KR20200135621A - 퀘르세틴-3-ｏ-글루쿠로니드를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재 - Google Patents

퀘르세틴-3-ｏ-글루쿠로니드를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재 Download PDF

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Abstract

본 발명은 연잎으로부터 추출물로부터 하기 화학식 구조를 가지며, 분자량이 478.4인 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 획득하고, 이 획득된 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재에 관한 것이다.
[화학식]
Figure pat00014

Description

퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재{Obesity prevention and treatment materials with Quercetin-3-O-glucuronide as a valid ingredient}
본 발명은 비만 예방 및 치료을 위한 소재에 관한 것이다.
상세하게는 연잎으로부터 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Q3G)를 획득하고 이를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료을 위한 소재에 관한 것이다.
현대인은 식생활의 변화, 유전적인 이유 및 스트레스에 의한 비정상적인 섭생에 의하여 비만 환자가 증가하고 있으며, 이러한 비만 환자의 증가는 사회적인 문제로 대두되어 있는 실정이다.
이러한 비만을 치료하기 위한 방법으로는 식이요법, 운동요법, 다이어트요법, 약물요법 및 수술요법 등 다양한 방법이 제안되고 있다.
비만 치료 및 개선을 위한 다양한 조성물에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 연구결과 물로 다양한 비만 치료 및 개선을 위한 조성물에 관한 특허문헌 및 논문 등이 제시되어 있다.
특허문헌인 (KR) 등록특허 제0573590호에서는 길경(Platycodi radix) 추출물, 귤피(Citrus unshiu Markovich) 추출물, 백모근(Imperatae rhizoma) 추출물 및 맥문동(Liriopsis tuber) 추출물의 혼합물을 함유하는 비만억제 및 치료용 약제의 기술이 제공되어 있으며, (KR) 등록특허 제0645385호에서는 멜리사엽 추출물, 인진쑥 추출물, 뽕나무잎 추출물을 유효성분으로 하는 비만 억제용 조성물에 관한기술이 제공되어 있다.
특허문헌인 (KR) 공개특허 제2016-0101732호에서는 포도잎 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘르세틴-3-O-글루쿠로니드를 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 기술이 제공되어 있으며, (KR) 공개특허 제2010-0001907호에서는 메밀 등 식물체 내에 존재하는 파이토케미칼(phytochemical) 중 하나인 루틴(rutin)을 아스퍼질러스나이거(Aspergillus niger) 유래의 람노시데이즈(rhamnosidase, EC 32140) 효소로 생물전환시 생기는 쿼세틴 배당체 (isoquercitrin, quercetin-3-glucoside)에 관한 것으로, quercetin-3-glucoside의 높은 항암활성에 관한 기술이 제공되어 있다.
또한, 일반적으로 퀘르세틴-3-O-글루쿠로니(Q3G)는 유방압 세포의 침입을 억제하는 기능을 가지는 것으로 연구되어 알려져 있다.
(KR) 등록특허 10-0573590 (KR) 등록특허 10-0645385 (KR) 공개특허 10-2016-0101732 (KR) 공개특허 10-2010-0001907
본 발명은 비만 예방 및 치료에 효과가 있는 조성물을 제공하고자 한다.
출원인은 비만 예방 및 치료에 효과가 있는 소재에 관한 연구를 지속적으로 한 결과, 본 발명과 같이 항암능력을 가지는 퀘르세틴-3-O-글루쿠로니(Q3G)를 가지는 식물을 찾고, 이 식물로부터 획득되는 퀘르세틴-3-O-글루쿠로니(Q3G)를 이용하여 비만을 예방하고 치료할 수 있음을 확보하고자 한다.
즉, 연잎이 가지는 효능에 대하여 잘 알려져 있지 않아 그 활용성이 크게 낮은 단점이 있으나, 출원인은 연잎의 성분 중 비만에 효능이 있는 유효성분을 찾아내 연잎의 활용성을 높이고, 이 연잎으로부터 획득되는 비만에 효능이 있는 유효성분인 퀘르세틴-3-O-글루쿠로니(Q3G)를 이용하여 비만을 예방하고 치료할 수 있도록 하고자 한다.
