KR20200113277A

KR20200113277A - 클로로퀸 겔 및 그 제조 방법, 적용

Info

Publication number: KR20200113277A
Application number: KR1020207025970A
Authority: KR
Inventors: 롱쉬 씨에; 샹링 리; 만리 위안; 팅 왕; 지엔위 왕
Original assignee: 광저우 하이브리바이오 메디슨 테크놀로지 엘티디.; 광저우 하이브리바이오 바이오테크 엘티디.
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2020-10-06
Also published as: EP3760192A1; US20200397713A1; WO2020114166A1; JP2021509681A; PT3760192T; US20210401763A1; EP3760192B1; AU2019391079B2; RU2760457C1; CN109288816B; BR112020019266A2; US11564891B2; ES2938738T3; PL3760192T3; AU2019391079A1; KR102260231B1; US11147773B2; JP6893288B2; EP3760192A4; CN109288816A

Abstract

본 발명은 클로로퀸 겔 및 그 제조 방법, 적용을 개시한다. 본 발명은 또한 클로로퀸 나노스피어를 제공하는데, 상기 클로로퀸 나노스피어는 수용성 나노스피어 담체 및 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 포함하며, 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노스피어 담체의 질량비는 1 : 3미만이다. 본 발명은 수용성 나노스피어 담체와 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 조합하여 나노스피어를 제조함으로써, 클로로퀸의 부작용과 약물 내성을 효과적으로 해결하고, 약물의 치료 부위에서의 체류 시간을 연장하여 약물의 생체 이용률 및 치료 효과를 향상하며, 외부 생식기 감염에 의한 질환을 효과적으로 치료하고 치료 효과를 향상시키며, 클로로퀸의 용도를 넓히고 적용 범위를 확대하며, 그 제조 방법이 간단하고 합성이 용이하며 독성 및 부작용이 없고 안전성이 우수하여 신형 약물의 산업화 적용이 가능하다.

Description

클로로퀸 겔 및 그 제조 방법, 적용

본 발명은 생물 의학 기술 분야에 관한 것으로, 특히 외부 생식기 감염 및 다른 피부 사마귀의 치료에 적용되는 클로로퀸 겔 및 그 제조 방법, 적용에 관한 것이다.

성 전파 질환이라고도 불리는 생식기 감염은 성 접촉을 주요한 전파 방식으로 하는 질병의 집합이다. 국제적으로는 20여종의 성 행위나 유사한 성 행위를 통한 감염성 질환을 생식기 감염 범주에 포함시켰다. 1980년대 이후 유동 인구가 날로 늘어나고 성 관념의 변화로 인해 안전하지 못한 성 행위가 증가했다. 중국의 생식기 감염과 성 전파 감염은 날로 증가되고 있으며, 연해 도시에서 내륙 도시로, 그리고 도시에서 농촌으로 발전하는 추세로서, 상당히 엄중한 상황이다. 통계에 따르면, 현재 중국에는 약 40만명의 에이즈 환자가 있고 HIV감염 비율은 약 1000분의1이며, 매일 수백명이 감염되고 성 전파 비율이 높으며, 고위험군에서 일반인으로 전파되는 특성을 가진다. 통계에 따르면, 최근 몇년간 중국의 남성과 여성의 생식기 감염 인수가 매년 마다 증가하고 있으며, 많은 지역의 발병률이 전염병 중에서 제2 위, 제3위를 차지하며, 기혼 여성의 생식기 감염률이 무려 50%에 도달하고, 70%의 여성이 평생에 적어도 한번은 외음부 칸디다증에 걸리고, 그 중 5%-10%은 질성 칸디다증에 걸리며, 90%의 여성이 인간 유두종 바이러스에 감염된 적이 있다. 남성과 여성의 생식기 감염의 발병률이 이처럼 빠르게 증가하여 통제가 어렵기 때문에, 이미 위해가 심각한 세계적인 사회 및 공중 보건 문제로 되었으며, 생식기 감염을 효과적으로 예방하는 것은 매우 심각하고 시급한 과제가 되었다.

현대 의학은 외부 생식기 감염에 대해 주로 병원체를 대상으로 치료한다. 예방 및 치료 측면에서, 생식기 감염을 일으키는 병원성 미생물의 종류가 매우 많고 또한 병원균의 변이와 약제 내성으로 인해, 생식기 감염을 예방하기 위해 항생제 약물을 선택하는데 어려움을 가져왔다. 현재 임상 실무에서 외부 생식기 감염의 치료는 주로 항생제 또는 소독제 기반 투여를 기반으로 한다. 그러나, 소독제는 국소 점막에 대한 자극으로 인해 질내 환경을 파괴하기에 사용이 제한되며, 일반적으로 국소치료에만 적용된다. 세균성 생식기 감염의 경우, 항생제 치료법은 종종 내성과 부작용을 가져온다. 따라서 항균 및 항 바이러스의 이중 기능을 갖는 새롭고 효과적인 외용 약물의 개발은 외부 생식기 감염의 효과적인 예방에 중요한 가치가 있다.

클로로퀸은 줄곧 말라리아원충 감염을 예방하고 치료하는 약물로 사용되어 왔으며, 형질 감염 효율을 향상시키기 위해 유전자 형질 감염 실험에도 자주 사용되었다. 체외 연구 결과에 따르면, 고농도의 클로로퀸이 체외에서 크립토코커스를 억제하고 사멸하는 효과가 있으며, 크립토코커스의 두가지 변종에 대한 작용에 차이가 없다. 동시에, 클로로퀸은 암포테리신 B의 항 크립토코커스 능력을 향상시킬 수 있고, 암포테리신B와의 상승적 항균 효과를 갖는다. 현재, 많은 연구들이 클로로퀸의 항 HIV 활성에 중점을 두고 있다. 연구 결과에 따르면, 클로로퀸은 광범위한 항 HIV 활성을 가지며, HIV-1 진화의 실험실 균주 B 뿐만 아니라, HIV-1 진화 A, B, C, D 및 E의 1차 분리주에 대해서도 매우 효과적이다. 클로로퀸의 항 HIV 효과의 주요 메카니즘은 gp120 바이러스 외피 단백질의 글리코 실화를 억제하여 새로 생성된 바이러스 입자의 감염성을 심각하게 감소시키는 것이다. 동시에, 연구에 따르면, 클로로퀸은 일종의 아미노퀴닌 막 침투제로서, 이중 가닥 DNA에 삽입되고 풀림에 의해 이중 나선 형태의 DNA를 변화시킬 수 있다. 세균학적 연구에 따르면, 클로로퀸은 아크리딘 오렌지 및 에티디움 브로마이드와 같은 일종의 삽입제로서, 작은 플라스미드 DNA의 공유 결합을 선택적으로 억제할 수 있고, DNA 수퍼 코일의 밀도를 변경하는 것을 통해 수퍼 코일의 폐쇄를 변경하여 박테리아와 바이러스에 감염된 세포의 증식을 억제할 수 있다. 자궁 경부암을 일으키는 인간 유두종 바이러스(HPV)의 DNA가 이러한 플라스미드이며, DNA 복제 및 RNA 전사를 수행하는 수퍼코일 복합 DNA이다. 반대로, 클로로퀸은 플라스미드 DNA의 수퍼코일 밀도를 변화시킴으로써 플라스미드 DNA를 억제하고 DNA 중합 효소 활성을 방해하는 것으로 증명되었다. 약한 알칼리성 때문에, 클로로퀸은 엔도좀/리소좀의 축적, pH의 변화 및 가능한 아 pop 토시스와 같은 미토콘드리아 기능 장애를 유발하는 것으로 나타났다. 또한, 클로로퀸은 불활성화된 p53(HPV 분해/비활성화된 p53)을 재활성화하고, 멜라닌 연결(멜라닌 생성은 피부의 HPV 복제와 동일한 층 : 표피의 기저층) 및 철 이온의 방출(복제시 철 촉매/HPV의 에너지 의존성)을 방지하는 것으로 증명되었다. 철은 DNA 복제에 불가피하며, 산소의 수송 및 저장에서 전자 촉매 역할을 한다. 그러나, 철은 또한 병원체 생존 및 바이러스 복제에 필수적이다. 철 입자의 억제는 클로로퀸이 바이러스와 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 중요한 메커니즘이기도 하다.

