KR20200135042A - 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 동적 요소를 분석함으로써 개체의 미세순환 장애를 위한 정보를 제공하는 방법 및 개체의 미세순환 장애 진단 장치에 관한 것으로, 상기 방법 및 장치를 이용하면 모세혈관 내부에서의 중성구의 움직임에 대한 정보를 쉽고 편하게 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 보다 정확하고 빠르게 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법 및 장치{Method and apparatus for providing information for diagnosing microcirculation disorders}
본 명세서에는 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 동적 요소를 분석함으로써 개체의 미세순환 장애를 위한 정보를 제공하는 방법 및 개체의 미세순환 장애 진단 장치가 개시된다.
패혈증(sepsis)은 입원 중 발생하는 사망의 가장 큰 부분을 차지하는 것으로(Torio CM, Moore BJ. National Inpatient Hospital Costs: The Most Expensive Conditions by Payer, 2013: Statistical Brief #204. Healthcare Cost and Utilization Project (HCUP) Statistical Briefs, Rockville (MD), 2016; Hall MJ, Levant S, DeFrances CJ. Trends in inpatient hospital deaths: National Hospital Discharge Survey, 2000-2010. NCHS Data Brief 2013(118): 1-8.), 병원균 침입에 대한 숙주의 난독반응(dysregulated response)로 특징지어지는 증후군이며, 생명을 위협하는 여러 가지 장기 기능 부전(dysfunction)을 이끄는 혈류역학적 변화를 수반한다(Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, Shankar-Hari M, Annane D, Bauer M, Bellomo R, Bernard GR, Chiche JD, Coopersmith CM, Hotchkiss RS, Levy MM, Marshall JC, Martin GS, Opal SM, Rubenfeld GD, van der Poll T, Vincent JL, Angus DC. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 2016: 315(8): 801-810; Angus DC, van der Poll T. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 2013: 369(9): 840-851). 패혈증에 의해 손상되는 장기 중 폐가 가장 먼저, 또한 가장 자주 손상되며, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI) 여부는 패혈증 환자의 사망 가능성을 예측하는 가장 중요한 인자이다(Lagu T, Rothberg MB, Shieh MS, Pekow PS, Steingrub JS, Lindenauer PK. Hospitalizations, costs, and outcomes of severe sepsis in the United States 2003 to 2007. Crit Care Med 2012: 40(3): 754-761.). 패혈증으로 인한 급성 폐 손상 치료를 목적으로 하는 집중적인 연구 노력에도 불구하고, 미세순환에 목적을 둔 효과적인 치료법은 없는 실정이다(Thompson BT, Chambers RC, Liu KD. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med 2017: 377(6): 562-572). 사강(dead space)을 측정하는 것이 급성 폐 손상에 있어 유의미한 임상적 데이터를 제공할 수 있다는 것이 알려져 있으나(Nuckton TJ, Alonso JA, Kallet RH, Daniel BM, Pittet JF, Eisner MD, Matthay MA. Pulmonary dead-space fraction as a risk factor for death in the acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med 2002: 346(17): 1281-1286), 현재까지는 폐 골격의 손상 측면에서 혈액에서 산소 공급은 일어나지만(ventilate) 관류(perfuse)되지는 않는 가설에 머물러 있을 뿐이다. 특히, 급성 호흡 곤란 증후군은 폐 손상과 미세순환 사이의 관련성에 대해 명확히 규명되지 않은 증후군이다(Ryan D, Frohlich S, McLoughlin P. Pulmonary vascular dysfunction in ARDS. Ann Intensive Care 2014: 4: 28). 최근, 한 연구에서 체외(ex vivo) 연구로 제한되었던 폐혈관 내 혈전의 증거가 보고되었으나, 중성구 유입의 생체 내(in vivo) 과정과 이에 따른 폐 미세순환의 교란 요인은 아직 연구된 바 없다(Matthay MA, Ware LB, Zimmerman GA. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest 2012: 122(8): 2731-2740; Yuan Y, Alwis I, Wu MCL, Kaplan Z, Ashworth K, Bark D, Jr., Pham A, McFadyen J, Schoenwaelder SM, Josefsson EC, Kile BT, Jackson SP. Neutrophil macroaggregates promote widespread pulmonary thrombosis after gut ischemia. Sci Transl Med 2017: 9(409)).
중성구의 조절되지 않는 모집(recruitment) 및 활성화는 사이토카인과 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 포함하는 염증 매개체의 방출을 통해 조직 손상을 유도할 수 있다(Grommes J, Soehnlein O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med 2011: 17(3-4): 293-307; Matute-Bello G, Downey G, Moore BB, Groshong SD, Matthay MA, Slutsky AS, Kuebler WM, Acute Lung Injury in Animals Study G. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol 2011: 44(5): 725-738). 그러나, 폐 마이크로순환에서 중성구 자체의 구체적인 동적 요소에 대한 종래 연구 결과는 대부분은 전신 순환을 관찰하여 얻은 추측에 제한된다(Phillipson M, Kubes P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med 2011: 17(11): 1381-1390). 중성구의 직경은 폐 모세혈관의 직경보다 크기 때문에, 중성구는 모세혈관을 통과하기 위해 변형되어야 하며, 이는 상대적으로 오랜 시간이 걸리는 과정이다(Doerschuk CM. Mechanisms of leukocyte sequestration in inflamed lungs. Microcirculation 2001: 8(2): 71-88). 중성구 격리(neutrophil sequestration)이라 불리는 이 과정은 원래 폐 내에서 자유롭게 순환하는 중성구 그룹보다는 세포에 대한 것으로 설명되었으며, 어느 정도 육안으로 볼 수 있는 방사선 모델링 영상 장치를 사용하여 관찰된 바 있다(MacNee W, Selby C. New perspectives on basic mechanisms in lung disease; Neutrophil traffic in the lungs: role of haemodynamics, cell adhesion, and deformability. Thorax 1993: 48(1): 79-88). 실제로, 이전의 연구는 폐 모세혈관에서 중성구 격리를 입증하였지만, 중성구 격리가 급성 폐 손상, 또는 급성 호흡 곤란 증후군으로 이어지는 과정에 대한 메커니즘은 알려진 바 없다(Kuebler WM, Borges J, Sckell A, Kuhnle GE, Bergh K, Messmer K, Goetz AE. Role of L-selectin in leukocyte sequestration in lung capillaries in a rabbit model of endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med 2000: 161(1): 36-43; Lien DC, Henson PM, Capen RL, Henson JE, Hanson WL, Wagner WW, Jr., Worthen GS. Neutrophil kinetics in the pulmonary microcirculation during acute inflammation. Lab Invest 1991: 65(2): 145-159). 따라서, 급성 폐 손상 또는 급성 호흡 곤란 증후군에서 폐 미세순환의 중요성 및 모호성을 고려할 때, 병리생리학을 규명하기 위해서는 중성구의 동적 요소를 포함한 폐 미세순환의 변화를 이해하는 것이 필수적이며, 이는 패혈증으로 인한 급성 폐 손상 또는 급성 호흡 곤란 증후군에 대한 새로운 치료 전략으로 이어질 수 있다(Looney MR, Bhattacharya J. Live imaging of the lung. Annu Rev Physiol 2014: 76: 431-445).
이에, 본 발명자들은 폐 손상으로 인한 폐 미세순환을 연구하기 위해, 마이크로 석션(micro-suction)을 기반으로 한 폐 이미징 윈도우와 결합하여 맞춤 설계된 비디오-속력 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하였다(Kim P, Puoris'haag M, Cote D, Lin CP, Yun SH. In vivo confocal and multiphoton microendoscopy. J Biomed Opt 2008: 13(1): 010501; Han S, Lee SJ, Kim KE, Lee HS, Oh N, Park I, Ko E, Oh SJ, Lee YS, Kim D, Lee S, Lee DH, Lee KH, Chae SY, Lee JH, Kim SJ, Kim HC, Kim S, Kim SH, Kim C, Nakaoka Y, He Y, Augustin HG, Hu J, Song PH, Kim YI, Kim P, Kim I, Koh GY. Amelioration of sepsis by TIE2 activation-induced vascular protection. Sci Transl Med 2016: 8(335): 335ra355). 또한, 생체 내 폐 이미징 시스템을 사용하여 패혈증으로 유도된 급성 폐 손상(ALI) 모델에서의 미세순환 관류의 변화를 직접 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 또는 트랙 굴곡 지수의 동적 요소를 분석함으로써 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 미세순환 장애 진단 장치를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법으로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계; 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 단계; 및 상기 동적 요소 분석 결과로부터 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 추출하는 단계;를 포함하는, 정보 제공 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 미세순환 장애 진단 장치로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및 상기 촬영부에서 촬영된 복수의 이동 이미지에 기반하여 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 분석부;를 포함하는, 미세순환 장애 진단 장치를 제공한다.
본 발명은, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 또는 트랙 굴곡 지수의 동적 요소를 분석함으로써 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 미세순환 장애 진단 장치에 관한 것으로, 상기 방법 및 장치를 이용하면, 모세혈관 내부에서의 중성구의 움직임에 대한 정보를 쉽고 편하게 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 보다 정확하고 빠르게 진단할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 LysMGFP /+ 마우스 모델의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 본 발명의 일 실시예에 따른 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도로서, 도 1에서 초록색(LysMGFP/+)은 중성구를, 붉은색(TMR Dextran)은 폐의 모세혈관을 나타내며, 도 1의 스케일 바는 10 μm 이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS)에서의 중성구 움직임을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도이다. 도 2에서 붉은색(LysMGFP /+)은 중성구를, 초록색(FITC Dextran)은 폐의 모세혈관을 나타내며, 확대도(Magnified spot)에서 Averaged imaging은 최대 30개 프레임의 평균 이미징을 나타내고, 점선으로 된 화살표는 흐름의 방향을, 흰색 화살표는 갇혀있는 중성구를, 노란색 화살표는 흐름이 없는 모세혈관을 나타낸다. 도 2의 Wide field의 스케일 바는 100 μm, 확대도(magnified spot)의 스케일 바는 20 μm 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS) 간의 단위면적(512 X 512 μm)(field)당 중성구의 수를 비교한 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델, LPS 6h 마우스 모델)과 대조군 모델(PBS) 각각의 폐 미세순환을 느린 속력으로 30분 동안 촬영한 저속력 이미징(time lapse imaging) 결과와 30분 동안 추적된 중성구(Ly6G+ 세포)의 움직임(트랙, track)을 나타낸 도이다. 도 4a의 스케일 바는 100 μm 이다. 도 4a에서 붉은색(LysMGFP /+)은 중성구를, 초록색(FITC Dextran)은 폐의 모세혈관을 나타낸다.
