KR20200122601A

KR20200122601A - Cd9을 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물과 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20200122601A
Application number: KR1020190045489A
Authority: KR
Inventors: 황정후
Original assignee: 황정후
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2020-10-28
Also published as: WO2020213982A1

Abstract

본 발명은 CD9을 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물과 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과, (a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. CD9의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 퇴행성 신경질환 환자의 기억력을 개선하는 효과를 발휘하여 퇴행성 신경질환 치료제 개발에 유용하게 활용이 될 수 있으며, CD9의 발현 수준 분석을 통해서 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질의 스크리닝할 수 있다.

Description

CD9을 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물과 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법{Composition for preventing or treating neurodegenerative disease and method for screening agents using CD9}

본 발명은 CD9을 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물과 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과, (a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환 (neurodegenerative diseases)은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지 (cognitive) 또는 운동 (motor) 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있고, 이들 질환은 주로 진행성이기 때문에 결과적으로 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다.

이들 질환은 파킨슨병 (Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병 (Huntington's disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증 (Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비 (progressive supranuclear palsy; PSP) 및 다른 질병들을 포함한다.

다양한 신경퇴행성 질환 중에서도 치매 (dementia)는 가장 광범위한 세포 손상을 유발하는 질환으로 퇴행성 정신장애를 동반하며, 특히 기억력 장애, 판단력 상실 등의 주요증상이 잘 알려져 있다. 치매는 뇌혈관의 협착이나 폐색으로 생기는 혈관성 치매와 베타아밀로이드 단백질이 뇌 내에 축적되어 발병하는 것으로 알려진 알츠하이머성 치매, 그리고 이들 두 가지 원인이 복합적으로 작용하여 생기는 혼합형 치매로 크게 나눌 수 있다.

치매 환자 중 가장 많은 비율을 차지하는 유형은 알츠하이머성 치매이며, 최근 연구에 따르면 2050년에는 85명중 1명의 비율로 이 질환을 가질 것이고, 이중 43 %는 특별한 관리를 받아야한다는 보고가 있다. (PrabhulkarS, Piatyszek R, et al. J Neurochem., 2012, 122, 374-381). 신경퇴행성 질환 중 알츠하이머병은 크게 유전성 알츠하이머병 (familiar Alzheimer's disease)과 산발성 알츠하이머병 (sporadic Alzheimer's disease, SAD)으로 분류된다. 유전성 알츠하이머병은 전체 알츠하이머 병 환자의 5~10 % 정도를 차지한다.

hyperphosphorylated, aggregated tau는 알츠하이머병 및 많은 인간 신경 퇴행성 질환의 중심 신경 병리학적 특징이다. MAPT 유전자의 돌연변이 발견 이후, 최근 몇 년간 타우 (tau)의 역할에 대한 상당한 보고서가 발표되었다. 다양한 타우 트랜스 제닉 동물 모델의 개발에 따라 뉴런에서 다른 세포로의 타우 병리학의 전파 및 Aβ와 타우 사이의 상호 작용을 포함하여 타우 의존성 병리학에서 상당한 진전을 보였다. 이러한 병리학 및 타우 관련 생체 표지 물질에 따라 새로운 치료법이 얻어졌다. 그럼에도 불구하고, 신경 변성을 유발하는 병인학적 요인 및 타우 매개 신경 독성의 정확한 기전은 아직 밝혀야 할 필요가 있으며, 현재까지 발병의 정확한 원인은 알려진 것이 없다.(Ann Transl Med. 2018 May; 6(10): 175.)

