KR20200124205A

KR20200124205A - Cd90, cd146, cd105 또는 cd73을 발현하는 태반 융모막판막 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20200124205A
Application number: KR1020200139737A
Authority: KR
Inventors: 유혜린; 박미라; 김기진
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2020-11-02
Also published as: WO2019035668A2; EP3669884B1; KR20200124199A; KR20200125555A; KR102190999B1; KR102190990B1; EP3669884A2; US11524036B2; KR20200124203A; KR20200124201A; EP3669884A4; WO2019035668A3; KR20200125556A; KR20190019032A; KR102190998B1; KR102190997B1; KR20200124204A; KR102190993B1; JP7168653B2; WO2019035668A9

Abstract

중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 갑상선 안질환 환자의 안와 섬유아세포의 비정상적인 히알루론산 생성 증가, 지방세포 분화 증가, 및 지질 축적 증가를 회복시키므로, 갑상선 안질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

CD90, CD146, CD105 또는 CD73을 발현하는 태반 융모막판막 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 조성물{A composition comprising mesenchymal stem cell derived from chorionic plate membrane expressing CD90, CD146, CD105 or CD73 for treating thyroid associated ophthalmopathy}

갑상선 안질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.

갑상선 안질환(Thyroid associated ophthalmopathy: TAO)은 갑상선 이상과 동반되어 나타나는 만성적 안와 염증질환으로서 갑상선 기능 이상 환자의 약 60%에게서 관찰된다. 갑상선 안질환 환자에게서는 일반적으로, 안와 섬유아세포의 지방세포로의 분화 증가 및 히알루론산의 증가가 관찰되며, 이에 따라 안구 주변 지방 세포의 비대, 또는 염증이 발생한다. 치료 시기를 놓치는 경우, 눈꺼풀후퇴, 안구돌출, 제한성 사시, 시력저하, 복시, 또는 시야감소 등 심각한 후유증을 유발할 수 있기 때문에 반드시 적절한 치료를 받아야 한다. 현재까지 갑상선 안질환의 치료를 위해 고농도 스테로이드, 방사선치료, 안와감압술 등을 이용하고 있으나, 그 효과가 제한적이며, 치료에 따른 부작용이나 위험성이 있다.

따라서 난치성 안와 염증 질환인 갑상선 안병증에서 새로운 치료제 개발이 절실한 형편이다.

중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

일 양상은 FOXP3(forkhead box P3), HLA-G(human leukocyte antigen G) 및 TLR4(Toll-like receptor 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하는 중간엽 줄기세포를 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 하기 a) 또는 b)의 특성을 가질 수 있다:

a) CXCL-1(chemokine (C-X-C motif) ligand 1), MCP-1(Monocyte chemotactic protein 1) 및 TIMP-1(tissue inhibitors of metalloproteinases)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하는 특성;

b) CD90, CD146, CD105 및 CD72로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 항원 특성.

본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반(placenta) 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반을 구성하는 다양한 조직, 예를 들어 양막 상피 세포, 양막, 영양막, 융모막 등의 조직으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 상기 태반 유래 중간엽 줄기세포는 태반의 융모막판(chorionic plate)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 융모막판막(chorionic plate membrane)으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 면역 사이토카인을 발현 또는 분비하는 것일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 대조군 대비, 섬유아세포 대비, 또는 다른 세포 대비 면역 사이토카인을 더 많이 발현 또는 분비하는 것일 수 있다. 상기 면역 사이토카인의 예는 CXCL-1, MCP-1, 또는 TIMP-1를 포함할 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 FOXP3, HLA-G, 또는 TLR4를 발현 또는 분비하는 것일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 대조군 대비, 섬유아세포 대비, 또는 다른 세포 대비 FOXP3, HLA-G, 또는 TLR4를 더 많이 발현 또는 분비하는 것일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래, 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포 대비 FOXP3, HLA-G, 또는 TLR4를 더 많이 발현 또는 분비하는 것일 수 있다. 상기의 발현 수준의 차이는 예를 들면 mRNA 또는 단백질 수준에서의 유전자 및 단백질의 발현량을 비교한 것일 수 있다. 또한 상기 발현 수준 차이는 예를 들면 마이크로어레이 및 프로테오믹스 분석에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 상기 인자 중 어느 하나 이상의 발현이 증가하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유전자 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포는 CXCL-1, MCP-1, 또는 TIMP-1 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, CXCL-1, MCP-1, 또는 TIMP-1 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽 줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다.