도 4b는 상기 도 4a에서 중성구(Ly6G+ 세포)의 트랙을 중첩시킨 도로서, 중성구의 각 트랙은 중심에서부터 그려진(plot) XY 변위를 보여주며, 스케일 바는 10 μm 이다.
도 5는 상기 도 4a 및 4b에 나타난 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델, LPS 6h 마우스 모델)과 대조군 모델(PBS) 각각의 시간(sequestration time) 별 트랙의 수를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6e는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델, LPS 6h 마우스 모델)과 대조군 모델(PBS)에서의 중성구의 동적 요소인, 격리 시간(sequestration time)(도 6a), 변위(track displacement length)(도 6b), 이동 거리(track length)(도 6c), 이동 속력(track velocity)(도 6d) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)(도 6e)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델의 중성구(Ly6G+ 세포)의 폐 미세순환을 실시간으로 촬영한 도이다. 도 7에서 점선 화살표는 혈액 흐름을 나타내고, 노란색 화살표는 그 전에 이미 격리된 중성구를 나타내며, 흰색 화살촉은 새로 나타난 중성구가 모세혈관의 순환을 방해하여 모세혈관 내에서 사강이 형성된 것을 나타낸다. 또한, 도 7에서 점선은 모세혈관에서 형성된 사강을 나타내고, 도 7의 스케일 바는 20 μm 이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델의 중성구(Ly6G+ 세포)의 폐 미세순환을 실시간으로 촬영한 도이다. 도 8에서 붉은색(Ly6G+)은 중성구를, 초록색(FITC Dextran)은 폐의 모세혈관을 나타내며, 도 8a는 모세혈관 내부의 혈전 형성에 대한 생체 내 이미징을(스케일 바는 20 μm), 도 8b는 동맥 내 혈전 형성의 생체 내 이미징을(스케일 바는 100 μm), 도 8c는 도 8b의 파란색 점선 사각형의 확대도이다(스케일 바는 20 μm).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템을 구현하여 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델의 모세혈관에 연결된 동맥의 분기 영역(branching region)에서 중성구(Ly6G+ 세포)에 의해 클러스터(cluster)가 형성되는 과정을 느린 속력으로 10 분 동안 촬영하여 생체 내 이미징을 수행하여 얻은 저속력 이미지(time-lapse imaging)이다. 도 9에서 경과 시간은 MM:SS(분:초)로 표시되며, 스케일 바는 20 μm 이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예인 DiD-라벨링된 적혈구를 갖는 ALI 마우스 모델의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 느린 속력으로 10 분 동안 촬영하여 이미징 처리 방법으로 처리한 도, 및 본 발명의 일 실시예에 따른 중성구의 트랙 도출 방법으로 얻은 DiD-라벨링된 적혈구의 트랙 경로(track path)이다. 도 10에서 흰색 점선으로 된 원은 미세순환에서의 사강을 나타내고, 흰색 화살표는 혈액 흐름의 방향을 나타내고, 도 10의 스케일 바는 100 μm 이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS) 각각의 중성구에서 활성 산소 생성 여부를 DHE 염색을 통해 확인한 도이다. 도 11에서, 초록색(FITC Dextran)은 폐의 모세혈관을, 붉은색(Ly6G)은 중성구를, 푸른색(DHE)은 활성 산소(ROS)를 나타내며, 스케일 바는 50 μm이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS) 각각의 단위면적(512 X 512 μm)당 활성 산소를 생성하는 중성구(ROS+ Ly6G+)의 수를 비교한 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예인 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS) 각각의 전체 중성구(Ly6G+) 중 활성 산소를 생성하는 중성구(ROS+ Ly6G+)의 비율을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법으로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계; 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 단계; 및 상기 동적 요소 분석 결과로부터 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 추출하는 단계;를 포함하는, 정보 제공 방법을 제공한다. 종래 전신 미세순환 장애와 관련된 중심 메커니즘으로 내피 기능 이상(endothelial dysfunction)과 혈관 수축(vasoconstriction)이 제안되었으며, 폐 모세혈관에서의 격리(sequestration)이 혈액 순환에서 병원균을 검출하기 위한 면역 감시 시스템으로 기능을 할 뿐이라고 알려져 있었으나, 이것만으로는 중성구의 격리가 미세순환 장애, 특히 급성 호흡 곤란 증후군과 같은 폐 미세순환 장애로 어떻게 진행되는지는 설명할 수 없었다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 패혈증으로 인해 유발된 급성 폐 손상의 초기 단계에서 모집된 중성구(recruited neutrophil)의 군집(cluster) 형성이 폐 미세순환 장애에 중요한 역할을 하며, 구체적으로 중성구가 집단을 형성하고 모세혈관 및 동맥에서의 순환에 장애물로 작용하여 미세순환의 재분배와 장애를 일으켜 미세순환 장애를 발생시키는 것을 알 수 있다.
상기 미세순환(microcirculation)은 모세동맥, 모세정맥, 모세혈관, 모세림프관 등의 소혈관에서 볼 수 있는 혈액순환으로서 미소순환 또는 모세순환이라고도 하며, 조직 가운데서 물질 대사의 중심이 되는 곳이고 필요한 물질의 공급과 배출이 행해진다. 본 발명의 일 측면에 있어서 미세순환은 폐 내 미세순환, 안구 내 미세순환, 신장 내 미세순환, 피부 내 미세순환일 수 있으며, 상기 피부는 손, 발 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 개체는 미세순환 장애 진단을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 구체적으로 상기 개체는 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 개체는 미세순환 장애, 미소순환 장애, 모세순환 장애 또는 말초순환 장애를 갖는 개체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체의 모세혈관은 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 동적 요소를 분석하여 그 결과로부터 개체의 미세순환 장애 여부를 판단할 수 있는 모세혈관이라면 제한되지 않으며, 개체의 폐, 신장, 피부 및 안구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모세혈관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법은 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 혈류 내 타겟 요소는 개체의 미세순환의 모세혈관을 통과하는 요소로서, 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 동적 요소, 예를 들어 상기 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 또는 트랙 굴곡 지수(meandering index)를 분석함으로써 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 이 때, 상기 혈류 내 타겟 요소는 미세순환을 따라 이동하는, 개체의 모세혈관을 통과하는 요소일 수 있고, 구체적으로 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류의 속력 또는 혈류량을 실질적으로 반영할 수 있는 혈액의 구성 요소일 수 있으며, 보다 구체적으로 중성구일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 혈류 내 타겟 요소는 이동 이미지를 수득할 수 있도록 표지(label)된 것이면 그 표시의 종류는 제한되지 않는다. 상기 혈류 내 타겟 요소가 중성구인 경우 상기 중성구는 중성구에서 발현되는 펩티드(peptide)를 코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA)에 발광형광단(fluorophore)이 결합한 것일 수 있고, 상기 중성구는 중성구에 특이적인 항체가 결합한 것이고, 상기 항체는 발광형광단(fluorophore)이 결합한 것일 수 있다. 상기 중성구에서 발현되는 펩티드를 코딩하는 핵산은 구체적으로 리신 모티프(Lysin Motif, LysM) 도메인을 코딩하는 핵산, 루코사이트6G(Leukocyte6G, Ly6G)를 코딩하는 핵산, 분화 분자 클러스터 11B(cluster of differentiation molecule 11B, CD11b)를 코딩하는 핵산 및 분화 분자 클러스터 18B (cluster of differentiation molecule 18, CD18)을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 중성구를 표지하여 이의 촬영 이미지로부터 동적 요소를 분석할 수 있는 핵산이라면 제한되지 않는다. 또한, 상기 중성구에 특이적인 항체는 중성구에서 발현되는 펩티드에 특이적인 항체일 수 있고, 구체적으로 리신 모티프(Lysin Motif, LysM) 도메인, 루코사이트6G(Leukocyte6G, Ly6G), 분화 분자 클러스터 11B (cluster of differentiation molecule 11B, CD11b) 및 분화 분자 클러스터 18B (cluster of differentiation molecule 18, CD18)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 특이적인 항체일 수 있으나, 중성구를 표지하여 이의 촬영 이미지로부터 동적 요소를 분석할 수 있는 항체라면 제한되지 않는다. 또한, 상기 발광형광단은 구체적으로 유전자변이 프로브(transgenic probe) 또는 형광 프로브(fluorescent probe)일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 유전자 변이 프로브는 CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 형광 프로브는 Alexa 405, Alexa 488, Alexa 555 및 Alexa 647로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈류 내 타겟 요소가 중성구인 경우 발광형광단(fluorophore)인 Alexa Fluor 555 또는 647 (A-20005 / A-20006, ThermoFisher Scientific)가 결합된 항-Ly6G+ 단일 클론 항체(monoclonal antibody)(Clone 1A8, 551459, BD Biosciences)을 개체에 주입하여 상기 항체가 결합한 중성구의 움직임을 형광 신호를 통해 측정함으로써 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 종래 알려진 바와 같이, 중성구에 의해 유도된 혈액 흐름 방해는 호흡(ventilation) 및 관류(perfusion)의 불일치 영역을 증가시켜 패혈증에 의해 유도된 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)로 인한 저산소증을 심화시킨다. 폐 모세혈관에서의 중성자의 접착(adhesion)에 대한 종래 생체 내 이미징 연구와 비교할 때(Yang N, Liu YY, Pan CS, Sun K, Wei XH, Mao XW, Lin F, Li XJ, Fan JY, Han JY. Pretreatment with andrographolide pills((R)) attenuates lipopolysaccharide-induced pulmonary microcirculatory disturbance and acute lung injury in rats. Microcirculation 2014: 21(8): 703-716.; Gill SE, Rohan M, Mehta S. Role of pulmonary microvascular endothelial cell apoptosis in murine sepsis-induced lung injury in vivo. Respir Res 2015: 16: 109), 본 발명의 일 실시예에 따른 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공방법은 호흡/관류 불일치가 있는 사강(dead space)이 어떻게 중성구에 의해 미세순환 내에서 만들어지는지를 명확히 보여주며, 종래 용적 측정에 따른 호기말 이산화탄소 분압측정(volumetric capnography)를 이용하여 동맥 대 호기 이산화탄소 분압 차이로 간접적으로 측정하였던 사강 분율을 직접적으로 이미지화할 수 있어, 보다 간편하고 정확하게 정보를 제공할 수 있다.