이러한 본 발명의 목적은, 연잎의 추출물로부터 하기 화학식 구조를 가지며, 분자량이 478.4인 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 획득하고, 이 획득된 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재로 해결될 수 있다.
[화학식]
Figure pat00001
상기 추출물은 건조된 연잎을 열수를 이용한 열수추출법 또는 70% 주정을 이용하는 주정추출법을 사용하여 획득한다.
상기 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드는, 70%주정을 이용하여 연잎 추출물을 획득하는 70%주정추출과정과, 상기 과정에서 획득한 연잎 추출물을 농축 및 동결건조를 통하여 연잎 추출분말을 획득하는 70%주정추출분말과정과, 상기 과정에서 획득한 연잎 추출분말을 물(Water)에 용해 후 n-헥산(Hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate), n-부탄올(Butanol)을 순차적으로 분획물을 획득하는 용매분획과정과, 상기 과정에서 획득한 분획물을 VLC(vacuum liquid chromatography)와 RPLC(reverse phase liquid chromatography)을 실시하여 성분 분리 및 정제를 하는 분리정제과정을 거쳐 연잎으로부터 획득됨을 특징으로 한다.
식물에서 획득되는 추출물로부터 하기 화학식 구조를 가지며, 분자량이 478.4인 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 획득하고, 이 획득된 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재로 해결될 수 있다.
[화학식]
Figure pat00002
이와 같이 이루어진 본 발명인 연잎으로부터 획득되어지는 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재에 의하여 연잎은 가치를 인정받을 수 있으며, 이로 인하여 활용성을 크게 높일 수 있어, 농가 소득 및 사업 소득에 크게 이바지할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명인 연잎으로부터 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide)을 획득하는 과정을 보인 모식도.
도 2는 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 분리성분의 고성능 액체 크로미터 그래피(HPLC(high-performance liquid chormatograph)) 결과표.
도 3은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide)의 화학식 구조식.
도 4은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 체중변화, 식이섭취량, 식이효율측정을 나타낸 것으로, 도 4a는 체중의 변화, 도 4b는 식이섭취량, 도 4c는 식이효율측정 결과표이다.
도 5는 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 글루코스 경구부하시험 결과표이다.
도 6은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모모델동물의 지방조직 중량측정결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 간, 신장, 비장조직 중량이며, 도 6b는 피하 지방조직 증량, 부고환 복부 지방조직 중량, 신장 지방조직중량, 내장지방 중량에 대한 결과표이다.(###p<0.001 vs. Nr; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 7은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모모델동물의 혈청 중 지질 생화학적 분석표로써, (a)는 LDL cholesterol, (b)는 Triglycerol, (c)는 Total cholesterol, (d)는 HDL cholesterol, (e)는 NEFA, (f)는 Glucose, (g)는 Creatinine, (h)는 AST & ALT이다.(###p<0.001 vs. Nr; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 8은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모모델동물의 혈청 아디포카인 분석표로써, (a)는 Adiponectin, (b)는 Leptin, (c)는 IGF-1이다.(###p<0.001 vs. Nr; **p<0.01 and ***p<0.001 vs. HFD-CTL)
도 9는 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 간 조직에서 지방합성 및 지방산화에 관한 바이오마커 측정 결과로써, (a)는 FAS, (b)는 SCD-1, (c)는 Leptin, (d)는 UCP2, (e)는 SREBP1c/ADD1, (f)는 PPARγ, (g)는 ACOX1, (h)는 DGAT1, (i)는 Adiponectin, (j)는 PPARα이다.(###p<0.001, ##p<0.01 and #p<0.05 vs. C57bl/6j-Nr; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 vs. HFD-CTL)
도 10은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 복부 부고환 지방 조직에서 지방합성 및 지방산화에 관한 바이오마커 측정 결과로써, (a)는 FAS, (b)는 ACS1, (c)는 Leptin, (d)는 CPT1b, (e)는 UCP-2, (f)는 ACOX1 (g)는 Adiponectin, (h)는 PPARα이다.
