KR20200123465A - 산화 알루미늄 표면 및 계면 분자 - Google Patents

산화 알루미늄 표면 및 계면 분자 Download PDF

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Abstract

관심 분석물을 결합하는데 사용하기 위한 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법으로서, 산화 알루미늄 표면에 고정화되는 것이다. 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 계면 분자에 부착되어, 분석물 또는 분석물에 특이적인 생체 분자에 결합하기 위한 가교제이다. 계면 분자는 2.2 내지 25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 유리 카르복시기는 2개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되며, 이를 통해 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 생체 분자는 계면 분자에 공유적으로 부착될 수 있고, 또는 생체 분자는 항원 결정기 또는 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착된 조작된 항체일 수 있다.

Description

산화 알루미늄 표면 및 계면 분자
본 발명은 생의학 또는 산업 응용분야에 사용하기 위한 단백질과 같은 생체 분자를 부착하는 산화 알루미늄 표면에 관한 것이다. 산화 알루미늄 표면은 진단 테스트, 친화성 분석, 복잡한 생체 분자 혼합물에서 관심 생체 분자 분리하는 것과 같은 응용 분야에서 유용하다.
지난 50년 동안 고정된 생체 분자에 대한 필요성이 크게 증가했다. 생체 분자를 고정하려는 초기의 노력은 ELISA 분석과 같은 진단을 위한 것이었다. 이 분석에서 항체는 마이크로 타이터 디쉬(microtiter dish)와 같은 고분자 표면에 첨가되었다. 이러한 표면은 보통 폴리스티렌(polystyrene)이었다. 항체는 무작위로 표면에 흡착되어 고정된 항체는 단지 5 내지 7% 만 활성이었다. 항체가 표면에 배향되어 Fab 단편이 표면에서 멀어지고 표면에 대한 실제 결합이 Fc 단편을 통해 발생하는 경우, ELISA 분석의 감도가 1배 이상 증가할 수 있음이 인식되었다. 배향된 고정 생체 분자의 필요성이 시간이 지남에 따라 증가했다. 미세 유체 장치, 유전자 및 단백질 마이크로배열 및 면역진단은 일반적으로 모두 배향된 결합에 유리한 영향을 받는다. 석영 미소 저울, 표면 플라즈몬 공명 및 모세관 전기 영동과 같은 추가적 분석 기술들 모두 개선된 배향 결합에 이점을 얻는다. 친화성 크로마토그래피 및 친화성 분리와 같은 산업 공정은 모든 단백질이 표면 위에 제대로 정렬되면 효율성이 개선된다. 이 모든 분야에서 공통적으로 중요한 것은 비특이적 단백질 결합을 방지해야 한다는 것이다.
산화물에 대한 단백질 흡착은 바이오 세라믹 분야에서 매우 중요하다. 티타니아, 알루미나 및 지르코니아는 의료 응용분야에 사용되는 보다 일반적인 산화물 세라믹 중 일부이다. 내식성, 내마모성, 생체 적합성 및 기계적 강도와 같은 우수한 재료 특성으로 인해, 의학 및 치과 분야에서 생체 재료로 자주 이용된다. 산화물에 대한 단백질의 흡착은 pH, 미세구조, 제타 전위, 및 표면 반응성과 같은 많은 물질적 및 환경적 측면을 고려해야 한다.
단백질 및 DNA, RNA와 같은 생체 분자는 특히 하전된 경우, 표면에 쉽게 흡착된다. 흡착 과정을 개선하려는 시도에는 표면을 화학적 또는 물리적으로 활성화하여 하전된 부위의 수를 늘리는 것이 포함된다. 높은 촉매 작용을 하는 알루미나가 고려되며, 흡착된 단백질은 변성될 수 있다. 이것이 일반적인 현상임을 나타내는 문헌에 충분한 증거가 있다(Murray and Laband, 1979; Murray, 1980; Thurman and Gerba, 1988; Bowen and Gan, 1992). 흡착 과정이 무작위적인 경향이 있기 때문에, 입체구조적 방해(steric hindrance)를 일으킬 수 있는 부적절한 결합이 생길 수 있다. 만약, 분자들이 부적절하게 배향되거나 너무 촘촘하게 밀착되면, 입체구조적 방해가 발생한다. 원하는 단백질이 표면을 완전히 덮지 않으면, 비특이적 결합이 심각한 문제가 될 수 있다.
하이드로겔과 같은 고분자 네트워크는 다른 분자들이 용해될 수 있는 물을 보유할 것이다. 이 분자들은 반응에 사용할 수 있다. 이 기술의 단점은 박막의 두께 및 느리게 일어날 수 있는 확산 공정을 포함한다. 알루미나와 같은 표면을 코팅하기 위해 폴리머 박막을 사용하는 시도가 있었다. 폴리머는 노출된 펜던트기를 가지고 있으며 이는 생체 분자에 공유결합 하는데 사용된다. 이 기술은 지나치게 두꺼운 박막의 문제를 해결하는데 도움을 주나 비특이적 결합 및 잘못된 배향에 이를 수 있다.
유리 및 실리카 표면에서 생체 분자를 표면에 공유 결합하는 가장 일반적인 기술은 실란화 공정을 이용하는 것이다. 이러한 공정에서 트리에톡시실란 유도체는 표면에 첨가되고, 에톡시-기가 표면의 하이드록시기와 반응하여 에탄올을 방출하여 실란화된 표면을 형성한다. 트리-에톡시실란 유도체의 실리콘은 표면 특성을 결정하는 그룹에 연결된다. 이 그룹이 장쇄 알칸인 경우, 표면은 소수성이 되고, 이 그룹이 메틸기인 경우 표면은 친수성이 된다. 그 다음 이 그룹들은 생체 분자에 공유적 연결되는데 사용된다. 이 경우, 생체분자는 항체, 항원, DNA, RNA, 또는 아비딘과 같은 분자일 수 있다. Mao et al. (U.S. 특허 No.8,178,602)는 표면을 기능화하는 바람직한 방법으로서 R-PEG-실란을 사용하는 시스템을 제시하였다. 그 예에서 R 그룹은 비오틴 또는 메톡시이다. 2개의 표면 변형 분자를 사용할 때, 메톡시 성분은 입체구조적 방해를 줄이고 비오틴이 아비딘에 더욱 결합되도록 하는 중성 스페이서이다. Wagner et al. (U.S. 특허 6,596,545)는 실란을 사용하여 링커 분자를 유리에 결합하거나, 또는 티올(thiol)을 사용하여 황 함유 링커 분자를 금 표면에 결합시킬 수 있음을 보여준다. 이러한 링커는 관심 생체 분자에 결합될 수 있다. Coyne et al. (U.S.특허 No. 6,589,799)는 지지체 매트릭스 물질에서 표면 하이드록시기를 활성화하고 활성화된 하이드록시기를 알데히드 알콕시 실란(aldehydic alkoxy silane)과 반응시키는 것을 설명하였다. 유도체화된 알데히드 지지체 매트릭스 물질은 생체 분자의 고정 및 생물학적 응용에 유용하였다.
다른 공유적 기술에는 칼릭사렌(calixarene)의 사용이 포함된다. 금속 산화물 표면이 실리콘 염화물 표면을 형성하기 위해 먼저 SiCl4 와 반응하면, 그 염화 실리콘은 표면에 안정한 구조를 형성하기 위해 칼릭사렌과 반응할 수 있다. 이 구조는 이에 공유 결합된 생체 분자를 가질 수 있다. (Katz et al. U.S. 특허 No.6,951,690)
본 발명자는 산화 알루미늄 표면은 카르복시 풍부 도메인을 갖는 계면 분자를 이용하여 생의학 응용을 위해 안정적으로 재기능화될 수 있음을 발견하였다. 특히, 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 고정되고, 생체 분자 또는 가교제는 계면 분자에 부착된다. 산화 알루미늄/계면분자 구조 또는 장치는 진단 장치 또는 친화성 분석을 위해, 생체 분자가 생물학적 정체성을 유지하는 방식으로, 염기(base)를 제공하고, 안정적인 방식으로 계면 분자에 부착된 상태를 유지한다.
하나의 넓은 측면에서, 본 발명은 관심 분석물과의 결합에 사용하기 위한 장치를 제공한다. 장치는 산화 알루미늄 표면 및 산화 알루미늄 표면에 고정되는 계면 분자를 포함한다. 계면 분자는 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정된다.
다음 중 하나가 계면 분자에 부착된다:
i) 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 계면 분자에 부착된 생체 분자, 분석물에 특이적인 생체 분자;
iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자.
본 발명은 또한, 산화 알루미늄 표면에 고정될 수 있고 관심 분석물에 결합하는데 사용하는 계면 복합체로 확장된다. 계면 복합체는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는 계면 분자를 포함한다. 계면 분자는 다음 중 하나를 더 포함한다:
i) 관심 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 인터페이스 부자에 부착된 생체 분자, 관심 분석물에 특이적인 생체 분자;
iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 관심 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 관심 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자.
다른 넓은 측면에서, 본 발명은 관심 분석물에 결합 여부를 테스트하기 위한 진단 시스템 또는 키트를 제공한다. 진단 시스템 또는 키트는 다음을 포함한다:
1) 산화 알루미늄 표면, 및 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는 계면 분자
2) 다음 중 하나
i) 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 인터페이스 부자에 부착된 생체 분자, 분석물에 특이적인 생체 분자;
iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자.
상기 일부 실시예에서, 계면 분자 및 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 중의 하나가 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 다른 실시예에서, 계면 분자 및, (i), (ii), (iii) 및 (iv) 중의 하나가, 산화 알루미늄 표면에 고정되기 전에 분석물과 접촉을 위한 계면 복합체로 제공된다.
진단 시스템 또는 키트의 일부 실시예는 시각적 진단 장치를 제공한다. 산화 알루미늄 표면은 산화 알루미늄의 다공성 층으로 커버될 때 색상을 형성할 수 있는 반사성 금속에 제공되고, 산화 알루미늄 표면은 다공성 양극 처리된 표면이다. 이와 같이, 시각적 진단 장치는, 분석물을 테스트하기 위한 샘플과 접촉할 때, (i)이 존재하는 경우 분석물이 가교제에 결합하거나, (ii), (iii) 또는 (iv)가 존재하는 경우 분석물이 생체 분자에 결합시, 분석물의 존재를 나타내는 색 변화가 감지된다.
본 발명은 또한 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법으로 광범위하게 확장된다.
상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 적어도 하나의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해, 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되고, 계면 분자는 다음 중 하나에 부착되는, 계면 분자가 고정된 산화 알루미늄 표면을 제공하는 단계:
ⅰ) 분석물에 결합하기 위한 가교제;
ⅱ) 분석물에 특이적인 생체 분자;
ⅲ) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
ⅳ) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자;
b) a)의 표면을 샘플과 접촉시켜 분석물을 테스트하는 단계; 및
c) 분석물이 a)의 표면에 결합할 때 분석물의 존재를 검출하는 단계;
일부 실시예에서, 본 발명은 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법으로 광범위하게 확장된다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 산화 알루미늄 표면을 제공하는 단계;
b) 계면 복합체는 계면 분자를 포함하고, 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 적어도 하나의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해, 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되고, 계면 분자는 다음 중 하나에 부착되는, 산화 알루미늄 표면에 부착될 수 있는 계면 복합체를 제공하는 단계:
ⅰ) 분석물에 결합하기 위한 가교제;
ⅱ) 분석물에 특이적인 생체 분자;
ⅲ) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
ⅳ) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자;
b) a)의 계면 복합체를 분석물 테스트를 위해 샘플과 접촉시키는 단계;
c) 샘플과 b)의 계면 복합체를 산화 알루미늄 표면과 접촉시키는 단계; 및
d) 산화 알루미늄 표면에 계면 복합체와 분석물이 결합할 때 분석물의 존재를 검출하는 단계.
상기 방법들의 일부 실시예에서, 산화 알루미늄 표면은 산화 알루미늄의 다공성 층으로 커버될 때 색상을 형성할 수 있는 반사성 금속에 제공되고, 산화 알루미늄 표면은 다공성 양극 처리된 표면이다. 이러한 방식으로 분석물을 테스트하기 위해 샘플과 접촉할 때, (i)이 존재하는 경우 가교제에 결합하거나 (ii), (iii) 또는 (iv)가 존재하는 경우 생체 분자에 결합하는 분석물의 존재를 나타내는 색 변화가 감지가 감지된다.
상기 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법의 일부 실시예에서,
카르복시 풍부 도메인은 다음을 제공한다:
2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
2.2-25 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
2.2-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는
2.2-17 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
7.0-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는
7.0-17 nm3의 분자 부피 내 20 개 이상의 유리 카르복시기.
상기 장치, 진단 시스템, 키트, 또는 방법의 일부 실시예에서:
가교제는 계면 분자에 공유 결합되고; 또는
생체 분자는 가교제를 통해 계면 분자에 공유 결합되고; 또는
계면 분자 및 생체 분자는 아미노산 서열로 조작되어 계면 분자 및 생체 분자가 펩티드 결합을 통해 부착되고; 또는
계면 분자는 카르복시 풍부 도메인을 포함하는 조작된 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이고; 또는
생체분자는 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 관심 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는, 조작된 항체이고; 또는
생체 분자는 관심 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖고 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되는 조작된 항체이다.
*일부 실시예에서, 가교제는 계면 분자에 공유 결합된다. 일부 실시예에서, 생체 분자는 가교제를 통해 계면 분자에 공유 결합된다. 일부 다른 실시예에서, 계면 분자 및 생체 분자는 아미노산 서열로 조작되어 펩티드 결합으로 부착된다. 또 다른 추가 실시예에서, 계면 분자는 카르복시 풍부 도메인을 포함하는 조작된 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다.
일부 실시예에서 계면 분자는 연속적 또는 비연속적 코팅으로서, 윤곽이 있는 스팟 또는 라인으로서, 또는 배열로서 산화 알루미늄 표면에 제공된다.
일부 실시예에서 계면 분자는 한 유형의 계면 분자에 부착되는 생체 분자를 갖는, 산화 알루미늄 표면 상에 이격된 상이한 유형의 계면 분자 중 하나이다.
일부 실시예에서, 산화 알루미늄 표면은 입자, 분말, 박막, 슬라이드, 스트립, 필터, 비드, 자성 비드, 자성 입자, 또는 코팅의 형태로 기판 상에 제공된다.
일부 실시예에서, 산화 알루미늄 표면은 알루미늄 금속 또는 알루미늄 합금의 스퍼터링, 증발, 주조 또는 압출에 의해 제공되고, 다공성 양극 산화 처리된 산화 알루미늄 표면을 제공하기 위해 추가로 양극 산화 처리된다.
일부 실시예에서, 산화 알루미늄 표면은 기판 상에 RF 스퍼터링, 반응성 스퍼터링 또는 화학적 증기 증착에 의해 제공된다.
일부 실시예에서, 계면 분자는 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 및 감마-카르복시 글루탐산(Gla)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 실시예에서, 계면 분자는 비타민 K 의존성 단백질, Gla 도메인을 함유하는 이의 단편, 또는 변형된 Gla 도메인을 포함하는 이의 단편이다.
일부 실시예에서, 계면 분자 및 생체 분자는 카르복시 풍부 도메인이 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항체, 탄수화물, 앱타머(aptamer) 또는 지질에 포함되도록 조작된 분자로 형성된다.
