RU2806331C1 - Применение 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этана в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью - Google Patents
Применение 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этана в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2806331C1 RU2806331C1 RU2023111080A RU2023111080A RU2806331C1 RU 2806331 C1 RU2806331 C1 RU 2806331C1 RU 2023111080 A RU2023111080 A RU 2023111080A RU 2023111080 A RU2023111080 A RU 2023111080A RU 2806331 C1 RU2806331 C1 RU 2806331C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- platelet
- compound
- dihydroxy
- methoxyphenyl
- hydroxyphenyl
- Prior art date
Links
Abstract
Настоящее изобретение относится к области фитохимии, а именно к новому применению 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этана формулы (1), в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью. Технический результат – улучшенное подавление агрегации тромбоцитов, эффективное удлинение реакции высвобождения тромбоцитов и полное ингибирование активации тромбоцитов, обеспечиваемые соединением формулы (1), проявляющим высокую антиагрегационную активность. 5 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области фитохимии, к применению биологически активных соединений природного происхождения - класса бибензилов а именно 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этан формулы (1):
обладающему антиагрегационной активностью, что позволяет предложить его использование в фармакологии и медицине в качестве антиагреганта.
Существуют два основных способа получения бибензилов известные из уровня техники - выделение из природных источников и химический синтез.
Известны структурные аналоги к заявляемому соединению, проявляющие антиагрегационное действие.
Антиагрегационная активность заявляемого соединения - 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этан ранее не была исследована.
Задачей изобретения является изыскание новых соединений, обладающих антиагрегационной активностью, и расширение арсенала средств воздействия на живой организм.
Поставленная задача решается тем, что соединение - 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этан (1) проявляет высокую антиагрегацилнную активность при низкой токсичности.
Получают заявляемое соединение путем выделения из надземной части водяники черной - Empetrum nigrum L.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение заявляемого соединения (1).
Проводилась многократная экстракция высушенного сырья - побеги Водяники черной (масса - 744 гр.) 96% этиловым спиртом (V = 3150 мл). Экстракция проводилась до полного истощения сырья. Полученное извлечение выпаривалось на вакуумно-ротационном испарителе марки Heidolph при 60°C, до приблизительного объема 200 мл. Затем проводилась последовательная многократная жидкость-жидкостная экстракция. На первом этапе экстракция проводилась с равным количеством гексана, до полного обесцвечивания гексана. Затем к спиртовому извлечению добавляли 50 мл воды очищенной и продолжали жидкость-жидкостную экстракцию с равным количеством дихлорметана также до полного его обесцвечивания. В заключении жидкостная экстракция проводилась с равным количеством бутанола. Остаточную водно-спиртовую и три полученных фракции выпаривали до объема 100 мл.
Дихлорметановую фракцию загружали на сорбент Sephadex LH-20, марки «GE Healthcare». Изначальный элюент - дихлорметан. Проводили градиентное элюирование с постепенным увеличением содержания метанола до 50% с шагом 5%. Сбор предварительных фракций производился в пробирки. Параллельно проводился скрининг полученных из колонки предварительных фракций методом ТСХ в системе гекса:дихлорметан:метанол (2:2:0,5), для дальнейшего их объединения. Полученные фракции 5-6 объединялись и упаривались при 60°C до объема пенициллинки. Затем полученная фракция загружалась на колонку с Silica gel, использовали градиентное элюирование с гексаном:дихлорметаном 50:50 до 100% дихлорметана, с постепенным увеличением 96% этилового спирта до 100%. Полученные фракции упаривали до объема пенициллинки. Фракцию 4 загружали на колонку с сорбентом Sephadex LH-20, марки «GE Healthcare». В качестве элюента использовали 96% этиловый спирт, изократический режим элюирования. Параллельно проводили скрининг полученных из колонки предварительных фракций методом ТСХ в системе БУВ (4:1:2). Полученную фракцию 4 загружали на препаративный хроматограф. Анализ полученных фракций и индивидуальных соединений проводили на аналитическом ВЭЖХ компании Shimadzu. Выделение индивидуального соединения проводили на препаративном ВЭЖХ компании Knauer.