도 11은 본 발명인 Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide) 소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 피하지방 조직에 지방산화에 바이오마커 측정 결과이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 될 것이며, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 연잎으로부터 추출되어 획득되는 비만에 효능이 있는 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Q3G)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료을 위한 소재에 관한 것이다.
연잎으로부터 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Q3G) 성분을 아래와 같은 과정을 통하여 획득한다.
건조상태의 연잎을 열수를 이용한 열수추출법 또는 70% 주정을 이용한 주정추출법으로 추출한 후 농축 및 동결건조과정을 통해 분말화한다.
분말된 연잎 추출분말을 물(Water)에 용해 후 n-헥산(hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate) 및 n-부탄올(Butanol)을 사용하여 분획물을 얻는다.
아세트산에틸(Ethyl acetate) 분획물을 VLC(vacuum liquid chromatography)와 RPLC(reverse phase liquid chromatography)을 실시하여 성분 분리 및 정제한다.
실시 예
도 1에 보인바와 같이.
연잎 250g을 70%-주정으로 추출한 후 농축 및 동결건조하여 약 50g의 연잎 70% 주정추출분말을 획득함(수율 약 20%).
상기 획득된 연잎 70% 주정추출분말 50g을 물(Water)에 용해 후 n-헥산(hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate) 및 n-부탄올(Butanol)을 사용하여 분획물을 얻음.
아세트산에틸(Ethyl acetate) 분획물을 VLC(vacuum liquid chromatography)와 RPLC(reverse phase liquid chromatography)을 실시하여 성분 분리 및 정제를 실시함.
이중 유의적으로 많은 함량을 가진 부분(fraction) 5개(EVF7-R-1, EVF7-R-6, EVF7-R-9, EVF7-R-12, EVF7-R-15)를 시료로 하고 이에 대하여 1차로 효능평가를 실시하였으며, 아래 실험에서와 같이 일부(fraction)인 시료(EVF7-R-6)에서 가장 우수한 효능을 확인함.
실험방법
가. 시료화
상기에서 실시 예에 기재한 바와 같이 연잎 70% 주정추출분말을 단계적인 분획과정을 거쳐서 얻어진 5개 시료(EVF7-R-1, EVF7-R-6, EVF7-R-9, EVF7-R-12, EVF7-R-15)를 제조함.
나. 항비만 활성평가(Oil red O staining)을 이용한 지방축적 조사
㉮ 분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정하고자 각각의 시료(100μg/ml)를 처리하여 24-well에서 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% 포르말린(formalin) 용액 500 μL를 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였음.
㉯ 그 후 동량의 포르말린(formalin) 용액으로 분화된 3T3-L1 세포 1시간 이상 실온에서 방치하여 세포를 고정시킨 뒤, 포르말린(formalin)을 제거하고 60% 아이소프로판올(iopropanol) 용액 500 μL로 세척하여 세포를 완전히 건조함.
완전히 건조된 세포들은 미리 제조해 둔 ORO working solution(Oil red O:DDW=6:4)으로 세포 내 축적된 지방성분들을 충분히 염색 한 뒤, 증류수를 이용하여 세포를 3~4회 세척하고 완전히 건조한 뒤 세포 내 축적된 지방 성분과 결합한 Oil red O는 100% 이소프로판올(iopropanol)을 이용하여 모두 용출시키고 용출된 Oil red O staining 용액을 490 nm에서 흡광도를 측정함.
[표 1]
Figure pat00003
상기 [표 1]에서 시료인 심플(sample) 7.8μM 처리는 연잎추출물에 함유되어 있는 조성비를 환산하여 처리한 량임.
