KR20200136901A - 신규한 사포닌 아쥬반트 및 그의 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분리된 OBI-821 아쥬반트의 6개 이성질체 구조물들(OBI-821-1990-V1A, OBI-821-1990-V1B, OBI-821-1990-V2A, OBI-821-1990-V2B, OBI-821-1858-A, 및 OBI-821-1858-B), 및 그들의 품질을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 각각 단독으로 또는 탠덤으로 사용하고, 연속적인 크로마토그래피에 의해 OBI-821 아쥬반트의 이성질체들을 분리할 수 있다. 따라서, 더 나아가 OBI-821 아쥬반트의 품질을 평가할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 발명의 명칭을 "신규한 사포닌 아쥬반트"로 하여, 2018년 3월 28일자로 출원된 미국 가특허출원 번호 제62/649,091호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 미국 가출원은 모든 목적을 위하여 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
본 발명은 퀄라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 몰리나 나무(Molina tree)의 수피(bark)로부터 유래된 사포닌(saponin) 기반의 아쥬반트를 제공한다. 이는 다른 아쥬반트인 QS-21에 대해 발견된 상세 사항들과 구조적으로 유사한 정제된 사포닌 아쥬반트이다. 또한, 본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 사포닌의 품질을 평가하기 위한 방법을 제공한다.
사포닌은 퀄라야 사포나리아 몰리나의 수피로부터 추출된 일종의 화합물이다. 이전의 연구는 QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-21로 지칭된 몇몇의 사포닌류가 항체 수준을 획기적으로 증가시킬 수 있으며, 이는 아쥬반트로서의 그들의 약학적 적용성을 나타낸다는 것을 보고하였다(Charlotte R. Kensil et al., The Journal of Immunology, Vol. 146, No. 02, page 431-437, 1991). 특히, QS-21은 백신류에서 아쥬반트로서 실제로 광범위하게 사용되어왔다.
상기한 관점에서, 본 발명의 목적은 사포닌계 아쥬반트의 6개 이성질체(isomer)들 및 이들의 순도 및/또는 품질을 더 평가할 수 있도록 상기 이성질체들을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 약학적 용도를 평가 및 달성할 수 있도록, 사포닌계 아쥬반트로부터 분리된 사포닌 화합물을 제공하는 것이다.
상기의 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 분리된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
여기서, R1은 β-D-아피오스(Apiose), β-D-자일로스 또는 수소로부터 선택되고;
R2 및 R3은 수소 또는 
로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 분리된 화합물은 하기 표에 나타낸 구조를 갖는다:
여기서, R1은 아피오스, 자일로스, 또는 H이고;
R2 및 R3는 독립적으로 수소 또는 지방산 아실(fatty acyl)이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 상기 분리된 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 사포닌 조성물을 제공한다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 사포닌 조성물의 이성질체 조성을 평가하는 방법을 더 제공한다: (a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(hydrophilic interaction liquid chromatography; HILIC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계; 여기서, 상기 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 아세토니트릴을 포함하고; 30분에 걸쳐 상기 이동상에서 상기 트리플루오로아세트산-물 용액의 양은 0%(v/v)에서 20%(v/v)로 변하고, 상기 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 80%(v/v)에서 100%(v/v)로 변하며; 상기 %(v/v)는 상기 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
바람직하게는, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직하게는, 상기 용출은 2 내지 11의 pH 범위에서 수행된다.
바람직하게는, 상기 친수헝 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼은 아미드 칼럼이다.
바람직하게는, 상기 크로마토그램은 자외선 검출에 의해 얻어진다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 사포닌 조성물의 순도를 평가하는 방법을 더 제공한다: (a) 상기 사포닌 조성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계; 여기서, 상기 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액을 포함하고; 상기 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액은 상기 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액의 총 부피를 기준으로 20%(v/v) 내지 80%(v/v)의 트리플루오로아세트산을 포함하고; 상기 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 35분에 걸쳐 20%(v/v)에서 80%(v/v)로 변하며; 상기 %(v/v)는 상기 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
바람직하게는, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직하게는, 상기 용출은 2 내지 7.5의 pH 범위에서 수행된다.
바람직하게는, 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼은 소수성 칼럼이다.
바람직하게는, 상기 소수성 칼럼은 C4 칼럼, C8 칼럼, 또는 C18 칼럼이다.
바람직하게는, 상기 크로마토그램은 자외선 검출에 의해 얻어진다.
본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 사포닌 조성물의 품질(quality)을 평가하는 방법을 더 제공한다: (a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 제1 이동상으로 용출시켜 제1 용출물을 수집하는 단계; (c) 상기 제1 용출물의 분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계; (d) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 제2 이동상으로 용출시켜 제2 용출물을 수집하는 단계; 및 (e) 상기 제2 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계; 여기서, 상기 제1 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 아세토니트릴을 포함하고; 상기 제2 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액을 포함한다.
