KR20200138325A - 이펙터 t 세포를 재프로그래밍하기 위한 히스톤 개질제의 용도 - Google Patents

Abstract

본원의 개시내용은 이펙터 T 세포를 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 IL-21과 배양함을 포함하는, 이펙터 T 세포를 중앙 기억 표현형으로 재프로그래밍하기 위한 방법을 제공한다 . 중앙 기억 T 세포를 투여함을 포함하는 암을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

이펙터 T 세포를 재프로그래밍하기 위한 히스톤 개질제의 용도

[0001] 본 출원은 2018년 3월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/649,265호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 내용 전체가 본원에 참조로 인용된다.

서열 목록의 도입

[0002] 3.81 KB (마이크로소프트 윈도우에서 측정된 바와 같이)이고 2019년 3월 28일자로 작성된 "UTFC.P1311WO_ST25. txt"란 명칭의 파일에 함유된 서열 목록은 전자 제출에 의해 이와 함께 파일링되었고 본원에 참조로 인용된다.

[0003] 본 발명은 일반적으로 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 중앙 기억 표현형을 갖는 T 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다.

[0004] 생체외 활성화되고 확장된 자가 종양-특이적 T 림프구의 투여인 입양 T 세포 치료요법(ACT)은 이전에 통상의 치료요법에 난치성인 전이 흑색종 환자에서 임상 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 환자 반응율은 생체내 주입된 T 세포의 지속성과 상호관련된다. 흔히, 그러나, 말초 혈액 및 종양 부위에서 발견되는 항원-특이적 T 세포는 잘-분화된 이펙터, 이펙터 기억, 및 때로는 매우 제한된 증식능을 갖는 최종 이펙터 세포이다. 중앙 기억 CD8⁺ T 세포는 자기 재생할 수 있고 동시 자극 수용체 CD28 및 다른 기억-연관된 마커 (예를 들어, CD127 및 CD62L)를 고도로 발현할 수 있다(문헌참조: Klebanoff et al., 2005). 따라서, 잘-분화된 이펙터 세포로부터 자기 재생할 수 있는 중앙 기억 T 세포를 생성하기 위한 방법에 대한 필요성이 충족되지 않고 있다. 중앙 기억 표현형을 갖는 이들 T 세포는 생체내 이들의 증가된 지속성으로 인해 높은 반응률을 갖는 ACT에 대해 사용될 수 있다.

발명의 개요

[0005] 본원 개시내용의 특정 구현예는 예를 들어, 재-프로그래밍 또는 탈-분화에 의해 이펙터 표현형을 갖는 T 세포로부터 중앙 기억 표현형을 갖는 T 세포를 생성하기 위한 방법(예를 들어, 시험관내 또는 생체외)을 제공한다.

[0006] 하나의 구현예에서, 항원-특이적 이펙터 T 세포 (T_EFF 세포)를 중앙 기억 T 세포 (T_CM 세포)를 재프로그래밍하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계; 임의로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

[0007] 일부 양상에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 수득하는 단계가 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는 샘플을 대상체로부터 채취하는 단계를 포함한다. 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 CD8⁺ T_EFF 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

[0008] 특정 양상에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 추가로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), T_REG, NK 세포 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), T_REG, NK 세포 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 CD8⁺ T_EFF 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

[0009] 일부 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 CD45RO를 발현한다. 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 CD45RO를 고도로 발현한다. 특정 양상에서, 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 양성, 높은 또는 낮은 발현은 대조군 집단 중에 상기 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 발현 수준에 상대적으로 정의된다. 특정 양상에서, 대조군 집단은 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질에 대해 음성이거나 검출가능하지 않은 수준을 갖는 집단이다. 일부 양상에서, 대조군 집단은 양성, 높은, 또는 낮은 발현을 갖는 집단과 동일한 샘플 중에 있다. 다른 양상에서, 대조군 집단은 양성, 높은 또는 낮은 발현을 갖는 집단을 함유하는 샘플과 실질적으로 유사한 샘플 중에 있다. 예를 들어, CD8⁺ T_EFF 세포 중에 CD45RO의 높은 발현은 대조군 집단의 CD8⁺ T_EFF 세포 중에 CD45RO의 발현 수준에 상대적으로 상승된 발현 수준으로서 정의될 수 있다. 상대적 발현 수준은 특히, 유동 세포측정에 의한 측정시 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 상대적 형광성 신호로서 측정될 수 있다.

[0010] 특정 상황에서, 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 고발현은 낮은 발현 집단에서 결정된 발현 수준 보다 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 (또는 여기에서 유래할 수 있는 임의의 값)배 큰 발현에 상응할 수 있다. 구체적으로, 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 고발현은 대조군 세포 집단의 형광성 신호에 상대적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 (또는 여기에서 유래할 수 있는 임의의 값)배 큰 형광성 신호에 상응할 수 있다. 대조군 세포 집단은 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 낮거나, 검출가능하지 않거나 정상 발현을 갖는 세포 집단일 수 있다. 다른 상황에서, 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 고발현은 낮은 발현 집단에서 결정된 발현 수준 보다 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 또는 10,000 (또는 여기에서 유래할 수 있는 임의의 값)배 큰 발현에 상응할 수 있다. 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 고발현은 대조군 세포 집단의 형광성 신호에 상대적으로 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 또는 10,000 (또는 여기에서 유래할 수 있는 임의의 값)배 큰 형광성 신호에 상응할 수 있다.

[0011] 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 저발현은 상기 표면 마커 또는 항원에 대해 음성이거나 검출가능하지 않을 수 있는 발현 수준에 상응하는 형광성 신호에 상대적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 (또는 본원에서 유래할 수 있는 임의의 값)배 큰 형광성 신호에 상응할 수 있다. 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 저발현은 상기 표면 마커 또는 항원에 대해 음성이거나 검출가능하지 않은 발현 수준에 상응하는 형광성 신호에 상대적으로 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 또는 10,000 (또는 여기서 유래할 수 있는 임의의 값) 배 큰 형광성 신호에 상응할 수 있다.

[0012] 양성 발현은 형광성 신호의 검출과 같은 소정의 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 세포 표면 마커, 항원 또는 단백질의 발현 수준을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은, 높고 낮은 발현 수준 둘다는 양성 발현인 것으로 고려될 수 있다.

[0013] 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-21을 첨가하기 전 HDACi의 존재하에 배양한다. 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-12를 첨가하기 전에 12 내지 48 시간 (예를 들어, 12-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 또는 40-48 시간)동안 HDACi의 존재하에 배양한다. 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-21를 첨가하기 전에 1 내지 3일 (예를 들어, 1. 2 또는 3일) 동안 HDACi의 존재하에 배양한다. 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전에 IL-21의 존재하에 배양한다. 일부 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전에 12 내지 48 시간 (예를 들어, 12-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 또는 40-48 시간)동안 IL-21의 존재하에 배양한다. 특정 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전에 1 내지 3일, 예를 들어, 1. 2 또는 3일동안 IL-21의 존재하에 배양한다. 일부 양상에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 양상에서, 배양은 7 내지 20일(예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일) 동안이다. 일부 양상에서, 배양은 12 내지 16일 (예를 들어, 12, 13, 14, 15, 또는 16일) 동안이다. 특정 양상에서, IL-21은 10 ng/mL 내지 50 ng/mL (예를 들어, 10-20, 20-30, 30-40, 또는 40-50 ng/mL)의 농도로 존재한다. 특정 양상에서, IL-21은 20 ng/mL 내지 40 ng/mL (예를 들어, 20-25, 25-30, 30-35, 또는 35-40 ng/mL)의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, HDACi는 1 nM 내지 5 nM (예를 들어, 1-2, 2-3, 3-4, 또는 4-5 nM)의 농도로 존재한다. 특정 양상에서, HDACi는 2 nM 내지 4 nM (예를 들어, 2, 3, 또는 4 nM)의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, IL-21은 10 ng/mL 내지 50 ng/mL (예를 들어, 10-20, 20-30, 30-40, 또는 40-50 ng/mL)의 농도로 존재하고 HDACi는 1 nM 내지 5 nM (예를 들어, 1-2, 2-3, 3-4, 또는 4-5 nM)의 농도로 존재한다. 특정 양상에서, IL-21은 20 ng/mL 내지 40 ng/mL (예를 들어, 20-25, 25-30, 30-35, 또는 35-40 ng/mL)의 농도로 존재하고 HDACi은 2 nM 내지 4 nM (예를 들어, 2, 3, 또는 4 nM)의 농도로 존재한다.

[0014] 특정 양상에서, HDACi는 고전적 HDACi이다. 일부 양상에서, 고전적 HDACi는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트 (Farydaq®로서 시판됨), 다시노스타트 (LAQ824), 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린(CI994), 및 모세티노스타트 (MGCD0103)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상에서, HDACi는 SAHA이다. 다른 양상에서, HDAC는 파노비노스타트이다.

[0015] 일부 양상에서, 수득한 T_CM 세포는 CD8⁺이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 중 적어도 2개를 발현한다. 일부 양상에서, 수득한 T_CM 세포는 CD8⁺이고 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 중 적어도 2개의 고발현을 갖는다. 특정 양상에서, 수득한 T_CM 세포는 CD8+ 이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 중 적어도 3개를 발현한다(즉, CD8⁺/CD45RO⁺/CD28⁺/CD62L⁺/CCR7⁺이다). 일부 양상에서, 수득한 T_CM 세포는 CD8⁺이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7의 고발현을 갖는다. 특정 양상에서, 수득한 T_CM 세포는 또한 그랜자임 B 및 퍼포린 1의 증가된 수준을 발현한다.

[0016] 추가의 양상에서, 상기 방법은 추가로 T_CM 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 확장은 T_CM 세포를 항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD137/4-1BB 중 적어도 하나로 처리함을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 확장은 T_CM 세포를 항-CD3 및 항-CD28로 처리함을 포함한다. 특정 양상에서, 상기 확장은 T_CM 세포를 항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD137/4-1BB로 처리함을 포함한다.

[0017] 추가의 양상에서, 방법은 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양의 HDACi 및 IL-21의 존재하에 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 배양하는 단계 전에 또는 이와 동시에 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 IL-2와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, T_CM 세포가 농축된 림프구 집단은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 5-배(예를 들어, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21-, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-배 이상) 초과의 T_CM 세포를 포함한다. 특정 양상에서, T_CM 세포가 농축된 림프구의 집단은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 10-배 초과의 T_CM 세포를 포함한다. 특정 양상에서, T_CM 세포가 농축된 림프구의 집단은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 30-배 초과의 T_CM 세포를 포함한다. 일부 양상에서, T_CM 세포가 농축된 림프구의 집단은 IL-2 및/또는 IL-15 처리에 반응하는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단과 비교하여 IL-2 및/또는 IL-15 처리에 반응하여 증가된 증식을 나타낸다.

[0018] 또 다른 구현예에서, 구현예(예를 들어, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계; 임의로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계)에 따라 생산된 T_CM 세포가 농축된 림프구의 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 암의 치료에 사용하기 위한 구현예의 약제학적 조성물이 본원에 추가로 제공된다.

[0019] 추가의 구현예는 암의 치료를 위한 구현예 (예를 들어, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계; 임의로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계에 따라 생산된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단의 용도를 제공한다.

[0020] 또 다른 구현예에서, 대상체에서 암의 치료를 위한 구현예(예를 들어. T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계; 임의로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 TEFF 세포를 TCM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계)의 방법에 의해 생산된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단을 포함하는 조성물이 제공된다.

[0021] 추가의 구현예는 구현예의 방법에 의해 생산된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단 또는 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단의 투여 전에 대상체에 대한 림프구고갈을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양상에서, T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단은 항종양 활성을 갖는 자가 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플로부터 유래한다. 일부 양상에서, T_CM 세포가 농축된 림프구 집단은 정맥내. 복막내 또는 종양내로 대상체에게 투여된다. 특정 양상에서, 대상체는 사람이다.

[0022] 추가의 양상에서, 방법은 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제는 화학치료요법, 방사선치료요법 및 면역치료요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 치료학적 제제는 면역치료요법이다. 특정 양상에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제이다. 일부 양상에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, 또는 아데노신 A2a 수용체 (A2aR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 단백질 또는 이의 리간드를 억제한다. 특정 양상에서, 면역 관문 억제제는 PD-1을 억제한다. 특정 양상에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4를 억제한다.

[0023] 또 다른 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계; 동시에 2 nM 내지 4 nM 농도의 HDACi 및 20 ng/mL 내지 40 ng/mL 농도의 IL-21을 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에 첨가하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 12 내지 16일 동안 배양하여 T_EFF 세포를 재프로그래밍하여 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에서 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_TM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계를 포함하는, T_EFF 세포로부터 T_CM 세포를 제조하기 위한 방법이 제공된다.

[0024] 또 다른 구현예에서, 사람 중앙 기억-유사 CD8⁺ T 세포 집단을 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 적어도 20% (예를 들어, 적어도 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 이상)의 T 세포는 CD127 및 CCR7의 낮은 발현과 함께 CD28 및 CD62L의 고발현을 갖는 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포이다. 일부 양상에서, 적어도 50% 또는 60%의 T 세포는 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포이다. 특정 양상에서, CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포는 Lef1 및/또는 Tcf1을 추가로 발현하거나 이의 고발현을 갖는다. 특정 양상에서, CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포는 필수적으로 CD45RA 및/또는 CD45RO 발현을 갖지 않는다. 일부 양상에서, CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포는 낮은 CD45RA 및/또는 CD45RO 발현을 갖는다.