일부 실시예에서, 카르복시 풍부 도메인은 비타민 K 의존성 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하고, 조작된 분자는 단백질 A, 단백질 A의 단편 B, 또는 IgG 분자를 포함한다.
일부 실시예에서, 계면 분자는 단백질, 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, 또는 Gla 잔기 중 하나 이상은 Glu, Asp, Glu-Glu, Glu-Asp, Asp-Glu, 또는 Asp-Asp로 치환된 단백질의 변형된 Gla 도메인이고, 단백질은 프로트롬빈, 프로트롬빈의 단편1, 단백질 S, 응고 인자 IX, 인자 X, 인자 VII, 단백질 C, 매트릭스 Gla 단백질, 및 뼈 Gla 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 항체-항원, 항체-합텐(hapten), 효소-기판, 효소-수용체, 독소-수용체, 단백질-단백질, 아비딘-비오틴, 앱타머-앱타머 표적, 및 약물 수용체-약물로 구성된 군으로부터 선택된 결합 쌍의 구성원이다.본 발명은 또한 생의학에 이용하기 위해 산화 알루미늄 표면을 재기능화하기 위한 계면 분자의 사용으로 확장되고, 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정될 수 있다.
도 1은 비타민 K 의존성 단백질 프로트롬빈(PT), 인자 IX(FIX), 인자 X (FX), 인자 VII (FVII), 단백질 C(PC), 단백질 S(PS), 매트릭스 Gla 단백질(MGP), 및 뼈 Gla 단백질(BGP)을 설명한다. 범례는 단백질 성분을 식별한다. 성숙한 단백질 구조를 형성하기 위해 절단이 일어날 때 단백질 분해 절단 부위는 얇은 화살표로 표시되고 효소 활성화에 연결될 때 절단 부위는 두꺼운 화살표로 표시된다. 이미지는 Furie B 및 Furie B (Furie and Furie, 1988)에서 발췌했다.
도 2는 프로트롬빈의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 10 개의 Gla 잔기가 있다(UnitProt Consortium, 2017a). 이것은 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 8.3 nm3 카르복시 글루타민 도메인(카르복시 풍부 Gla 도메인)을 형성한다.
도 3은 사람 응고 인자 IX의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 및 40 부위에 12 개의 Gla 잔기가 있다. 추가적 금속 결합 부위는 1, 2, 47, 48, 50, 64, 65, 235, 237, 240, 242 및 245 (UnitProt Consortium, 2017b)이다. 이것은 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 17.0 nm3의 카르복시글루타민 도메인(카르복시 풍부 Gla 도메인)을 형성한다.
도 4는 단백질 S의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 및 36 부위에 11개의 Gla 잔기가 있다(UnitProt Consortium, 2017c). 이것은 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 12.3 nm3의 카르복시글루타민 도메인을 형성한다.
도 5는 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질 상의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 10 개의 Asp 잔기가 있다. 이것은 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 8.7 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 6은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 Asp 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 7은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 7.7 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 8은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 9는 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 8.5 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 10은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 11은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 12.5 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 12는 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 13은 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 11.8 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 14는 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 15는 소 인자 II (Bovine Factor II)의 단편 1의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 7.0 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 16은 소 인자 II의 단편 1의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하는 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 17은 IgG 중쇄의 카르복시 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Asp 로 치환)의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기를 치환한 10 개의 Asp 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 IgG 구조의 기저에 3.6 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 18은 IgG 중쇄의 카르복시 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Asp 로 치환)의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기를 대신한 10 개의 Asp 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 IgG 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 19는 IgG 중쇄의 카르복시 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Glu 로 치환)의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기를 대신한 10 개의 Glu 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 IgG 구조의 기저에 3.7 nm3 의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 20은 IgG 중쇄의 카르복시 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Glu 로 치환)의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기를 대신한 10 개의 Glu 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 IgG 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 21은 인간 인자 II 의 단편 1의 처음 35개 아미노산에 연결된 단백질 A의 단편 B의 3차원 구조를 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 단편 B 구조의 기저에 2.2 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.도 22는 인간 인자 II 의 단편 1의 처음 35개 아미노산에 연결된 단백질 A의 단편 B의 3차원 구조의 표면 전하 맵을 도시한다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 10 개의 Gla 잔기가 있다. 이는 알루미나 표면에 결합하도록 하는 단편 B 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다.
도 23은 Gla(카르복시 풍부) 도메인을 통해 표면에 고정된 프로트롬빈(FII) 계면 분자를 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. FII는 항원 같은 생체 분자를 결합하는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 가교제로 변형된다. 항원은 이에 특이적인 항체에 결합된 것으로 나타난다. 실시예 1은 이 도면을 대표한다. 실시예 1에서, 링커는 글루타르알데히드이고, 항원은 인플루엔자 B이며, 표적 항체는 항-인플루엔자 B 바이러스이다.
도 24는 Gla 도메인을 통해 표면에 고정되는, 프로트롬빈의 단편 1 (Frag1) 계면 분자를 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. Frag 1은 항원에 나타난 바와 같이, 생체 분자를 결합하기 위해 교차 링커로 변형되고, 이의 특이적 항체에 결합된다. 실시예 5는 본 도면을 대표하고, 링커는 글루타르알데히드이고, 항원은 B형 간염 바이러스에서 유래하고, 표적 항체는 항-Hep B 항체이다.
도 25는 Gla 도메인을 통해 표면에 고정되는, 인자 IX (FIX) 계면 분자를 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. FIX는 생체 분자와 결합하는 교차 링커로 변형되고, 항원에서 나타나듯, 특이적 항체에 결합된다. 예를 들어, 링커는 글루타르알데히드 일 수 있고, 고정된 항원은 인플루엔자 B, 및 항체는 항-인플루엔자 B일 수 있다.
도 26은 산화 알루미늄 표면에 Gla 도메인이 결합하도록, 구조 내에 FII의 Frag 1을 포함하도록 조작된 단백질 A의 단편B가 고정된 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. 단백질 A의 단편 B는 항체로 표시된 생체 분자에 결합되는 계면 분자를 제공하고, 그 특이적 항원에 결합된다. 예를 들어, 고정된 항체는 항-인플루엔자 B에서 유래할 수 있고 항원은 인플루엔자 B일 수 있다.
도 27은 Fc 구조의 카르복시 말단에 FII의 단편 1의 Gla 도메인에 혼입되어 Gla 도메인을 통해 표면에 결합되도록 조작된 IgG를 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. 조작된 항체는 특이적 항원에 결합되는 것으로 나타난다. 예를 들어, Fab는 항-인플루엔자 B일 수 있고 표적 항원은 인플루엔자 B일 수 있다.도 28은 Fc 구조의 카르복시 말단에 FII의 단편 1의 Gla 도메인에 혼입되어 Gla 도메인을 통해 표면에 결합되도록 조작된 항체 (IgG)를 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. 조작된 항체는 특정 항원에 결합되는 것으로 나타난다. 두번째 항체는 표적 항원에 결합하고, 표적 항원은 신호를 증폭하는데 사용할 수 있다. 두번째 항체는 변형되지 않거나 또는 전체 장치로부터 신호를 증폭하기 위해 연결된 효소 또는 방사성 표지로 변형될 수 있다. 예를 들어, Fab는 항-테스토스테론 일 수 있고, 표적 항원은 테스토스테론일 수 있으며, 증폭 항체는 항-테스토스테론일 수 있다.
도 29는 Gla 도메인을 통해 표면에 결합되는 두 가지 유형의 계면 분자로서 프로트롬빈(FII) 및 프로트롬빈의 단편1을 모두 갖는 산화 알루미늄 표면을 나타낸 개략도이다. 글루타르 알데히드와 같은 가교제는 항원과 같은 생체 분자를 결합하기 위해 첨가된다. 이 장치는 한 유형의 계면 분자(Frag1)를 사용하여 다른 계면 분자(FII) 사이의 스페이서 역할을 하여, 입체구조적 방해와 같은 요인을 감소시킨다. 항원, 및 항원에 특이적인 항체(미도시)는 표면에서 가장 멀리 떨어진 계면 분자(FII)에 부착하는데 입체구조적 방해가 적다. 예를 들어, 고정된 항원은 Hep B 바이러스 항원일 수 있고, 링커 캡핑제(예. 리신(lysine))는 비특이적 단백질 결합을 방지하기 위해 항원 결합 후 첨가될 수 있다. 도 30a-30d는 계면 분자 및 항체를 포함하는 계면 복합체의 사용을 도시한 개략도이다. 복합체는 Fc의 말단에 카르복시 풍부 도메인을 갖는 조작된 항체, 또는 테스트 샘플에서 분석물로 항원을 포획하는데 사용되는, 카르복시 말단을 통해, 카르복시 풍부 도메인에 접합된 Fc 일 수 있다. 이 유형의 조작된 항체의 예는 IgG 항체의 Fc 말단에 연결된 비타민 K 의존성 단백질의 Gla 도메인이다. 항원은 산화 알루미늄 표면과 접촉하여 용액에서 분리되어, 항원에 결합된, 조작된 항체의 카르복시 풍부 도메인은 알루미나 표면에 결합한다. 도 30a는 단백질 혼합물을 갖는 용액 내의 조작된 항체를 보여준다; 도 30b는 조작된 항체의 특이적 항원에 대한 결합을 보여준다; 도 30c는 산화 알루미늄 표면에 대한 카르복시 풍부 도메인을 통한 조작된 항체-항원 복합체의 결합을 보여준다; 도 30d는 용액에서 산화 알루미늄 표면을 제거하여 혼합물에서 관심 단백질을 분리하는 것을 보여준다. 산화 알루미늄 표면이 시각적 진단 장치로 형성되면, 항원의 결합은 도 30d에서 색 변화에 의해 감지된다. 예로서, Fab는 항-알부민 일 수 있고 표적 단백질은 알부민일 수 있다.
도 31a-31d는 프로트롬빈 (FII)과 같은 계면 분자가 고정된 산화 알루미늄 표면을 나타내는 개략도이다. FII 분자는 도 31a에 도시 된 바와 같이 글루타르 알데히드와 같은 가교제로 변형된다. 도 31b에서, 표면은 소변 같은 샘플에 담궈져 있다. 샘플에 분석물 단백질이 있으면 도 31c에 도시된 바와 같이, 계면 분자의 글루타르 알데히드에 결합한다. 도 31d에 도시된 바와 같이, 가교제를 통해 계면 분자에 결합된 단백질을 제거하는 샘플로부터 표면을 제거한다. 산화 알루미늄 표면이 시각적 진단 장치로 형성되면, 단백질 결합은 도 31d에서 색상 변화를 통해 감지된다.
도 32a-32c는 조작된 항체로서 계면 분자 및 항체를 포함하는 계면 복합체를 보여주는 개략도이다. 인자 II의 단편 1과 같은 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 항체는 도 32a에 나타낸 바와 같이, 두 개의 별개의 Fab 항원 결정기, Fab1 및 Fab2로 조작된다. 유전자 조작 또는 습식 화학을 통해 당업계에 공지된 기술에 의해, 조작된 항체가 제조될 수 있다. Fab1은 계면 분자(예를 들어, 안피프로트롬빈의 안티트롬빈 성분)에 결합하기 위해 계면 분자에 특이적이고, 반면 Fab2는 항원과 같은 관심 분석물에 특이적이다. 도 32b는 산화 알루미늄 표면의 계면 분자 및 Fab1을 통한 계면 분자에 부착된 조작된 항체를 도시한다. 도 32c는 Fab2를 통해 분석물 항원에 결합하는 조작된 항체를 도시한다. 대안적으로 Fab2는 항체 또는 앱타머와 같은 결합 쌍의 일부로 기능하는 추가 생체 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어 Fab1은 항-트롬빈이고 Fab2는 항-전립선 특이적 항원일 수 있고, 반면 분석물은 전립선 특이적 항원이다.도 33a 및 33b는 산화 알루미늄 표면에 카르복시 풍부 도메인을 통해 결합된 두 개의 서로 다른 크기의 (높고 낮은) 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 결합된 것을 나타내는 개략도이다. 이 구성은 두 개의 서로 다른 생체 분자가 예를 들어, 앱타머와 같은 가교제를 통해(도 33a), 계면 분자에 연결되도록 한다. 링커는 하나의 계면 분자에 대한 벌크 용액과, 다른 계면 분자의 별도 용액에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 높은 계면 분자는 프로트롬빈일 수 있고 낮은 계면 분자는 인자 II의 단편 1일 수 있다. 도 33b에서, 생체 분자는 가교제를 통해 부착되어 있다. 생체 분자는 샘플에서, 서로 다른 항체에 의해 인식되는 서로 다른 항원이다. 예를 들어, 표적 분자는 hCG 및 LH와 같은 두 가지 상이한 호르몬 일 수 있다. 기본 표면이 시각적 분석으로 기능하는 반사층의 산화 알루미늄인 경우, 상이한 항체의 결합은 항체에 따라 여러 색상 조합을 생성한다. 예를 들어, 0은 항체 결합 없음에 대한 색 변화 없음을 나타내고, 1 또는 2는 항체 1 또는 항체 2의 결합에 대한 색 변화를 나타내며, 3은 항체 1과 항체 2 모두의 결합에 대한 색 변화를 나타낸다. 다른 구체예에서, 생체 분자는 항체, 앱타머 또는 대체 결합 쌍의 성분일 수 있다.
도 34a 및 34b는 산화 알루미늄 표면에 대한 다클론 조작된 IgG의 결합을 보여주는 개략도이다. IgG 분자는 산화 알루미늄 표면에 결합하기 위해, Fc 단편의 카르복시 말단에 형성된 카르복시 풍부 도메인으로 조작된다. Fab 단편은 관심 항원의 상이한 항원 결정기(에피토프)에 결합하기 위한 Fab1 및 Fab2로 예시된다(도 34b에 제시된 배향 1 또는 배향 2). 이러한 방식으로, Fab 단편은 개발된 항원에 특이적 결합할 수 있다. 다클론 항체를 사용함으로써 항체의 배향이 중요한 인자가 아니기 때문에 결합이 더 빠르다. Fab1은 전립선 특이적 항원(특정 부위/배향)에 대해 단일 클론-1 일 수 있고 Fab2는 전립선 특이적 항원(특이적 부위/배향)에 대해 단일 클론 -2 일 수 있고, 이때 분석물은 전립선 특이적 항원이다.
도 35a 및 35b는 산화 알루미늄 표면에서 계면 분자를 패턴화하기 위한 두 가지 실시예를 보여주는 개략도이다. 도 35a에서, 알루미늄은 당업계에 공지된 마스킹 기술을 사용하여 라인 패턴으로 표면에 스퍼터링 된다. 알루미늄은 슬라이드와 같은 기본 지지체 상 탄탈룸(tantalum) 박막 위에 스퍼터링 된다. 그런 다음 알루미늄을 양극 산화 처리하여 탄탈룸 표면의 탄탈룸 산화물 층 위에 산화 알루미늄 층을 형성할 수 있다. 일단 양극 산화 처리가 완료되면, 산화 알루미늄 스트립은 계면 분자, 생체 분자 및 생체 분자에 결합하는 분석물이 추가될 때마다 변화하는 간섭색을 생성할 수 있다. 인터페이스 색상의 변화를 가시광선 스펙트럼에서 눈으로, 및/또는 가시광선 스펙트럼에서 또는 가시광선 스펙트럼 밖에서 카메라 등의 적절한 검출기를 사용하여 감지할 수 있다. 일부 실시예에서 이와 같은 패턴은 계면 분자를 반사층 상 연속적인 산화 알루미늄 표면에 라인 또는 패턴으로 인쇄함으로써 달성될 수 있다. 도 36a 및 36b는 바코드 리더 또는 스마트폰으로 인식할 수 있는, 배열, 분석, 환자 등과 관련된 정보를 포함하는 바코드, QR 코드와 함께 35a, 35b에 대해 설명된 바와 같이, 시험부위가 선이나 배열로 인쇄되는 본 발명에 따른 진단 장치의 실시예를 도시한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 특정 용어는 아래에서 정의되고, 명확화된다.