바람직하게는, 30분에 걸쳐 상기 제1 이동상에서 상기 트리플루오로아세트산-물 용액의 양은 0%(v/v)에서 20%(v/v)로 변하고, 상기 제1 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 80%(v/v)에서 100%(v/v)로 변하며; 상기 %(v/v)는 상기 제1 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
바람직하게는, 35분에 걸쳐 상기 제2 이동상에서 상기 트리플루오로아세트산-물 용액의 양은 20%(v/v)에서 80%(v/v)로 변하고, 상기 제2 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 20%(v/v)에서 80%(v/v)로 변하며; 상기 %(v/v)는 상기 제2 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
바람직하게는, 상기 단계 (b)에서 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직하게는, 상기 단계 (b)에서 상기 용출은 2 내지 11의 pH 범위에서 수행된다.
바람직하게는, 상기 단계 (d)에서 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직하게는, 상기 단계 (d)에서 상기 용출은 2 내지 7.5의 pH 범위에서 수행된다.
바람직하게는, 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼은 아미드 칼럼이다.
바람직하게는, 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼은 소수성 칼럼이다.
더욱 바람직하게는, 상기 소수성 칼럼은 C4 칼럼, C8 칼럼, 또는 C18 칼럼이다.
도 1은 OBI-821 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 자외선(UV) 크로마토그램이다.
도 2는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 자외선(UV) 크로마토그램으로부터 수집된 피크 1 분획(1858 화합물, 상단), 피크 2 분획(1990-V1 화합물, 중간) 및 피크 3 분획(1990-V2 화합물, 하단)을 나타내는 OBI-821 음성 ESI MS 스펙트럼들이다.
도 3은 (a) 1858 화합물(왼쪽)과 1990 화합물(오른쪽)의 구조, 및 OBI-821로부터의 그들의 탠덤(tandem) MS 단편화 이온, 및 (b) 1990 화합물(상단)과 1858 화합물(하단)의 MS/MS 스펙트럼들이다.
도 4는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 자외선(UV) 크로마토그램으로부터 수집된 피크 2 분획(1990-V1 화합물, 상단), 피크 3 분획(1990-V2 화합물, 중간) 및 피크 1 분획(1858 화합물, 하단)에 대한 펄스식 전기화학 검출과 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 단당류 분석을 나타낸다.
도 5는 OBI-821 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 크로마토그램이다.
도 2는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 자외선(UV) 크로마토그램으로부터 수집된 피크 1 분획(1858 화합물, 상단), 피크 2 분획(1990-V1 화합물, 중간) 및 피크 3 분획(1990-V2 화합물, 하단)을 나타내는 OBI-821 음성 ESI MS 스펙트럼들이다.
도 3은 (a) 1858 화합물(왼쪽)과 1990 화합물(오른쪽)의 구조, 및 OBI-821로부터의 그들의 탠덤(tandem) MS 단편화 이온, 및 (b) 1990 화합물(상단)과 1858 화합물(하단)의 MS/MS 스펙트럼들이다.
도 4는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 자외선(UV) 크로마토그램으로부터 수집된 피크 2 분획(1990-V1 화합물, 상단), 피크 3 분획(1990-V2 화합물, 중간) 및 피크 1 분획(1858 화합물, 하단)에 대한 펄스식 전기화학 검출과 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 단당류 분석을 나타낸다.
도 5는 OBI-821 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 크로마토그램이다.
사포닌 조성물의 일종인 OBI-821 아쥬반트 물질(AS)은 퀄라야 사포나리아(Quillaja saponaria)로부터의 식물 유래 복합 사포닌이고, 하기의 화학식 (I)을 공유하는 6개의 이성질체들을 포함한다:
여기서, R1은 아피오스, 자일로스, 또는 H이고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 지방산 아실이다.
상기 6개의 이성질체들은 본 명세서에 기재된 참고명(reference name)으로서 하기 표 1에 열거되어 있다. 6개의 이성질체들 중, 말단 아피오스를 갖는 OBI-821-1990-V1, 말단 자일로스를 갖는 OBI-821-1990-V2, 및 OBI-821-1990 이성질체들에서의 삼당(trisaccharide) 부분(moiety) 대신에 푸코실 잔기에 부착된 이당(disaccharide) 부분(D-자일로실-(1→4)-O-β-D-L-람노오실-(1→4))을 갖는 OBI-821-1858이 3개의 주요 성분들이다.
번호 "1990"은 OBI-821-1990-V1A, OBI-821-1990-V1B, OBI-821-1990-V2A, 및 OBI-821-1990-V2B의 이론적으로 평가된 분자량을 의미한다. 유사하게, 번호 "1858"은 OBI-821-1858-A 및 OBI-821-1858-B의 이론적으로 평가된 분자량을 의미한다.
OBI-821 아쥬반트 물질(adjuvant substance; AS)에서 총 6개의 이성질체들이 발견되었다. 이들 6개의 이성질체들은, OBI-821-1990-V1, OBI-821-1990-V2 및 OBI-821-1858의 3 그룹으로 분류될 수 있다. 각 그룹은 그룹 A 및 그룹 B로 나뉠 수 있는 두 개의 구조이성질체(regioisomer)를 포함한다. OBI-821 아쥬반트의 명명법 및 물리화학적 성질들을 하기 표 2에 정리하였다.