또한 상기 중간엽 줄기세포는 CD90, CD146, CD105 또는 CD72를 발현하는 것일 수 있다. 상세하게는, 본 명세서에서 제공되는 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD90, CD146, CD105 또는 CD72 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하는 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여, CD45, CD31, CD34, 또는 HLA-DR 음성 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD90에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD90+"이다. 본 명세서에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD45에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD45-"이다.

다른 양상은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.

용어 "갑상선 안질환(Thyroid associated ophthalmopathy: TAO)"은 갑상선 호르몬의 과다 분비로 인한 갑상선 기능 항진증으로 인해 발생하는 안와염증질환을 의미한다. 눈꺼풀 후퇴, 안구 돌출, 제한성 사기, 시력 저하, 복시, 시야 감소 등의 병증을 나타낼 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 대안적으로 그의 배양물, 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 배양물, 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.

상기 약학적 조성물은 안구에 투여하기 위한 것일 수 있다. 용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일, 길면 수년 이상일 수 있다.

일 구체예 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물의 투여 용량은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다. 또한, 중간엽줄기세포의 투여 용량은 1.0Х 10⁵ 내지 1.0Х 10⁸ 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 흡입, 및 주사, 점안 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 중간엽 줄기세포가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995] 등에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

또 다른 양상은 중간엽 줄기세포, 또는 그의 배양물, 용해물, 또는 추출물을 포함하는 갑상선 안질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다.

상기 건강식품 조성물은 상기 중간엽 줄기세포 이외에 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포가 갑상선 안질환 환자의 섬유아세포의 비정상적인 활성(과도한 히알루론산 생성, 지방세포분화, 및 지질축적)을 회복시킴을 확인하였으므로, 이를 포함하는 조성물은 갑상선 안질환의 치료, 예방, 또는 개선을 위한 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 약학적 조성물은 안와 섬유아세포의 비정상적인 활성을 회복시키므로, 갑상선 안질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 세포 배양 배지로부터 측정한 hPMSC의 신경-보호 사이토카인들의 수준을 나타낸다.
도 1b는 MSC임을 확인할 수 있는 마커들을 hPMSC의 표면에서 확인한 것을 나타낸다.
도 2는 정상인과 TAO 환자 눈물에 포함된 HAS, HA 및 HAdase를 면역분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 안와 섬유아세포와 hPMSC를 공배양하고, 이 때 HAS2 발현의 변화를 웨스턴 블롯으로 측정한 것을 나타낸다.
도 3b는 안와 섬유아세포와 hPMSC를 공배양하고, 이 때 HAS2 발현의 변화를 수치화 한 것을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 정상인과 환자의 안와 섬유아세포를 hPMSC와 공배양한 후, 공배양된 섬유아세포의 표면 마커의 변화를 관찰한 결과이다.
도 5는 정상인과 환자의 안와 섬유아세포를 hPMSC와 공배양한 후, PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα 의 mRNA 발현을 Real-time PCR로 분석한 결과이다.
도 6은 정상인과 환자의 안와 섬유아세포를 hPMSC와 공배양한 후, 섬유아세포의 지질 축적의 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은 일 구체예에 따른 중간엽줄기세포가 염증 유도된 세포의 면역 반응 조절 인자에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다;AD: 지방유래 중간엽줄기세포, BM: 골수유래 중간엽줄기세포, PD: 태반유래 중간엽줄기세포, WI-38: 섬유아세포; a: FOXP3, b: HLA-G, c: hTRL4; *대조군 vs. 그외: 감소, # 대조군 vs. 그외: 증가, ** 1ng vs. 10ng: 감소, ## 1ng vs. 10ng: 증가.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예