현재, 클로로퀸에 대한 외부 약물, 특히 자극이 적고 더 광범위한 치료 효과를 갖는 외용제가 없다. 임상 적용에서, 클로로퀸은 주로 말라리아의 급성 발작을 치료하고 말라리아 증상을 제어하는데 사용된다. 또한, 간아메바증, 간흡충증, 폐흡충증, 결합 조직 질환 등의 치료에도 사용될 수 있다. 또한 태양 홍반과 같은 감광성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 정제 및 주사제는 말라리아 치료에 사용되는데, 복용량이 크고 치료 기간이 길어 위장관과 피부에 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 클로로퀸은 또한 피부에 자극을 주어 피부 손상 및 여러가지 피부 발진을 일으킬 수 있다. 따라서, 투여 형태를 변경하는 것을 통해 클로로퀸의 자극을 줄이고, 부작용을 감소하며 클로로퀸의 적용 가치를 향상시키기 위한 방법이 현재 주요 문제가 되고 있다.

약물 마이크로스피어는 약물이 중합체 매트릭스에서 분산 또는 흡착되어 형성된 작은 구형 실체를 지칭한다. 마이크로스피어 제제는 지효성 방출 또는 표적화 효과를 가지기 때문에 환자의 약물 사용의 편리성 및 순응성을 크게 향상시킬 수 있으며, 임상적으로 강점이 부각되어 잠재력이 높은 제형이다. 그리고, 마이크로스피어 제제 제품은 부가가치가 높고 시장 전망이 넓어서, 최근에는 약물 연구 및 개발의 핫이슈로 되었다.

본 발명의 목적은 상술한 종래 기술의 단점을 극복하고 천연 폴리머 화합물을 마이크로스피어 담체로 사용함으로써 제조 공정이 간단하고 제품의 부작용이 작으며 클로로퀸과 마이크로스피어 담체 사이의 상승적 효과를 충분히 발휘하고 현저한 항염증, 항균 및 항바이러스 효과를 가지며 클로로퀸이 피부에 대한 자극을 줄이고 상처의 치유를 촉진하며 약물 방출 속도를 제어하고 기존 마이크로스피어 담체의 항균 효과가 미흡하고 클로로퀸의 자극이 큰 단점을 극복할 수 있는 클로로퀸 나노 마이크로 스피어를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 외부 생식기 및 다른 피부 사마귀에 적용되는 클로로퀸 나노스피어의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 클로로퀸 나노스피어의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 또 다른 목적은 외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀의 예방 및 치료를 위한 제품을 제공하는 것이다.

본 발명은 다음의 기술 방안을 통해 상술한 목적을 구현한다.

수용성 나노스피어 담체 및 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 포함하는 클로로퀸 나노스피어를 제공한다.

본 발명자는 수용성 나노스피어 담체와 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 조합하여 나노스피어를 제조하면, 작용 시간이 길고 점막 접착성, 국소 체류성 및 자기 분해성을 갖고 클로로퀸의 자극을 감소하고 외부 생식기를 자극하지 않으며, 동시에 기존의 외부 생식기 감염의 치료 방법에서 부작용이 크고 사용이 불편한 결함을 극복하고 클로로퀸의 부작용과 약물 내성을 효과적으로 해결하며; 본 발명의 나노스피어는 질염, 평면 사마귀 등과 같은 외부 생식기 감염 및 기타 피부 사마귀 질환을 효과적으로 예방 및 치료하고 심지어 현저한 상승적 효과를 나타내며; 클로로퀸의 사용을 넓히고 적용 범위를 확대할 뿐만 아니라, 기존의 항균제 남용으로 인한 약물 내성 현상을 개선할 수 있다는 사실을 의외로 발견하였다.

본 발명은 또한 상기 클로로퀸 나노스피어의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은,

S1, 상기 수용성 나노입자 담체를 용해시킨 후, 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 첨가하여 균일하게 혼합 교반하여 수성상으로 사용하는 단계 - 여기서 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노입자 담체의 질량비는 1 : 3미만임 - ;

S2, 유상 기질에 유화제를 첨가하여 유상으로 사용하고, 수성상을 유상에 첨가하며, 수성상과 유상의 부피비는 1 : 1~6이고, 10000~20000r/min에서 10~30 min유화하여 나노입자 에멀젼을 얻는 단계;

S3, 나노입자 에멀젼에 침전제를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 2~8 min정치시킨 후에 탈수, 고속 원심 세정, 건조를 거쳐 상기 클로로퀸 나노입자를 얻는 단계;를 포함한다.

바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노스피어 담체의 질량비는 1 : 3~1 : 5이다.

더 바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노스피어 담체의 질량비는 1 : 3이다.

바람직하게, 상기 클로로퀸 유도체는 하이드록시 클로로퀸, 인산 클로로퀸 또는 황산 클로로퀸 중의 하나 이상으로부터 선택된다.

바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체의 부하율은 3.0%~21.6%이다.

더 바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체의 부하율은 12.5%이다.

바람직하게, 상기 수용성 나노스피어 담체는 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분 중의 하나 이상으로부터 선택된다.

바람직하게, 상기 수용성 나노스피어 담체는 수용성 키토산이다.

더 바람직하게, 상기 수용성 키토산의 탈아세틸화는 80%~95%이고, 점도 평균 분자량은 3000~5000이다.

바람직하게, 단계S2에서 수성상과 유상의 부피비는 1 : 3이다.

바람직하게, 단계S3에서 고속 원심 분리 조건은 1500~2000r/min로 5~10 min원심 분리한다.

더 바람직하게, 단계S3에서 고속 원심 분리 조건은 1500r/min로 10 min원심 분리한다.

바람직하게, 단계S3에서 나노스피어 에멀젼에 초당 1~5방울의 속도로 침전제를 첨가한다.

바람직하게, 상기 유화제와 침전제의 부피비는 1~1.5 : 30~50이다.

더 바람직하게, 상기 유화제와 침전제의 부피비는 1 : 50이다.

바람직하게, 상기 유상 기질은 식물성 오일이고; 상기 침전제는 알칼리성 유기상이다.

더 바람직하게, 상기 알칼리성 유기상은 수산화 나트륨 n-프로판올 혼합 용액이다.