용어 Abiomolecule@는 생체 시스템과 상호 작용하는 분자를 포함한다. 일반적으로 생체 분자(또는 생물학적 분자)는 유기체에 존재하는 분자 또는 이온에 대한 용어이다. 생체 분자는 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산 (앱타머)과 같은 큰 거대 분자 (또는 폴리음이온), 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함한다. 생체 분자는 또한 1 차 대사 산물, 2 차 대사 산물, 천연물 및 그 유도체와 같은 소분자를 포함한다. 생체 분자는 일반적으로 내인성이지만 외인성일 수 있다. 예를 들어, 의약품은 천연물 또는 반합성(바이오 의약품)이거나 완전히 합성될 수 있으며, 따라서 생체 분자라는 용어에 포함된다. 생체 분자는 또한 합성 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드, 합성 DNA 또는 RNA, 합성 지질 및 합성 탄수화물로 확장된다.
A알루미나@ 및 A산화 알루미늄@이라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되며, 산화물이 천연이든, 일 예로 스퍼터링 또는 산화 알루미늄을 제공하기 위한 양극 처리에 의해 형성된 것이든, 산화 알루미늄 또는 알루미늄 금속 합금의 표면에 형성된 산화물을 포함한다. 산화 알루미늄 표면은 입자, 분말, 비드, 자성 비드 또는 자성 입자, 박막, 슬라이드, 스트립, 필터 또는 코팅과 같이, 기판 또는 지지체 상에 형성될 수 있다. 산화 알루미늄 표면은 알루미늄 금속 또는 알루미늄 합금 스퍼터링, RF 스퍼터링, 반응성 스퍼터링, 화학 기상 증착, 증발, 주조 또는 압출로 형성될 수 있고, 추가로 양극 산화 처리하여 다공성 양극 산화 알루미늄 표면을 제공 할 수 있다.용어 Abioidentity@ and Abiological identity@는 다른 생체 분자, 세포 또는 조직과의 결합에 대해 인식 가능하거나 특이적으로 만드는 생체 분자의 구조적 및 화학적 특성을 지칭하기 위해 동의어로 사용된다. 예를 들어, 항원이 고정된 경우, 동물 모델, 시험관 내 시스템 또는 컴퓨터 모델에서, 개발된 항체가 용액에서 자유로울 때와 동일한 특이성 및 민감도로 결합하는 경우 생체 동일성을 유지한다고 한다. 여기에서 생체 동일성은 생체 분자, 예를 들어 효소에서 유지되는 생물학적 활성을 반드시 필요로하지 않으며, 생체 분자가 여전히 인식되는 것으로 충분하다.
용어 Adomain@은 그 단백질 또는 폴리펩티드의 다른 부분으로부터 기능, 특성 또는 구조로 식별될 수 있는, 단백질 또는 폴리펩티드 내의 아미노산 그룹을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 Aimmobilized@ 또는 Aimmobilize@는 화학적 결합 여부에 관계없이, 산화 알루미늄 표면에 하나 이상의 계면 분자가 부착 또는 흡착되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 Acovalent binding@, Acovalent bonding@ 및 Across-linking@는 계면 분자와 생체 분자 사이의 공유 결합의 형성을 언급하는데 사용된다. 일반적으로, 생체 분자가 폴리펩티드일 때, 계면 분자는 가교제를 통해 공유 결합된다. 대안적으로, 계면 분자가 생체 분자를 포함하도록 조작될 때, 공유 결합은 펩티드 결합을 통해 이루어진다.
용어 A폴리펩티드@는 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산 사슬을 말하며, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질, 자연적인 것이든 조작된 것이든, 그러한 단백질의 단편 및 그러한 단백질 또는 단편으로부터 유도된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 Asample@은 하나 이상의 관심 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 또는 환경적 물질을 포함하며, 분석물에 대한 테스트가 음성이 되는, 분석물이 부족한 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플에는 예를 들어, 체액 및 식료품과 같은 유기 물질을 포함한다. 체액은 일 예로 전혈, 혈장, 혈청, 가래, 뇌척수액, 흉막액, 조직, 배설물 등을 포함한다. 환경 샘플 예를 들어, 토양, 슬러지, 물 등을 포함한다. 샘플은 예를 들어, 세포가 있는 경우 원심 분리, 추출, 및/또는 용해와 같이 처리될 수 있다. 또는, 샘플은 진단 장치와 직접 접촉할 수 있다. 본 발명에 따르면, 산화 알루미늄 표면은 생체 의학 응용 분야에서 사용하기 위해 표면에 고정될 수있는 계면 분자로 재기능화된다. 일부 실시예에서, 계면 분자는 가교제에 부착하여 활성화될 수 있다. 다른 실시예에서, 계면 분자는 생체 분자에 부착될 수 있고, 그 다음 (직접 또는 간접적으로) 샘플에서 관심 분석물에 결합하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 생체 분자는 가교제 또는 펩티드 결합과 같은 공유 결합에 의해 계면 분자에 공유 결합된다. 계면 분자와 생체 분자는 계면 복합체로서 함께 조작될 수 있다. 다른 실시예에서, 생체 분자는 예를 들어, 계면 분자에 특이적인 하나의(제1) 항원 결정기와 시험 샘플에서 관심 분석물 또는 다른 생체 분자에 특이적인 제 2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체일 수 있다. 다른 실시예에서, 생체 분자는 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고 관심 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체일 수 있다.
상기 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 유리 카르복시기는 둘 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되며, 이를 통해 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 부착된 생체 분자는 계면 분자에 부착될 때 생물학적 정체성을 유지한다.
명확성을 위해, 본 명세서 및 청구 범위에 정의된 바와 같이, 생체 분자에 부착된 계면 분자를 제공하는 복합체는 프로트롬빈과 같은 비타민 K 의존성 단백질인 최종 생성물을 배제한다.
일부 실시예에서, 상기와시 풍부 도메인은 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기; 또는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 7.0-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는 7.0-17 nm3의 분자 부피 내 20 개 이상의 유리 카르복시기를 제공한다.
i) 생체 분자를 갖는 계면 분자 또는 계면 복합체
본 발명에 따르면, 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인을 통해 산화 알루미늄 표면에 대해 특히 높은 친화성을 갖는 계면 분자는 예를 들어 연속 또는 불연속 코팅으로, 윤곽이 있는 점 또는 선으로, 또는 배열로 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 계면 분자는 적합한 용매에서 계면 분자의 용액으로부터 산화 알루미늄 표면에 코팅으로서 고정될 수 있고, 이어서 용매를 제거할 수 있다. 일반적으로, 계면 분자는 카르복시 풍부 도메인을 제공하기 위해, 하나 이상의 아미노산 아스파르트산 (Asp), 글루탐산 (Glu) 및 감마-카르복시 글루탐산 (Gla)을 포함한다. 계면 분자는 예를 들면, 비타민 K 의존성 단백질, 카르복시 풍부 Gla 도메인을 함유하는 그 단편, 변형된 Gla 도메인을 함유하는 그 단편, 또는 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인을 제공하는 합성 펩티드다. 계면 분자 및 생체 분자는 조작된 분자로서 형성될 수 있으며 카르복시 풍부 도메인은 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항체, 탄수화물, 앱타머 또는 지질에 포함된다. 예를 들어, 카르복시 풍부 도메인은 비타민 K 의존성 단백질 또는 이의 단편 또는 유도체의 Gla 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 조작된 분자는 단백질 A, 단백질 A의 단편 B, 또는 IgG 분자와 같은 생체 분자를 포함할 수있다.
하나 이상의 카르복시 풍부 도메인이 합성 펩티드로서 계면 분자에 제공되는 실시예에서, 카르복시기-함유 아미노산은 합성 펩티드에 위치하고 이격되어 충분한 유리 카르복시기가 접힌 합성 펩티드의 표면에 노출되어 산화 알루미늄 표면에 고정될 수 있도록 보장한다. 접힌 합성 펩티드의 표면에 유리 카르복시기가 노출되는 방식으로 접히는 능력은 다음 실시예에서 설명되는 바와 같이, 분자 모델을 통해 쉽게 확인할 수 있다.
계면 분자의 크기는 고정된 인터페이스 및 생체 분자에 대한 특정 적용에 따라 다르다. 예를 들어, 생체 분자가 Fc 단편에 포함된 계면 분자를 갖는 조작된 항체인 경우, 계면 분자는 바람직하게 입체구조적 방해를 제한하도록 크기가 조정된다. 예를 들어, 약 50kD 크기의 중쇄를 갖는 항체의 경우, 계면 분자는 바람직하게는 약 30kD 미만과 같은, 더 작은 크기를 갖고, 계면 분자의 각각 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인 부분, Gla 도메인 부분, 또는 계면 분자의 변형된 Gla 도메인 부분은 약 50 개의 연속적인 아미노산 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공한다. IgG 생체 분자를 사용한 이 계면 분자의 크기의 예시는 다음의 실시예 14 및 16 내지 19에 제시된다.
산화 알루미늄 표면으로부터의 거리는 계면 분자의 크기를 변경하여 제어할 수 있다. 프로트롬빈은 고정된 개체를 표면에서 약 10nm 유지하는 반면 프로트롬빈의 단편 1 도메인은 고정된 개체를 표면에서 약 3nm 유지한다. 적절한 링커를 사용하여 분자가 표면에서 유지되는 거리를 약 1nm에서 약 40nm까지 다양하게 할 수 있다.
계면 분자는 입체구조적 방해를 감소시키기 위해, 예를 들어, 도 29에 도시된 바와 같이, 산화 알루미늄 표면에 이격된 상이한 유형의 계면 분자를 포함할 수 있다. 도 29에 도시 된 바와 같이, 프로트롬빈은 프로트롬빈의 단편 1과 이격되어 있다. 프로트롬빈은 항원과 같은 생체 분자와 결합된다.산화 알루미늄 표면에 고정된 계면 분자는 관심 분석물에 부착하기 위해 (도 31 참조), 또는 생체 분자에 부착하기 위해 가교제로 활성화될 수 있다. 대안적으로, 생체 분자와 계면 분자는 가교제를 사용하여 복합체로 사전 조립되고, 복합체는 산화 알루미늄 표면에 고정된다. 또는, 계면 분자와 생체 분자는 유전 공학 또는 습식 화학을 통해서, 예를 들어 분자 끝에 부착된 카르복시 풍부 도메인의 적절한 결합 서열로(예, 인간 프로트롬빈의 처음 32개 아미노산:Ala-Asn-Thr-Phe-Leu-Gla-Gla-Val-Arg-Lys-Gly-Asn-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Val-Gla-Thr-Cys-Ser-Tyr-Gla-Gla-Ala-Phe-Gla-Ala-Leu-Gla-XXX) 대규모 항원 또는 항체를 형성함으로써, 형성된다.
일부 실시예에서, 계면 분자는 산화 알루미늄 표면 상에 연속 또는 불연속 코팅, 윤곽이있는 스폿 또는 라인, 또는 배열로서 제공된다. 일부 실시예에서 산화 알루미늄 표면은 입자, 분말, 박막, 슬라이드, 스트립, 필터, 비드, 자기 비드, 자기 입자 또는 코팅과 같은 형태로 기판 상에 제공된다.
비타민 K 의존성 단백질을 포함한 몇 가지 Gla 함유 단백질이 있다: 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 Gla 단백질 (MGP), 뼈 Gla 단백질 (BGP), GAS6 페리오스틴, 두 개의 막 관통 Gla 단백질 (TMGP) 및 두 개의 프롤린-풍부 Gla-단백질 (PRGP). 이러한 Gla 도메인 단백질 중 일부의 구조는 도 1에 나와 있다. SEQ ID NO. 1은 인자 II(프로트롬빈), SEQ ID NO.2는 인자 IX, SEQ ID NO. 3는 단백질 S에 대한 서열 목록을 제공한다. 각 단백질의 전하 대 질량 비율은 저농도에서 기판 표면으로 어떻게 확산되는지에 중요한 역할을 한다. 발명자는 유리 카르복시기의 수, 위치 및 밀도가 산화 알루미늄 표면에 대한 단백질의 결합에 중요한 것임을 밝혀내었다. 특히, 아래에 설명된 바와 같이, 본 발명자는 카르복시 풍부 도메인의 부피 및 계면 분자의 카르복시 풍부 도메인에서 유리 카르복시기(-COOH)의 밀도가 산화 알루미늄 표면에의 계면 분자의 결합을 결정하는 요소임을 밝혀냈다.프로트롬빈 단편 1의 Gla 도메인의 부피는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 설정되었다. I-Tasser 생성 모델을 Molsoft ICM-Pro에서 열었다. 관심 단백질 영역을 선택하고 다른 영역을 숨겼다. 디스플레이 설정에서, 두 원자 사이의 거리를 측정하는 옵션이 선택되었다. 관심 영역에 대한 길이, 너비 및 높이 치수를 생성하기 위해 두 개의 포인트가 선택되었다. 이 치수의 곱은 분자에 따른, Gla 도메인 또는 하전된 영역의 부피를 제공하였다. 그 다음, 하기 표1에 제시된 바와 같이, 동일한 소프트웨어를 사용하여 자연적으로 발생하는 단백질, 단백질 S, FIX 및 소의 프로트롬빈(bovine prothrombin)의 단편 1의 카르복시 풍부 도메인에 대한 유리 카르복시기의 부피와 밀도를 설정했다. 마찬가지로, 부피 및 유리 카르복시기 밀도는 표 1에 제시된 바와 같이, 그리고 본 명세서 아래에 더 자세히 설명된 바와 같이, 프로트롬빈의 Gla 도메인의 염기 구조에 기초하여 다양한 합성 카르복시 풍부 도메인에 대해 확립되었다. 이들 부피 범위는 2.2 내지 17 nm3이고 유리 카르복시기 밀도는 1.15 내지 9.09 nm3이다. 부피 범위는 자연적으로 발생하는 FIX (17 nm3)와 두 개의 자연 발생 도메인, 프로트롬빈의 Gla 도메인 및 단백질 A의 단편 B 도메인의 융합 단백질(2.2nm3)로 묶인 것으로 확인되었다. 합성 카르복시 풍부 도메인 부피는 이 두 단백질 사이에서 감소하였다. 밀도 범위는 합성 카르복시 풍부 도메인(아래에 설명된 FII-frag1-Asp, 1.15 COOH/nm3) 및 두 개의 자연 발생 도메인, 프로트롬빈의 Gla 도메인 및 단백질 A로부터의 단편 B 도메인의 융합 단백질 (9.09 COOH/nm3), 이들 단백질 사이에 있는 다른 카르복시 풍부 도메인 예시들로 묶였다. 표 1의 부피에 밀도를 곱한 것은 카르복시 풍부 도메인에있는 유리 카르복시기의 수를 제공한다. 그 범위는 10 내지 24개의 유리 카르복시기에 해당한다. 합성 단백질 구조(도 5-14 참조)와 인자 II의 단편 1 (도 2 및 도 15-16)의 비교는 일반 클러스터에 노출된 카르복시기로 기본 구조가 유지됨을 보여준다. 이는 합성 구조가 천연 비타민 K 의존성 분자와 거의 동일한 방식으로 산화 알루미늄 표면에 결합하기 위한 카르복시 풍부 도메인을 제공함을 나타낸다.