알츠하이머병의 병리학적 특징으로는 신경세포의 외부에 축적되어지는 노인반점 (senile plaques), 신경세포의 세포체 내에 엉켜진 실뭉치처럼 보이는 신경섬유 덩어리 (neurofibrilary tangles) 및 신경세포의 손실(neuronal loss) 등을 들 수 있다. 이러한 병리학적 특징은 유전성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병 모두에 나타나며, 이 중 노인반점의 주요 구성 요소로는 응집된 아밀로이드 베타 펩티드 (amyloid β peptide; Aβ)라는 독성단백질이 밝혀져 있다. 아밀로이드 베타 펩티드는 아밀로이드 전구단백질의 비정상적인 절단으로부터 생성된 40 내지 42개의 아미노산으로 이루어진 불용성 펩티드이다. 또한, 아밀로이드 베타 펩티드의 과다 축적은 유전성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병 모두에 공통적 현상으로 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 아밀로이드 베타 펩티드는 알츠하이머병의 주요 병원성 물질 (pathogenic material)로 간주되고 있다. 알츠하이머병의 전반적인 발병과정은 프레세닐린 1, 2 유전자 (PS 1, 2)의 돌연변이가 발생하면 베타-세크레타제(β-secretase)에 의해 아밀로이드 전구단백질이 비정상적으로 절단되고 아밀로이드 베타 펩티드가 생성된다. 생성된 아밀로이드 베타 펩티드에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머병이 발병하게 된다고 알려져 있다.

현재까지 치매의 원인과 병인론 그리고 그 치료법에 대한 광범위하고 다양한 연구가 진행되었지만, 원인규명이 미비하고 효과적인 치료법의 개발 또한 미진하다. 비록 FDA에서 알츠하이머 치매의 치료제로 타크린 (tacrine), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine), 도네페질 (donepezil), 메만틴 (memantine)을 인가하였음에도, 현재 사용되는 치매 치료제 대부분은 퇴행성 치매의 증상을 완화시키는 정신퇴행 완화 물질에 불과하며, 이들 중 대부분은 소염작용을 주로 하는 약물로 간독성과 소화기관의 점막을 손상시키는 등 부작용이 상당하며, 궁극적인 원인치료라기 보다는 대증적인 요법에 국한되어 있다는 한계가 있다.

한편, CD9은 분자량이 24 내지 27 kDa의 테트라스파닌(tetraspanin)계 세포막 당단백질로 포유 동물에는 34개의 테트라스파닌이 있으며, 그 중 33개가 인간에서 확인되었다. 각각의 테트라스파닌은 세포 부착 및 이동, 혈소판 활성 및 응집, 포유동물의 수정 과정에서 난자와 정자의 융합, 암의 발생 및 전이, 체액성 면역 반응 및 알러지 반응, 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)과 인플루엔자 바이러스 복제 등에 중요한 역할을 하는 항원으로 알려져 있다. 그러나, 인간에서 CD9 항원의 세포 노화 조절이나, 노화 조절 연구는 단순히 노화된 사람 혈관 내피세포에서 발현이 증가되는 것이 보고되었을 뿐, CD9의 발현 및 활성이 퇴행성 신경질환에 미치는 영향은 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자는 새로운 퇴행성 신경질환 치료법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, CD9 단백질의 발현 또는 활성을 저해하면 퇴행성 뇌 병변으로 유발되는 기억력 감소 등의 증상이 개선될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 ‘예방’은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

'단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. FGF12 단백질의 '단편(fragment)'은 FGF12 단백질의 일부분의 펩타이드를 말한다.

본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’ 또는 ‘핵산’은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다.

한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.

본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 사멸하는 경우 나타나는 증상들과 관련된 질환을 의미하며, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽 병(Niemann-Pick disease), 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 알츠하이머병일 수 있다.