상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1/900 초 내지 1 초의 시간 차이로 촬영된 복수의 이미지일 수 있다. 예를 들어, 상기 복수의 이미지가 하나의 시점(T)을 기준으로 상기 시점(T)의 이미지(M) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T-1, T+1)의 이미지(M-1, M+1)인 경우, 상기 촬영된 3개의 이미지(M-1, M, M+1)는 각각 동일한 시간 차(t)의 연속적인 제 1 시점(T-1), 제 2 시점(T) 및 제 3 시점(T+1)의 이미지를 각각 나타내므로, 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에는 각각 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로가 나타날 수 있다. 이로부터 혈류 내 타겟 요소의 동적 요소, 예를 들어 상기 타겟 요소의 격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 또는 트랙 굴곡 지수를 분석함으로써 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공할 수 있고, 구체적으로는, 시간 차(t)를 두고 촬영된 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에서 각각 나타난 동일한 타겟 요소를 판별함으로써, 상기 동일한 타겟 요소의 동적 요소를 분석할 수 있다.
상기 3개의 영상(M-1, M, M+1)을 촬영하는 시간 차(t)는 1/900 초 내지 1 초일 수 있고, 구체적으로 1/300 초 내지 1/3 초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1/900 초 이상, 1/800 초 이상, 1/700 초 이상, 1/600 초 이상, 1/500 초 이상, 1/ 400 초 이상, 1/300 초 이상, 1/200 초 이상, 1/100 초 이상, 1/90 초 이상, 1/80 초 이상, 1/70 초 이상, 1/60 초 이상, 1/50 초 이상, 1/45 초 이상, 1/40 초 이상, 1/35 초 이상, 1/30 초 이상, 1/25 초 이상, 1/20 초 이상, 1/15 초 이상, 1/10 초 이상 또는 1/5 초 이상일 수 있고, 1 초 이하, 1/5 초 이하, 1/10 초 이하, 1/15 초 이하, 1/20 초 이하, 1/25 초 이하, 1/30 초 이하, 1/35 초 이하, 1/40 초 이하, 1/45 초 이하, 1/50 초 이하, 1/60 초 이하, 1/70 초 이하, 1/80 초 이하, 1/90 초 이하, 1/100 초 이하, 1/200 초 이하, 1/300 초 이하, 1/400 초 이하, 1/500 초 이하, 1/600 초 이하, 1/700 초 이하, 1/800 초 이하 또는 1/900 초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 동적 요소를 분석할 수 있는 시간 차이라면 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속력으로 촬영된 복수의 이미지일 수 있고, 상기 프레임 속력은 구체적으로 3 내지 300 프레임/초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1 프레임/초 이상, 5 프레임/초 이상, 10 프레임/초 이상, 15 프레임/초 이상, 20 프레임/초 이상, 25 프레임/초 이상, 30 프레임/초 이상, 35 프레임/초 이상, 40 프레임/초 이상, 45 프레임/초 이상, 50 프레임/초 이상, 60 프레임/초 이상, 70 프레임/초 이상, 80 프레임/초 이상, 90 프레임/초 이상, 100 프레임/초 이상, 200 프레임/초 이상, 300 프레임/초 이상, 400 프레임/초 이상, 500 프레임/초 이상, 600 프레임/초 이상, 700 프레임/초 이상 또는 800 프레임/초 이상일 수 있고, 900 프레임/초 이하, 800 프레임/초 이하, 700 프레임/초 이하, 600 프레임/초 이하, 500 프레임/초 이하, 400 프레임/초 이하, 300 프레임/초 이하, 200 프레임/초 이하, 100 프레임/초 이하, 90 프레임/초 이하, 80 프레임/초 이하, 70 프레임/초 이하, 60 프레임/초 이하, 50 프레임/초 이하, 45 프레임/초 이하, 40 프레임/초 이하, 35 프레임/초 이하, 30 프레임/초 이하, 25 프레임/초 이하, 20 프레임/초 이하, 15 프레임/초 이하, 10 프레임/초 이하 또는 5 프레임/초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소의 동적 요소를 분석할 수 있는 프레임 속력이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 복수의 이미지는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope), 형광 현미경(Fluorescence microscopy), 이광자현미경(Two-photon microscopy) 또는 삼광자 현미경(Three-photon microscopy)에 의해 촬영된 이미지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법은 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 격리 시간(sequestration time)은 상기 혈류 내 타겟 요소가 모세혈관을 통과하는 과정에서 모세혈관의 특정 영역에 머무르는(sequestration) 시간을 의미한다. 상기 혈류 내 타겟 요소의 직경이 커서 모세혈관을 통과하기 위해 변형되어야 하는 경우, 혈류 속력에 비해 모세혈관을 통과하는 속력이 보다 오래 걸리게 되는데, 상기 타겟 요소의 격리 시간이 일정 시간 이상인 경우 모세혈관을 통과하기 보다는 특정 영역에 격리되어 미세순환 장애가 발생할 가능성이 높다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 마우스 모델(PBS)은 중성구가 모세혈관을 통과하는 것과는 달리, 폐 손상 마우스 모델(ALI 마우스 모델)은 미세순환의 수많은 지점에서 중성구의 흐름이 중단됨을 확인하였다(실험예 2, 및 도 2 및 3). 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 마우스 모델(PBS)은 대부분의 중성구가 매우 짧은 시간 격리된 반면, 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h, LPS 6h)은 폐 손상으로 인해 중성구가 모세혈관의 특정 영역에 격리되고, 격리된 중성구의 비율이 대조군에 비하여 크게 증가함을 확인하였다(실험예 3, 및 도 4a 내지 4b 및 도 5a 내지 5c).
상기 변위(track displacement length)는 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 위치의 변화량(단위: μm)으로, 상기 변위의 크기가 클수록 상기 타겟 요소의 운동성이 크다는 것을 의미한다.
상기 이동 거리(track length)는 상기 혈류 내 타겟 요소가 시간에 따라 실제로 움직인 거리(단위: μm)로서, 상기 이동 거리가 클수록 상기 타겟 요소의 운동성이 크다는 것을 의미한다.
상기 이동 속력(track velocity)은 단위 시간 동안에 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동한 거리(단위: μm/m)로서, 상기 이동 속력이 클수록 상기 타겟 요소의 운동성이 크다는 것을 의미한다.
상기 트랙 굴곡 지수(track meandering index)는 상기 혈류 내 타겟 요소가 목표하는 지점 또는 특정 방향으로 나아가려는 경향성(단위: a.u. 즉, 임의 단위)을 나타내는데, 트랙의 굴곡 지수가 클수록 목표하는 지점 또는 특정 방향으로 직선으로 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하여 가장 빠른 시간 내에 목표 지점에 도달할 수 있게 되는 것을 의미한다. 상기 트랙 굴곡 지수(a.u.)는 IMARIS 프로그램의 Spots & Tracking 을 이용하여 계산되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군(PBS)과 비교하였을 때 폐 손상 마우스 모델(ALI 마우스 모델, LPS 3h 마우스 모델, LPS 6h 마우스 모델)은 상기 격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 및 트랙 굴곡 지수에 있어 차이가 있는바, 상기 동적 요소 분석을 통해 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 제공할 수 있음을 알 수 있었다(실험예 4 및 도 6a 내지 6e).
상기 동적 요소 분석은 상기 복수 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 분석하는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 복수의 이동 이미지 각각으로부터 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로를 측정하고, 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 및 트랙 굴곡 지수로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 시간 차(t)를 갖고 촬영된 이미지를 바탕으로 복수의 이미지들을 상호간에 비교함으로써, 동일한 혈류 내 타겟 요소를 용이하게 판별 및 추적하여 단일 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로를 측정하고, 이와 동일한 방법으로 수득한 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 동적 요소를 측정할 수 있다.
