KR20200120413A

KR20200120413A - 약콩 껍질 추출물을 포함하는 에스트라디올 생합성 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20200120413A
Application number: KR1020190043307A
Authority: KR
Inventors: 이기원; 양희; 윤정한; 박수민
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2020-10-21

Abstract

약콩 껍질 추출물을 포함하는 에스트라디올 생합성 촉진용 조성물에 관한 것에 관한 것이다.

Description

약콩 껍질 추출물을 포함하는 에스트라디올 생합성 촉진용 조성물 {A composition comprising Yak-kong seed coat extract for promoting estradiol biosynthesis}

에스트로겐은 여성의 생식과 성적 발달에 중요한 역할을 하는 스테로이드 호르몬이다. 여성은 노화가 진행됨에 따라 에스트로겐의 분비가 감소하며, 안면홍조, 불면증과 같은 다양한 갱년기 증상들이 나타난다. 2017년 기준 대한민국 여성 인구는 총 2565만명으로 추정되며, 그 중 약 40만명이 폐경 및 여성의 갱년기 상태와 관련된 진료를 받은 것으로 조사되었다.

전세계적으로 갱년기 증상의 치료에 사용되는 여성호르몬 대체요법(HRT: Hormone replacement therapy)은 폐경으로 인해 부족해지는 호르몬을 인위적으로 보충해주는 방법이다. 미국 Wyeth 사에서 최초로 개발하여, 2002년까지의 세계시장 규모는 44억 달러까지 성장하였다. 그러나, HRT 요법이 유방암, 심장병, 뇌졸중 발병률을 높인다는 부작용이 발표된 후, 대표적인 HRT 약품인 'Premarin'과 'Prempro'의 처방이 2002년 20억 달러에서 2003년 10억 달러로 급감하였다. 그 이후, 2003년부터 2011년까지의 평균 성장률은 -0.2%로, 마이너스 성장세를 보였다.

이에, 최근에는 HRT 요법을 대체하는 운동요법, 식이요법, 식물성 여성 호르몬 등과 같은 부작용이 적은 비-호르몬 치료법에 대한 시장의 수요가 증가하고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 약콩 껍질 추출물의 에스트라디올 생합성능을 확인하고, 이를 이용한 에스트라디올 생합성 촉진용 조성물을 완성하였다.

일 양상은 약콩 껍질 추출물을 포함하는 에스트라디올 생합성 촉진용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 약콩 껍질 추출물을 포함하는 갱년기 질환을 예방 또는 개선하는 식품 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 약콩 껍질 추출물을 포함하는 갱년기 질환을 예방 또는 치료하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 약콩은 한국 토종콩으로서, 이소플라본 계열 유용성분인 제니스테인 (genistein)과 다이드제인 (daidzein)이 다른 검은콩보다 월등히 많이 포함되어 있어 새로운 건강기능성식품 소재로 주목을 받고 있다. 또한, 검은콩의 일종으로 검은콩 특유의 색을 나타내는 안토시아닌 성분이 풍부하게 함유되어 있어 항산화 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 약콩의 영어 학명은 린코시아 눌루빌리스(Rhynchosia　Nulubilis)이고, 쥐의 눈알같이 생겼다고 하여 쥐눈이콩 또는 서목태라고도 불린다. 상기 약콩 껍질 추출물의 에스트라디올 생합성 촉진 효과, 및 갱년기 증상 개선 효과는 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.

상기 추출물은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

상기 약콩 껍질 추출물은 약콩 껍질을 이용하여 통상적인 방법으로 얻어낸 약콩에 속한 성분이나 물질을 의미할 수 있다. 상기 추출물은 상기 약콩 껍질을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의　추출물을 포함할 수 있다.　

상기 약콩 껍질을 추출하는 방법 또는 추출 용매는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법 또는 용매를 사용할 수 있다.

예를 들어, 상기 추출 용매는 약콩 껍질　추출물을 제조할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 물 또는 다양한 유기용매 등으로 추출하여 수득할 수 있다. 　이때, 사용되는 유기용매는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 물, 극성 용매 또는 비극성 용매가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 이들의 혼합용매 등이 될 수 있다.

