KR102364786B1 - 미세순환 정량화 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 기능적 모세혈관 분율을 계산함으로써 개체의 미세순환을 정량화하는 방법 및 개체의 미세순환 측정 장치에 관한 것으로, 실제 적혈구가 지나가는 공간을 반영할 수 있어 보다 쉽고 간편하며 정확하게 미세순환을 정량화할 수 있고, 밀도 개념으로 정량화하기에 어려운 그물망 형태의 미세순환을 정량화할 수 있는 우수한 효과가 있다. 또한, 한 장의 이미지로 전체 모세혈관의 영역 중 기능적 모세혈관의 영역이 차지하는 비율을 눈으로 확인할 수 있어, 상기 정량화된 결과를 바탕으로 미세순환 장애 여부를 정확하고 빠르게 판단할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

미세순환 정량화 방법 및 장치 {Method and apparatus for quantifying microcirculation}
본 명세서에는 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 기능적 모세혈관 분율을 계산함으로써 개체의 미세순환을 정량화하는 방법 및 개체의 미세순환 측정 장치가 개시된다.
미세순환(microcirculation)은 모세동맥, 모세정맥, 모세혈관, 모세림프관 등의 소혈관에서 볼 수 있는 혈액순환으로서 미소순환 또는 모세순환이라고도 하며, 조직 가운데서 물질 대사의 중심이 되는 곳이고 필요한 물질의 공급과 배출이 행해진다. 기존의 미세순환 정량화는 기능적 모세혈관의 밀도(Functional capillary, density, FCD) 측정에 의해 이루어졌으며(De Backer D, Creteur J, Preiser JC, Dubois MJ, Vincent JL. Microvascular blood flow is altered in patients with sepsis. Am J Respir Crit Care Med 2002: 166(1): 98-104), 이는 30 초 내에 혈관 내 적혈구의 통과 유무에 따라 적혈구가 통과하면 1, 통과하지 않으면 0으로 기능적 모세혈관의 수를 계산하는 것이었다. 종래 기능적 모세혈관 밀도 측정 방식은 하나의 모세혈관에서 30 초 내에 하나의 적혈구가 지나가는 경우와 수백 개의 적혈구가 지나가는 경우 모두 동일한 기능적 모세혈관의 밀도로 계산하기 때문에 실제로 기능성에 차이가 있음에도 불구하고, 이를 구분하지 못하는 한계가 있다. 또한, 폐 내 모세혈관은 그물망 구조의 형태를 가지고 있기 때문에 실제로 각 모세혈관의 시작과 끝 부분을 정확히 아는 것은 어려워 구획을 정하기 어렵고, 밀도 계산에 있어 한계가 존재할 수 밖에 없다. 나아가, 기능적 모세혈관의 밀도를 측정하는 방식은 실제로 육안으로 한 눈에 기능적 모세혈관을 확인하기 어려운 문제가 있어, 미세순환계에서 기능적 모세혈관의 밀도를 확인하는 방식이 많이 사용되었으나, 숫자로만 표현하는 방식들이 대부분이고, 이미지로 기능적 모세혈관의 변화를 보여주는 방식은 전무하였다.
이에, 본 발명자들은 밀도가 아닌 면적을 기반으로 한 개체의 미세순환 정량화 방법에 대한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하고, 전체 모세혈관의 면적에 대한 기능적 모세혈관의 면적의 비율인 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 기반으로 개체의 미세순환을 정량화하는 방법 및 장치, 해당 방법을 수행하는 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 개체의 미세순환 정량화 방법에 따라 계산된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 이용하여 개체의 미세순환 장애 여부를 빠르고 정확하게 판단할 수 있는 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법 및 장치, 해당 방법을 수행하는 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 개체의 미세순환 정량화 방법으로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계; 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 단계; 및 하기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 계산하는 단계;를 포함하는, 미세순환 정량화 방법을 제공한다.
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
다른 측면에서, 본 발명은, 개체의 미세순환 측정 장치로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지에 기초하여 상기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 개체의 미세순환 측정 장치를 제공한다. 구체적으로, 해당 장치는 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및 상기 촬영부에서 촬영된 이미지에 기반하여 상기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 계측부;를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 상기 개체의 미세순환 정량화 방법에 따라 계산된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)로부터 개체의 미세순환 장애 여부를 진단하기 위한 정보를 추출하는 단계를 포함하는, 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법 및 장치를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 하드웨어와 결합되고 상기 미세순환 정량화 방법 또는 상기 개체의 미세 순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법을 실행하도록 구현되어 컴퓨터로 판독 가능한 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명은, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하고, 전체 모세혈관의 면적에 대한 기능적 모세혈관의 면적의 비율인 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 기반으로 개체의 미세순환을 정량화하는 것에 관한 것으로, 이를 이용하면 밀도가 아닌 면적의 개념으로 미세순환을 정량화할 수 있어 하나의 적혈구가 지나가는 영역과 다수의 적혈구가 지나가는 영역을 차별화할 수 있다.
이를 통해 실제 적혈구가 지나가는 공간(영역)을 반영할 수 있어 보다 쉽고 간편하며 정확하게 미세순환을 정량화할 수 있고, 밀도 개념으로 정량화하기에 어려운 그물망 형태의 미세순환을 정량화할 수 있는 우수한 효과가 있다.
