KR20200134657A - 유자 유래 항염증 화합물 및 이의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 유래의 항염증 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유자 유래 항염증 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것이다.
상기 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물은 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]

본 발명은 유자에서 분리한 신규 화합물을 항염증 분야에 이용할 수 있도록 함으로써, 유자 관련 산업 및 항염증 관련 분야 등에서 널리 활용될 수 있다. 또한, 유자로부터 에센셜 오일 등을 분리하고 남은 부산물로부터도 항염증 활성을 갖는 화합물을 획득할 수 있으므로, 산업적으로 유용하다.

Description

유자 유래 항염증 화합물 및 이의 분리방법 {Anti-inflammation Compound derived from Yuja and Isolating Method Thereof}

본 발명은 천연물 유래의 항염증 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유자 유래 항염증 화합물 및 이의 분리방법에 관한 것이다.

현대 사회에서는 의학의 발달로 인해 인간의 평균 수명이 증가하여 고령화 사회로 접어들고 있으며 그에 따른 사람들의 미용에 대한 관심과 연령이 다양해지고 있는 추세이다. 최근에는 웰빙(well-being) 열풍과 함께 식물 유래의 천연 성분에 대한 인식이 높아지고 있다. 각종 식물의 뿌리, 열매, 꽃 나무껍질, 줄기, 잎, 종자 등 약용 식물의 모든 부위로부터 유래된 한약재의 경우 예전부터 전해 내려오는 처방으로 증명된 안전성과 효능을 인정받고 있어 건강식품, 건강보조식품, 바이오 식품, 한방화장품 등 한약재를 원료로 한 다양한 제품들이 활용되고 있다. 또한 인체에 친화적으로 부작용이 낮은 천연물을 이용한 의약품 및 화장품 등 기능성 소재에 관해 많은 연구가 진행 중이다.

면역 반응의 일종인 염증반응은 미생물이나 화합물 등에 의해 유해한 자극이 가해진 후의 인체의 방어기전으로, 자극의 제거 및 손상된 조직의 수복과정까지의 모든 과정을 가리킨다. 염증반응이 만성적으로 일어날 때에는 염증매개 물질이 과도하게 분비되어 암세포의 성장을 촉진시키거나, 인슐린 저항성을 증가시켜 동맥경화를 악화시키는 등 다양한 병리학적 기전에 관여한다고 보고되어 있다. 면역체계에서 대식세포(macrophage)는 염증반응과 면역기능을 조절하며, 항상성을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다. LPS(Lipopolysaccharide)의 자극에 의해 활성이 증가하며, 이 LPS는 외부의 항원과 공유결합으로 결합된 지질과 다당류의 복합체로서 주로 그람음성균(Gram-negative bacteria)의 외막 성분으로 존재하는 내독소(endotoxin)이다. 자극에 의해 활성화된 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 및 IL-6와 같은 전 염증성 사이토카인의 분비를 촉진시킨다. 이러한 염증 매개 물질들이 형성되면 아라키돈산이 COX(cyclooxygenase)의 작용을 거쳐 류코트리엔, 트롬복산, 프로스타글란딘 등으로 바뀌는 과정 및 NO(nitric oxide)의 대량 생성에 관여함으로써 염증매개에 큰 역할을 하며, 숙주의 치명적 손상을 입힌다고 알려져 있다. 그 중 자유라디칼인 NO는 반응성이 높은 물질로 NOS(NO synthase)에 의해 L-아르기닌으로부터 생성되며, NOS는 cNOS(constitutive NOS)와 iNOS(inducible NOS)의 두 그룹으로 나누어진다. 특히 iNOS는 외부자극이나 전염증성 사이토카인 등에 의해 자극을 받게 되면, 다양한 세포에서 발현되어 NO를 다량으로 생산한다고 보고되고 있다. TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 생성에는 ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2), p38(p38 kinases), JNK(c-Jun NH₂-terminal kinase)와 같은 MARKs(mitogen-activated protein kinases), NF-κB(nuclear factor kappa B)가 관여하는 것으로 알려져 있다. 대식세포에서 LPS의 자극이 오면 MAPKs와 NF-κB가 활성화되어 각종 염증인자들의 생성을 유도시킨다. NF-κB는 면역과 염증 반응에 관계된 유전자의 발현에 중요한 역할을 한다. LPS에 의하여 NF-κB가 활성화되면 결합해 있던 Iκ-Bα(inhibitory kappa Bα)가 분해되고, 그 후 NF-κB가 세포 원형질에서 핵으로 들어가게 되어 TNF-α, IL-6 등의 사이토카인 발현의 전사인자로서 생성을 촉진시킨다. 따라서 다양한 염증성 질환들을 개선하기 위해서는 염증을 유발하는 염증인자와 염증반응에 관여하는 MAPKs와 NF-κB의 활성을 조절하는 것이 중요하다.