예를 들어, 상기　추출하는 방법은 바람직하게는 상기 약콩 껍질, 이의 건조물, 가공물 등을 상기 용매에 침지하고, 10 내지 25℃의 상온에서 추출하는 냉침추출법, 40 내지 100℃로 가열하여 추출하는 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 약콩 껍질 추출물의 농도는 1 내지 40 μg/ml일 수 있다. 상기 범위를 벗어나 상기 약콩 껍질 추출물의 농도가 낮으면, 에스트라디올 분비 촉진 효과가 거의 없거나 미미하게 나타날 수 있다. 반대로, 상기 범위를 벗어나 상기 약콩 껍칠 추출물의 농도가 높으면, 약콩 껍질 추출물의 용량 대비 에스트라디올 분비 촉진 효과가 크지 않아 경제적이지 않을 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 범위의 약콩 껍질 추출물은 에스트라디올을 단백질 및 mRNA 수준에서 발현을 증가시킬 수 있고, 유방암 및 난소암 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

상기 약콩 껍질 추출물의 농도는 예를 들어 2 내지 35 μg/ml, 예를 들어 2 내지 30 μg/ml, 예를 들어 3 내지 30 μg/ml, 예를 들어, 3 내지 25 μg/ml, 예를 들어 4 내지 25 μg/ml, 예를 들어, 3 내지 20 μg/ml, 예를 들어 4 내지 20 μg/ml, 예를 들어, 5 내지 20 μg/ml로 포함하는 것일 수 있다.

상기 에스트라디올(estradiol)은 생체 내에서 만들어지는 주요한 여성호르몬으로서, 에스트로겐의 대표적인 호르몬이다. 상기 에스트라디올은 17 베타-에스트라디올(17β-estradiol)이라고도 불린다.

일 실시예에 따르면, 상기 약콩 껍질 추출물을 부신 피질 암세포주에 처리한 경우, 에스트라디올의 생합성량이 증가시켜 에스트로겐 저하로 인한 증상을 예방 및 개선할 수 있음을 확인하였다.

일 실시예에 따르면, 상기 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, 유방암 및 난소암 세포의 증식이 억제됨을 확인하였다. 즉, 상기 약콩 껍질 추출물은 에스트라디올 생합성을 촉진시켜 부족한 에스트로겐 수준을 보충할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 호르몬 대체 요법의 장기 복용으로 인한 부작용인 유방암 또는 난소암을 유발하는 문제를 극복할 수 있음을 확인하였다.

상기 조성물에서, 약콩 껍질 추출물, 갱년기 질환에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

상기 개선은 상기 약콩 껍질 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 식품 조성물은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 갱년기　질환에 대한 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 상기 식품은 여성　갱년기　질환의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 상기 약콩 껍질 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 조성물에서, 약콩 껍질 추출물에 관한 내용은 상술한 바와 같다.

상기 갱년기 질환은 여성에게서 월경이 중단되는 시기인　갱년기에 생기는 다양한 이상 증상들을 나타내는 질환을 의미하며, 대체로　갱년기의 여성에게서 난소의 기능이 노화로 인해 저하되어 여성호르몬을 적게 내기 때문에 이러한 성호르몬의 불균형으로 인하여 발병된다고 알려져 있다. 상기 갱년기 질환은 여성의 성호르몬인 에스트로겐의 분비 감소로 인한 증상을 나타내며, 상기 증상은 비만, 골다공증, 에너지 대사 장애 등의 증상을 부수적으로 수반할 수 있다. 따라서, 상기 갱년기 질환은 여성 호르몬 저하증, 에스트로겐 저하증, 에스트라디올 저하증 등일 수 있다.

상기 예방은 상기 약콩 껍질　추출물을 포함하는 약학 조성물의 투여에 의해 갱년기　질환을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

상기 치료는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 갱년기　질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 약콩 껍질 추출물을 포함하는 조성물은 17β-에스트라디올의 생합성을 촉진하는 효능을 가지므로, 여성의 에스트로겐 저하로 인한 갱년기 증상을 예방 및 개선할 수 있다.

도 1은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 속 추출물, 약콩 껍질 추출물, 백태 속 추출물, 백태 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진 여부를 확인한 인 비트로 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진을 확인한 인 비트로 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, CYP19A1의 단백질 수준에서의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물의 아로마타아제 발현 증가를 확인한 인 비트로 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 쥐의 난소에서 분리한 동난포 세포에서 약콩 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진 여부를 확인한 생체 외(ex vivo) 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 MCF-7 세포 및 OVCAR-8 세포에서 약콩 껍질 추출물의 에스트로겐 의존성 암 세포 사멸을 확인한 인 비트로 실험 결과를 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물의 에스트라디올 분비 촉진 효과

스테로이드 생합성 능력이 있는 기관인 부신으로부터 유래한 인간 세포주, NCI-H295R 세포에서 약콩 껍질 추출물이 17β-에스트라디올 생성을 증가시키는지 확인하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA: enzyme　linked　immunoassay)을 이용하여 인 비트로(in vitro) 시험을 수행하였다.