Характеристика метода аналитического ВЭЖХ:
Хроматографическая колонка «SUPELCOSIL» LC-18, 25см × 4.6 мм, 5 мкм. Температура анализа - 40°C. Элюент: вода (компонент А), ацетонитрил (компонент В) с содержанием ТФУ 0,1%.
| Время (мин) | Скорость потока (мл/мин) | Концентрация компонента А (%) | Концентрация компонента В (%) |
| 0,01 | 1,00 | 95 | 5 |
| 5,00 | 1,00 | 95 | 5 |
| 45,75 | 1,00 | 0 | 100 |
| 50,00 | 1,00 | 0 | 100 |
| 60,00 | 1,00 | 95 | 5 |
| 65,00 | 1,00 | 95 | 5 |
Время удерживания: 23, 475 мин.
Характеристика метода препаративного ВЭЖХ:
Хроматографическая колонка «Kromasil» 100-5C18, 250 × 30 мм. Скорость потока 40 мл/мин. Элюент: вода (компонент А), ацетонитрил (компонент В) с содержанием ТФУ 0,1%.
| Время (мин) | Скорость потока (мл/мин) | Концентрация компонента А (%) | Концентрация компонента В (%) |
| 0,00 | 40,000 | 90 | 10 |
| 5,00 | 40,000 | 90 | 10 |
| 35,00 | 40,00 | 25 | 75 |
| 42,00 | 40,000 | 25 | 75 |
| 46,00 | 40,000 | 90 | 10 |
Длинна волны: 235 нм.
Время удерживания: 34, 232 мин.
Ацетонитрил компании «J.T.Baker» класса ВЭЖХ.
Полученная фракция выпаривались досуха, перерастворялись в 2-3 мл. дихлорметана. Данная фракция переносилась в пенициллинку и выдерживалась на плитке при 60°C до полного испарения дихлорметана, затем замораживалась и леофилизировалась.
Заявляемое соединение (1) представляет собой желтое кристаллическое вещество, имеющее один максимум поглощения в УФ-спектре при (λmax) 272 нм. Спектр HR-ESIMS имеет пик псевдомолекулярного иона [M+H]+ при m/z 261.1126 (расч. 261.1127), что соответствует молекулярной формуле С15Н16О4.
| Таблица 1. Данные 1Н ЯМР-спектров соединения 1. | ||
| Положение | 1H химический сдвиг, J (Hz) | 13C химический сдвиг |
| 1-C | - | 137.20 |
| 2,6-CH | 6.21 (1H, s) | 107.66 |
| 3,5-C | - | 150.79 |
| 4-C | - | 133.91 |
| 1’-C | - | 143.29 |
| 2’-CH | 6.64 (1H, m) | 115.63 |
| 3’-C | - | 157.83 |
| 4’-CH | 6.60 (1H, m) | 119.14 |
| 5’-CH | 7.02 (1H, t 8.5, 7.7 Hz) | 129.46 |
| 6’-CH | 6.60 (1H, m) | 119.38 |
| αH CH2 | 2.58 (2H, m) | 37.32 |
| βH CH2 | 2.66 (2H, m) | 37.57 |
| 3,5-OH | 8.99 (2H, s) | - |
| 4-OH | 9.44 (1H, s) | - |
| 3’-OMe | 3.62 (3H, s) | 54.6 |
При установлении структуры соединения 1 применяли спектральные методы анализа. УФ-спектроскопию (СФ-2000, ОКБ Спектр, Россия), ЯМР-спектроскопию (Bruker Avance III 400 NMR Spectrometer, США) и масс-спектрометрию высокого разрешения (Bruker Micromass Q-TOF spectrometer, США).
Пример 2. Исследование влияние заявляемого соединения (I) на процессы активации и агрегации тромбоцитов.
Оценка влияние соединения I на функциональную активность тромбоцитов проводилась в условиях in vitro следующим образом. Эксперименты выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 12 человек. Забор крови проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.
Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).
Исследование влияния на процесс агрегации тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.G.V.Nature (London).-1962 .-V.194.) на агрегометре "АТ-02” (НПФ "Медтех", Россия). Определение антиагрегационной активности исследуемых веществ и препаратов сравнения проводили в конечной концентрации 1×10-3 моль/л. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту («Ацетилсалициловая кислота», Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства “Технология-Стандарт” (Россия, г. Барнаул).