[0025] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0026] 도 1a-1c: 이펙터 기억 (CD45RA ^- CCR7 ^- ) CD8 ⁺ T 세포에서 CD28 프로모터 상에 감소된 AcH3 수준. (A) CD 프로모터 상에 AcH3 수준의 ChIP 결과. 프라이머 8-10은 전사 개시 부위의 다운스트림에 게놈 DNA 영역을 포괄한다. 상기 결과는 인풋 양의 퍼센트로 정규화하였다. 나이브 (Naive) (CD45RA⁺CCR7⁺) CD8+ T 세포는 비교를 위해 사용하였다. (B) SAHA에 의한 AcH3 수준의 용량-의존성 증가의 웨스턴 블롯 결과. H3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. (C) CTL에서 IL-21-유도된 pSTAT3의 웨스턴 블롯 결과. STAT3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0027] 도 2a-2c: IL-21 및 SAHA은 협력 작용하여 CD28 및 CD62L 발현을 상향조절한다. (A) 4일동안 지정된 조건으로 처리된 CTL 상에서 CD28 수준의 대표적인 히스토그램. 각각의 패널 내부의 숫자는 CD28 염색의 MFI를 보여준다. (B) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 TIL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (C) CD28 프로모터 상에 STAT 결합 부위 부근의 AcH3 및 STAT3 집적의 ChIP 결과. 상기 결과는 인풋 양의 퍼센트로 정규화하였다. IgG는 음성 대조군으로서 사용하였다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. MFI: 평균 형광 강도. AcH3: H3 아세틸화. ** p<0.01, *** p<0.001.
[0028] 도 3a-3d: IL-21 및 파노비노스타트는 협력 작용하여 CD28 ⁺ CD62L ⁺ CTL을 유도한다. (A) 파노비노스타트에 의한 AcH3 수준의 용량-의존성 증가의 웨스턴 결과. H3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. (B) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 CTL의 소형-REP 확장 배수. (C) 소형-REP 말기에 CD28+CD62L+ CTL의 퍼센트. (D) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 CTL의 REP 확장 배수. Pano: 파노비노스타트.
[0029] 도 4a-4c: IL-21 및 파노비노스타트(Pano)는 협력하여 중앙-기억 유사 T 세포를 유도한다. (A) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 CTL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (B) CFSE 희석에 의해 지정된 IL-2 또는 IL-15로 처리되는 경우 확장된 CTL의 증식. 게이트는 2일내에 2회 이상 분열된 세포의 퍼센트를 나타낸다. (C) 정기적으로 또는 IL-21로 확장된 CTL 상의 CD132 (gC) 수준의 대표적인 히스토그램. 지정된 조건으로 확장된 CTL 상에 CD132 MFI의 요약. 3 내지 5개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. Pano: 파노비노스타트. MFI: 평균 형광 강도. ** p<0.01.
[0030] 도 5a-5b: IL-21/파노비노스타트-유도된 CD28 ⁺ CD62L ⁺ T 세포는 기억-관련 유전자의 증진된 발현을 나타낸다. (A) IL-21 및 파노비노스타트로 확장된 CD28^-CD62L^- 및 CD28⁺CD62L⁺ CTL은 분류-정제하고 mRNA 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 RPL13A 발현으로 정규화하였다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. ** p<0.01. n.s.: 유의적이지 않음. (B) TIL의 임상적 Grex REP 확장 배수.
[0031] 도 6a-6b: IL-21/파노비노스타트-확장된 CTL은 증강된 종양 사멸 능력을 나타낸다. (A) 지정된 조건으로 확장된 CTL에 의한 표적 종양 세포 사멸의 퍼센트를 입증하는 CRA 결과. (B) 표적 종양 세포에 의해 활성화된 상이한 CTL에서 세포내 IFN-γ 및 그랜자임 B 발현의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. CRA: 크로뮴 방출 검정. Pano: 파노비노스타트.
[0032] 도 7: IL-21 및 파노비노스타트 (Pano)는 협력 작용하여 TIL 상에 CD28 및 CD62L 발현을 상향조절한다. 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 TIL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. TIL: 종양 침윤 림프구.
[0033] 도 8: 나이브, 중앙 기억, 및 이펙터 T 세포의 마커를 도시하는 도식. 나이브 T 세포는 CD62L, CD127, CD28, 및 CD45RA를 발현한다. 중앙 기억 T 세포는 CD62L, CD45RO, CD127, 및 CD28을 발현한다. 이펙터 T 세포는 CD45RO를 발현한다.
[0034] 도 9a-9f: IL-21은 활성화된 사람 나이브 CD8+ T 세포에서 CD28 발현을 상향조절한다. (A) M27-특이적 CD8⁺ T 세포 상의 CD28 표면 수준의 대표적인 히스토그램 및 이소타입 대조군 항체는 음성 염색 대조군으로서 사용하였다. (B) M27-특이적 CD8⁺ T 세포의 표면 상의 CD28 단백질 수준의 MFI (n=12, 평균 ± SEM, **** p < 0.0001, 독립 (unpaired) t 시험). MFI: 평균 형광 강도. (C) 활성화 후 7일째에 염색된 사람 나이브 CD8⁺ T 세포 상에 CD28 표면 수준의 대표적인 히스토그램. 이소타입 대조군 항체는 음성 염색 대조군으로서 사용하였다. (D) 7일 동안 지정된 조건으로 활성화된 CD8⁺ T 세포의 표면 상에 CD28 단백질 수준의 MFI. (n=4, 평균 ± SEM, * p < 0.05, 대응 (paired) t 시험). (E) IL-21의 존재 또는 부재하에 생성된 분류-정제된 사람 Mart1(M27)-특이적 CD8⁺ T 세포에서 CD28 mRNA의 정량적 RT-PCR 결과. IL-21 없이 확장된 세포에서 발현 수준은 1로서 설정하였다. (n=2, 평균 ± SEM, ** p < 0.01, 독립 t 시험). (F) 7일 동안 지정된 조건으로 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포에서 CD28 mRNA 수준의 정량적 RT-PCR 결과. 7일 동안 항-CD3/CD28 비드로 활성화된 세포내 발현 수준은 1로서 설정하였다. (n=6, 평균 ± SEM, ** p < 0.01, 대응 t 시험). CD28 유전자에 대한 정량적 RT-PCR의 결과는 RPL13A로 정규화하였다. A, B, 및 E에서의 결과는 상이한 건강한 공여자 기원의 세포를 사용한 2개 (E) 또는 3개 (A-B) 독립적 실험으로부터 대표된다. 패널 C는 상이한 건강한 공여자 기원의 세포를 사용한 4개의 독립적 실험으로부터 대표된다. D 및 F에서의 결과는 상이한 건강한 공여자 기원의 세포를 사용한 4개 (D) 또는 6개 (F)의 독립적 실험으로부터 수집되었다.
[0035] 도 10a-10g: STAT3 활성화는 IL-21-유도된 CD28 상향조절을 위해 필수적이다. (A) 건강한 공여자 또는 잡 (Job) 증후군 환자 기원의 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포 상에 CD28 표면 수준의 대표적인 히스토그램. HD: 건강한 공여자. (B) 항-CD3/CD28만으로 활성화된 세포의 MFI 대비 항-CD23/CD28로 활성화된 세포의 MFI의 배수로서 제공되는, CD28 MFI의 배수 변화. (n=3, 평균 ± SEM, * p < 0.05, 독립 t 시험). (C) 건강한 공여자로부터 또는 7일 동안 항-CD3/CD28로 또는 이와 함께 IL-2로 활성화된 잡 증후군 환자로부터의 사람 CD8⁺ T 세포에서 CD28 mRNA 수준의 정량적 RT-PCR 결과의 배수 변화. 건강한 공여자로부터 또는 항-CD3/28 비드만으로 활성화된 잡 증후군으로부터의 세포에서 발현 수준은 1로서 설정하였다. (n=3, 평균 ± SEM, ** p < 0.01, 독립 t 시험). (D) 대조군, STAT1 또는 STAT3 shRNA로 형질감염되고 7일 동안 지정된 조건으로 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포 상에 CD28 표면 수준의 대표적인 히스토그램. (E) 음성 대조군 (대조군) 또는 7일동안 지정된 조건으로 활성화된 STAT-녹다운 CD8⁺ T 세포의 표면 상에 CD28 MFI의 배수 변화. 데이터는 항-CD3/CD28만으로 활성화된 세포의 MFI 대비 항-CD23/CD208 및 IL-21로 활성화된 세포의 MFI의 배수로서 제공된다. (n=6, 평균 ± SEM, * p < 0.05, 원-웨이 ANOVA). (F) 대조군, STAT1 또는 STAT3 shRNA로 형질감염되고 7일 동안 항-CD3/CD28로 또는 이와 함께 IL-21로 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포에서 CD28 mRNA 수준의 정량적 RT-PCR 결과의 배수 변화. 7일 동안 CD3/28 비드만으로 활성화된 세포내 발현 수준은 1로서 설정하였다. (n=4, 평균 ± SEM, * p < 0.05, 원-웨이 ANOVA). (G) 사람 CD28 프로모터 상에 근거리 및 원거리 STAT 부위에 결합하는 STAT3의 ChIP 결과. (N=6, 평균 ± SEM, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 투-웨이 ANOVA). 결과는 대표적이거나 (A, D, G) 상이한 공여자 기원의 세포를 사용한 3개 (B, C, G), 4개 (F), 또는 6개 (E) 독립 실험으로부터 수집하였다.
[0036] 도 11a-11f: IL-21에 반응한 CD28의 차등적 유도는 나이브 및 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 히스톤 H3 아세틸화 수준과 상호관련된다. (A-B) 4일동안 IL-21의 존재 또는 부재하에 M27-펄스된 성숙한 수지상 세포로 활성화된 M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포 상의 CD28 수준의 대표적인 히스토그램 및 개요. 이소타입 항체는 음성 염색 대조군으로서 사용하였다. [n=3; 평균 ± SEM; ns: 유의적이지 않음; 대응 t 시험]. (C) 나이브 및 M27-특이적 이펙터 CTL에서 IL-21-유도된 pSTAT3의 웨스턴 블롯 결과. STAT3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 밴드는 이미지J를 사용하여 정량하였고 상응하는 샘플 중에 액틴의 밀도로 정규화하였다. 분자량은 킬로돌턴으로 지적한다. UT: 비처리된. (D) 나이브를 CD45RA⁺EM (T_EMRA) CD8⁺ T 세포와 비교하여 CD28 프로모터상에 H3 아세틸화 수준의 ChIP 결과. 결과는 인풋 양의 퍼센트로 정규화하였다. TSS: 전사 개시 부위. [n=3; 평균 ± SEM; * p<0.05, *** p<0.001; 투-웨이 ANOVA]. (E) 4일 동안 항-CD3/CD28로 또는 이와 함께 IL-21로 활성화된 나이브 및 T_EMRA CD8⁺ T 세포 상의 CD28 수준의 대표적인 히스토그램. (F) 나이브를 M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포와 비교하여 CD28 프로모터상에 H3 아세틸화 수준의 ChIP 결과. 결과는 인풋 양의 퍼센트로 정규화하였다. [n=3; 평균 ± SEM; ** p<0.01, *** p<0.001; 투-웨이 ANOVA]. 결과는 2개 (C, E, F) 또는 3개 (A, D)로부터 대표적인 것이거나 상이한 공여자 기원의 세포를 사용하여 3개 (B) 독립 실험으로부터 수집하였다.
[0037] 도 12a-12f: SAHA는 IL-21-유도된 pSTAT3가 CD28 프로모터에 근접하도록 하고 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 CD28 발현을 상향조절한다. (A) 비처리된 상태로 있거나 (부재) 또는 24시간 동안 SAHA로 처리된 M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포에 대한 CD28 프로모터 상에 H3 아세틸화 수준의 ChIP 결과. [n=3; 평균 ± SEM; *** p<0.001; 투-웨이 ANOVA]. (B) 비처리된 상태로 있거나 24시간 동안 SAHA로 처리되고 이어서 30분동안 IL-21로 자극된 M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포에 대한 CD28 프로모터에 결합하는 STAT3의 ChIP 결과. [n=3; 평균 ± SEM; ns: 유의적이지 않음, * p<0.05, ** p<0.01; 투-웨이 ANOVA]. (C) 4일 동안 지정된 조건으로 처리된 CTL 상의 CD28 수준의 대표적인 히스토그램. 히스토그램 그래프 내부 숫자는 각각의 조건에 대한 대표적인 CD28 MFI를 보여주고 수직선은 CD28^- 및 CD28⁺ 집단을 분리한다. (D) 독립적 실험으로부터 CTL 상의 CD28의 MFI(n=4; 평균 ± SEM; * p<0.05; 원-웨이 ANOVA, IL-2+SAHA를 다른 조건과 비교하는). (E) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 TIL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (F) 독립적 실험으로부터 지정된 조건으로 확장된 CD28⁺CD62L⁺ 세포의 퍼센트(n=4; * p<0.05; 원-웨이 ANOVA). 2개 (B), 3개 (A), 또는 4개 (C, E) 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0038] 도 13a-13b: IL-21 및 파노비노스타트 (Pano)는 협력하여 CD28 ⁺ CD62L ⁺ 세포를 유도한다. (A) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 CTL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (B) 독립적 실험으로부터 지정된 조건으로 확장된 CTL에서 CD28⁺CD62L⁺ 세포의 퍼센트(n=3; * p<0.05; 원-웨이 ANOVA, 일반 프로토콜로 확장된 CTL과 비교하여). 3개 (A) 독립 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0039] 도 14a-14d: IL-21/파노비노스타트-확장된 CTL은 시험관내 중앙 기억-유사 특징을 나타낸다. (A) CFSE 희석에 의해 지정된 IL-2 또는 IL-15로 처리되는 경우 확장된 CTL의 증식. 숫자는 2일내에 2회 이상 분열된 세포의 퍼센트를 지적한다. (B) 지정된 조건으로 확장된 CTL 상의 CD132 (γC) 수준의 대표적인 히스토그램. 상기 숫자는 각각의 조건에서 CD132의 대표적인 MFI를 보여준다. (C) 독립적 실험으로부터 지정된 조건으로 확장된 CTL 상의 CD132 MFI의 개요(n=6; 평균 ± SEM; * p<0.05, ** p<0.01; 원-웨이 ANOVA, 정기적 프로토콜로 확장된 CTL과 비교하여). (D) IL-21 및 파노비노스타트로 확장된 CTL로부터 분류된 CD28-CD62L- 및 CD28⁺CD62L⁺ 세포에서 mRNA 유전자 발현의 대표적인 결과. 유전자 발현은 하우스키핑 유전자 RPL13A 발현으로 정규화하였다. (n=2; 평균 ± SD; ** p<0.01, ns: 유의적이지 않음; 투-테일드(two-tailed) t 시험). 2개 (A), 3개 (D), 또는 6개 (B) 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0040] 도 15a-15b: STAT3은 사람 나이브 CD8 ⁺ T 세포에서 IL-21-매개된 CD28 상향조절을 위해 요구된다. (A) 세포 치료 후 30분에 pSTAT1, pSTAT3 및 pSTAT5 수준의 대표적인 웨스턴 결과. (B) 음성 대조군, STAT1 또는 STAT3 shRNA로 형질감염된 사람 CD8⁺ T 세포에서 총 STAT1 및 STAT3 수준의 웨스턴 결과. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 밴드는 이미지J를 사용하여 정량하였고 상응하는 샘플 중에 액틴의 밀도로 정규화하였다. 분자량은 킬로돌턴으로 지적한다. 2개 (B) 또는 3개 (A) 독립 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. UT: 비처리된. Ctl: 대조군.
[0041] 도 16: SAHA는 용량-의존성 방식으로 H3 아세틸화를 증가시킨다. SAHA에 의한 H3 아세틸화 (AcH3) 수준의 용량-의존성 증가의 웨스턴 블롯 결과. H3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 밴드는 이미지J를 사용하여 정량하였고 상응하는 샘플 중에 액틴의 밀도로 정규화하였다. 분자량은 킬로돌턴으로 지적한다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0042] 도 17a-17b: IL-21 및 파노비노스타트 (Pano)는 협력 작용하여 CD28 및 CD62L 발현을 상향조절한다. (A) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 TIL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (B) 파노비노스타트에 의한 AcH3 수준의 용량-의존성 증가의 웨스턴 결과. H3 및 β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용하였다. 밴드는 이미지J를 사용하여 정량하였고 상응하는 샘플 중에 액틴의 밀도로 정규화하였다. 분자량은 킬로돌턴으로 지적한다. 2개의 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0043] 도 18a-18c: IL-21 및 파노비노스타트는 협력 작용하여 CD28 ⁺ CD62L ⁺ 세포를 유도한다. (A) 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 TIL 상의 CD28 및 CD62L 수준의 대표적인 플롯. 상기 플롯 내 숫자는 사분면 각각에서 세포의 퍼센트에 대한 주석이다. (B) 독립적 실험으로부터 REP의 말기에 CD28+CD62L⁺ TIL의 퍼센트 (n=7; * p<0.05; 원-웨이 ANOVA). (C) 4개의 독립적 실험으로부터 2주 동안 지정된 조건으로 확장된 CTL의 REP 확장 배수. 막대 그래프는 각각의 조건의 평균 ± SEM을 보여준다. 2개 (A) 독립적 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다.
[0044] 도 19: IL-21/파노비노스타트-확장된 CTL은 IL-21로 확장된 CTL에 대해 상응하는 종양 사멸 능력을 나타낸다. 크로뮴 방출 검정 결과는 지정된 조건으로 확장된 CTL에 의한 표적 종양 세포 사멸의 퍼센트를 입증한다 (n=5; 평균 ± SD; ns: 유의적이지 않음; 투-테일드 t 시험).

I. 정의

[0045] 본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같은 단수 용어 “a”,　“an”, 및 “the”는 달리 명백히 지정되지 않는 경우 복수의 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들어, “세포”에 대한 언급은 상기 세포의 복수를 언급하고 “펩타이드”에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 펩타이드 및 이의 등가물 (예를 들어, 폴리펩타이드)에 대한 언급을 포함한다.

[0046] 본운에서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같은 용어 “또는”은 단지 대안물을 언급하기 위해 명백히 지적되지 않은 경우 또는 대안물이 상호 배타적이지 않은 경우 “및/또는”을 의미한다.

[0047] 본원에서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같은 용어 “또 다른”은 적어도 2번째 이상을 의미할 수 있다.

[0048] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “약”은 특정 값 또는 측정치가 상기 값을 계산하기 위해 측정치를 수득하기 위해 사용된 장치와 관련된 고유 변화 또는 연구 대상체 중에 존재하는 천연 변화를 포함함을 지적한다.　

[0049] 용액 (예를 들어, 하나 이상의 단백질. 중합체 또는 수분자의 제제)의 성분과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 “필수적으로 없는”은 제제가 상기 성분을 포함하도록 제형화되지 않거나 상기 성분이 단지 미량 (예를 들어, 오염물로서)으로만 존재함을 의미한다. 특정 구현예에서, 관심 대상의 분자 제제는 상기 제제가 상기 성분을 0.05% (w/w) 미만으로 포함하는 경우 특정 성분이 필수적으로 없다. 특정 구현예에서, 관심 대상의 분자 제제는 상기 제제가 상기 성분을 0.01% (w/w) 미만으로 포함하는 경우 특정 성분이 필수적으로 없다. 특정 구현예에서, 관심 대상의 분자의 제제는 특정 성분의 어떠한 양이 표준 분석학적 방법 (예를 들어, UV 분광광도측정, 질량 분광분석법, 핵 자기 공명 분광측정 등)을 사용하여 제제 중에 검출될 수 없는 경우 특정 성분이 필수적으로 없다.　