더 바람직하게, 상기 알칼리성 유기상의 pH값은 8.5~10.0이다.

한층 더 바람직하게, 상기 알칼리성 유기상의 pH값은 9.0이다.

바람직하게, 상기 식물성 오일은 옥수수 기름, 올리브 기름, 땅콩 기름, 콩기름, 유채 기름 등 식물성 오일 중의 하나 이상으로부터 선택된다.

바람직하게, 상기 유화제는 트윈-20, 트윈-80, Span 80 중의 하나 이상으로부터 선택된다.

상기 클로로퀸 나노스피어가 항균 및/또는 항 바이러스 제품의 제조에서의 적용 및 외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀를 예방 및 치료하기 위한 제품의 제조에서의 적용도 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.

상기 클로로퀸 나노스피어를 함유한 제품은 클로로퀸의 피부 자극을 현저히 감소시키고 상처 치유를 촉진하고 지효성 방출 효과를 가져오며, 동시에 생물학적 활성을 향상시키고 외부 생식기 감염 및 기타 피부 사마귀의 치료에 적합하다.

바람직하게, 상기 외부 생식기 감염은 바이러스성 질염, 첨규콘딜롬, 세균성 질염, 진균 감염성 질염 또는 편모충 질염을 포함한다.

바람직하게, 상기 다른 피부 사마귀는 평면 사마귀, 비 생식기 부위의 HPV감염에 의한 사마귀를 포함한다.

상기 클로로퀸 나노스피어는 바이러스성 질염, 첨규콘딜롬, 세균성 질염, 진균 감염성 질염 또는 편모충 질염 등 외부 생식기 감염 및 평면 사마귀, 비 생식기 부위의 HPV감염에 의한 사마귀 등 다른 피부 사마귀에 대해 모두 뛰어난 치료 효과를 가진다.

본 발명은 또한 외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀를 예방 및 치료하기 위한 제품을 제공하는데, 상기 제품은 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 포함하며, 또한 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분 중의 하나 이상을 포함한다.

바람직하게, 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분의 질량비는 1 : 3을 초과하지 않는다.

더 바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분의 질량비는 1 : 3~1 : 5이다.

한층 더 바람직하게, 상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분의 질량비는 1 : 3이다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀를 예방 및 치료하기 위한 제품은 상기 클로로퀸 나노스피어를 포함한다.

더 바람직하게, 상기 클로로퀸 나노스피어가 제품 총중량의 1%~6%을 차지한다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 제품은 겔, 연고, 크림, 발포성 정제, 질 정제, 캡슐, 필름제제 또는 좌약이다.

본 발명의 상기 제품은 겔, 크림 등과 같은 반고체 제제 또는 정제 및 발포성 정제와 같은 고형 제제로 가공될 수 있으며, 클로로퀸 자체의 쓴 맛 및 피부 자극을 현저히 개선할 수 있고, 상처 치유를 촉진하고 지효성 방출 효과가 있는 동시에 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 제품은 겔이다.

종래 기술과 비교하면, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 가진다.

(1) 본 발명은 수용성 나노스피어 담체와 클로로퀸을 결합하여 살균 및 항바이러스 효과를 동시에 갖는 외용제를 제조하는데, 현저한 상승적 효과를 발휘하고 각종 세균 및 바이러스에 대해 일정한 세정 및 살균 기능이 있으며, 남성과 여성의 외부 생식기에 대해 모두 세정 및 관리 작용이 있고 외부 생식기의 염증을 줄이고 클로로퀸으로 인한 피부의 자극을 개선할 수 있으며, 질 점막과 음경에 자극이 없고 점막 접착성, 국소 체류성 및 자기 분해성을 가져 세균 및 바이러스 감염을 예방할 뿐만 아니라 미세 상처의 치유를 촉진하며, 외부 생식기 감염 및 피부 사마귀의 효과적인 치료에 적용될 수 있고, 특히 성생활 전후의 외부 생식기의 위생 관리에 대해 효과가 뛰어나고 시원하고 편안한 작용이 있다.

(2) 본 발명은 수용성 나노스피어 담체와 증효제인 클로로퀸을 주요 성분으로 하며, 처방이 안정하고, 약물이 마이크로스피어 형태로 존재하기에 약물의 치료 부위에서의 체류 시간을 연장하여 작용 시간을 길게 하고 약물의 생체 이용률 및 치료 효과를 개선하며, 제조 방법이 간단하고 합성이 용이하며 독성 및 부작용이 없고 안전성이 우수하며, 신형 약물의 산업 적용에 적응할 수 있고 항균 및 항바이러스 약물의 개발 및 적용을 위해 새로운 방향을 제시한다.

도 1은 클로로퀸 키토산 나노스피어를 나타낸다.
도 2는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 클로로퀸의 표준 곡선을 나타낸 도면이다.
도 3은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 클로로퀸 키토산 마이크로스피어의 클로로퀸 함량을 나타낸 도면이다.
도 4는 클로로퀸 키토산 나노스피어와 클로로퀸 마이크로스피어의 약물 방출 상황을 나타낸 도면이다.
도 5는 매끄러운 유리 평면에서 서로 다른 비례의 겔 제품(1 내지 4번 겔 제품의 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 각각 1 : 5, 1 : 3, 1 : 1, 1 : 0.5이며, 5번은 순수한 키토산의 겔 제품)을 관찰한 도면이다.
도 6은 서로 다른 비례의 겔 제품이 1 min내에 매끄러운 유리 평면에서의 유동 상황(1 내지 4번 겔 제품의 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 각각 1 : 5, 1 : 3, 1 : 1, 1 : 0.5이며, 5번은 순수한 키토산의 겔 제품)을 나타낸 도면이다.
도 7은 손상된 피부 자극 시험의 H-E염색 결과를 나타낸 도면이며, 여기서, A그룹 : 대조군, 블랭크 겔 매트릭스, 도 A1은 (시험물군), 도 A2는 (음성 대조군); B그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3, 도 B1은 (시험물군), 도 B2는 (음성 대조군); C그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 5, 도 C1(시험물군), 도 C2는 (음성 대조군); D그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹3, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5, 도 D1은 (시험물군), 도 D2은 (음성 대조군); E그룹 : 인산 클로로퀸 겔 그룹, 도 E1은 (시험물군), 도 E2는 (음성 대조군)이다.
도 8은 헤르페스 바이러스 질염 동물 시험의 H-E염색 결과를 나타낸 도면이며, 여기서, 도 A는 블랭크 대조군이고; 도 B는 모델 대조군이고; 도 C는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1이고, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3이며; 도 D는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2이고, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5이며; 도 E는 인산 클로로퀸 겔 그룹이다.
도 9는 HPV첨규콘딜롬 동물 시험의 H-E염색 결과를 나타낸 도면이며, 여기서, 도 A는 모델 대조군이고; 도 B는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1이고, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3이며; 도 C는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2이고, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5이며; 도 D는 인산 클로로퀸 겔 그룹이다.

이하, 구체적인 실시 방식을 결부하여 본 발명에 대해 한층 더 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이러한 실시예는 본 발명을 어떠한 형태로도 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 사상 및 취지를 벗어나지 않는 전제하에 본 발명의 방법, 단계 또는 조건에 대한 간단한 수정 또는 대체는 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다. 별도의 설명이 없는 한, 실시예에 사용된 기술적 수단은 당업자에게 주지된 통상적인 수단이다.

