KR20200135598A - 손발톱 무좀 예방 및 개선제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손발톱 무좀 예방 및 개선제에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 천연 식물 오일과 추출물을 주성분으로 하여 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 갖는 손발톱 무좀 예방 및 개선제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 손발톱 무좀 예방 또는 개선제는 천연 오일을 주성분으로 하고 독성이나 피부자극 등의 부작용이 적을 뿐만 아니라 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 나타내므로 손발톱 무좀의 예방 및 개선을 위한 화장품 또는 제약 조성물로서 바람직하게 사용될 수 있다.

Description

손발톱 무좀 예방 및 개선제{Preparation for preventing and curing dermatophytosis of nail}

본 발명은 손발톱 무좀 예방 및 개선제에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 천연 식물 오일과 추출물을 주성분으로 하여 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 갖는 손발톱 무좀 예방 및 개선제에 관한 것이다.

현대 사회의 과도한 스트레스로 인한 호르몬의 이상과 급작스런 외부 환경의 변화로 인하여 피부의 방어 기제를 넘어서는 대기 오염 물질이나 자외선 등의 영향으로 각질층의 각질이 정상적인 주기로 떨어져 나가지 못하거나 혹은 떨어져 나가는 주기의 불균형으로 인하여 피부 톤이 일정치 않게 되어 피부가 거칠고, 칙칙해 보이게 된다.

피부의 노화는 자유라디칼(free-radical)에 의한 세포내 물질의 산화적 손상이 원인이 된다. 즉, 하이드록시 라디칼, 슈퍼옥사이드 라디칼 등의 활성 산소와 같은 높은 반응성의 자유라디칼은 세포막을 구성하는 지방 성분을 산화시켜 세포막을 파괴하고, 이 결과로 단백질을 산화시키며 핵산의 기능을 정지시켜 결국 생체내 성분을 파괴하고 세포사멸을 일으킨다. 이와 같은 피부노화의 원인으로는 과다한 자외선 노출, 피부세포의 영양 결핍 및 화장품의 부작용 등을 들 수 있다.

피부의 노화는 생체내의 산화적 손상을 억제함으로써 예방하거나 줄일 수 있다. 한편, 항산화 화장료는 지방 성분의 산화를 포함한 피부의 산화적 손상을 억제하여 피부의 노화를 예방, 또는 지연시키는 작용을 한다.

특히, 기능성 화장품 중에서 한 제품에 두 가지 이상의 기능성을 갖는 복합기능성 화장품(예로서, 주름개선 기능과 미백 기능을 동시에 포함)에 대한 생산액 및 시장 성장률이 단일기능성 화장품에 비해 월등히 높게 나타나고 있다.

따라서 환경 친화적이고 자연지향적인 추세에 따라 화장품에 사용되는 유효성분들도 화학물질뿐만 아니라 식물 유래의 천연물이 그 유용성을 기반으로 하여, 피부에 부작용이 적은 천연 재료가 여러 가지 형태로 화장품에 배합되어 이용되고 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1117564호(2012.02.10.)에는, 과량의 소금 및/또는 설탕; 수상 성분; 음이온, 양쪽성 및 비이온 계면활성제; 및 폴리올을 포함하는 화장료 조성물로서, 상기 소금은 화장료 조성물 내에서 과포화 용해된 후 과포화 용해된 소금이 재결정화된 입자 상태로 존재하는 것이고, 수상 성분은 정제수이고, 음이온 계면활성제는 암모늄라우레스셀페이트이고, 양쪽성 계면활성제는 코카아미도프로필베타인이고, 비이온 계면 활성제는 코카마이드디이에이이고, 폴리올은 글리세린인 화장료 조성물이 개시되어 있다.

상기 등록특허는 재결정화된 소금 및/또는 설탕 입자들에 의한 각질 제거, 피부 유연감, 혈행 촉진 효과 및 제형의 안전성을 얻을 수 있고, 소금 및/또는 설탕의 포화 용액 내에 용해된 상태로 잔류하는 소금 및/또는 설탕이 보습 기능을 나타내며, 음이온, 양쪽성 및 비이온 계면활성제를 함유함으로써 피부 세정 효과와 헹굼성이 우수하고, 또한 젤 형태로 사용 편리성이 우수하나, 과량의 소금을 함유함에 따라 소금 특유의 살균작용으로 인한 정상세포의 기능저하 및 그로 인해 콜라겐이 파괴되어 피부노화를 지나치게 유발하는 문제점이 있다.