OBI-821 AS의 제조 공정은 3 단계의 정제 단계들(단계 Ⅰ, Ⅱ, 및 Ⅲ)을 포함한다. 중요 원료 물질인 Quil-A에서 발견되는 OBI-821의 초기 함량은 전형적으로 3% 이하이다. 단계 Ⅰ의 정제 공정은 OBI-821 함량을 약 15%로 증가시키고, 여기서 얻어진 중간체들은 정제된 Quil-A(PQA)로 분류된다. 단계 Ⅱ의 공정에서, OBI-821 함량은 염(salt)을 갖는 건조된 형태로 약 0.2g/g으로 증가되고, 여기서 얻어진 중간체들은 조(crude) OBI-821(Crd-821)로 분류된다. 단계 Ⅲ의 정제 공정 후에, OBI-821 함량은 98% 이상으로 풍부해질 수 있고, 이는 OBI-821 AS로 분류된다.
Quil-A는 상업적으로 Brenntag Biosector A/S (Brenntag; Frederikssund, Denmark)로부터 구입할 수 있고, 이는 덴마크 규제 기관에 의해 식품 첨가제로서의 용도에 대해 승인받았다(승인 번호 32119).
본 발명의 첫번째 측면은 사포닌계 아쥬반트 유래의 분리된 사포닌 화합물들에 관한 것이다. 용어 "분리된(isolated)"은 해당 사포닌 화합물이 실질적으로 순수하다는 것을 의미한다. 더욱 상세하게는, 일 구체예에 있어서, 분리된 사포닌 화합물은 불순물 및 그의 다른 이성질체가 없다. 예를 들어, 일 구체예에 있어서, 분리된 사포닌 화합물은 화합물 1990-V1A이고, 이는 화합물 1990-V2A, 화합물 1990-V1B, 화합물 1990-V2B, 화합물 1858-A, 및 화합물 1858-B를 함유하지 않는다.
본 발명의 두번째 측면은 상기한 분리된 화합물들 중 하나 이상 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 사포닌 조성물에 관한 것이다. 상기 사포닌 조성물은 2 이상의 상기 분리된 화합물들을 아쥬반트 효과를 발휘하기에 적합한 비율로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 담체일 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 사포닌 조성물은, 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로, 화합물 1990의 혼합물 75 내지 90중량% 및 화합물 1858의 혼합물 10 내지 25중량%를 포함하고; 여기서, 상기 화합물 1990의 혼합물은 화합물 1990-V1A, 화합물 1990-V1B, 화합물 1990-V2A, 화합물 1990-V2B, 또는 이들의 혼합물을 포함하고; 상기 화합물 1858의 혼합물은 화합물 1858-A, 화합물 1858-B, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 사포닌 조성물은, 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로, 화합물 1990의 혼합물 80 내지 88중량% 및 화합물 1858의 혼합물 12 내지 23중량%를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 사포닌 조성물은, 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로, 화합물 1990-V1A를 약 45 내지 65중량% 포함한다. 특정의 일 구체예에서, 상기 사포닌 조성물은, 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로, 화합물 1990-V1A 약 45 내지 65중량%; 화합물 1990-V2A 약 19.31 내지 27.99중량%; 화합물 1990-V1B 약 0.29 내지 7.71중량%; 및 화합물 1990-V2B 약 0.11 내지 3.11중량%를 포함한다. 다른 특정의 구체예에서, 상기 사포닌 조성물은, 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로, 화합물 1990-V1A 약 49.26 내지 63.42중량%; 화합물 1990-V2A 약 19.31 내지 27.99중량%; 화합물 1990-V1B 약 0.29 내지 7.71중량%; 및 화합물 1990-V2B 약 0.11 내지 3.11중량%를 포함한다.
이하에서, "OBI-821의 이성질체 조성을 평가"라는 기재는 OBI-821의 상기 3개의 주요 성분들을 분리할 수 있는 방법에 의하여 OBI-821을 분리하고, 관찰하는 것을 의미한다. 대상이 되는 OBI-821가 상기한 3개의 주요 성분들을 모두 포함하고 있는지의 여부를 확인하는 것은 필수적인데, 이는 항체 또는 세포-매개 면역반응을 향상시킴에 있어서의 OBI-821의 기능을 위한 요소일 수 있기 때문이다. 이하에서, "OBI-821의 순도를 평가"라는 기재는 대상이 되는 OBI-821 내에 존재하는 불순물의 함량을 평가하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 대상이 되는 OBI-821 내의 불순물의 함량은 10중량% 미만이고; 즉, 상기 OBI-821의 순도는 90% 이상이다. 이하에서, "OBI-821의 품질을 평가"라는 기재는 대상이 되는 OBI-821 내의 상기 3개의 주요 성분들의 존재 및 OBI-821의 순도 모두를 평가하는 것을 의미한다.