[0050] 용액 또는 현탁액 (예를 들어, 하나 이상의 세포 유형, 단백질, 중합체 또는 소분자의 제제)의 성분과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 “농축된”은 정상 농도 보다 높은 농도의 성분 또는 정상 수 보다 많은 성분을 포함하도록 제형화된 것임을 의미한다(예를 들어, 림프구의 현탁액은 이펙터 T 림프구에 대해 농축될 수 있다).

[0051] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “T　세포” 또는 “T　림프구”는 흉선에 의해 생성되거나 흉선에서 가공되고 후천성 면역 반응에 활성적으로 참여하는 유형의 림프구 또는 백혈구 세포를 언급한다. 상기 용어는 이펙터 T 세포 (T_EFF 세포), CD4⁺ 헬퍼 T 세포(CD4⁺ T 세포 또는 T_H 세포), CD8⁺ 세포독성 또는 킬러 T 세포 (CD8⁺ 또는 CTL), 기억 T 세포, 조절 또는 서프레서 T 세포 (T_REGs), 천연 킬러 T 세포 (T_NK), 점막 관련 영구 T 세포 및 감마 델타 또는 γδ⁺　T　세포 (T_γδ)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

[0052] 각각의 T 세포는 항원-제공 또는 병원체-감염된 세포의 표면 상에 나타나는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 관련하여 펩타이드 항원을 인지하는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현한다. 주요 TCR 종은 알파 (a) 서브유닛 및 베타 (b) 서브유닛을 포함하고 이들 각각은 항원-반응성 T 세포의 다양한 레퍼토리를 생성하기 위한 체세포 V(D)J 재조합을 진행한 유전자에 의해 암호화되어 있고 각각의 개체에서 최대 가능한 10¹⁴ 특유의 TCRab 이종이량체를 갖는다. 소수의 TCR 종(T_γδ)은 또한 체세포 V(D)J 재조합에 의해 생성된다. 기능성 TCR의 성공적인 재조합 및 흉선으로부터의 출현은 2차 림프구 조직 (림프절 및 비장) 및 말초 순환계를 통해 주로 이동할 수 있지만 감염성 챌린지로부터 보호할 수 있는 임의의 종류의 반응을 아직 생성할 수 없는 휴지기 “나이브” T 세포를 유도한다.

[0053] 면역 보호를 매개할 수 있는 T 세포의 생성은 먼저 나이브 T 세포의 “활성화”를 요구한다. 이것은 T 세포 및 항원-제공 세포 (APC), 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 또는 부류 II 분자에 비공유적으로 결합된 감염성 제제로부터 유래된 항원성 펩타이드를 함유하는 세포 상의 다수의 분자 간에 협력 상호작용을 포함한다. TCR은 2개의 쇄 (α 및 β)로 구성되고, 이들은 적당한 부류 I 또는 부류 II MHC 분자와 관련하여 결합되는 경우에만 펩타이드 항원을 인지한다. T 세포 상에, TCR은 총체적으로 CD3 (γ-, δ-, ε-, 및 ζ-서브유닛으로 구성된)으로서 공지된 막 단백질의 복합체와 연합하고, 이것은 TCR 연결 후 세포내 신호를 증폭시키기는데 관여하는 상기 복합체의 시토졸 영역이다. 각각의 TCR은 또한 T 세포의 유형에 의존하여 CD4 또는 CD8 공동-수용체와 연합한다. 이들 2개의 분자는 MHC (CD8에 대해 부류 I 및 CD4에 대해 부류 II)에 결합하여 T 세포와 APC 간의 상호작용을 추가로 안정화시킨다.

[0054] T_EFF의 카테고리는 T_H, CTL, T_REG, 및 잠재적으로 다른 T 세포 유형을 포함하는, 면역 자극 (예를 들어. 공동-자극)에 활성적으로 반응하는 다양한 T 세포 유형을 포함한다. T_H 세포는 B 세포의 혈장 세포 및 기억 B 세포로의 성숙화, 및 CTL 및 대식세포의 활성화를 포함하는. 면역학적 프로세싱에서 다른 림프구를 원조한다. T_H 세포는 항원-제공 세포 (APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 부류 II 분자에 결합된 세포외 단백질로부터 유래된 펩타이드 항원이 제공되는 경우 활성화된다. 다양한 서브타입의 T_H 세포가 있고, 이는 T_H1, T_H2, T_H3, T_H9, T_H17, T_H22, 및 T 여포 헬퍼 세포 (T_FH)를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 각각은 하나 이상의 상이한 신호 전달 단백질 (즉, 사이토킨)을 분비하여 후천성 면역 반응의 상이한 양상을 상향 또는 하향 조절한다. CTL은 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 사멸시킬 수 있고 이식된 조직 거부에 연루되어 있다. CTL은 표적 세포의 표면 상에서 발현된 MHC 부류 I 분자에 결합된 비-자가 세포내 단백질로부터 유래된 펩타이드가 제공되는 경우 활성화된다. T_REGs는 면역 반응의 말단을 향한 T 세포-매개된 면역력을 중단하거나 억제하고 흉선에서 음성 선택을 회피하는 자가반응 T 세포를 억제함에 의한 면역학적 관용성의 유지에 중요한 역할을 수행한다. 적어도 3개의 주요 부류의 T_REGs가 있다: CD4⁺FoxP3⁺, CD4⁺FoxP3^- T_REGs, 및 1형 조절 T 세포(T_r1 세포)인 CD4⁺CD49b⁺LAG-3⁺CD226⁺.

[0055] CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 대부분 단순히 기억 T 세포 (T_MEM) 및 T_EFF 세포를 포함하는. 나이브 또는 항원-경험한 집단으로서 분류된다. T_MEM 세포의 2개의 주요 서브타입인 T_CM 세포 및 T_EM 세포는 이들의 이펙터 기능 및 상이한 해부학적 부위로 귀소하는 능력에서 차이가 있는 것으로 공지되어 있다. T 세포의 다양한 유형 및 서브타입, 예를 들어, T_CM 세포, T_EM 세포, 및 T_EFF 세포는 각 유형에 특징적인 하나 이상의 세포 표면 단백질의 발현을 분석함에 의해 구분될 수 있다. 표준 마커는 예를 들어, src-계열 키나제를 조절하는 단백질 티로신 포스파타제인 CD45를 포함하고 이는 모든 조혈 세포 상에서 발현된다.　 사람 CD45는 세포외 도메인의 일부를 포함하는 3개의 엑손의 대안적 스플라이싱에 의해 여러 이소형 중 하나로서 발현될 수 있다. 6개 이소형은 통상적으로 사람에서 동정되고, 이는 1, 2, 또는 3개의 대안적으로 스플라이스된 엑손을 갖는 변이체를 포함한다: CD45RA, CD45RO, CD45RB, CD45RAB, CD45RBC, 및 CD45RABC.

[0056] 나이브 T 세포는 CD45RA, L-셀렉틴 (CD62L), 인터류킨 수용체 7-알파 서브유닛 (IL7Ra; CD127), 및 CD28을 발현한다. 기억 T 세포 (T_MEM)의 카테고리는 다양한 서브타입을 포함하고 이는 중앙 기억 T 세포(T_CM 세포) 및 이펙터 기억 T 세포(T_EM 및 T_EMRA 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T_CM　세포는 CD45RO,　L-셀렉틴　(CD62L), 인터류킨 수용체 7-알파 서브유닛 (IL7Ra; CD127), CD28, 및 C-C 케모킨 수용체 7형　(CCR7)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. T_EM　세포는 CD45RO, 보다 낮고 다소 이종성 수준의 L-셀렉틴 (CD62L), 인터류킨 수용체 7-알파 서브유닛(IL7Ra; CD127)을 발현하지만 CCR7을 발현하지 않는다.　 T_EMRA 세포 (CD45RA를 재발현하는 최종적으로 분화된 이펙터 기억 세포)는 CD45RA, 보다 낮고 어느정도 이종성 수준의 L-셀렉틴(CD62L), 인터류킨 수용체 7-알파 서브유닛 (IL7Ra; CD127), 및 CD28을 발현하지만 CCR7을 발현하지 않는다.

[0057] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “종양 침윤 림프구” 또는 “TIL”은 세포독성 T 세포 (CTL) 및 헬퍼 T 세포 (T_H 세포), 및 B 세포, 대식세포, 천연 킬러 세포, 및 전문 항원 제공 세포 (APC), 예를 들어, 수지상 세포의 혼합을 포함하는, 많은 상이한 유형의 고형 종양에서 관찰되거나 이로부터 단리된 면역 세포의 복합 혼합물을 언급한다.

[0058] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항원”은 척추동물, 예를 들어, 사람에서 체액성 또는 세포성 면역 반응, 특히, 항체의 생성, B 세포의 활성화 및/또는 T 세포의 활성화를 유도하는 독소, 단백질 또는 다른 외래 물질을 언급한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 포함한다.

[0059] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “에피토프” 또는 “항원성 결정인자”는 예를 들어, 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해서와 같은 면역계에 의해 인지되는 특정 항원의 하나 이상의 부분을 언급한다. 따라서, 에피토프는 항체가 결합하는 항원의 특정 부분, 또는 T 세포 수용체가 결합하는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합되는 특정 펩타이드이다. 항체에 의해 인지되는 에피토프는 선형이거나 형태적일 수 있다. 선형 에피토프는 예를 들어, 항원 내 아미노산의 연속 선형 서열에 의해 형성된 1차 아미노산 서열을 통해 항체와 상호작용하는 에피토프이다. 형태적 에피토프는 예를 들어, 항원 내 불연속 또는 비-선형 분절에 의해 형성된, 항원의 3차원 구조 또는 형태 (즉, 이의 3차원 구조)를 기준으로 항체와 상호작용하는 에피토프이다.

[0060] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “네오에피토프”는 새로운 에피토프. 또는 암 세포 또는 암성 조직에는 존재하지만 건강한 조직에는 존재하지 않는 비-천연적으로 존재하는 돌연변이의 결과로서 암 세포 또는 암성 조직에 존재하는 항원과 같은, 새로운 항원 (“네오항원”) 상의 에피토프를 언급한다.

[0061] 용어 “종양-관련 항원”, “종양 항원”, “종양-특이적 항원”, 또는 “암 세포 항원”은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 정상의 비-암성 조직과 비교하여, 하나 이상의 특정 종양 유형 상에서 특유하게 또는 보다 풍부하게 발현되고 암 환자에서 항원-특이적 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 자극할 수 있는 단백질, 탄수화물 또는 다른 분자를 언급한다.

[0062] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “키메라 항원 수용체”, “CAR”, “키메라 T 세포 수용체”, “인공 T 세포 수용체” 또는 “키메라 면역수용체”는 목적하는 비-MHC-제한된 항원-결합 특이성을 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 이펙터 T 세포상으로 이식하는 가공된 키메라 수용체 작제물을 언급한다. CAR은 예를 들어, 세포외 항원-결합 도메인 (예를 들어, 목적하는 항원 특이성을 갖는 단일쇄 가변 단편 (scFv)와 같은 항체 또는 항체 단편), 스페이서 서열, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 세포내 티로신-기반 활성화 모티프 (“ITAMs”), 예를 들어, CD3-제타(CD3z), 및/또는 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인. 예를 들어, CD28, 4-1BB/CD137, ICOS, OX40, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

[0063] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항원 제공 세포” 또는 “APC”는 항원 제공할 수 있는, 즉, 세포 표면 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 결합된 항원 펩타이드를 하나 이상의 다른 면역 세포, 예를 들어, T 세포에 제공할 수 있는. 면역 세포 부류를 언급한다. 대부분의 면역 세포 유형은 APC의 일부 유형이지만 전문 APC, 예를 들어, 대식세포, B 세포로서 작용할 수 있고 수지상 세포는 외래 항원을 T_H 세포에 제공하고, 다른 세포 유형은 세포내 항원을 CTL에 제공할 수 있다. APC는 후천성 면역 반응의 필수 성분인데 그 이유는 CTL 및 T_H 세포 둘다의 기능이 APC 활성에 의존하기 때문이다. 항원 제공은 후천성 면역력의 특이성을 가능하게 하고 세포내 및 세포외 둘다의 병원체 둘다에 대한 후천성 면역 반응을 가능하게 하며 종양에 대한 방어에 관여한다.

[0064] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “히스톤 데아세틸라제”, “HDAC 효소”, 또는　“HDAC”는 예를 들어, 히스톤 상의 ε-N-아세틸-라이신 아미노산으로부터 아세틸 그룹(CH₃―CO―R)의 제거를 촉매하는 효소 부류 (EC 3.5.1.98)를 언급한다. 예를 들어, 문헌(Seto and Yoshida, 2014)을 참조한다. 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 수행한다. 히스톤의 아세틸화는 이들의 양전하를 중화시키고 음전하 DNA와의 이들의 상호작용을 느슨하게 하는 것으로 사료된다. 이것은 염색질 구조를 개방하여 전사 인자의 결합 및 이어서 유전자 전사를 촉진시킨다. HDAC에 의한 히스톤의 탈아세틸화는 DNA와의 이들의 상호작용을 강화하여 폐쇄된 염색질 구조 및 유전자 전사의 억제를 유도한다. 히스톤 라이신 아세틸화는 고도로 가역적이다. 라이신 잔기는 히스톤/라이신 아세틸트랜스퍼라제 효소 (HAT)의 작용에 의해 아세틸화되고 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)에 의해 탈아세틸화된다.

[0065] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “HDAC　억제제” 또는 “HDACi”는 하나 이상의 HDAC 효소의 히스톤 데아세틸라제 활성을 강하게 및 특이적으로 억제할 수 있는 광범위한 부류의 화합물을 언급한다. 　고전적 HDACi는 부류 I, II, 및 IV에서 통상적인 HDAC에 배타적으로 작용하고 상기 HDAC는 이들의 데아세틸라제 활성을 위해 조인자로서 Zn²⁺을 요구하는 HDAC를 포함한다. 고전적 HDACi는 전형적으로 티올 그룹과 함께 아연 이온에 결합하는, 사이클릭 테트라펩타이드를 제외하고는 아연 이온에 결합하는데 관여하는 화학적 모이어티에 따라 분류된다. 예시적인 고전적 HDACi는 하이드록삼산 또는 하이드록사메이트(예를 들어, 트리코스타틴 A), 사이클릭 테트라펩타이드(예를 들어, 트라폭신 B) 및 데프시펩타이드, 벤즈아미드, 친전자성 케톤, 및 지방족 산(예를 들어, 페닐부티레이트 및 발프로산)을 포함한다. 제2 세대의 고전적 HDAC는 하이드록삼산 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트 (Farydaq®로서 시판됨), 다시노스타트 (LAQ824), 벤즈아미드 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린(CI994), 및 모세티노스타트 (MGCD0103)를 포함한다.

[0066] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항체” 또는 “면역글로불린”은 4개의 별도의 폴리펩타이드로서, 디설파이드 결합에 의해 연결된-2개의 중쇄 및 2개의 경쇄-를 전형적으로 포함하는 임의의 여러 고분자량의 당단백질을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 항체는 통상적으로 항원 자극 후 B 세포로 불리우는 특수화된 림프구에 의해 생성된다. 항체는 체액성 면역 반응의 일부로서 B 세포를 자극하는 항원상의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이고 각각 상이한 중쇄의 존재에 의해 구분되는 이소타입으로서 언급되는 5개 상이한 형태로 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 항체는 프로테아제 효소에 의해 절단되어 예를 들어, Fab (단편, 항원-결합), 항원 특이성을 결정하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 Fv (단편, 가변 영역), 및 Fc (단편, 불변 영역)을 포함하는 일련의 단편을 방출할 수 있다.