상기 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법은 상기 동적 요소 분석 결과로부터 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간이 5 분 이상이면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것일 수 있다. 상술한 바와 같이, 대조군에 비하여 미세순환 장애가 있는 개체의 경우, 상기 혈류 내 타겟 요소는 모세혈관을 통과하기 보다 특정 영역에 머무르는(entrapment) 경향이 커서 격리 시간(sequestration time)이 증가한다. 따라서, 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간이 5 분 이상이면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있고, 구체적으로 상기 격리 시간이 5 분 이상, 5 분 10 초 이상, 5 분 20 초 이상, 5 분 30 초 이상, 5 분 40 초 이상, 5 분 50 초 이상, 6 분 이상, 6 분 10 초 이상, 6 분 20 초 이상, 6 분 30 초 이상, 6 분 40 초 이상, 6 분 50 초 이상, 7 분 이상, 7 분 10 초 이상, 7 분 20 초 이상, 7 분 30 초 이상, 7 분 40 초 이상, 7 분 50 초 이상, 8 분 이상, 8 분 10 초 이상, 8 분 20 초 이상, 8 분 30 초 이상, 8 분 40 초 이상, 8 분 50 초 이상, 9 분 이상, 9 분 10 초 이상, 9 분 20 초 이상, 9 분 30 초 이상, 9 분 40 초 이상, 9 분 50 초 이상, 10 분 이상, 11 분 이상, 12 분 이상, 13 분 이상, 14 분 이상, 15 분 이상, 16 분 이상, 17 분 이상, 18 분 이상 또는 19 분 이상이면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있으나, 상기 미세순환 장애 여부를 판단하는 기준이 되는 격리 시간의 범위는 개체의 종류, 모세혈관의 종류, 개체의 연령, 성별, 체중과, 개체의 질환 종류 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 인자에 기초한 미세순환 장애 여부 판단은 당업자의 수준 내에 있는바, 상기 범위에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군(PBS)의 격리 시간은 약 3 분, LPS 3h 마우스 모델은 약 8 분, LPS 6h 마우스 모델은 약 18 분으로, 대조군(PBS)에 비하여 폐 손상 마우스 모델(LPS 투여군)의 중성구의 격리 시간이 더 길고, LPS 투여 3 시간이 경과했을 때(LPS 3h 마우스 모델)보다 6 시간이 경과하였을 때(LPS 6h 마우스 모델) 격리 시간이 약 2 배 정도 더 긴 것을 알 수 있었다(실험예 4 및 도 6a).
상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 혈류 내 타겟 요소의 트랙의 굴곡 지수가 0.4 a.u. 이하이면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것일 수 있다. 대조군에 비하여 미세순환 장애가 있는 개체의 경우, 상기 혈류 내 타겟 요소는 혈류의 흐름에 따라 모세혈관을 통과하기 보다는 특정 영역에 격리되어 있거나 아주 느린 속도로 방향성 없이 움직이는 경향이 있다. 따라서, 상기 혈류 내 타겟 요소의 트랙의 굴곡 지수가 0.4 a.u. 이하이면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있고, 구체적으로 상기 트랙의 굴곡 지수가 0.4 a.u. 이하, 0.39 a.u. 이하, 0.38 a.u. 이하, 0.37 a.u. 이하, 0.36 a.u. 이하, 0.35 a.u. 이하, 0.34 a.u. 이하, 0.33 a.u. 이하, 0.32 a.u. 이하, 0.31 a.u. 이하, 0.3 a.u. 이하, 0.29 a.u. 이하, 0.28 a.u. 이하, 0.27 a.u. 이하, 0.26 a.u. 이하, 0.25 a.u. 이하, 0.24 a.u. 이하, 0.23 a.u. 이하, 0.22 a.u. 이하, 0.21 a.u. 이하 또는 0.2 a.u. 이하이면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있으나, 상기 미세순환 장애 여부를 판단하는 기준이 되는 트랙의 굴곡 지수의 범위는 개체의 종류, 모세혈관의 종류, 개체의 연령, 성별, 체중과, 개체의 질환 종류 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 인자에 기초한 미세순환 장애 여부 판단은 당업자의 수준 내에 있는바, 상기 범위에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군(PBS)의 굴곡 지수는 약 0.5 a.u., LPS 3h 마우스 모델은 약 0.4 a.u., LPS 6h 마우스 모델은 약 0.2 a.u.로, 대조군(PBS)에 비하여 폐 손상 마우스 모델(LPS 투여군)의 중성구의 트랙의 굴곡 지수가 더 작고, LPS 투여 3 시간이 경과했을 때(LPS 3h 마우스 모델)보다 6 시간이 경과하였을 때(LPS 6h 마우스 모델) 트랙의 굴곡 지수가 약 1/2 정도로 감소하는 것을 확인하였다(실험예 4 및 도 6e).
상기 동적 요소가 변위, 이동 거리 및 이동 속력으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 하기와 같은 2 시간 이상의 시간 간격(t')으로 촬영된 2 이상의 복수의 이동 이미지 세트일 수 있다:
(1) 하나의 시점(T1)의 복수의 이미지 제 1 세트(SET_M1)로서, 상기 제 1 이미지 세트는 하나의 시점(T1)을 기준으로 상기 시점(T1)의 이미지(M1) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T1-1, T1+1)의 이미지(M1-1, M1+1)를 포함한다.
(2) 상기 하나의 시점(T1)으로부터 2 시간 이상의 시간(t') 이후인 시점(T2)의 복수의 이미지 제 2 세트(SET_M2)로서, 상기 제 2 이미지 세트는 하나의 시점(T2)을 기준으로 상기 시점(T2)의 이미지(M2) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T2-1, T2+1)의 이미지(M2-1, M2+1)를 포함한다.
(3) 상기 하나의 시점(T2)으로부터 2 시간 이상의 시간(t') 이후인 시점(T3)의 복수의 이미지 제 3 세트(SET_M3)로서, 상기 제 3 이미지 세트는 하나의 시점(T3)을 기준으로 상기 시점(T3)의 이미지(M3) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T3-1, T3+1)의 이미지(M3-1, M3+1)를 포함한다.
상기 2 이상의 복수의 이동 이미지 세트는 상기 (1) 내지 (3)과 동일한 방식으로 수득한 것일 수 있고, 상기 복수의 이동 이미지 세트는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6 이상의 이미지 세트일 수 있다.
상기 복수의 이미지 세트 간의 시간 간격(t')은 2 시간 이상, 3 시간 이상, 4 시간 이상, 5 시간 이상 또는 6 시간 이상일 수 있으나, 상기 복수의 이미지 세트로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 변위, 이동 거리 및 이동 속력으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하여 미세순환 장애를 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있는 시간 간격이라면 상기 범위에 제한되지 않는다.
상기 동적 요소가 변위, 이동 거리 및 이동 속력으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 상기 동적 요소 분석은 상기 2 세트 이상의 복수의 이동 이미지 세트로부터 상기 동적 요소를 시간 순서대로 분석하는 것이고, 상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 동적 요소를 분석한 결과 상기 동적 요소가 시간이 지남에 따라 감소하면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것일 수 있다. 대조군에 비하여 미세순환 장애가 있는 개체의 경우, 상기 혈류 내 타겟 요소는 미세순환 장애, 예를 들어 내독신에 의해 폐 손상이 발생하는 경우 폐 손상 초기에는 중성구의 운동성이 증가하나, 미세순환 장애로 인해 염증이 심화되면 폐 손상 초기 이후에는 중성구의 운동성이 감소하여 변위, 이동 거리 및 이동 속력이 감소하는 경향이 있다. 따라서, 상기 혈류 내 타겟 요소의 변위, 이동 거리 또는 이동 속력이 시간이 지남에 따라 감소하면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군(PBS)의 변위, 이동 거리 및 이동 속력은 대조군(PBS)에 비하여 LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)에서 증가하였다가, 다시 LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델)은 대조군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다(실험예 4 및 도 6b 내지 6d).
상기 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법은 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소에서 활성 산소(reactive oxygen)의 생성 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 활성 산소 생성 여부 검출은 구체적으로 디하이드로에티디움(dihydroethidium, DHE) 염색(staining)을 통해 검출하는 것일 수 있으나, in vivo 또는 in situ 상에서 개체의 활성 산소 생성 여부를 검출할 수 있는 방법이라면 그 방법은 제한되지 않는다. 또한, 상기 혈류 내 타겟 요소에서 활성 산소가 생성되면 미세순환 장애인 것으로 판단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군(PBS)의 일시적으로 격리된 중성구에서는 활성 산소를 생성하지 않으나, 폐 손상 마우스 모델(ALI 마우스 모델)의 모세혈관 내 중성자는 활성 산소를 생성하고 전체 중성구를 기준으로 활성 산소를 생성하는 중성구의 비율이 큰 폭으로 증가함을 확인하였다(실험예 6, 및 도 10, 11a 및 11b).
다른 측면에서, 본 발명은 미세순환 장애 진단 장치로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및 상기 촬영부에서 촬영된 복수의 이동 이미지에 기반하여 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 분석부;를 포함하는, 미세순환 장애 진단 장치를 제공한다. 상기 개체, 미세순환, 미세순환 장애 혈류 내 타겟 요소, 복수의 이동 이미지, 동적 요소, 동적 요소의 분석, 미세순환 장애 진단을 위한 정보에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 개체의 혈류 내 타겟 요소의 동적 요소 분석 결과로부터 도출되는 것일 수 있다.
상기 촬영부는 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 촬영할 수 있고, 만일, 하나의 시점(T)을 기준으로 상기 시점(T)의 이미지(M) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T-1, T+1)의 이미지(M-1, M+1)를 각각 촬영한 것인 경우, 상기 촬영된 3개의 영상(M-1, M, M+1)은 각각 동일한 시간 차(t)의 연속적인 제 1 시점(T-1), 제 2 시점(T) 및 제 3 시점(T+1)의 이미지를 각각 나타내므로, 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에는 각각 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로가 나타날 수 있다.