나아가, 한 장의 이미지로 전체 모세혈관의 영역 중 기능적 모세혈관의 영역이 차지하는 비율을 예컨대 눈으로도 확인할 수 있어, 기능적 모세혈관의 위치, 보다 더 많은 적혈구가 통과하는 모세혈관의 위치를 편리하게 확인할 수 있으며, 상기 정량화된 결과를 바탕으로 미세순환 장애 여부를 정확하고 빠르게 판단할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, DiD-라벨링된 적혈구의 양자면역전달(adoptive transfer)를 이용한 폐 미세순환 시각화를 위한 생체 내 폐 이미징 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 폐 손상 마우스 모델의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 상기 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도로서, 도 2의 Time sequence는 형광 염색된 적혈구가 지나가는 각각의 시간대(0.000 sec, 0.033 sec 및 0.066 sec)에서의 이미지를 나타내며, 도 2의 Merge는 상기 각각의 시간대를 합한 이미지이다. 도 2에서 초록색은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 폐 모세혈관에서 덱스트란 염료로 형광 염색된 혈관 구조(전체 모세혈관)를 나타내고, 붉은색은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 폐 모세혈관에서 DiD-라벨링된 적혈구(기능적 모세혈관)를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 시간 영역별(90 프레임, 180 프레임, 360 프레임, 600 프레임)로 적혈구가 지나가는 공간을 합하여 계산한 기능적 모세혈관의 분율을 전체 모세혈관의 영역과 대비하여 그려진 도이다. 도 3에서 초록색(Capillary)은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 폐 모세혈관에서 덱스트란 염료로 형광 염색된 혈관 구조(전체 모세혈관)를 나타내고, 붉은색(Functional)은 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 폐 모세혈관에서 DiD-라벨링된 적혈구(기능적 모세혈관)를 나타내며, Merge는 상기 기능적 모세혈관 및 전체 모세혈관 영역을 합한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 손상 마우스 모델의 시간 영역별로 적혈구가 지나가는 공간을 합하여 계산한 기능적 모세혈관의 분율을 나타낸 그래프이다. 도 4의 x 축은 시간별로 투사된 프레임의 수, y 축은 기능적 모세혈관의 분율(%)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 모델(PBS) 및 폐 손상 마우스 모델(LPS)의 미세순환을 촬영한 이미지로서, 전체 모세혈관, 기능적 모세혈관을 나타낸 도이다. 도 5에서 초록색(Capillary)는 폐 모세혈관에서 덱스트란 염료로 형광 염색된 혈관 구조(전체 모세혈관)를, 붉은색(Functional)은 DiD-라벨링된 적혈구(기능적 모세혈관, Functional, 붉은색)를, Merge는 상기 전체 모세혈관 및 기능적 모세혈관 영역을 합한 것을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 모델(PBS) 및 폐 손상 마우스 모델(LPS)의 전체 모세혈관 면적(도 6a), 기능적 모세혈관 분율(FCR, 도 6b), 동맥 내 산소 분압(도 6c) 및 이산화탄소 분압(도 6d)를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 "부", "모듈", "장치", "시스템" 등의 용어는 하드웨어뿐만 아니라 해당 하드웨어에 의하여 구동되는 소프트웨어의 조합을 지칭할 수 있다. 예컨대, 하드웨어는 CPU 또는 다른 프로세서(processor)를 포함하는 데이터 처리 기기일 수 있다. 또한, 하드웨어에 의해 구동되는 소프트웨어는 실행중인 프로세스, 객체(object), 실행파일(executable), 실행 스레드(thread of execution), 계산 프로그램(program) 등의 프로그램일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 개체의 미세순환 정량화 방법으로서, 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계; 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 단계; 및 하기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 계산하는 단계;를 포함하는, 미세순환 정량화 방법을 제공한다.
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
상기 미세순환(microcirculation)은 모세동맥, 모세정맥, 모세혈관, 모세림프관 등의 소혈관에서 볼 수 있는 혈액순환으로서 미소순환 또는 모세순환이라고도 하며, 조직 가운데서 물질 대사의 중심이 되는 곳이고 필요한 물질의 공급과 배출이 행해진다. 본 발명의 일 측면에 있어서 미세순환은 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 측정되는 기능적 모세혈관의 면적에 기반하여 미세순환을 정량화할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 예를 들어 폐 내 미세순환, 안구 내 미세순환, 신장 내 미세순환, 피부 내 미세순환일 수 있으며, 상기 피부는 손, 발 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 개체는 미세순환 정량화를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 구체적으로 상기 개체는 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 개체는 미세순환 장애, 미소순환 장애, 모세순환 장애 또는 말초순환 장애를 갖는 개체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체의 모세혈관은 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정하여 미세순환을 정량화할 수 있는 모세혈관이라면 제한되지 않으며, 개체의 폐, 신장, 피부 및 안구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모세혈관일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체의 미세순환 정량화는 개체의 미세순환의 순환 정도를 정량화하는 것을 의미한다.
상기 개체의 미세순환 정량화 방법은 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 혈류 내 타겟 요소는 개체의 미세순환의 모세혈관을 통과하는 요소로서, 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지로부터 상기 타겟 요소가 이동하는 면적, 예를 들어 기능적 모세혈관의 면적을 측정함으로써 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출할 수 있다. 이 때, 상기 혈류 내 타겟 요소는 미세순환을 따라 이동하는, 개체의 모세혈관을 통과하는 요소일 수 있고, 구체적으로 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류의 속도 또는 혈류량을 실질적으로 반영할 수 있는 혈액의 구성 요소일 수 있으며, 보다 구체적으로 백혈구, 적혈구, 혈소판 및 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 혈류 내 타겟 요소는 이동 이미지를 수득할 수 있도록 표지(label)된 것이면 그 표시의 종류는 제한되지 않으며, 구체적으로 상기 표지는 형광 염색, 유전자변이 프로브(transgenic probe) 및 항체 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 유전자변이 프로브는 CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 보다 구체적으로 상기 항체 표지는 형광 프로브(fluorescent probe)가 결합된 형태일 수 있으며, 예를 들어 Alexa 405, Alexa 488, Alexa 555 및 Alexa 647로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 프로브가 결합된 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈류 내 타겟 요소가 적혈구인 경우 Vybrant DiD (V22887, ThermoFisher Scientific)으로 형광 염색하여 이의 복수의 이동 이미지로부터 적혈구가 이동하는 면적(기능적 모세혈관의 면적)을 측정함으로써 미세순환을 정량화하였다.
