CN112118862A - 新颖皂苷佐剂及其评估方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及分离的OBI‑821佐剂的六种异构体结构(OBI‑821‑1990‑V1A、OBI‑821‑1990‑V1B、OBI‑821‑1990‑V2A、OBI‑821‑1990‑V2B、OBI‑821‑1858‑A、以及OBI‑821‑1858‑B)及用于评估其品质的方法。本公开内容的方法单独或串联采用亲水性相互作用液相层析(HILIC)及反相高效液相层析(RP‑HPLC)，并且能够在随后的层析中分离OBI‑821佐剂的异构体。因此，可进一步评估OBI‑821佐剂的性质。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求来自2018年3月28日提交且标题为“NOVEL SAPONIN ADJUVANT”的美国临时专利申请流水号62/649,091的优先权，该申请在此通过引用完整并入本文用于所有目的。
发明领域
本公开内容公开一种源自皂树(Quillaja saponaria Molina)树皮的基于皂苷的佐剂。它是一种在结构上类似于对另一种佐剂QS-21发现的描述的纯化的皂苷佐剂。此外，本公开内容公开一种通过高效液相层析评估皂苷品质的方法。
发明背景
皂苷是一类从皂树(Quillaja Saponaria Molina)树皮中萃取的化合物。先前的研究表明，若干种皂苷(称为QS-7、QS-17、QS-18及QS-21)能够显著提高抗体浓度，这意味着其作为佐剂的医药应用(Charlotte R.Kensil等，The Journal of Immunology，Vol.146，No.02，第431-437页，1991)。其中，QS-21实际上已广泛用作疫苗中的佐剂。
发明概述
鉴于上述情况，本公开内容的目的是公开基于皂苷的佐剂的六种异构体及分离这些异构体的方法，从而可进一步评估其纯度及/或品质。
本公开内容的另一目的是提供来自基于皂苷的佐剂的分离的皂苷化合物，从而可评估并实现医药用途。
为了达到上述目的，本公开内容提供一种分离的式(Ⅰ)化合物或其医药上可接受的盐，
其中
R1选自β-D-芹菜糖、β-D-木糖或氢；以及
R2及R3选自氢或
优选地，所述分离的化合物具有如下表所示的结构：
其中R1为芹菜糖、木糖或H；
其中R2及R3独立地为氢或脂肪酰基。
本公开内容还提供皂苷组合物，其包含一种或多种前述分离的化合物及医药上可接受的载体。
本公开内容更提供一种用于评估皂苷组合物的异构体组合物的方法，其包含：(a)将皂苷组合物应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；(b)用流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱，以获得洗脱液；以及(c)获得所述洗脱液的层析图；其中所述流动相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；其中在30分钟内，所述流动相中的所述三氟乙酸水溶液的量从0％(v/v)变化至20％(v/v)，而所述流动相中的所述乙腈的量从80％(v/v)变化至100％(v/v)；其中所述％(v/v)基于所述流动相的总体积。
优选地，所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
优选地，所述洗脱在2至11的pH范围内进行。
优选地，所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱为酰胺管柱。
优选地，所述层析图通过紫外光检测获得。
本公开内容还提供一种用于评估皂苷组合物纯度的方法，其包含：(a)将皂苷组合物应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；(b)用流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，以获得洗脱液；以及(c)获得所述洗脱液的层析图；其中所述流动相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液；其中所述三氟乙酸乙腈溶液包含基于所述三氟乙酸乙腈溶液的总体积计的20至80％(v/v)的所述三氟乙酸；而所述流动相中所述乙腈的量在35分钟内从20％(v/v)变化至80％(v/v)；其中所述％(v/v)基于所述流动相的总体积。
优选地，所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