한편, CD9은 분자량이 24 내지 27 kDa의 테트라스파닌(tetraspanin)계 세포막 당단백질로 포유 동물에는 34개의 테트라스파닌이 있으며, 그 중 33개가 인간에서 확인되었다. 각각의 테트라스파닌은 세포 부착 및 이동, 혈소판 활성 및 응집, 포유동물의 수정 과정에서 난자와 정자의 융합, 암의 발생 및 전이, 체액성 면역 반응 및 알러지 반응, 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)과 인플루엔자 바이러스 복제 등에 중요한 역할을 하는 항원으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “CD9”는 테트라스파닌계(tetraspanin family)의 멤버에 속하는 약 24~27 kDa의 세포표면 당단백질 수용체로서, 세포 발달, 활성, 성장 및 운동성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 신호전달 작용(signal transduction events)을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 세포 부착 및 세포 이동을 조절할 수 있고, 혈소판-유발 내피세포 증식(platelet-induced endothelial cell proliferation)에 관여하는 혈소판활성화(platelet activation)와 집성(aggregation)을 유도한다. 아울러, 근육세포 융합(muscle cell fusion)을 촉진하고 근관 유지(myotube maintenance)에 기여하는 등 세포 내의 다양한 현상에 관여한다.

본 발명에서의 CD9 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 CD9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 CD9 isoform 1(NP_001760.1) 또는 서열번호 2로 표시되는 인간의 CD9 isoform 2(NP_001317241.1)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number).

상기 CD9 단백질의 발현 억제제는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, crispr-cas9, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 또한 상기 CD9 mRNA는 가장 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 인간 CD9 mRNA transcript variant 1(NM_001769.3) 또는 서열번호 4로 표시되는 인간 CD9 mRNA transcript variant 2(NM_001330312.1)의 염기서열을 포함하는 것이다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number). 상기한 인간의 CD9 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genbank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

나아가, 본 발명에 따른 CD9 단백질 발현억제제는 바람직하게는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유발하는 shRNA일 수 있다.

본 발명에서 상기 ‘siRNA(small interfering RNA 또는 short interfering RNA 또는 silencing RNA)'는 세포 안에 인위적으로 도입되어 특정 유전자의 mRNA의 분해를 유도하여 단백질 번역(translation)이 나지 않도록 하여 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 일으키는 짧은 이중가닥의 RNA로, 표적 mRNA의 특정 부위에 상보적인 20 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 세포 내에서 siRNA의 이중 가닥 중 표적 mRNA에 상보적인 가닥(antisense strand)이 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA에 결합하고, RISC 복합체 안의 argonaute 단백질이 표적 mRNA를 절단하여 분해시키거나, 단백질 번역에 중요한 단백질과 리보솜이 mRNA와 결합하는 것을 억제하는 등의 기작으로 특정 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명에서 상기 shRNA는 RNA 간섭을 유도하는 물질로서, 1본쇄 RNA에서 부분적으로 회문상(回文狀)의 염기서열을 포함함으로써, 분자 내에서 2본쇄 구조를 가지고 헤어핀과 같은 구조가 되는 약 20염기 이상의 분자이다. 또한, shRNA 발현용 플라스미드(plasmid)를 세포 내로 도입시켜 발현하게 되면, 세포 내의 다이서(dicer)라는 RNaseⅢ(ribonucleaseⅢ) 효소에 의해 21~23개 염기쌍의 siRNA가생성되어 RNAi를 유도한다.

본 발명에서 상기 siRNA 또는 shRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.

또한 상기 CD9 단백질 활성 억제제는 CD9 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수도 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 퇴행성 신경질환 치료를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. 바람직하게는 transfection reagent를 이용하여 제형화하고, 피하, 혈액, 골수, 복강 등을 이용 세포에 전달할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 퇴행성 신경질환을 예방하거나 증상을 완화하고 치료하기 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.

투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장, 또는 췌장 내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다.

또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우, 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 퇴행성 신경질환 치료의 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

또한 본 발명은

(a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계는 분석의 대상인 시험 물질이 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현을 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위하여 CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.

본 발명의 방법에서 ‘접촉(contacting)’ 또는 ‘처리(treatment)’는 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개의 리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험 관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.