실시예를 바탕으로, 분자 모델링 작업을 포함하여 추가로 확립된 바와 같이, 산화 알루미늄 표면에 결합하기 위한 카르복시 풍부 도메인은 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기, 또는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내의 10개 이상의 유리 카르복시기, 또는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내의 20개 이상의 유리 카르복시기, 또는 2.2-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는 2.2-17 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 또는 7.0-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는 7.0-17 nm3의 분자 부피 내 20 개 이상의 유리 카르복시기를 제공한다.
인간 프로트롬빈은 NH2-말단 도메인에 10 개의 γ-카르복시 글루탐산 (Gla) 잔기를 포함한다. Gla 잔기는 부속 쌍으로 발생하거나 서로 근접하여 발생한다(잔기 6, 7, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32) (Walz DA et al., 1977; UnitProt Consortium, 2017a). 20 개의 유리 카르복시기를 가진이 10 개의 Gla 잔기는 8.3 nm3의 공간을 차지한다. 이는 2.4 카르복시기/nm3의 밀도를 제공한다. 프로트롬빈은 Ca2+에 대한 높은 친화성 금속 결합 부위를 가지고 있다. 이 결합 부위는 단일 결합 금속 이온을 공유하는 폴리펩티드 사슬 내 두 개의 Gla 잔기에 의해 형성된다. 분자 간 가교가 형성되고, 이는 단백질의 3차 구조를 안정화한다. 알루미나 표면의 계면 분자로 사용될 때, 프로트롬빈의 NH2-말단 도메인에서 고농도의 Gla 잔기는 특정 방향의 산화 알루미늄에 일관된 결합을 제공한다.
도 2는 단백질 구조의 제한된 (8.3 nm3) 부분에 Gla 도메인의 위치를 나타내는 프로트롬빈의 3차원 구조를 나타낸다. 여기서 계면 분자로서, 프로트롬빈은 Gla 도메인에서 산화 알루미늄 표면에 결합하는 것으로 밝혀졌다. Gla는 다른 아미노산에 비해 알루미나 표면에 높은 친화성을 갖기 때문이다. 프로트롬빈은 분자량 72,000 Da, 등전점은 4.7-4.9 범위에 있으며, 및 1μmol/L 이하의 해리 상수를 갖는다(Bajaj et al., 1975; Kotkow et al., 1993; Mann, 1976; UnitProt Consortium, 2017a).
인간 프로트롬빈은 단편 1, 단편 2 및 트롬빈으로 구성된 3-도메인 단백질이다. Gla 잔기 (10)는 모두 단편 1에 있다. 이는 155 개의 아미노산 잔기 (인간)로 구성된다. Gla 잔기는 모두 처음 32 개 아미노산 잔기에 위치한다. 따라서 이 잔기는 알루미나 기판에 대해 높은 친화성을 갖는다. 20개의 유리 카르복시기를 갖는 이 10 개의 Gla 잔기는 8.3 nm3의 공간을 차지한다. 이는 2.4 카르복시기/nm3의 밀도를 제공한다.
계면 분자의 카르복시 풍부 도메인은 비타민 K 의존성 단백질의 Gla 도메인 또는 비타민 K 의존성 단백질의 단편의 Gla 도메인을 변형함으로써 제공될 수 있다. 변형은 당업자에게 잘 알려진 유전 공학 기술 또는 습식 화학에 의해 달성될 수있다.인자 II의 단편 1은 아스파르트산과 같은 디카르복시 아미노산으로 변형될 수 있다. 이는 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 10 개의 Asp 잔기가 있는 도 5에 나타난다. 이는 알루미나 기판에 결합이 일어나는 구조의 기저에 8.7 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 10 개의 유리 카르복시기를 갖는 이 10 개의 Asp 잔기는 8.7 nm3의 공간을 차지한다. 이는 1.15 카르복시기/nm3의 밀도를 제공한다. 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 6)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인자 II의 단편 1은 아스파르트-아스파르트산과 같은 한 쌍의 디카르복실 아미노산으로 변형될 수 있다. 도 7에는 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하는 구조의 기저에 7.7 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 20 개의 유리 카르복시기를 갖는, 이 20 개의 Asp 잔기는 8.7 nm3의 공간을 차지하고, 2.60 카르복시기/nm3의 밀도를 제공한다. 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 8)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인자 II의 단편 1은 아스파르트-글루탐산과 같은 한 쌍의 디카르복시 아미노산으로 변형될 수 있다. 도 9에는 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 (Asp-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하는 구조의 기저에 8.5 nm3의 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 20 개의 유리 카르복시기를 갖는, 이 10 개의 Asp-Glu 잔기는 8.5 nm3의 공간을 차지하고, 2.35 카르복시기/nm3의 밀도를 갖는다. 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 10)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인자 II의 단편 1은 글루탐산-아스파르트산과 같은 한 쌍의 디카르복시 아미노산으로 변형될 수 있다. 도 11에는 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Asp) 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하는 구조의 기저에 12.5 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 20 개의 유리 카르복시기를 갖는, 이 10 개의 Glu-Asp 잔기는 12.5 nm3의 공간을 차지하고, 1.60 카르복시기/nm3의 밀도를 갖는다. 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 12)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인자 II의 단편 1은 글루탐산-아스파르트산과 같은 한 쌍의 디카르복시 아미노산으로 변형될 수 있다. 도 13에는 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 (Glu-Glu) 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하는 구조의 기저에 11.8 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 20 개의 유리 카르복시기를 갖는, 이 10 개의 Glu-Glu 잔기는 11.8 nm3의 공간을 차지하고, 1.69 카르복시기/nm3의 밀도를 갖는다. 인자 II의 변형된 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 14)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
소의 프로트롬빈은 단편1, 단편2 및 트롬빈으로 구성되는 3-도메인 단백질이다. 도 15는 Gla 잔기 (10)가 모두 단편 1에 위치한 것을 나타낸다. 이는 156개의 아미노산으로 구성된다. Gla 잔기는 처음 33개의 아미노산 잔기에 위치한다. 이 부분은(moiety) 알루미나 기판에 대해 높은 친화성을 갖는다. 20개의 유리 카르복시기를 갖는, 이 10 개의 Gla 잔기는 7.0 nm3의 공간을 차지한다. 이는 2.4 카르복시기/nm3의 밀도를 제공한다. 인자 II의 변형된 소의 단편 1의 3차원 구조에 대한 표면 전하 맵(도 16)은 알루미나와의 결합을 촉진하는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
계면 분자 및 생체 분자는 당업자에게 잘 알려진 유전 공학 기술에 의해, 카르복시 풍부 도메인이 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항체, 탄수화물, 앱타머 또는 지질에 포함되는 방식으로 조작된 분자로 형성될 수 있다. 예를 들어, 인간 인자 II의 단편 1 또는 Gla 도메인을 포함하는 비타민 K 의존성 단백질의 단편을 IgG 구조의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 제공하기 위해, IgG 중쇄의 카르복시 말단에 첨가될 수 있다. 유사하게, 카르복시 풍부 도메인을 관심 항원의 서열에 추가하여 면역 분석을 위한 합성 항원을 생성할 수 있다. 예를 들어, 뎅기 바이러스에는 5 ~ 7 개의 혈청형이 있으며, 각 혈청형에 특이적인 합성 항원은 카르복시 풍부 도메인으로 조작될 수 있다. 산화 알루미늄 표면에 다중 패턴으로 배치하면, 질병이 빠르게 진단될 수 있다.
인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Asp)는 도 17에 도시된 바와 같이, IgG 종쇄의 카르복시 말단에 첨가될 수 있다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 Asp 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하도록 IgG 구조의 기저에 3.6 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 이는 3.03 카르복시기/nm3의 밀도를 갖는 도메인이다. IgG 중쇄의 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Asp)의 3차원 구조의 표면 전하 맵(도 18)은 알루미나에 결합을 촉진하는 카르복시기 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Glu)는 도 19에 도시된 바와 같이, IgG 종쇄의 카르복시 말단에 첨가될 수 있다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 Gla 잔기 대신 10 개의 Glu 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합하도록 IgG 구조의 기저에 3.7 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 이는 2.70 카르복시기/nm3의 밀도를 갖는 도메인을 생성한다. IgG 중쇄의 말단에 첨가된 인간 인자 II의 변형된 단편 1(Gla 대신 Asp)의 3차원 구조의 표면 전하 맵(도 20)은 알루미나에 결합을 촉진하는 카르복시기 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
단백질 A의 단편 B 도메인은 인간 인자 II의 단편 1의 처음 32 개 아미노산에 연결될 수 있다. 단백질 상의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 10 개의 Gla 잔기가 있다. 이는 알루미나 기판에 결합할수 있도록 단편 B 구조의 기저에 2.2 nm3 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. 이는 nm3 당 9.09 카르복시기를 갖는 도메인을 생성한다. 인간 인자 II의 단편 1의 처음 32 개 아미노산에 연결된 단백질 A의 단편 B의 3차원 구조의 표면 전하 맵(도 22)은 알루미나 기판에 결합하도록 하는 단편 B 구조의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인에서 표면 전하의 농도를 나타낸다.
인간 인자 IX (hFIX)는 혈액 응고의 내인성 경로에 관여하는 비타민 K 의존성 혈장 세린 프로테아제(vitamin K dependent plasma serine protease)이다. pre-pro 자이모겐 형태로, 461개의 아미노산으로 구성된다. 성숙한 구조로 생합성하는 동안, pre- 및 pro- 펩티드가 제거된다. 성숙한 hFIX는 NH2- 말단 근처에 12 개의 Gla 잔기를 포함하여, Gla 풍부한 도메인을 생성한다. 단백질의 이 영역은 금속 이온에 대한 친화성을 갖는 막 고정 도메인이다(Furie & Furie, 1988; 1992; Furie et al., 1979). 알루미나 기판 표면에 친화성을 가질 수 있는 12 개의 다른 금속 결합 부위도 있다(UnitProt Consortium, 2017b). 도 3은 hFIX의 3 차원 구조를 도시한다. 이미지는 금속에 대한 친화성이 높은 Gla 풍부 도메인을 식별한다. 이 도메인은 부피가 17.0 nm3이고 알루미나 기판에 결합이 발생하는 구조의 기저에 위치한다. 이 도메인에는 nm3 당 1.4 카르복시기의 밀도를 제공하는, 24 개의 카르복시기가 있다.알루미나 기판에 대한 hFIX의 결합 방향은 Gla 도메인에 있다. 이 방향에서 단백질은 넓은 염기를 가지고 있어 구조적으로 안정적이다. 이는 hFIX 단백질이 배향을 바꿀 가능성이 낮기 때문에 결합 방향은 일관적임을 시사한다. 예측 가능하고 일관된 결합 방향이 고정된 단백질의 일관된 특성을 가져오므로 바람직하다. 인자 IX는 분자량이 55,000 Da이고, 등전점은 4.2-4.5 범위이고, 1.0 μmol/ L 미만의 해리 상수를 갖는다(Amphlett et al., 1978; Nelsestuen et al., 1978; Thompson, 1986; UnitProt Consortium, 2017b).
단백질 S는 응고 인자 V/Va 및 인자 VIIIa의 분해에서 활성화된 단백질 C (APC)에 대한 비-효소 보조 인자 역할을 하는 당 단백질이다. NH2 말단 근처에 11개의 Gla 잔기가 있고, 이는 막 결합에 중요한 역할을 하고 알루미나 기판에 결합하는 부위이다. 단백질 S는 분자량 69,000 Da, 등전점은 5.0-5.5 범위이며 해리 상수는 0.005 μmol/L(Lundwall et al., 1986; Walker, 1981; Sugo et al 1986; UnitProt Consortium, 2017c)이다. 도 4는 단백질 S의 3차원 구조와 Gla 도메인(잔기 42-87)의 일반적인 위치를 나타낸다. Gla 도메인은 NH2- 말단에 가깝게 위치하여, 구조 외부에 노출되고 알루미나 기판에 대한 단백질의 결합 부위임을 시사한다. 이는 알루미나 기판에 결합이 발생하는 구조의 기저에 12.3 nm3 카르복시 글루탐산 도메인을 형성한다. 도메인에는 nm3 당 1.79 카르복시기의 밀도를 제공하는, 22개의 카르복시기가 있다.
단백질 소스(source) 변화(change) 도메인 부피(nm 3 ) 밀도(COOH/nm 3 )
FII natural none 8.30 2.4
FII-frag1 natural none 8.30 2.4
FII-frag1-Asp synthetic Asp for Gla 8.65 1.15
FII-frag1-Asp-Asp synthetic Asp-Asp for Gla 7.70 2.6
FII-frag1-Asp-Glu synthetic Asp-Glu for Gla 8.50 2.35
FII-frag1-Glu-Asp synthetic Glu-Asp for Gla 12.50 1.6
FII-frag1-Glu-Glu synthetic Glu-Glu for Gla 11.80 1.69
FII-frag1-Bovine natural none 7.00 2.86
FII-frag1-IgG-Asp synthetic Asp for Gla on IgG 3.60 2.8
FII-frag1-IgG-Glu synthetic Glu for Gla on IgG 3.70 2.7
FII-frag1 on Prot. synthetic Fusion protein 2.20 9.09
FIX natural none 17.00 1.40
Protein S natural none 12.30 1.79
ii) 산화 알루미늄 표면
산화 알루미늄 표면은 하소된 알루미나, 다양한 전이 알루미나(예: 감마, 에타, 델타), 산화 알루미늄 하이드록시기(예: 보에마이트(boehmite) 및 비정질 알루미나(예: 알루미늄 천연 산화물, 양극 산화 알루미늄 및 알루미늄 합금)를 포함하는 산화 알루미늄 및 하이드록시기의 형태를 취할 수 있다. 일반적으로, 계면 분자에 대한 결합은 양성자화된 하이드록시 표면 기와의 리간드 교환을 통해, 또는 노출된 알루미늄 이온과 같은 양전하를 띤 표면 부위와 폴리음이온 그룹 사이의 정전기적 인력을 통해, 양이온 표면 부위에서 발생한다.
산화 알루미늄 표면은 입자, 분말, 자성 비드, 박막, 슬라이드 또는 코팅과 같은 기판 상에 형성될 수 있다. 산화 알루미늄 표면은 알루미늄 금속 또는 알루미늄 합금을 스퍼터링, RF 스퍼터링, 반응성 스퍼터링, 화학 기상 증착, 증발, 주조 또는 압출하는 방식으로 형성될 수 있고, 추가로 양극 산화 처리하여 다공성 양극 산화 알루미늄 표면을 제공할 수 있다.
iii) 생체 분자
생체 분자는 위에서 광범위하게 정의되었다. 친화성 결합 분석의 경우 생체 분자는 결합 쌍의 구성원 일 수 있다: 항체-항원, 항체-합텐, 효소 기판, 효소 수용체, 합텐-호르몬, 독소 수용체, 단백질-단백질, 아비딘-비오틴, 앱타머-앱 타머 표적, 단백질-약물 및 약물 수용체-약물.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 계면 분자에 결합된 생체 분자의 결합 파트너 또는 생체 접합체는, 결합 쌍에 대한 진단 테스트에 사용되는 경우, 관심 분석물이라고 한다.