다. 연잎의 비만개선효과를 가진 유효성분 확인
이에 가장 우수한 효능을 보인 시료(fraction) VF7-R-6에 대하여 TLC, HPLC로 성분분리 유무 및 순도확인과 LC/MS로 분자량을 측정하고, 최종 NMR을 측정 후 얻어진 데이터을 참고문헌[(1) Phytochemical Constituents of Nelumbo nucifera., Ki-Hyun Kim et al., 2009, Natural Product Sciences, 15(2):pp.90-95. (2) Flavonoids analysis of four Vicia species of Narbonensis complex in two different vegetative phases., ELISABETTA CAMPEOL et al., 2003, CARYOLOGIA, 56(3):pp.365-371, (3) Flavono
Figure pat00004
from Euphorbia guyoniana Boissier & Reuter., Ouanissa Smara et al.., 2014, Journal of Life Sciences, 8(6):pp.544-551]과 비교검토하여 본 발명에서 연잎(Nelumbo nucifera Leaves) 70% 주정추출물로부터 분리한 단일성분이 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Q3G)(Quercetin-3-O-glucuronide)임이 확인되었다.
[분리성분의 HPLC Chromatograph 결과]
Figure pat00005
[분리성분 및 Quercetin-3-O-glucuronide의 구조]
Figure pat00006
[분리성분 및 Quercetin-3-O-glucuronide의 NMR Data]
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
라. 연잎의 비만개선효과 확인
연잎으로 추출되는 추출물이 비만개선에 대한 효과를 아래와 같이 동물실험을 통하여 비만개선효과를 확인함.
1. 동물실험을 통한 연구방법
1) 비만모델 동물실험설계
본 실험을 위하여 사용된 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스는 2주간 실험실 환경(실온 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간 light-dark cycle)에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
정상식이 군을 제외한 모든 군은 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 고지방식이(HFD; 60% kcal fat; Research Diet, Inc., No. D12492)를 공급하여 2주간 비만 유도를 하였다.
실험동물은 무작위로 C57BL/6J 정상군, 60% HFD 대조군, 양성대조군 (가르시니아 캄보지아, GK_245mg/kg), Quercetin-3-O-glucuronide(Q3G_10mg/kg)투여군으로 설정하고, 8주간 투여를 병행하였다.
군당 10마리씩 분리하여 사육하였으며, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실험을 진행하였다.
2) 실험물질 제조 및 조제
시험군은 양성대조군 (가르시니아 캄보지아, GK_245mg/kg), Quercetin-3-O-glucuronide(Q3G_10mg/kg) 용량으로 각각 생리식염수에 녹여서 0.2ml 용량으로 투여하였으며, 약물투여는 경구투여용 금속제 존대(Zonde)를 이용하여 위내로 강제 경구투여 하였다.
3) 체중증가 억제 효능 검증
● 체중변화 : 매주 수요일 09:00 측정/기록
● 총 체중 증가량 : Final body wt - initial body wt
● 1일 평균 체중 증가량 : Total body wt gain / days
● 식이섭취량(food intake) : 1일 평균 식이 섭취량, Total food intake / days
● 식이효율(food efficiency ratio, FER) : [Total wt gain / Total food intake] x 100
4) C57BL/6J 비만 모델 동물의 글루코스 경구부하시험(oral glucose tolerance test, OGTT)
소재를 8주간 투여 후 부검 1일전에 마우스를 12시간 절식시킨 후 혈당을 측정하고 곧 바로 포도당(1g/kg)을 복강투여(i.p) 한 후 0, 15, 30, 45, 60 및 75분에 혈당을 측정하였다.
혈당 측정에 사용할 혈액은 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 혈청분석기(Accutrend plus GCTL Cobas Roche, Germany)로 측정하였다.
5) C57BL/6J 비만 모델 동물의 지방조직 중량 측정
소재를 8주간 투여 후 각 실험동물을 피하 지방조직 중량(abdominal subcutaneous fat), 부고환주변 복부 지방조직 중량(epididymal adipose tissue), 신장주변 지방조직 중량(kidney adipose tissue), 내장지방 중량(intestine adipose tissue) 및 간, 신장, 비장 조직의 중량으로 구분하여 적출 후 지방조직의 중량을 산출하였다.