[0067] 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 폴리클로날 항체는 각각 상이한 에피토프에 결합하는. 동일한 항원에 대해 반응하는 총체적 항체를 포함하는. 체내 상이한 B 세포 계통에 의해 분비되는 항체의 혼합물이다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 세포주와 같은 세포의 단일 클론에 의해 생성되는 항체이고 동일한 특이성 (즉. 각각 동일한 에피토프에 결합하는)을 갖는 항체를 포함한다. 용어 “항체”는 모든 천연적으로 존재하고 목적하는 생물학적 활성, 예를 들어, 항원 결합, 보체 고정화, Fc 수용체 결합 등을 보유하는 가공된 항체 단편을 포괄한다. 가공된 항체 및 항체 단편은 예를 들어, 이특이적 항체, Fab, F(ab’)₂, 단일특이적 Fab₂, 이특이적 Fab₂, 삼특이적 Fab₃, 1가 IgG, scFv, 이특이적 디아바디, 삼특이적 디아바디, scFv-Fc 등을 포함한다. 항체의 공급원 및 목적하는 용도 (즉, 사람 치료제로서 사용하기 위한 마우스 모노클로날 항체)에 의존하여 추가로 가공되어 결합 친화성을 개선시키기거나 ‘사람화’로 불리우는 과정에 의해 면역원성을 감소시킬 수 있다.

[0068] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “면역치료요법” 또는 “면역 치료요법”은 면역계를 포함하는 기전에 의존하는 암을 예방하거나 검출하거나 치료하기 위한 임의의 접근법을 언급하고, 예를 들어, 백신, 세포 치료요법 및 세포 치료요법의 생성 및 용도에 관여하는 임의의 벡터 또는 관련 성분, 암용해 바이러스, 항체(예를 들어, 나출된, 약물 접합된, 이특이성 등)), 면역조절제 (예를 들어, 보조제(adjuvants), 사이토킨, 성장 인자 등) 및 면역억제를 감소시키고. 면역세포의 트래픽킹 및/또는 활성화를 증진시키거나 선호적으로 종양 미세환경을 변경하는 다른 카테고리의 제제, 및 암에 대한 면역 반응 또는 이의 효과의 특징 분석과 관련된 임의의 연구 기술이 있다.

[0069] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “면역 관문” 또는 “면역 관문 단백질”은 면역 반응. 예를 들어, 세포성 면역 반응의 하나 이상의 양상을 음성으로 조절하고 자가 내성의 유지, 자가면역력의 예방, 말초 조직에서 생리학적 면역 반응의 지속성 및 정도의 조절 및 부수적인 조직 손상에 중요한 역할을 하는 과정 또는 경로에 관여하는 임의의 광범위한 단백질을 언급한다. 면역 관문 단백질은 예를 들어, 프로그램화된 세포사 경로 1 (PD-1/CD279) 및 이의 리간드(PD-L1/CD274 및 PD-L2/CD273), 세포독성 T 림프구-관련 항원 4 (CTLA-4/CD152), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3/CD223), B 및 T 림프구 약독화인자 (BTLA), Ig a및 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM) 도메인 (TIGIT)을 갖는 T 세포 면역수용체, T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3/HAVcr2), 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR/CD158), T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 서프레서(VISTA), 및 아데노신 A2a 수용체 (A2aR)를 포함한다.

[0070] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “면역 관문 억제제”는 면역 관문 단백질에 결합할 수 있고 면역 반응에 대한 이들의 음성 조절을 경감시킬 수 있는 치료학적 제제 부류를 언급한다. 예시적인 면역 관문 억제제는 예를 들어, 이필리무맙 (CTLA-4를 표적화하는, Yervoy®로서 시판됨), 펨브롤리주맙 (PD-1을 표적화하는, Keytruda®로서 시판됨), 니볼루맙 (Pd-1을 표적화하는, Opdivo®로서 시판됨), 아테졸리주맙 (PD-L1을 표적화하는, Tecentriq®로서 시판됨), 아벨루맙 (PD-L1을 표적화하는, Bavencio®로서 시판됨), 및 두르발무맙(PD-L1을 표적화하는, Imfinzi®로서 시판됨)을 포함한다. 면역 관문 억제는 기능의 감소 및 완전한 차단 둘다를 포괄한다.

[0071] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “항암제”, “화학치료학적 제제” 등은 암성 또는 악성 세포 또는 조직, 즉, 고증식률을 갖는 세포 또는 조직에 선택적으로 독성인 임의의 화학 물질 또는 화합물을 언급한다. 화학치료학적 제제는 대상체에서 암을 치유하거나, 제어하거나 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 많은 상이한 부류의 화학치료제가 있고, 이는 알킬화제, 안트라사이클린, 세포골격 붕괴제, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 억제제(상기 참조), 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 키나제 억제제, 뉴클레오타이드 유사체 및 뉴클레오타이드 전구체 유사체, 펩타이드 항생제, 백금계 화합물, 레티노이드, 빈카 알칼로이드 및 유도체 등을 포함한다. 알킬화제는 사이클로포스파미드, 메클로로에타민, 클로람부실, 멜팔란, 다카바진, 니트로소우레아, 및 테모졸로미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 안트라사이클린은 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 발루비신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포골격 붕괴제(예를 들어, 탁산)은 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산(나브-파클리탁셀), 및 탁소테레를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 토포이소머라제 I의 억제제는 이리노테칸 및 토포테칸을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 토포이소머라제 I의 억제제는 에토포시드. 테니포시드 및 타플루포시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 키나제 억제제는 보르테조밉, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베누라페닙, 및 비스모데깁을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드 유사체 및 뉴클레오타이드 전구체 유사체는 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 및 티오구아닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 펩타이드 항생제는 블레오마이신 및 악티노마이신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 백금계 제제는 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 레티노이드는 트레티노인. 알리트레티노인 및 벡사로텐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 빈카 알칼로이드 및 유도체는 빈블라스틴. 빈크리스틴. 빈데신 및 비노렐빈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

[0072] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “치료한다”, “치료”, “치료하는” 등은 예를 들어, 치료학적 제제를 대상체에 투여함에 의해 또는 대상체에 대해 수술, 임상 또는 다른 의학적 절차를 수행함에 의해 대상체에서 질환 또는 병태의 증상을 완화시키거나, 감소시키거나 다르게는 경감시키는 과정을 언급한다.

[0073] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “대상체” 또는 “환자”는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 개체, 예를 들어, 사람 또는 비-사람 유기체, 예를 들어, 영장류, 포유동물 또는 척추동물을 언급한다.

[0074] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “치료학적으로 효과적인” 또는 “치료학적으로 이로운” 등은 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선하거나, 완화시키거나 다르게는 경감시켜 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체의 웰빙을 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시킴에 의해 증진시키는 수술 과정, 임상 과정 또는 다른 의학적 과정을 언급한다. 따라서, 치료학적으로 효과적인 또는 치료학적으로 이로운 암 치료는 예를 들어, 종양의 크기를 감소시키거나, 종양의 성장률을 감소시키거나 종양 파종 또는 전이의 가능성을 감소시킬 수 있다.　

[0075] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “약제학적으로 허용되는” 또는 “약리학적으로 허용되는”은 포유동물 또는 척추동물 대상체에게 투여되는 경우 부작용, 알레르기 또는 다른 목적하지 않은 반응을 생성하지 않은 치료학적 제제의 약제학적 제형을 언급한다.　 상기 제제는 FDA 생물학적 표준 사무소에서 요구하는 멸균,　발열성, 순도 및 기타 관련 표준에 대한 양호한 제조 수행능 (GMP) 표준을 준수하여 제조되어야 한다.

[0076] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 예를 들어, 수성 용매(예를 들어, 물, 알콜/수용액, 식염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸올레에이트), 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항세균 또는 항진균 제제, 항-산화물, 킬레이팅 제제 및 불활성 가스), 등장성 제제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향제, 염료, 유체 및 영양물 보충제, 이의 임의의 조합물과 같이, 포유동물 또는 척추동물 대상체에게 전달하기 위해 치료학적 제제의 제형화에 사용되는 임의의 모든 화학적 화합물 또는 용매를 언급한다.　

[0077] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “유닛 용량형”, “용량형”, 또는 “투여형”은 적당한 경로 및 목적하는 치료 용법에 따라 투여되는 치료학적으로 효과적일 것으로 예상되는 소정량의 제제를 함유하는, 포유동물 또는 척추동물 대상체로의 투여에 적합한 치료학적 제제의 제형을 언급한다. 대상체에게 투여될 특정 치료제의 실제 투여형은 예를 들어, 대상체의 체중, 연령, 건강, 및 성별, 치료받고 있는 질환 유형, 질환 진행 정도, 이전 또는 병행 치료학적 중재, 투여 경로 및 특정 치료학적 물질의 효능, 안정성 및 독성을 포함하는, 다양한 물리적 및 생리학적 파라미터 측면에서 보건의에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

II. T _EFF 세포를 재프로그래밍하는 방법

[0078] 하나의 양상에서, 본원의 개시내용은 항원-특이적 이펙터 T 세포 (T_EFF 세포)를 또 다른 목적하는 유형의 T 세포, 예를 들어, 중앙 기억 T 세포 (T_CM 세포)로 재프로그래밍하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본원에서는 항원-특이적 이펙터 T 세포(T_EFF 세포)를 중앙 기억 T 세포(T_CM 세포)로 재프로그래밍하기 위한 방법이 제공된다.

[0079] 특정 구현예에서, 방법은 하기의 단계를 포함한다: 대상체로부터 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 수득하는 단계; 임의로 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계.

[0080] 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-21을 첨가하기 전 HDACi의 존재하에 배양한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-21을 첨가하기 전 12 내지 48시간 동안 HDACi의 존재하에 배양한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 IL-21를 첨가하기 전 1 내지 3일 동안 HDACi의 존재하에 배양한다 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전에 IL-21의 존재하에 배양한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전 12 내지 48시간 동안 IL-21의 존재하에 배양한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 HDACi를 첨가하기 전 1 내지 3일 동안 IL-21의 존재하에 배양한다

[0081] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 대상체로부터 혈액 샘플을 채취함에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, 혈액 샘플은 추가로 분리반출법에 의해 정제한다. 특정 구현예에서, 분리반출법은 백혈구분리반출법을 포함하고 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 생성한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 대상체로부터 취득된 새로운 종양 생검 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플을 단리함에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 대상체로부터 취득된 새로운 종양 생검 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플을 단리하고 이들을 IL-2의 존재하에 배양함에 의해 TIL을 확장시킴에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 대상체로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플을 채취함에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 대상체 (예를 들어, 노인 대상체)로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플을 채취하고 이들을 IL-2의 존재하에 배양함에 의해 T_EFF 세포를 확장시킴에 의해 수득된다. 특정 양상에서, 출발 림프구 집단의 전처리 (예를 들어, 활성화)는 요구되지 않는다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 포유동물은 사람, 예를 들어, 노인이다.

[0082] 특정 구현예에서, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플은 대상체로부터 취득한 새로운 종양 생검 조직으로부터 제조된 세포 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 현탁액은 예를 들어, gentleMACS™　분해기 (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca)를 사용하여 종양 조직의 기계적 분해에 의해 수득된다. 특정 구현예에서, 세포 현탁액은 예를 들어, 콜라게나제를 사용하여 종양 조직의 효소적 분해에 의해 수득된다.

[0083] 특정 구현예에서, 상기 방법은 추가로 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 목적하는 T_EFF 세포 유형 및 서브타입을 단리하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 단리된 목적하는 T_EFF 세포 유형 또는 서브타입은 CD8⁺ T_EFF 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 또한 CD45RO를 발현한다. 특정 구현예에서, 단리된 CD8+ T_EFF 세포는 추가로 정제한다. 특정 구현예에서, 추가의 정제는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포(MDSC), TREG, NK 세포, 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, CD8+ T_EFF 세포는 당업자에게 널리 공지된 면역 세포 유형을 분리하는 임의의 다양한 방법, 예를 들어, 침강, 여과, 또는 상이한 세포 유형 (예를 들어, 크기, 밀도)의 물리적 성질에서의 차이를 이용하는 밀도 구배 원심분리; 현탁액 중 부유 세포로부터 접착 세포를 분리하기 위해 표면 전하 및 접착에서의 차이를 이용하는 플라스틱 또는 다른 중합체 표면으로의 접착; 특정 세포 표면 표현형을 기준으로 상이한 세포 유형을 선택적으로 포획하기 위해 세포 표면 항원의 하나 이상의 특이적 결합제 (예를 들어, 항체, 핵산 압타머)로의 결합을 사용하여 단리되거나 추가로 정제되고; 포획된 세포는 이어서 유동 세포측정, 컬럼 크로마토그래피, 자기 비드의 단리 또는 사용된 항체 시약에 의존하는 다른 방법에 의해 세포의 복합체 혼합물로부터 분리될 수 있다.

[0084] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계는 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), T_REG, NK 세포 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, MDSC, T_REG, NK 세포 및 대식세포가 고갈된 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 추가로 정제한다. 특정 구현예에서, 추가의 정제는 MDSC, T_REG, NK 세포 및 대식세포가 고갈된 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 목적하는 T_EFF 세포 유형 및 서브타입을 단리함을 포함한다. 특정 구현예에서, MDSC, T_REG, NK 세포 및 대식세포가 고갈된 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 단리된 목적하는 T_EFF 세포 유형 또는 서브타입은 CD8+ T_EFF 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, CD8⁺ T_EFF 세포는 또한 CD45RO를 발현한다. 특정 구현예에서, CD8+ T_EFF 세포는 당업자에게 널리 공지된 면역 세포 유형을 분리하는 임의의 다양한 방법, 예를 들어, 침강, 여과, 또는 상이한 세포 유형 (예를 들어, 크기, 밀도)의 물리적 성질에서의 차이를 이용하는 밀도 구배 원심분리; 현탁액 중 부유 세포로부터 접착 세포를 분리하기 위해 표면 전하 및 접착에서의 차이를 이용하는 플라스틱 또는 다른 중합체 표면으로의 접착; 특정 세포 표면 표현형을 기준으로 상이한 세포 유형을 선택적으로 포획하기 위해 세포 표면 항원의 하나 이상의 특이적 결합제 (예를 들어, 항체, 핵산 압타머)로의 결합을 사용하여 단리되거나 추가로 정제되고; 포획된 세포는 이어서 유동 세포측정, 컬럼 크로마토그래피, 자기 비드의 단리 또는 사용된 항체 시약에 의존하는 다른 방법에 의해 세포의 복합체 혼합물로부터 분리될 수 있다.

[0085] 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 하나 이상의 목적하는 T_EFF 세포 유형 또는 서브타입은 하나 이상의 세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 기반으로 하는 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단에 의해 동정되고/되거나 이로부터 단리된다. 상기 동정 및/또는 단리에 유용한 예시적인 세포 표면 마커는 예를 들어, CD34, 조혈 선조체 줄기 세포 항원, 동시 자극 분자, 예를 들어, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD28, 및 L-셀렉틴 (CD62L)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 T_EFF　집단은 CD45RO 및/또는 CD45RA의 이들의 발현을 기준으로 단리되거나 특징 분석된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 T_EFF　집단은 CD28, CD62L, CCR7 및/또는 CD127의 이들의 발현 부재를 기준으로 단리되거나 특징 분석된다. 특정 구현예에서, 상기 단리는 세포 표면 마커, 예를 들어, CD8의 발현에 대한 양성 선택을 포함하여, 목적하는 유형의 T_EFF 세포, 예를 들어, CD8⁺ T_EFF 세포는 보유된다. 특정 구현예에서, 상기 단리는 세포 표면 마커, 예를 들어, Foxp3의 발현에 대한 음성 선택을 포함하여, 목적하지 않은 유형의 T_EFF 세포, 예를 들어, T_REG는 제거된다.

[0086] 특정 구현예에서, 세포 표면 마커의 발현을 기준으로 목적하는 유형 또는 서브타입의 T_EFF의 동정 및/또는 단리는 예를 들어, 형광성-활성화된 세포 분류 (FACS), 컬럼 크로마토그래피 및 다른 크로마토그래피 방법, 자기 비드를 사용한 패닝, 웨스턴 블롯팅, 자기방사법, 전기영동, 및 다양한 다른 널리 공지된 면역학적 방법, 예를 들어, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 다양한 표준 방법에 의해 성취된다.

[0087] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하기 전에 추가로 배양되거나 확장된다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 인터류킨-2 (IL-2)에서 추가로 배양된다. 특정 구현예에서, IL-2는 50 U/ml 내지 6000 U/ml의 농도로 3일 마다 투여한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 컨플루언트할때까지, 예를 들어, 약 2 내지 약 21일, 바람직하게 약 10 내지 약 14일까지 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 이들이 10¹⁰ 이상의 세포와 같이 목적하는 농도에 도달할때까지 배양한다.