또한 본 발명의 방법에서 ‘시험 물질’은 시험 제제(test agent) 또는 제제(agent)와 호환가능하게 사용할 수 있는 것으로, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 방법으로 스크리닝할 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 유도체(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 이들의 조합을 포함한다. 시험 제제는 합성 물질 또는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라 이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같이 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.

상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5~30개, 바람직하게는 약 5~20개, 보다 바람직하게는 약 7~15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 ‘바이어스(biased)’ 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 핵산일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 ‘바이어스(biased)’ 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용할 수 있다.

또한 상기 시험 제제는 소분자(small molecule; 예를 들어, 약 1,000Da이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).

본 명세서에서 ‘발현(expression)’이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. 상기 CD9를 발현하는 세포는 CD9를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, CD9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 CD9를 과발현하는 세포일 수도 있다. 바람직하게는 상기 CD9 유전자를 발현하는 세포는 섬유아세포(fibroblast)일 수 있다.

상기 (b) 단계는 시험 물질을 접촉시킨 CD9를 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키지 않은 CD9를 발현하는 세포에서 CD9의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계이다.

CD9 mRNA 발현의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한 CD9 단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 (c) 단계는 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계이다.

본 발명자가 규명한 바와 같이, CD9의 활성을 저해하면 퇴행성 신경질환 동물모델에서 기억력이 향상되는 바와 같이, CD9의 단백질 또는 mRNA의 발현을 저해하는 물질 또한 CD9의 활성을 저해시키는 효과를 발휘하는 바 퇴행성 신경질환 치료제로서 활용될 가능성이 있다는 것이 자명하게 이해될 수 있다.

CD9의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 퇴행성 신경질환 환자의 기억력을 개선하는 효과를 발휘하여 퇴행성 신경질환 치료제 개발에 유용하게 활용이 될 수 있으며, CD9의 발현 수준 분석을 통해서 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질의 스크리닝할 수 있다.

도 1은 permeabilization을 하지 않은 AD 섬유아세포에서 CD9의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 permeabilization을 한 경우의 AD 섬유아세포에서 CD9의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 AD 섬유아세포에서 항-CD9 항체의 처리에 따른 타우 인산화를 나타낸 것이다.
도 4는 anti-CD9Ab을 투여에 따른 기억력 개선 효과를 확인한 것이다. 각각 일반적인 운동 활성(도 4A). 약물을 투여 한 마우스의 교대 반복 횟수(도 4B), 문맥 회상(contextual recall)(도 4C), freezing 시간 (도 4D), Morris 물 미로에서의 표적 영역에 대한 도달 수(도 4E) 및 표적 영역에서 소비한 시간(도 4F)을 측정하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 세포, 항체 및 실험동물의 준비

암컷 3xTg 생쥐 (JAX 004807)를 실험동물로 사용하였다. 실험동물은 멸균 사료와 물을 제공하고 각각 10 마리 미만의 동물로 사육하였다. 밤낮 주기는 12시간으로 하였다. 동물실험은 동물실험윤리위원회의 지도, 감독하에 고려대학교 동물사육 시설 내에서 진행하였고, 동물실험 절차는 고려대학교 IACUC의 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.

시험 항체접종(CD9)은 PBS(phosphate buffer solution)과 혼합하여 준비하고 8~12주령 생쥐의 피하로 100ul 주입하였다. 실험별 그룹으로 생쥐 (그룹 당 n=4)를 구분하고 대조군으로는 PBS(control)를 사용하였다. 항체는 1주에 한번 씩 총 4회 주사하여 실험을 진행하였다.

실험에는 Coriell사 (Camden, NJ)에서 구입한 AD 섬유아세포 두 종류와 (AG07374(AD fibroblast 1), AG05770(AD fibroblast 2)) age-control 섬유아세포 (AG09857), 그리고 본 실험실에서 추출한 정상인의 편도선 섬유아세포 를 사용하였다.