优选地，所述洗脱在2至7.5的pH范围内进行。
优选地，所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱是反相管柱。
优选地，所述疏水性管柱为C4管柱、C8管柱或C18管柱。
优选地，所述层析图通过紫外光检测获得。
本公开内容更提供一种用于评估皂苷组合物品质的方法，其包含：(a)将皂苷组合物应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；(b)用第一流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析管柱以收集第一洗脱液；(c)将所述第一洗脱液的级份应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；(d)用第二流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱以收集第二洗脱液；及(e)获得所述第二洗脱液的层析图；其中所述第一流动相包含三氟乙酸水溶液及乙腈。
优选地，在30分钟内，所述第一流动相中的所述三氟乙酸水溶液的量从0％(v/v)变化至20％(v/v)，而所述第一流动相中的所述乙腈的量从80％(v/v)变化至100％(v/v)；其中所述％(v/v)基于所述第一流动相的总体积。
优选地，在35分钟内，所述第二流动相中的所述三氟乙酸水溶液的量从20％(v/v)变化至80％(v/v)，而所述第二流动相中的所述乙腈的量从20％(v/v)变化至80％(v/v)；其中所述％(v/v)基于所述第二流动相的总体积。
优选地，所述步骤(b)中的洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
优选地，所述步骤(b)中的洗脱在2至11的pH范围内进行。
优选地，所述步骤(d)中的洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
优选地，所述步骤(d)中的洗脱在2至7.5的pH范围内进行。
优选地，所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱为酰胺管柱。
优选地，所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱为疏水性管柱。
更优选地，所述疏水性管柱为C4管柱、C8管柱或C18管柱。
附图简述
图1.OBI-821亲水性相互作用液相层析(HILIC)紫外光(UV)层析图。
图2.收集自亲水性相互作用液相层析(HILIC)紫外光(UV)层析图的OBI-821的峰1级份(1858化合物，上图)、峰2级份(1990-V1化合物，中图)及峰3级份(1990-V2化合物，下图)的负ESI MS谱。
图3.(A)1858化合物(左图)及1990化合物(右图)的结构及其来自OBI-821的串联MS片段化离子和(B)1990化合物(上图)及1858化合物(下图)的MS/MS谱。
图4.收集自亲水性相互作用液相层析(HILIC)紫外光(UV)层析图的峰2级份(1990-V1化合物，上图)、峰3级份(1990-V2化合物，中图)及峰1级份(1858化合物，下图)的高效阴离子交换层析法配合脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)单糖分析。
图5.OBI-821的反相高效液相层析(RP-HPLC)层析图。
发明详述
OBI-821佐剂物质(AS)，一种皂苷组合物，是来自皂树(Quillaja saponaria)的源自植物的皂苷复合物，且包含六种共享下式(I)的异构体：
其中R1为芹菜糖、木糖或H；
其中R2及R3独立地为氢或脂肪酰基。
六种异构体列于下表1中，在本文中具有参考名称。在六种异构体中，连接在岩藻糖基残基上的代替OBI-821-1990异构体中的三糖部分的具有末端芹菜糖的OBI-821-1990-V1、具有末端木糖的OBI-821-1990-V2及具有二糖部分的OBI-821-1858(D-木糖基-(1→4)-O-β-D-L-鼠李糖基-(1→4))是其主要的三种组分。三种主要组分分别具有“A形式”及“B形式”位置异构体。
数字“1990”是OBI-821-1990-V1A、OBI-821-1990-V1B、OBI-821-1990-V2A及OBI-821-1990-V2B经理论上估算的分子量。同样地，数字“1858”是OBI-821-1858-A及OBI-821-1858-B经理论上估算的分子量。
表1 OBI-821佐剂物质(AS)的六种异构体