상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1/900 초 내지 1 초의 시간 차이로 촬영된 복수의 이미지일 수 있다. 예를 들어, 상기 복수의 이미지가 하나의 시점(T)을 기준으로 상기 시점(T)의 이미지(M) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T-1, T+1)의 이미지(M-1, M+1)인 경우, 상기 촬영된 3개의 이미지(M-1, M, M+1)는 각각 동일한 시간 차(t)의 연속적인 제 1 시점(T-1), 제 2 시점(T) 및 제 3 시점(T+1)의 이미지를 각각 나타내므로, 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에는 각각 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로가 나타날 수 있다. 이로부터 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정함으로써 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출할 수 있고, 구체적으로는, 시간 차(t)를 두고 촬영된 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에서 각각 나타난 동일한 타겟 요소를 판별함으로써, 기능적 모세혈관의 면적을 측정할 수 있다.
상기 3개의 영상(M-1, M, M+1)을 촬영하는 시간 차(t)는 1/900 초 내지 1 초일 수 있고, 구체적으로 1/300 초 내지 1/3 초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1/900 초 이상, 1/800 초 이상, 1/700 초 이상, 1/600 초 이상, 1/500 초 이상, 1/ 400 초 이상, 1/300 초 이상, 1/200 초 이상, 1/100 초 이상, 1/90 초 이상, 1/80 초 이상, 1/70 초 이상, 1/60 초 이상, 1/50 초 이상, 1/45 초 이상, 1/40 초 이상, 1/35 초 이상, 1/30 초 이상, 1/25 초 이상, 1/20 초 이상, 1/15 초 이상, 1/10 초 이상 또는 1/5 초 이상일 수 있고, 1 초 이하, 1/5 초 이하, 1/10 초 이하, 1/15 초 이하, 1/20 초 이하, 1/25 초 이하, 1/30 초 이하, 1/35 초 이하, 1/40 초 이하, 1/45 초 이하, 1/50 초 이하, 1/60 초 이하, 1/70 초 이하, 1/80 초 이하, 1/90 초 이하, 1/100 초 이하, 1/200 초 이하, 1/300 초 이하, 1/400 초 이하, 1/500 초 이하, 1/600 초 이하, 1/700 초 이하, 1/800 초 이하 또는 1/900 초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 정량화할 수 있는 시간 차이라면 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속도로 촬영된 복수의 이미지일 수 있고, 상기 프레임 속도는 구체적으로 3 내지 300 프레임/초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1 프레임/초 이상, 5 프레임/초 이상, 10 프레임/초 이상, 15 프레임/초 이상, 20 프레임/초 이상, 25 프레임/초 이상, 30 프레임/초 이상, 35 프레임/초 이상, 40 프레임/초 이상, 45 프레임/초 이상, 50 프레임/초 이상, 60 프레임/초 이상, 70 프레임/초 이상, 80 프레임/초 이상, 90 프레임/초 이상, 100 프레임/초 이상, 200 프레임/초 이상, 300 프레임/초 이상, 400 프레임/초 이상, 500 프레임/초 이상, 600 프레임/초 이상, 700 프레임/초 이상 또는 800 프레임/초 이상일 수 있고, 900 프레임/초 이하, 800 프레임/초 이하, 700 프레임/초 이하, 600 프레임/초 이하, 500 프레임/초 이하, 400 프레임/초 이하, 300 프레임/초 이하, 200 프레임/초 이하, 100 프레임/초 이하, 90 프레임/초 이하, 80 프레임/초 이하, 70 프레임/초 이하, 60 프레임/초 이하, 50 프레임/초 이하, 45 프레임/초 이하, 40 프레임/초 이하, 35 프레임/초 이하, 30 프레임/초 이하, 25 프레임/초 이하, 20 프레임/초 이하, 15 프레임/초 이하, 10 프레임/초 이하 또는 5 프레임/초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 정량화할 수 있는 프레임 속도라면 이에 제한되는 것은 아니다..
상기 복수의 이미지는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope), 형광 현미경(Fluorescence microscopy), 이광자현미경(Two-photon microscopy) 또는 삼광자 현미경(Three-photon microscopy)에 의해 촬영된 이미지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체의 미세순환 정량화 방법은 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 기능적 모세혈관(functional capillary)은 모세혈관 중 모세혈관의 기능, 예를 들어 확산에 의해 혈액과 조직 사이에서 산소, 이산화탄소, 영양분 및 기타 물질을 교환하는 기능이 원활히 일어나는 모세혈관을 의미한다. 상기 기능적 모세혈관은 백혈구, 적혈구, 혈소판, 림프구 등의 혈류 내 타겟 요소가 이동하는, 또는 통과하는 모세혈관일 수 있다. 전체 모세혈관 중 기능적 모세혈관이 많을수록 개체의 미세순환이 원활하거나 미세순환 장애가 없다는 것을 의미한다.