또한, Mouse control IgG1, anti-CD9 ALB6 (Immunotech)을 1차 항체로 사용하였고, FITC로 표지된 goat anti-mouse IgG(Jackson Immunoresearch)를 2차 항체로 사용하였다.

2. FACS 염색

배양 중인 섬유아세포에 trypsin-EDTA를 첨가하여 세포를 준비하였다. 세포의 절반은 Becton Dickinson Bioscience에서 구입한 FACS permeabilizing solution 2로 15분 동안 처리하였고, 나머지 절반은 4℃에 방치하였다. 세포를 1% FBS (Fetal bovine serum)와 0.05% sodium azide가 포함된 PBS로 세척 후, FACS tube로 옮기고, 1차 항체와 4℃에서 15분 동안 반응시켰다. FACS wash buffer로 세척 후 2차 항체를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 반응시킨 다음 FACS buffer로 세척 후 BD FACSCalibur로 CD9 발현을 분석하였다.

3. 동물 행동실험

3-1. Y-미로

Y-미로 장치는 26cm 벽 (San Diego Instruments, San Diego, CA)을 갖는 32cm (길이) × 10cm (폭)의 3개의 암(arm)으로 구성되었다. 각 마우스를 Y-미로의 중앙에 놓고 5분 동안 미로를 통해 자유롭게 이동할 수 있게 하였다. 마우스 4개의 발이 모두 미로의 암(arm)에 들어가면 유효한 것으로 간주하였다. 교대(alternation)는 3개의 서로 다른 암(즉, 1, 2, 3 또는 2, 3, 1 등)에 3연속으로 들어가는 것으로 정의되었다. 백분율 교대 점수는 다음 공식을 사용하여 계산하였다.

spontaneous alternation % = (number of spontaneous)/(total number of arm entries -2) x 100

또한, 총 암(arm) 갯수는 동물의 일반적인 활동의 척도로 사용되었다. 미로를 70% 에탄올로 깨끗이 닦아 악취 신호를 최소화했다.

3-2. Morris Water Maze

사용 된 장치는 벽이 76cm 인 흰색 원형 플라스틱 탱크 (직경 122 cm)로, 22u +/- 22uC로 유지된 물로 채웠으며, 독성이 없는 흰색 페인트를 추가하여 불투명하게 만들었으며 내부에는 분리 가능한 정사각형 (측면 길이 10cm) Plexiglas 플랫폼. 탱크는 여러 가지 눈에 띄는 시각적 신호를 포함하는 시험실에 있었다. 첫 번째 세션의 첫 번째 시험 전에 마우스를 플랫폼에 10초 동안 두었다. 마우스는 물의 표면 아래 1.5cm에 잠긴 플랫폼으로 수영하도록 훈련 받았다. 플랫폼은 탱크의 중앙과 벽에서 등거리에 고정된 위치에 있었다. 마우스는 하루에 3회의 훈련을 받았다. 각 훈련기간 동안, 마우스는 4개의 지정된 시작점 중 하나에서 무작위 순서로 탱크에 넣었다. 마우스는 침수된 플랫폼에서 찾아 탈출할 수 있도록 했다. 60 초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 수동으로 플랫폼으로 안내되어 10초 동안 그대로있게했다. 마우스는 20초 (탈출 대기 시간)의 훈련 기준에 도달하도록 훈련되었다. 마우스는 마지막 트레이닝 세션 후 24 시간 동안 프로브 시험에서 평가되었으며, 플랫폼이없는 풀에서 60초의 자유 수영으로 구성되었다. 각 동물의 성능은 획득 매개 변수 (플랫폼 및 거리 추적을 찾는 대기 시간) 및 probe-trial 매개 변수 (대상 플랫폼 영역과 에 대한 항목 수)에 대한 데이터를 제공하는 Any-Maze^TM 비디오 추적 시스템 (Stoelting Co.)를 사용하여 모니터링하였다.