현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다 (Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010).

따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 천연물 유래의 새로운 약물의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2019-0044169호는 사데풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2019-0038702호는 다시마 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 개시하였으며, 한국등록특허 제1923822호는 산수유 씨앗 추출물을 포함하는 항염증 조성물을 개시하였다.

한편, 유자는 운향과 감귤속에 속하는 식물로서, 한국에서는 제주를 포함하여 고흥, 거창, 완도, 장흥, 강진, 거제 및 남해 등의 남해안 일대에서만 자생한다. 유자는 과피가 두껍고 과육을 바로 소비할 수 있는 과실의 특성이 떨어져, 식용작물로서의 한계를 가지고 있으나, 천연의 뛰어난 방향성을 지니고 있는 대중적 과실로 오랜 기간 동안 널리 이용되고 있다.

따라서, 한국등록특허 제1921193호와 같이 유자로부터 유자 에센셜 오일을 효율적으로 제조하는 방법에 대하여 주로 연구가 진행되었을 뿐, 유자의 신규 생리활성을 밝히려는 연구는 부족하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 유자로부터 분리한 화합물이 항염증 활성이 우수하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 피부 부작용을 유발하지 않으며, 피부 염증을 효과적으로 억제하는 항염증용 화합물 및 이를 포함하는 항염 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 부작용을 유발하지 않으며, 피부 염증을 효과적으로 억제하는 항염증용 화합물을 고수율로 분리하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물 또는 이를 포함하는 유자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 유자를 유기용매로 추출하여 유자 추출물을 얻는 단계; (b) 상기 유자 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키는 단계; (c) 분획된 부탄올 분획물을 물(water) 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 항염증 활성이 높은 분획물을 클로로포름, 메탄올 및 물 혼합액 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 물과 아세토니트릴 혼합액을 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물의 분리방법을 제공한다.

본 발명은 유자에서 분리한 신규 화합물을 항염증 분야에 이용할 수 있도록 함으로써, 유자 관련 산업 및 항염증 관련 분야 등에서 널리 활용될 수 있다. 또한, 유자로부터 에센셜 오일 등을 분리하고 남은 부산물로부터도 항염증 활성을 갖는 화합물을 획득할 수 있으므로, 산업적으로 유용하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유자 추출물의 분획과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유자로부터 항염 활성을 갖는 화합물 1의 분리과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따라 분리된 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과이다.(상: ¹H-NMR 스펙트럼, 하: ¹³C-NMR 스펙트럼)
도 4는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 NO 생성 저해활성을 평가한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 세포독성을 평가한 결과 그래프이다.