상기 기능적 모세혈관 면적 측정은 상기 복수의 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것일 수 있고, 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간 차에 따른 위치 차이로부터 이동 면적을 측정함으로써 계산되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 복수의 이동 이미지 각각으로부터 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로를 측정하고, 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 시간 차(t)를 갖고 촬영된 이미지를 바탕으로 복수의 이미지들을 상호간에 비교함으로써, 동일한 혈류 내 타겟 요소를 용이하게 판별 및 추적하여 단일 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로를 측정하고, 이와 동일한 방법으로 수득한 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 혈류 내 타겟 요소를 적혈구로 하여 이를 형광 염색하고 각각의 시간대(0.000초, 0.033초 및 0.066초)별로 동일한 적혈구의 이동 이미지를 수득하여 상기 동일한 적혈구의 복수의 이동 이미지를 합한 경우, 모세혈관을 통해 이동하는 적혈구의 이동 경로를 측정할 수 있다(실험예 1 및 도 2). 또한, 상기와 같은 방법으로 복수의 적혈구 이동 경로를 합하여 기능적 모세혈관의 면적을 측정할 수 있다(실험예 2 및 도 3).
상기 개체의 미세순환 정량화 방법은 하기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 계산하는 단계;를 포함할 수 있다.
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
상기 미세순환 정량화는 상기 식 1에 의한 기능적 모세혈관 분율 계산에 의할 수 있다. 상기 미세순환 정량화는 밀도가 아닌 면적의 개념으로 미세순환을 정량화할 수 있어 하나의 적혈구가 지나가는 영역과 다수의 적혈구가 지나가는 영역을 차별화할 수 있으며, 이를 통해 실제 적혈구가 지나가는 공간(영역)을 반영할 수 있어 보다 쉽고 간편하며 정확하게 미세순환을 정량화할 수 있고, 밀도 개념으로 정량화하기에 어려운 그물망 형태의 미세순환을 정량화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 전체 모세혈관 면적은 Tie2 또는 덱스트란 신호에 의해 감지된 혈관 면적을 전체 모세혈관 면적으로, DiD 로 염색된 적혈구가 이동하는 면적을 기능적 모세혈관 면적으로 하여 상기 식 1에 의하여 기능적 모세혈관 분율을 계산하였으며, 이를 통해 개체의 미세순환을 정량화할 수 있음을 확인하였다(실험예 2, 및 도 3 및 4).
다른 측면에서, 본 발명은 개체의 미세순환 측정 장치로서, 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지에 기초하여 상기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 개체의 미세순환 측정 장치를 제공한다. 구체적으로, 해당 장치는 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및 상기 촬영부에서 촬영된 이미지에 기반하여 하기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 계측부;를 포함할 수 있다. 상기 개체, 미세순환, 혈류 내 타겟 요소, 이미지, 미세순환 정량화에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
상기 개체의 미세순환 측정은 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터에 의해 측정되는 것일 수 있으며, 상기 미세순환에 대한 정량적인 데이터는 상기 식 1에 의한 기능적 모세혈관 분율을 계산함으로써 도출되는 것일 수 있다.
상기 촬영부는 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 촬영할 수 있고, 만일, 하나의 시점(T)을 기준으로 상기 시점(T)의 이미지(M) 및 동일한 시간 차(t)의 전후 시점(T-1, T+1)의 이미지(M-1, M+1)를 각각 촬영한 것인 경우, 상기 촬영된 3개의 영상(M-1, M, M+1)은 각각 동일한 시간 차(t)의 연속적인 제 1 시점(T-1), 제 2 시점(T) 및 제 3 시점(T+1)의 이미지를 각각 나타내므로, 3개의 이미지(M-1, M, M+1)에는 각각 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로가 나타날 수 있다. 이로부터 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정함으로써 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출할 수 있고, 구체적으로는, 시간 차(t)를 두고 촬영된 3개의 영상(M-1, M, M+1)에서 각각 나타난 동일한 타겟 요소를 판별함으로써, 기능적 모세혈관의 면적을 측정할 수 있다.
상기 3개의 이미지(M-1, M, M+1)를 촬영하는 시간 차(t)는 1/900 초 내지 1 초일 수 있고, 구체적으로 1/300 초 내지 1/3 초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1/900 초 이상, 1/800 초 이상, 1/700 초 이상, 1/600 초 이상, 1/500 초 이상, 1/ 400 초 이상, 1/300 초 이상, 1/200 초 이상, 1/100 초 이상, 1/90 초 이상, 1/80 초 이상, 1/70 초 이상, 1/60 초 이상, 1/50 초 이상, 1/45 초 이상, 1/40 초 이상, 1/35 초 이상, 1/30 초 이상, 1/25 초 이상, 1/20 초 이상, 1/15 초 이상, 1/10 초 이상 또는 1/5 초 이상일 수 있고, 1 초 이하, 1/5 초 이하, 1/10 초 이하, 1/15 초 이하, 1/20 초 이하, 1/25 초 이하, 1/30 초 이하, 1/35 초 이하, 1/40 초 이하, 1/45 초 이하, 1/50 초 이하, 1/60 초 이하, 1/70 초 이하, 1/80 초 이하, 1/90 초 이하, 1/100 초 이하, 1/200 초 이하, 1/300 초 이하, 1/400 초 이하, 1/500 초 이하, 1/600 초 이하, 1/700 초 이하, 1/800 초 이하 또는 1/900 초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 측정할 수 있는 시간 차이라면 이에 제한되지 않는다.