6) C57BL/6J 비만 모델 동물의 혈청 생화학적 분석
소재를 8주간 투여 후 혈액생화학적 검사를 실시하기 위해 심장천자법으로 채혈한 뒤 원심분리(3,000rpm, 4℃, 15min)를 하여 분리한 혈장을 -74℃에서 보관하였다. 간 기능의 지표인 ALT 및 AST를, 혈장 및 간의 지질함량의 지표인 총콜레스테롤(total cholesterol), HDL(High-density lipoprotein), LDL(Low-density lipoprotein), 중성지방(triglyceride), FFA, 혈당, γ-GPT, LDH의 함량을 생화학자동 분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
7) C57BL/6J 비만 모델 동물의 혈청 아디포카인 분석
소재를 8주간 투여 후 각 실험동물로부터 분리한 혈중 아디포넥틴, 렙틴, IGF-1을 분석하였다.
이를 위하여, 각 항체를 코팅 완충용액에 희석하여 마이크로웰에 코팅한 후 4℃에서 밤새 방치하였으며, 각 웰을 3회 세척 완충용액으로 세척한 후, 혈청(10배 희석)을 100㎕씩 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 세척 완충용액으로 세척하였다. 이후, 항체 아비딘-HRP 접합체 100㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
TMB 기질을 100㎕씩 분주하여 암소에서 30분간 방치한 후 50㎕의 스톱 용액을 처리하고, ELISA 판독기로 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
8) C57BL/6J 비만 모델 동물의 유전자 발현 분석
소재를 8주간 투여 후 각 실험동물로부터 적출한 간과 지방조직들의 유전자 발현 양상을 real-time PCR 증폭법을 사용하여 알아보았다.
부고환주변 복부지방량(epididymal adipose tissue) 및 간 (liver)등 조직은 RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR Green PCR kit (AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 하였다.
지방조직에 RNAzolB 500㎕를 넣고, homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 클로로포름(chloroform)(CHCl3) 50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000rpm에서 원심 분리한 후 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다.
이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하고, 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화 시킨 후, first strand cDNA합성에 사용하였다.
역전사(reverse transcription)반응은 준비된 total RNA 3㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5㎕ 10mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides (25pmole/ 25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor (20U/㎕), 1㎕ 100 mM DTT, 4.5㎕ 5×buffer(250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT (200U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다.
이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후, 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.
Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다.
유전자 발현은 TaqMan probe(FAM dye-labeled, ABi, USA)를, internal standard를 Mouse GAPDH probe set; Endogenous Control(VIC/MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems(4352339E)를 사용하였고, 프라이머(primer)의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다.
Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation 2분(min) at 50℃, 10 min 94℃, 그리고 40 cycles을 0.15분(min) at 95℃, 1분(min) at 45℃에서 수행하였다.
실험군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR로 계산하여 RQ(relative quantitative)을 측정하였다.
Figure pat00010
[표 2] Mouse Probe & Oligonucleotide의 염기배열
Figure pat00011
2. 연구결과
1) C57BL/6J 비만 모델 동물의 체중 변화, 식이효율 측정
Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide)소재의 C57BL/6J 비만 모델 동물의 체중변화, 식이섭취량, 식이효율측정을 측정하였다.
가) Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide)를 포함한 각 군의 체중변화 및 식이 섭취량 및 식이효율 측정하여 도 4와 같은 결과를 얻었다. 체중의 Initial body weight에는 그룹별로 유의한 차이를 나타내지 않았으나 final body weight에는 그룹별 유의한 차이를 나타내었으며, 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 체중이 유의하게 증가되어 고지방식이로 인한 비만이 유도되었음을 알 수 있었다.