4. 웨스턴 블롯 분석

단백질 농도는 Bradford Assay(Bio-Rad Protein Assay 500-0006, Germany, Munchen)를 사용하여 정량하였고 전체 세포 단백질 또는 age-control 섬유아세포, AD-섬유아세포를 8-10% SDS 폴리아크릴 아미드 겔로 분리하였다. Polyvinylidene difluoride(PVDF) 막은 트리스 완충식염수(5 % 지방 분유 없음, 0.1% Tween20)에서 블로킹되었다. 1차 항체로, anti PHF-tau clone AT8(MN1020, Thermo Scientific, Rockford, USA), p타우 pSer422(T7944, 시그마), anti-tau clone tau-5(MAB361, Millipore Billerica, Ma), CD9를 사용하였다. 모든 도말은 액틴(MAB1501, Chemicon-Millipore, Billerica, Ma)으로 표준화되었다.

실험결과

1. AD 섬유아세포에서 CD9의 발현 확인

Permeabilization을 하지 않은 세포의 경우, age-control 섬유아세포는 CD9을 거의 발현하지 않았으나 AD 섬유아세포는 두 종류 모두 CD9을 높은 수준으로 발현하였다(도 1). 이 결과는 세포막에 CD9 분자가 위치한다는 이전 자료에 부합하는 것은 물론 두 환자 그룹간의 차이는 알츠하이머 병의 진행정도와 관련 있는 것으로 추정되었다. 또한, 정상인의 편도선(Tonsil) 섬유아세포의 CD9 발현도 높은 수준인 것을 확인하였다.

또한, 도 2에서 보듯이, Permeabilization 후에는 여전히 CD9은 age-control fibroblast는 발현되지 않았다. 또한, 세포막에서 AD fibroblast 2에 비하여 상대적으로 CD9의 낮은 발현하는 것으로 나타난 AD fibroblast 1는 Permeabilization 후에도 거의 발현되지 않았다. 이는 permeabilization 처리 단계에서 세포 표면 및 세포 내부에 있는 CD9 분자가 소실된 것으로 판단된다. 한편, 세포막 단백질인 CD9이 Permeabilization 후 AD fibroblast 2에서는 높은 수준으로 발현하는 것으로 나타났다. 이것은 alzheimer 병의 진행정도에 따라서는 정상적으로는 세포막에만 존재하는 CD9 단백이 nucleoplasm 또는 핵에도 존재하는 것으로 해석되었다.

2. AD 섬유아세포의 타우(Tau) 과인산화 확인

타우 과인산화를 통한 신경 퇴행 탈락된 β-아밀로이드는 타우 병증을 자극할 수 있으며 타우의 과인산화는 알츠하이머 병에서 신경 섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles, NFTs)과 신경 퇴화를 일으키는 미세 소관 조립의 변화와 관련되어 있다. 뿐만 아니라 알츠하이머 병과 파킨슨 병을 비롯한 많은 다른 신경계 질환과 관련이 있다. 본 발명에서 항-CD9 항체를 투여하여 타우의 인산화를 확인한 결과, AD 섬유아세포에서 인산화된 타우(p-Ser422)의 수준(control lane)은 age control 섬유아세포(미도시)에 비해 현저하게 상승하였으며, 항체를 투여한 경우 현저하게 감소(anti-CD9-Ab panel)되는 것을 확인하였다, 하지만, 전체 타우 양은 의미 있는 변화를 보이지 않았다 (도 3).

3. Tg 마우스에서의 기억력 개선 효과

Y-maze에서 anti-CD9 Ab을 투여한 4 마리의 Tg 마우스 (3xTg+Ab)와 위약으로 처리한 그룹(3xTg)은 총 암 출입수에 유의한 차이가 없었으므로 일반적인 운동 활성에는 차이가 없음을 알 수 있었다(도 4A). 그러나 약물을 투여 한 마우스의 교대 반복 횟수는 대조군에 비해 높았으며 백분율 값이 높았다(도 4B, ^#p<0.05).