달리 명시되지 않은 한, 이하 실시예에 사용된 시약 및 물질은 모두 시장에서 구매한 것이다.

실시예 1 클로로퀸 키토산 나노스피어의 제조

1. 제조 방법

S1, 수용성 키토산3g을 칭량하여 100mL의 물에 첨가하여 용해시킨 후, 인산 클로로퀸1.0g을 첨가하여 균일하게 혼합 교반하여 수성상으로 사용하며, 여기서, 수용성 키토산의 탈아세틸화는 80%이고, 점도 평균 분자량은 5000이다.

S2, 옥수수 기름 300mL을 칭량하여 유상 기질로 사용하고, 유상 기질에 1mL의 유화제 트윈-20을 첨가하여 유상으로 사용하며, 수성상과 유상의 부피비1 : 3으로 수성상을 유상에 첨가하고 15000r/min로 30 min 유화하여 나노스피어 에멀젼을 얻는다.

S3, 수산화 나트륨 n-프로판올 혼합 용액을 침전제로 하며, 10mL의 n-프로판올을 취해 수산화 나트륨 포화 용액 몇방울을 첨가하여 pH=9로 조절하여 균일하게 혼합하고, 유화제와 침전제의 부피비를 1 : 50로 제어하여 초당 1~5방울의 속도로 나노스피어 에멀젼에 첨가하며, 5 min정치시킨 후에 적절한 양의 n-프로판올을 첨가하여 탈수하며, 1500r/min로 10 min원심 분리 후, 세척 및 건조하여 상기 클로로퀸 키토산 나노스피어를 얻는다.

2. 제품 특징

(1) 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 제조 단계를 통해 얻은 클로로퀸 키토산 나노스피어의 입자 크기는 100~800 nm이다.

(2) 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한 클로로퀸 키토산 마이크로스피어의 클로로퀸의 부하율은 12.5%이다.

실시예 2 클로로퀸 키토산 나노스피어의 제조

1. 제조 방법

S1, 수용성 키토산을 물에 용해시킨 후, 하이드록시 클로로퀸과 수용성 키토산의 질량비 1 : 5로 하이드록시 클로로퀸을 첨가하여 균일하게 혼합 교반하여 수성상으로 사용하며, 여기서, 수용성 키토산의 탈아세틸화는 90%이고, 점도 평균 분자량은 3000이다.

S2, 옥수수 기름 300mL을 칭량하여 유상 기질로 사용하고, 유상 기질에 1mL의 유화제 트윈-20을 첨가하여 유상으로 사용하며, 수성상과 유상의 부피비1 : 1로 수성상을 유상에 첨가하고 10000r/min로 30 min유화하여 나노스피어 에멀젼을 얻는다.

S3, 수산화 나트륨 n-프로판올 혼합 용액을 침전제로 하며, 10mL의 n-프로판올을 취해 수산화 나트륨 포화 용액을 몇방울 첨가하여 pH=8.5로 조절하여 균일하게 혼합하고, 그 다음에 유화제와 침전제의 부피비가 1.5 : 50이 되게 나노스피어 에멀젼에 천천히 첨가하여 2 min정치시키고 적절한 양의 n-프로판올을 첨가하여 탈수시키며; 2000r/min로 5 min원심 분리 후, 세척 및 건조하여 상기 클로로퀸 카라기난 나노스피어를 얻으며, 그 입자 크기는 200~800nm이고, 클로로퀸의 부하율은 10.3%이다.

실시예 3 클로로퀸 키토산 나노스피어의 제조

1. 제조 방법

S1, 수용성 키토산을 물에 용해시킨 후, 황산 클로로퀸과 수용성 키토산의 질량비 1 : 7로 황산 클로로퀸을 첨가하여 균일하게 혼합 교반하여 수성상으로 사용하며, 여기서, 수용성 키토산의 탈아세틸화는 90%이고, 점도 평균 분자량은 4000이다.

S2, 올리브 오일을 취해 유상 기질로 사용하고, 유상 기질에 유화제트윈-80을 첨가하여 유상으로 사용하며, 수성상과 유상의 부피비1 : 6로 수성상을 유상에 첨가하고 20000r/min로 10 min유화하여 나노스피어 에멀젼을 얻는다.

S3, 수산화 나트륨 n-프로판올 혼합 용액을 침전제로 하며, n-프로판올을 취해 수산화 나트륨 포화 용액을 첨가하여 pH=10로 조절하여 균일하게 혼합하고, 그 다음에 유화제와 침전제의 부피비가 1.5 : 30이 되게 나노스피어 에멀젼에 천천히 첨가하여 8min정치시키고 적절한 양의 n-프로판올을 첨가하여 탈수시키며; 1500r/min로 10min원심 분리 후, 세척 및 건조하여 상기 클로로퀸 전분 나노스피어를 얻으며, 그 입자 크기는 400nm이고, 클로로퀸의 부하율은 8.6%이다.

실시예 4 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔의 제조

1. 겔 처방 :

2. 제조 방법은 다음 단계를 포함한다.

(1) 마이크로스피어의 제조 : 실시예1의 클로로퀸 키토산 나노스피어의 제조 단계에 따라 제조한다.

(2) 카르복시메틸셀룰로오스20g을 취하고 배합량의 글리세린300g 및 에칠파라벤2g을 첨가하여 균일하게 교반하여 충분히 팽윤된 후 겔 매트릭스로 사용하며, 클로로퀸 키토산 나노스피어10g을 취해 100mL의 물에 용해시키고 겔 매트릭스에 단계적으로 첨가하여 교반하며, 페퍼민트 오일1ml을 첨가하고 1000mL까지 물을 첨가하여 외부 생식기에 적용되어 항균, 항 바이러스 역할을 할 수 있는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔을 제조한다.

3. 동일한 방법으로 순수한 클로로퀸 겔을 제조하여 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔과 클로로퀸 겔 중의 클로로퀸의 방출 속도를 비교한다.

도 4에 도시된 바와 같이, 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔은 클로로퀸을 천천히 평온하게 방출한다. 본 발명에 따라 제조한 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔은 초기에 갑자기 방출되는 현상이 존재하지 않고 방출 속도가 배지의 영향을 거의 받지 않으며, 우수한 지효성 방출 효과를 나타내기에 외용 투여 후 약물의 지속적인 방출에 유리하다.

실시예 5 클로로퀸 키토산 나노스피어겔의 제조

1. 겔 처방 :

2. 제조 방법은 다음 단계를 포함한다.

(2) 카르복시메틸셀룰로오스를 취하고 배합량의 글리세린 및 800mL의 물을 첨가하여 균일하게 교반하여 충분히 팽윤된 후 겔 매트릭스로 사용하며, 클로로퀸 키토산 나노스피어를 취해 100mL의 물에 용해시키고 겔 매트릭스에 단계적으로 첨가하여 교반하며, 50mL의 80~85℃온수를 사용하여 에칠파라벤을 용해시키고 온도가 40℃이하로 냉각된 후 겔 매트릭스에 첨가하여 균일하게 교반하며, 페퍼민트 오일을 첨가하고 1000mL까지 물을 첨가하여 외부 생식기의 항균, 항 바이러스에 적합한 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔을 제조한다.