본 발명의 세번째 측면에서는, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)에 의해 사포닌 조성물의 이성질체 조성을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계.
바람직한 일 구체예에서, 상기 이동상은, 30분에 걸쳐 상기 이동상에서 트리플루오로아세트산-물 용액의 양은 0%(v/v)에서 20%(v/v)로 변하고, 상기 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 80%(v/v)에서 100%(v/v)로 변하는 구배(gradient)로 적용되며; 상기 %(v/v)는 상기 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
상기 용출은 작업 조건들에 따라 적절한 유속으로 수행될 수 있다. 그러나, 바람직한 일 구체예에서, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 칼럼은 분석이 수행되기 전에 버퍼로 컨디셔닝될 수 있다. 또한, 바람직한 일 구체예에서, 상기 칼럼은 분석이 완료된 후 세정 버퍼로 세정될 수 있다. 상기 컨디셔닝을 위해 사용되는 버퍼는 트리플루오로아세트산-물 용액, 아세토니트릴, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 세정 버퍼는 아세토니트릴, 물, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세정 버퍼는 적절한 구배의 아세토니트릴과 물의 혼합물이다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 크로마토그램은 상기한 6개의 이성질체들 중 상기 3개의 주요 성분들을 각각 나타내는 3개의 피크들을 포함할 것이다. 실제로, 대상이 되는 OBI-821의 순도를 예비적으로 결정하기 위해 상기 3개의 피크들의 피크 면적이 계산될 수 있다.
본 발명의 네번째 측면에서, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 사포닌 조성물의 순도를 평가하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 상기 사포닌 조성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및 (c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계.
바람직한 일 구체예에서, 상기 이동상은, 35분에 걸쳐 상기 이동상에서 트리플루오로아세트산-물 용액의 양은 20%(v/v)에서 80%(v/v)로 변하고, 상기 이동상에서 상기 아세토니트릴의 양은 20%(v/v)에서 80%(v/v)로 변하는 구배로 적용되며; 상기 %(v/v)는 상기 이동상의 총 부피를 기준으로 한 것이다.
상기 용출은 작업 조건들에 따라 적절한 유속으로 수행될 수 있다. 그러나, 바람직한 일 구체예에서, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 크로마토그램은 "A 형태" 구조이성질체 및 "B 형태" 구조이성질체를 각각 나타내는 2개의 피크들을 포함할 것이다. 구체적으로, "A 형태" 구조이성질체를 나타내는 피크는 OBI-821-1990-V1A, OBI-821-1990-V2A, 및 OBI-821-1858-A의 조합일 것이고; "B 형태" 구조이성질체를 나타내는 피크는 OBI-821-1990-V1B, OBI-821-1990-V2B, 및 OBI-821-1858-B의 조합일 것이다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 2개의 피크들의 피크 면적은 대상이 되는 OBI-821의 순도를 결정하기 위해 계산될 수 있다.
본 발명의 다섯번째 측면에서, 사포닌 조성물의 품질을 평가하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 HILIC와 RP-HPLC를 탠덤으로 사용하여 수행된다. 기본적으로, 사포닌 조성물은 본 발명의 상기 세번째 측면에 따른 사포닌 조성물의 이성질체 조성을 평가하기 위한 방법에 적용된 후, 얻어진 분획은 본 발명의 상기 네번째 측면에 따른 OBI-821의 순도를 평가하기 위한 방법에 적용된다.
구체적으로, 상기 방법은, (a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼에 적용하는 단계; (b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 제1 이동상으로 용출시켜 제1 용출물을 수집하는 단계; (c) 상기 제1 용출물의 분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계; (d) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 제2 이동상으로 용출시켜 제2 용출물을 수집하는 단계; 및 (e) 상기 제2 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계.
바람직하게는, 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)의 칼럼, 이동상, 유속 등을 포함하는 조건들은 상기한 단락들에서 설명한 바와 동일하다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 단계 (c)에서, 상기 6개의 이성질체들 중 상기한 3개의 주요 성분들의 어느 하나에 해당하는 상기 제1 용출물의 분획이 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용되어, 분획 중의 "A 형태" 구조이성질체와 "B 형태" 구조이성질체가 분리될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 단계 (c)에서, 상기 6개의 이성질체들 중 상기한 3개의 주요 성분들에 각각 해당하는 3개의 분획들이 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용되어, 상기 3개의 주요 성분들 각각의 "A 형태" 구조이성질체와 "B 형태" 구조이성질체가 분리될 수 있다. 따라서, 3개의 크로마토그램이 얻어질 수 있고, 그들의 각각은 "A 형태" 구조이성질체를 나타내는 하나의 피크 및 "B 형태" 구조이성질체를 나타내는 하나의 피크를 갖는다. 얻어진 상기 3개의 크로마토그램의 상기 두 피크들의 피크 면적은 대상이 되는 OBI-821의 6개 이성질체들의 각각의 함량을 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1: HILIC에 의한 OBI-821 아쥬반트의 분리
본 실험은 6개의 이성질체들이 관찰될 수 있도록 OBI-821 아쥬반트를 분리하기 위해 수행되었다. 분석 방법 및 조건들은 하기 표 3 및 표 4에 요약되어 있다. 1.0 내지 2.0mg의 시료를 블랭크 버퍼(탈이온수 중의 80%(v/v) 아세토니트릴)에 용해시켜, OBI-821 용액(500㎍/mL)을 제조하였다. 그런 다음, 상기 OBI-821 용액을 WATERS XBridge 아미드 칼럼(Waters Corporation, Part No. 186004896)에 주입하였다. HILIC의 이동상은 용리액 A와 용리액 B의 혼합물이었다. 용리액 A는 탈이온수(DI water)에 용해된 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산이었고, 용리액 B는 아세토니트릴이었다. 이동상의 구배는 하기 표 4에 나타낸 용출 프로그램에 따라 설정되었다.