| 参考名称 | R<sup>1</sup> | R<sup>2</sup> | R<sup>3</sup> |
| OBI-821-1990-V1A | β-D-芹菜糖 | 脂肪酰基 | H |
| OBI-821-1990-V1B | β-D-芹菜糖 | H | 脂肪酰基 |
| OBI-821-1990-V2A | β-D-木糖 | 脂肪酰基 | H |
| OBI-821-1990-V2B | β-D-木糖 | H | 脂肪酰基 |
| OBI-821-1858-A | H | 脂肪酰基 | H |
| OBI-821-1858-B | H | H | 脂肪酰基 |
在OBI-821佐剂物质(AS)中发现总共六种异构体。这六种异构体可分为三组，OBI-821-1990-V1、OBI-821-1990-V2及OBI-821-1858。每组包含两种可鉴定为A组及B组的位置异构体。OBI-821佐剂的命名及物理化学性质总结在表2中。
表2 OBI-821佐剂物质(AS)的命名及物理化学性质
OBI-821AS的制造过程涉及三个纯化阶段(阶段I、阶段II及阶段III)。在主要原料Quil-A中发现的OBI-821的初始含量通常不超过3％。阶段I纯化过程将OBI-821含量增加至约15％，其中中间体被鉴定为纯化的Quil-A(PQA)。在阶段II过程中，将OBI-821含量增加至约0.2g/g具有盐的干燥形式(约50％主峰M.W.1990，此为经HPLC法得到的层析纯度)，其中中间体被鉴定为粗OBI-821(Crd-821)。在阶段III纯化过程后，可将OBI-821的含量富集至不低于98％，并被鉴定为OBI-821AS。
Quil-A可从Brenntag Biosector A/S(Brenntag；Frederikssund，丹麦)商业获得，其已被丹麦监管机构认证用作食品添加剂(证书号32119)。
本公开内容的第一方面涉及来自基于皂苷的佐剂的分离的皂苷化合物。术语“分离的”是指描述皂苷化合物基本上是纯的。更具体地，在一个实施方案中，分离的皂苷化合物不含杂质及其他异构体。例如，在一个实施方案中，分离的皂苷化合物是化合物1990-V1A，并且其不含化合物1990-V2A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2B、化合物1858-A及化合物1858-B。
本公开内容的第二方面有关一种皂苷组合物，其包含一种或多种前述分离的化合物及医药上可接受的载体。皂苷组合物可包含适于展现佐剂效果的比例的两种或更多种前述分离的化合物。医药上可接受的载体可以是本领域常用的任何载体。
在一个优选的实施方案中，该皂苷组合物包含占皂苷组合物总重量的75至90重量％的化合物1990混合物及10至25重量％的化合物1858混合物；其中化合物1990混合物包含化合物1990-V1A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2A、化合物1990-V2B，或其混合物；且化合物1858混合物包含化合物1858-A、化合物1858-B或其混合物。在一个更优选的实施方案中，该皂苷组合物包含占皂苷组合物总重量的80-88重量％的化合物1990混合物及12-23重量％的化合物1858的混合物。
在另一个优选的实施方案中，该皂苷组合物包含占皂苷组合物总重量的约45至65重量％的化合物1990-V1A。在一个具体的实施方案中，该皂苷组合物包含占皂苷组合物总重量的约45至65重量％的化合物1990-V1A；约19.31至27.99重量％的化合物1990-V2A；约0.29至7.71重量％的化合物1990-V1B；以及约0.11至3.11重量％的化合物1990-V2B。在另一个具体的实施方案中，该皂苷组合物包含占皂苷组合物总重量的约49.26至63.42重量％的化合物1990-V1A；约19.31至27.99重量％的化合物1990-V2A；约0.29至7.71重量％的化合物1990-V1B；以及约0.11至3.11重量％的化合物1990-V2B。
下文中提到的“评估OBI-821的异构体组成”的术语是通过一种方法分离OBI-821，从而可分离并观察OBI-821的三种主要组分。这对于验证所讨论的OBI-821是否包含所有三种主要组分至关重要，因为其可能是OBI-821在增强抗体或细胞介导的免疫应答中的功能的一个因素。下文中提到的“评估OBI-821纯度”的术语是评估所讨论的OBI-821中存在的杂质含量。优选地，在所讨论的OBI-821中杂质含量小于10重量％；也就是说，OBI-821的纯度超过90％。下文中提到的“评估OBI-821的品质”的术语是评估三种主要组分的存在及所讨论的OBI-821的纯度两者。