[0088] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 배양된 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 풀링하고 확장시킨다. 특정 구현예에서, 확장은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플과 비교하여 약 10일 내지 약 14일 동안 T_EFF 세포의 수에서 적어도 약 50-배, 적어도 약 60-배, 적어도 약 70-배, 적어도 약 80-배, 적어도 약 90-배, 또는 적어도 약 100-배의 증가를 제공한다. 특정 구현예에서, 확장은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플과 비교하여 약 10일 내지 약 14일 동안 T_EFF 세포의 수에서 적어도 약 200-배, 적어도 약 300-배, 적어도 약 400-배, 적어도 약 500-배, 적어도 약 600-배, 적어도 약 700-배, 적어도 약 800-배, 적어도 약 900-배, 또는 적어도 약 1000-배의 증가를 제공한다.

[0089] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 배양된 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플의 확장은 예를 들어, 피더 (feeder) 림프구 및 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재하에 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 다양한 표준 방법에 의해 성취된다. 특정 구현예에서, 비-특이적 T-세포 수용체 자극은 30 ng/ml 용량의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(Ortho-McNeil®, Raritan, Nj)를 포함한다.

[0090] 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 추가로 하나 이상의 세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 기준으로 재프로그래밍된 T_CM 세포를 동정하고/하거나 단리하는 단계를 포함한다. 상기 동정 및/또는 단리에 유용한 예시적 세포 표면 마커는 예를 들어, CD45RO, CD28, CD62L, CCR7, CD127, 및 CD27을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 T_CM　집단은 CD28 및/또는 CD62L의 이들의 발현을 기준으로 단리되거나 특징 분석된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 T_CM　집단은 CD45RA의 이들의 발현의 부재를 기준으로 단리되거나 특징 분석된다. 특정 구현예에서, 상기 단리는 세포 표면 마커, 예를 들어, CD8의 발현에 대한 양성 선택을 포함하여, 목적하는 유형의 T 세포, 예를 들어, CD8⁺ T_CM 세포는 보유된다. 특정 구현예에서, 상기 단리는 세포 표면 마커, 예를 들어, CD45RA의 발현에 대한 음성 선택을 포함하여, 목적하지 않은 유형의 T 세포, 예를 들어, T_N은 제거된다.

[0091] 특정 구현예에서, 세포 표면 마커의 발현을 기준으로 T_CM의 동정 및/또는 단리는 예를 들어, 형광성-활성화된 세포 분류 (FACS), 컬럼 크로마토그래피 및 다른 크로마토그래피 방법, 자기 비드를 사용한 패닝, 웨스턴 블롯팅, 자기방사법, 전기영동, 및 다양한 다른 널리 공지된 면역학적 방법, 예를 들어, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 다양한 표준 방법에 의해 성취된다.

A. 가공된 T _EFF 세포　

[0092] 또 다른 양상에서, 항원-특이적 T_EFF 세포를 본원에 제공된 T_CM 세포로 재프로그래밍하기 위한 방법에 사용하기 위한 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단은 가공된 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 가공된 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포(CAR T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 가공된 T 세포는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 결합할 수 있는 재조합 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 포함한다.

[0093] 일부 구현예에서, 가공된 T　세포는 당업자에게 공지된 임의의 많은 잘 확립된 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 가공된 세포는 목적하는 표적 종양 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 암호화하거나 목적하는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 특이적인 재조합 TCR을 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 가공된 세포는 목적하는 표적 종양 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체를 암호화하거나 목적하는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 특이적인 재조합 TCR을 암호화하는 핵산을 도입하기 위해 비-바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 작제된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터 기반 유전자 전달 방법은 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 클러스터링된 규칙적 간극의 짧은 팔린드롬 반복체(CRISPR)/CRISPR-연합된 단백질 9 (Cas9) 뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 편집 방법을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터 기반 유전자 편집 방법은 지질감염, 핵감염, 유전자총, 비로좀(virosome), 리포좀, 다가양이온(polycation) 또는 지질:핵산 접합체, 나출된 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제 증진된 취득으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 형질감염 또는 형질전환 방법을 포함한다.

[0094] 특정 구현예에서, CAR T 세포는 세포외 항원-결합 도메인, 선택적 스페이서 서열, 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 CAR T 세포를 활성화시키거나 불활성화시키기 위한 하나 이상의 선택적 조절 서열을 포함하는 CAR 작제물을 발현한다.

[0095] 특정 구현예에서, 세포외 항원-결합 도메인은 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 이의 항원-결합 단편은 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 종양-특이적 항원이다. 특정 구현예에서, 종양-특이적 항원은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원 (MAGE) (예를 들어, MAGE-1, MAGE-11, 또는 MAGE-A), 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, 및 사람 파필로마 바이러스 (HPV)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 종양-특이적 네오에피토프이다. 특정 구현예에서, 종양 특이적 네오에피토프는 인 실리코 분석에 의해 동정된다. 특정 구현예에서, 종양-특이적 네오에피토프는 사람 대상체로부터 유래된 자가 TIL 집단으로부터 동정되고 정제된다.

[0096] 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 세포 막에 걸칠 수 있는 구조를 형성할 수 있는 임의의 합성 또는 천연 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 막에 걸칠 수 있는 구조물은 알파 헬릭스를 포함한다. 특정 구현예에서, 막관통 영역은 CD3ζ, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB/CD137, CD154, 유도성 T 세포 동시자극인자 (ICOS)/CD278, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 (GITR)/CD357, NKG2D, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천연적으로 존재하는 막관통 단백질로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 천연적으로 존재하는 막관통 단백질로부터 유래된 막관통 영역은 다른 신호전달 단백질과의 상호작용에 관여하는 것으로 공지된 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

[0097] 특정 구현예에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 세포내 티로신 기반 활성화 모티프 (“ITAM”)를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 ITAM은 CD3-제타 (CD3ξ) 분자 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 추가로 CD28, 4-1BB/CD137, ICOS, OX40, CD2, CD40L, CD27, 라이트(Light)-R, GITR, 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동시자극 신호전달 도메인을 포함한다.

B. 재조합 T 세포 수용체 (TCR)　

[0098] 특정 구현예에서, T 세포는 종양-특이적 에피토프 또는 네오에피토프에 결합할 수 있는 재조합 T 세포 수용체를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 T 세포 수용체는 대상체로부터 단리된 T 세포로부터 클로닝된 천연적으로 존재하는 TCR을 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR은 TCR 알파 (TCRα) 폴리펩타이드 및 TCR 베타 (TCRβ) 폴리펩타이드 (즉, TCRαβ)를 포함하는 이종이량체를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 TCR은 TCR 감마 (TCRγ) 폴리펩타이드 및 TCR 델타 (TCRδ) 폴리펩타이드 (즉, TCRγδ)를 포함하는 이종이량체를 포함한다.

[0099] 특정 구현예에서, 재조합 TCRαβ는 대상체로부터 단리되고 목적하는 표적으로부터 유래된 펩타이드 항원에 특이적인 클로닝된 TCRαβ를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 포유동물은 사람이다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양 특이적 항원이다. 특정 구현예에서, 재조합 TCRγδ는 대상체로부터 단리되고 목적하는 표적으로부터 유래된 펩타이드 항원에 특이적인 클로닝된 TCRγδ를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 포유동물은 사람이다. 특정 구현예에서, 목적하는 표적은 CD19, CD20, CD22, 암배아 항원, 알파페토단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파쇄, 람다쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 및 VEGFR2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양 특이적 항원이다.

C. 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi)

[0100] 본원에서 항원-특이적 이펙터 T 세포 (T_EFF 세포)를 중앙 기억 T 세포 (T_CM 세포)로 재프로그래밍하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 조합된 IL-21　및　HDACi　치료는 부가적 초과의 효과를 가져 이펙터 T 세포로부터 중앙 기억 표현형을 유도하고 IL-2 및 IL-5에 대한 반응을 증진시킨다.

[0101] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 HDACi 및 IL-21과 순차적으로 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 먼저 HDACi (예를 들어, 0.1-5 nM, 예를 들어, 1-3 nM)와 배양하고 이어서 IL-21 (예를 들어, 10-50 ng/mL, 예를 들어, 20-40 ng/mL, 특히 약 30 ng/mL)와 배양하였다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 먼저 IL-21(예를 들어, 10-50 ng/mL, 예를 들어, 20-40 ng/mL, 특히 약 30 ng/mL)와 배양하고 이어서 HDACi (예를 들어, 0.1-5 nM, 예를 들어, 1-3 nM)와 배양하였다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 T_CM 표현형을 유도하기에 충분한 기간 동안 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 7 내지 20일 동안 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 12 내지 16일동안 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 동안 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 13, 14 또는 15일 동안 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양한다.

[0102] 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 하나 이상의 추가의 사이토킨, 케모킨 또는 성장 인자의 존재하에 추가로 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플은 IL-2의 존재하에 추가로 배양한다. 특정 구현예에서, T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양하기 전에 IL-2의 존재하에 배양한다.

[0103] 특정 구현예에서, HDACi는 이의 데아세틸라제 활성을 위해 조인자로서 Zn²⁺를 요구하는 고전적 HDACi를 포함한다. 특정 구현예에서, 고전적 HDACi는 하이드록삼산 또는 하이드록사메이트, 사이클릭 테트라펩타이드 및 뎁시펩타이드, 벤즈아미드, 친전자성 케톤, 및 지방족 산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, HDACi는 하이드록삼산 또는 하이드록사메이트를 포함한다. 특정 구현예에서, 하이드록삼산 또는 하이드록사메이트는 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트(Farydaq®로서 시판됨), 및 다시노스타트 (LAQ824)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, HDACi는 벤즈아미드를 포함한다. 특정 구현예에서, 벤즈아미드는 엔티노스타트 (SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린 (CI994), 및 모세티노스타트(MGCD0103)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, HDACi는 사이클릭 테트라펩타이드 또는 뎁시펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 사이클릭 테트라펩타이드 또는 뎁시펩타이드는 트라폭신 B이다. 특정 구현예에서, HDACi는 지방족 산이다. 특정 구현예에서, 지방족 산은 페닐부티레이트 및 발프로산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

D. 인터류킨-21 (IL-21)

[0104] 사람 인터류킨 21 (IL-21)은 바이러스 감염되거나 암성 세포를 파괴할 수 있는 천연 킬러 (NK) 세포 및 세포독성 T 세포를 포함하는, 면역계의 세포에 대해 강력한 조절 효과를 갖는, IL-21 유전자에 의해 암호화된 단백질 사이토킨이다. 162개 아미노산 사람 IL-21 단백질 (GenBank 승인 번호. BBA22643; 서열번호 1)은 미국 특허 제6,307,024호, 및 미국 특허 제6,686,178호에 기재되어 있고, 이 둘다는 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 방법은 중앙 기억 T 세포의 생성을 위해 이펙터 T 세포를 HDACi와 조합된 IL-21로 처리하는 것이다. 일부 양상에서, IL-21은 10 ng/mL 내지 50 ng/mL, 예를 들어, 15 ng/mL 내지 60 mg/mL, 예를 들어, 20 ng/mL 내지 40 ng/mL, 특히 약 25, 30, 또는 35 ng/mL의 농도로 배양 배지에 존재한다.　

III. 사용 방법

[0105] 또 다른 양상에서, 본원에서 대상체 내 암 또는 감염을 치료하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단을 상기 대상체에게 투여함을 포함한다. 세포는 TIL이 배양될 수 있는 암을 갖는 대상체에게 입양적으로 전달될 수 있거나 종양 항원-특이적 CTL은 시험관내 생성될 수 있다.

[0106] 본 발명의 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

[0107] 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma); 선단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanomas); 결절성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 벌크 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 급성 골수 백혈병 (AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.

[0108] 특정 구현예에서, 방법은 치료학적 유효량의 T_CM 세포 집단의 투여 전에 림프구고갈을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 림프구고갈은 비-골수절제 림프구고갈 화학치료요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 비-골수절제 림프구고갈 화학치료요법은 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함한다.

[0109] 특정 구현예에서, 상기 방법은 자가 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 T-세포 성장 인자를 자가 T 세포와 동시에 또는 자가 T 세포에 후속적으로 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 성장 인자는 자가 T-세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자를 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 성장 인자는 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12, 및 이의 조합(예를 들어, IL-2 및 IL-7, IL-2 및 IL-15, IL-7 및 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15, IL-12 및 IL-7, IL-12 및 IL-15, 또는 IL-12 및 IL-2)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

[0110] 특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단은 정맥내, 종양내 또는 복막내로 대상체에게 투여된다. T 세포 치료요법의 적당한 투여형은 치료될 암의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 개체의 임상적 조건, 개체의 임상적 병력 및 치료에 대한 반응 및 담당의의 판단을 기준으로 결정될 수 있다.

A. 조합 치료요법　

[0111] 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 추가로 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 모든 추가의 치료학적 제제는 임의의 잠재적 독성. 가능한 부작용 및 임의의 다른 관련 인자를 고려하여, 각각 특정 조성물 또는 치료요법에 대해 양호한 임상 관행에 따라 대상체에게 투여된다.

[0112] 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법, 방사선 치료요법, 수술 (예를 들어, 종양의 수술 절제), 화학치료요법, 골수 이식 또는 이전의 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 표적화된 치료요법일 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 1차 치료 전 (즉, 보조제 치료요법으로서) 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 1차 치료 후 (즉, 신규보조제 치료요법으로서) 투여된다.

[0113] 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 프로그램화된 세포사 경로 1 (PD-1/CD279) 및 이의 리간드(PD-L1/CD274 및 PD-L2/CD273), 세포독성 T 림프구-관련 항원 4 (CTLA-4/CD152), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3/CD223), B 및 T 림프구 약독화인자 (BTLA), Ig 및 면역수용체 티로신-기반 억제성 모티프 (ITIM) 도메인 (TIGIT)을 갖는 T 세포 면역수용체, T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3/HAVcr2), 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR/CD158), T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 서프레서(VISTA), 및 아데노신 A2a 수용체 (A2aR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 단백질을 억제한다.

[0114] 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1 결합 길항제이다. 특정 구현예에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체이다. 특정 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　면역글로불린 불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융ㄹ합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다.

[0115] 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 CTLA-4 결합 길항제이다. 특정 구현예에서, 상기 CTLA-4 결합 길항제는 항-CTLA-4 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

[0116] 특정 구현예에서, 추가의 치료학적 제제는 방사선치료요법을 사용한 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 감마선 (γ-선), X-선, 마이크로파, 양성자 빔 조사, 자외선 조사 및 방사성동위원소의 종양으로의 지시된 전달로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 X-선을 사용한 치료를 포함한다. 특정 구현예에서, X-선은 3 내지 4주의 기간 동안 50 내지 200 뢴트겐의 하루 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, X-선은 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량으로 투여된다.　 특정 구현예에서, 방사선치료요법은 방사성동위원소의 종양으로의 지시된 전달을 포함한다. 방사성동위원소에 대한 용량 범위는 동위원소의 반감기, 방출된 조사 강도 및 유형 및 종양 세포에 의한 흡수 정도에 의존하여 광범위하게 다양하지만 적당한 치료학적 유효량의 결정은 당업계 기술 수준내에 있다.

[0117] 특정 구현예에서, 추가의 치료학적 제제는 1차 치료와 관련된 부작용 (예를 들어, 구역질. 악액질 등)의 치료를 위한 제제의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 면역치료요법을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방사선치료요법은 감마 조사를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법 및 수술의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 알킬화제, 안트라사이클린, 세포골격 붕괴제, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 키나제 억제제, 뉴클레오타이드 유사체 및 뉴클레오타이드 전구체 유사체, 펩타이드 항생제, 백금계 화합물, 레티노이드, 빈카 알칼로이드 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학치료학적 제제 부류를 사용한 치료를 포함한다.

[0118] 본원에서 고려되는 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물의 투여 전, 투여 후 또는 투여와 동시에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 추가의 치료요법은 본원에 제공된 조성물의 투여 전 또는 후에 하나 이상의 간격으로 투여된다. 치료받는 대상체가 조합 치료요법으로 부터 혜택을 받을 수 있도록 추가의 치료요법의 투여를 위한 적당한 간격의 결정은 당업자의 기술 수준 내에 있다.

B. 약제학적 조성물　

[0119] 또 다른 양상에서, 본원에서 T_CM 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.

[0120] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 수용액 형태. 예를 들어, 생리 식염수(예를 들어. 0/9%) 및 사람 혈청 알부민 (예를 들어, 10%)의 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22^nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).

II. 실시예

[0121] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명한다.　　당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다.　　그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 실시양태에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.　