참고예 1. 태반 유래 중간엽 줄기세포의 분리

정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리한 조직 (chorioamniotic membranes) 을 50 ml tube에 넣고 DPBS를 첨가해 여분의 혈액을 제거 후 20 ml 효소 용액 I (1mg/ml collagenase type I, 2 mg/ml Trypsin, 20 mg/ml DNase I, 1.2 U/ml Dispase, x1 PS in HBSS) 에서 멸균된 슬라이드 글라스로 융모양막(chorioamniotic membranes)의 위쪽 부분을 긁어 회수되는 부유물들을 한쪽으로 모아주었다. 효소 용액 I 10ml을 넣고 고르게 섞어준 후 37℃ 효소반응을 15분간씩 2회 반복하면서, 조직으로부터 줄기세포를 분리하였다. 분리된 세포 현탁액을 원심분리하고, 분리된 세포는 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 DMEM/F12를 이용하여 배양하였으며, 이후 4일내지 5일 간격으로 배양배지를 교환하였으며, 첫 계대에서 Invitrogen사의 TrypLE를 37℃인큐베이터에서 단기간 (3분) 처리하여 계대 배양하였다

참고예 2. 안와 섬유아세포( Orbital fibroblast ) 배양 및 처리

사람으로부터 안와 섬유아세포(정상 4명, 환자 4명)를 채취하여 DMEMF12(Gibco)(10% FBS, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 배양하였다. 섬유아세포가 배지에 분포되어 자라고 2일 후, DMEM(10% FBS)에서 5 μg/ml 인슐린, 1 mM 덱사메타손, 및 0.5 mM IBMX을 첨가하여 지방 세포로의 분화가 시작되게 하였다(day 0). 72시간 후(day 3), 배지를 10% FBS 및 5 μg/ml 인슐린이 보충된 DMEM 배지로 교체하고, 그 후 격일마다 10% FBS가 보충된 DMEM 배지를 공급하였다.

참고예 3. 안와 섬유아세포( Orbital fibroblast ) 지질축적 분석

정상인과 환자의 안와 섬유아세포에 지방생성유도 분화 배지를 넣은 후 hPMSC(placenta derived mesenchymal stem cell)와 공배양 유무를 나눠 10 일간 배양하였다(초기 4 일동안 DMEM supplemented with 10% FBS, 33 uM biotin, 17 uM pantothenic acid, 0.2 nM T3, 10 μg/mL transferrin, 0.2 uM prostaglandin I2, 0.1mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 uM dexamethasone, 5 ug/ml insulin / 5-10일 동안 w/o IBMX, Dexamethaxone, Insulin). 10일 뒤 Oil-Red-O 염색을 통해 섬유아세포의 지질축적 변화를 관찰하였다.

참고예 4. 눈물 시료 채취

정상인(n=13), 및 갑상선 안질환(Thyroid associated ophthalmopathy: TAO) 환자(n=13)로부터 스키머 스트립(Schirmer strip)을 이용하여 눈물을 채취하였다. 이후 스키머 스트립을 바닥에 캐뉼라(cannula)가 있는 0.5 ml 튜브에 옮기고, 30 μL PBS를 첨가하였다. 상기 튜브의 내용물을 더 큰 튜브(1.5 ml)에 옮기고, 5분간 원심 분리를 수행하였다(13,000 rpm). 이와 같이 채취된 눈물은 -20℃에서 보관하였다.

참고예 5. Real-time PCR

배양 8 일차(day 8)에, hPMSC(2 x 10⁵)를 안와 섬유아세포와 함께 48 시간 동안 공배양하였다. 세포 용해물은 TRIzol(Invitrogen, Carlbad, CA, USA)에서 균질화하여, RNA를 추출하였다. 각각의 시료로부터의 1 μg의 총 RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. cDNA합성 조건은 아래와 같다: RNA 융해(65℃, 1분), 풀림 (25℃, 5분), 증폭(42℃, 60분) 및 효소 불활성 (85℃, 1분).

아래의 PCR 조건에 따라 각 유전자의 mRNA 발현을 증폭하여 표준화(normalization)하였다: 초기 융해(95℃, 2분), 증폭(95℃, 10초; 55℃, 20초; 및 72℃, 20초) 40 사이클. PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα, 프라이머 세트는 아래와 같다:

PPARγ FP: 5'- TTGACCCAGAAAGCGATTCC(서열번호 1)-3', RP: 5'- AAAGTTGGTGGGCCAGAATG(서열번호 2)-3'; ADIPONECTIN FP: 5'- GGCCGTGATGATGGCAGAGAT(서열번호 3)-3', RP: 5'-TTTCACCGATGTCTCCCTTAGG(서열번호 4)-3' C/EBPα FP: 5'- TGTATACCCCTGGTGGGAGA(서열번호 5) -3', RP: 5'-TCATAACTCCGGTCCCTCTG(서열번호 6)-3'. 각 유전자의 mRNA의 발현은 18s rRNA로 표준화하였다. 데이터는 정상 집단과 비교하여 지방분화 관련 인자의 배수(fold)(평균±SEM)로 표현하였다.