상기 3개의 이미지(M-1, M, M+1)를 촬영하는 시간 차(t)는 1/900 초 내지 1 초일 수 있고, 구체적으로 1/300 초 내지 1/3 초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1/900 초 이상, 1/800 초 이상, 1/700 초 이상, 1/600 초 이상, 1/500 초 이상, 1/ 400 초 이상, 1/300 초 이상, 1/200 초 이상, 1/100 초 이상, 1/90 초 이상, 1/80 초 이상, 1/70 초 이상, 1/60 초 이상, 1/50 초 이상, 1/45 초 이상, 1/40 초 이상, 1/35 초 이상, 1/30 초 이상, 1/25 초 이상, 1/20 초 이상, 1/15 초 이상, 1/10 초 이상 또는 1/5 초 이상일 수 있고, 1 초 이하, 1/5 초 이하, 1/10 초 이하, 1/15 초 이하, 1/20 초 이하, 1/25 초 이하, 1/30 초 이하, 1/35 초 이하, 1/40 초 이하, 1/45 초 이하, 1/50 초 이하, 1/60 초 이하, 1/70 초 이하, 1/80 초 이하, 1/90 초 이하, 1/100 초 이하, 1/200 초 이하, 1/300 초 이하, 1/400 초 이하, 1/500 초 이하, 1/600 초 이하, 1/700 초 이하, 1/800 초 이하 또는 1/900 초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 측정할 수 있는 시간 차이라면 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속력으로 촬영된 복수의 이미지일 수 있고, 상기 프레임 속력은 구체적으로 3 내지 300 프레임/초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1 프레임/초 이상, 5 프레임/초 이상, 10 프레임/초 이상, 15 프레임/초 이상, 20 프레임/초 이상, 25 프레임/초 이상, 30 프레임/초 이상, 35 프레임/초 이상, 40 프레임/초 이상, 45 프레임/초 이상, 50 프레임/초 이상, 60 프레임/초 이상, 70 프레임/초 이상, 80 프레임/초 이상, 90 프레임/초 이상, 100 프레임/초 이상, 200 프레임/초 이상, 300 프레임/초 이상, 400 프레임/초 이상, 500 프레임/초 이상, 600 프레임/초 이상, 700 프레임/초 이상 또는 800 프레임/초 이상일 수 있고, 900 프레임/초 이하, 800 프레임/초 이하, 700 프레임/초 이하, 600 프레임/초 이하, 500 프레임/초 이하, 400 프레임/초 이하, 300 프레임/초 이하, 200 프레임/초 이하, 100 프레임/초 이하, 90 프레임/초 이하, 80 프레임/초 이하, 70 프레임/초 이하, 60 프레임/초 이하, 50 프레임/초 이하, 45 프레임/초 이하, 40 프레임/초 이하, 35 프레임/초 이하, 30 프레임/초 이하, 25 프레임/초 이하, 20 프레임/초 이하, 15 프레임/초 이하, 10 프레임/초 이하 또는 5 프레임/초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 정량화할 수 있는 프레임 속력이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 촬영부는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope), 형광 현미경(Fluorescence microscopy), 이광자현미경(Two-photon microscopy) 또는 삼광자 현미경(Three-photon microscopy)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또는 상기 촬영부로부터 촬영된 복수의 이동 이미지는 하기와 같은 2 시간 이상의 시간 간격(t')으로 촬영된 2 이상의 복수의 이동 이미지 세트일 수 있다:
(1) 하나의 시점(T1)의 복수의 이미지 제 1 세트(SET_M1)로서, 상기 제 1 이미지 세트는 하나의 시점(T1)을 기준으로 상기 시점(T1)의 이미지(M1) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T1-1, T1+1)의 이미지(M1-1, M1+1)를 포함한다.
(2) 상기 하나의 시점(T1)으로부터 2 시간 이상의 시간(t') 이후인 시점(T2)의 복수의 이미지 제 2 세트(SET_M2)로서, 상기 제 2 이미지 세트는 하나의 시점(T2)을 기준으로 상기 시점(T2)의 이미지(M2) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T2-1, T2+1)의 이미지(M2-1, M2+1)를 포함한다.
(3) 상기 하나의 시점(T2)으로부터 2 시간 이상의 시간(t') 이후인 시점(T3)의 복수의 이미지 제 3 세트(SET_M3)로서, 상기 제 3 이미지 세트는 하나의 시점(T3)을 기준으로 상기 시점(T3)의 이미지(M3) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T3-1, T3+1)의 이미지(M3-1, M3+1)를 포함한다.
상기 2 이상의 복수의 이동 이미지 세트는 상기 (1) 내지 (3)과 동일한 방식으로 수득한 것일 수 있고, 상기 복수의 이동 이미지 세트는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6 이상의 이미지 세트일 수 있다.
상기 복수의 이미지 세트 간의 시간 간격(t')은 2 시간 이상, 3 시간 이상, 4 시간 이상, 5 시간 이상 또는 6 시간 이상일 수 있으나, 상기 복수의 이미지 세트로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 변위, 이동 거리 및 이동 속력으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하여 미세순환 장애를 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있는 시간 간격이라면 상기 범위에 제한되지 않는다.
상기 미세순환 장애 진단 장치는 상기 혈류 내 타겟 요소에서 활성 산소(reactive oxygen)의 생성 여부를 검출하는 활성 산소 검출부;를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 검출부는 구체적으로 디하이드로에티디움(dihydroethidium, DHE) 염색(staining)을 통해 활성 산소 생성 여부를 검출하는 것일 수 있으나, in vivo 또는 in situ 상에서 개체의 활성 산소 생성 여부를 검출할 수 있는 것이라면 그 종류는 제한되지 않는다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
한편, 하기 실시예 및 실험예에서의 모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 표준 지침에 따라 수행되었고, KAIST (프로토콜 No. KA2014-30 및 KA2016-55)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았다.
또한, 하기 실험예에서의 모든 데이터는 각 군의 값을 각각 나타내기 위해 적절한 평균 ±SD 또는 중간값 ±사분범위(interquartile range)로 표시된다. 평균 또는 중간값 간의 통계적 차이는 unpaired 2-tailed Student's t-test, Mann-Whitney test, post hoc Holm-Sidak 의 다중 비교를 사용한 one-way ANOVA, 또는 post hoc Dunn의 다중 비교를 사용한 Kruskal-Wallis test에 의해 적절하게 결정되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었으며, Prism 6.0 (GraphPad)로 분석을 수행하였다.
[ 실시예 1] 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델 준비
미세순환 장애를 진단하기 위해, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델을 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
본 실시예에서 사용된 모든 마우스는 12시간 : 12시간(12:12h)의 명:암 주기(light:dark cycle) 하에서 환기가 되고 온도(22.5 ℃)와 습도(52.5%)가 조절된 우리에 개별적으로 수용되었고 표준 식단과 물을 임의로(ad libitum) 제공하였다. 생후 8 내지 20주 된 수컷 마우스 (20 ~ 30 g)을 실험군으로 하였다. LysMGFP /+ 마우스는 미국 로체스터 대학(University of Rochester)의 김민수 교수로부터 제공받았다(이하, LysM GFP /+ 마우스 모델이라 함).
상기 LysMGFP /+ 마우스에 고용량의 LPS 를 투여한 마우스 모델을 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI) 마우스 모델로 하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 고용량의 LPS 투여 모델의 경우, 모세혈관 촬영 3 내지 6 시간 전, 상기 LysMGFP /+ 마우스에 LPS (10 mg/kg, E.coli 혈청형 055:B5, L2880, Sigma-Aldrich)를 복막(peritoneum)에 복강 내 투여하였다(이하, ALI 마우스 모델이라 하며, ALI 마우스 모델 중 LPS 투여 3 시간 후의 마우스 모델은 LPS 3h 마우스 모델, LPS 투여 6 시간 후의 마우스 모델은 LPS 6h 마우스 모델이라 함). 대조군으로는 동량의 PBS를 복막에 주사한 마우스(이하, 대조군 또는 PBS 마우스 모델이라 함)를 준비하였다.
[ 실시예 2] 중성구 표지화(labeling) 및 생체 내 폐 이미징
(1) 중성구 표지화(labeling)
In vivo 상에서 중성구(neutrophil)의 움직임을 촬영하기 위해, 이미징 2 시간 전에, 발광형광단(fluorophore)인 Alexa Fluor 555 또는 647 (A-20005 / A-20006, ThermoFisher Scientific)가 결합된 항-Ly6G+ 단일 클론 항체(monoclonal antibody)(Clone 1A8, 551459, BD Biosciences)를 상기 실시예 1의 마우스 모델의 꼬리를 통해 주입하여 중성구를 라벨링(labeling)하였다.
또한, 상기 실시예 1의 마우스 모델의 적혈구(erythrocyte) 및 맥관 구조(vasculature)을 형광 염색하였다. 구체적으로, 적혈구는 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 수득하고, 그런 다음으로 Vybrant DiD (V22887, ThermoFisher Scientific)으로 제품 정보 시트에 기재된 방법에 따라 라벨링하였다. 그런 다음 촬영 직전에 상기 실시예 1의 마우스 모델의 꼬리 정맥의 혈관 카테터를 통해 상기 5천만 카운트(count)의 DiD-라벨링된 적혈구를 주입하였다. 또한, 맥관 구조를 시각화하기 위해, 덱스트란 염료(extran dye)가 결합된 FITC (분자량 2M Da, Sigma-Aldrich) 또는 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine, TMR)을 상기 실시예 1의 마우스 모델에 상기와 동일한 혈관 카테터를 통해 주입하였다.
상기 마우스 모델에 발광형광단이 결합된 항-Ly6G+ 단일 클론 항체, DiD-라벨링된 적혈구, 덱스트란 염료가 결합된 FITC 또는 TMR를 주입하는 과정은 하기 생체 내 폐 이미징에 설명되었다.