또는, 상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속도로 촬영된 복수의 이미지일 수 있고, 상기 프레임 속도는 구체적으로 3 내지 300 프레임/초일 수 있으며, 보다 구체적으로 1 프레임/초 이상, 5 프레임/초 이상, 10 프레임/초 이상, 15 프레임/초 이상, 20 프레임/초 이상, 25 프레임/초 이상, 30 프레임/초 이상, 35 프레임/초 이상, 40 프레임/초 이상, 45 프레임/초 이상, 50 프레임/초 이상, 60 프레임/초 이상, 70 프레임/초 이상, 80 프레임/초 이상, 90 프레임/초 이상, 100 프레임/초 이상, 200 프레임/초 이상, 300 프레임/초 이상, 400 프레임/초 이상, 500 프레임/초 이상, 600 프레임/초 이상, 700 프레임/초 이상 또는 800 프레임/초 이상일 수 있고, 900 프레임/초 이하, 800 프레임/초 이하, 700 프레임/초 이하, 600 프레임/초 이하, 500 프레임/초 이하, 400 프레임/초 이하, 300 프레임/초 이하, 200 프레임/초 이하, 100 프레임/초 이하, 90 프레임/초 이하, 80 프레임/초 이하, 70 프레임/초 이하, 60 프레임/초 이하, 50 프레임/초 이하, 45 프레임/초 이하, 40 프레임/초 이하, 35 프레임/초 이하, 30 프레임/초 이하, 25 프레임/초 이하, 20 프레임/초 이하, 15 프레임/초 이하, 10 프레임/초 이하 또는 5 프레임/초 이하일 수 있으나, 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 미세순환을 정량화할 수 있는 프레임 속도라면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 촬영부는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope), 형광 현미경(Fluorescence microscopy), 이광자현미경(Two-photon microscopy) 또는 삼광자 현미경(Three-photon microscopy)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 계측부는 상기 촬영부에서 촬영된 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간 차에 따른 위치 차이로부터 이동 면적을 측정함으로써 기능적 모세혈관의 면적을 측정하고, 상기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율을 계산하는 것일 수 있다. 구체적으로 혈류 내 타겟 요소의 복수의 이동 이미지 각각으로부터 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로를 측정하고, 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 시간 차(t)를 갖고 촬영된 이미지를 바탕으로 복수의 이미지들을 상호간에 비교함으로써, 동일한 혈류 내 타겟 요소를 용이하게 판별 및 추적하여 단일 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로를 측정하고, 이와 동일한 방법으로 수득한 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정하여 상기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율을 계산하는 것일 수 있다. 이러한 이동 경로에 따른 이동 면적 측정을 위하여 예컨대 이동 경로 상의 픽셀 분석을 통해 면적을 구할 수 있다. 참고로, 아래 실시예에서는 ImageJ와 같은 분석 프로그램을 이용하였다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 개체의 미세순환 정량화 방법에 따라 계산된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)로부터 개체의 미세순환 장애 여부를 진단하기 위한 정보를 추출하는 단계를 포함하는, 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 상기 개체의 미세순환 정량화 방법, 기능적 모세혈관 분율, 미세순환에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 계산된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)로부터 개체의 미세순환 장애 여부를 진단하기 위한 정보를 추출하는 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 장치를 제공한다. 해당 장치는 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지에 기초하여 상기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 미세순환 정량화 부; 및 상기 도출된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)에 근거하여 미세순환 장애 여부를 결정하는 미세순환 장애 판별 부;를 포함할 수 있다.
상기 미세순환 장애는 미세순환이 정상이 아닌 경우를 말하며, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 림프구 등의 혈류 내 타겟 요소가 모세혈관을 원활하게 통과하지 못하여 미세순환이 정상적으로 이루어지지 않는 것을 의미한다. 구체적으로 상기 미세순환 장애는 기능적 모세혈관 분율이 미세순환 장애가 없는 정상군의 기능적 모세혈관 분율의 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하인 것일 수 있고, 또는 상기 미세순환 장애는 기능적 모세혈관 분율이 0.4 이하, 0.38 이하, 0.36 이하, 0.34 이하, 0.32 이하, 0.3 이하, 0.28 이하, 0.26 이하, 0.24 이하, 0.22 이하, 0.2 이하, 0.18 이하, 0.16 이하, 0.14 이하, 0.12 이하, 0.1 이하, 0.08 이하, 0.06 이하, 0.04 이하 또는 0.02 이하일 수 있으나, 상기 미세순환 장애 여부를 판단하기 위한 기능적 모세혈관 분율의 범위는 미세순환 장애 여부를 측정하는 모세혈관이 분포한 개체의 장기의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기 범위에 제한되는 것이 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 모델(PBS 처리)과 LPS 처리로 인해 패혈증이 유발되어 급성 폐 손상을 가진 마우스 모델은 전체 모세혈관 면적은 차이가 없으나, 대조군 모델에 비해 급성 폐 손상 마우스 모델의 적혈구가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적이 급격히 감소하여 기능적 모세혈관 분율(FCR)이 50% 이상 감소하였는바(실험예 3, 및 도 6a 및 도 6b), 본 발명의 일 측면에 따른 방법에 의해 기능적 모세혈관 분율을 측정함으로써 개체의 미세순환 장애 여부를 쉽고 편리하게 진단할 수 있는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
한편, 하기 실시예 및 실험예에서의 모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 표준 지침에 따라 수행되었고, KAIST (프로토콜 No. KA2014-30 및 KA2016-55)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았다.
[ 실시예 1] 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델 준비
미세순환을 정량화하기 위해, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델을 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
본 실시예에서 사용된 모든 마우스는 12시간 : 12시간(12:12h)의 명:암 주기(light:dark cycle) 하에서 환기가 되고 온도(22.5 ℃)와 습도(52.5%)가 조절된 우리에 개별적으로 수용되었고 표준 식단과 물을 임의로(ad libitum) 제공하였다. 생후 8 내지 20주 된 수컷 마우스 (20 ~ 30 g)을 실험군으로 하였다. C57BL/6N 마우스는 OrientBio 사(대한민국, 수원)에서, Tie2-GFP 마우스 (Stock No. 003658, Jackson Laboratory)는 Jackson Laboratory에서 구입하였고, 상기 Tie2-GFP 마우스에서 GFP는 내피(endothelium)-특이적인 Tie2 프로모터 하에서 발현된다. LysMGFP /+ 마우스는 미국 로체스터 대학(University of Rochester)의 김민수 교수로부터 제공받았다.