在本公开内容的第三方面，提供一种用于通过亲水性相互作用液相层析评估皂苷组合物的异构体组成的方法。该方法包含：(a)将皂苷组合物应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；(b)用流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱，以获得洗脱液；以及(c)获得所述洗脱液的层析图。
在一个优选的实施方案中，所述流动相以下述梯度应用，所述流动相中的三氟乙酸水溶液的量在30分钟内从0％(v/v)变化至20％(v/v)，而所述流动相中的所述乙腈的量从80％(v/v)变化至100％(v/v)；其中所述％(v/v)基于所述流动相的总体积。
所述洗脱可根据操作条件以合适的流速进行。然而，在一个优选的实施方案中，所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
在一个优选的实施方案中，在进行分析之前，该管柱应由缓冲液条件化(conditioned)。另外，在一个优选的实施方案中，在分析完成后，应以洗涤缓冲液洗涤所述管柱。用于所述条件的缓冲液可以是三氟乙酸水溶液、乙腈或其混合物。所述洗涤缓冲液可以是乙腈、水或其混合物。优选地，所述洗涤缓冲液是具合适梯度的乙腈和水的混合物。
在一个优选的实施方案中，所述层析图可包含三个峰，分别代表上述六种异构体的三种主要组分。实际上，可透过计算三个峰的峰面积来初步确定所讨论的OBI-821的纯度。
在本公开内容的第四方面，提供一种用于通过反相高效液相层析(RP-HPLC)评估皂苷组合物纯度的方法。该方法包含：(a)将皂苷组合物应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；(b)用流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，以得到洗脱液；(c)获得所述洗脱液的层析图。
在一个优选的实施方案中，所述流动相以下述梯度应用，所述流动相中的所述三氟乙酸水溶液的量在35分钟内从20％(v/v)变化至80％(v/v)，而所述流动相中的所述乙腈的量从20％(v/v)变化至80％(v/v)；其中％(v/v)基于所述流动相的总体积。
所述洗脱可根据操作条件以合适的流速进行。然而，在一个优选的实施方案中，所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
在一个优选的实施方案中，所述层析图包含分别代表“A形式”位置异构体及“B形式”位置异构体的两个峰。具体地，代表“A形式”位置异构体的峰将是OBI-821-1990-V1A、OBI-821-1990-V2A及OBI-821-1858-A的组合；代表“B形式”位置异构体的峰将是OBI-821-1990-V1B、OBI-821-1990-V2B及OBI-821-1858-B的组合。在一个优选的实施方案中，可透过计算所述两个峰的峰面积来确定所讨论的OBI-821的纯度。
在本公开内容的第五方面，提供一种用于评估皂苷组合物品质的方法。该方法通过HILIC及RP-HPLC串联进行。将皂苷组合物应用于本公开内容第三方面的评估皂苷组合物的异构体组成的方法，然后将所得的级份应用于本公开内容第四方面的评估OBI-821的纯度的方法。
具体地，方法包含(a)将皂苷组合物应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；(b)用第一流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱，以收集第一洗脱液；(c)将所述第一洗脱液的级份应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；(d)用第二流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，以收集第二洗脱液；以及(e)获得所述第二洗脱液的层析图。
优选地，亲水性相互作用液相层析(HILIC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)的包括管柱、流动相、流速等的条件与前面段落中所述的相同。
在一个优选的实施方案中，在所述步骤(c)中，将代表六种异构体的三种主要组分中的任何一种的所述第一洗脱液的级份应用到所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，因此可分离级份的“A形式”位置异构体及“B形式”位置异构体。