일반적으로 결합 쌍 사이의 결합을 분자 결합이라고 한다. 결합 쌍에 따라 분자 결합은 비공유 결합, 가역적 공유결합 또는 비가역적 공유결합일 수 있다. 분자 결합에 참여하는 생체 분자에는 일반적으로 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 약물과 같은 작은 유기 분자 (천연, 생합성, 합성 또는 유도체화 여부 무관)가 포함된다.
iv) 가교제
계면 분자 또는 생체 분자를 갖는 계면 분자의 변형된/조작된 분자는 이미도에스테르(imidoesters), 글루타르 알데히드, 카르보디이미드(carboiimides), 말레이미드(maleimides), 할로아세틸(haloacetyles), 히드라지드(hydrazides), 뿐만 아니라 당업자에게 일반적으로 공지된 다른 가교제를 포함하는 임의의 수의 동종- 또는 이종이기능성 가교제를 사용하여 활성화될 수 있다. 동종이기능성 가교제는 일 예로 펜탄 -1,5- 다이알이다. 이종이기능성 가교제는 일 예로, PDPH(3- [2-pyridyldithio] propionyl hydrazide)이다. 계면은 가교제를 통해 단백질/펩티드, 탄수화물, 핵산 및 지질과 같은 생체 분자에 결합될 수 있다. 이렇게 결합된 단백질/펩티드, 탄수화물, 핵산 및 지질은 표면에 유지되고 생물학적 정체성을 유지하며, 구조적으로 온전한 상태로 유지되어 원래 물질로 인식되고 따라서 항원, 항체, 앱타머 등과 상호작용한다. 가교제는 당업계에 잘 알려진 바와 같이 계면 분자와 생체 분자의 화학 성분에 따라 달라진다. 일반적인 가교제의 목록은 https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf. 에서 찾을 수 있다.
v) 양극 산화
알루미늄 또는 양극 산화가 가능한 알루미늄 합금 재료를 양극 산화 처리에 사용하여 배리어 또는 다공성 알루미나 층을 생성할 수 있다. 양극 알루미나 필름의 주요 지배 요인은 전해질 유형(Ono, Masuko 2003, Abd-Elnaiem, Gaber 2013), 강도 (예, 농도 또는 pH) (Belwalkar et al. 2008, Araoyinbo et al. 2010, Yim et al. 2007), 및 온도 (Li, Zhang & Metzger 1998, Abd-Elnaiem, Gaber 2013, Yim et al. 2007), 및 전압 (Zhu et al. 2011, Ono, Masuko 2003, Belwalkar et al. 2008, Rahman et al. 2012, Abd-Elnaiem, Gaber 2013, Yim et al. 2007)을 포함한다. 이러한 매개 변수는 층의 용해 및 에칭 속도와 함께 기공 직경 및 기공 벽 두께를 통해 다공성을 제어한다(Van Overmeere et al. 2010). 산화 중 추가 처리에는 전처리(Zhu et al. 2011) 및 후처리가 포함될 수 있다.
알루미나가 전해질(예: 옥살산, 황산 및 인산)에 용해되면, Al3+가 용해되고 다공성 알루미나 층이 형성된다. 양극 산화의 초기 기간 동안 저항성이 높은 Al2O3 배리어 필름이 알루미늄 층에 형성된다. 추가 양극 산화 처리는 배리어 필름을 통한 개별 경로의 전파를 초래하며, 이는 기공 형성의 전구체에 해당한다. 다음으로, 배리어 필름이 파괴되고, 다공성 구조가 형성된다. 알루미늄 층에서 다공성 산화물 형성이 완료되면 밑에 있는 층의 양극 산화가 발생한다(예: Ta). 배리어 산화물 층이 완전히 형성되면 전류 밀도가 거의 0이 된다(Eftekhari 2008).
특히 흥미로운 것은 시각적 분석에 사용하기 위해 반사성 금속 위에 형성된, 다공성 양극 산화 처리된 표면이다. 산화 알루미늄 표면은 산화 알루미늄의 다공성 층으로 덮일 때 색상을 생성할 수있는 반사성 금속 위에 제공된다. 산화 알루미늄 표면은 위와 같이 양극 산화 처리되어 다공성 양극 산화 처리된 표면을 제공하며, 샘플과 접촉하여 생체 분자에 특이적인 분석물을 테스트할 때, 생체 분자 결합시 분석물의 존재를 나타내는, 색 변화가 감지되도록 한다.
vi) 용매
산화 알루미늄 표면에 계면 분자를 고정하는데 사용하기 적합한 용매는 일반적으로 수용액, 바람직하게는 염 함량이 낮고 알루미나 표면에 대해 높은 친 화성을 갖는 음이온이 없는 수용액이다(예: 포스페이트, 카르복실레이트, 황산염). 결합 시간은 표면 범위, 용매 및 용액의 pH에 따라 달라질 수 있다.
vii) 신호 증폭
산화 알루미늄 표면이 예를 들어 시각적 분석을 위한 색상 생성 장치의 일부인 경우, 일부 응용 프로그램은 신호 증폭, 즉 감지 가능한 색상 변화를 생성하기에 충분한 결합된 층을 장치에 제공하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 항체가 계면 분자에 부착되거나 이와 함께 조작되고, 일치하는 항원이 매우 작은 경우(예: 1.5nm 미만), 필름 두께 변화가 충분히 크지 않아(일반적으로는 1.5nm 이상) 항원 결합시 색상 변화가 유의미하지 않을 수 있다. 신호를 증폭하기 위해 (즉, 감지 가능한 색상 변화), 표면이 항원 관심 분석물을 함유하는 샘플에 노출된 후 표면에 두 번째 항체를 추가할 수 있다. 항원에 특이적인 두 번째 항체는 첫 번째 항체에 결합된 항원에 결합한다. 이 두 번째 항체의 결합은 원하는 항원이 첫번째 항체에 결합된 경우에만 발생하고, 필름 두께를 예를 들어, 약 7nm 증가시킨다. 이러한 두께 증가는 간섭 색상에 극적인 변화를 가져와 감지될 수 있도록 한다.
신호 증폭의 한 가지 예가 도 28에 나와 있다. 도 28은 위에서 설명한대로 준비된 기본 반사층 위에 산화 알루미늄의 얇은 층인 산화 알루미늄 표면을 나타낸다. 항체 (IgG)는 FII의 Fragment 1의 Gla 도메인이 Fc 구조의 하나의 말단에 포함되어 있다. IgG가 그 Fc 구조의 Gla 도메인을 통해 산화 알루미늄 표면에 결합되어 있다. 조작된 항체가 특정 항원에 결합되어 있는 것으로 나타난다. 두 번째 항체는 신호를 증폭하는데 사용할 수 있는 표적 항원에 결합하는 것으로 나타난다. 두 번째 항체는 변형되지 않거나 또는 전체 장치의 신호를 증폭하기 위해 연결된 효소 또는 방사성 표지로 변형될 수 있다.예를 들어, 신호 증폭을 사용하여 호르몬 분자와 같은 작은 분자를 감지할 수 있다. 테스토스테론(C19H28O2)의 분자량은 288이고 탄소 골격은 19 개이다. 길이가 약 2nm이고 폭이 1nm 미만으로, 간섭 색상 기반 분석에서 검출의 하한을 둔다. 신호를 증폭하기 위해 시스템에 테스토스테론-항체 복합체를 인식하는 두 번째 항체를 추가할 수 있다. 테스토스테론이 항체에 결합하면, 두 번째 항체가 결합하다. 이것은 광학 경로 길이를 약 7-10 nm까지 증가시켜 신호를 효과적으로 증폭하고, 관심 호르몬이 검출될 수 있게 한다.
viii) 키트 및 진단 애플리케이션
진단 테스트와 같은 일부 실시예에서, 본 발명은 슬라이드와 같은 적절한 기판 상에 산화 알루미늄 표면을 제공하는 진단 장치를 포함하는 진단 시스템 또는 키트로 확장된다. 시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 경우, 진단 장치는 산화 알루미늄의 다공성 층으로 덮었을 때 색을 발생시킬 수 있는 탄탈룸과 같은 반사성 금속 위에 제공된 산화 알루미늄 표면을 포함한다. 이러한 응용에서, 산화 알루미늄 표면은 다공성 양극 산화 처리된 표면으로 제공된다. 시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 계면 분자는 산화 알루미늄 표면에 제공되고, 특정 항원은 계면 분자에 부착되어 있다. 이는 특정 항원을 이용하여, 항원이 체액, 조직 등과 같은 테스트 용액과 접촉할 때 항원 및 항체의 결합시 장치에서 눈에 띄는 색 변화가 발생하므로, 해당 항원(분석물)에 특이적인 항체의 존재를 감지하는 키트이다.
시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 상기에 명시된 바와 같은 진단 장치를 포함하나, 특정 항체와 접합된다. 일부 응용에서, 특정 항체는 계면 분자로서 카르복시 풍부 도메인을 포함하도록 조작된다. 이 키트를 사용하면 항원 결합시 장치에서 눈에 띄는 색상 변화가 발생하기 때문에 테스트 용액에서 특정 항원을 검출할 수 있다.
시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 상기 기재된 바와 같은 진단 장치를 포함하나, 계면 분자에 특이적인 제 1 항원 결정기 (Fab1) 및 시험 샘플에서, 항원과 같은 관심 분석물에 특이적인 제 2 항원 결정기(Fab2)를 갖는 이중 특이적 조작된 항체에 부착된다. 이 키트를 사용하면 항원이 조작된 항체에 결합할 때, 가시적인 색상 변화가 발생하므로, 테스트 용액에서 특정 항원을 검출할 수 있다. 이중 특이적 항체 합성 기술은 잘 알려져 있다(예를 들어 Brinkmann, Ulrich et al. 참조).시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 위에 제시된 바와 같은 진단 장치를 포함하나, 앱타머와 접합된다. 앱타머는 가시적 인 색 변화를 보이며, 특이적 표적 분자에 결합한다.
시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 위에 제시된 바와 같은 진단 장치를 포함하나, 계면 분자로서 카르복시 풍부 도메인을 포함하는 조작된 단백질 A에 접합된다. 이 단백질 A는 눈에 띄는 색 변화와 함께 이에 상응하는 특이적 항원을 검출하기 위해 항체의 적절한 방향을 보장하는, 항체의 FC 영역에 결합한다.
시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 위에 제시된 바와 같은 진단 장치를 포함하나, 계면 분자는 가교제에 대한 부착에 의해 변형되거나 활성화된다. 가교제는 가시적 색 변화를 보이며, 테스트 샘플 내의 특정 관심 분석물(예: 소변 내 단백질)에 결합한다.
시각적 분석 또는 시각적 진단 장치의 일부 실시예에서, 키트는 위에서 설명한 바와 같은 산화 알루미늄 표면을 포함하지만, 계면 분자 및 가교제 또는 생체 분자는 산화 알루미늄 표면과 별도로 제공되고, 예를 들어, 다음 중 하나를 제공한다:
계면 분자에 부착된 또는 부착되기 위한 가교제로, 관심 분석물에 결합할 수 있는 가교제; 또는
계면분자에 부착된 또는 부착하기 위한, 관심 분석물에 특이적인 생체분자; 또는
관심 분석물에 특이적인 제 2 항원 결정기를 갖고 제 1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착된, 또는 부착되기 위한 조작된 항체의 형태인 생체 분자.
키트의 구성으로 시험 전에 복합화를 위한 계면 분자를 별도로 포함할 수 있고, 또는 키트에서 계면 분자 및 가교제 또는 생체 분자는 계면 복합체로 형성될 수 있다. 계면 복합체는 분석물 테스트를 위해 샘플과 접촉하고, 이후 샘플 및 계면 복합체는 산화 알루미늄 표면에 접촉된다. 키트는 감지 가능한 색 변화로 산화 알루미늄 표면에의 분석물 및 계면 복합체의 결합시 분석물의 존재를 감지한다.
진단 장치 외에도, 이러한 키트에는 일반적으로 장치를 수용하는 컨테이너와 하나 이상의 기타 구성요소가 포함된다. 키트는 하나 이상의 컨테이너에 제약 또는 진단 등급 구성요소(예: 가교제, 분석 표준, 테스트 구성요소 등)를 포함할 수 있습니다. 키트에는 장치 또는 구성요소의 사용을 홍보하거나 설명하는 설명서 또는 라벨이 포함될 수 있다. 구성요소 패키징에 대한 설명서가 포함될 수 있다. 설명서에는 임의의 방식으로 제공되는, 예를 들어, 키트의 하나 이상의 구성 요소를 혼합하거나 및/또는 샘플을 분리 및 분석하기 위한, 구두 또는 전자 설명도 포함될 수 있다.
샘플에서 개별 분석물의 정량화를 용이하게 하기 위해, 분석 구성 요소는 분석물에 대한 표준을 사용할 수 있다. 여기서 표준은 분석의 정량화를 위해 장치에 제공되는, 검출되는 분석물의 사전 결정량이다. 표준을 분석하여 분석물 양과 샘플에 존재하는 분석물의 양을 동일시하는 작업 곡선을 생성할 수 있다. 시각적 분석의 경우, 표준에는, 진단 장치 사전 테스트, 음성 결과 및 양성 결과를 나타내는 샘플 색상 차트가 포함될 수 있다.
단백질 인쇄 기술은 잘 알려져 있으며 계면 분자, 생체분자 또는 계면 분자 및 생체 분자의 복합체를 인쇄하는데 사용할 수 있다(예를 들어, Delaney, Joseph T et al., McWilliam I, et al. 및 Li, J et al.). 예를 들어, 잉크젯 프린터를 사용한 단백질 프린팅은 테스트를 다중화하기 위해, 서로 다른 단백질 배열을 증착하는데 사용할 수 있다. 각 단백질은 표적 분자(예: 항체, 항원, 압 타머, DNA 가닥 또는 RNA 가닥)가 존재하는 경우 변화하는, 색을 형성한다. 예를 들어, 특정 패턴으로 산화 알루미늄 표면에 다른 단백질을 배치하여 면역 분석을 다중화 할 수 있다. 이러한 패턴은 직선, 곡선, 원, 점 또는 복합 패턴 형태 일 수 있다. 테스트 샘플의 다양한 분석물에 대한 결과를 제공한다. 결과는 인쇄된 패턴의 여러 부분의 색상 변화에 의해 결정된다. 예를 들어, 다양한 항원이 Chikungunya, Dengue Fever, Yellow Fever 및 Zika의 원인이 되는 특정 바이러스의 특징적인 진단 표면에 결합될 수 있다. 진단 기술은 특정 부위의 색 변화에 따라 질병뿐만 아니라 현재 혈청형도 식별한다. 이 다중 검사는 단일 샘플에 하나 이상의 바이러스 또는 혈청형으로 감염된 환자의 사례를 밝혀낸다.일부 응용 분야에서 생체 분자에 대한 분석물-특이적 결합은 임의의 적합한 검출기를 사용하여 검출할 수 있으며, 수행되는 테스트 또는 분석 유형에 따라 달라진다. 일반적으로, 검출기는 조명원 및 검출 전자 장치를 포함한다. 광원은 예를 들어, 현장 진단(point-of-care diagnostic)을 위한 일광(daylight)이거나 LED, 레이저 및 필라멘트 램프와 같은 기타 광원 일 수 있다. 이러한 광원은 광학 필터, 편광판, 회절 격자 및 빛의 특정 스펙트럼을 제공하기 위한 기타 광학 구성과 함께 사용될 수 있다. 생체 발광, 형광 등과 같은 다른 형태의 방사선을 사용할 수 있다. 여기 파장(excitation wavelength)은 가시 영역(300-700 nm 파장)에 있을 수 있고 또는 적외선 및 자외선과 같은 그 외 파장일 수 있다. 흡수, 반사 또는 재방출된 빛은 눈(가시 파장의 경우)을 사용하거나, 또는 포토다이오드 또는 광전자증배관(photomultiplier)과 같은 감광성 검출기를, 분광 및/또는 공간 필터링과 결합하여, 사용하여 관찰 및/또는 감지될 수 있다.