본 발명에서는 활용성이 제한적인 것으로 알려진 유자 또는 유자 부산물로부터 신규 생리활성물질을 갖는 화합물을 분리할 수 있음을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 유자로부터 추출물을 추출하고, 추출물을 분획한 다음, 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 단일 화합물을 분리하고, 분리된 화합물의 생리활성을 평가하였다. 그 결과 분리된 화합물이 항염 활성이 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 유자로부터 정유를 추출하고 남은 부산물을 이용하여, 메탄올로 추출한 다음, 극성에 따라 유기용매로 분획하였다. 그중 부탄올 분획물을 대상으로 HP20 레진 및 실리카겔 크로마토 그래피를 순차적으로 수행한 다음, 최종적으로 prep HPLC를 수행하여 항염 활성을 갖는 단일 화합물을 분리하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드(kaempfelrol 4'-O-β-neohesperidoside)이다.

본 발명은 다른 관점에서, 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물 또는 이를 포함하는 유자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 식품 조성물, 화장료 조성물, 또는 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은 건강식품 조성물일 수 있고, 상기 건강식품 조성물에 있어서, 상기 화합물의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 건강식품 조성물은 건강기능식품일 수 있고, 그 뿐만 아니라, 예를 들어 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류, 빵류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품과 같이 어떠한 형태의 가공식품도 포함하고, 비타민이나 미네랄 등을 포함하는 기능성 식품류일 수 있다.

상기 외에, 본 발명의 일 측면에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 일 측면에 따른 건강식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않으나 본 발명의 일 측면에 따른 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 50 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 예를 들어 피부용 또는 모발용 조성물로서, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 아이에센스, 에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디에센스, 보디세정제, 염모제, 샴푸, 린스, 정발제, 양모제, 연고, 젤, 크림, 패취, 분무제 및 피부 접착타입 등의 제형을 가질 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 각각의 제형에 있어서 상기한 필수성분 이외에 다른 성분들은 기타 외용제의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적합하게 선정하여 배합할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 마이크로 니들, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 명세서에 따른 화장료 조성물에는 본 명세서의 화합물, 추출물 또는 분획물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 본 명세서에 따른 화장료 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 명세서의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

또 다른 구현 예에 의하면, 상기 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있다. 피부 외용제 조성물은 화장료, 구강제, 세정제, 약학 및 의약외품 등의 조성물이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 피부 외용제는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없다.

또한, 본 명세서의 피부 외용제 조성물은 특별한 목적을 위한 기능성의 염(salt) 및 pH 조절을 위한 pH 조절제 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 염은 이온 차폐, 보습, 자외선 차단 등을 위한 무기염, 유기염 및/또는 유기-무기염으로부터 선택될 수 있다. 구체적인 예를 들어, 상기 염은 소듐클로라이드(NaCl), 인산나트륨(Na₃PO₄) 및 염화칼슘(CaCl₂) 등으로부터 선택될 수 있다. 상기 pH 조절제는 산(aicd)이나 염기(base)로부터 선택되며, 예를 들어 염산, 황산, 주석산, 구연산, 인산, 초산, 락틱액시드, 소듐락테이트, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 알킬 아민, 알칸올 아민 및 암모니아 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

본 명세서의 피부 외용제 조성물은 화장료, 약학 또는 의약외품 조성물일 수 있는데, 상기 화장료, 약학 또는 의약외품 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 조성물은, 로션, 크림, 연고 또는 젤 등으로 제형화될 수 있다. 상기 피부 외용제 조성물은, 경피 투여되는 것이 바람직하다.

상기 약학 또는 의약외품 조성물의 유효성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 상기 유효성분의 투여량은 0.00001mg/kg/일 내지 15mg/kg/일 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물의 적용량 또는 투여량은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있다.