상기 Tie2-GFP 마우스에 고용량의 LPS 를 투여한 마우스 모델을 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI) 마우스 모델로 하여 하기 실험을 수행하였다.
상기 고용량의 LPS 투여 모델의 경우, 모세혈관 촬영 3 내지 6 시간 전, 상기 Tie2-GFP 마우스에 LPS (10 mg/kg, E.coli 혈청형 055:B5, L2880, Sigma-Aldrich)를 복막(peritoneum)에 복강 내 투여하였다. 대조군으로는 동량의 PBS를 복막에 주사한 마우스를 준비하였다.
[ 실시예 2] 적혈구와 혈관 구조 염색 및 생체 내 폐 이미징
(1) 적혈구와 혈관 구조 염색
In vivo 상에서 미세순환을 촬영하기 위해, 상기 실시예 1의 마우스 모델의 적혈구(erythrocyte) 및 혈관 구조(vasculature)을 형광 염색하였다. 구체적으로, 적혈구는 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 수득하고, 그런 다음으로 제품 정보 시트에 기재된 방법에 따라 라벨링하였다. 이 때, 적혈구는 Vybrant DiD (V22887, ThermoFisher Scientific)으로 형광 라벨링하였다. 그런 다음 촬영 직전에 상기 실시예 1의 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델의 꼬리 정맥의 혈관 카테터를 통해 상기 5천만 카운트(count)의 DiD-라벨링된 적혈구를 주입하여 양자면역전달(adoptive transfer)을 수행하였다.
또한, 형광 염료로 혈관을 시각화하기 위해, 덱스트란 염료(extran dye)가 결합된 FITC (분자량 2M Da, Sigma-Aldrich) 또는 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine, TMR)을 상기 실시예 1의 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델에 상기와 동일한 혈관 카테터를 통해 주입하였다.
상기 마우스 모델에 DiD-라벨링된 적혈구, 덱스트란 염료가 결합된 FITC 또는 TMR을 주입하는 과정은 하기 생체 내 폐 이미징에 설명되었다.
(2) 생체 내 폐 이미징
다음과 같이 생체 내 폐 이미징을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1의 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델, 대조군 마우스 모델 및 정상군(Sham group) 마우스 모델을 케타민(Ketamine)(80 mg/kg) 및 질라진(Xylazine)(12 mg/kg)으로 마취한 후, 라이트닝 가이드와이어(lightning guidewire)로 20 게이지 혈관 카테터를 사용하여 삽관을 하고 인공호흡기(MouseVent, Kent Scientific)에 연결하였다. 상기 호흡은 24~30 mmHg의 흡기압, 분당 120~130의 호흡수(respiratory rate), 및 2cmH2O의 호기말 양압(positive-end expiratory pressure, PEEP)로 세팅되어 수행되었다. 마취 상태를 유지하기 위해 2% 이소플루란(isoflurane)을 투여(delivery)하였으며, 산소 공급과 생존 상태를 모니터하기 위해 맥박 산소 측정법(pulse oximetry)를 적용하였다. 항온 시스템(RightTemp, Kent Scientific)의 열침을 직장(rectum)으로 주입하고, 피드백-조절식 열 패트(feedback-regulated heating pad)를 사용하여 체온을 37.0℃로 유지하였다. 꼬리 정맥은 상기 (1)의 염료 및 적혈구의 정맥 주입을 위해 PE-10 튜브에 부착된 30-게이지 바늘로 캐뉼러가 삽입되었다(cannulated). 그런 다음, 마우스 모델을 오른쪽으로 옆으로 누운 자세를 취하게 하고, 왼쪽 개흉술(thoracotomy)을 수행하였다. 늑골이 노출될 때까지 피부 및 근육을 절개하고, 3번째 늑골과 4번째 늑골 사이를 절개하여 흉막(pleura)을 노출시켰다. 개흉술 후, 하기 실험예의 이미징 윈도우를 흉막 표면에 적용하고, 폐 이미징 윈도우에 연결된 튜브를 통해 펌프(DOA-P704-AA, GAST) 및 조절기(NVC 2300a, EYELA)로 음의 흡기 압력(negative suction pressure)을 가하였다.
[ 실험예 1] 폐 미세순환 촬영
폐 이미징 윈도우(pulmonary imaging window)를 통해 in vivo 상 폐 미세순환을 시각화하기 위해, 맞춤형 비디오-속도 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템(custom-built video-rate laser-scanning confocal microscopy system)을 구현하였다.