따라서 종래기술의 한계점을 극복하고, 부작용이 적으며, 피부 건강에 핵심적인 요소인 항균, 항산화 및 항염효과가 모두 우수하여 피부의 상태를 개선시킬 수 있는 천연물 소재의 제품 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1117564호(2012.02.10.) 대한민국 등록특허 제10-1114399호(2012.02.02.)

본 발명자는 천연물을 대상으로 하여 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 갖는 손발톱 무좀 예방 및 개선용 제제를 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 후술하는 바와 같은 천연 식물성 오일과 추출물을 포함하는 조성물이 피부 보호는 물론이고, 항산화 및 항균 작용을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연 식물성 오일 및 추출물을 포함하는 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 갖는 손발톱 무좀 예방 및 개선용 제제를 제공하는 것에 있다.

위와 같은 본 발명의 목적은 사차인치 오일 15~35 중량%, 유칼립투스 오일 15~35 중량%, 티트리 오일 15 ~ 35 중량%, 프로폴리스 추출액 15~35 중량% 및 제주 조릿대 추출액 1 ~ 10 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 손발톱 무좀 예방 또는 개선제는 천연 식물성 오일을 주성분으로 하고 독성이나 피부 자극 등의 부작용이 적을 뿐만 아니라 피부보호, 항산화 및 항균 작용을 동시에 나타내므로 손발톱 무좀의 예방 및 개선을 위한 화장품 또는 제약 조성물로서 바람직하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명 실시예 조성물의 DPPH 유리 라디칼 소거능을 나타내는 그라프도이다.
도 2는 본 발명 실시예 조성물의 히드록시 라디칼 소거능을 나타내는 그라프도이다.
도 3은 본 발명 실시예의 조성물의 Fe²⁺ 킬레이팅 에세이 분석 결과를 나타내는 그라프도이다.
도 4는 본 발명 실시예 조성물의 아질산 소거능 분석 결과를 나타내는 그라프도이다(pH 1.2).

본 발명은, 일면에 있어서, 사차인치 오일 15~35 중량%, 유칼립투스 오일 15~35 중량%, 티트리 오일 15 ~ 35 중량%, 프로폴리스 추출액 15~35 중량% 및 제주 조릿대 추출액 1 ~ 10 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 손발톱 무좀 예방 및 개선제에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 조성물에 있어서 주요 성분중 하나인 사차인치 오일(Sacha Inchi oil)은 아프리칸 월넛(Plukenetia volubilis)의 씨를 압착해 얻은 오일로, 잉카오일, 잉카인치 오일, 사카 잉키오일, 사차인치 오일 등의 다양한 별명으로 불리고 있다. 사차인치 오일은 오메가3(48%), 오메가6(36%), 오메가9(9%)를 함유하고, 요오드와 비타민 A, E를 풍부하게 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 사차인치오일에 함유된 오메가 3와 비타민 E는 피부 재생 효과에 탁월한 효능을 가지고 있는 것으로 알려 있다.

상기 유칼립투스 오일은 유칼립투스 나무(Eucalyptus)의 잎에서 정유를 추출한 무색의 유동액으로 숙성시 노란색을 띠며 캠퍼향과 달콤한 나무향을 낸다. 유칼립투스 오일은 산소운반을 도와 피부 호흡을 증가시키고 머리를 맑게 하고 각종 염증에 탁월한 효과가 있다고 알려져 있다.

티트리(Tea Tree) 오일은 호주에서 자생하던 수종으로 미르타시아(Myrtaceae)속에 속하는 식물로서, 잎속에 입자상의 물질이 함유되어 있고 잎을 분쇄하면 입자상의 물질로부터 티트리오일이 얻어진다. 티트리오일은 알파-피넨 2.5%, 알파-터피넨 9.1%, 파라-시멘 3.9%, 1.8-시네오올 4.3%, 감마-터피넨 24.6%, 알파-터피네올 2.3%, 터피넨-4-올 42.1%, 터피놀렌 4.1% 및 잔량의 미량성분들로 구성되어 있는 것으로, 향균성의 효과 뿐만아니라 소염, 진통 및 상처치료 효과가 있으며, 이의 효과는 인삼과 마찬가지로 그 작용기전이 명확히 밝혀지지 않았다.