상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 환제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바, 티백 등으로 제형화 될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 유자를 유기용매로 추출하여 유자 추출물을 얻는 단계; (b) 상기 유자 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키는 단계; (c) 분획된 부탄올 분획물을 물(water) 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 항염증 활성이 높은 분획물을 클로로포름, 메탄올 및 물 혼합액 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 물과 아세토니트릴 혼합액을 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물의 분리방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서, 본 발명에서 사용하는 용어 '유자'는 운향과 감귤속 후생감귤아속에 속하는 유자나무의 열매를 의미하며, 유자는 보통 노란색의 공모양이며, 껍질이 울퉁불퉁하고, 신맛이 나는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 유자 과육, 과피, 씨앗, 전과 또는 이들로부터 에센셜 오일 등을 추출 후 버려지는 부산물인 유자박을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 메탄올(methanol), 에탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산, 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 유자 분획물은 유기용매의 극성에 따라 용해되는 화합물들을 분리하는 통상의 방법으로 획득할 수 있으며, 본 발명에서는 먼저 추출한 유자 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획하여 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 획득하였다.

본 발명에서는 항염 활성이 우수한 것으로 확인된 부탄올 분획물을 대상으로 크로마토그래피 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 추가적으로 수행하여 화학식 1로 표시되는 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드를 분리하였다.

상기 크로마토그래피는 오픈 컬럼 크로마토그래피인 HP20 레진 크로마토그래피를 수행 후, 실리카 겔 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 것이 바람직하며, HP20 레진 크로마토그래피 수행시 이동상은 물(water) 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 수행시 이동상은 클로로포름:메탄올:물(200:4:1 부피비) 혼합액에 메탄올이 100%가 될 때까지 순차적으로 메탄올을 추가시키는 것이 더욱 바람직하다.

상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 수행시 이동상은 물 및 아세토니트릴(ACN)(70:30 부피비) 혼합액에 아세토니트릴(ACN)이 100%가 될 때까지 순차적으로 아세토니트릴(ACN)을 추가시키는 것이 바람직하다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유자 씨의 박 추출물 및 분획물의 제조

유자 씨 초임계 추출 부산물인 유자박(건조 중량 1083g)을 100% MeOH를 가하여 24시간을 shaking하고 필터링한 후 감압농축을 진행하여 메탄올 추출물 약 886g을 얻었다. 참고로, 상기 유자박은 한국공개특허 제2018-0117391호에 기재된 방법으로 유자로부터 정유를 추출하고 남은 부산물을 이용할 수 있다.

총 메탄올 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후, 도 1에 제시된 바와 같이 용매의 극성에 따라 n-Hexane 분획물 (171g), EtOAc 분획물 (13g), n-BuOH 분획물 (21g), 물 분획물(318g)을 얻었다.

실시예 2. 활성 화합물의 분리 및 구조 동정

2-1. 유자 씨의 박 추출물 n -BuOH 분획물로부터 화합물의 분리

실시예 1에서 획득한 유자 씨의 박 추출물의 n-BuOH 분획물을 대상으로 resin HP20을 이용한 오픈 컬럼 크로마토그래피 (MeOH : Water = 0 : 100 → 100 % MeOH)를 실시하여 극성에 따라 순차적으로 12개의 소분획 (B1 내지 B12)으로 분리하였다. 이중, 분획 B5 및 B6에 대해 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(CHCl₃:MeOH:Water=200:4:1→100% MeOH)를 실시하여 극성에 따라 순차적으로 10개의 소분획 (B5-1 내지 B5-10)을 최종적으로 얻었다.

이중 항염증 활성이 우수한 B5-5를 HPLC(물 및 아세토니트릴(ACN)의 혼합용매(70:30 부피비)→ 100 % 아세토니트릴(ACN))를 이용하여 2mL/min 유속으로 분리하면서 254 nm에서 UV검출기로 분석하여, 최종적으로 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 (2.2 mg)을 분리하였고, 상기 화합물의 용출시간은 9.961분이었다.

2-2. 화학식 1로 표시되는 화합물의 구조 동정

2-1에서 분리된 화합물의 구조 동정을 위하여, 성상, 분자량, 질량분석, ¹H-NMR스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 2-1에서 분리된 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 토대로 분자식은 C₂₇H₃₀O₁₅이고, UV 스펙트럼의 265 nm 파장에서 강한 흡수를 보여 이 화합물은 플라노보이드임을 추정할 수 있었다.