3. 다른 공정 조건은 변경하지 않고 단지 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비만 변경하여 상기 단계에 따라 겔1, 겔2, 겔3, 겔4를 각각 제조하며, 이와 동시에, 다른 공정 조건은 변경하지 않고, 또한 클로로퀸 또는 그 유도체를 첨가하지 않고 순수한 키토산을 주요 활성 성분으로 사용하여 상기 실시예의 제조 단계에 따라 겔5를 제조한다. (하기 표 참조)

여기서, 도 5는 매끄러운 유리 평면에서 서로 다른 비례의 겔 제품(1 내지 4번 겔 제품의 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 각각 1 : 5, 1 : 3, 1 : 1, 1 : 0.5이며, 5번은 순수한 키토산의 겔 제품)을 관찰한 도면이며, 도 6은 서로 다른 비례의 겔 제품이 1 min내에 매끄러운 유리 평면에서의 유동 상황을 나타낸 도면이다.

시험 결과에 따르면, 인산 클로로퀸과 키토산의 비례가 1 : 1 또는 1 : 0.5인 경우, 제조된 겔의 품질이 균일하지 못하고 작은 과립이 존재하고 유동성이 바람직하지 못하며; 인산 클로로퀸과 키토산의 비례가 1 : 5 또는 1 : 3인 경우, 제조된 겔의 품질이 균일하고 pH가 질 또는 피부의 투여에 적합하고 점도가 적당하고 색과 냄새가 모두 다양한 사람들의 수요를 충족할 수 있고 클로로퀸 함량이 안정되지만, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비가 1 : 5인 경우, 클로로퀸 함량이 비교적 낮고 약효가 일정한 제한을 받게 되며, 종합적으로 고려하면, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비가 1 : 3인 경우에 제품의 효과가 더욱 우수하다.

실시예 6 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔이 손상된 피부에 대한 자극성 시험

1. 실험 방법

(1) 뉴질랜드 토끼를 실험 대상으로 사용하고, 동일한 신체의 왼쪽 및 오른쪽 자체 피부 비교법을 이용하며, 왼쪽 및 오른쪽의 약물 투여 부위의 피부를 각각 "＃"형태로 절개(면적은 약 3.0cmХ3.0cm)하고, 왼쪽은 시험물을 1.0g 사용하고 투여량은 마리당 9cm²이고 매번 부착 면적은 3.0 cmХ3.0 cm이며, 오른쪽은 1.0g의 백색 바셀린을 사용하여 음성 대조군으로 한다. 각 그룹의 동물에 대해 매일 1회씩, 연속 28일 동안 약물을 투여한다.

시험물군 :

A그룹 : 대조군, 블랭크 겔 매트릭스.

B그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3.

C그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 5.

D그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹3, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5.

E그룹 : 인산 클로로퀸 겔 그룹.

매번 약물 도포 전 및 약물 제거 후 1시간, 제28일째에 약물 제거 후 1시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 14일에 상기 각 동물군의 각 관찰 시점에서 약물 투여 부위의 홍반 및 부종을 관찰하고 홍반 및 부종에 대해 평가하며, 또한 약물 투여 부위에 색소 침착, 점상출혈, 거친 피부 또는 피부가 얇아지는 현상이 존재하는지 여부를 관찰하여 그 발생 시간과 복귀 시간을 기록한다.

(2) 상기 5개 그룹의 동물군에 대해, 마지막으로 약물 제거 후 제14일째에 약물 투여 부위의 왼쪽 및 오른쪽 피부에 대해 각각 조직 병리학적 검사를 진행한다.

2. 결과

(1) 각 군의 피부 관찰 결과

시험 결과 :

음성 대조군(오른쪽)의 경우, 각 시험물군의 동물의 약물 투여 부위의 피부에 각 관찰 시점에서 모두 현저한 자극성 반응이 발견되지 않았기 때문에, 백색 바셀린을 투여한 음성 대조군의 결과를 음성으로 판단한다.

A그룹 : 각 관찰 시점에서 모두 현저한 자극성 반응이 발견되지 않았기 때문에, 블랭크 겔 매트릭스가 피부에 자극이 없는 것으로 판단한다.

B그룹 : 6/6사례 동물의 시험물군(왼쪽)의 약물 투여 부위 피부가 제1일부터 제12일 사이에 육안으로 관찰하는 시점에서 가벼운 홍반 또는 부종이 발견되었으며, 제12일부터 부검 전 까지 각 동물의 약물 투여 부위에 현저한 이상이 발견되지 않았고 마지막 약물 투여일 이후 72시간 및 제14일의 조직 병리학적 검사 결과에 따르면, 6/6사례 동물의 시험물군의 약물 투여 부위 피부 중에서 2사례에 가벼운 부종이 발견되었고 다른 사례는 모두 현저한 이상 또는 변화가 발견되지 않았다. 따라서, 상기 자극에 대해 피부가 손상된 후 약물이 기계적 자극을 일정한 정도로 악화시키는 것으로 판단한다.

C그룹 : 6/6사례 동물의 시험물군(왼쪽)의 약물 투여 부위 피부가 제1일부터 제12일 사이에 육안으로 관찰하는 시점에서 가벼운 홍반 또는 부종이 발견되었고, 제12일부터 부검 전 까지 각 동물의 약물 투여 부위에 현저한 이상이 발견되지 않았고 마지막 약물 투여일 이후 72시간 및 제14일의 조직 병리학적 검사 결과예 따르면, 6/6사례 동물의 시험물군의 약물 투여 부위 피부에 모두 현저한 이상 또는 변화가 발견되지 않았다. 따라서, 상기 가벼운 자극을 피부가 손상된 후의 기계적 자극으로 판단한다.

D그룹 : 6/6사례 동물의 시험물군(왼쪽)의 약물 투여 부위에서 4/6사례의 동물이 제12일부터 약물 투여 부위에 현저한 홍반 또는 부종이 발견되었고, 딱지(결가)가 약물 투여 시에 떨어졌고, 떨어질 때 피부 표면이 완전히 유합되지 않았으며, 마지막으로 약물 제거 후 72시간 후에 상처가 현저히 유합되었다.

E그룹 : 6/6사례 동물의 시험물군(왼쪽)의 약물 투여 부위에서 4/6사례의 동물이 제11일부터 손상 부위가 터지는 현상이 나타났고 외부로 확산되는 추세를 보였으며, 약물 투여 부위에 전에 보다 더욱 현저한 홍반 또는 부종이 나타났고, 딱지가 져 새로운 살이 생성되다가 다시 떨어졌으며, 떨어질 때 피부 표면이 완전히 유합되지 않아 동일한 신체의 오른쪽의 음성 대조군과 분명하게 차이가 났으며, 마지막 약물 투여일 이후 72시간 및 제14일의 조직 병리학적 검사 결과예 따르면, 6/6사례 동물의 시험물군의 약물 투여 부위 피부에 모두 현저한 이상이 나타났고, 그중에서 72시간 후에 부검을 한 3사례의 동물에 일정한 정도의 손상이 나타났는데, 표피층이 현저하게 두꺼워지고 표피 아래 결합 조직의 배열이 무질서하며 섬유 조직이 증식하고 염증 세포가 침윤되었으며, 표피에 딱지가 생기고 표피의 일부분이 침지되었고 구조가 흐려졌으며, 마지막 약물 투여일 이후 제14일의 부검에서 3사례 동물이 국소적으로 표피가 두꺼워지고 표피 아래 결합 조직의 배열이 무질서하며 섬유 조직이 증식하고 염증 세포가 침윤되었다.