在一个优选的实施方案中，收集分别代表六种异构体的三种主要组分的三种级份，用于在所述步骤(c)中的所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，因此，可分离三种主要组分各自的“A形式”位置异构体及“B形式”位置异构体。因此，可获得三个层析图，其中每个层析图具有代表“A形式”位置异构体的一个峰及代表“B形式”位置异构体的一个峰。计算获得的三个层析图的两个峰的峰面积便能够提供所讨论的OBI-821的六种异构体各自的含量。
实施例
实施例1：通过HILIC分离OBI-821佐剂。
进行本实验分离OBI-821佐剂，因此可以观察六种异构体的三种主要组分。分析方法及条件总结在下表3及表4中。将1.0至2.0mg测试样品溶于空白缓冲液(含80％(v/v)乙腈的去离子水)中以制备OBI-821溶液(500微克/毫升)。然后，将OBI-821溶液注射入WATERSXBridge酰胺管柱(Waters Corporation，Part No.186004896)中。HILIC的流动相是洗脱液A及洗脱液B的混合物。洗脱液A是0.1％(v/v)的溶解在去离子水(DI水)中的三氟乙酸，而洗脱液B是乙腈。将流动相的梯度设定为如下表4中所示的洗脱程序。
表3HILIC的条件
表4 HILIC的洗脱程序
| 时间(分钟) | 洗脱液A(％) | 洗脱液B(％) |
| 0 | 18.0 | 82.0 |
| 18 | 19.0 | 81.0 |
| 25 | 19.0 | 81.0 |
| 26 | 18.0 | 82.0 |
| 30 | 18.0 | 82.0 |
数据处理：
1.处理在214nm处的层析图。对所有峰进行积分并记录所有峰的保留时间、峰面积(曲线下面积)及面积％。(注意：请避免对来自空白的溶剂峰进行积分)。面积％可理解为重量％(wt/wt)。
2.相对保留时间(RRT)的计算
RRT是峰的保留时间与峰值1990-V1的保留时间的比率。1990-V1的保留时间通过OBI-821溶液中主峰的平均保留时间定义。
RRT＝RT峰/RT1990-Api
3.峰识别
三种OBI-821组分(1858、1990-V1及1990-V2)通过表5中所示的相对保留时间(RRT)来识别，如下所示：
表5 HILIC的1858异构体、1990-V1异构体及1990-V2异构体的相对保留时间
| 异构体名称 | 供识别的RRT |
| 1990-V1(末端芹菜糖) | 1.00±0.1 |
| 1858 | 0.93±0.1 |
| 1990-V2(末端木糖) | 1.07±0.1 |
数据分析：
1.系统适用性测试(SST)
SST的结果由注入OBI-821溶液获得。计算RT的相对标准偏差(RSD％)及1990-Api的峰面积。RT和峰面积的可接受标准应小于2％。
2.糖异构体分布
糖异构体分布由峰的峰面积决定。
1858(％)＝1858的峰面积/3个峰(1858、1990-V1及1990-V2)的峰面积之和x100％
1990-V1(％)＝1990-V1的峰面积/3个峰(1858、1990-V1及1990-V2)的峰面积之和x 100％
1990-V2(％)＝1990-V2的峰面积/3个峰(1858、1990-V1及1990-V2)的峰面积之和x 100％
将结果平均并计算相对标准偏差(％RSD)。将最终结果表示为平均含水量±标准偏差。
如图1所示，OBI-821的层析图分别在保留时间的9.661分钟(以下为峰1；OBI-821-1858)、10.113分钟(以下为峰2；OBI-821-1990-V1)以及10.560分钟(以下为峰3；OBI-821-1990-V2)显示三个主峰。保留时间为6.300分钟时还有另一个峰，这将是HILIC的溶剂峰。
为了进一步鉴定上述三个主峰的洗脱液，收集上述三个OBI-821峰的级份，并通过负ESI MS检测。如图2所示，对于OBI-821-1990-V1(峰2)及-V2(峰3)观察到m/z 1989；对于-1858(峰1)观察到m/z 1857。这些m/z结果分别与理论分子量1990.13192(C92H148O46)及1858.0173(C87H140O42)一致。
为了确认OBI-821异构体的结构，经由定向输注MS/MS及MS/MS/MS分析，进一步应用ESI MS中三个峰的洗脱液进行结构分析。串联MS结构信息总结在图3(A)中。MS/MS谱显示于图3(B)中，选择图中指定的质量峰用于MS/MS/MS分析。从串联质谱中，显示碎片离子与母离子之间存在相应的结构关系。