나) Q3G(Quercetin-3-O-glucuronide)(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군은 가르시니아 캄보지니아 양성대조군(HFD+GK_245 mg/kg)에 비해 높은 체중감소율을 지닌 것을 확인하였다.
도 4a는 체중의 변화, 도 4b는 식이섭취량, 도 4c는 식이효율측정 결과이다.
2) C57BL/6J 비만 모델 동물의 글루코스 경구부하시험 (oral glucose tolerance test , OGTT)
가) Q3G의 투여가 고지방 식이에 의해 유도된 혈당 상승에 미치는 영향을 알아보기 위해 포도당을 경구투여한 후 시간별로 당 부하 검사를 실시하여 측정한 결과 도 5와 같은 결과를 얻었다.
나) 고지방 식이를 급여한 마우스는 정상식이군에 비해 유의적으로 높은 혈당수치를 나타내었으며, 이때 고지방식이에 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 고지방식이에 의한 혈당 상승을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
3) C57BL/6J 비만 모델 동물의 지방조직 중량측정
가) Q3G 소재와 양성대조군, 음성대조군의 투여로 인한 간, 신장, 비장 그리고 피하 지방, 부고환 복부 조직, 신장 지방 조직, 내장지방조직의 무게를 측정하여 도 6과 같은 결과를 얻었다. 신장과 비장의 중량은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았지만, 간에서는Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 고지방식이군에 비해 중량의 유의적인 감소를 확인하였다.
나) 또한, 신장 지방조직은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 피하 지방조직과 부고환 복부 지방조직 및 내장지방 조직은 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 군을 투여했을 때, 가르시니아 양성대조군(HFD-GK_245 mg/kg) 투여군 보다 내부 장기에 지방이 축적되는 것을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
4) C57BL/6J 비만 모델 동물의 혈청생화학적 분석
가) Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 소재와 대조군에 대한 혈중 지질 농도 및 간 독성, 신장 기능을 분석하여 도 7과 같은 결과를 얻었다. 혈중 지질 농도를 분석하기 위해 LDL-C, HDL-C, TC, TG, NEFA, Glucose를 측정하였고, 간 독성 및 신장 기능을 조사하기 위해 AST와 ALT, Creatinine 을 측정하였다.
나)　혈중 total cholesterol(TC)은 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 고지방식이군(HFD-CTL)에 비해 유의적인 혈중 농도 저하를 나타낸 것으로 확인되었다. 또한 혈중 Triglycerol(TG), 비에스터화지방산(NEFA), Glucose를 측정한 결과, 고지방식이군이 정상식이군에 비해 유의적으로 수치가 증가하는 것을 확인하였다.
다) 혈액의 TG 수치는 고지방식이군에 비해 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없었으며, NEFA, Glucose 수치는 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 유의적인 혈중 농도 억제를 확인하였다. 또한 혈중 Creatinine, AST 및 ALT를 측정한 결과, Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여로 인한 유의적인 억제 효과를 확인하여, 8주간의 경구투여가 간 및 신장 독성에 영향을 미치지 않는다는 것이 나타났다.
5) C57BL/6J 고지방 식이 비만 (DIO) 유발 생쥐의 혈청 아디포카인 분석
가) Q3G과 대조군에 대하여 혈청 Adiponectin, Leptin, IGF-1을 분석하여 도 8과 같은 결과를 얻었다.
나) 지방 세포에서 분비되어 인슐린 저항성을 개선시키는 데 중요한 단백질, adiponectin은 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 HFD-CTL군과 비교하여 그 수치가 유의적으로 증가하는 것이 확인되었으며, 지방 세포로부터 분비되는 체내 에너지 항상성 유지 호르몬인 leptin과 인슐린과 구조가 유사한 세포증식인자 Insulin-like growth factor-1(IGF-1)은 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 유의적으로 감소하는 것이 확인되었다.
6) C57BL/6J 비만 모델 동물의 유전자 발현 분석
가) Q3G 소재와 대조군의 간, 복부 부고환지방, 피하지방에서 지방합성 및 지방산화에 관한 바이오마커를 측정하여 도 9와 도 10과 같은 결과를 얻었다.