참고예 6. 웨스턴 블롯

RIPA 완충액을 이용하여 용해물을 준비하였다. 동량의 총 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 막에 옮겼다. 상기 막은 항-HAS1 및 HAS2(SantaCruz Biotechnology, SA, USA)로 1:1000 희석에서 면역블롯팅하였고, 같은 막을 GAPDH(SantaCruz)와 함께 배양하였다. 세척 후, 홀스래디쉬 과산화 효소-접합 항-염소 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG) 2차 항체와 함께 1:10000 희석에서 상온에서 3시간 배양하였다. 면역 반응 밴드는 향상된 화학 발광 솔루션(enhanced chemiluminescence solution)(Animal Genetics, Suwon, Korea)으로 이미지화하였고, ChemiDoc^TM XRS+ System Imager (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 검출하였다. 단백질 발현량은 GAPDH로 표준화(normalization)하였다. 데이터는 정상 집단과 비교하여 HAS2의 배수(fold)(평균±SEM)로 표현하였다.

참고예 7. 효소결합면역흡착검사(ELISA)

정상 및 TAO 환자로부터 채취한 눈물을 준비하고, 이의 히알루론산(hyaluronic acid: Ha) 및 히알루로니데이즈(hyaluronidase)(Hyal)의 수준을 ELISA로 결정하였다. 본 분석의 수행은 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다.

참고예 8. FACS 분석

인간 섬유아세포(3 x 10⁵)를 세포 해리 버퍼(Life Technologies)로 해리시키고 PBS(2%(v/v) FBS)로 세척하였다. 이를 아이소타입 대조군 IgG(isotype control IgG) 또는 항원-특이적 항체(BD Biosciences, CA, USA)와 함께 20분간 배양하고, 세포를 확인하는데 이용하였다. FACS 분류(sorting)는 FACS vantage Flow Cytometer (BD Biosciences, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.

실시예 1. 태반 유래 줄기 세포 ( placenta derived stem cell )의 특성 분석

상기 참고예 1에서 분리한 태반유래 중간엽줄기세포의 특성을 분석하기 위해, 사이토카인 분비 특성 및 표면 항원 특성을 분석하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 통해 태반유래 중간엽줄기세포의 배양 배지에서 신경 보호 사이토카인의 농도를 측정하였고, FACS 분석을 통해 태반유래 중간엽줄기세포의 표면항원(CD34, CD45, CD90, CD31, HLA-DR, CD146, CD106, 및 CD73) 특성을 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1a는 세포 배양 배지로부터 측정한 hPMSC의 신경-보호 사이토카인들의 수준을 나타낸다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, ELISA 분석 결과 hPMSC를 배양한 배양액에서 염증반응 및 상처치유에 관련된 사이토카인 (CXCL-1, MCP-1, TIMP-1)의 분비가 증가함을 확인하였다.

도 1b는 hPMSC의 표면 패턴을 나타낸다. 도 1b에 나타낸 바와 같이 FACS로 분석한 결과, 중간엽세포 마커인 CD90, CD146, CD105와 CD72가 양성으로 확인되었다.

실시예 2. TAO 환자에서 히알루론산 합성 증가의 확인

정상인 및 TAO 환자에게서 채취한 눈물(총 26개 시료)을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하고, 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase: HAS)의 양을 측정하였다. 총 10 μg 단백질을 로딩하였다. 항-HAS1 및 HAS2를 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. TAO 환자로부터 채취한 눈물에 대한 ELISA 분석 또한 실시하였다.

그 결과, 도 2a와 같이 환자의 눈물에서 정상인에 비해 히알루론산 합성효소인 HAS1과 HAS2의 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다. 도 2b에서와 같이 Ha의 수준 또한 증가한 것이 관찰되었으나, 도 2c와 같이 HAdase의 수준은 유의한 변화가 없는 것을 확인하였다.

상기와 같이 ELISA 분석 결과, TAO 환자의 눈물 내 히알루론산의 레벨은 증가하였으나 히알루론산 분해효소의 레벨은 정상인과 환자와의 차이를 볼 수 없었다. 따라서, TAO 환자에서는 히알루론산 합성효소가 증가하여 히알루론산의 생성이 증가함을 확인하였다.