(2) 생체 내 폐 이미징
다음과 같이 생체 내 폐 이미징을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1의 LysM GFP /+ 마우스 모델, ALI 마우스 모델, LPS 3h 마우스 모델, LPS 6h 마우스 모델 및 PBS 마우스 모델을 케타민(Ketamine)(80 mg/kg) 및 질라진(Xylazine)(12 mg/kg)으로 마취한 후, 라이트닝 가이드와이어(lightning guidewire)로 20 게이지 혈관 카테터를 사용하여 삽관을 하고 인공호흡기(MouseVent, Kent Scientific)에 연결하였다. 상기 호흡은 24~30 mmHg의 흡기압, 분당 120~130의 호흡수(respiratory rate), 및 2cmH2O의 호기말 양압(positive-end expiratory pressure, PEEP)으로 세팅되어 수행되었다. 마취 상태를 유지하기 위해 2% 이소플루란(isoflurane)을 투여(delivery)하였으며, 산소 공급과 생존 상태를 모니터하기 위해 맥박 산소 측정법(pulse oximetry)를 적용하였다. 항온 시스템(RightTemp, Kent Scientific)의 열침을 직장(rectum)으로 주입하고, 피드백-조절식 열 패트(feedback-regulated heating pad)를 사용하여 체온을 37.0℃로 유지하였다. 꼬리 정맥은 상기 (1)의 염료, 적혈구 및 중성구의 정맥 주입을 위해 PE-10 튜브에 부착된 30-게이지 바늘로 캐뉼러가 삽입되었다(cannulated). 그런 다음, 마우스 모델을 오른쪽으로 옆으로 누운 자세를 취하게 하고, 왼쪽 개흉술(thoracotomy)을 수행하였다. 늑골이 노출될 때까지 피부 및 근육을 절개하고, 3번째 늑골과 4번째 늑골 사이를 절개하여 흉막(pleura)을 노출시켰다. 개흉술 후, 하기 실험예의 이미징 윈도우를 흉막 표면에 적용하고, 폐 이미징 윈도우에 연결된 튜브를 통해 펌프(DOA-P704-AA, GAST) 및 조절기(NVC 2300a, EYELA)로 음의 흡기 압력(negative suction pressure)을 가하였다.
[ 실험예 1] 폐 미세순환 촬영
폐 이미징 윈도우(pulmonary imaging window)를 통해 in vivo 상 폐 미세순환을 시각화하기 위해, 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템(custom-built video-rate laser-scanning confocal microscopy system)을 구현하였다.
이미징 시스템
구체적으로, 3 종의 연속 레이저 모듈 (488 nm (MLD488, 코볼트), 561 nm (Jive, 코볼트), 640 nm (MLD640, 코볼트)의 파장)을 다색 형광 이미징(imaging)을 위한 여기 경량 광원(excitation light source)으로 활용하였다. 레이저 빔은 다이크로닉 빔 분리장치(diachronic beam splitter)(DBS1; FF593-Di03, DSB2; FF520-Di02, Semrock)에 의해 동일 선상으로(collinearly) 통합되었으며, 다지점(multi-edge) 다이크로닉 빔 분리장치(DBS3; Di01-R405/488/561/635, Semrock)에 의해 레이저-빔 스캐너로 전송되었다. 상기 레이저 스캐닝부는 36 개의 측면(MC-5, 알루미늄 코팅, Lincoln Laser)이 있는 회전 다각형 거울을 사용한 X축 스캐닝과 검류계 스캐닝 거울(galvanometer scanning mirror)(6230H, Cambridge Technology)를 사용한 Y축 스캔 등 2개의 축으로 구성되었다. 상용화된 대물렌즈(LUCPLFLN, 20X, NA 0.45, Olympus, LUCPLFLN, 40X, NA 0.6, Olympus, LCPLFLN100XLCD, 100X, NA 0.85, Olympus)를 통해 상기 실시예 1의 LysMGFP /+ 마우스 모델의 폐로 2차원 래스터(raster) 스캐닝 레이저 빔을 옮겼다. 상기 대물렌즈에 의해 XYZ 변환 3D 단계(3DMS, Sutter Instrument)에서 상기 마우스 모델의 폐에서 방출된 형광 신호를 미리 감지하였다. 스캐닝되지 않은(de-scanned) 3색 형광 신호를 다이크로닉 빔 분리장치(DBS4; FF560-Di01, DBS5; FF649-Di01, Semrock)로 스펙트럼으로 분할한 다음, 대역필터(band pass filter)(BPF1; FF02-525/50, BPF2; FF01-600/37, BPF3; FF01-685/40, Semrock)를 통해 광전자 증배관(photomultiplier)(PMT; R9110, Hamamatsu)으로 검출하였다. 각각의 PMT의 전압 출력은 10 MHz의 샘플링 속력에서 8 비트 해상도(resolution)를 갖는 3-채널 프레임 그래버(frame grabber)(Solios, Matrox)에 의해 디지털화되었다. Matrox Imaging Library(MIL9, Matrox)와 Visual C#을 기반으로 한 맞춤형 영상 소프트웨어를 사용하여 30 Hz의 프레임률(frame rate)과 512 X 512 픽셀의 프레임 크기로 영상 속력의 영화가 실시간으로 표시되고 기록되었다.
이미지 처리
상기 이미징 시스템을 이용하여 촬영된 이미지는 프레임 당 512 X 512 픽셀의 초당 30 프레임의 획득 속력으로 표시되고 저장되었다. 실시간 이미지 프레임은 대조도(contrast) 및 신호-대-노이즈 비율(signal-to-noise ratio)을 개선하기 위해 MATLAB (Mathworks) 코드를 사용하여 평균 30 프레임 이상을 얻었다. 운동 인공물(motion artifact)를 최소화하기 위해, 평균화 전에 각 프레임을 이미지 등록 알고리즘(image registration algorithm)으로 처리하였다. 3차원 재구성을 이용한 이미지 렌더링(rendering), 중성구의 트랙 분석, 트랙 변위 표시는 IMARIS 8.2(Bitplane)로 실시하였다.
상기 실시예 1의 LPS를 투여하지 않은 LysMGFP /+ 마우스 모델의 폐 미세순환을 상기 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 상기 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과는 도 1과 같다.
도 1에 나타난 바와 같이, 중성구가 폐 모세혈관을 통해 상부(푸른색 캐럿, ^) 및 하부(붉은색 별표, *)에서 압착된 후에 재개되는 것을 확인하였으며, LysMGFP/+ 마우스 모델의 폐 내 미세순환 중에 모세혈관에 중성구가 과도하게 갇히는(entrapment) 현상을 확인하였다. 또한, 모세혈관 폐색이 일어나는 동안 적혈구로 추정되는 순환하는 세포는 모세혈관을 통해 흐를 수 없으나, 중성구가 모세혈관을 통과한 후에는 모세혈관의 혈액 흐름(flow)이 재개됨을 확인하였다.
한편, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델은 급성 폐 손상 초기에 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR; 전체 모세혈관 면적에 대한 기능적 모세혈관 면적으로 계산됨)이 감소하는데, 상기 폐 손상 마우스에서 발견되는 모세혈관 폐색(capillary obstruction) 또는 막힘들은 상기 FCR 감소의 기초가 되는 일차 병리학적 매커니즘을 나타낼 수 있는 모세혈관 내부의 대상(object)에 의해 유도된다. 도 1에 나타난 결과로부터 중성구가 전신 염증에 빠르게 반응하기 때문에 상기 폐색을 유도하는 대상이 중성구임을 알 수 있었다.
따라서, 모세혈관 내의 중성구, 구체적으로 모세혈관에서 중성구가 갇히는 것(entrapment)이 미세순환 장애, 특히 패혈증과 관련이 있음을 알 수 있는바, 본 발명의 일 측면에 따른 정보 제공 방법, 및 미세순환 장애 진단 장치를 이용하면 중성구의 움직임을 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 중성구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 중성구 각각의 움직임에 대한 정보를 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편하게 진단할 수 있다.
[ 실험예 2] 폐 손상 마우스 모델과 대조군 모델의 중성구 움직임 비교
상기 실험예 1로부터 모세혈관에서 중성구의 움직임이 미세순환 장애와 관련이 있음을 확인하였는바, 상기 실시예 1에서 제조한 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 모델(PBS)에서의 중성구 움직임을 시각화하기 위해, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템을 구현하였으며, 생체 내 이미징 결과는 도 2와 같다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스 모델의 폐 내 미세순환에서 중성구가 모세혈관을 통과하는 것과는 달리, ALI 마우스 모델에서는 수많은 지점에서 폐 미세순환에서 세포의 흐름이 중단되었다.
또한, 상기 도 2의 Wide field의 이미징 처리 결과를 바탕으로 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 마우스 모델(PBS) 간의 단위면적(512 X 512 μm)(field)당 중성구의 수를 비교하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군에서의 중성구의 수는 약 10 cells/field 인 반면, ALI 마우스 모델에서의 중성구의 수는 약 200 cells/field 로, 대조군 모델에 비해 ALI 마우스 모델에서 중성구의 수가 약 20 배 정도 더 많음을 확인하였다(n (분석을 수행한 field의 개수) = 30, 마우스 1 마리 당 10 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, * P < 0.05, two-tailed t-test, 데이터는 평균 ±s.d이다). 이는 상기 실험예 1에 따라 폐 내 미세순환을 촬영 시, 포착되는 중성구의 수가 더 많다는 것이며, 이는 급성 폐 손상에 의해 중성구가 모세혈관에서 순환하지 않고 갇히게 되어 일정한 시간차를 두고 촬영된 이미지에서 발견될 확률이 더 높기 때문이다. 이를 통해, 염증 초기에, 선천적인 면역 세포가 모일 때, 폐의 모세혈관에서의 미세순환에 있어 중성구가 1차적인 장애물임을 확인하였다.
따라서, 중성구의 모세혈관에서의 격리(entrapment)가 미세순환 장애와 관련이 있음을 알 수 있는바, 본 발명의 일 측면에 따른 정보 제공 방법, 및 미세순환 장애 진단 장치를 이용하면 중성구의 움직임을 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 중성구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 중성구 각각의 움직임에 대한 정보를 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편하게 진단할 수 있다.