然后，进行高效阴离子交换层析法配合脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)单糖分析(Thermo Fisher Scientific，Dionex ICS-5000和CarboPac PA1管柱(部件号035391，4x250 mm))，进一步区分这三个级份的身份。从HILIC收集OBI-1990-V1、-V2及-1858并通过旋转蒸汽浓缩。浓缩的OBI-1990-V1、-V2及-1858在100℃下用4M TFA水解4小时并冻干。冻干后，通过去离子水重建(reconstitute)OBI-1990-V1、-V2及-1858，并通过高效阴离子交换层析法配合脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)进行分析。使用200mM氢氧化钠作为流动相A，并且使用去离子水作为流动相B。使用100mM氢氧化钠及500mM乙酸钠作为流动相C。
流动相的初始组合物在流动相A为91％，流动相B为9％，持续10分钟。然后切换至90％流动相A和10％流动相C，然后在10分钟内线性梯度至60％流动相A和40％流动相C。然后通过100％流动相A进行洗涤步骤20分钟。
根据图4和表6所示的结果，三种洗脱液均含有一个岩藻糖(fucose)、一个鼠李糖、一个半乳糖、一个葡糖醛酸及一个阿拉伯糖，但木糖和芹菜糖的数量不同。峰1级份具有2个木糖但没有芹菜糖。峰2级份具有2个木糖和1个芹菜糖。峰3级份具有3个木糖和0个芹菜糖。因此，三种级份分别被鉴定为OBI-821-1858异构体、OBI-821-1990-V1异构体及OBI-821-1990-V2异构体。也就是说，在该实验中进行的HILIC分析能够分离OBI-821的六种异构体的三种主要组分。换句话说，通过上述HILIC分析可以清楚地观察到OBI-821的三种主要组分。
表6从HILIC收集的峰级份的单糖组合物摩尔比。
实施例2：通过RP-HPLC鉴定OBI-821佐剂的位置异构体
在该实验中，通过反相高效液相层析(RP-HPLC)分离OBI-821以鉴定其位置异构体。如本领域所知，OBI-821具有含有在岩藻糖的4-羟基位置处键结的酰基的A形式位置异构体和含有在3-羟基位置处具有酰基的B形式位置异构体。RP-HPLC的条件列于下表7和表8中。简言之，将测试样品溶解在配方缓冲液(1.25mg/mL)中并注射到YMC-Pack C4管柱(部件号BU30S05-2546WT，5μm，4.6×250mm)中，并在15分钟内通过包含水/乙腈梯度中的0.1％TFA的流动相洗脱管柱。然后通过214nm的紫外线检测洗脱液。
表7 RP-HPLC的条件
表8 RP-HPLC的洗脱程序
| 时间(分钟) | 洗脱液A(％) | 洗脱液B(％) |
| 0 | 75 | 25 |
| 15 | 25 | 75 |
| 20 | 20 | 80 |
| 30 | 75 | 25 |
| 35 | 75 | 25 |
数据处理：
1.处理在214nm处的层析图。积分参数如下所示：
(a)峰宽：30
(b)阈值：50.0
(c)最低峰高：2000
(d)积分时间：6-17分钟
2.峰定义
在YMC-Pack C4层析中，OBI-821由主峰和次峰组成。记录主峰和次峰的保留时间。次峰对主峰的相对保留时间(RRT)应在0.95-0.97之间。
数据分析：
1.系统适用性
计算平均保留时间和峰面积以及相对标准偏差(RSD)。RT和峰面积的RSD应小于2％。SST的峰也应符合标准：
美国药典理论拖尾因子(USP tailing)：0.5-2.0
美国药典理论塔板数(USP plate count)：≧8000
解析度：≧1.8
2.OBI-821的识别：
记录测试样品的峰保留时间。测试样品的保留时间应与OBI-821参考标准品的保留时间相对应。与标准品的保留时间差异应在2％以内。
3.测定OBI-821的纯度和杂质
纯度和杂质由记录峰面积％的峰面积分析确定如下：
纯度(％)＝(AOBI-821/A总峰)
单一杂质(％)＝(A单一杂质峰/A总峰)
总杂质(％)＝(A总杂质峰/A总峰)
AOBI-821＝测试样品的主峰和次峰的峰面积之和
A单一杂质峰＝除溶剂峰外的单一杂质峰的峰面积
A总杂质峰＝除溶剂峰外的每个单一杂质峰的峰面积之和
A总峰值＝除溶剂峰外的所有峰的峰面积
对每个测试样品的纯度(％)和杂质(％)的值取平均值。
结果如图5所示。主峰的保留时间为9.912分钟，次峰为9.526分钟。主峰代表A形式位置异构体，包含OBI-821-1858-A、OBI-821-1990-V1A和OBI-821-1990-V2A。次峰代表B形式位置异构体，包含OBI-821-1858-B、OBI-821-1990-V1B和OBI-821-1990-V2B。在7.104分钟处的另一个峰被识别为杂质。因此，结果证明该实验的RP-HPLC能够分离OBI-821的两种形式的位置异构体，从而可以清楚地观察其存在和含量。