실시예 3. hPMSC의 히알루론산 생성 감소 효과 확인

섬유아세포의 배양 15일차에(day 15), 안와 섬유아세포를 지방생성유도과정 중 자극제로서 IL-1β(20 ng/mL)와 함께 배양하였다. hPMSC와의 공배양 후, HAS2의 단백질 발현을 결정하였다.

도 3a와 같이, 유도과정 동안 TAO 환자의 섬유아세포에서 히알루론산 합성효소인 HAS2의 발현이 증가됨을 확인하였고, PMSC와 공배양을 통해 증가된 합성효소의 단백질 발현이 감소됨을 검증하였다.

또한 도 3b와 같이, 히알루론산 합성효소 HAS2의 단백질 발현양을 수치화 한 결과, 지방생성 유도 분화미디어에서 배양된 TAO 환자의 섬유아 세포가 IL-1β 자극으로 인해 HAS2의 단백질 발현이 약 2.3배 정도 증가함을 보였고, 이는 PMSC와 공배양을 통해 감소됨을 확인하였다.

실시예 4. hPMSC의 안와 섬유아세포 표면 항원 마커에 미치는 효과 확인

정상 및 TAO 환자에게서 채취한 안와 섬유아세포를 hPMSC와 공배양하여 일어나는 변화를 관찰하였다. 섬유아세포는 FACS로 분석하였다.

섬유아세포의 배양 15일차(day 15)에, 섬유 아세포에 IL-1β(20 ng/mL)를 처리하였다. 배양 24시간 후, hPMSC를 공배양하였다. 공배양된 섬유아세포를 CD90, 또는 CD105를 마커로 분류하였다. 또한, 섬유아세포를 현미경으로 관찰하였다.

도 4a 및 4b와 같이, 정상인과 환자 섬유아세포 마커인 CD105와 CD90 변화를 분석한 결과 hPMSC와 공배양에 의해 TAO 환자의 섬유아세포내 CD90이 변화함을 확인하였다.

실시예 5. hPMSC의 지방세포분화( adipogenesis )에 대한 효과 확인

정상 및 TAO 환자로부터 채취한 안와 섬유아세포를 4 일 동안 지방분화 유도 미디어1 (33 μM biotin, 17 μM pantothenic acid, 0.2 nM T3, 10 μg/mL transferrin, 0.2 μM prostaglandin I2, 0.1mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone, 5 ug/ml insulin)와 함께 배양 후 5 일째부터 10 일째까지 지방분화 유도 미디어2 (33 μM biotin, 17 μM pantothenic acid, 0.2 nM T3, 10 μg/mL transferrin, 0.2 μM prostaglandin I2, 0.1mM)와 함께 배양하였다. 배양 8일째, hPMSC(2 x 10⁵)와 지방분화 미디어에 배양중인 안와 섬유아세포를 48 시간 동안 공배양하였다. 이후에, 대표적인 지방세포 분화 관련 인자인 PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα 의 mRNA 발현을 상기 참고예 5에 기재된 바와 같이 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 지방분화 유도 배지에 배양한 환자의 섬유아세포내의 PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα의 mRNA 발현이 각각 21.5 배, 약 80배, 및 33배 증가함을 확인하였다. 이에 반해, PMSC와 공배양을 통해 증가된 mRNA 의 PPARγ발현이 약 8배, ADIPONECTIN의 mRNA발현이 약 33배, C/EBPα의 mRNA 발현이 약 12.4배로 감소됨을 확인하였다. 이상의 결과로 중간엽 줄기세포가 안와 섬유아세포의 PPARγ, ADIPONECTIN 및 C/EBPα의 발현을 억제함을 알 수 있었고, 이는 중간엽 줄기세포가 안와 섬유아세포의 지방세포분화성을 억제함을 의미한다.

실시예 6. 안와 섬유아세포의 지질 축적 확인

인간 태반유래 중간엽줄기세포가 안와 섬유아세포의 지질 축적에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 정상 및 TAO 환자로부터 채취한 안와 섬유아세포를 지방생성유도 배지 배양과 함께 PMSC와의 공배양도 진행하였다. 7일 후, Oil-Red O 염색을 이용하여, 안와 섬유아세포 내 지질 축적을 상기 참고예 3에서와 같이 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6과 같이 분화 배지에 유도된 TAO 환자의 섬유아세포의 지질축적이 PMSC와 공배양을 통해 감소됨을 확인하였다.