색상 변화가 가시적 감지 한계 미만이고 눈으로 감지할 수 없는 경우, 민감한 감지 방법을 사용할 수 있다. 디지털 이미지 분석, 분광 광도계 및 기타 광자 계수 감지기를 사용하여 반사된 파장의 변화를 분석할 수 있다. 고해상도 이미지의 캡쳐 및 디지털 처리는 일반적으로 생물학적 연구에서 색상 패턴을 정량화하고 분석하는데 사용되므로, 당업계에서 잘 알려진 기술도 마찬가지다. 디지털 처리를 통해 가시적 색상의 정량화를 수행할 수 있다. 색상을 구별하기 위해 플롯을 사용할 수 있다. 색도 좌표의 2D 플롯을 허용하는 International Commission on Illumination) 또는 Commission Internationale de I = Ecla (CIE) 색 공간을 사용하여 생성된다. 분광 광도계는 사람이 감지할 수 있는 것 이상으로, 반사율 특성에 대한 전체 스펙트럼 측정으로, 분석을 제공할 수 있다. 매우 낮은 수준의 광도의 경우, 광자 계수 검출기 어셈블리(예: 광전자증배관)를 사용하여 검출 전에 신호를 곱하여 광자 수를 측정할 수 있다.
적합한 검출기의 한 가지 예는 반사 표면의 반사율을 측정하는 반사 분광계이다. 대안으로 검출기는 카메라 또는 이미징 장치 일 수 있다. 검출은 시각적 분석과 같이 현장 진단 현장에서 이루어질 수 있고, 또는 샘플 수집 또는 환자 현장에서 떨어져서 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 검출된 분석물 특이적 결합을 임의의 데이터 획득 구성 요소에 의해 획득된 데이터와 통합하기 위해 데이터 통합, 분석, 저장 및 전송을 위한 컴퓨터로 확장될 수 있다. 통합된 결합 및 데이터는 후속 액세스를 위해 컴퓨터에 의해 분석되고 저장될 수 있다. 컴퓨터는 일반적으로 하나 이상의 알고리즘 및/또는 소프트웨어에 액세스하여 분석 구성요소의 데이터를 분석하여 예를 들어, 컴파일 된 곡선 또는 표준 곡선과 비교하여, 테스트 중인 분석물의 존재 및/또는 양을 결정하는 운영 체제를 포함한다. 원시 데이터 및/또는 통합 및 분석된 데이터가 컴퓨터 디스플레이 또는 휴대 전화, PDA 등과 같은 컴퓨터 화면에 표시된다. 분석 구성요소에 대한 정보를 자동으로 입력하기 위해 바코드 판독기가 제공될 수 있다. 바코드 판독기는 분석할 테스트를 식별하고 사용자 에러를 줄이기 위한 특정 테스트의 원 포인트 분석 교정을 자동으로 시작하는 바코드 활성화 시스템과 결합될 수 있다. 각각의 개별 분석 구성 요소는 판독될 고유 바코드를 포함하고 적절한 알고리즘이 사용되도록 장치를 초기화하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 분석 구성 요소의 예시적인 실시예는 도 36a(바코드) 및 36b(QR 코드)에 도시된다.
진단 장치는 위에서 설명한 것과 같은 하나 이상의 구성 요소를 포함하는 휴대용 장치 또는 키트와 같은 샘플 장치로 조정될 수 있다.
ix) 응용
본 발명에 따른 카르복시 풍부한 도메인을 제공하는 계면이 고정되는 산화 알루미늄 표면은 광범위하게 적용되고, 그 예로 다음이 포함될 수 있다: 생체 의학 적용에서와 같이, 다양한 제품을 위한 다양한 표면 상의 단백질 코팅; 시각적 면역 분석으로 의료 진단 장치용 양극 박막에의 코팅, 환경 모니터링을 위한 양극 박막에의 코팅; 식품 안전 진단 장치를위한 양극 박막 상의 코팅; ELISA 테스트 등을 위한 마이크로 타이터 플레이트의 양극 필름 상의 코팅; 진단용 MEMS/NEMS 상의 코팅, 표적 치료 전달을 위한 나노 입자 상의 코팅; 콘트라스트 이미징을 위한 나노 입자 상의 코팅; 컬럼 기반 친화성 분리 용도를 위한 알루미나 입자; 생체 분자 및 세포의 친화력 회복을 위한 자기 입자; 테스팅 전에 항체의 진실성을 확인하기 위한 연구 분석; 테스트를 용이하게 하기 위한 플라스틱 샘플 컵 및 뚜껑용 코팅, 및 의료 기기 또는 임플란트 상의 코팅.
본 발명은 또한 하기의 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
실시예
(i) 친화성 장치(affinity device)로서의 산화 알루미늄 표면 및 계면 분자
실시예 1
본 실시예는 프로트롬빈이 계면 분자로서 고정된 알루미나 기판에 단백질 (특히 바이러스 항원)의 결합을 나타낸다. 알루미늄 기판은 먼저 탄탈룸을 비정질 지지체에 200nm 두께로 스퍼터링하고, 이어서 탄탈룸(Ta)에 120nm의 두께로 알루미늄을 스퍼터링하여 제조된다. 알루미늄은 전류가 거의 0mA로 감소할 때까지 0.4M 인산의 전해질로 8V에서 인산 양극 산화를 이용하여 수행된 전기 화학적 산화(anodization)를 통해 알루미나로 전환되었다. 두께 14nm의 Ta2O5층 위에 약 190nm 두께의 Al2O3 층을 생성했다. 15°에서 백색광으로 편광판을 통해 관찰했을 때 생성된 소자의 색상은 금색이었다. 프로트롬빈을 100 % RH 환경에서 30 분 동안 알루미나 표면 (1mg/mL 용액 10μL)에 둔 다음 탈이온수로 완전히 헹구었다. 장치를 자연 건조시킨 후, 색상이 녹으로 변했다. 그 다음, 장치를 pH 6.9의 25mM 인산염 완충액이 있는 0.5%(v/v) 글루타르 알데히드 용액에 60분 동안 담궜다. 다시 탈 이온수로 헹군 뒤, 인플루엔자 B 바이러스 항원을(1.75 mg/mL 용액 10μL)(strain Hong Kong 5/72) 표면에 60 분 동안 두었다. 장치를 25mM 인산염 완충액에서 60분 동안 헹구고 자연 건조시킨 뒤, 색상이 라벤더로 변하였다. 항원의 고정으로 인한 광 경로 길이의 증가로 색상 변화가 발생하였다.
실시예 2
본 실시예는 IgG와 같은 단백질이 양극 알루미나 표면에 결합하지 않음을 설명한다. 장치는 실시예 1에서와 같이 제작되었고, 프로트롬빈은 실시예 1에서 설명된 것과 동일한 절차로 3 개의 묘사된 스팟 중 2 개에서 표면에 고정되었다. 프로트롬빈 고정 후 녹슨 색이 관찰되었다. 프로트롬빈이 있는 한 스팟과 나머지 빈 스팟에 항-프로트롬빈을 15 분 동안 첨가하고(100μg/mL 용액 10μL) 탈 이온수로 헹구었다. 장치를 공기 건조시킨 후 실시예 1에서와 같이 15°에서 관찰했다. 항원(프로트롬빈)과 단백질 항체(항 프로트롬빈)를 모두 포함하는 지점에서 버건디 스팟이 관찰되었다. 색상 변화는 고정된 단백질이 결합된 항체에 의해 인식되고 단백질 층의 전체 두께를 변화시켰음을 나타낸다. 항 프로트롬빈이 첨가된 빈(프로트롬빈이 없는) 양극 산화물 표면에서는 관찰가능한 색상 변화가 없었다. 이는 표면에 남은 단백질이 빛의 광학 경로 길이를 변경하기에 충분하지 않음을 나타내고, 즉 단백질이 양극 표면에 결합하지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 고정된 프로트롬빈과 결합이 일어나지 않도록 글루타르알데히드를 아미노 단백질, 특히 트리스(히드록시메틸)아미노메탄으로 캡핑함으로써 고정된 단백질을 특이적으로 만드는 방법을 보여준다.장치를 제조하고, 프로트롬빈을 표면에 고정시키고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 글루타르 알데히드 용액을 첨가한 다음, 장치를 1x TBS 완충액에 담가 결합에 개방된 모든 글루타르알데히드를 캡핑했다. 단백질(특히 IgG 항체, 염소가 키운 항 인플루엔자 B) 층을 표면에 30분 동안 놓은 다음 탈 이온수로 헹구었다. 장치를 자연 건조시킨 후 15°에서 관찰하였다. 눈에 띄는 색 변화가 발견되지 않았다. 이러한 색 변화가 없다는 것은 추가된 비특이적 항체에 대한 노출에 의해 광 경로 길이가 변경되지 않았음을 나타낸다. 이는 장치가 비특이적 단백질에 거짓 양성이 없는 친화성 기판으로 기능한다는 것을 보여주는데 중요하다.
실시예 4
본 실시예는 항원을 프로트롬빈 계면에 결합하여 표면의 항체-항원 복합체에 대한 시각적 분석을 보여준다. 장치를 제조하고, 프로트롬빈을 표면에 고정시키고, 가교제를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 첨가하였다. B형 간염에 대한 합성 표면 항원(Hep B)을 실시예 1과 동일한 절차를 사용하여 프로트롬빈에 결합시켰다. 항원 결합 후 녹슨 색이 관찰되었다. 남은 글루타르 알데히드를 pH 7.0의 0.3M 인산염 완충액 중 0.1M L-리신 용액으로 60분 동안 캡핑하였다. 마지막으로 혈청 샘플(n = 20)을 표면에 15 분 동안 놓고 탈 이온수로 헹구었다. 장치를 자연 건조시킨 후, 15°에서 마젠타 색 점이 관찰되었다. 색상 변화는 결합된 단백질이 결합된 항체에 의해 인식되고 단백질 층 전체 두께를 변화시켰음을 나타낸다.
상기 실시예는 자연적으로 발생하는 단백질 프로트롬빈을 알루미나 상의 계면 코팅으로 사용한다. 이어서 프로트롬빈을 동종- 또는 이종-이기능 분자로 활성화시켜 관심 단백질을 프로트롬빈에 연결시켰다. 프로트롬빈(~ 10nm)이 바람직하지 않은 경우(예: ~ 3nm) 프로트롬빈 분자의 단편 1이 아래의 실시예에 제시된 바와 같이 프로트롬빈 대신 사용될 수 있다. 글루타르 알데히드 또는 임의의 다른 동종- 또는 이종이기능 분자를 사용하여 관심 생체 분자를 단편 1에 연결할 수 있다.
실시예 5
본 실시예는 FII의 단편 1에 항원을 결합하여 표면에 항체-항원 복합체를 형성하는 능력을 설명한다. 장치는 실시예 1과 같이 만들었고 프로트롬빈 대신 단편 1을 알루미늄 표면에 고정하였다. 단편 1을 100 % RH 환경에서 30분 동안 장치 표면 (0.3 mg/mL 용액 10μL)에 놓은 다음 탈 이온수로 완전히 헹구었다. 장치를 자연 건조시킨 후 색이 옅은 녹으로 변했다. B형 간염 바이러스에 대한 항원을 실시예 1과 동일한 가교 과정을 통해 표면에 결합시켰다. B형 간염 항원을 고정화한 후 녹슨 색이 관찰되었다.
남은 글루타르 알데히드를 pH 7.0의 0.3M 인산 완충액 중 0.1M L- 리신 용액으로 60 분 동안 캡핑했다. 마지막으로 항-Hep B 항체를 표면에 15 분 동안 두었고(10μL의 100μg/mL 용액) 탈 이온수로 헹구었다. 장치를 자연 건조한 후 15 °에서 보라색 스팟이 관찰되었다. 색상 변화는 고정된 단백질이 이에 결합된 항체에 의해 인식되고 단백질 층의 전체 두께를 변화시킨 것을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 시험 샘플에서 분석물과의 결합에 사용하기 위해 산화 알루미늄 표면에 고정되고 가교제에 부착하여 활성화된 계면 분자를 나타낸 것이다. 장치는 실시예 1에서와 같이 제조되었고 프로트롬빈은 산화 알루미늄 표면에 두 스팟에 고정되었다. 한 스팟에서는 실시예 1에서 설명한 바와 같이 글루타르 알데히드 가교제를 부착하여 프로트롬빈을 활성화시켰다. 다른 스팟은 변경되지 않았다. 양 스팟 모두 녹슨 색을 띄었다. 넌센스 IgG 용액(즉, 프로트롬빈에 특이적이지 않음)을 두 스팟에 첨가하고 60 분 동안 방치한 다음 세척 단계와 공기 건조를 수행하였다. 활성화된 프로트롬빈이 들어있는 스팟이 보라색으로의 변색이 나타내는 바와 같이, 넌센스 IgG에 결합되었다. 두 번째 스팟은 색 변화가 일어나지 않아 결합이 발생하지 않았음을 나타냈다. 본 실시예는 도 31에 개략적으로 도시되어 있으며, 현장 진료 장치로서, 소변 내 단백질 검출을 위한 진단 테스트를 적용한 예시이다.
(ii) 카르복시 풍부 계면을 갖는 조작된 생체 분자
실시예 7
본 실시예는 알루미나 표면에 결합하기 위한 카르복시가 풍부한 아미노산 서열을 갖는 앵커 단백질로 조작된 계면 분자를 예시한다. 여기서, 인간 인자 II의 단편 1로부터의 처음 32 개 아미노산은 변형되고 안정한 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합된다. 변형된 Fragment 1은 디카르복실 아미노산 Asp와 연관된 카르복시기 클러스터를 통해 알루미나 표면에 결합된다. 단백질에서 부위 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32에 위치한 Gla 잔기는 Asp로 치환된다. 이는 실시예 6에서 천연 단편 1에 비해 표면에 결합할 수 있는 카르복시기의 수를 절반으로 줄였다. 이 치환은, 단백질 폴딩 소프트웨어에 의해 생성된, 구조의 컴퓨터 모델(도 5)에 나타난 바와 같이 단편 1의 아미노 말단에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO.4.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 6)은 알루미나 기판에 대한 결합이 일어나는 조작된 계면 분자의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 보여, 이를 뒷받침한다.