상기 실험 결과로부터 알수 있다 시피, 뉴질랜드 토끼의 손상된 피부에 약물을 여러회 투여한 결과, 인산 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔이 손상된 피부에 대한 자극이 인산 클로로퀸 겔(일반 외용제)보다 훨씬 작으며; 인산 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔의 경우, 클로로퀸/나노스피어 담체의 비례가 작을수록 피부에 대한 자극성 반응이 더욱 작고, 약물 투여 중단 후 손상된 피부가 더욱 잘 복구된다. 클로로퀸 겔의 경우, 손상된 피부에 대한 손상이 더욱 엄중해졌으며, 음성 대조군이 이미 완전히 복구된 상황에서 클로로퀸 겔군의 피부는 정상적으로 복구되지 못했고, 약물 투여 중단 후 14일간 복구된 후에야만 클로로퀸 겔군의 피부가 일정한 정도로 복구되었는데, 양자의 차이가 매우 현저하다. 따라서, 이는 클로로퀸이 손상된 피부에 대해 자극 작용이 있지만 클로로퀸 키토산 마이크로스피어가 이런 자극 작용을 현저히 감소시킨다는 것을 설명하는데, 이는 키토산 자체가 항균, 소염 및 상처 유합 효과를 갖기 때문일 수 있다.

（2） 병리학적 검사 결과

A그룹 : 도 7의 도 A1(블랭크 매트릭스군), 도 A2(음성 대조군)에 도시된 바와 같이, 피부 표피, 진피 및 부속물의 구조가 손상되지 않았고, 염증 세포 침윤 및 혈관 확장이 나타나지 않았다.

B그룹 : 도 7의 도 B1(클로로퀸 키토산 나노스피어 겔), 도 B2(음성 대조군)에 도시된 바와 같다. 도 B2에 도시된 바와 같이, 피부 표피, 진피 및 부속물의 구조가 손상되지 않았고, 염증 세포 침윤 및 혈관 확장이 나타나지 않았다. 음성 대조군과 비교하면, 도 B1에 도시된 바와 같이, 해당 그룹의 국소 표피가 약간 두꺼워졌고, 소량의 염증 세포 침윤이 관찰되었다.

C그룹 : 도 7의 도 C1(클로로퀸 키토산 나노스피어 겔군), 도 C2(음성 대조군)에 도시된 바와 같다. 도 C2에 도시된 바와 같이, 피부 표피, 진피 및 부속물의 구조가 손상되지 않았고, 염증 세포 침윤 및 혈관 확장이 나타나지 않았다. 도 C1에 도시된 바와 같이, 해당 그룹의 피부의 국소 표피가 약간 두꺼워졌고 세포층의 수량이 현저하게 증가되었으며, 진피로 연장되어 성장되었고 표피 아래 결합 조직의 배열이 무질서하고 일부 염증 세포 침윤이 나타났다.

D그룹 : 도 7의 도 D1(클로로퀸 키토산 나노스피어 겔군), 도 D2(음성 대조군)에 도시된 바와 같다. 도 D2에 도시된 바와 같이, 피부 표피, 진피 및 부속물의 구조가 손상되지 않았고, 염증 세포 침윤 및 혈관 확장이 나타나지 않았다. 음성 대조군과 비교하면, 도 D1에 도시된 바와 같이, 해당 그룹의 피부의 국소 표피가 약간 두꺼워졌고 세포층의 수량이 증가되었으며, 소량의 염증 세포 침윤이 나타났다.

E그룹 : 도 7의 도 E1(클로로퀸 겔군), 도 E2(음성 대조군)에 도시된 바와 같다. 음성 대조군의 경우, 피부 표피, 진피 및 부속물의 구조가 손상되지 않았고, 염증 세포 침윤 및 혈관 확장이 나타나지 않았지만, 클로로퀸 겔군의 피부는 국소 표피에 딱지가 생기고 표피가 현저히 두꺼워졌으며, 일부 딱지가 피하 조직에 긴밀히 연결되었고, 표피의 일부분이 침지되고 구조가 흐려졌으며, 대량의 염증 세포 침윤 및 섬유 조직의 증식이 나타났고, 진피층 모낭의 수량이 현저히 감소되었지만 근육층 및 피하 조직에는 현저한 이상이 나타나지 않았다.

상기 병리학적 검사 결과로부터 알수 있다 시피, 클로로퀸 키토산 마이크로스피어 겔이 클로로퀸 겔에 비해, 자극성 및 약물 투여 중단 후의 유합 측면에서 모두 현저한 우세를 가진다. 각 클로로퀸 키토산 마이크로스피어군에서, 클로로퀸 나노스피어 담체의 비례가 낮을 수록 피부에 대한 자극성 반응이 더욱 작다.

피부 관찰 결과와 병리학적 검사 결과를 종합하면, 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔이 피부에 대한 자극성 반응이 클로로퀸 겔보다 현저히 작고, 클로로퀸 키토산 나노스피어는 클로로퀸이 피부를 자극하는 부작용을 대폭 감소시키며, 어느 정도로 상처의 치유를 촉진한다는 것을 설명한다. 클로로퀸과 키토산의 질량비가 1 : 3를 초과하지 않는 경우, 자극 작용이 비교적 작고, 약물 함량이 제일 높다.

실시예 7 헤르페스 바이러스 질염 동물 시험

1. 실험 방법

실시예 2를 통해 얻은 클로로퀸 키토산 나노스피어로 겔을 만들어 헤르페스 바이러스 질염 동물 실험을 진행한다.

구체적인 실험 방법은, 적응성 관찰에 합격된 Hartley기니피그를 선택하고 무작위로 10마리를 선택하여 블랭크 대조군(A)으로 하며, 나머지 동물은 모두 질을 통해 헤르페스 바이러스를 감염시켜 모델을 만들고, 모델로 만든 동물을 무작위로 5개 그룹으로 나누며, 전체적인 그룹 구분 상황은 다음과 같다.

A그룹 : 블랭크 대조군.

B그룹 : 모델군.

C그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3.

D그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5.

E그룹 : 인산 클로로퀸 겔 그룹.

각 그룹당 10마리씩이고, 모두 질을 통해 약물을 투여한다. 블랭크 대조군, 모델 대조군에는 0.9%염화나트륨주사액을 투여하고, C그룹, D그룹 및 E그룹에는 상응한 시험 약물을 투여하며, 매일 1회 투여하고, 각 그룹에 연속 2주일간 약물을 투여한다. 약물 투여 14일 후, 그 다음날에 질 점막 조직을 취해 고정 및 파라핀 포매하고 연속하여 4 μm두께로 절편을 만들며, 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 후, 현미경으로 질 점막 조직의 병리학적 상태를 관찰한다.

2. 결과

(1) 병리학적 검사

A그룹 : 블랭크 대조군의 결과는 도 8의 A에 도시된 바와 같이, 블랭크 대조군의 질 점막 상피 세포의 구조가 손상되지 않았고 고유층 혈관이 확장되지 않았으며 염증 세포 침윤이 없다.