구체적으로, NCI-H295R 세포는 DMEM/F-12, 2.5% 누-세럼(Nu-serum), 1% 셀레늄/인슐린/트랜스페린 믹스(selenium/insulin/transferrin mix), 0.1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 포함하는 배지를 사용하여 배양하였다. NCI-H295R 세포를 6cm²세포 배양 접시(cell culture dish)에 2.5×10⁵cells/ml 농도로 맞추어 배지를 2ml 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신만을 포함하는 DMEM/F-12 무혈청 배지에 약콩(YK: Yak-kong) 속 추출물, 약콩 껍질 추출물, 백태(YS: Yellow soybean) 속 추출물, 백태 껍질 추출물을 40μg/ml 농도로 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후, 에스트라디올 민감성 ELISA 키트 (estradiol sensitive ELISA kit, DRG, ELA-4399)를 이용하여 배양액에 분비된 17β-에스트라디올의 농도 (pg/ml)를 측정하였다.

도 1은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 속 추출물, 약콩 껍질 추출물, 백태 속 추출물, 백태 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진 여부를 확인한 인 비트로 실험 결과이다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 대조군인 약콩 속 추출물, 백태 속 추출물 및 백태 껍질 추출물과 비교하여, 약콩 껍질 추출물을 처리하였을 때, 17β-에스트라디올이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.

실시예 2: NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물의 농도에 따른 에스트라디올 분비 촉진 효과

상기 실시예 1에서 17β-에스트라디올의 생합성 촉진 효과를 확인한 약콩 껍질 추출물의 농도 의존적인 효과를 확인하기 위하여, NCI-H295R 세포에서 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 인 비트로 시험을 수행하였다.

NCI-H295R 세포는 상기 실시예 1과 동일한 배지를 사용하여 배양하였다. NCI-H295R 세포를 6cm²세포 배양 접시에 2.5×10⁵cells/ml로 맞추어 배지를 2ml 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신만을 포함하는 DMEM/F-12 무혈청 배지에 약콩 껍질 추출물을 5 μg/ml, 10 μg/ml, 및 20 μg/ml 농도로 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후, 에스트라디올 민감성 ELISA 키트인 ELA-4399를 이용하여 배양액에 분비된 17β-에스트라디올의 농도 (pg/ml)를 측정하였다.

도 2은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진을 확인한 인 비트로 실험 결과이다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 약콩 껍질 추출물을 5 μg/ml, 10 μg/ml, 및 20 μg/ml 각각의 농도로 처리하였을 때, 17β-에스트라디올이 증가됨을 확인하였다.

실시예 3: 약콩 껍질 추출물의 에스트로겐 생성과 관련된 효소의 단백질 및 mRNA 수준에서의 발현 증가 효과

17β-에스트라디올의 생합성 촉진 효과를 확인한 약콩 껍질 추출물이 스테로이드호르몬 생합성 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, NCI-H295R 세포에서 웨스턴 블롯팅 분석법, 실시간 PCR 분석법을 이용하여 인 비트로 시험을 수행하였다. NCI-H295R 세포에 약콩 껍질 추출물을 처리하였을 때, 안드로겐(androgen)에서 에스트로겐(estrogen)으로 전환되는 단계에 필요한 효소인 아로마타아제(aromatase, CYP19A1)의 발현 증가를 mRNA 및 단백질 수준에서 확인하였다.

구체적으로, NCI-H295R 세포는 상기 실시예 1과 동일한 배지를 사용하여 배양하였다. 스테로이드호르몬 생합성 경로에 관여하는 효소를 mRNA 수준에서 관찰하기 위하여 NCI-H295R 세포를 6cm²세포 배양 접시에 2.5×10⁵cells/ml로 맞추어 배지를 2ml 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신만을 포함하는 DMEM/F-12 무혈청 배지에 약콩 껍질 추출물을 5 μg/ml, 10 μg/ml, 및 20 μg/ml 농도로 처리하였다. 추출물 처리 12시간 후, 세포에서 RNA를 추출하여, 실시간 PCR 분석법을 통해 CYP19A1의 발현 정도를 mRNA 수준에서 관찰하였다. 또한, 추출물 처리 24시간 후, 세포에서 단백질을 추출하였고 웨스턴 블롯팅 분석법을 통해 CYP19A1의 발현 정도를 단백질 수준에서 관찰하였다.

