게 나타났다.

도 12에 나타난 바와 같이, E. coli O2 불활화 항원(Whole bacterin)에 대한 E. coli O2의 특이적인 IgG항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신 접종군의 IgG 항체가(OD₄₅₀값)가 상용백신접종군의 IgG 항체가보다 3.2배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 2.2배 높게 나왔다. 그리고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 2.9배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 5.9배 높게 나왔다. 그리고 시험백신 접종군과 WB 접종군과 비교하면 시험백신 접종군이 1.1배 효과가 좋은 것으로 나타났다. 42일째 시험백신 접종군이 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 5.9배, 음성 대조군보다 4.5배 높게 나타남을 확인하였고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 6.3배, 음성대조군보다 6.1배 높게 나타남을 확인하였다. 그리고 시험백신 접종군과 WB 접종군을 비교하면 WB 접종군이 1.1배 항체가가 높은 것으로 나타났다.

도 13에 나타난 바와 같이, E.coli O78 불활화 항원(Whole bacterin) 에 대한 E.coli O78의 특이적인 IgG항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신 접종군의 IgG 항체가(OD₄₅₀값)가 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 2.4배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 1.6배 높게 나왔다. 그리고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 2.0배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 1.3배 높게 나왔다. 그리고 시험백신 접종군과 WB 접종군을 비교하면 시험백신 접종군이 1.2배 효과가 좋은 것으로 나타났다. 42일째 시험백신 접종군이 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 4.8배, 음성 대조군보다 3.9배 높게 나타남을 확인하였고 WB 접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 3.5배, 음성대조군보다 2.9배 높게 나타남을 확인하였다. 그리고 시험백신 접종군을 WB 접종군과 비교하면 시험백신 접종군이 1.4배 항체가가 높은 것으로 나타났다.

상기 개발한 백신은 기존 상용화된 백신 포울백 이콜라이(poulvac E. coli,㈜조에티스, 한국)보다 탁월한 항체가를 나타내었으며, 이는 결과적으로 월등한 효과를 가짐을 확인하였다.

8.4 E.coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 장기 면역 지속능 평가.

E. coli O1, O2, O78 3가 불활화 백신의 목적동물에서의 면역지속능 평가를 하기 위하여, 주차별 혈청으로 ELISA방법으로 백신의 면역 지속능을 확인하였다. 3주령 병아리 26수를 구입하여 사용하였다. 동물 실험은 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인(KW-180517-1)하에 실시하였고, 모든 실험은 동물실험윤리지침을 준수하였다.

실험동물을 총 4군으로 분류하였으며, 각각의 시험군은 표 13에 나타내었다.

닭의 경정맥에서 0, 2, 5, 8, 11, 14주 간격으로 채혈을 수행하였으며, 상기과정에서 얻은 혈액샘플은 7000rpm으로 10분간 원심분리한 후 혈청을 분리하였으며, -20 ℃에서 ELISA로 분석할 때까지 보관하였다.

실시예 8.3에서 실시한 ELISA와 동일하게 ELISA를 실시하였으며, 측정한 흡광도를 바탕으로, E.coli O1에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 14에 나타내었으며, E.coli O2에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 15에 나타내었고, E.coli O78에 특이적인 IgG 항체가를 시험군 별로 비교한 그래프를 도 16에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, E.coli O1 불활화 항원(Whole bacterin) 에 대한 E.coli O1의 특이적인 IgG 항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신 접종군의 IgG 항체가(OD450 값)가 상용백신(포울백 이콜라이(poulvac E.coli,㈜조에티스, 한국))접종군의 IgG 항체가보다 3.0배 높게 나왔으며 음성대조군에 비하여 4.5배 높게 나왔다. 그리고 WB백신 접종군의 IgG 항체가는 상용백신접종군의 IgG 항체가보다 1.5배 높게 나왔으며 음성대조군에 비하여 2.3배 높게 나왔다. 35일째가 가장 큰 차이로 시험백신 접종군이 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 4.3배, 음성대조군보다 5.5배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 4.5배, 음성 대조군보다 5.7배 높게 나타남을 확인하였다. 2차 접종 후 10주째인 98일째는 시험백신 접종군이 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 3.4배, 음성대조군보다 3.5배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 3.2배, 음성대조군보다 3.2배 높게 나타남을 확인하였다.