프로폴리스(propolis)는 꿀벌이 여러 가지 수목이나 꽃에서 수지를 모아 뒷다리에 붙여 돌아오면 벌통 속의 다른 꿀벌이 그것을 받아 씹게 될 때 꿀벌의 타액 내 효소로 인해 생성되는 자연 물질로서, 꿀벌이 외부로부터 자기를 보호하기 위한 목적 또는 살균의 목적에서 생산된다고 알려져 왔다. 프로폴리스는 꿀벌이 수지를 채집해 오는 수목의 종류에 따라서 약간의 차이는 있으나 안정된 구조를 가지고 있고, 벌꿀과 마찬가지로 인체에 대한 부작용 및 독성은 없으며, 특유의 발삼(balsam)향을 가지고 있어서 방향제 및 구강청정제 등으로 널리 사용되고 있다.

제주 조릿대(Sasa quelpaertensis)는 잎은 긴 타원상 피침형으로 가지 끝에 2∼3개씩 달린다. 높이는 1 내지 2m 가량 자란다. 땅속에서 뿌리줄기가 뻗어 새로운 개체가 발생하는 영양번식과 씨앗을 통해 번식하는 종자번식을 함께 한다. 꽃은 5∼6년마다 한 번씩 핀다고 알려져 있으나 일정하지 않고, 꽃이 피고 나면 지상부는 죽는다. 조릿대는 나무의 성질과 풀의 성질을 모두 가지고 있다. 나무처럼 단단한 목질을 지녀 나무와 유사하지만, 첫 해에 성장이 멈추고 더 이상 줄기가 두꺼워지지 않는 것은 여러해살이 풀에 가깝다. 음지에서도 잘 자라고 추위에 강하며, 수분이 적당하고 비옥한 토양을 좋아한다. 공해와 염해를 견디는 능력이 다소 있지만 건조에는 약하다. 본 발명의 제주조릿대는 제주조릿대의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 수피, 가지, 꽃, 뿌리, 열매, 줄기 등)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 전초 또는 뿌리를 사용할 수 있다.

상기 사차인치 오일, 유칼립투스 오일 및 티트리 오일을 포함하는 식물성 오일은 잎이나 과실 또는 열매를 통상적인 압착법이나 정류법에 의해 추출하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 종자나 잎 또는 과육을 잘 선별한 후 세척 및 건조시킨 다음 70 ~ 150℃에서 압착한 다음 착유된 오일을 여과 및 집유 과정을 통해 수집할 수 있다.

별법으로, 식물 원료에 1:2 내지 1:20 중량 비율로 추출용매를 가하여 환류냉각장치(reflux condenser)에 넣고 2~3 시간 동안 가열 증류시킨 후 냉각시킨 후, 냉각시킨 추출물을 5~7시간 동안 여과하여 추출물을 개별적으로 제조할 수 있다. 별법으로, 원액 오일을 상업적으로 구입하여 이용하여도 좋다.

상기 프로폴리스는 프로폴리스 원괴로부터 통상의 추출법을 이용하여 프로폴리스 추출물을 수득하거나, 또는 상업적으로 판매되는 것을 사용할 수 있다(예, 프로비프로폴리스TM, 서울프로폴리스(주)대경, 또는 PANINKRET사 제품).

상기 제주 조릿대는 세척하여 건조하여 세절하는 등의 전처리 후 원료 중량의 5배 내지 10 배의 추출용매를 더하여 고압멸균솥에 넣고 65 ~ 125℃의 온도에서 2 내지 6시간, 바람직하게는 5시간 동안 가열시켜　추출하여 여과하고 농축하여 얻을 수도 있다

여기서 추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

본 발명은 천연 식물들로부터 피부보호, 항산화작용 및 항균 특성의 다기능성을 갖는 성분들과 이들의 최적의 조합비를 찾아낸 것에 주된 특징이 있는 것으로서, 상기 사차인치 오일, 유칼립투스 오일, 티트리 오일 및 프로폴리스 추출액은 피부보호 작용, 항산화 작용, 및 항균 작용을 나타내는 주요 성분들이고, 조릿대 추출물은 방부제로서 기능한다.

상기 본 발명에 따른 조성물의 조성비는 각각의 성분이 갖는 유효 용량과 부작용 등을 고려하여 설정한 것이며, 그 비율의 범위를 벗어나는 경우에는 효과가 떨어질 우려가 있다.