B그룹 : 모델 대조군의 결과는 도 8의 B에 도시된 바와 같이, 모델 대조군의 질 점막 아래 고유층에 대량의 염증 세포 침윤이 나타났고 소성결합조직의 배열이 무질서하며 부종이 분명하다.

C그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹1 (인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 3)의 결과는 도 8의 C에 도시된 바와 같이, 해당 군의 자궁 내막층의 결합 조직이 증가되고 배열이 무질서하며 부종이 분명하고 소량의 염증 세포 침윤이 동반되었다.

D그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2 (인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5)의 결과는 도 8의 D에 도시된 바와 같이, 해당 군은 점막 아래 고유층의 부종이 분명하고 자궁 내막층의 결합 조직이 증가되고 배열이 무질서하며 부종이 분명하고 염증 세포 침윤이 나타났다.

E그룹 : 인산 클로로퀸 겔 그룹의 결과는 도 8의 E에 도시된 바와 같이, 클로로퀸 겔 그룹의 질 점막의 국소 상피 세포가 변성 및 괴사되었고 점막 아래 고유층의 소성결합조직의 배열이 약간 무질서하며 부종이 분명하고 염증 세포 침윤이 동반되었다.

(2) 시험 동물의 조직학적 병변 정도 검사 결과

참고 : "-"는 조직 구조에 명백한 이상이 없음을 나타내고, "±"는 매우 가벼운 손상을 나타내고, "+"는 가벼운 손상을 나타내고, "++"는 중도의 손상을 나타내고, "+++"는 심각한 손상을 나타낸다.

상기 연구 결과는 클로로퀸 겔에 비해 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔은 헤르페스 바이러스에 의해 유발된 질염을 현저하게 개선할 수 있다는 것을 보여준다. 각 군의 염증 정도를 비교하면, 모델 대조군＞인산 클로로퀸E그룹＞클로로퀸 키토산 나노스피어겔D그룹>클로로퀸 키토산 나노스피어겔C그룹>블랭크 대조군의 순서이다. 그리고, 클로로퀸과 키토산을 함께 사용하면 질의 부종 상태를 현저하게 개선할 수 있고, 그 결과는 염증 정도와 유사하다. 이는 클로로퀸 키토산 마이크로스피어를 함께 사용함으로써 치료 효과를 현저하게 향상시키는 효과를 가져왔다는 것을 설명한다.

실시예 8 HPV에 의해 유발된 첨규콘딜롬 치료

1. 실험 방법

적응성 관찰에 합격된 누드마우스를 암컷 반 및 수컷 반으로 일부 선택하여 HPV감염된 사마귀 조직을 누드마우스의 피하에 직접 접종하며, 이식 과정은 무균 수술 원칙을 엄격히 준수한다. 사마귀 접종 5-6 일 후, 접종 부위의 상태가 바람직한 누드마우스를 체중과 성별에 따라 무작위로 4개 그룹으로 골고루 나눈다. 즉 :

A그룹 : 모델 대조군.

C그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹2, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 1 : 0.5.

D그룹 : 인산 클로로퀸 겔 그룹.

각 그룹당 6마리씩이고, 암컷 반 및 수컷 반이다. 여기서, 모델 대조군에 백색 바셀린을 투여하고 다른 각 그룹은 상응한 겔을 투여하며, 각 그룹 모두 피부에 바르는 방식으로 약물을 투여하고, 동물의 약물 투여 부위의 투여 구역은 2cm×2cm이다. 매일 1회, 매번 6시간 투여하고, 6시간 후에 약물을 제거하며, 연속 14일 투여한다. 양성 대조군은 매주 3회, 매번 6시간 투여하고 6시간 후에 약물을 제거하여, 연속 14일 투여한다. 약물 투여 14일 후, 그 다음날에 해부하여 사마귀 조직을 추출하여 고정하며, 파라핀 포매하고 연속하여 4 μm두께로 절편을 만들며, 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 후, 현미경으로 사마귀 조직의 병리학적 상태를 관찰한다.

2. 결과

병리학적 검사 결과

(1) A그룹의 사마귀 결과에 따르면, 각 사례의 동물에서 사마귀 조직이 관찰되고, 사마귀 조직의 상피 세포 구조에 손상이 없고, 국소적으로 공세포가 관찰된다.

도 9의 A에 도시된 바와 같이, 사마귀의 국소 상피 세포의 세포핵 주위에 분명하게 액포가 존재하고, 세포핵의 핵인이 분명하다.(H-E염색×200)

(2) B그룹의 사마귀의 결과를 보면, 6사례의 동물에서 사마귀 조직이 관찰된다. 여기서, 2사례 동물(03,04;2/6)의 사마귀 조직의 상피 세포가 국소적으로 변성 및 괴사되었고, 소량의 공세포가 관찰되며; 4사례 동물(01,02,05,06;4/6)의 사마귀 조직의 상피 세포가 구조에 손상이 없고, 국소적으로 공세포가 관찰된다.

도 9의 B에 도시된 바와 같이, 사마귀의 국소 상피 세포의 세포핵 주위에 분명하게 액포가 존재하고, 세포핵의 핵인이 분명하다.(H-E염색×200)

(3) C그룹의 사마귀의 결과를 보면, 6사례 동물에서 사마귀 조직이 관찰된다. 여기서, 3사례 동물(03,04,05;3/6)의 사마귀 조직 상피 세포가 국소적으로 변성 및 괴사되었고, 소량의 공세포가 관찰되며; 3사례 동물(01,02,06;3/6)의 사마귀 조직 상피 세포 구조가 손상이 없고 국소적으로 공세포가 관찰된다.

도 9의 C에 도시된 바와 같이, 사마귀의 국소 상피 세포의 세포핵 주위에 분명하게 액포가 존재하고, 세포핵의 핵인이 분명하다.(H-E염색×200)

(4) D그룹의 사마귀의 결과를 보면, 6사례 동물에서 사마귀 조직이 관찰된다. 여기서, 4사례 동물(01,02,03,04;4/6)의 사마귀 조직 상피 세포가 국소적으로 변성 및 괴사되었고, 소량의 공세포가 관찰되며; 2사례 동물(05,06;2/6)의 사마귀 조직 상피 세포 구조가 손상이 없고 국소적으로 공세포가 관찰된다.

도 9의 D에 도시된 바와 같이, 사마귀의 표피 세포가 과다각화되고, 표피 아래에 편평상피가 관찰되며, 국소 상피 세포가 변성 및 괴사되고 국소적으로 소량의 공세포가 관찰된다.

상기 연구 결과에 따르면, 클로로퀸이 HPV에 의해 유발된 사마귀에 대해 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 효과가 있고, 클로로퀸의 함량이 높을 수록 HPV에 감염된 공세포가 감소된다. 클로로퀸 겔 그룹(D그룹)의 경우, 감염된 세포를 분명하게 제거하지만, 조직의 국소적 변성 및 괴사를 유발할 수 있다. 순수한 클로로퀸 겔과 비교하면, 클로로퀸 키토산 겔은 감염 세포를 감소시키는 동시에 피부를 보호하는 효과가 있다.