이미징 시스템
구체적으로, 3 종의 연속 레이저 모듈 (488 nm (MLD488, 코볼트), 561 nm (Jive, 코볼트), 640 nm (MLD640, 코볼트)의 파장)을 다색 형광 이미징(imaging)을 위한 여기 경량 광원(excitation light source)으로 활용하였다. 레이저 빔은 다이크로닉 빔 분리장치(diachronic beam splitter)(DBS1; FF593-Di03, DSB2; FF520-Di02, Semrock)에 의해 동일 선상으로(collinearly) 통합되었으며, 다지점(multi-edge) 다이크로닉 빔 분리장치(DBS3; Di01-R405/488/561/635, Semrock)에 의해 레이저-빔 스캐너로 전송되었다. 상기 레이저 스캐닝부는 36 개의 측면(MC-5, 알루미늄 코팅, Lincoln Laser)이 있는 회전 다각형 거울을 사용한 X축 스캐닝과 검류계 스캐닝 거울(galvanometer scanning mirror)(6230H, Cambridge Technology)를 사용한 Y축 스캔 등 2개의 축으로 구성되었다. 상용화된 대물렌즈(LUCPLFLN, 20X, NA 0.45, Olympus, LUCPLFLN, 40X, NA 0.6, Olympus, LCPLFLN100XLCD, 100X, NA 0.85, Olympus)를 통해 상기 실시예 1의 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델의 폐로 2차원 래스터(raster) 스캐닝 레이저 빔을 옮겼다. 상기 대물렌즈에 의해 XYZ 변환 3D 단계(3DMS, Sutter Instrument)에서 상기 마우스 모델의 폐에서 방출된 형광 신호를 미리 감지하였다. 스캐닝되지 않은(de-scanned) 3색 형광 신호를 다이크로닉 빔 분리장치(DBS4; FF560-Di01, DBS5; FF649-Di01, Semrock)로 스펙트럼으로 분할한 다음, 대역필터(band pass filter)(BPF1; FF02-525/50, BPF2; FF01-600/37, BPF3; FF01-685/40, Semrock)를 통해 광전자 증배관(photomultiplier)(PMT; R9110, Hamamatsu)으로 검출하였다. 각각의 PMT의 전압 출력은 10 MHz의 샘플링 속도에서 8 비트 해상도(resolution)를 갖는 3-채널 프레임 그래버(frame grabber)(Solios, Matrox)에 의해 디지털화되었다. Matrox Imaging Library(MIL9, Matrox)와 Visual C#을 기반으로 한 맞춤형 영상 소프트웨어를 사용하여 30 Hz의 프레임률(frame rate)과 512 X 512 픽셀의 프레임 크기로 영상 속도의 영화가 실시간으로 표시되고 기록되었다.
이미지 처리
상기 이미징 시스템을 이용하여 촬영된 이미지는 프레임 당 512 X 512 픽셀의 초당 30 프레임의 획득 속도로 표시되고 저장되었다. 실시간 이미지 프레임은 대조도(contrast) 및 신호-대-노이즈 비율(signal-to-noise ratio)을 개선하기 위해 MATLAB (Mathworks) 코드를 사용하여 평균 30 프레임 이상을 얻었다. 운동 인공물(motion artifact)를 최소화하기 위해, 평균화 전에 각 프레임을 이미지 등록 알고리즘(image registration algorithm)으로 처리하였다. 3차원 재구성을 이용한 이미지 렌더링(rendering), 적혈구 및 중성구의 트랙 분석, 트랙 변위 표시는 IMARIS 8.2(Bitplane)로 실시하였다.
상기 실시예 1의 대조군 마우스 모델의 폐 미세순환을 상기 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 상기 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과는 도 2와 같다.
도 2 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 미세순환 정량화 방법, 및 미세순환 측정 장치를 이용하면 빠른 속도로 이동하는 적혈구(DiD-라벨링된 적혈구)를 GFP로 라벨링된 폐 모세혈관 내부에서 선명하게 볼 수 있어, 모세혈관을 통해 이동하는 적혈구의 복수의 이동 이미지를 얻을 수 있으며, 적혈구 각각의 이동 궤적(flowing trajectory)과 속도에 대한 공간적 정보를 획득할 수 있다.
[ 실험예 2] 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 기반으로 한 미세순환 정량화
기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 기반으로 개체의 미세순환을 정량화하기 위해, 상기 실험예 1의 이미징 시스템 및 이미지 처리를 통해 수득한 모세혈관에서 이동하는 DiD-라벨링된 적혈구의 실시간 영상을 사용하여 기능적 모세혈관 이미지를 분석하였다. 영상의 색상을 분할한 후, DiD를 검출하는 채널의 순차 이미지를 반경 2 픽셀의 중간값 필터(median filter)로 처리하여 신호-대-노이즈 비율을 증가시켰다. 적혈구에 의해 관류되는 기능적 모세혈관을 보여주기 위해 600 내지 900 프레임 (20 내지 30 초)의 최대 투사 강도(maximal intensity projection)를 생성하였다. 기능적 모세혈관 분율(Functional capillary ratio, FCR)을 하기 식 1에 의해 계산하였다.
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
상기 식 1에서 전체 모세혈관 면적은 Tie2 또는 덱스트란 신호에 의해 감지된 혈관 면적이고, 기능적 모세혈관 면적은 DiD-라벨링된 적혈구가 이동하는 면적을 의미한다. 상기 기능적 모세혈관 분율을 계산하기 위한 모든 이미지 처리는 ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)에 의해 수행되었으며, 그 결과는 도 3 및 도 4와 같다.
도 4는 시간 영역별로 적혈구가 지나가는 공간을 합하여 계산한 기능적 모세혈관의 분율을 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 측면에 따른 미세순환 정량화 방법, 및 미세순환 장치를 이용하여 기능적 모세혈관 분율을 계산함으로써 미세순환을 정량화할 수 있다.