본 발명에서 목적하는 효과를 상기한 천연 식물 추출물을 최적의 비율로 배합함으로써 각종 미생물의 생육을 저지하고 세포보호 및 항산화 효과를 극대화시킬 수 있다.

상기 사차인치 오일, 유칼립투스 오일, 티트리 오일 및 프로폴리스 추출액의 사용량이 15중량% 미만인 경우에는 항균 작용 효과가 미약하고, 35 중량%를 초과할 경우에는 전체적인 조성과 균형을 이루지 못하여 비경제적이고, 첨가량에 따른 상승 효과가 없어 경제성이 문제가 된다. 조릿대 추출물은 1 ~ 10 중량%로 포함됨으로써 전체적인 조성물의 안정적인 조화와 다양한 기능성을 최적으로 발휘할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 화학 합성제가 아닌 천연 물질의 추출물을 포함하고 있으므로 후술하는 실시예 및 시험예의 결과로부터 잘 알 수 있는 바와 같이 피부에 대한 자극성이나 독성이 없어서 안정성이 우수하며, 피부보호 등에 탁월한 효과를 갖고 있을 뿐만 아니라 무좀균을 포함한 세균에 대한 항균성, 아토피염 피부염 치유, 유아의 진물 치료, 피부에 대한 보호 효과가 있어서 피부촉감 개선 등의 기능성이 있으므로 이러한 기능성을 요하는 화장품이나 치료제로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 유효 성분으로서 상기 조성물 및 화장품 또는 제약학상 허용되는 첨가제 또는 담체를 포함하는 무좀 개선용 조성물을 제공한다.

상기 화장품의 제형은 화장품 제조 분야에서 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 첨가제로서는 비타민 E 아세테이트(항산화제), 폴리소르베이트(20)(분산제), 벤질알코올(방부제), 티몰(thymol)(안정화제)을 상기 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.5 ~ 10 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 화장품의 부형제로서는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 방부제 또는 식물성 방부제, 정제수, 보습제, 벌크화제, 크림제, 계면활성제, pH 조정제, 향료 등을 적량 혼합하여 원하는 제형의 형태에 따라 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 현탁액, 에멀젼, 에어로졸 등의 외용제의 형태로 제형화하여 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 그 제제형태, 투여방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10㎍～200 ㎎/㎏이다. 그러나, 당업자는 특정 시약의 약물동력학적인 특성 및 그의 투여 모드 및 경로; 수여자의 나이, 건강, 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과 등의 공지의 요인에 따라서 투여량이 변화함은 이해할 것이다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기술한 것으로서 발명의 내용 및 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 식물 정유의 제조

믹서로 곱게 마쇄된 티트리잎 1 Kg을 5배수의 추출용매(정제수 및 30% 주정)를 가하여 환류냉각장치(reflux condenser)에 넣고 2~3 시간 동안 가열 증류시킨 후 냉각시키고, 냉각시킨 추출물을 6시간 동안 여과(Toyo No. 2)하여 추출물을 얻었다. 티트리의 추출 수율은 18.6%이고, 굴절당도계로 측정한 brix는 2.32%이었다. 이어서, 여액을 60℃의 온도에서 -0.08 MPA의 감압하에서 3~8시간 동안 농축하여 티트리 오일을 얻었다. 고형분의 brix는 각각 35.6(정제수) 및 37.8(주정)로 측정되었다.

마찬가지로 유칼립투스 잎을 처리하여 유칼리투스 오일을 얻었다. 고형분의 brix는 각각 42.3(정제수) 및 45.6(주정)로 측정되었다.

실시예 2: 사차인치 오일의 제조

사차인치 열매 1 Kg을 상태가 양호한 것으로 선별한 후 정제수로 세척하고 이를 자연 건조시켰다. 이어서, 압착기를 사용하여 85℃에서 압착하여 오일을 얻고 이를 여과하여 사차인차 오일을 얻었다.

실시예 3: 제주조릿대 추출물의 제조

제주 조릿대 1 Kg를 깨끗이 세척하여 건조하여 세절한 다음 원료 중량의 5배의 정제수 및 30% 주정을 더하여 고압멸균솥에 넣고 65 ~ 125℃의 온도에서 2 내지 6시간 동안 가열시켜 추출하여 여과하고 농축하여 추출물을 얻었다. 제주조릿대 추출물의 고형분의 brix는 각각 55.2(정제수) 및 56.8(주정)로 측정되었다.