실시예9 다양한 질 내 병원성 미생물에 대한 사멸 및 억제 기능

실시예 6의 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔 그룹(B그룹 : 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔, 인산 클로로퀸과 키토산의 질량비는 3 : 1)에 대해 체외 항균 활성 검사를 진행한다. 20g의 겔 제품을 100mL의 pH 7.0완충 용액(음성 대조군에는 시험약물을 첨가하지 않음)에 첨가하여 충분히 용해시킨다. 시험약물이 첨가된 pH 7.0완충 용액을 각각 1mL, 0.5mL, 0.25mL, 0.125mL취해 박테리아에 대응하는 배양배지에 첨가하여 평판 배양한다. 슈도모나스 아에루기 노사, 칸디다 알비칸스, 에스 케리 키아 콜라이, 황색포도상 구균을 해동 및 희석하며, 박테리아 농도가 100 cfu/mL일 때, 접종 루프에 각 배양배지를 접종하여 5~7일간 배양 후 관찰을 시작한다.

체외 항균 활성 검사 결과에 따르면, 서로 다른 농도의 키토산 클로로퀸 나노스피어 겔이 슈도모나스 아에루기 노사, 칸디다 알비칸스, 에스 케리 키아 콜라이, 황색포도상 구균에 대해 모두 생장을 억제하고 농도가 높을 수록 억제 효과가 더욱 높다. 그중에서, 칸디다 알비칸스와 황색포도상 구균의 민감도가 더욱 높다.

상기 결과는 클로로퀸 키토산 나노스피어 겔이 다양한 박테리아에 대해 양호한 억제 효과가 있지만, 민감도에 차이가 있다는 것을 설명한다.

본 발명에서는 클로로퀸과 키토산을 함께 사용하였는데, 다양한 질 내 병원성 미생물에 대해 상승적으로 억제하는 효과를 갖는다. 본 발명의 약물은 황색 포도상 구균(SA), 슈도모나스 아에루기 노사(EC), 베타 용혈성 연쇄상 구균(ST), 칸디다 알비칸스(CA), 유레아플라즈마 유레아리티쿰(Uu), 질트리코모나스 및 박테로이데스 프라질리스, 단순형 헤르페스 바이러스2형(HSV-2) 등 다양한 질 내 병원성 미생물에 대해 사멸 또는 억제 효과가 있다. 또한, 본 발명의 약물은 병원체와 숙주인 질의 상피 세포 사이의 접착을 억제하고 칸디다 알비칸스 질염, 편모충 질염, 세균성 질염, 생식기 헤르페스 바이러스 등 다양한 외부 생식기 감염을 예방 및 치료한다.

실시예10 예비 임상 연구 결과

본 발명의 클로로퀸 키토산 나노스피어를 칸디다 감염으로 인한 질염을 가진 10 명의 여성에게 적용한 결과, 치료 기간에 부작용 및 거부 반응이 보고되지 않았고, 6 개월간의 추적 관찰 과정에서도 부작용 및 거부 반응이 발견되지 않았으며, 클로로퀸 키토산 나노스피어 치료군의 총유효율이 클로로퀸 치료군의 총유효율보다 30% 향상되었다.

본 발명을 HPV감염에 의해 유발된 30사례의 피부 사마귀의 치료에 적용하였는데, 2 ~ 3 주 동안의 치료를 거쳐 30명의 환자의 피부 사마귀가 부작용 없이 자연적으로 소실된 사실을 발견하였다.

본 발명의 클로로퀸 나노스피어는 바이러스성 질염, 첨규콘딜롬, 세균성 질염, 진균 감염성 질염 또는 편모충 질염 등 외부 생식기 감염 및 평면 사마귀, 비 생식기 부위의 HPV감염에 의한 다른 피부 사마귀에 대해 모두 뛰어난 치료 효과를 가진다.

본 발명의 상기 실시예는 본 발명을 명확하게 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 구현 방식에 대해 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 실시예를 기반으로 다양한 변경 또는 수정이 가능하다. 여기서는 본 발명의 모든 구현 방식을 나열할 필요가 없을 뿐만 아니라, 나열할 수도 없다. 본 발명의 취지 및 원리를 벗어나지 않는 범위 내에서 실시한 모든 수정, 균등한 대체 및 개선은 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.

Claims

수용성 나노스피어 담체 및 클로로퀸(chloroquine) 또는 클로로퀸 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항에 있어서,
상기 클로로퀸 나노스피어의 제조 방법은,
S1, 상기 수용성 나노스피어 담체를 용해시킨 후, 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 첨가하여 균일하게 혼합 교반하여 수성상으로 사용하는 단계 - 여기서 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노스피어 담체의 질량비는 1 : 3미만임 - ;
S2, 유상 기질에 유화제를 첨가하여 유상으로 사용하고, 수성상을 유상에 첨가하며, 수성상과 유상의 부피비는 1 : 1~6이고, 10000~20000r/min에서 10~30min유화하여 나노스피어 에멀젼을 얻는 단계; 및,
S3, 나노스피어 에멀젼에 침전제를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 2~8min정치시킨 후에 탈수, 고속 원심 세정, 건조를 거쳐 상기 클로로퀸 나노스피어를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체와 수용성 나노스피어 담체의 제조 시 질량비가 1 : 3~1 : 5인 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 클로로퀸 유도체는 하이드록시 클로로퀸, 인산 클로로퀸 또는 황산 클로로퀸로 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 수용성 나노스피어 담체는 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분 중의 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제조된 클로로퀸 나노스피어 중에서 클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체의 부하율이 3.0%~21.6%인 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제2항에 있어서,
유화제와 침전제의 부피비가 1~1.5 : 30~50인 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제2항에 있어서,
상기 유상 기질은 식물성 오일이고, 상기 침전제는 알칼리성 유기상인 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제8항에 있어서,
상기 알칼리성 유기상은 수산화 나트륨 n-프로판올 혼합 용액이고, 상기 알칼리성 유기상의 pH값은 8.5~10.0인 것을 특징으로 하는 클로로퀸 나노스피어.
제1항 또는 제2항의 클로로퀸 나노스피어가 항균 및/또는 항 바이러스 제품의 제조에서의 적용.
제1항 또는 제2항의 클로로퀸 나노스피어가 외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀를 예방 및 치료하기 위한 제품의 제조에서의 적용.
제11항에 있어서,
상기 외부 생식기 감염은 바이러스성 질염, 첨규콘딜롬, 세균성 질염, 진균 감염성 질염 또는 편모충 질염인 것을 특징으로 하는 적용.
제11항에 있어서,
상기 다른 피부 사마귀는 평면 사마귀, 비 생식기 부위 사마귀를 포함하는 것을 특징으로 하는 적용.
외부 생식기 감염 및/또는 다른 피부 사마귀를 예방 및 치료하기 위한 제품으로서,
클로로퀸 또는 클로로퀸 유도체를 포함하고, 또한 수용성 키토산, 수용성 카라기난 또는 수용성 전분 중의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
제14항에 있어서,
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 클로로퀸 나노스피어를 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
제15항에 있어서,
상기 클로로퀸 나노스피어가 제품 총중량의 1%~6%를 차지하는 것을 특징으로 하는 제품.
제14항 내지 제16항에 있어서,
상기 제품의 제형은 겔, 연고, 크림, 발포성 정제, 질 정제, 캡슐, 필름제제 또는 좌약인 것을 특징으로 하는 제품.