[ 실험예 3] 폐 손상 마우스 모델과 대조군 모델의 중성구의 움직임(track) 비교 분석
상기 실험예 2로부터 중성구가 모세혈관에서 갇히는 것에 의해 폐 손상과 같은 미세순환 장애가 발생할 수 있음을 확인하였는바, 상기 실시예 1에서 제조한 LPS 투여에 의해 패혈증이 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델 및 LPS 6h 마우스 모델)과 LPS 대신 PBS를 투여한 대조군 마우스 모델의 중성구의 움직임(track)을 비교 분석하였다.
저속력 이미징(Time lapse imaging)으로부터 중성구의 트랙 도출
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템을 구현하여 마우스 모델들의 폐 미세순환을 느린 속력으로 30 분 동안 촬영하여 생체 내 이미징을 수행하였으며, 도 4a 및 4b와 같다.
도 4a의 저속력 이미징(time lapse imaging) 및 30 분 동안 추적된 중성구의 움직임(track)에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS)에서는 30 분 동안 특정 위치에 머물러 있는 중성구의 수가 매우 적은 반면, LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)은 30 분 동안 특정 위치에 머물러 있는 중성구의 수가 대조군에 비해 증가하였고 LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델)에서는 전체 모세혈관 전 영역에서 중성구가 30 분 동안 특정 위치에 머물러 있음을 확인하였다.
이는 도 4b의 중성구의 트랙 변위(track displacement)를 통해 다시 확인할 수 있는데, 대조군에 비하여 LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)에서 중성구의 트랙 변위가 급격히 증가하였는데, 이로부터 LPS 투여 3 시간 후에는 모세혈관에서의 중성구의 운동성이 증가함을 알 수 있었다. 다만, 이후 미세순환 장애로 인한 염증이 심화됨에 따라 LPS 투여 6 시간 후(LPS 6h 마우스 모델)에는 중성구의 운동성이 감소하여 중성구의 트랙 변위가 감소함을 알 수 있었다.
즉, 도 4a 및 4b에 따르면, 적혈구의 이동 속력이 500 μm/s 초과로 빠르다는 점을 감안할 때, 2 분 이상 연속적으로 검출된 중성구는 이동하지 않는 중성구이므로, 폐 손상으로 인해 중성구가 모세혈관의 특정 영역에 격리(즉, 혈관 내부에서 몹시 느리게 이동하거나 가장자리화되어 있음(marginating))되는 것을 알 수 있었다.
중성구의 격리 정도 비교
상기 저속력 이미징(Time lapse imaging) 결과(도 4a 및 4b)로부터 대조군과 폐 손상 마우스 모델의 중성구의 격리 정도를 비교하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 x축은 시간(sequestration time)을, y 축은 시간별로 도 4a 및 도 4b에 나타난 트랙의 수를 의미한다.
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 1 분 미만에는 트랙(track, 구간)이 약 100 개 정도인 반면, LPS 투여 6 시간 후 마우스 모델(LPS 6h)은 29 내지 30 분 사이의 트랙이 약 300 개 이상으로, LPS 투여 6 시간 후 마우스 모델은 대조군에 비하여 미세순환 내에서 중성구가 오래 갇혀 있는, 또는 오래 격리되어 있는 트랙이 많음을 확인하였다. 즉, 대조군에서는 대부분의 중성구가 매우 짧은 시간 격리되어 있으며, 격리된 중성구의 비율이 대조군에 비하여 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h, LPS 6h)에서 크게 증가함을 확인하였다.
[ 실험예 4] 폐 손상 마우스 모델과 대조군 모델의 중성구의 동적 요소 비교 분석
상기 실험예 3으로부터 대조군 모델에 비하여 폐 손상 마우스 모델은 모세혈관에서 중성구가 격리되어 움직임이 적음을 확인하였는바, 상기 실험예 1 내지 3으로부터 얻은 데이터들을 바탕으로 상기 실시예 1에서 제조한 LPS 투여에 의해 패혈증이 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델 및 LPS 6h 마우스 모델)과 LPS 대신 PBS를 투여한 대조군 마우스 모델의 중성구의 동적 요소들(격리 시간, 변위, 이동 거리, 이동 속력 및 트랙의 굴곡 지수(meandering index))을 비교 분석하였으며, 그 결과는 도 6a 내지 6e와 같다 (n (트랙의 개수) = 466(PBS), 794(LPS 3h), 및 1076(LPS 6h) 이며, 상기 3 가지 군 각각의 마우스는 3 마리이다. * P < 0.05, post hoc Dunn의 다중 비교를 사용한 Kruskal-Wallis test이며, 데이터는 중간값 ±사분범위(interquartile range)이다).
먼저, 격리 시간(sequestration time)의 경우(도 6a), 대조군(PBS)의 격리 시간은 약 3 분, LPS 3h 마우스 모델은 약 8 분, LPS 6h 마우스 모델은 약 18 분으로, 대조군(PBS)에 비하여 폐 손상 마우스 모델(LPS 투여군)의 중성구의 격리 시간이 더 길고, LPS 투여 3 시간이 경과했을 때(LPS 3h 마우스 모델)보다 6 시간이 경과하였을 때(LPS 6h 마우스 모델) 격리 시간이 약 2 배 정도 더 긴 것을 확인하였다.
변위(track displacement length)의 경우(도 6b), 대조군(PBS)의 변위는 약 3 μm, LPS 3h 마우스 모델은 약 8 μm, LPS 6h 마우스 모델은 약 4 μm로, 대조군(PBS)에 비하여 LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)의 변위량이 약 2 내지 3 배 정도 증가하고, LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델)의 변위는 다시 대조군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
이동 거리(track length)도(도 6c) 상기 변위와 마찬가지로, 대조군(PBS)의 이동 거리는 약 10 μm, LPS 3h 마우스 모델은 약 23 μm, LPS 6h 마우스 모델은 약 15 μm로, 대조군(PBS)에 비하여 LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)의 이동 거리가 약 2 배 이상 증가하고, LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델)의 이동 거리는 다시 대조군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
이동 속력(track velocity)의 경우(도 6d), 대조군(PBS)의 이동 속력은 약 1.0 μm/m, LPS 3h 마우스 모델은 약 1.9 μm/m, LPS 6h 마우스 모델은 약 0.8 μm/m로, 대조군(PBS)에 비하여 LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)의 이동 속력이 약 1.5 배 이상 증가하고, LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델)의 이동 속력은 다시 대조군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 트랙의 굴곡 지수(meandering index)(도 6e)는 중성구가 한 쪽 방향으로 나아가려는 경향성을 나타내는데, 트랙의 굴곡 지수가 클수록 목표하는 지점 또는 특정 방향으로 직선으로 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하여 가장 빠른 시간 내에 목표 지점에 도달할 수 있게 되는 것을 의미한다. 도 6e에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS)의 굴곡 지수는 약 0.5 a.u., LPS 3h 마우스 모델은 약 0.4 a.u., LPS 6h 마우스 모델은 약 0.2 a.u.로, 대조군(PBS)에 비하여 폐 손상 마우스 모델(LPS 투여군)의 중성구의 트랙의 굴곡 지수가 더 작고, LPS 투여 3 시간이 경과했을 때(LPS 3h 마우스 모델)보다 6 시간이 경과하였을 때(LPS 6h 마우스 모델) 트랙의 굴곡 지수가 약 1/2 정도로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 도 6b 내지 6d에 따르면, LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 3h 마우스 모델)에서 중성구의 동적 요소 중 변위, 이동 거리 및 이동 속력이 증가하였는데, 이로부터 LPS 투여 3 시간 후에는 모세혈관에서의 중성구의 운동성이 증가함을 알 수 있었다. 다만, 이후 미세순환 장애로 인한 염증이 심화됨에 따라 LPS 투여 6 시간 후(LPS 6h 마우스 모델)에는 중성구의 운동성이 감소하여 변위, 이동 거리 및 이동 속력이 감소함을 알 수 있었다.
또한, 상기 도 6e에 따르면, 대조군, LPS 투여 3 시간 후의 폐 손상 마우스(LPS 3h 마우스 모델) 모델, LPS 투여 6 시간 후의 폐 손상 마우스 모델(LPS 6h 마우스 모델) 순으로 트랙의 굴곡 지수가 감소하는데, 이는 중성구의 증가된 격리 시간 및 머무름(또는 격리) 특성에 영향을 받았기 때문이다.
따라서, 상기 중성구의 동적 요소를 종합하면, 내독신에 의해 유도된 급성 폐 손상 초기에는 중성구가 활성화되어 모세혈관 내부에서 운동성이 증가하나, 후기에는 점차적으로 모세혈관 내부에 격리되는 것을 알 수 있는바, 본 발명의 일 측면에 따른 정보 제공 방법, 및 미세순환 장애 진단 장치를 이용하면 중성구의 움직임을 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 중성구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 중성구 각각의 움직임에 대한 정보를 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편하게 진단할 수 있다.
[ 실험예 5] 중성구의 격리와 사강 (dead space) 발생의 관계 확인
상기 실험예 4로부터 급성 폐 손상에 의해 모세혈관 내 중성구가 격리되는 것을 확인하였는바, 상기 실시예 1에서 제조한 ALI 마우스 모델의 생체 내 이미징을 이용하여 폐 미세순환에서 사강(dead space)이 형성되는 전체 과정을 확인하였다.
실시간 이미징 (real-time imaging) 및 저속력 이미징 (time lapse imaging)
구체적으로, 상기 실시예 1의 ALI 마우스 모델의 중성구(Ly6G+ 세포)의 폐 미세순환을 상기 실험예 2의 방법으로 실시간으로 촬영하여 도 7 및 8의 실시간 이미지를 얻었다.