실시예 4~8: 천연 추출물을 포함하는 조성물의 제조

상시 실시예 1 내지 3에서 얻어진 각 성분들을 다음의 표 1에 나타낸 배합비로 배합하고 무좀 예방용 조성물을 제조하였다. 플로폴리스 추출액은 시중에서 구입하여 사용하였다. 각 식물 오일 및 추출물은 정제수 추출물과 주정 추출물을 1:1 중량비로 혼합하여 사용하였다.

성분함량(g)	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8	비교예
사차인치 오일	15	30	25	20	35	70
유칼립투스 오일	25	15	30	35	15	30
티트리 오일	24	35	15	22	20	-
프로폴리스 추출액	35	17	25	15	20	-
조릿대 추출액	1	3	5	8	10	-
합계	100	100	100	100	100	100

시험예 1: 천연물 추출 조성물의 항산화 효과 분석

1-1) DPPH 라디칼 소거능 분석

시험관 내 항산화능 분석은 517nm에서 최대 흡광도를 보이는 자유 라디칼인 DPPH와 실시예 4~8의 조성물을 반응시켜 노란색이 되면서 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. DPPH 유리 라디칼 소거능은 96-웰 마이크로플레이트 중의 메탄올에 녹인 실시예의 조성물과 에탄올에 녹인 DPPH 0.1 mM을 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 결정하였다. 추출물들을 DPPH 용액 0.6 mL과 혼합한 후 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 반응 혼합물의 흡광도를 517 nm에서 측정하였다. 라디칼 소거능의 억제 백분율은 에탄올 처리군 또는 아스코르브산(100㎍)-처리군과 비교하여 결정하였다. DPPH 유리 라디칼 소거 능의 백분율은 다음의 식으로 계산하였다.

(%) = (Abs_{control without sample}-Abs_sample)/Abs_{control without sample} Х 100

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 본 발명 실시예 조성물의 DPPH 유리 라디칼 소거능을 나타내는 그라프도이다. Con, 음성 대조군으로서 메탄올(vehicle) 처리군; AA, 양성대조군으로서 아스코르브산(1 mg/ml) 처리군; 시료 100㎍ 시료 처리군(이하, 시험예에서 동일함). 양성대조군 ascorbic acid(AA)은 1 mg/ml 농도에서 자유라디칼을 98.36% 억제시켰다. 시료 처리군은 각각 96.23%(실시예 4), 96.35%(실시예 5), 97.36%(실시예 6), 97.45%(실시예 7), 96.37%(실시예 8), 47.35%(비교예) 억제시켰다(도 1).

1-2) Hydroxyl 라디칼 소거능 분석

Hydroxyl 라디칼 소거능 분석은 Fenton's reagent에 의해 발생되는 Hydroxyl 라디칼과 실시예의 조성물을 반응시켜 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다.

실시예의 조성물을 100 μM EDTA, 1 mM H₂O₂, 및 2.8 mM 데옥시리보오스를 함유하는 반응혼합물에 첨가하였다. 부피는 20 mM pH 7.4 인산염 완충액으로 보충하여1 mL가 되게 한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다.

이어서 혼합물을 수조에서 95℃까지 15 분동안 가열하고, 각각의 2.8%TCA 및 0.5% TBA 1 mL을 첨가하였다. 냉각 후 4800 rpm으로 15 분 동안 원심분리 시켰다. 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다. 비교분석을 위해 음성대조군은 vehicle(phosphate buffer)을 처리하였고 양성대조군은 ascorbic acid를 처리하여 Hydroxyl 라디칼 소거능을 분석하였다.

도 2는 본 발명 실시예 조성물의 히드록시 라디칼 소거능을 나타내는 그라프도이다. 양성대조군 ascorbic acid(AA)은 1 mg/ml 농도에서 자유라디칼을 51.69% 억제시켰다. 시료 처리군은 각각 46.23%(실시예 4), 45.25%(실시예 5), 45.57%(실시예 6), 45.21%(실시예 7), 46.24%(실시예 8), 23.50%(비교예) 억제시켰다(도 2).

1-3) 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석

실시예의 조성물들을 Folin-Denis 시약 100 μL과 혼합한 후, 실온(RT, 22-24℃에서 3 분 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물을 10 % 탄산 나트륨 100 ㎕로 중화시키고, 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 마이크로플레이트 판독기로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 폴리페놀 함량을 표준으로서 갈릭산을 사용하여 계산하였다.