В качестве маркера активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р- селектина на поверхности тромбоцитов. Цитофлуориметрический анализ проводили на приборе BD FACSCanto II (США), используя оригинальное программное обеспечение. Измеряли связывание с тромбоцитами крови здоровых доноров флюорисцентно- меченых антител против CD62. Для этого образцы богатой тромбоцитами плазмы разводили в 100 раз 0,15 М фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,0-7,5), вносили исследуемые препараты и инкубировали в течение 5 минут. Для активации тромбоцитов в пробы вносили АДФ до конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию проводили в течение 15 минут, после чего клетки фиксировали добавлением 1% раствора формалина. После инкубации образцы богатой тромбоцитами плазмы окрашивали 20 минут при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами CD62, меченными APC (алофикоцианином) (Becton Dickinson, США) согласно рекомендациям производителя. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Для каждой пробы собирали не менее 10000 событий. «Тромбоцитарное окно» выделяли по параметрам прямого (FCS) и малоугольного (SSC) светорассеяний в логарифмической шкале координат. Оценивали количество позитивных клеток (%) по CD62.
Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Выявлено, что вид распределения полученных данных отличается от нормального, поэтому при дальнейшей работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.
По результатам исследования установлено, что ацетилсалициловая кислота в скрининговой концентрации 1×10-3 моль/л проявила выраженную антиагрегационную активность, подавляя агрегацию тромбоцитов на 13,7% относительно контроля. При этом следует отметить, что ацетилсалициловая кислота не оказывает влияние на процессы реакции высвобождения тромбоцитов (латентный период) (таблица 1) и процессы активации тромбоцитов (таблица 2).
| Таблица 1. - Влияние соединения I и ацетилсалициловой кислоты на показатели агрегации тромбоцитов, Ме (0,25-0,75) | |||||
| № | Шифр | Латентный период, % к контролю | Максимальная амплитуда, % к контролю | Скорость агрегации, % к контролю | Время достижения МА, % к контролю |
| 1. | Соединение I | +21,7 (20,3-23,8)**, ## | -19,4 (17,8-21,5)**, # | -15,4 (13,7-18,7)*, # | -18,9 (16,4-20,3)**, ## |
| 2. | Ацетилсалициловая кислота | -2,1 (1,1-2,6) | -13,7 (10,8-16,4)* | -10,5 (7,6-12,3)* | +10,5 (8,7-13,4)* |
Примечание: *р≤0.05, **р≤0.001 - в сравнении с контролем; #р≤0.05, ##р≤0.001 - в сравнении с ацетилсалициловой кислотой; n=6.
| Таблица 2. - Экспрессия CD62 тромбоцитов в присутствии соединения I и ацетилсалициловой кислоты, Ме (0,25-0,75) | |||
| № | Шифр | CD62АДФ- | CD62АДФ+ |
| 1. | Контроль | 1,3 (1,1-1,4) | 17,9 (16,5-19,3)‡‡ |
| 2. | Соединение I | 1,1 (1,1-1,3)* | 1,3 (1,2-1,5)**, ‡ |
| 3. | Ацетилсалициловая кислота | 1,3 (1,1-1,4)* | 16,4 (14,5-17,3)*, ‡‡ |
Примечание: Уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контролем: * - p>0,05, ** - p≤0,05; уровень статистической значимости различий признаков групп после активации АДФ: ‡ - p>0,05, ‡‡ - p≤0,05. CD62АДФ- - экспрессия CD62 до воздействия АДФ, CD62АДФ+ - экспрессия CD62 после воздействия АДФ.
Соединение I в эквимолярной концентрации подавляло АДФ-индуцированной агрегацию тромбоцитов в среднем на 19,7%, что по превышает показатели активности ацетилсалициловой кислоты. Однако соединение I эффективнее ацетилсалициловой кислоты удлиняет реакцию высвобождению тромбоцитов на 21,7% и полностью ингибирует активацию тромбоцитов (экспрессия Р-селектина).
Таким образом, соединение I оказывают выраженную антиагрегационную активность, превосходящую по уровню и спектру аналоговый препарат - ацетилсалициловую кислоту.