이상의 결과로부터 인간 태반-유래 줄기 세포(hPMSC)가 TAO 환자의 섬유아세포의 비정상적인 활성을 회복시킴을 확인하였다.

실시예 7. 중간엽줄기세포의 면역 조절능력 확인

상기 참고예 1에서 분리한 태반 유래 중간엽줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포 및 골수 유래 중간엽 줄기세포의 안와 섬유아세포에서 대한 면역 조절능을 확인하기 위해 naive 상태의 중간엽 줄기세포에 염증유도 인자를 처리함으로써, 각 중간엽줄기세포에서 발현되는 각 인자들의 발현을 염증반응에 따른 발현을 비교분석하였다. 상기 지방 유래 중간엽 줄기세포와 골수 유래 중간엽 줄기세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 제공받아 사용하였다.

구체적으로, 상기 중간엽줄기세포들에 염증 유도 인자인 LPS 및 IL-1β를 각각 1 또는 10ng로 처리하였다. 이후에, 면역 조절인자인, hFOXP3, hHLA-G, 및 hTRL4의 발현량을 qRT-PCR로 확인하였다. 구체적으로, qRT-PCR은 염증유도 인자를 처리한 세포들을 회수하여 TRIZOL을 이용한 세포 용해(lysis) 단계, 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용한 cDNA 합성 단계, 유전자 특이적 염기서열과 Tag. DNA 폴리머라제를 이용한 PCR 증폭 단계, 및 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 증폭된 유전자의 유무를 확인하는 단계로 수행하였다. 상기 qRT-PCR 분석의 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7은 일 구체예에 따른 중간엽줄기세포가 염증 유도된 세포의 면역 반응 조절 인자에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다;AD: 지방유래 중간엽줄기세포, BM: 골수유래 중간엽줄기세포, PD: 태반유래 중간엽줄기세포, WI-38: 섬유아세포; a: FOXP3, b: HLA-G, c: hTRL4; *대조군 vs. 그외: 감소, # 대조군 vs. 그외: 증가, ** 1ng vs. 10ng: 감소, ## 1ng vs. 10ng: 증가.

도 7에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 중간엽줄기세포는 HLA-G, FOXP3, 및 TLR4를 섬유아세포 대비 더 많이 발현한다는 것을 알 수 있었다. 특히, 태반유래 중간엽줄기세포의 경우에는, 면역반응 조절에 관여하여 T 세포 공격으로부터 세포를 보호하는 효과가 알려진 HLA-G 뿐만 아니라, FOXP3, 및 TLR4를 다른 세포에 비해 더 많이 발현할 뿐만 아니라, 염증 유도인자가 처리된 후에도 높은 발현량을 보였다. naive한 상태에서 면역과 관련된 인자들의 발현 패턴들을 염증유도 인자 처리에 따라 발현의 변화를　분석함으로써, HLA-G와 같은 면역조절능 인자의 과발현을 나타내는 중간엽줄기세포(특히, 태반 유래 중간엽줄기세포)가 갑상선 안질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Sungkwang medical foundation <120> A composition comprising mesenchymal stem cell derived from chorionic plate membrane expressing CD90, CD146, CD105 or CD73 for treating thyroid associated ophthalmopathy <130> PN136652 <150> KR 10-2017-0103723 <151> 2017-08-16 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fprimer for PPAR <400> 1 ttgacccaga aagcgattc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PPAR <400> 2 aaagttggtg ggccagaatg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ADIPONECTIN <400> 3 ggccgtgatg atggcagaga t 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ADIPONECTIN <400> 4 tttcaccgat gtctccctta gg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for C/EBP <400> 5 tgtatacccc tggtgggaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for C/EBP <400> 6 tcataactcc ggtccctctg 20

Claims

태반 융모막판막(chorionic plate membrane) 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 갑상선 안질환을 치료하기 위한 약학적 조성물로서,
상기 중간엽 줄기세포는 CXCL-1, MCP-1, 또는 TIMP-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 분비 또는 발현하고; 및 CD90, CD146, CD105 및 CD73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 발현하는 것인 약학적 조성물.