¹HNMR스펙트럼에서 δ _H 6.16 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-6), 6.37 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-8)을 통해 1개의 5, 7번이 치환된 방향족 환을 확인하였고, δ _H6.86(2H,d,J = 8.8 Hz, H-3',5'), 7.96 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2',6')을 통해 1개의 4번의 위치가 치환된 방향족환을 확인하였다. δ _H5.28(1H,d,J = 7.6 Hz, Glc-1)을 통해 1개의 글루코오즈를 확인하였고, δ _H0.96(3H,d.J = 6.0 Hz)을 통해 람노오즈의 메틸기를 확인하였고, 2D NMR 스펙트럼을 통해 각 치환체의 위치를 확인하였다.

이상의 결과로 본 발명에서 분리 및 동정한 화합물을 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드로 결정하였고, 이는 천연에서 처음 분리 보고되는 물질이다.

[화학식 1]

실험예 1: 활성 물질의 염증 억제 활성 평가

1-1. RAW 264.7 세포주의 배양

마우스 유래 대식 세포인 RAW 264.7 세포주를 한국 세포주 은행에서 구입하여, 37℃ 배양기에서 공기(95%)와 이산화산소(5%)의 혼합기체를 지속적으로 공급하며, 10% FBS, 100 IU/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지로 배양하였다. 75T 플라스크에 배양하고 80% confluent 할 때 2일 마다 교환하였다.

1-2. 염증 유도 및 항염증 활성평가

마우스 유래 대식세포 RAW 264.7을 10% FBS, 100IU/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지로 96 well plate (2×10⁵ cells/well)에 분주하고 24시간 안정화하였다. 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드를 농도 별로 처리하고 1시간 후 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리 후, 20시간 배양한 다음 NO 생성 억제능을 확인하였다.

염증반응을 유도시킨 20시간 후 상층액을 96 well plate로 100 μL씩 옮긴 후 Griess reagent A와 B를 동량으로 혼합하여 10분 동안 암실에서 상온 반응시켜 microplate reader를 이용해 540 nm 에서의 흡광을 측정하여 NO 생성 저해활성을 판단하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 도시된 바와 같이, 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드는 200 μM에서 20%의 NO 생성 저해활성을 갖는 것을 확인되었다.

1-3. 세포 생존률 측정

마우스 유래 대식세포 RAW 264.7을 1-2의 방법으로 염증반응을 유도시킨 24시간 후 serum free DMEM으로 교환하였다. MTT 용액은 1/100의 부피로 0.5 mg/mL 농도로 처리하였고, 암실의 37℃ 환경에서 2시간 후 배지를 제거하고 200μL의 DMSO를 이용해 formazan을 용해하였다. 540 nm에서의 흡광(absorbance; Abs)을 측정하고, 대조군과 비교하여 세포 생존률을 %로 계산한 후, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, 캄페롤 4'-오-베타-네오헤스페리도사이드는 50, 100, 200μM의 농도에서 90% 이상으로 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 하기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물 또는 이를 포함하는 유자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
3. 다음 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물의 분리방법:
   (a) 유자를 유기용매로 추출하여 유자 추출물을 얻는 단계;
   (b) 상기 유자 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시키는 단계;
   (c) 분획된 부탄올 분획물을 물(water) 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분획하고, 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계;
   (d) 상기 항염증 활성이 높은 분획물을 클로로포름, 메탄올 및 물 혼합액 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 항염증 활성이 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
   (e) 물과 아세토니트릴 혼합액을 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 화학식 1로 표시되는 화합물을 분리하는 단계.
   [화학식 1]
   

   

   
   
4. 제3항에 있어서, 상기 유자는 씨앗, 과피, 과육 및 전과로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물의 분리방법.
   
5. 제5항에 있어서, 상기 유자는 초임계 추출 후 부산물인 유자박인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 유자 유래 항염증 활성을 갖는 화합물의 분리방법.

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