그 결과를 표 2에 나타내었다. 각 조성물의 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량은 비교예의 것에 상당히 현저히 높았다.

성분	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8	비교예
폴리페놀 (mg/g)	58.45	59.23	57.32	58.63	56.65	25.45
플라보노이드 (mg/g)	9.35	9.65	9.25	9.25	9.25	2.15

1-4) Reducing power 효능 분석

Reducing power 효능 분석은 FeCl₃에 의한 산화적 반응 유도과정에 각 실시예의 조성물을 반응시켜 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하고 ascorbic acid의 효능과 비교분석하여 항산화 효과를 분석하였다.

실시예의 각 조성물들을 200 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.6) 0.5 mL, 및 1 % 포타슘 페리시아나이드 0.5 mL과 혼합한 후 혼합물을 50 ℃에서 20 분동안 인큐베이션시키고, 이어서 10 % TCA 0.5 mL을 첨가하였다. 이를 650 g로 10 분 동안 원심분리시키고, 상층액 1 mL을 동일 부피의 증류수 및 0.1% 페릭 클로라이드 0.2 mL과 혼합하였다. 동일한 처리를 표준 아스코르브산 용액에 대하여 수행하고 흡광도를 700 nm에서 측정하였다. 환원력을 계산하고 아스코르브산 기준으로 나타내었다.

그 결과를 표 3에 나타내었다. 각 조성물의 Reducing power 효능은 비교예의 것에 상당히 현저히 높았다.

	실시예4	실시예5	실시예6	실시예7	실시예8	비교예
환원력(ascorbic acid equivalent/g)	28.67	29.36	27.63	28.68	27.55	13.32

1-5) Fe ²⁺ chelating 활성 분석

Fe²⁺ chelating 활성 분석은 Fe²⁺-ferrozine complex에 의한 산화적 반응 유도과정에 실시예의 조성물을 반응시켜 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다.

바로 준비한 500 μM FeSO₄ 150 ㎕을 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) 170 μL, Tris-HCl 완충액 220 μL 및 각 실시예의 조성물을 혼합한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시고, 0.25 % 1,10-phenanthroline (w/v) 10 μL을 첨가하였다. 흡광도를 510 nm에서 측정하였다. Fe²⁺ 킬레이팅 능력은 대조군에 대하여 다음의 식으로 계산하였다.

Fe²⁺ chelating ability (%) = (Abs_{control without sample}-Abs_sample)/Abs_{control without sample} Х 100.

비교분석을 위해 음성대조군은 vehicle (Tris-HCl buffer)을 처리하였고 양성대조군은 ascorbic acid를 처리하여 Fe²⁺ chelating 활성을 분석하였다.

도 3은 본 발명 실시예의 조성물의 Fe²⁺ 킬레이팅 에세이 분석 결과를 나타내는 그라프도이다. 양성대조군 ascorbic acid(AA)은 1 mg/ml 농도에서 Fe²⁺-ferrozine complex에 의한 산화적 반응을 39.08% 억제시켰다. 각 실시예의 조성물은 100㎕에서 Fe²⁺-ferrozine complex에 의한 산화적 반응을 48.25 ~ 56.65%로 억제시킨 반면, 비교예의 것은 18.50% 억제시켰다.

1-6) 아질산염 소거능 분석

아질산염 소거능 분석은 아질산염과 실시예의 조성물을 반응시켜 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 비교분석을 위해 음성대조군은 vehicle (PBS)을 처리하였고 양성대조군은 ascorbic acid를 처리하여 아질산염 소거능을 분석하였다.

각 시료를 0.1 N HCl 용액(pH 1.2)으로 처리한 후 1 mM NaNO₂ 용액을 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 2% 아세트산 및 Griess 시약을 첨가한 후 실온에서 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 혼합물의 흡광도를 520 nm에서 측정하였다.

도 4는 본 발명 실시예 조성물의 아질산 소거능 분석 결과를 나타내는 그라프도이다(pH 1.2). 아질산염 억제(%) = [1 - (Abs_sample/Abs_{control without sample})] x 100. 콘트롤, 음성 대조군으로서 PBS (vehicle) 처리군; AA, 양성 대조군으로서 ascorbic acid (1 mg/ml) 처리군;100 ㎍, 시료군으로서 조성물 100㎍.