실시예 1　-　이펙터 T 세포의 중앙 기억 T 세포로의 재프로그래밍　

[0122] CD28의 고발현과 일치하여, 나이브 CD8⁺ T 세포는 이펙터 기억 CD8⁺ T 세포와 비교하여 CD28의 프로모터 상에서 및 전사 개시 부위 근처에서 급격히 증가된 아세틸화된 히스톤 H3 (AcH3)을 보여주었다(도 1a). 이들 결과는 CD8⁺ T 세포 분화가 히스톤 아세틸화의 상실을 수반하고 히스톤 탈아세틸화의 억제는 CD8⁺ T 세포 분화를 역전시킬 수 있다. 도 1b는 1uM 이상의 SAHA가 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 AcH3 수준을 증강시킴을 보여주고, 도 1c는 IL-21이 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 STAT3 인산화를 유도하였음을 지적한다.

[0123] 본 연구는 CD45RO를 발현하는 이펙터 T 세포를 CD62L 및 CD28을 발현하는 중앙 기억 T 세포로 재프로그랭하거나 탈분화시키기 위한 방법을 개발하기 위해 수행되었다(도 8).　중앙 기억 마커 CD28 및 CD62L에 대한 IL-21 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 치료의 효과를 평가하였다. MART1 (M27)-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포는 처리되지 않거나 24시간 동안 SAHA로 전처리하고 이어서 4일 동안 SAHA/IL-21의 존재 또는 부재에서 M27-펄스된 성숙한 수지상 세포로 활성화시킨다. 대조군 세포 (SAHA 부재, IL-21 부재)와 비교하여, IL-21 단독은 CD28 발현을 약간 증가시켰다. 단독의 SAHA는 CD28 발현을 상향조절하였고, 흥미롭게도, SAHA 및 IL-21은 함께 CD28 발현을 급격히 증진시켰고 이는 CD28 발현에 대한 SAHA 및 IL-21의 협력 효과를 입증한다(도 2a).

[0124] 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하고 이어서 사이토킨 IL-2를　사용하여 확장시켰다.　TIL은 2주 동안 IL-21　(30 ng/mL) 또는 IL-21 및　HDACi　(SAHA)의 조합으로 처리하였다.　확장 말기에, TIL은 CD8,　CD28　및　CD62L에 대한 항체로 염색시키고, CD8⁺　게이트를 사용하여 분석하였다.　결과는 HDACi　및 IL-21 처리의 조합이 중앙 기억 T 세포의 퍼센트를 상당히 증가시킴을 보여주었다(도 2b).

[0125] 추가로, CD28 프로모터 상의 STAT 결합 부위 근처에 AcH3 및 STAT3 농축의 ChiP 결과는 HDACi (SAHA) 처리가 CD28 프로모터 상에 아세틸화된 H3 (AcH3) 수준을 증가시켜, IL-21-유도된 STAT3가 동일한 DNA 영역에 결합하도록 함을 보여주었다(도 2c).

[0126] 파노비노스타트는 0.5nM 이상의 용량에서 AcH3 수준을 증가시켰다(도 3a). 파노비노스타트의 존재 또는 부재하에 소형-REP로의 IL-21의 첨가는 세포 확장의 수율을 급격히 증가시켰고(도 3b) 파노비노스타트는 IL-21에 의한 CD28⁺CD62L⁺ 세포 집단의 유도를 상당히 증진시켰다(도 3c). 정기적 REP에서, 단독의 파노비노스타트 (Pano)의 REP로의 첨가가 확장 수율을 약간 증가시키긴 하였지만, 확장 배수는 다른 3개의 조건에 대해 유사하였다(도 3d).

[0127] 이들 결과를 입증하기 위해,　중앙 기억 및 이펙터 T 세포를 포함하는 항원-특이적 CTL 세포주를 확장시키고 CD8, CD28 및 CD62L에 대한 항체로 염색하고 CD8⁺　게이트에서 분석하였다.　　IL-21와 HDACi　파노비노스타트의 조합 처리는 약 0.5% 중앙 기억 T 세포로부터 19% 초과의 중앙 기억 T 세포로의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 4a).

[0128] 확장된 TILs/CTL은 또한 CD8 및 CD132에 대한 항체로 염색하였고 CD8⁺ 게이트를 사용하여 분석하였다.　IL-21은 CD132 (γ　쇄) 발현을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다(도 4c).　추가로, 확장된 CTL은 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지시키고 IL-2 또는 IL-15와 함께 2일 동안 배양하여 세포 분열을 검사하였다.　IL-21 및 파노비노스타트-처리된 세포는 γ-쇄　사이토킨 IL-2 및 IL-15에 대해 증진된 반응을 보여주었다.　(도 4b).

[0129] 도 5a는 IL-21 및 파노비노스타트-유도된 CD28⁺CD62L⁺ 세포가 CD28, CD62L, Lef1 및 Tcf1를 고도로 발현시킴을 보여주고, 이는 이들 세포가 CD28^-CD62L^- 세포 보다 덜 분화되어 있음을 시사하였다.

[0130] 임상적 관련 TIL 확장에서 IL-21 및 파노비노스타트의 효과를 평가하였다. 확장에 단독의 파노비노스타트의 포함은 하나의 TIL 세포주에서 생성물 수율을 감소시켰지만, 확장 배수는 확장에서 IL-21/파노비노스타트를 사용한 정기적 확장에 대해 유사하였다(도 5b).

[0131] 확장 말기에, 크로뮴-방출 검정(CRA)을 수행하여 상이한 조건하에 확장된 세포의 종양 사멸 효율을 평가하였다.　IL-21 처리 및 조합된 파노비노스타트+IL-21 처리는 종양 세포 사멸을 증진시켰다(도 6a). 확장 후, 종양 항원-특이적 CTL 세포는 종양 세포로 재자극시키고 이어서 세포내 염색하였다.　IL-21은 IFNγ　및 그랜자임 B 발현을 증강시켰다(도 6b).　

[0132] 또 다른 실험에서, 최종적으로 분화되고 비-최종적으로 분화된 TIL의 이종성 집단을 확장시키고 CD8, CD28 및 CD62L에 대한 항체로 염색하였고,　CD8⁺ 게이트를 사용하여 분석하였다.　IL-21 및　파노비노스타트(Pano) 처리는 TIL 상에서 중앙 기억 마커 CD28 및 CD62L 발현을 상향조절하였다(도 7a).

[0133] 따라서, HDACi를 사용하여 이펙터 T 세포를 재프로그래밍하여 이들이 기억 T 세포에 민감성이되도록 할 수 있다.　결론적으로, 조합된 IL-21　및　HDACi　처리는 상승작용효과를 가져 이펙터 T 세포로부터 중앙 기억 표현형을 유도하고 IL-2 및 IL-15에 대한 반응을 증진시키는 것으로 나타났다.　　　

실시예 2 - 물질과 방법　

[0134] 종양 항원-특이적 CTL 세포주 또는 종양 침윤 림프구(TIL)의 확장:　 CTL 세포주 또는 TIL은 항-CD3을 사용하여 확장시키고 신속한 확장을 위해 피더 세포로서 동종이계 PBMC　또는　림프아구성 세포주 (LCL)　(CTL 세포주에 대해)를 방사능 조사하였다.　TIL은 환자 흑색종 종양으로부터 배양하였다. 배양물에 3일 마다 50 U/ml　(CTL 세포주에 대해) 또는 6000 U/ml (TIL에 대해)로 IL-2를 공급하였다.　　IL-21 (30ng/ml) 또는　HDACi　파노비노스타트　(3nM) (대조군으로서) 또는 IL-21 및　HDACi의 조합은 0, 4 및 7일에 공급하였다.　14일 후, 세포는 추가의 분석을 위해 사용하였다. SAHA를 사용한 연구를 위해 (도 2), SAHA는 1-5 μM로 사용하였다.

[0135] 유동 세포측정: 　 세포는 CD8, CD28, CD62L 또는 CD132에 대한 항체로 염색하였다. 모든 FACS 데이터는 LSR II 유동 세포측정기를 통해 획득하였고 FlowJo　소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 통해 분석하였다.

[0136] 세포내 염색: 세포는 16시간 동안 종양 세포로 재극하였고 CD8에 대한 항체로 염색하고 이어서 고정화시키고 투과성 완충액 중에서 IFN-γ 및 그랜자임 B에 대한 항체로 염색하였다. 세포는 세척하고 분석 전 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다.

[0137] 정량적 실시간 PCR: 　 총 RNA는 Qiagen RNA 정제 키트를 사용하여 제조하였다. cDNA는 Superscript 역전사 효소 및 올리고(dT) 프라이머(Life Technology)를 사용하여 제조하였고, 유전자 발현은 iQ　SYBR　그린 실시간　PCR 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하는 Bio-Rad　iCycler 광학 시스템으로 검출하였다. 데이터는 참조 유전자　RPL13A로 정규화하였다. RPL13A 프라이머는 제조원(Qiagen)으로부터 구입하였다. 사용되는 다른 프라이머 쌍은 다음과 같다: CD28 정배향: CTCACACTTCGGGTTCCTCGG　(서열번호 2), 역배향: GACTCCACCAACCACCACCAG　(서열번호 3); CD62L 정배향: ATGGAACGATGACGCCTGCC　(서열번호 4), 역배향: GGCCTCCAAAGGCTCACACT　(서열번호 5); 추가의 프라이머는 림프구성 증진제-결합 인자 1 (LEF1) 정배향: CACACCCGTCACACATCCCA (서열번호 6), 역배향: TGGGAAAACCAGCCAAGAGGTG (서열번호 7); 전사 인자 1 (TCF1) 정배향: TGCAGCTATACCCAGGCTGG (서열번호 8), 역배향: CCTCGACCGCCTCTTCTTC (서열번호 9)를 포함하였다.

[0138] 염색질 면역침전 (ChIP): ChIP는 제조업자의 지침 (Millipore)에 따른 ChiP 검정 키트를 사용하여 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 프라이머로 수행하였다: CD28 프로모터 근접 STAT 부위: 정배향 TCTGCTGGATTTCAAGCACCC (SEQ ID NO:10), 역배향 GACTGCAGCATTTCACACAGG (서열번호 11); 원위 STAT 부위: 정배향 TGCTTGCACGTAGAATGGGT (서열번호 12), 역배향 GGATGGGGACAGGTTGTGTC (서열번호 13); 토끼 IgG는 음성 대조군으로서 사용하였다.

[0139] 크로뮴 방출 검정 (CRA): 　 종양 세포는 4시간 동안 20:1의 이펙터:종양에서 항원-특이적 CTL로 항온처리하기 전에 Cr51로 표지시켰다. 상등액 중의 Cr51 양을 측정하고 사멸 효율은 다음과 같이 계산하였다: % 사멸 =100% x　(샘플 평균 - 음성 대조군의 평균) / (양성 대조군의 평균 - 음성 대조군의 평균).

[0140] 소형-REP는 상응하게 T25 플라스크로부터 24-웰 플레이트로 축소시키면서 개시하였다. IL-21 및 파노비노스타트 용량은 변화되지 않은 상태로 남아있다.

[0141] 통계학적 분석: 　 데이터의 그래프 제공 및 통계학적 분석은 GraphPad　프리즘(버젼　6,　GraphPad　소프트웨어,　San　Diego,　CA) 및　엑셀을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 및 STD로서 나타낸다.　실험 그룹 간의 결과는 스튜던트 t 시험을 사용하여 비교하였다. p<0.05는 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다. 통계학적 유의성은 *P <　0.05,　**P　<　0.01, ***P < 0.001로서 나타낸다.　

실시예 3　- 사람 이펙터의 기억 CD8 ⁺ T 세포로의 재프로그래밍

[0142] IL-21은 활성화된 사람 나이브 CD8+ T 세포 상의 CD28 발현을 상향조절한다: CD28은 나이브 T 세포 활성화 및 기억 T 세포 기능을 위한 주요 동시자극 분자이다. 시험관내 종양-항원 특이적 CTL의 생성에 대한 다양한 γC 사이토킨의 효과를 비교하는 이전의 연구는 IL-21이 증진된 지속성을 나타내고 입양 전달 후 환자 임상 반응을 개선시키는 CD28^hi CTL를 농축시키는 특유의 능력을 가짐을 밝혔다. IL-21-유도된 CD28 발현의 분자 기전을 조사하기 위해, T 세포 (MART1, M27)-특이적 CTL에 의해 인지되는 흑색종 항원은 이전에 기재된 바와 같이 IL-21의 부재 또는 존재하에 생성하였다(문헌참조: Li t al., 2005). IL-21을 사용하여 생성된 M27-특이적 CTL은 IL-21의 부재하에 생성된 세포 보다 상당히 높은 CD28 발현을 나타냈다(도 9a 및 b). 상기 발견을 추가로 확증하기 위해, 건강한 공여자로부터 분류-정제된 나이브 사람 CD8⁺ T 세포 (CD45RA⁺CCR7⁺)는 IL-21의 부재 또는 존재하에 항-CD3/CD28 비드를 사용하여 활성화시키고 표면 CD28 발현은 유동 세포측정에 의해 검출하였다. 항원-특이적 CTL과 일치하여(도 9a 및 b), CD28의 표면 수준 발현은 폴리클로날적으로 활성화된 IL-21-처리된 사람 나이브 CD8⁺ T 세포에서 상당히 증가하였다(도 9c 및 d). 증진된 CD28 단백질 발현과 일치하여, 크게 증강된 CD28 mRNA 수준은 IL-21의 존재하에 생성된 M27-특이적 CTL (도 9e)에서 및 IL-21-처리된 항-CD3/CD28 활성화된 사람 나이브 CD8⁺ T 세포(도 9f)에서 일관되게 검출되었다. 이들 결과는 함께 IL-21이 CD28 mRNA 발현을 상향조절하여 CD28 표면 수준 발현을 증가시켰다.

[0143] STAT3 활성화는 CD28 발현의 IL-21-매개된 증진을 위해 요구된다: IL-21은 야누스(Janus)-활성화된 키나제 1 (JAK1) 및 JAK3의 활성화 및 전사 (STAT)-3, 보다 더 드물게는 STAT1 및 STAT5의 신호 변환인자 및 활성화인자의 후속적 인산화를 통해 기능한다. 따라서, STAT1, STAT3 및 STAT5의 인산화는 배양 조건하에 나이브 CD8+ T 세포에서 조사하였다. 건강한 공여자로부터 사람 나이브 CD8⁺ T 세포는 상이한 시기 동안 IL-21의 부재 또는 존재하에 항-CD3/CD28 비드로 활성화시켰다. IL-21 자극은 활성화 후 30분에 강한 STAT1 및 STAT3 인산화를 유도하였지만 약한 STAT5 인산화를 유도하였다(도 16a). IL-21은 강한 STAT1 및 STAT3 활성화를 유도하고, 상기 연구는 STAT1 및/또는 STAT3 활성화가 IL-21에 의한 CD28 상향조절을 위해 필수적인지의 여부를 설명하기 위한 것을 목적으로 한다. STAT3의 역할을 조사하기 위해, 잡 (Job) 증후군 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하였다. 잡 증후군 (또한 고수준-IgE 증후군으로서 공지된, 혈중 비정상적 고수준의 면역글로불린 E (IgE)를 특징으로 하는)은 STAT3 유전자 내 우성의 음성 돌연변이로 인해 감소된 STAT3 기능에 의해 유발된다. 총 CD8⁺ T 세포는 건겅한 공여자 또는 잡 증후군 환자의 PBMC로부터 단리하고 상기한 바와 같이 활성화하였다. IL-21은 건강한 공여자로부터의 CD8⁺ T 세포에서 단백질 및 mRNA 수준 둘다에서 CD28의 발현을 증가시켰지만, CD28 발현의 IL-21-매개된 증진은 잡 증후군 환자로부터의 세포에서 완전히 중단되었다(도 17a-c). 이들 결과는 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포에서 IL-21에 의한 CD28 발현의 상향조절을 위해 중요함을 지적하였다.