데이터 처리:
1. 214nm에서 크로마토그램 처리. 모든 피크들을 통합하고, 모든 피크들의 체류시간, 피크 면적(커브 아래 면적), 및 면적%를 기록. (주: 블랭크(Blank)에 기인한 용매 피크들은 통합하지 말 것). 면적%는 중량%(wt/wt)로 이해될 수 있다.
2. 상대 체류 시간(relative retention time: RRT) 계산
RRT는 피크 1990-V1의 체류 시간에 대한 해당 피크의 체류 시간의 비율이다. 1990-V1의 체류 시간은 OBI-821 용액에서 주 피크의 평균 체류 시간으로 규정된다.
RRT= RT피크/ RT1990-Api
3. 피크 확인
3개의 OBI-821 성분들(1858, 1990-V1 및 1990-V2)은 하기 표 5에 나타낸 상대 체류 시간(RRT)에 의해 식별된다.
데이터 분석:
1. 시스템 적합성 테스트(SST)
SST의 결과는 OBI-821 용액의 주입으로부터 얻어진다. RT의 상대 표준 편차(RSD%) 및 1990-Api의 피크 면적이 계산된다. RT 및 피크 면적의 허용 기준치는 2% 미만이어야 한다.
2. 당 이성질체 분포
당 이성질체 분포는 피크의 피크 면적에 의해 결정된다.
1858(%) = 1858의 피크 면적 / 3개 피크(1858, 1990-V1 및 1990-V2)의 피크 면적의 합계 × 100%
1990-V1(%) = 1990-V1의 피크 면적/ 3개 피크(1858, 1990-V1 및 1990-V2)의 피크 면적의 합계 × 100%
1990-V2(%) = 1990-V2의 피크 면적 / 3개 피크(1858, 1990-V1 및 1990-V2)의 피크 면적의 합계 × 100%
상기 결과치들의 평균값을 계산하고, 상대 표준 편차(%RSD)를 계산한다. 최종 결과값을 평균 물 함량±표준 편차로 표시한다.
도 1에 도시된 바와 같이, OBI-821의 크로마토그램은 9.661분(이하, 피크 1; OBI-821-1858), 10.113분(이하, 피크 2; OBI-821-1990-V1) 및 10.560분(이하, 피크 3; OBI-821-1990-V2)의 체류 시간에서 각각 3개의 주 피크들을 나타내었다. 또한, 6.300분의 체류 시간에서 다른 피크가 나타났는데, 이는 HILIC의 용매 피크일 것이다.
상기한 3개의 주 피크들의 용출물들을 더 확인하기 위하여, OBI-821의 상기 3개 피크들의 분획들을 수집하고, 음성 ESI MS에 의해 조사하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, OBI-821-1990-V1(피크 2) 및 OBI-821-1990-V2(피크 3)에 대해 m/z 1989가 관찰되었고; OBI-821-1858(피크 1)에 대해 m/z 1857이 관찰되었다. 이러한 m/z 결과들은 각각 이론적 분자량 1990.13192(C92H148O46) 및 1858.0173(C87H140O42)과 일치하였다.
OBI-821의 이성질체들의 구조를 확인하기 위하여, 상기 ESI MS에서의 3개 피크들의 용출물들을 유도 주입 MS/MS 및 MS/MS/MS 분석을 이용한 구조 분석에 추가로 적용하였다. 탠덤 MS 구조 정보는 도 3(a)에 요약되어 있다. MS/MS 스펙트럼은 도 3(b)에 도시되어 있고, 도면에서의 할당된 질량 피크는 MS/MS/MS 분석을 위해 선택되었다. 탠덤 질량 스펙트럼으로부터, 단편 이온들(fragment ions)과 모(parent) 이온 간의 상응하는 구조 관계가 나타났다.