양성대조군 ascorbic acid(AA)은 1 mg/ml 농도에서 아질산염을 pH 1.2 조건에서 91.05% 억제시켰다. 각 실시예의 조성물은 아질산염을 pH 1.2의 조건에서 61.32%(실시예 4) 내지 63.36(실시예 7) 억제시키고, 비교예의 것은 20.51%억제시켰다.

시험예 2: 항균 활성 시험

실시예 4 ~ 8에 따른 조성물의 미생물에 대한 방부력 및 살균력에 대하여 disc paper test를 실시하여 시험하였다.

시험균주를 petri dish 에 분주하여 유리막대를 사용하여 배지 전체에 넓게 도말한 후 직경 5㎜의 paper disc를 그 위에 올려 놓았다. 그리고 각 실시예의 조성물 30㎕를 paper disc 위에 넣었다. 30℃에서 하룻밤 배양한 후 Inhibition zone을 확인하여 항균성을 알아보았다. 그 결과를 다음의 표 4에 나타냈다.

시험 균주	Inhibition zone(d) : ㎝
	Ex4	Ex5	Ex6	Ex7	Ex8	Comp. Ex.
Staphylococcus aureus ATCC 10537	2.8	2.8	2.8	2.9	2.9	1.0
Staphylococcus aureus ATCC 256E	2.9	2.8	2.7	2.9	2.88	1.5
Salmonella typhimurium KCTC 1925	2.8	2.9	2.8	2.9	2.7	1.8
Candida albicans ATCC 10231	2.6	2.8	2.8	2.8	2.8	2.0

위의 시험결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명에 따른 조성물은 정도의 차이가 있으나 무좀균 등의 세균에 대한 우수한 항균작용을 가지므로 이를 요하는 용도의 화장용 제품이나 무좀 치료제로 사용할 수 있다.

시험예 3: 곰팡이의 생육저해활성 측정

곰팡이균, 트리코피톤 루브럼(Trichophyton rubrum , KCTC 6345), 마이코스포럼 오더위니(Micosporum audouinii, KCTC 6346), 트리코피톤 페러기네움(Trichophyton ferrugineum, KCTC6351), 에피더모피톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum, KCTC 6586), 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes, KCTC 6077) 5종을 대상으로 생육 저해 활성에 대하여 시험하였다. 곰팡이 생육저해활성은 여지확산법(Paper disc diffusion method)으로 검정하였다. 각 균주를 사보라우드 한천(Sabouraud's agar) 배지에 접종한 후 각 조성물(실시예 4~8, 처리농도 100 ㎍)을 직접 paper disc에 처리하였다. 여지를 각 균이 접종된 상기 배지에 올려놓고 28℃에서 5일간 호기배양 한 후, 여지 주위에 형성된 생육저해환(clear zone)의 크기를 보고 항균 활성을 체크하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

시험 균주	Inhibition zone(d) : ㎝
	Ex4	Ex5	Ex6	Ex7	Ex8	Comp. Ex.
Trichophyton rubrum	3.1	3.3	3.5	3.5	3.3	0.5
Micosporum audouinii	3.3	3.3	3.4	3.4	3.2	0.5
Trichophyton ferrugineum	2.8	3.3	3.4	3.22	3.22	0.8
Epidermophyton floccosum	2.7	3.4	3.2	3.3	2.9	1.0
Trichophyton mentagrophytes	3.11	3.4	3.2	3.4	3.1	0.8

실시예의 조성물에 의한 생육저해환의 크기는 2.7 cm 이상으로 나타났으며, 뛰어난 곰팡이 생육저해활성을 가지는 것으로 나타났다. 이러한 항균활성은 나머지 진균들에서도 비슷한 양상을 보였다.