[0144] 상기 발견을 추가로 확인하기 위해 그리고 또한 IL-21-유도된 CD28 상향조절에서 STAT1의 역할을 평가하기 위해, 사람 STAT1 또는 STAT3 유전자의 다양한 영역을 표적화하는 상이한 shRNA 작제물을 사용하여 비처리된 사람 CD8⁺ T 세포에서 STAT1 또는 STAT3 발현을 녹다운시켰다. 총 STAT1 및 STAT3 수준은 STAT1 또는 STAT3 shRNA가 특이적으로 및 효율적으로 이들 각각의 단백질의 발현을 감소시킴을 보여주었다(도 16b). 도 10d-f에 나타낸 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, IL-21-유도된 CD28 단백질 및 mRNA 상향조절은 STAT3 shRNA-형질감염되고 활성화된 CD8⁺ T 세포에서 감소하였지만 STAT1 shRNA-형질감염되고 활성화된 세포에서는 감소하지 않았다. 이들 결과는 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포에서 CD28 발현의 IL-21-유도된 상향조절에서 STAT3의 중요한 역할을 지지하였지만, STAT1은 아니었다. 상기 발견과 일치하여, STAT3 돌연변이체, STAT1 돌연변이체 및 IL21R 돌연변이체 환자 세포의 이전의 연구는, STAT1은 아닌 IL21/STAT3가 CD8+ 중앙 기억 (CD45RA^-CCR7⁺) 및 이펙터 기억(CD45RA^-CCR7^-) 세포의 생체내 분화를 위해 요구됨을 지적하였다.

[0145] STAT3이 활성화된 사람 CD8⁺ T 세포에서 CD28 발현의 IL-21-유도된 상향조절을 매개하게 하는 분자 기전을 추가로 설명하기 위해, 사람 CD28 프로모터를 분석하고 여러 컨센서스 STAT 부위는 CD28 프로모터의 근위 및 원위 부분에 클러스터링되어 있는 것으로 동정되었다. ChIP 검정은 단독의 항-CD3/CD28 처리와 상대적으로, 항-CD3/CD28 및 IL-21로 활성화된 세포에서 근접 및 원위 CD28 프로모터 영역 둘다에서 STAT3의 2 내지 3배 농축을 보여주었다(도 10g). 총체적으로, 이들 결과는 IL-21-활성화된 STAT3이 사람 CD28 프로모터에 결합하여 CD28 전사를 촉진시킴을 시사하였다.

[0146] IL-21에 반응한 CD28의 차등적 유도는 나이브 및 이펙터 CD8 ⁺ T 세포에서 히스톤 H3 아세틸화 수준과 상호관련된다. 상기 연구는 IL-21이 특유하게 활성화 후 나이브 CD8⁺ T 세포상의 CD28 발현을 증진시킴을 입증하였다. 그러나, IL-21에 의한 CD28의 유도는 이들의 동족 펩타이드-펄스된 성숙한 수지상 세포로 활성화된 MART1 (M27)-특이적 이펙터 CD8+ T 세포 상에서 관찰되지 않았다(도 11a 및 b). IL-21은 주로 STAT3의 인산화를 통해 기능하고(도 10), IL-21-유도된 STAT3 인산화 수준은 나이브 및 이펙터 CD8⁺ T-세포에서 비교하고 상응하는 것으로 밝혀졌고(도 11c), 이는 이펙터 CD8⁺ T 세포 상의 CD28 발현을 증가시키는 IL-21의 무능력이 IL-21 신호전달의 부재로 인한 것이 아니고 pSTAT3의 이의 결합 부위로의 근접 부재로 인한 것임을 시사한다.

[0147] 염색질 접근성과 유전자 발현은 히스톤 아세틸화에 의해 조절될 수 있다. 히스톤 아세틸화 수준이 CD28 발현과 상호관련되는지를 결정하기 위해, 염색질 면역침전 (ChIP)은 각각 높고 낮은 CD28 수준을 갖는, 나이브 (CD45RA⁺CCR7⁺) 및 T_EMRA 이펙터 기억 (CD45RA⁺CCR7^-) CD8⁺ T 세포에 대해 수행되었다. 이들의 높은 CD28 발현과 일치하여, 나이브 CD8⁺ T 세포는 T_EMRA CD8⁺ T 세포와 비교하여 CD28 유전자의 프로모터 상에 및 전사 개시 부위 근처의 원위 및 근접 STAT3 결합 부위 주변의 증가된 아세틸화된 히스톤 H3 (AcH3)을 보여주었다(도 11d). IL-21 처리는 활성화된 T_EMRA CD8⁺ T 세포에서 CD28 발현을 최소로 상향조절하였다(도 11e). 유사하게, MART1 (M27)-특이적 CD28neg 이펙터 CD8⁺ T 세포는 나이브 CD8⁺ T 세포와 비교하여 CD28 유전자좌 상에 상당히 감소된 AcH3 수준을 나타냈다(도 11f). 이들 결과는 CD28 전사가 히스톤 아세틸화에 의해 조절됨을 지적했고, 이는 나이브 및 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 IL-21에 의한 CD28의 차등적 유도와 상호관련된다. 따라서, AcH3의 조절은 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 IL-21-매개된 CD28 상향조절을 가능하게 할 수 있다.

[0148] SAHA는 IL-21-유도된 pSTAT3이 CD28 프로모터에 근접하도록 하고 이펙터 CD8 ⁺ T 세포에서 CD28 발현을 상향조절한다. 상기 발견은 CD28 전사가 히스톤 아세틸화에 의해 조절됨을 지적하였고, 이는 히스톤 아세틸화 수준의 감소가 CD8⁺ T 세포 분화 및 나이브/중앙 기억 마커 발현의 상실을 유도할 수 있음을 시사한다. HDACi의 사용을 통한 히스톤 아세틸화의 증가가 CD8⁺ T 세포 분화를 역전시키는 것으로 추정되었다. IL-21은 히스톤 아세틸화의 보다 높은 수준을 갖는(도 11d), 나이브 CD8⁺ T 세포 상의 CD28 발현을 상당히 증가시키기 때문에(도 9), HDACi 및 IL-21의 조합이 CD28 발현에 대해 상승작용 효과를 갖는 다는 것은 합리적이었다. 가설을 시험하기 위해, 피부 T-세포 림프종을 치료하기 위해 승인되고 다른 질환을 치료하기 위해 임상 시험에 사용되어온 광범위 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi)인 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (SAHA, 비리노스타트)으로서 임상적으로 가용한 화합물의 효과를 평가하였다. 유효량을 결정하기 위한 적정 연구는 1M 이상의 농도에서 SAHA가 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 AcH3 수준을 증강시킬 수 있음을 보여주었다(도 16).

[0149] 보다 생리학적 항원-특이적 (비-특이적 폴리클로날과는 대조적으로) 자극에서 CD28 발현에 대한 SAHA/IL-21의 효과를 평가하기 위해, 펩타이드-펄스된 자가 수지상 세포를 사용하여 생성된 MART1 (M27)-특이적 이펙터/이펙터 기억 세포에 대한 상기 효과를 평가하였다. MART1 (M27)-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포 (CD45RO⁺, CD28-neg, CD62L-neg)는 시험관내 자극, M27-특이적 CTL의 사량체-가이드 분류 및 균일하게 확장(> 95% MART-1-특이적 이펙터 CTL)의 반복적인 사이클 후 생성하였다. 먼저, SAHA의 효과는 CD28 프로모터 영역으로의 pSTAT3 결합에 대해 평가하였다. SAHA 처리는 CD28 유전자의 프로모터 및 TSS 영역 상의 AcH3 수준을 상당히 증가시켰다(도 12a). 증가된 AcH3 수준과 관련하여, SAHA 처리는 CD28 프로모터로의 IL-21-유도된 pSTAT3의 결합을 증가시켰다 (도 12b). 이어서, M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포는 처리되지 않거나 24시간 동안 SAHA로 전처리하고 이어서 4일 동안 SAHA/IL-21의 존재 또는 부재에서 M27-펄스된 성숙한 수지상 세포로 활성화시킨다. 흥미롭게도, SAHA 및 IL-21은 함께 CD28 발현을 상당히 증진시키고 (도 12c 및 d), 이는 CD28 발현에 대한 SAHA 및 IL-21의 협력 효과를 입증한다. 이들 결과는 SAHA 처리가 M27-특이적 이펙터 CD8⁺ T 세포에서 AcH3 수준 및 염색질 접근성을 증가시킴에 따라서 IL-21-활성화된 STAT3이 이의 프로모터 부위에 결합하고 CD28 발현을 유도하도록함을 시사하였다.

[0150] IL-21 및 SAHA는 협력 작용하여 CD28 및 CD62L 발현을 상향조절한다. 해독 세팅에서 SAHA/IL-21의 효과를 평가하기 위해, 상기 프로그램은 종양-침윤 림프구 (TIL)에 대해 평가하였다. 전이성 흑색종 및 다른 TIL⁺ 고형 종양을 갖는 환자의 치료를 위한 TIL 세포의 입양 전달은 종양 생검으로부터 침윤 림프구의 추출, 고용량의 IL-2를 사용한 시험관내 치료, 신속 확장 프로토콜 (REP)을 사용한 시험관내 확장 및 이어서 고용량 림프구고갈 조건화 후 생체외 확장된 TIL의 주입을 포함한다. TIL 치료요법은 전이성 흑색종 환자의 치료에서 일부 성공을 나타냈지만, 많은 환자들은 부분적으로 주입된 세포의 제한된 지속성으로 인해 TIL 치료요법에 응답하지 않는다. TIL 생성물에서 CD8⁺ T 세포는 일반적으로 감소된 증식 능력을 갖는, 잘-분화된 이펙터, 이펙터 기억 및 말단 이펙터 세포이다. HDAC 억제제/IL-21 조합의 가능한 탈분화 효과를 조사하기 위해, TIL은 비처리되거나 24시간동안 SAHA로 전처리하고 이어서 정기적 REP (조사된 PBMC 및 LCL 세포, 항-CD3 및 IL-2) 또는 SAHA/IL-21과 함께 REP에 적용하였다. 단독의 SAHA의 REP 배양물로의 첨가는 급격한 세포사를 유발하였고 혈구계 계수는 REP 말기에 생존 세포가 거의 없음을 보여주었다. 단독의 REP 또는 단독의 IL-21과 함께 REP와 비교하여, REP 동안에 조합으로 주어지는 SAHA 및 IL-21은 나이브 및 중앙 기억 T 세포상에서 고도로 발현되는 2개의 마커인 CD28 및 CD62L 발현을 증가시켰다(도 12e 및 f). 이들 결과는 M27-이펙터 CD8⁺ T 세포에서의 결과와 유사하게, SAHA 처리가 TIL에서 AcH3 수준 및 염색질 접근성을 증가시킴에 따라서 IL-21-활성화된 STAT3이 이의 프로모터 부위에 결합하도록 하고 이펙터 CD8⁺ T 세포의 CD28 발현 및 탈분화의 표현형 증거를 유도할 수 있게 함을 시사하였다.

[0151] IL-21 및 파노비노스타트(Pano)는 협력하여 중앙-기억 유사 T 세포를 유도한다. SAHA의 세포독성은 ACT에서 이의 적용을 제한하기 때문에, 다른 약리학적으로 가용한 HDACi (도 17a)를 스크리닝하였고 파노비노스타트 (LBH589, Pano)가 SAHA의 것과 유사하지만 최소의 세포독성을 갖는 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 파노비노스타트는 0.5nM 이상의 용량에서 AcH3 수준을 증가시켰다(도 17b). 파노비노스타트의 효과는 처음에 소규모로 REP에서 TIL에 대해 조사하였고 전처리된 것 (Pano 및 IL-21을 사용한 신속 확장 전에 24시간동안 세포가 파노비노스타트로 전처리된 것)과 동시-처리(세포 확장을 개시하는 경우 파노비노스타트 및 IL-21을 첨가하는)된 것을 비교하였다. 이들 2개의 전략은 TIL에 대해 CD28⁺CD62L⁺ 세포 집단을 유도하는데 상응하는 효과를 갖고 있기 때문에(도 18a 및 18b), 동시 처리 계획은 유사성에 대해 후속 연구에서 수행하였다.

[0152] 항원-특이적 ACT의 세팅에서 파노비노스타트 (Pano)의 임상적 적용범위를 조사하기 위해, ETC 접근법을 통해 생성된 MART1 (M27)-특이적 이펙터/이펙터 기억 세포를 사용하였고 이전에 기재된 바와 같이 REP에 의해 시험관내 확장시켰다(Yee, 2014). 세포는 4개의 상이한 프로토콜을 사용하여 확장시켰다(정기적, 단독의 IL-21 첨가, 단독의 Pano 첨가, 또는 IL-21 + Pano). 단독의 파노비노스타트의 REP로의 첨가가 총 수율을 약간 감소시켰지만, 확장 배수는 다른 3개의 조건에 대해 유사하였다(도 18c). 파노비노스타트의 첨가는 IL-21의 첨가와 조합된 경우 추가로 증진되는 CD28⁺CD62L⁺ 세포 집단을 유도하였다(도 13a 및 b). SAHA와 같은 파노비노스타트는 STAT3 및 기타 전사 인자/보조 인자가 결합 부위에 접근하고 CD28 및 CD62L 발현을 유도할 수 있도록 하는 것으로 추정되었다.

[0153] IL-21/Pano-유도된 CD28⁺CD62L⁺ 집단과 연관된 중앙 기억 기능은 이들 중앙 기억 유사 T 세포가 IL-7 및 IL-15에 응답하여 항상성 증식을 진행하는 능력에 의해 평가되었다. 4개의 상이한 프로토콜(정기적, 단독의 IL-21 첨가, 단독의 Pano 첨가 또는 IL-21 + Pano)은 CFSE로 표지시키고 2일동안 IL-2, IL-7 또는 IL-15와 배양하였다. IL-7은 아마도 저수준의 CD127 발현으로 인해 세포 분열을 유도하지 않았다. IL-21의 존재하에 확장된 세포는 증진된 IL-2- 및 IL-15-유도된 증식을 나타냈다(도 14a). 단독의 파노비노스타트의 REP로의 첨가는 IL-2에는 응답하지 않지만 IL-15에 응답하여 세포 증식을 증가시켰다. 모호하게도, IL-21 및 파노비노스타트의 조합으로 확장된 세포는 임의의 다른 코호트 보다 IL-2 및 IL-15에 대해 보다 큰 증식 반응을 나타냈다(도 14a). IL-2 및 IL-15는 CD132 (γC) 및 CD122 수용체 서브유닛을 공유하기 때문에, CD132 및 CD122 수준은 이들 세포의 표면 상에서 평가하였다. IL-21 +/- 파노비노스타트를 사용한 처리는 상당히 증가된 표면 CD132 수준을 유도하였고 (도 14b 및 c), 이는 IL-2 및 IL-15에 대한 이들의 증가된 자기 재생에 기여할 수 있다.

[0154] HDACi/IL-21 처리된 CTL의 중앙-기억-유사 성질을 추가로 확인하기 위해, 관련 분화 유전자의 발현을 평가하였다. 중앙 기억/줄기 세포 기억 CD8⁺ T 세포 분화에서 역할을 수행하는 것으로 공지된 중앙 기억-관련 전사 시그네이쳐 (Lef1 ^hi, Tcf7 ^hi)는 파노비노스타트 및 IL-21 처리의 조합에 의해 생성된 CD28⁺CD62L⁺ 세포중에서 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 14d). 전사 인자 T-bet 및 에오메소더민(Eomes)은 이펙터 및 기억 T 세포 형성에서 필수 역할을 하고, 이들의 발현은 분화된 CD8⁺ T-세포에서 증가된다. 흥미롭게도, Tbx21 및 Eomes 발현은 CD28⁺CD62L⁺ 세포와 CD28-CD62L- 세포간에 유사하였다(도 14d).

[0155] 본 연구에서, IL-21과 HDACi의 조합을 사용하여 이펙터 세포가 높은 복제 능력을 갖는 덜 분화된 중앙 기억 유사 T 세포가 되도록 이펙터 세포를 재프로그래밍할 수 있음이 입증되었다. 전반적으로, IL-21 + Pano 접근법의 2개 임상 관련 ACT 양식에 대한 잠재적 적용이 입증되었다: ETC 및 TIL. 상기 연구는 개선된 임상적 결과를 유도하는 덜-분화된 ACT 생성물을 생성하기 위해 해독가능한 접근법을 입증하였다.

실시예 4 - 재료 및 방법　

[0156] 종양 항원-특이적 CTL 세포주 또는 종양 침윤 림프구(TIL)의 확장:　 CTL 세포주 또는 TIL은 항-CD3을 사용하여 확장시키고 신속한 확장을 위해 피더 세포로서 동종이계 PBMC　또는　림프아구성 세포주 (LCL)　(CTL 세포주에 대해)를 방사능 조사하였다.　TIL은 환자 흑색종 종양으로부터 배양하였다. 배양물에 3일 마다 50 U/ml　(CTL 세포주에 대해) 또는 6000 U/ml (TIL에 대해)로 IL-2를 공급하였다.　　IL-21 (30 ng/ml) 또는　HDACi　파노비노스타트　(3nM) (대조군으로서) 또는 IL-21 및　HDACi의 조합은 0, 4 및 7일에 공급하였다.　14일 후, 세포는 추가의 분석을 위해 사용하였다. SAHA를 사용한 연구를 위해, SAHA는 1-5 μM로 사용하였다.