공포 컨디셔닝 테스트에서 두 그룹 모두 훈련 단계에서 차이가 나타나지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 그러나, anti-CD9Ab을 투여받은 3xTg 마우스는 위약을 투여한 동물군보다 문맥 회상(contextual recall)에서는 freezing 시간에서 의미있는 차이를 보이지 않았다(도 4C). anti-CD9Ab을 투여한 3×Tg 마우스는 위약을 투여한 패밀리보다 cued recall 패러다임에서도 유의하게 더 높은 freezing 시간을 보였다 (도 4D,^#p<0.05).

마우스는 Morris 물 미로를 사용하여 기준 공간 기억 기능에서 검사를 받았다. 이 연구에서 우리는 눈에 보이는 플랫폼 교육을 수행한 다음 하루에 네 번의 프로브 시도로 숨겨진 플랫폼 테스트를 수행했다. 각 그룹의 모든 마우스는 4 일 이내에 훈련 기준에 도달할 수 있었고 유사하게 숙련된 수영능력을 나타냈다. 그러나, 탐침 시험에서 anti-CD9Ab으로 치료한 3xTg 마우스는 대조군과 비교할 때 표적 영역에 대한 도달 수 및 표적 영역에서 소비한 시간의 유의한 증가를 보였다 (도 4E, 4F, ^#p<0.05).