실시예 8
본 실시예는 알루미나 표면에 결합하기 위한 카르복시가 풍부한 아미노산 서열을 갖는 앵커 단백질로 조작된 계면 분자를 예시한다. 여기서, 인간 인자 II로부터 단편 1로부터의 처음 32 개 아미노산은 변형되고 안정적인 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합된다. 변형된 단편 1은 디카르복실 아미노산 Asp (디카르복실산)와 연관된 카르복시기의 클러스터를 통해 알루미나 표면에 결합된다. 단백질의 부위 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32에 위치한 Gla 잔기는 Asp-Asp로 치환된다. 이는 실시예6에서 천연 단편 1과 비교하여 표면에 결합할 수 있는 카르복시기의 수를 유지한다. 이 치환은 구조의 컴퓨터 모델(도 7)에 나타난 바와 같이 단편 1의 아미노 말단에서 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 5.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델 (도 8)은 조작된 계면 분자의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인을 보여주어, 이를 뒷받침한다.
실시예 9
본 실시예는 알루미나 표면에 결합하기 위해 카르복시가 풍부한 아미노산 서열로 조작된 계면 분자를 예시한다. 인간 인자 II로부터 단편 1로부터의 처음 32 개 아미노산은 안정한 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합되도록 변형된다. 변형된 단편 1은 디카르복실 아미노산 Asp-Glu와 연관된 카르복시기의 클러스터를 통해 알루미나 표면에 결합된다. 단백질의 부위 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32에 위치한 Gla 잔기는 Asp-Glu로 치환된다. 이는 실시예 6에서 천연 단편 1와 비교하여 표면에 결합할 수 있는 카르복시기의 수를 유지한다. 이 치환은 구조의 컴퓨터 모델(도9)에 나타난 바와 같이 단편 1의 아미노 말단에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 6.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 10)은 이를 뒷받침하여 조작된 계면 분자의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인을 보여준다.
실시예 10
본 실시예는 인간 Factor II의 Fragment 1의 처음 32 개 아미노산이 안정한 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합되도록 변형된 조작된 계면 분자를 나타낸다. 변형된 단편 1이 디카르복실 아미노산 Glu-Asp 와 연관된 카르복시기 클러스터를 통해 알루미나에 결합되어 있다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기는 Glu-Asp 로 치환되었다. 이는 실시예 6에서 천연 단편 1과 비교하여 알루미나 표면에 결합하기 위해 이용 가능한 카르복시기의 수를 유지한다. 이 치환은 구조의 컴퓨터 모델에(도 11) 도시된 바와 같이 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변 된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 7.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 12)은 이를 뒷받침하여 조작된 계면 분자의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인을 보여준다.
실시예 11
본 실시예는 추가로 조작된 계면 분자를 나타낸다. 인간 인자 II의 단편 1로부터의 처음 32 개 아미노산은 안정한 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합되도록 변형된다. 변형된 단편 1이 디카르복실 아미노산 Glu-Glu와 연관된 카르복시기 클러스터를 통해 알루미나에 결합되어 있다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기는 Glu-Glu로 치환된다. 이는 실시예 6에서 천연 단편 1과 비교하여 알루미나 표면에 결합하기 위해 이용 가능한 카르복시기의 수를 유지한다. 이 치환은 구조의 컴퓨터 모델(도 13)에 도시된 바와 같이 단편 1의 아미노 말단에서 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 8.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 14)은 이를 뒷받침하며 조작된 분자의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인을 보여준다.
실시예 12
본 실시예는 소 인자 II의 단편 1의 계면 분자를 예시한다. 소 단편 1은 인간 단편 1에 비해 위치 4에 여분의 아미노산이 삽입 되어있다. 소 단편 1의 사용은 구조의 컴퓨터 모델(도 15)에 나타난 바와 같이 단편 1의 아미노 말단에 카르복시 풍부 도메인을 형성한다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 9.에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델 (도 16)은 이를 뒷받침하며, 분자의 기저에 있는 카르복시 풍부 도메인을 보여준다.
(iii) 유전적으로 조작되거나 화학적으로 유도체화된 카르복시 풍부 도메인을 갖는 단백질/항체
실시예 13
본 실시예는 안정된 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합하기 위해, 인간 인자 II의 단편 1로부터 카르복시 풍부 아미노산 서열로 화학적 변형되고 조작된 항체를 설명한다. 이 조작된 분자는 항체의 Fc 단편의 카르복시 말단으로 결합되거나 또는 혼입된다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 위치한 Gla는 Asp로 치환된다. 이 치환으로 인해 구조의 컴퓨터 모델에서 볼 수 있듯이(도 17), 변형된 단편 1의 아미노 말단에 카르복시 풍부 도메인이 형성된다. F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 10에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 18)은 알루미나에 결합하기 위해 조작된 분자의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 나타냄으로써 이를 뒷받침한다.
실시예 14
본 실시예는 안정한 형태로 산화 알루미늄 표면에 직접 결합하기 위해 인간 인자 II의 단편 1로부터의 카르복시가 풍부한 아미노산 서열로 화학적으로 변경되거나 조작된 IgG 중쇄 항체를 설명한다. 이 조작된 분자는 항체의 Fc 단편의 카르복시 말단으로 결합되거나 또는 혼입된다. 단백질의 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 및 32 부위에 위치한 Gla 잔기는 Glu로 치환되고, 이는 천연 단편 1에 비교하여 표면에 결합할 수 있는 카르복시기의 수를 절반으로 줄인다. 이러한 치환은 구조의 컴퓨터 모델에 나타난 바와 같이(도 19), 단편 1의 아미노 말단에 카르복시 풍부 도메인을 생성한다. 중쇄 IgG 항체를 갖는 F1 단편의 변형된 Gla 도메인에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 11에 제공된다. 단백질 표면 전하의 컴퓨터 모델(도 20)은 알루미나 표면에 결합하기 위해 조작된 분자의 기저에 카르복시 풍부 도메인을 나타냄으로써 이를 뒷받침한다.
실시예 15
본 실시예는 또 다른 조작된 계면-생체 분자를 설명한다. 단백질 A의 단편 B 도메인은 인간 인자 II의 단편 1의 처음 32 개 아미노산에 연결된다. 단백질의 단편1에 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 및 32 부위에 위치한 10개의 Gla 잔기가 있다. 조작된 분자는 컴퓨터 모델에서 생성된 바와 같이, 도 21에 도시된다. 조작된 분자에 대한 서열 목록은 SEQ ID NO. 12에 제공된다. 이는 단편 1-Fragment B 구조의 기저에 2.2nm3의 카르복시 풍부 도메인을 제공하여 알루미나 기판에 결합할 수 있도록 한다. 이는 nm3 당 9.09 카르복시기를 갖는 카르복시 풍부 도메인을 생성한다. 인간 인자 II의 단편 1의 처음 32 개 아미노산에 연결된 Protein A의 Fragment B의 3차원 구조의 표면 전하 맵(도 22)은 알루미나 기판에 결합하기 위해 조작된 분자의 기저에서 표면 전하의 농도를 보여준다.
실시예 16
인자 II, 인자 VII, 인자 X, 크링글(Kringle) 도메인이 있는 인자 II, 단백질 C, 단백질 Z, 및 카르복시 풍부 도메인을 갖는 합성 펩티드 서열(미국 특허 번호 9,694,048 Bauzon et al.참조)로부터의 하나 이상의 Gla 도메인을 함유하는 Gla 서열은 IgG(항 가우시아 루시퍼라아제)(anti gausia luciferase)의 각 Fc 단편에 클로닝 되었다. 사용된 클로닝 기술은 토론토 대학의 CCAB(Centre for the Commercialization of Antibodies and Biologics)의 표준 Fc 엔지니어링 기술이었다(Liu et al.). 이들 단백질 또는 합성 펩티드로부터의 Gla 도메인은 1에서 3까지의 단위로 클로닝되어, 단백질의 1, 2 또는 3 개의 Gla 도메인이 IgG 생체 분자의 각 Fc 단편에 존재하도록 했다. 이들은 표 2에서 Gla1x, Gla 2x 또는 Gla 3x로 지정된다. 클로닝 기술은 유연한 링커 서열 (SEQ ID NO. 20에 제시된 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 및 오픈 리딩 프레임 (ORF)(SEQ ID NO. 21)을 Gla 도메인을 Fc 단편에 부착하기 위해 사용하였다. Fc 단편의 중쇄 당 하나 이상이 부착된 경우 Gla 도메인을 연결하기 위해 유연한 링커 서열도 사용되었다. 당업계에서 잘 알려진 다른 링커 및 ORF도 이용될 수 있다. 클로닝 기술은 서브 클론 4275 hG1을 사용하며, 여기서 hG1은 (즉, 인간 IgG1)로 표현되는 Ab 이소 타입을 나타내고, 4275는 가우시아 루시퍼라제에 특이적으로 결합하는 항체이고 포유류의 생체 내 작업에 대한 표준 음성 대조군으로 사용된다(Liu et al.). 클로닝은 Gla 서열을 Fc 단편의 모든 중쇄의 카르복시 말단에 첨가한다. 따라서, 표 2에 열거된 바와 같이 Gla1x는 IgG의 Fc 단편에 클론된 2 개의 Gla 도메인을 갖고, Gla2x는 4 개의 Gla 도메인을 갖고, Gla3x는 6 개의 Gla 도메인을 가졌다. 모든 클론은 10ml 부피로 발현되었다. 이들 발현된 형태는 각 경우 Gla 도메인 서열의 천연 형태를 이용하였다.
Gla 소스(source of Gla) 서열 번호(SEQ ID NO.)
Factor VII Gla1x SEQ ID NO. 16
Factor VII Gla2x SEQ ID NO. 16
Factor VII Gla3x SEQ ID NO. 16
Factor X Gla1x SEQ ID NO. 13
Protein C Gla1x SEQ ID NO. 15
Protein C Gla2x SEQ ID NO. 15
Protein C Gla3x SEQ ID NO. 15
Factor II Gla1x SEQ ID NO. 14
Factor II Gla3x SEQ ID NO. 14
Factor II Gla with Kringle 1x SEQ ID NO. 19
Factor II Gla with Kringle 2x SEQ ID NO. 19
Synthetic Peptide Gla1x SEQ ID NO. 18
Synthetic Peptide Gla2x SEQ ID NO. 18
Synthetic Peptide Gla3x SEQ ID NO. 18
Protein Z Gla1x SEQ ID NO. 17
Protein Z Gla2x SEQ ID NO. 17
Protein Z Gla3x SEQ ID NO. 17
실시예 17
본 실시예는 다양한 초기 알루미늄 스퍼터링 두께 범위에서 실시예 16의 조작된 항체를 고정화한 결과로 발생하는 강한 색상 변화를 설명한다. 박막 소자는 200nm 두께의 탄탈룸 층을 기판 위에 스퍼터링한 다음 90 내지 140nm 두께 범위의 알루미늄 층을 스퍼터링하여 형성되었다. 그런 다음 얇은 금속 필름을 0.4M 인산과 0.1M 옥살산을 포함하는 혼합 전해질에서 4V의 일정한 전위를 가하며 양극 산화 처리하였다. 전해조에서 제거하고 표면을 증류수로 완전히 헹구었다. 이어서 장치 표면을 천연 프로트롬빈 (0.004 mg) 및 실시예 16 (표 2)에 기재된 바와 같이 Fc 영역에서 Gla 도메인으로 변형된 재조합 IgG의 단백질 용액에 노출시켰다. 단백질을 30 분 동안 노출시킨 후 용액을 제거하고 증류수로 헹구고 공기 건조시켰다. 알루미나 두께에 관계없이 조작된 IgG (Gla 1x) (~ 150kDa)는 천연 프로트롬빈처럼 정상으로부터 75˚에서 볼 때 장치 표면에 강한 색상 변화를 생성하였다. 클론된 Gla 단위의 수가 1 ~ 3 개에서 증가함에 따라 색상 변화를 생성하는 능력이 감소하여 Gla3x 조작된 항체의 경우 색상 변화가 사람의 눈에는 오직 약간만 보일 수 있으나, 위에 나타난 바와 같이 다른 검출 기술을 사용할 수 있다. 이러한 색상 변화는 조작된 단백질이 맞춤 제작된 알루미나 두께에 성공적으로 고정될 수 있으며 1 차 및 2 차 색상 영역 내에서 다양한 색상 변화를 형성할 수 있음을 나타낸다.
실시예 18
본 실시예는 실시예 16의 조작된 항체가 실시예 16의 Gla 변형을 통해 표면에 고정되는 반면, IgG 분자 자체는 가시적인 색 변화를 일으키지 않았음을 설명한다. 실시예 16의 조작된 인간 항체로 코팅된 표면은 이후 염소 항-인간(GAH) IgG(0.02mg) 또는 염소 항-쥐(GAM) IgG (0.02mg)의 용액으로 코팅되었다. GAH IgG(양성 대조군)이 고정된 조작된 항체가 있는 스팟에 노출되었을 때 색상 변화가 증가한 반면, GAH IgG(음성 대조군)이 고정된 조작된 인간 항체가 있는 스팟에 노출되었을 때는 눈에 띄는 색상 변화가 발생하지 않았다. 또한 두 GAH 및 GAM 용액은 30분 동안 빈 장치 표면에 노출되었으며, 어느 용액에서도 색상 변화가 발생하지 않았다. 이는 GAH가 표면 상 흡착된 재조합 항체를 검출할 때 2차 IgG 층의 형성으로 인한 색상 변화를 명확하게 설명한다.
실시예 19
본 실시예는 실시예 16의 고정된 조작된 항체가 특이적 항원, 가우시아 루시퍼라아제에 노출될 때 강한 색 변화가 발생하였음을 설명한다. 박막 장치는 먼저 실리콘 기판 상에 200nm 두께로 탄탈룸을 스퍼터링하고, 이어서 알루미늄 층을 110 nm 두께로 스퍼터링하여 형성한다. 그 후, 0.4M 인산과 0.1M 옥살산을 함유하는 혼합 전해질에서 4V의 일정한 전위를 적용하여 금속 박막을 양극 산화 처리했다. 전해조에서 표면을 제거하고 표면을 증류수로 완전히 헹구었다. 이후 실시예 16에 도시된 바와 같이, 장치 표면을, 천연 프로트롬빈(0.004 mg) 및 Fc 영역에서 Gla 도메인(인자 VII Gla1x)으로 변형된 재조합 IgG (항-가우시아 루시퍼라아제)의 단백질 용액에 노출시켰다. 단백질을 30 분 동안 노출시킨 후 용액을 제거하고 증류수로 헹구고 공기 건조시켰다. 조작된 IgG (~ 150 kDa)는 원래의 프로트롬빈과 같이 정상에서 75˚에서 보았을 때 장치 표면에서 강한 색상(연보라색)을 생성했다. 그런 다음 표면을 프로트롬빈(인자 II )의 단편 1의 0.2 mg/ml 용액에 노출시켜, 표면의 활성부위를 캡핑하였다. 증류수로 헹구고 건조시킨 후에 더 이상의 색 변화가 관찰되지 않았다. 가우시아 루시퍼라아제 (0.2mg/ml) 또는 프로칼시토닌(0.2mg/ml) 용액을 30 분 동안 표면에 노출시킨 다음 헹구고 건조하였다. 가우시아 루시퍼라아제에 노출된 조작된 IgG는 보라색으로 바뀌고 프로칼시토닌에 노출된 표면은 색이 변하지 않았다. 프로트롬빈 처리된 표면은 가우시아 루시퍼라아제 또는 프리칼시토닌으로 색이 변하지 않았다. 이러한 색 변화는 조작된 단백질이 알루미나 표면에 성공적으로 고정되고 그에 특이적 항원에 노출될 때 색상 변화를 생성하는 것을 나타낸다. 조작되고 고정된 항체는 그 기능성을 유지한다.