이어서, 상기 3개의 분획들의 특성을 더 구분하기 위하여, 펄스식 전기화학 검출과 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 단당류 분석(Thermo Fisher Scientific, CarboPac PA1 칼럼(Part. No. 035391, 4×250mm)을 갖는 Dionex ICS-5000)을 수행하였다. HILIC로부터 OBI-1990-V1, OBI-821-1990-V2, 및 OBI-821-1858이 수집되었고, 이들은 회전증발기로 농축되었다. 농축된 OBI-1990-V1, OBI-821-1990-V2, 및 OBI-821-1858은 4시간 동안 100℃ 하에서 4M TFA에 의해 가수분해되었고, 동결건조되었다. 동결건조 후에, OBI-1990-V1, OBI-821-1990-V2, 및 OBI-821-1858은 탈이온수에 의해 복원되었고, 펄스식 전기화학 검출과 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)에 의해 분석되었다. 이동상 A로서 200mM 소듐히드록사이드가 사용되었고, 이동상 B로서 탈이온수가 사용되었다. 이동상 C로서 100mM 소듐히드록사이드와 500mM 소듐아세테이트가 사용되었다.
이동상의 초기 조성은 이동상 A 91%, 이동상 B 9%로 10분 동안 유지되었다. 그런 다음 이동상 A 90%와 이동상 C 10%로 변경되었고, 이어서 10분에 걸쳐 이동상 A 60%와 이동상 C 40%로 선형 구배로 변경되었다. 그 후, 이동상 A 100%를 이용하여 20분 동안 세정 단계가 수행되었다.
도 4 및 표 6에 나타낸 결과들에 따르면, 3개의 용출물들 모두 하나의 푸코오스, 하나의 람노오스, 하나의 갈락토오스, 하나의 글루쿠론산 및 하나의 아라비노스를 가지고 있었으나, 자일로스 및 아피오스의 수는 서로 달랐다. 피크 1 분획은 2개의 자일로스를 가졌지만 아피오스는 없었다. 피크 2 분획은 2개의 자일로스 및 하나의 아피오스를 가졌다. 피크 3 분획은 3개의 자일로스를 가졌으나 아피오스는 없었다. 따라서, 상기 3개의 분획들은 각각 OBI-821-1858 이성질체, OBI-821-1990-V1 이성질체 및 OBI-821-1990-V2 이성질체로 확인되었다. 즉, 본 실험에서 수행된 상기 HILIC 분석은 OBI-821의 6개 이성질체들 중 상기 3개의 주요 성분들을 분리할 수 있었다. 즉, OBI-821의 상기 3개의 주요 성분들은 상기한 HILIC 분석을 통해 명확하게 관찰될 수 있었다.
실시예 2: RP-HPLC에 의한 OBI-821 아쥬반트의 구조이성질체들의 확인
본 실험에서는, OBI-821의 구조이성질체들을 확인하기 위하여, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 OBI-821를 분리하였다. 당분야에 알려져 있는 바와 같이, OBI-821은 푸코오스의 4-히드록실 위치에 결합된 아실기를 갖는 A 형태 구조이성질체와 3-히드록실 위치에 아실기를 가진 B 형태 구조이성질체를 갖는다. RP-HPLC의 조건들은 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다. 요약하면, 시료를 제제화 버퍼(1.25mg/mL)에 용해시키고, YMC-Pack C4 칼럼(Part No. BU30S05-2546WT, 5㎛, 4.6×250mm) 내로 주입하고, 상기 칼럼을 15분에 걸쳐 물/아세토니트릴 구배 중의 0.1% TFA를 포함하는 이동상에 의해 용출시켰다. 그런 다음, 얻어진 용출물을 214nm의 자외선으로 검출하였다.
데이터 처리:
1. 214nm에서 크로마토그램 처리. 통합 파라미터들은 하기에 열거된다:
(a) 피크 폭: 30
(b) 한계값: 50.0
(c) 최소 피크 높이: 2000
(d) 통합 시간: 6~17분
2. 피크 정의
YMC-Pack C4 크로마토그래피에서, OBI-821은 주 피크(Major peak)와 부 피크(Minor peak)로 구성된다. 주 피크와 부 피크의 체류 시간을 기록한다. 주 피크에 대한 부 피크의 상대 체류 시간(RRT)은 0.95~0.97 내이어야 한다.
데이터 분석:
1. 시스템 적합성
평균 체류 시간과 피크 면적 및 상대 표준 편차(RSD)를 계산한다. RT 및 피크 면적의 RSD는 2% 미만이어야 한다. SST의 피크들은 또한 하기 기준들을 충족하여야 한다:
USP 테일링(tailing): 0.5~2.0
USP 평판 계수(plate count): ≥8000
분해능(resolution): ≥1.8
2. OBI-821의 확인:
시료의 피크 체류 시간을 기록한다. 시료의 체류 시간은 OBI-821 참조 표준의 체류 시간에 상응하여야 한다. 체류 시간과 상기 표준의 차이는 2% 이내이어야 한다.