CD9의 발현 또는 활성을 저해하는 물질은 퇴행성 신경질환 환자의 기억력을 개선하는 효과를 발휘하여 퇴행성 신경질환 치료제 개발에 유용하게 활용이 될 수 있으며, CD9의 발현 수준 분석을 통해서 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질의 스크리닝할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> HWANG, Jung Hoo <120> Composition for preventing or treating neurodegenerative disease and method for screening agents using CD9 <130> NP19-0039 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CD9 isoform 1(NP_001760.1) <400> 1 Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly 1 5 10 15 Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly 20 25 30 Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu 85 90 95 Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser 100 105 110 His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr 115 120 125 Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys 130 135 140 Ala Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu 145 150 155 160 Gln Phe Ile Ser Asp Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe 165 170 175 Thr Val Lys Ser Cys Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys 180 185 190 Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile 195 200 205 Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Arg Glu Met Val 225 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CD9 isoform 2(NP_001317241.1) <400> 2 Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Val Gln Glu Ser 1 5 10 15 Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala 20 25 30 Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His Lys Asp Glu Val 35 40 45 Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Leu Lys 50 55 60 Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala Ile His Tyr Ala 65 70 75 80 Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln Phe Ile Ser Asp 85 90 95 Ile Cys Pro Lys Lys Asp Val Leu Glu Thr Phe Thr Val Lys Ser Cys 100 105 110 Pro Asp Ala Ile Lys Glu Val Phe Asp Asn Lys Phe His Ile Ile Gly 115 120 125 Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met Ile Phe 130 135 140 Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn Arg Glu Met Val 145 150 155 <210> 3 <211> 1321 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CD9 mRNA(NM_001769.3) <400> 3 cttttcccgg cacatgcgca ccgcagcggg tcgcgcgccc taaggagtgg cactttttaa 60 aagtgcagcc ggagaccagc ctacagccgc ctgcatctgt atccagcgcc aggtcccgcc 120 agtcccagct gcgcgcgccc cccagtcccg cacccgttcg gcccaggcta agttagccct 180 caccatgccg gtcaaaggag gcaccaagtg catcaaatac ctgctgttcg gatttaactt 240 catcttctgg cttgccggga ttgctgtcct tgccattgga ctatggctcc gattcgactc 300 tcagaccaag agcatcttcg agcaagaaac taataataat aattccagct tctacacagg 360 agtctatatt ctgatcggag ccggcgccct catgatgctg gtgggcttcc tgggctgctg 420 cggggctgtg caggagtccc agtgcatgct gggactgttc ttcggcttcc tcttggtgat 480 attcgccatt gaaatagctg cggccatctg gggatattcc cacaaggatg aggtgattaa 540 ggaagtccag gagttttaca aggacaccta caacaagctg aaaaccaagg atgagcccca 600 gcgggaaacg ctgaaagcca tccactatgc gttgaactgc tgtggtttgg ctgggggcgt 660 ggaacagttt atctcagaca tctgccccaa gaaggacgta ctcgaaacct tcaccgtgaa 720 gtcctgtcct gatgccatca aagaggtctt cgacaataaa ttccacatca tcggcgcagt 780 gggcatcggc attgccgtgg tcatgatatt tggcatgatc ttcagtatga tcttgtgctg 840 tgctatccgc aggaaccgcg agatggtcta gagtcagctt acatccctga gcaggaaagt 900 ttacccatga agattggtgg gattttttgt ttgtttgttt tgttttgttt gttgtttgtt 960 gtttgttttt ttgccactaa ttttagtatt cattctgcat tgctagataa aagctgaagt 1020 tactttatgt ttgtctttta atgcttcatt caatattgac atttgtagtt gagcgggggg 1080 tttggtttgc tttggtttat attttttcag ttgtttgttt ttgcttgtta tattaagcag 1140 aaatcctgca atgaaaggta ctatatttgc tagactctag acaagatatt gtacataaaa 1200 gaattttttt gtctttaaat agatacaaat gtctatcaac tttaatcaag ttgtaactta 1260 tattgaagac aatttgatac ataataaaaa attatgacaa tgtcctggac tggtaaaaaa 1320 a 1321 <210> 4 <211> 1437 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens CD9 mRNA(NM_001330312.1) <400> 4 cttggggact gcccagccct cagctgtgtt attattcggt gataggtatt tgctaattac 60 ttccaaaagc ctcccatctg tcatcccacc cagactgcgc gcttctaatt cctcctaccc 120 cacatgctgt gcccaatgaa aagtatggtc agcgagcgaa ggtttgcaag gagacagacg 180 agggcgaaat taagccaggc ggcttccctt taaatcctcg caaagcagaa gggcccctca 240 ctctggcagc aggccttggc caaggggcct ttagccctga cgacccgggg aagagtctcc 300 caaagcagaa cgcccggtcc ggcgcccaga ccaaacgcgg gggaaccgga agggcgaggc 360 ctccaccttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 420 accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 480 tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 540 gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 600 gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 660 gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 720 gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 780 cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 840 tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 900 atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 960 atccgcagga accgcgagat ggtctagagt cagcttacat ccctgagcag gaaagtttac 1020 ccatgaagat tggtgggatt ttttgtttgt ttgttttgtt ttgtttgttg tttgttgttt 1080 gtttttttgc cactaatttt agtattcatt ctgcattgct agataaaagc tgaagttact 1140 ttatgtttgt cttttaatgc ttcattcaat attgacattt gtagttgagc ggggggtttg 1200 gtttgctttg gtttatattt tttcagttgt ttgtttttgc ttgttatatt aagcagaaat 1260 cctgcaatga aaggtactat atttgctaga ctctagacaa gatattgtac ataaaagaat 1320 ttttttgtct ttaaatagat acaaatgtct atcaacttta atcaagttgt aacttatatt 1380 gaagacaatt tgatacataa taaaaaatta tgacaatgtc ctggactggt aaaaaaa 1437

Claims

CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽 병(Niemann-Pick disease), 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노선 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질 발현 억제제는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, crispr-cas9, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 CD9 mRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질 활성 억제제는 CD9 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) CD9 단백질 또는 mRNA를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포와 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포에서 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 퇴행성 신경질환 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법.
제7항에 있어서, 상기 CD9의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative 또는 semi-Quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quantitative 또는 semi-Quantitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot), DNA 칩(chip) 및 RNA 칩으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제7항에 있어서, CD9의 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.