[ 실험예 3] 폐 손상 마우스 모델과 대조군의 기능적 모세혈관 분율 비교
상기 실시예 1에서 제조한 LPS 투여에 의해 패혈증이 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델과 LPS 대신 PBS를 투여한 대조군의 기능적 모세혈관 분율을 비교하였다. 대조군 마우스 모델도 상기 실험예 1 및 2와 동일한 방법으로 폐 미세순환을 촬영하고 그 이미지를 분석하였다. 그 결과, 대조군 마우스 모델과 폐 손상 마우스 모델의 적혈구의 평균 속도는 유의미한 차이가 없었으나, 폐 손상 마우스 모델은 적혈구 관류 패턴(perfusion pattern)이 극적으로 변하였다. 또한, 적혈구의 관류 영역을 정량화하기 위해 600 프레임(20초)의 순차 이미지에서 적혈구를 최대 투사 강도(maximal intensity projection)로 표시하였다.
상기 실험예 2의 식 1을 이용하여 상기 대조군 마우스 모델과 폐 손상 마우스 모델의 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 계산하였으며, 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다(n (field 개수) = 30, 마우스 1 마리당 FOV(field of view)는 10개, 각 군 별로 마우스는 3 마리, P = 0.8157, *P < 0.05, two-tailed t-test).
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군 모델의 관류(perfusion)는 광범위하고 확산된 특성을 보이는 반면, 폐 손상 마우스 모델의 관류는 더욱 집중되고 동맥 및 몇몇의 모세혈관에 겹쳐졌으며(overlapped), 대조군 모델과는 달리 급성 폐 손상 마우스 모델은 폐 모세혈관의 전체 영역 중 적혈구가 지나가지 못하는 사강(dead space, 도 5의 흰색 별)이 확인되었다.
또한, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 대조군 모델과 폐 손상 마우스 모델은 전체 모세혈관 면적은 차이가 없으나(도 6a), 대조군 모델에 비해 급성 폐 손상 마우스 모델의 적혈구가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적이 급격히 감소하여 기능적 모세혈관 분율(FCR)이 50% 이상 감소함을 확인하였다(도 6b). 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델에서 비정상적인 관류가 나타남을 의미한다.
나아가, 상기 대조군 모델과 폐 손상 마우스 모델의 동맥혈에서의 산소 분압 및 이산화탄소 분압을 측정하기 위해, 동맥혈 가스 분석을 수행하였다. 구체적으로, 22 게이지 바늘이 들어간 1 mL의 주사기를 헤파린으로 코팅하고 상기 대조군 모델(PBS, n = 6)과 폐 손상 마우스 모델(LPS, n = 16)의 심장의 좌심실에 도입하였다. 그 후 약 200 μL의 혈액이 i-STAT 소형 혈액 분석기(i-STAT handheld blood analyzer)(G3 카트리지, Abbott Point of Care Inc.)로 샘플링되고 분석되었으며, 상기 마우스 모델들을 혈액 샘플링 직후 CO2 챔버로 안락사시켰다. 상기 동맥혈 가스 분석 결과는 도 6c 및 도 6d와 같다(*P <0.05, Mann-Whitney test). 도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, 대조군 모델에 비하여 폐 손상 마우스 모델의 동맥 내 산소 분압은 감소하고(도 6c), 이산화탄소 분압은 증가하였는바(도 6d), 상기 폐 손상 마우스 모델에서의 기능적 모세혈관 분율의 감소는 저산소증(hypoxemia) 및 과탄산혈증(hypercapnia)에 따른 결과임을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 미세순환 정량화 방법, 및 미세순환 측정 장치를 이용하면 기능적 모세혈관 분율을 기반으로 in vivo 상에서 개체의 미세순환을 보다 쉽고 간편하게 정량화할 수 있으며, 상기 정량화된 결과를 바탕으로 미세순환 장애 여부를 정확하고 빠르게 판단할 수 있다.

Claims (11)

  1. 촬영부 및 계측부를 포함하는 개체의 미세순환 정량화 장치에 의해 수행되는 개체의 미세순환 정량화 방법으로서,
    상기 촬영부에 의해, 상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소의 시간에 따른 복수의 이동 이미지를 수득하는 단계;
    상기 계측부에 의해, 상기 복수의 이동 이미지로부터 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 단계; 및
    상기 계측부에 의해, 하기 식 1에 의해 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 계산하는 단계;를 포함하는, 미세순환 정량화 방법:
    [식 1]
    기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈류 내 타겟 요소는 백혈구, 적혈구, 혈소판 및 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 미세순환 정량화 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 혈류 내 타겟 요소는 형광 염색된 혈류 내 타겟 요소인, 미세순환 정량화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 시간에 따른 복수의 이동 이미지는 1 내지 900 프레임/초의 범위의 프레임 속도로 촬영된 복수의 이미지인, 미세순환 정량화 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 복수의 이미지는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscope)에 의해 촬영된 이미지인, 미세순환 정량화 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기능적 모세혈관의 면적 측정은 상기 복수의 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것인, 미세순환 정량화 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 기능적 모세혈관의 면적 측정은 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간 차에 따른 위치 차이로부터 이동 면적을 측정함으로써 계산되는 것인, 미세순환 정량화 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 개체의 모세혈관은 개체의 폐, 신장, 피부 및 안구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 모세혈관인, 미세순환 정량화 방법.
  9. 개체의 미세순환 측정 장치로서,
    상기 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟(target) 요소를 촬영하는 촬영부; 및
    상기 촬영부에서 촬영된 이미지에 기반하여 하기 식 1에 의해 개체의 미세순환에 대한 정량적인 데이터를 도출하는 계측부;를 포함하는, 미세순환 측정 장치:
    [식 1]
    기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 개체의 미세순환 정량화 방법에 따라 계산된 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)로부터 개체의 미세순환 장애 여부를 진단하기 위한 정보를 추출하는 단계를 포함하는, 개체의 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 하드웨어와 결합되어 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 개체의 미세순환 정량화 방법을 실행하도록 구현되어 컴퓨터로 판독 가능한 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램.
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