3. OBI-821의 순도 및 불순물 결정
상기 순도 및 불순물은 다음과 같이 피크 면적%를 기록하는 피크 면적 분석에 의해 결정된다:
순도(%) = (AOBI-821/A총 피크들)
단일 불순물(%) = (A단일 불순물 피크/A총 피크들)
총 불순물(%) = (A총 불순물 피크들/A총 피크들)
AOBI-821 = 시료의 주 피크와 부 피크의 피크 면적의 합계
A단일 불순물 피크 = 용매 피크들을 제외한 단일 불순물 피크의 피크 면적
A총 불순물 피크들 = 용매 피크들을 제외한 각각의 단일 불순물 피크들의 피크 면적의 합계
A총 피크들 = 용매 피크들을 제외한 모든 피크들의 피크 면적
각 시료의 순도(%) 및 불순물(%)의 평균값을 계산한다.
결과들은 도 5에 나타내었다. 체류 시간 9.912분에 주 피크가 있었고, 체류 시간 9.526분에 부 피크가 있었다. 주 피크는 OBI-821-1858-A, OBI-821-1990-V1A, 및 OBI-821-1990-V2A를 포함하는 A 형태 구조이성질체를 나타낸다. 부 피크는 OBI-821-1858-B, OBI-821-1990-V1B, 및 OBI-821-1990-V2B를 포함하는 B 형태 구조이성질체를 나타낸다. 체류 시간 7.104분에서의 추가 피크는 불순물인 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 결과는 본 실험에서의 RP-HPLC가 OBI-821의 두가지 형태의 구조이성질체들을 분리할 수 있고, 그들의 존재 및 함량을 명확하게 관찰할 수 있다는 것을 입증하였다.
추가적으로, 상기 불순물 피크, 주 피크 및 부 피크의 상대 체류 시간은 주 피크의 체류 시간을 표준으로 사용하여 계산되었다(표 9). 또한, 순도는 약 96.72%였다. 얻어진 결과들과 함께, 본 발명의 RP-HPLC는 대상이 되는 OBI-821의 순도를 결정하는데 유용하였다.
실시예 3: HILIC와 RP-HPLC의 탠덤 조합에 의한 OBI-821의 6개 이성질체들의 확인
실시예 1에 기재된 연구는 본 발명의 HILIC 분석이 OBI-821 이성질체들 중 3개의 주요 성분들을 분리할 수 있다는 증거들을 제공하였다. 실시예 2에서의 연구는 본 발명의 RP-HPLC 분석이 OBI-821의 구조이성질체들을 관찰하는데 유용하다는 것을 확인해주었다. 따라서, HILIC 분석에서 수집된 분획들을, 각 분획의 A 형태 구조이성질체와 B 형태 구조이성질체로 더 분류할 수 있도록, 본 발명의 HILIC 분석과 RP-HPLC 분석을 탠덤으로 조합하는 것은 적합할 것이다. 이어서, OBI-821의 6개 이성질체들은 분리될 수 있고, 그들의 함량이 계산될 수 있다.
본 실험에서, 6개의 아쥬반트 물질 시료들을 상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 HILIC에 적용하여, 상기한 3개의 주요 성분들을 대표하는 3개의 분획들을 수집하였다. 그 후, 각 분획을 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 RP-HPLC에 각각 적용하여, 그들의 구조이성질체들을 분리하였다. 따라서, 분석 말기에, 6개의 이성질체들이 각각의 OBI-821 시료로부터 수득될 것으로 기대되었다. 각 시료의 6개 피크들의 피크 면적이 각 이성질체의 함량 계산을 위해 결정되었다. OBI-821 AS(아쥬반트 물질; Adjuvant Substance) 및 OBI-821 AP(아쥬반트 생성물; Adjuvant Product)의 결과들을 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.
※ OBI-821 AP(아쥬반트 생성물)은 OBI-821 AS의 동결건조 제제이다.
보고된 퍼센트는 HILIC 및 RP-HPLC의 크로마토그래피 데이터로부터 정규화되어 계산된다. 크로마토그래피 분석 조성에 의해, 3개의 주요 이성질체들인 OBI-821-1990-V1A, OBI-821-1990-V2A, 및 OBI-821-1858-A가 OBI-821 아쥬반트의 90% 이상인 것으로 계산되었다. 이들 3개의 주요 이성질체들은 푸코오스 잔기의 4-히드록실기에 부착된 지방산 아실 치환기로부터 형성되는 것으로 확인되었다. 상기 6개의 이성질체들 중, OBI-821-1990-V1A는 49 내지 63%로 계산되고, 이는 OBI-821 아쥬반트의 주요 이성질체이다.
달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 기계적 용어들과 과학적 용어들 및 임의의 약어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미들을 갖는다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 키트 및 정보 전달 수단들과 유사하거나 동등한 임의의 조성물, 방법, 키트 및 정보 전달 수단들이 본 발명의 실시를 위해 사용될 수 있으나, 본 명세서에는 바람직한 조성물, 방법, 키트 및 정보 전달 수단들이 기재되어 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 그 전체 내용이 적법하게 본 명세서에 통합된다. 그러한 참고문헌들에 대한 논의는 단순히 해당 저자들의 의견을 요약하기 위해 의도된 것이다. 어느 참고문헌(또는 어느 참고문헌의 일부)이 본 발명과 관련있는 선행기술임을 인정하는 것은 전혀 아니다. 본 출원인은 인용된 임의의 참고문헌의 정확성 및 적합성에 대해 이의를 제기할 권리를 보유한다.