참조 및 변형에 의한 통합
본 출원 전체에서 발행되거나 허가된 특허 또는 동등물을 포함하는 실시예 특허 문서에 대한 모든 참조; 특허 출원 간행물; 및 비 특허 문헌 문서 또는 기타 소스 자료; 각각의 참고 문헌이 본 출원의 개시 내용과 적어도 부분적으로 일치하지 않는 한, 비록 개별적으로 참고로 포함되는 것처럼, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다(실시예의 경우, 부분적으로 일치하지 않는 참조는 참조의 부분적으로 일치하지 않는 부분을 제외하고 참조로 통합된다).
여기에 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시되고 설명 된 특징의 균등물 또는 그 일부를 배제하려는 의도는 없다. 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시예에 의해 구체적으로 개시되었지만, 예시적인 실시예 및 선택적 특징, 여기에 개시된 개념의 수정 및 변형은 당업자에 의해 의도될 수 있으며, 그러한 수정 및 변형은 첨부 된 청구 범위에 의해 정의 된 바와 같이 본 발명의 범위 내에있는 것으로 간주 된다. 본 명세서에 제공된 특정 실시예는 본 발명의 유용한 실시예의 예시이며, 본 발명이 장치, 장치 구성 요소, 방법 단계의 많은 변형을 사용하여 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 설명에 명시되어 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 방법에 유용한 방법 및 장치는 다수의 선택적 구성 및 처리 요소 및 단계를 포함 할 수 있다.
명세서에 범위가 주어질 때마다, 실시예의 경우 온도 범위, 시간 범위, 크기 범위 또는 조성 또는 농도 범위, 모든 중간 범위 및 하위 범위, 그리고 주어진 범위에 포함된 모든 개별 값은 명세서에 포함되도록 의도되었다. 본원의 설명에 포함된 범위 또는 하위 범위의 임의의 하위 범위 또는 개별 값은 본원의 청구 범위에서 제외될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 기술 수준을 나타냅니다. 본 명세서에 인용된 참고 문헌은 그 공개 또는 출원일 현재의 최신 기술을 나타내기 위해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되며, 필요하다면 이 정보가 선행 기술에있는 특정 실시예를 배제하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있도록 의도된다. 예를 들어, 물질의 조성물이 청구될 때, 본 명세서에 인용된 참고 문헌에서 가능하게 하는 개시가 제공되는 화합물을 포함하여 출원인의 발명 이전에 당해 분야에 공지되고 이용 가능한 화합물은 본 명세서에서 물질 청구의 구성에 포함되도록 의도되지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 Acomprising @은 "포함하는", "함유하는"또는 "특징되는"과 동의어이며 포괄적이거나 개방적인 것이며 추가의, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "이루어진"은 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 명세서에 사용 된 "본질적으로 구성되는"은 청구 범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원의 각각의 경우에서 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"이라는 용어 중 어느 하나는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소, 제한 또는 제한의 부재하에 적절하게 실시될 수 있다.
당업자는 구체적으로 예시된 것 이외의 출발 물질, 생물학적 물질, 시약, 합성 방법, 정제 방법, 분석 방법, 검정 방법 및 생물학적 방법이 본 발명의 실행에 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 과도한 실험. 이러한 물질 및 방법의 모든 당업계에 공지된 기능적 등가물이 본 발명에 포함되도록 의도된다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용할 때 표시 및 설명 된 기능의 균등물 또는 그 일부를 제외하려는 의도는 없지만 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식하였다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시 예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 수정 및 변형은 당업자에 의해 의도될 수 있으며, 이러한 수정 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내로 고려된다는 것을 이해해야한다.
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Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asn Thr Phe Leu Glu 325 330 335 Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys 340 345 350 Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr 355 360 365 <210> 12 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag B of protein A with 35 amino acids of F1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(65) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(78) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(84) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 12 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asn Thr Phe Leu Xaa 50 55 60 Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa Cys Val Xaa Xaa Thr Cys 65 70 75 80 Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa Ser Ser Thr 85 90 <210> 13 <211> 45 <212> PRT <213> Factor X Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 13 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Met Lys Lys Gly His Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Met Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa 20 25 30 Asp Ser Asp Lys Thr Asn Xaa Phe Trp Asn Lys Tyr Lys 35 40 45 <210> 14 <211> 35 <212> PRT <213> Factor II Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(35) <223> Gla domain of prothrombin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 14 Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa 20 25 30 Ser Ser Thr 35 <210> 15 <211> 46 <212> PRT <213> Protein C Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 15 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa Ile Phe Gln 20 25 30 Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp 35 40 45 <210> 16 <211> 45 <212> PRT <213> Factor VII Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 16 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser 35 40 45 <210> 17 <211> 46 <212> PRT <213> Protein Z Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(21) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(27) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 17 Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Xaa Xaa Leu Phe Xaa Gly Asn Leu Xaa Lys 1 5 10 15 Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Ile Cys Val Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe 20 25 30 Xaa Asn Xaa Val Val Thr Asp Xaa Phe Trp Arg Arg Tyr Lys 35 40 45 <210> 18 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide with Gla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 18 Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa 20 25 30 Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu 35 40 45 <210> 19 <211> 143 <212> PRT <213> Factor II Gla with Kringle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(7) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (137) <223> Xaa is a gamma-carboxyglutamic acid residue <400> 19 Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa 20 25 30 Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Xaa 35 40 45 Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Xaa Gly Asn 50 55 60 Cys Ala Xaa Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr 65 70 75 80 Arg Ser Gly Ile Xaa Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys 85 90 95 Pro Xaa Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Xaa Asn 100 105 110 Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 115 120 125 Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gln Xaa Cys Ser Ile Pro Val Cys 130 135 140 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Fusion Linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Open Reading Frame <400> 21 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 10

Claims (26)

  1. 관심 분석물에 결합하는데 사용하는 장치로서,
    산화 알루미늄 표면;
    계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는, 산화 알루미늄 표면에 고정된 계면 분자; 및
    다음 중 하나를 포함한다:
    i) 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
    ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 계면 분자에 부착된 생체 분자, 분석물에 특이적인 생체 분자;
    iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
    iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자.
  2. 관심 분석물에 결합하는데 사용하고, 산화 알루미늄 표면에 고정될 수 있는 계면 복합체로서,
    계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는, 산화 알루미늄 표면에 고정된 계면 분자; 및 다음 중 하나를 포함한다:
    i) 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
    ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 인터페이스 부자에 부착된 생체 분자, 분석물에 특이적인 생체 분자;
    iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
    iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자.
  3. 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 진단시스템 또는 키트로서,
    산화 알루미늄 표면;
    계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는, 산화 알루미늄 표면에 고정된 계면 분자; 및 다음 중 하나를 포함하고:
    i) 분석물에 결합하기 위해 계면 분자에 부착된 가교제;
    ii) 하나 이상의 공유 결합을 통해 인터페이스 부자에 부착된 생체 분자, 분석물에 특이적인 생체 분자;
    iii) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
    iv) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자;
    여기서, 계면 분자 및, (i), (ii), (iii) 및 (iv) 중의 하나가 산화 알루미늄 표면에 결합되고; 또는
    계면 분자 및, (i), (ii), (iii) 및 (iv) 중의 하나가 산화 알루미늄 표면에 결합되기 전에 분석물과 접촉을 위한 계면 복합체로 제공되는 것을 특징으로 하는,
    관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 진단시스템 또는 키트.
  4. 제 3항에 있어서,
    산화 알루미늄 표면은 산화 알루미늄의 다공성 층으로 커버될 때 색상을 형성할 수 있는 반사성 금속에 제공되고; 및
    산화 알루미늄 표면은 다공성 양극 처리된 표면이고;
    분석물을 테스트하기 위해 샘플과 접촉할 때, (i)이 존재하는 경우 가교제에 결합하거나, (ii), (iii) 또는 (iv)가 존재하는 경우 생체 분자에 결합하는 분석물의 존재를 나타내는 색 변화가 감지되도록 하는 것을 특징으로 하는, 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 진단시스템 또는 키트.
  5. 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법으로서,
    a) 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 적어도 하나의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해, 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되고, 계면 분자는 다음 중 하나에 부착되는, 계면 분자가 고정된 산화 알루미늄 표면을 제공하는 단계:
    ⅰ) 분석물에 결합하기 위한 가교제;
    ⅱ) 분석물에 특이적인 생체 분자;
    ⅲ) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
    ⅳ) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자;
    b) a)의 표면을 샘플과 접촉시켜 분석물을 테스트하는 단계; 및
    c) 분석물이 a)의 표면에 결합할 때 분석물의 존재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법.
  6. 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법으로서,
    a) 산화 알루미늄 표면을 제공하는 단계;
    b) 계면 복합체는 계면 분자를 포함하고, 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 적어도 하나의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해, 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되고, 계면 분자는 다음 중 하나에 부착되는, 산화 알루미늄 표면에 부착될 수 있는 계면 복합체를 제공하는 단계:
    ⅰ) 분석물에 결합하기 위한 가교제;
    ⅱ) 분석물에 특이적인 생체 분자;
    ⅲ) 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체의 형태인 생체 분자; 및
    ⅳ) 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되고, 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖는 조작된 항체 형태의 생체 분자;
    b) a)의 계면 복합체를 분석물 테스트를 위해 샘플과 접촉시키는 단계;
    c) 샘플과 b)의 계면 복합체를 산화 알루미늄 표면과 접촉시키는 단계; 및
    d) 산화 알루미늄 표면에 계면 복합체와 분석물이 결합할 때 분석물의 존재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
    산화 알루미늄 표면은 산화 알루미늄의 다공성 층으로 커버될 때 색상을 형성할 수 있는 반사성 금속에 제공되고; 및
    산화 알루미늄 표면은 다공성 양극 처리된 표면이고;
    분석물을 테스트하기 위해 샘플과 접촉할 때, (i)이 존재하는 경우 가교제에 결합하거나, (ii), (iii) 또는 (iv)가 존재하는 경우 생체 분자에 결합하는 분석물의 존재를 나타내는 색 변화가 감지되도록 하는 것을 특징으로 하는, 관심 분석물에 대한 결합 발생 여부를 테스트하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    카르복시 풍부 도메인은:
    2.2-25 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
    2.2-25 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
    2.2-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는
    2.2-17 nm3의 분자 부피 내의 20 개 이상의 유리 카르복시기; 또는
    7.0-17 nm3의 분자 부피 내에서 10 개 이상의 유리 카르복시기, 또는
    7.0-17 nm3의 분자 부피 내 20 개 이상의 유리 카르복시기를
    제공하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  9. 제 1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    가교제는 계면 분자에 공유 결합되고; 또는
    생체 분자는 가교제를 통해 계면 분자에 공유 결합되고; 또는
    계면 분자 및 생체 분자는 아미노산 서열로 조작되어 계면 분자 및 생체 분자가 펩티드 결합을 통해 부착되고; 또는
    계면 분자는 카르복시 풍부 도메인을 포함하는 조작된 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이고; 또는
    생체분자는 계면 분자에 특이적인 제1 항원 결정기를 통해 계면 분자에 부착되고, 관심 분석물에 특이적인 제2 항원 결정기를 갖는 조작된 항체이고; 또는
    생체 분자는 관심 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖고 항체의 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되는 조작된 항체인 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자는 연속적 또는 비연속적 코팅으로서, 윤곽이 있는 스팟 또는 라인으로서, 또는 배열로서 산화 알루미늄 표면에 제공되는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 계면 분자는 한 유형의 계면 분자에 부착되는 생체 분자를 갖거나, 각 유형의 계면 분자들에 부착되는 특이적 생체 분자를 갖는, 산화 알루미늄 표면에 이격된 상이한 유형의 계면분자들을 포함하여, 상이한 특이적 생체 분자들을 부착하는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 알루미늄 표면은 입자, 분말, 박막, 슬라이드, 스트립, 필터, 비드, 자성 비드, 자성 입자, 또는 코팅의 형태로 기판 상에 제공되는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 알루미늄 표면은 알루미늄 금속 또는 알루미늄 합금의 스퍼터링, 증발, 주조 또는 압출에 의해 제공되고, 다공성 양극 산화 처리된 산화 알루미늄 표면을 제공하기 위해 추가로 양극 산화 처리되는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 알루미늄 표면은 기판 상에 RF 스퍼터링, 반응성 스퍼터링 또는 화학적 증기 증착에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자 또는 계면 복합체는 적절한 용매 중의 계면 분자 용액으로부터 산화 알루미늄 표면에 코팅으로서 고정화되고, 이후 용액은 제거되는 것을 특징으로 하는 장치, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자는 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 및 감마-카르복시 글루탐산(Gla)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자는 비타민 K 의존성 단백질, Gla 도메인을 함유하는 이의 단편, 또는 변형된 Gla 도메인을 포함하는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자 및 생체 분자는 카르복시 풍부 도메인이 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항체, 탄수화물, 앱타머(aptamer) 또는 지질에 포함되도록 조작된 분자로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    카르복시 풍부 도메인은 비타민 K 의존성 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하고, 조작된 분자는 단백질 A, 단백질 A의 단편 B, 또는 IgG 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자는 단백질, 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, 또는 Gla 잔기 중 하나 이상은 Glu, Asp, Glu-Glu, Glu-Asp, Asp-Glu, 또는 Asp-Asp로 치환된 단백질의 변형된 Gla 도메인이고, 단백질은 프로트롬빈, 프로트롬빈의 단편1, 단백질 S, 응고 인자 IX, 인자 X, 인자 VII, 단백질 C, 매트릭스 Gla 단백질, 및 뼈 Gla 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자는 단백질, 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, 또는 Gla 잔기 중 하나 이상은 Glu, Asp, Glu-Glu, Glu-Asp, Asp-Glu, 또는 Asp-Asp로 치환된 단백질의 변형된 Gla 도메인이고, 단백질은 프로트롬빈, 프로트롬빈의 단편1, 단백질 S, 응고 인자 IX을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체 분자는 항체-항원, 항체-합텐(hapten), 효소-기판, 효소-수용체, 독소-수용체, 단백질-단백질, 아비딘-비오틴, 앱타머-앱타머 표적, 및 약물 수용체-약물로 구성된 군으로부터 선택된 결합 쌍의 구성원인 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    계면 분자 및 생체 분자는 분석물에 특이적인 Fab 단편을 갖고 Fc 단편을 통해 계면 분자에 부착되는 조작된 항체의 계면 복합체 형태이고; 계면 복합체는 항체의 Fc 단편의 각 중쇄의 카르복시 말단에 클로닝된 하나 이상의 카르복시 풍부 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    하나 이상의 카르복시 풍부 도메인은 비타민 K 의존성 단백질의 하나 이상의 Gla 도메인, Gla 도메인을 함유하는 이의 단편, 또는 변형된 Gla 도메인을 함유하는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    항체는 IgG이고, 단백질은 인자 II, 인자 VII, 인자 X, 단백질 C, 단백질 Z 에서 선택되고, 계면 복합체는 Fc 단편의 각 중쇄에 클로닝된 하나 이상의 Gla 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치, 계면 복합체, 진단 시스템, 키트 또는 방법.
  26. 계면 분자는 2.2-25 nm3의 분자 부피 내에 5개 이상의 유리 카르복시기를 제공하는 하나 이상의 카르복시 풍부한 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 유리 카르복시기는 두개 이상의 카르복시기를 함유하는 아미노산에 의해 제공되고, 이를 통해 계면 분자가 산화 알루미늄 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 생물학적 응용분야에 사용하기 위한 산화 알루미늄 표면을 재기능화하는 계면 분자의 용도.

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