Claims (3)
- Применение 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этана (1):
-
- в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2806331C1 true RU2806331C1 (ru) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3971651A (en) * | 1973-02-12 | 1976-07-27 | Rikagaku Kenkyusho | Plant growth modifier and a process for preparation thereof |
| RU2219166C2 (ru) * | 1998-04-30 | 2003-12-20 | Мерк Патент Гмбх | Производные бифенила, способ их получения, фармацевтическая композиция, способ ее получения, лекарственное средство |
| JP2004250442A (ja) * | 2003-01-31 | 2004-09-09 | Mitsubishi Pharma Corp | エンドセリン血中濃度低下剤 |
| US20070099826A1 (en) * | 2003-10-10 | 2007-05-03 | Norman Wong | Treatment of diseases associated with the egr-1 enhancer element |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3971651A (en) * | 1973-02-12 | 1976-07-27 | Rikagaku Kenkyusho | Plant growth modifier and a process for preparation thereof |
| RU2219166C2 (ru) * | 1998-04-30 | 2003-12-20 | Мерк Патент Гмбх | Производные бифенила, способ их получения, фармацевтическая композиция, способ ее получения, лекарственное средство |
| JP2004250442A (ja) * | 2003-01-31 | 2004-09-09 | Mitsubishi Pharma Corp | エンドセリン血中濃度低下剤 |
| US20070099826A1 (en) * | 2003-10-10 | 2007-05-03 | Norman Wong | Treatment of diseases associated with the egr-1 enhancer element |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| А.О. ПОНКРАТОВА и др. "Сравнительный фитохимический анализ образцов надземной части Empetrum nigrum L., собранных в различных регионах РФ, как перспективного источника фармакологически активных вторичных метаболитов" // Методы анализа лекарственных средств, 27.12.2021, с.138-145. * |
| Понкратова Анастасия Олеговна. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук: "Фитохимическое изучение побегов водяники черной (EMPETRUM NIGRUM L.)", Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург, 2022, текст диссертация размещен на сайте СПХФУ 05.02.2022. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gonzales et al. | Ultra (high)-pressure liquid chromatography–electrospray ionization-time-of-flight-ion mobility-high definition mass spectrometry for the rapid identification and structural characterization of flavonoid glycosides from cauliflower waste | |
| Demeyer et al. | Molecular diversity and body distribution of saponins in the sea star Asterias rubens by mass spectrometry | |
| AU2020202064B2 (en) | Novel compound contained in manuka honey and use of same | |
| Schepetkin et al. | Immunomodulatory activity of oenothein B isolated from Epilobium angustifolium | |
| Bachvaroff et al. | Characterization and quantification of karlotoxins by liquid chromatography–mass spectrometry | |
| Pérez et al. | Phytotoxic steroidal saponins from Agave offoyana leaves | |
| SaraJliJa et al. | Preparation of flaxseed for lignan determination by gas chromatography-mass spectrometry method | |
| Wu et al. | Simultaneous analysis of isomers of escin saponins in human plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry: Application to a pharmacokinetic study after oral administration | |
| Khatuntseva et al. | Triterpenoid saponins from the roots of Acanthophyllum gypsophiloides Regel | |
| Stead et al. | Eryloside F, a novel penasterol disaccharide possessing potent thrombin receptor antagonist activity | |
| Dimitrova et al. | New iridoids from Verbascum nobile and their effect on lectin-induced T cell activation and proliferation | |
| Draisci et al. | Isolation of a new okadaic acid analogue from phytoplankton implicated in diarrhetic shellfish poisoning | |
| Sherman et al. | neo-Inositol in mammalian tissues. Identification, measurement, and enzymic synthesis from mannose 6-phosphate | |
| Khattab et al. | Extraction, identification and biological activities of saponins in sea cucumber Pearsonothuria graeffei | |
| RU2806331C1 (ru) | Применение 1-(3,5-дигидрокси-4-метоксифенил)-2-(3-гидроксифенил)-этана в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью | |
| Pandey et al. | POLYENE ANTIBIOTICS. V. CHARACTERIZATION OF COMPONENTS OF THE FILIPIN COMPLEX BY MASS SPECTROMETRY1 | |
| Han et al. | Flavanone glycosides from Viscum coloratum and their inhibitory effects on osteoclast formation | |
| RU2808460C1 (ru) | Применение 2,3,4-триметокси-5-гидрокси-9,10-дигидрофенантрена в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью | |
| RU2811240C1 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ 4-O-α-АРАБИНОФУРАНОЗИЛЭЛЛАГОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| RU2812630C1 (ru) | Применение 5,7-дигидрокси-6,8-диметилфлаванона в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью | |
| TWI820099B (zh) | 新穎皂素佐劑及其評估方法 | |
| Lee et al. | Anti-complementary ginsenosides isolated from processed ginseng | |
| Matsukawa et al. | A novel bufadienolide, marinosin, in the skin of the giant toad, Bufo marinus | |
| Uhlig et al. | Bioassay-guided fractionation of extracts from Easter lily (Lilium longiflorum) flowers reveals unprecedented structural variability of steroidal glycoalkaloids | |
| Popov et al. | Metabolite profiling of polar steroid constituents in the Far Eastern starfish Aphelasterias japonica using LC–ESI MS/MS |