도 3은 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, CYP19A1의 단백질 수준에서의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 실험 결과이다. 도 4는 NCI-H295R 세포주에서 약콩 껍질 추출물에 의한 mRNA 수준 및 단백질 수준에서의 CYP19A1의 발현 정도를 확인한 인 비트로 실험 결과이다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, CYP19A1의 mRNA 수준에서의 발현이 증가하며, 특히, 10 μg/ml 및 20 μg/ml 농도로 처리하였을 때, CYP19A1의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 또한, 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, CYP19A1의 단백질 수준에서의 발현이 증가하며, 특히, 10 μg/ml 및 20 μg/ml 농도로 처리하였을 때, CYP19A1의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실시예 4: 쥐의 난소에서 분리한 동난포 세포에서 약콩 껍질 추출물의 농도에 따른 에스트라디올 분비 촉진 효과

쥐에서 스테로이드 생합성 능력이 있는 기관인 난소로부터 분리한 동난포 세포에서 약콩 껍질 추출물이 17β-에스트라디올 생성을 증가시키는지 확인하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA: enzyme　linked　immunoassay)을 이용하여 생체 외 실험(ex vivo)을 수행하였다.

구체적으로 생후 25-30일령 사이의 암컷 쥐(C57BL/6)로부터 난소를 분리하고 난소로부터 동난포 세포만 채취하여 일차 세포 배양(primary cell culture)한다. 동난포 세포는 α-MEM, 1% 셀레늄/인슐린/트랜스페린 믹스(selenium/insulin/transferrin mix), 5% 소태아혈청 (fetal bovine serum)을 포함하는 배지를 사용하여 배양하였다. 난소로부터 분리한 동난포 세포는 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 웰 당 하나씩 넣는다. 배지에 약콩 껍질 추출물을 첨가해 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml 농도로 만들고, 배지 ml 당 5 IU의 FSH (follicle stimulating hormone)을 함께 첨가하여 하나의 난포가 들어 있는 웰 당 150 μL 첨가한 후 96시간 동안 배양하였다. 추출물 처리 96시간 후, 에스트라디올 민감성 ELISA 키트 (estradiol sensitive ELISA kit, DRG, ELA-4399)를 이용하여 배양액에 분비된 17β-에스트라디올의 농도 (pg/ml)를 측정하였다.

도 5은 쥐의 난소에서 분리한 동난포 세포에서 약콩 껍질 추출물의 17β-에스트라디올 분비 촉진 여부를 확인한 생체 외 실험 결과이다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 약콩 껍질 추출물을 처리하였을 때, 17β-에스트라디올이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.

실시예 5: 약콩 껍질 추출물의 유방암 및 난소암 세포의 증식 억제 효과

17β-에스트라디올의 생합성 촉진 효과를 확인한 약콩 껍질 추출물이 에스트로겐 의존성 조직의 암 발생에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 사람의 유방암 세포인 MCF-7 세포, 및 사람의 난소암 세포인 OVCAR-8 세포에서 세포 독성 평가 (MTS assay)를 이용하여 인 비트로 시험을 수행하였다.

구체적으로, MCF-7 세포 및 OVCAR-8 세포는 DMEM, 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum), 0.1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배지를 사용하여 배양하였다. MCF-7 세포 및 OVCAR-8 세포를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 4.0×10⁴cells/well 농도로 맞추어 배지를 100 μL 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신만을 포함하는 DMEM 무혈청 배지에 약콩 껍질 추출물을 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml 농도로 처리하였다. 추출물 처리 48시간 후, 각 웰 당 20 μL의 PMS/MTS 솔루션을 첨가하고 1~4시간 인큐베이션하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6은 MCF-7 세포 및 OVCAR-8 세포에서 약콩 껍질 추출물에 의해 유방암 및 난소암세포가 사멸됨을 확인한 인 비트로 실험 결과이다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, 유방암 세포의 세포생존율이 감소되며, 특히, 40 μg/ml 농도로 처리하였을 때, 세포생존율이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한, 약콩 껍질 추출물을 처리한 경우, 난소암 세포의 세포 생존율이 감소되며, 특히, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml 및 40 μg/ml의 모든 농도에서 세포생존율이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

Claims

약콩 껍질 추출물을 포함하는 에스트라디올의 생합성을 촉진하는 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약콩 껍질 추출물을 1 내지 40 μg/ml로 포함하는 것인 조성물.
약콩 껍질 추출물을 포함하는 갱년기 증상을 예방 또는 개선하는 식품 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 약콩 껍질 추출물을 1 내지 40 μg/ml로 포함하는 것인 조성물.