나) 간 조직에서 지방합성과 관련하여 FAS, SCD-1, Leptin, SREBP1c/ADD1, PPARγ, DGAT1, 지방산화와 관련하여 UCP2, ACOX1, PPARα, Adiponectin의 mRNA level을 측정하였다. FAS, SCD-1, Leptin, SREBP1c/ADD1, PPARγ, DGAT1와 같은 지방세포의 분화 및 지방합성에 관여하는 유전자의 mRNA 발현 정도는 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 HFD-CTL군에 비해 감소한 결과를 얻었으며, 반대로 UCP2, ACOX1, PPARα, Adiponectin의 mRNA 발현 정도는 증가한 결과를 얻었다.
다) 복부 부고환지방 조직에서는 지방합성과 관련하여 FAS, Leptin, 지방산화와 관련하여 ACS1, CPT1b, UCP-2, ACOX1, Adiponectin ,PPARα의 mRNA level을 측정하였다. FAS, Leptin 유전자의 mRNA 발현 정도는 Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 HFD-CTL군에 비해 감소한 결과를 얻었으며, 반대로 ACS1, CPT1b, UCP-2, ACOX1, Adiponectin ,PPARα의 mRNA 발현 정도는 증가한 결과를 얻었다.
라) 피하 지방 조직에서는 지방산화와 관련하여 UCP1 mRNA level을 측정하였으며, 도 11과 같은 결과를 얻었다. Q3G(HFD+Q3G_10 mg/kg) 투여군에서 HFD-CTL군에 비해 유의적으로 증가하는 것으로 분석되었다.

Claims (4)

  1. 연잎의 추출물로부터 하기 화학식 구조를 가지며, 분자량이 478.4인 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 획득하고, 이 획득된 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재.
    [화학식]
    Figure pat00012
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 건조된 연잎을 열수를 이용한 열수추출법 또는 70% 주정을 이용한 주정추출법을 사용하여 획득함을 특징으로 하는 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드는,
    70%주정을 이용하여 연잎 추출물을 획득하는 70%주정추출과정과,
    상기 과정에서 획득한 연잎 추출물을 농축 및 동결건조를 통하여 연잎 추출분말을 획득하는 70%주정추출분말과정과,
    상기 과정에서 획득한 연잎 추출분말을 물(Water)에 용해 후 n-헥산(Hexane), 아세트산에틸(Ethyl acetate), n-부탄올(Butanol)을 순차적으로 분획물을 획득하는 용매분획과정과,
    상기 과정에서 획득한 분획물을 VLC(vacuum liquid chromatography)와 RPLC(reverse phase liquid chromatography)을 실시하여 성분 분리 및 정제를 하는 분리정제과정을 거쳐 연잎으로부터 획득됨을 특징으로 하는 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재.
  4. 식물에서 획득되는 천연 추출물로부터 하기 화학식 구조를 가지며, 분자량이 478.4인 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 획득하고, 이 획득된 퀘르세틴-3-Ｏ-글루쿠로니드(Quercetin-3-O-glucuronide)를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재.
    [화학식]
    Figure pat00013
KR1020190060577A 2019-05-23 2019-05-23 퀘르세틴-3-ｏ-글루쿠로니드를 유효성분으로 하는 비만 예방 및 치료소재 KR20200135621A (ko)

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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100573590B1 (ko) 2004-02-02 2006-04-24 주식회사 유유 비만치료ㆍ억제용 생약 조성물
KR100645385B1 (ko) 2005-10-05 2006-11-23 주식회사 안지오랩 비만 억제용 조성물
KR20100001907A (ko) 2008-06-27 2010-01-06 재단법인서울대학교산학협력재단 아스퍼질러스 나이거 유래의 람노시데이즈를 이용한루틴에서 쿼세틴 -3- 글루코사이드를 제조하는 방법
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