Claims (27)
- 하기 화학식 (I)의 분리된 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염:
(I)
여기서, R1은 β-D-아피오스, β-D-자일로스 또는 H로부터 선택되고;
R2 및 R3은 H 또는로부터 선택된다.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 β-D-아피오스이고, R2는이며, R3은 H인 분리된 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 β-D-아피오스이고, R2는 H이며, R3은인 분리된 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 β-D-자일로스이고, R2는이며, R3은 H인 분리된 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 β-D-자일로스이고, R2는 H이며, R3은인 분리된 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 H이고, R2는
이며, R3은 H인 분리된 화합물.
- 제1항에 있어서, 상기 R1은 H이고, R2는 H이며, R3은인 분리된 화합물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 분리된 화합물의 하나 이상 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 사포닌 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 사포닌 조성물은, 상기 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로,
화합물 1990의 혼합물 약 75 내지 90중량%; 및
화합물 1858의 혼합물 약 10 내지 25중량%를 포함하고;
상기 화합물 1990의 혼합물은 화합물 1990-V1A, 화합물 1990-V1B, 화합물 1990-V2A, 화합물 1990-V2B, 또는 이들의 혼합물을 포함하고; 상기 화합물 1858의 혼합물은 화합물 1858-A, 화합물 1858-B, 또는 이들의 혼합물을 포함하며;
상기 화합물 1990-V1A, 화합물 1990-V1B, 화합물 1990-V2A, 화합물 1990-V2B, 화합물 1858-A, 화합물 1858-B는 각각 하기의 화학식을 갖는 것인 사포닌 조성물:
(I)
화합물 1990-V1A는 상기 식에서 R1이 β-D-아피오스이고, R2가이며, R3이 H이고;
화합물 1990-V1B는 상기 식에서 R1이 β-D-아피오스이고, R2가 H이며, R3이이고,
화합물 1990-V2A는 상기 식에서 R1이 β-D-자일로스이고, R2가이며, R3이 H이고;
화합물 1990-V2B는 상기 식에서 R1이 β-D-자일로스이고, R2가 H이며, R3이이고;
화합물 1858-A는 상기 식에서 R1이 H이고, R2가
이며, R3이 H이고;
화합물 1858-B는 상기 식에서 R1이 H이고, R2가 H이며, R3이이다.
- 제9항에 있어서, 상기 사포닌 조성물의 총 중량을 기준으로,
화합물 1990-V1A 약 45 내지 65중량%;
화합물 1990-V2A 약 19.31 내지 27.99중량%;
화합물 1990-V1B 약 0.29 내지 7.71중량%;
화합물 1990-V2B 약 0.11 내지 3.11중량%;
화합물 1858-A 약 11.94 내지 21.25중량%; 및
화합물 1858-B 약 0.06 내지 2.44중량%를 포함하는 사포닌 조성물. - 다음의 단계들을 포함하는, 사포닌 조성물의 이성질체 조성을 평가하기 위한방법:
(a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼에 적용하는 단계;
(b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및
(c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계;
여기서, 상기 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 아세토니트릴을 포함한다. - 제11항에 있어서, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼은 아미드 칼럼인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 크로마토그램은 자외선 검출에 의해 수득되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 사포닌 조성물은 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 사포닌 조성물인 방법.
- 다음의 단계들을 포함하는, 사포닌 조성물의 순도를 평가하기 위한 방법:
(a) 상기 사포닌 조성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계;
(b) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 이동상으로 용출시켜 용출물을 얻는 단계; 및
(c) 상기 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계;
여기서, 상기 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액을 포함한다. - 제16항에 있어서, 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행되는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼은 소수성 칼럼인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 소수성 칼럼은 C4 칼럼, C8 칼럼, 또는 C18 칼럼인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 크로마토그램은 자외선 검출에 의해 수득되는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 사포닌 조성물은 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 사포닌 조성물인 방법.
- 다음의 단계들을 포함하는, 사포닌 조성물의 품질을 평가하기 위한 방법:
(a) 상기 사포닌 조성물을 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼에 적용하는 단계;
(b) 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼을 제1 이동상으로 용출시켜 제1 용출물을 수집하는 단계;
(c) 상기 제1 용출물의 분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼에 적용하는 단계;
(d) 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼을 제2 이동상으로 용출시켜 제2 용출물을 수집하는 단계; 및
(e) 상기 제2 용출물의 크로마토그램을 얻는 단계;
여기서, 상기 제1 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 아세토니트릴을 포함하고; 상기 제2 이동상은 트리플루오로아세트산-물 용액 및 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 용액을 포함한다. - 제22항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행되는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 상기 용출은 0.1 내지 10 mL/min의 유속으로 수행되는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 칼럼은 아미드 칼럼인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 칼럼은 소수성 칼럼인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 소수성 칼럼은 C4 칼럼, C8 칼럼, 또는 C18 칼럼인 방법.
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