[0157] CD8+ T 세포의 폴리클로날 자극: 나이브 CD8⁺ T 세포 (CD8⁺CD45RA⁺CCR7⁺)는 유동 세포측정으로 분류하거나 EasySep^TM 사람 나이브 CD8⁺ T 세포 농축 키트(StemCell)를 사용하여 단리하였다. 일부 구현예에서, 총 CD8⁺ T 세포는 EasySep^TM 사람 CD8⁺ T 세포 농축 키트(StemCell)를 사용하여 음성으로 선택하였다. 나이브 또는 총 CD8⁺ T 세포의 순도는 유동 세포측정에 의해 결정된 바와 같이 95% 초과이다. CD8⁺ T 세포는 10% 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신과 함께 RPMI 1640 중에서 배양하였다. CD8⁺ T 세포는 1:1의 비드:세포 비율로 또는 30ng/mL 사람 IL-21 (Peprotech)와 함께 T 세포 확장 및 활성화를 위해 Dynabeads® 사람 T-활성화인자 CD3/CD28(Life Technologies)를 사용하여 활성화시켰다. 지정된 시점에서, T 세포를 수거하고 비드는 다운스트림 분석 전에 자기를 사용하여 제거하였다.

[0158] 세포 배양 및 신속 확장 프로토콜 (REP): CTL 세포주를 위한 배지는 RPMI1640, 10% FBS, 4 μM 글루타민, 및 2-머캅토에탄올이다. TIL은 RPMI1640, 10% 사람 AB 혈청, 10 mM HEPES, 및 2-머캅토에탄올을 함유하는 50% AIM-V. 50% TIL 완전 배지에서 배양하였다. REP를 위해, CTL 세포주 또는 TIL은 피더 세포로서 30 ng/mL의 항-CD3 (OKT3) 및 200x 조사된 동종이계 PBMC 또는 LCL을 사용하여 확장시켰다. 배양물에 3일 마다 50U/ml로 IL-2를 공급하였다. IL-21 (30 ng/ml) 또는 HDACi SAHA (1-5 μM) 또는 파노비노스타트 (1-3 nM)은 확장에 포함되는 경우 0, 4 및 7일에 첨가하였다. 14일 후, 확장된 세포는 추가의 분석에 적용하였다.

[0159] 유동 세포측정: 　 세포는 CD8, CD28, CD62L 또는 CD132에 대한 항체로 염색하였다. 모든 FACS 데이터는 LSR II 유동 세포측정기를 통해 획득하였고 FlowJo　소프트웨어 (Tree Star, Inc.)를 통해 분석하였다.

[0160] 세포내 염색: 세포는 16시간 동안 종양 세포로 재극하였고 CD8에 대한 항체로 염색하고 이어서 고정화시키고 투과성 완충액 중에서 IFN-γ 및 그랜자임 B에 대한 항체로 염색하였다. 세포는 세척하고 분석 전 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다.

[0161] 정량적 실시간 PCR:　 총 RNA는 Qiagen RNA 정제 키트를 사용하여 제조하였다. cDNA는 Superscript 역전사 효소 및 올리고(dT) 프라이머(Life Technology)를 사용하여 제조하였고, 유전자 발현은 iQ　SYBR　그린 실시간　PCR 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하는 Bio-Rad　iCycler 광학 시스템으로 검출하였다. 데이터는 참조 유전자　RPL13A로 정규화하였다. RPL13A 프라이머는 제조원(Qiagen)으로부터 구입하였다. 사용되는 다른 프라이머 쌍은 다음과 같다: CD28 정배향: CTCACACTTCGGGTTCCTCGG　(서열번호 2), 역배향: GACTCCACCAACCACCACCAG　(서열번호 3); CD62L 정배향: ATGGAACGATGACGCCTGCC　(서열번호 4), 역배향: GGCCTCCAAAGGCTCACACT　(서열번호 5); 추가의 프라이머는 림프구성 증진제-결합 인자 1 (LEF1) 정배향: CACACCCGTCACACATCCCA (서열번호 6), 역배향: TGGGAAAACCAGCCAAGAGGTG (서열번호 7); 전사 인자 1 (TCF1) 정배향: TGCAGCTATACCCAGGCTGG (서열번호 8), 역배향: CCTCGACCGCCTCTTCTTC (서열번호 9)를 포함하였다.

[0162] 사람 shRNA 녹다운: 총 CD8⁺ T 세포를 단리하고 제조업자의 지침 (Lonza)에 따라 Amaxa 사람 T 세포 뉴클레오펙터 키트를 사용하여 5 ㎍ 음성 대조군, STAT1 shRNA, 또는 STAT3 shRNA (Dharmacon)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 1 내지 2일 동안 방치하고 생존 GFP⁺ 세포는 면역블롯 분석을 위해 분류-정제하거나 추가의 분석 전에 이전에 기재된 바와 같이 7일동안 자극하였다.

[0163] 웨스턴 블롯 분석: 동일한 수의 세포를 2x SDS 로딩 완충액에 용해시키고 상이한 항체 (Cell Signaling)를 사용한 면역블롯 분석을 위해 로딩하였다. 항-β-액틴-HRP는 제조원(Santa Cruz Biotech)으로부터 기원하였다. β-액틴은 모든 면역블롯 실험에 대해 로딩 대조군으로서 사용하였다. 결과는 이미지J를 사용하여 정량하였고 상응하는 샘플 중에 액틴의 밀도로 정규화하였다.

[0164] 염색질 면역침전 (ChIP): ChIP는 제조업자의 지침 (Millipore)에 따른 ChiP 검정 키트를 사용하여 수행하였다. 정량적 실시간 PCR은 프라이머로 수행하였다: CD28 프로모터 근접 STAT 부위: 정배향 TCTGCTGGATTTCAAGCACCC (SEQ ID NO:10), 역배향 GACTGCAGCATTTCACACAGG (서열번호 11); 원위 STAT 부위: 정배향 TGCTTGCACGTAGAATGGGT (서열번호 12), 역배향 GGATGGGGACAGGTTGTGTC (서열번호 13); 토끼 IgG는 음성 대조군으로서 사용하였다.

[0165] 크로뮴 방출 검정 (CRA): 　 종양 세포는 4시간 동안 20:1의 이펙터:종양에서 항원-특이적 CTL로 항온처리하기 전에 Cr51로 표지시켰다. 상등액 중의 Cr51 양을 측정하고 사멸 효율은 다음과 같이 계산하였다: % 사멸 =100% x　(샘플 평균 - 음성 대조군의 평균) / (양성 대조군의 평균 - 음성 대조군의 평균).

[0166] 소형-REP는 상응하게 T25 플라스크로부터 24-웰 플레이트로 축소시키면서 개시하였다. IL-21 및 파노비노스타트 용량은 변화되지 않은 상태로 남아있다.

[0167] 통계학적 분석: 　 데이터의 그래프 제공 및 통계학적 분석은 GraphPad　프리즘(버젼　6,　GraphPad　소프트웨어,　San　Diego,　CA) 및　엑셀을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 및 STD로서 나타낸다.　실험 그룹 간의 결과는 스튜던트 t 시험을 사용하여 비교하였다. p<0.05는 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다. 통계학적 유의성은 *P <　0.05,　**P　<　0.01, ***P < 0.001로 나타낸다.　

* * *

[0168] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다.　　본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다.　　보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다.　　당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.　

[0169] 참조문헌

하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.

Klebanoff et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102(27):9571-6, 2005.

Li et al., J. Immunol. 175, 2261-2269, 2005.

Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition, Pharmaceutical Press. 2013.

Seto and Yoshida, Cold Spring Harb Perspect Biol. 6(4):a018713, 2014.

U.S. Patent No. 6,307,024

U.S. Patent No. 6,686,178

Yee, Immunol. Rev. 257, 250-263, 2014.

<110> Board of Regents, The University of Texas System YEE, CASSIAN WANG, JUNMEI <120> USE OF HISTONE MODIFIERS TO REPROGRAM EFFECTOR T CELLS <130> UTFC.P1311WO <150> 62649265 <151> 2018-03-28 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctcacacttc gggttcctcg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gactccacca accaccacca g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 atggaacgat gacgcctgcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ggcctccaaa ggctcacact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cacacccgtc acacatccca 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tgggaaaacc agccaagagg tg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tgcagctata cccaggctgg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cctcgaccgc ctcttcttc 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 tctgctggat ttcaagcacc c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gactgcagca tttcacacag g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tgcttgcacg tagaatgggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ggatggggac aggttgtgtc 20

Claims (62)

1. 항원-특이적 이펙터 T 세포(T_EFF 세포)를 중앙 기억 T 세포(T_CM 세포)로 재프로그래밍하기 위한 방법으로서, 상기 방법이:
   (a) 대상체로부터 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 수득하는 단계;
   (b) 임의로, T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계; 및
   (c) T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양으로 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDACi) 및 인터류킨-21 (IL-21)의 존재하에 배양하는 단계로서, 상기 재프로그래밍이 대상체로부터 수득한 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 중에 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 수득하는 단계가 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는 샘플을 대상체로부터 채취하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계가 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 CD8⁺ T_EFF 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계가 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), T_REG, NK 세포 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계가 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 골수-유래된 서프레서 세포 (MDSC), T_REG, NK 세포 및 대식세포를 고갈시키는 단계를 포함하는, 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단으로부터 T_EFF 세포가 농축된 샘플을 제조하는 단계가 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단으로부터 CD8⁺ T_EFF 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 CD45RO를 발현하는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 IL-21을 첨가하기 전 HDACi의 존재하에 배양되는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 IL-21을 첨가하기 전 12 내지 48시간 동안 HDACi의 존재하에 배양되는, 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 IL-21를 첨가하기 전 1 내지 3일 동안 HDACi의 존재하에 배양되는, 방법.
12. 제8항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 HDACi를 첨가하기 전 IL-21의 존재하에 배양되는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 HDACi를 첨가하기 전 12 내지 48시간 동안 IL-21의 존재하에 배양되는, 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 HDACi를 첨가하기 전 1 내지 3일 동안 IL-21의 존재하에 배양되는, 방법.
15. 제8항에 있어서, 상기 CD8⁺ T_EFF 세포가 HDACi 및 IL-21의 존재하에 동시에 배양되는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 배양이 7 내지 20일 동안인 것인, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 배양이 12 내지 16일 동안인 것인, 방법.
18. 제12항, 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 IL-21이 10ng/ml 내지 50 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 IL-21이 20ng/mL 내지 40 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
20. 제9항, 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 HDACi가 1 nM 내지 5 nM의 농도로 존재하는, 방법.　
21. 제20항에 있어서, 상기 HDACi가 2 nM 내지 4nM의 농도로 존재하는, 방법.　
22. 제15항, 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 IL-21이 10ng/ml 내지 50 ng/mL의 농도로 존재하고 상기 HDACi가 1 nM 내지 5 nM의 농도로 존재하는, 방법.　
23. 제22항에 있어서, 상기 IL-21이 20ng/mL 내지 40 ng/mL의 농도로 존재하고 상기 HDACi가 2 nM 내지 4 nM의 농도로 존재하는, 방법.　
24. 제9항, 제10항, 제11항, 제15항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDACi가 고전적 HDACi인, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 고전적 HDACi가 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 보리노스타트 (수버라닐로하이드록삼산 또는 SAHA, Zolinza®로서 시판됨), 벨리노스타트 (PXD101, Beleodaq®로서 시판됨), 파노비노스타트 (Farydaq®로서 시판됨), 다시노스타트 (LAQ824), 엔티노스타트(SNDX-275 또는 MS-275), 타세디날린(CI994), 및 모세티노스타트 (MGCD0103)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 HDACi가 SAHA인, 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 HDAC가 파노비노스타트인, 방법.　
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수득한 T_CM 세포가 CD8⁺이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 중 적어도 2개를 발현하는, 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 수득한 T_CM 세포가 CD8⁺이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 중 적어도 3개를 발현하는, 방법.
30. 제28항에 있어서, 상기 수득한 T_CM 세포가 CD8⁺ 이고 또한 CD45RO, CD28, CD62L, 및 CCR7 (즉, CD8⁺/CD45RO⁺/CD28⁺/CD62L⁺/CCR7⁺)을 발현하는, 방법.
31. 제28항, 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 수득한 T_CM 세포가 또한 증가된 수준의 그랜자임 B 및 퍼포린 1을 발현하는, 방법.
32. 제31항에 있어서, T_CM 세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 확장이 상기 T_CM 세포를 항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD137/4-1BB 중 적어도 하나로 처리함을 포함하는, 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 확장이 상기 T_CM 세포를 항-CD3 및 항-CD28로 처리함을 포함하는, 방법.
35. 제33항에 있어서, 상기 확장이 상기 T_CM 세포를 항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD137/4-1BB로 처리함을 포함하는, 방법.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 T_EFF 세포를 T_CM 세포로 재프로그래밍하기에 충분한 양의 HDACi 및 IL-21의 존재하에 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 T_EFF 세포가 농축된 상기 샘플을 배양하는 단계 전에 또는 이와 동시에 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단 또는 TEFF 세포가 농축된 상기 샘플을 IL-2와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단이, T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 5-배 초과의 T_CM 세포를 포함하는, 방법.
38. 제36항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단이, T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 10-배 초과의 T_CM 세포를 포함하는, 방법.
39. 제36항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단이, T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단에서 보다 적어도 30-배 초과의 T_CM 세포를 포함하는, 방법.
40. 제36항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 림프구의 집단이, IL-2 및/또는 IL-15 처리에 반응하는 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단과 비교하여 IL-2 및/또는 IL-15 처리에 반응하여 증가된 증식을 나타내는, 방법.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단을 포함하는 약제학적 조성물.
42. 제41항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
43. 암의 치료를 위한 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단의 용도.
44. 대상체에서 암의 치료를 위한 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단을 포함하는 조성물.
45. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단 또는 제41항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는, 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단의 투여 전에 대상체에 대한 림프구 고갈을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 치료학적 유효량의 림프구 집단이 항종양 활성을 갖는 자가 종양 침윤 림프구 (TIL)의 샘플로부터 유래하는, 방법.
48. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 T_CM 세포가 농축된 림프구 집단이 정맥내. 복막내 또는 종양내로 대상체에게 투여되는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
50. 제49항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제가 화학치료요법, 방사선치료요법 및 면역치료요법으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 치료학적 제제가 면역치료요법인, 방법.
53. 제52항에 있어서, 상기 면역치료요법이 면역 관문 억제제인, 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제가 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR, 또는 아데노신 A2a 수용체 (A2aR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역 관문 단백질 또는 이의 리간드를 억제하는, 방법.
55. 제54항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제가 Pd-1을 억제하는, 방법.
56. 제54항에 있어서, 상기 면역 관문 억제제가 CTLA-4를 억제하는, 방법.
57. T_EFF 세포로부터 T_CM 세포를 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법이:　
    (a) T_EFF 세포를 포함하는 출발 림프구 집단을 대상체로부터 수득하는 단계;
    (b) 동시에 2 nM 내지 4 nM 농도의 HDACi 및 20 ng/mL 내지 40 ng/mL 농도의 IL-21을 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단에 첨가하는 단계; 및
    (c) T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단을 12 내지 16일 동안 배양하여 상기 T_EFF 세포를 재프로그래밍하여 T_EFF 세포를 포함하는 상기 출발 림프구 집단에서 T_CM 세포의 수와 비교하여 T_TM 세포가 농축된 림프구 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
58. 사람 중앙 기억 유사 CD8⁺ T 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 T 세포의 적어도 20%가 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포인, 조성물.
59. 제58항에 있어서, 상기 T 세포의 적어도 50%가 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포인, 조성물.
60. 제58항에 있어서, 상기 T 세포의 적어도 60%가 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포인, 조성물.
61. 제58항에 있어서, 상기 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포가 Lef1 및/또는 Tcf1을 추가로 발현하는, 조성물.
62. 제58항에 있어서, 상기 CD28⁺CD62L⁺CD127^-CCR7^- T 세포가 필수적으로 CD45RA 및/또는 CD45RO 발현을 갖지 않는, 조성물.

Images