또한, 모세혈관에 연결된 동맥의 분기 영역(branching region)에서 중성구(Ly6G+ 세포)에 의해 클러스터(cluster)가 형성되는 과정을, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템을 구현하여 느린 속력으로 10 분 동안 촬영하여 생체 내 이미징을 수행하였으며, 그 결과 도 9의 저속력 이미지(time-lapse imaging)를 얻었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 모세혈관에서 순환하는 중성구는 이미 다른 중성구에 의해 이동이 어려운(obstructed) 혈관의 한 영역에 갇히게 되었다. 두 중성구 사이의 흐름이 멈추면서 미세순환에서 사강이 형성되었다. 일부 모세혈관 영역에서는, 흐름이 감지되지 않는 중성구 클러스터(cluster)을 관찰할 수 있었으며(도 8), 상기 미세순환 장애는 모세혈관에 국한되지 않고, 모세혈관에 연결된 동맥의 분기 영역(branching region)에서도 관찰되었다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 10 분간 폐의 모세혈관에서의 중성구의 움직임을 촬영하는 동안, 중성구가 분기 영역을 막아 막힌 부위(obstructed region) 근처의 미세순환을 방해하는 것을 확인하였다.
기능적 모세혈관 시각화를 통한 중성구 격리와 사강 형성의 상관관계 확인
중성구 격리와 사강 형성의 상관관계를 확인하기 위해 적혈구를 형성 염색하여 적혈구가 이동하는, 즉 미세순환이 원활하게 일어나는 기능적 모세혈관(Functional capillary)을 시각화하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2의 DiD-라벨링된 적혈구를 갖는 ALI 마우스 모델의 폐 미세순환을 실험예 3의 방법으로 느린 속력으로 10 분 동안 촬영하여 각각 실험예 1의 이미징 처리 방법으로 처리하였으며, 상기 실험예 3의 중성구의 트랙 도출 방법으로 DiD-라벨링된 적혈구의 트랙 경로(track path)를 얻었다. 그 결과는 도 9과 같으며, 도 9에서 흰색 점선으로 된 원은 미세순환에서의 사강을 나타내고, 흰색 화살표는 혈액 흐름의 방향을 나타낸다. 도 10의 스케일 바는 100 μm 이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 중성구가 클러스터를 형성한 영역에서는 적혈구가 이동하지 않아 중성구에 의해 유도된 모세혈관과 동맥의 장애(obstruction)가 미세순환에서 사강을 형성함을 확인하였다.
따라서, 폐 손상과 같은 미세순환 장애 발생 시 중성구가 모세혈관 내부에 격리되어 사강(dead space)을 형성함을 알 수 있는바, 본 발명의 일 측면에 따른 정보 제공 방법, 및 미세순환 장애 진단 장치를 이용하면 중성구의 움직임을 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 중성구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 중성구 각각의 격리 여부에 대한 정보를 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편하게 진단할 수 있다.
[ 실험예 6] 중성구의 격리와 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS )의 관계
상기 실험예 4로부터 급성 폐 손상에 의해 모세혈관 내 중성구가 격리되는 것을 확인하였는바, 상기 실시예 1에서 제조한 ALI 마우스 모델과 LPS 대신 PBS를 투여한 대조군의 중성구의 격리가 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)의 체외에서의 방출에 어떠한 영향을 끼치는지 확인하였다.
구체적으로, 활성 산소 발생 여부를 확인하기 위해 종래 생체 내 이미징(intravital imaging) 연구에서 사용하던 방식(Finsterbusch M, Hall P, Li A, Devi S, Westhorpe CL, Kitching AR, Hickey MJ. Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus. Proc Natl Acad Sci U S A 2016: 113(35): E5172-5181)으로 DHE(dihydroethidium, 디하이드로에티듐) 염색(staining)을 수행하되, 고용량의 DHE (10 mg/kg)을 사용하였다. 15.7 mg 의 DHE 스톡(stock)을 1.5 mL의 DMSO에서 준비하고 -20℃의 온도에서 저장하였다. 그런 다음, DHE 10mg/kg을 최대 60℃까지 가열한 150μL의 식염수에 희석하고 즉시 생체 내 현미경을 위해 준비된 상기 실시예 1의 ALI 마우스 모델과 대조군 마우스 모델 각각에 정맥 주사하였다.
활성 산소(ROS) 발생 여부는 DHE 주입 20 분 후에 확인하였다. 이 때 중성구(ROS+ Ly6G+)의 수는 육안으로 개수를 세거나 ImageJ 프로그램을 사용하여 세거나, 또는 IMARIS 프로그램의 Spots 기능을 이용하여 중성구의 수를 확인하였다. 또한, 활성 산소를 생성하는 중성구(ROS+ Ly6G+)의 수는 중성구(Ly6G+, 붉은색)과 DHE(푸른색)이 모두 양성(double positive)으로 확인된 중성구를 IMARIS 프로그램의 Colocalization 기능을 이용하여 확인하였다.
그 결과는 도 11 및 도 12와 같다(n (field의 개수) = 30, 마우스 1 마리 당 10 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, * P < 0.05, two-tailed t-test, 데이터는 평균 ±s.d이다). 도 11에 나타난 바와 같이, in situ에서 혈관 내 중성자가 활성 산소를 생성함을 확인하였다.
한편, 도 12a에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS)과 ALI 마우스 모델(LPS) 간의 단위면적(512 X 512 μm)(field)당 활성 산소를 생성하는 중성구(ROS+ Ly6G+)의 수를 비교한 결과, 대조군에서는 활성 산소를 생성하는 중성구가 거의 없는 반면, ALI 마우스 모델에서는 활성 산소를 생성하는 중성구가 무려 약 30 개 정도임을 확인하였다. 또한, 도 12b에 나타난 바와 같이, 전체 중성구(Ly6G+) 중 활성 산소를 생성하는 중성구(ROS+ Ly6G+)의 비율의 경우, 대조군(PBS)은 거의 0에 가까운 반면, ALI 마우스 모델(LPS)은 약 0.4로 증가하였음을 확인하였다. 즉, 도 12a 및 12b에 따르면, 대조군(PBS)은 일시적으로 격리된 중성구에서 활성 산소를 검출할 수 없었으나, ALI 마우스 모델(LPS)에서는 활성 산소를 생성하는 중성구의 수와 그 비율이 모두 큰 폭으로 증가하였다.
이를 통해, 염증 부위에서 중성구에 의해 활성 산소가 생성된다는 것에 대해 종래 알려진 것과는 달리, 활성 산소 생성이 모세혈관에서의 중성구 격리가 일어나는 것에 의해 훨씬 더 초기 단계에서 시작됨을 알 수 있었다. 또한, 격리된 중성구가 in situ 에서 활성산소를 방출하여 혈관 밖으로 활성 산소가 유출(extravasation)되기 전에 내피세포(endothelial cell) 및 이와 인접한 혈관 내 구조에 해를 끼칠 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 폐 손상과 같은 미세순환 장애 발생 시 중성구가 모세혈관 내부에 격리되어 활성 산소를 생성하는 것을 알 수 있는바, 본 발명의 일 측면에 따른 정보 제공 방법, 및 미세순환 장애 진단 장치를 이용하면 중성구의 움직임을 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 중성구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 중성구 각각의 격리 여부에 대한 정보를 획득하여 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편하게 진단할 수 있다.
종합적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 미세순환 정량화 방법, 및 미세순환 측정 장치를 이용하면 기능적 모세혈관 분율을 기반으로 in vivo 상에서 개체의 미세순환을 보다 쉽고 간편하게 정량화할 수 있으며, 상기 정량화된 결과를 바탕으로 미세순환 장애 여부를 정확하고 빠르게 판단할 수 있다.

Claims (15)

  1. 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
    개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계;
    상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 단계; 및
    상기 동적 요소 분석 결과로부터 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보를 추출하는 단계;를 포함하는, 정보 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈류 내 타겟 요소는 중성구(neutrophil)인, 정보 제공 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중성구는 중성구에 특이적인 항체가 결합한 것이고, 상기 항체는 발광형광단(fluorophore)이 결합한 것인, 정보 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속력으로 촬영된 복수의 이미지인, 정보 제공 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 복수의 이미지는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope)에 의해 촬영된 이미지인, 정보 제공 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 동적 요소 분석은 상기 복수 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 분석하는 것인, 정보 제공 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간이 5 분 이상이면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 혈류 내 타겟 요소의 트랙의 굴곡 지수가 0.4 a.u. 이하이면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 이동 이미지는 2 시간 이상의 간격으로 촬영된 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지가 2 세트 이상인 것이고,
    상기 동적 요소는 상기 혈류 내 타겟 요소의 변위, 이동 거리 및 이동 속력으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이며,
    상기 동적 요소 분석은 상기 2 세트 이상의 복수의 이동 이미지 세트로부터 상기 동적 요소를 시간 순서대로 분석하는 것인, 정보 제공 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 2 세트 이상의 복수의 이동 이미지로부터 동적 요소를 분석한 결과, 상기 동적 요소가 시간이 지남에 따라 감소하면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소에서 활성 산소(reactive oxygen)의 생성 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보는 상기 타겟 요소에서 활성 산소가 생성되면 미세순환 장애인 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 개체의 모세혈관은 개체의 폐, 신장, 피부 및 안구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모세혈관인, 정보 제공 방법.
  14. 미세순환 장애 진단 장치로서,
    개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및
    상기 촬영부에서 촬영된 복수의 이동 이미지에 기반하여 상기 혈류 내 타겟 요소의 격리 시간(sequestration time), 변위(track displacement length), 이동 거리(track length), 이동 속력(track velocity) 및 트랙 굴곡 지수(meandering index)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 동적 요소를 분석하는 분석부;를 포함하는, 미세순환 장애 진단 장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 장치는 상기 혈류 내 타겟 요소에서 활성 산소(reactive oxygen)의 생성 여부를 검출하는 활성 산소 검출부;를 추가로 포함하는 것인, 미세순환 장애 진단 장치.
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