도 15에 나타난 바와 같이, E.coli O2 불활화 항원(Whole bacterin) 에 대한 E.coli O2의 특이적인 IgG 항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신접종군의 IgG 항체가(OD450 값)가 상용백신접종군의 IgG 항체가보다 2.1배 높게 나왔으며 음성 대조군에 비하여 3.1배 높게 나왔다. 그리고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 1.6배 높게 나왔으며 음성대조군에 비하여 2.1배 높게 나왔다. 35일째가 가장 큰 차이로 시험백신접종군이 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 3.8배, 음성대조군보다 5.1배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG항체가는 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 2.5배, 음성대조군보다 3.5배 높게 나타남을 확인하였다. 2차 접종 후 10주째인 98일째는 시험백신접종군이 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 4.7배, 음성대조군보다 4.5배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 2.5배, 음성대조군보다 2.3배 높게 나타남을 확인하였다.

도 16에 나타난 바와 같이, E.coli O78 불활화 항원(Whole bacterin) 에 대한 E.coli O78의 특이적인 IgG 항체가를 비교 측정하였을 때, 백신접종 14일(2주)째 시험백신접종군의 IgG 항체가(OD450 값)가 상용백신접종군의 IgG 항체가보다 1.6배 높게 나왔으며 음성대조군에 비하여 2.5배 높게 나왔다. 그리고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신 접종군의 IgG 항체가보다 1.0배 높게 나왔으며 음성대조군에 비하여 1.6배 높게 나왔다. 35일째가 가장 큰 차이로 시험백신접종군이 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 3.4배, 음성대조군보다 4.8배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 1.8배, 음성대조군보다 2.5배 높게 나타남을 확인하였다. 2차 접종 후 10주째인 98일째는 시험백신접종군이 상용백신 접종군보다 IgG 항체가가 3.2배, 음성대조군보다 2.8배 높게 나타남을 확인하였고 WB접종군의 IgG 항체가는 상용백신접종군보다 IgG 항체가가 2.0배, 음성대조군보다 1.8 배 높게 나타남을 확인하였다.

최종적으로 보면 5주와 8주에는 항체형성능이 가장 높고 13주에는 조금 감소하나, 면역력이 지속됨을 확인할 수 있었고 시험백신접종군과 상용백신군과의 유의성이 있음을 확인하였다.

한국생명공학연구원 KCTC18719P 20181016 한국생명공학연구원 KCTC18718P 20181016 한국생명공학연구원 KCTC18717P 20181016

Claims (13)

1. msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O1 균주, msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O2 균주 및 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O78 균주를 포함하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O1 균주는 수탁번호 KCTC 18719 P이며, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O2 균주는 수탁번호 KCTC 18718 P이고, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O78 균주는 수탁번호 KCTC 18717 P인 것을 특징으로 하는, 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O1 균주, msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O2 균주 또는 msbB　유전자가 결손된 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) O78 균주는 지질 A (Lipid A)가 저감된 것을 특징으로 하는, 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 대장균 감염증이 E. coli O1, E. coli O2 및 E. coli O78으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세균에 의해 감염되는 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 대장균 감염증이 조류 대장균증(avian colibacillosis)인 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아, 거위 및 꿩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 조류 대장균증은 패혈증, 육아종, 기낭염, 수란관염, 및 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질병을 유발하는 것을 특징으로 하는, 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 msbB　유전자가 결손된 E. coli O1, E. coli O2 및 E. coli O78 균주를 1:0.5 내지 2:0.5 내지 2의 CFU 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 부형제로써 오일 및 수산화 알루미늄 겔를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 오일 및 수산화 알루미늄 겔의 부피비가 1:3 내지 5인 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방용 백신 조성물.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 대장균 감염증 예방용 백신 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장균 감염증 예방 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 대장균 감염증이 조류 대장균증인 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아, 거위 및 꿩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장균 감염증 예방 방법.
    

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