另外，以主峰的保留时间为标准，计算上述杂质峰、主峰和次峰的相对保留时间(表9)。此外，纯度约为96.72％。与获得的结果一起，本公开内容的RP-HPLC可用于确定所讨论的OBI-821的纯度。
表9 OBI-821层析图的定量数据
实施例3：通过HILIC和RP-HPLC的串联组合鉴定OBI-821的六种异构体。
实施例1中描述的研究提供证据表明本HILIC分析能够分离OBI-821异构体的三种主要组分。实施例2中的研究证实，本RP-HPLC分析可用于观察OBI-821的位置异构体。因此，将本HILIC分析和RP-HPLC分析串联组合是合理的，以便在HILIC分析中收集的级份可以进一步分为每个级份的A形式位置异构体和B形式位置异构体。随后，可分离OBI-821的六种异构体，并可计算其含量。
在该实验中，如上述实施例1所述，将六种佐剂物质样品应用于HILIC分析，以收集代表三种主要组分的三种级份。然后，如前述实施例2中所公开的，将各级份分别进行RP-HPLC分析，以分离其位置异构体。因此，在分析结束时，预计从每个OBI-821样品中获得六种异构体。确定每个样品的六个峰的峰面积以计算每种异构体的含量。OBI-821AS(佐剂物质)和OBI-821AP(佐剂产物)的结果显示在表10和表11中。
表10 OBI-821AS批次的每种异构体的含量。
表11 OBI-821AP批次的每种异构体的含量。
※OBI-821AP(佐剂产品)是OBI-821AS的冻干配方。
报告的百分比被标准化并由HILIC和RP-HPLC的层析数据计算。按照层析组成计，三种主要异构体OBI-821-1990-V1A、-V2A和1858-A占OBI-821佐剂的90％以上。发现这三种主要异构体由与岩藻糖残基的4-羟基连接的脂肪酰基取代基形成。在六种异构体中，OBI-821-1990-V1A占49％至63％，且为OBI-821佐剂的主要异构体。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本发明领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管用于传递与本文描述的那些类似或等同的信息的任何组合物、方法、试剂盒和手段可用于实施本公开内容，但本文描述了用于传递信息的优选组合物、方法、试剂盒和手段。
本文引用的所有参考文献在法律允许的最大范围内通过引用并入本文。对那些参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者所作的断言。不承认任何参考文献(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术。申请人保留质疑任何引用参考文献的准确性和针对性的权利。
Claims (27)
1.一种分离的式(I)化合物或其医药上可接受的盐，
其中，
R1选自β-D-芹菜糖、β-D-木糖或H；以及
R2及R3选自H或
2.权利要求1的分离的化合物，其中R1为β-D-芹菜糖，R2为
且R3为H。
3.权利要求1的分离的化合物，其中R1为β-D-芹菜糖，R2为H且R3为
4.权利要求1的分离的化合物，其中R1为β-D-木糖，R2为
且R3为H。
5.权利要求1的分离的化合物，其中R1为β-D-木糖，R2为H且R3为
6.权利要求1的分离的化合物，其中R1为H，R2为
且R3为H。
7.权利要求1的分离的化合物，其中R1为H，R2为H且R3为
8.一种皂苷组合物，其包含一种或多种权利要求1至7中任一项所述的分离的化合物及医药上可接受的载体。
9.权利要求8的皂苷组合物，其包含按该皂苷组合物的总重量计：
约75至90重量％化合物1990的混合物；以及
约10至25重量％化合物1858的混合物；
其中该化合物1990的混合物包含化合物1990-V1A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2A、化合物1990-V2B，或其混合物；而该化合物1858的混合物包含化合物1858-A、化合物1858-B或其混合物；
其中该化合物1990-V1A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2A、化合物1990-V2B、化合物1858-A、化合物1858-B分别具有下式：
化合物1990-V1A：R1为β-D-芹菜糖，R2为
且R3为H；
化合物1990-V1B：R1为β-D-芹菜糖，R2为H，且R3为