시험예 4: 피부자극시험

본 발명의 실시예에 따른 각 조성물의 실험동물에 대한 자극성 정도를 알아보고자 피부자극 실험을 수행하였다. 실험동물로는 체중 2.3-2.7 kg의 3-4개월령의 뉴질랜드 white rabbit 8 마리를 사용하였다. 먼저, 실험 동물들을 입수후 1주일간 동물실에서 순화시키고 순화기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 사용하였다. 토끼는 시험물질 적용 24시간 전에 제모를 실시하여 처치 구획 및 대조 구획으로 구분한 다음 시험동물 한 마리당 시험물질 0.5 ml씩 투여부위에 1회 도포하고, 무처치 대조구획에는 멸균 생리 식염수를 동량 도포하였다. 부착 후 고형 재질의 박지로 덮고 테이프를 사용하여 고정한 후 일정시간 적용시켰다. 적용시간 종료후에는 생리식염수를 이용해 도포부를 가볍게 세정해 주었다. 시험물질 투여후 일주일간 매일 외관, 사료 및 음수 소비 상태와 임상증상 등에 대하여 관찰하고, 적용후 7일째에 국소마취제(리도카인, 광명약품)를 귀정맥을 통해 주입하여 안락사시킨 후 부검하여 이상유무를 육안으로 관찰하였다.

피부반응의 평가는 "의약품 등의 독성시험기준"을 이용하여 24 시간과 72 시간에 대하여 판정하였다. 또한 피부에 대한 자극성의 정도 판정은 일반적으로 많이 이용되는 Draize의 P.I.I.(Primary Irritation Index)의 산출방법에 따랐다. 시험결과 시험물질 도포부위의 홍반과 가피형성 및 부종 등의 자극성은 인정되지 않았으며, Draize의 P.I.I에 의한 피부1차 자극율은 "0"으로 평가되었다.

시험예 5: 급성 독성 시험

실시예의 조성물에 대하여 급성 독성 실험을 수행하고 그 독성유무를 관찰하였다. 실험용동물은 4, 5주령의 체중 105의 수컷과 95의 암컷의 SD계 래트 60 마리를 사용하였고 각 실시예의 조성물과 음성대조군으로서 증류수를 사용하여 시험하였다. 먼저, 상기 래트들을 온도 22℃, 상대습도 53% 및 형광등 조명(09:00 점등-18:00 소등)의 명암사이클, 150-300 Lux의 조도 조건을 갖춘 실험실 사육 상자에서 약 1 주일 정도의 기간에 걸쳐 순화시킨 다음, 건강한 동물들만을 선택하여 평균 체중이 일치하도록 각 군으로 나누고 일일 1회 20ml/kg의 양으로 14일 동안 강제 경구투여한 다음, 일반상태의 변화, 중독증상, 운동성, 외관, 자율신경, 체중변화 및 사망동물의 유무에 관하여 점검하였다.

실험 결과에 의하면, 실험기간 동안 체중에 있어서 5% 이내의 변화를 보였으나 유의성은 없었고, 시료의 양을 시험동물에 투여가능한 최대량인 kg당 20ml의 최고 농도를 선정하였음에도 사망동물이 관찰되지 않아 개략의 치사량 산출은 불가하였으므로 LD₅₀은 20ml/kg B.W. 이상인 것으로 나타났고, 특이한 일반증상이나 부검시 특이한 병변이 관찰되지 않았으므로 이를 종합적으로 판단해보면 상기 조성물은 독성이 없는 것으로 판명되었다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부한 도면에 의해 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환, 변형 및 변환이 가능하다는 것을 본 발명이 속하는 기술 분야에서, 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

Claims (4)

1. 사차인치 오일 15~35 중량%, 유칼립투스 오일 15~35 중량%, 티트리 오일 15 ~ 35 중량%, 프로폴리스 추출액 15~35 중량% 및 제주 조릿대 추출액 1 ~ 10 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 사차인치 오일, 유칼립투스 오일 및 티트리 오일을 포함하는 식물성 오일은 잎이나 과실 또는 열매를 식물을 압착하여 얻거나 또는 원료에 1:2 내지 1:20 중량 비율로 추출용매를 가하여 환류냉각장치에 넣고 2~3 시간 동안 가열 증류시킨 후 냉각시킨 후, 냉각시킨 추출물을 5~7시간 동안 여과하여 추출물을 개별적으로 제조된 것이고,
   상기 프로폴리스 및 제주 조릿대는 깨끗이 세척하여 건조하여 세절한 다음 원료 중량의 5배 내지 10 배의 추출용매를 더하여 고압멸균솥에 넣고 65 ~ 125℃의 온도에서 2 내지 6시간, 바람직하게는 5시간 동안 가열시켜　추출하여 여과하고 농축하여 얻은 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출용매는 정제수, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 항산화 작용, 항균작용 또는 피보 보호작용을 갖는 것을 특징으로 하는 손발톱 무좀 예방 또는 개선용 외용제 조성물.

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