化合物1990-V2A：R1为β-D-木糖，R2为
且R3为H；
化合物1990-V2B：R1为β-D-木糖，R2为H，且R3为
化合物1858-A：R1为H，R2为
且R3为H；以及
化合物1858-B：R1为H，R2为H且R3为
10.权利要求9的皂苷组合物，其包含按该皂苷组合物的总重量计：
约45至65重量％的所述化合物1990-V1A；
约19.31至27.99重量％的所述化合物1990-V2A；
约0.29至7.71重量％的所述化合物1990-V1B；
约0.11至3.11重量％的所述化合物1990-V2B；
约11.94至21.25重量％的所述化合物1858-A；以及
约0.06至2.44重量％的所述化合物1858-B。
11.一种用于评估皂苷组合物的异构体组成的方法，其包含：
(a)将该皂苷组合物应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；
(b)用流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱，以获得洗脱液；以及
(c)获得所述洗脱液的层析图；
其中所述流动相包含三氟乙酸水溶液及乙腈。
12.权利要求11的方法，其中所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
13.权利要求11的方法，其中所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱为酰胺管柱。
14.权利要求11的方法，其中所述层析图通过紫外光检测获得。
15.权利要求11的方法，其中所述皂苷组合物为权利要求8至10中任一项的组合物。
16.一种用于评估皂苷组合物纯度的方法，其包含：
(a)将所述皂苷组合物应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；
(b)用流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱，以获得洗脱液；以及
(c)获得所述洗脱液的层析图；
其中所述流动相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液。
17.权利要求16的方法，其中所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
18.权利要求16的方法，其中所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱为疏水性管柱。
19.权利要求16的方法，其中所述疏水性管柱为C4管柱、C8管柱或C18管柱。
20.权利要求16的方法，其中所述层析图通过紫外光检测获得。
21.权利要求16的方法，其中所述皂苷组合物为权利要求8至10中任一项的组合物。
22.一种用于评估皂苷组合物品质的方法，其包含：
(a)将该皂苷组合物溶液应用到亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱；
(b)用第一流动相洗脱所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱以收集第一洗脱液；
(c)将所述第一洗脱液的级份应用到反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱；
(d)用第二流动相洗脱所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱以收集第二洗脱液；以及
(e)获得所述第二洗脱液的层析图；
其中所述第一流动相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；
其中所述第二流动相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液。
23.权利要求22的方法，其中所述步骤(b)中的所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
24.权利要求22的方法，其中所述步骤(d)中的所述洗脱以0.1至10mL/分钟的流速进行。
25.权利要求22的方法，其中所述亲水性相互作用液相层析(HILIC)管柱为酰胺管柱。
26.权利要求22的方法，其中所述反相高效液相层析(RP-HPLC)管柱为疏水性管柱。
27.权利要求22的方法，其中所述疏水性管柱为C4管柱、C8管柱或C18管柱。
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