KR20200108427A - 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법 Download PDF

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필립 체임벌린
수잔나 스툴리니 쿠토
강 루
캐서린 스탬프
필립 제이. 쉐라트
줄리아 후이
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Abstract

샘플을 얻는 단계; SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 단계; 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계; SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 단계; SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하여 세레블론 개질 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하는 단계; 및 SALL4의 분해를 유도하지 않는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법.

Description

세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2018년 1월 12일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/617,112호 및 2018년 2월 16일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/710,401호의 우선권의 이점을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 본원에 전체적으로 참고로 포함된다.
서열목록
본원은 2019년 1월 8일 창작되고 크기가 57,330 바이트인, 텍스트 파일명 14247-269-228_SEQ_LISTING.txt로 본원과 함께 제출된 서열목록을 참고로 포함한다.
1. 분야
특정 실시형태에서, 기형발생성을 유도하는 감소된 위험을 갖는 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 추가로 본원에 제공된다.
2. 배경
각각 442 및 441개 아미노산 길이인 적어도 2개의 단백질 세레블론 (CRBN)의 동형체가 존재하고, CRBN은 식물로부터 인간으로 보존된다. 인간에서, CRBN 유전자는 상염색체 열성 비신드롬성 정신 지체 (ARNSMR)의 후보 유전자로 확인되었다. 문헌 [Higgins, J.J. et al., Neurology, 2004, 63:1927-1931] 참고. CRBN은 초기에 랫트 뇌에서 칼슘-활성화된 칼륨 채널 단백질 (SLO1)과 상호작용하는 RGS-함유 신규 단백질로 특징되어 졌고, 나중에 AMPK1 및 DDB1과 함께 망막에서 전압-개폐 클로라이드 채널 (CIC-2)과 상호작용하는 것으로 나타났다. 문헌 [Jo, S. et al., J.　Neurochem, 2005, 94:1212-1224; Hohberger B. et al., FEBS Lett, 2009, 583:633-637; Angers S. et al., Nature, 2006, 443:590-593] 참고. DDB1은 본래 손상된 DNA 결합 단백질 2 (DDB2)와 결합하는 뉴클레오타이드 절개 복구 단백질로 확인되었다. 그것의 결함 활성은 색소성 건피증 상보성 그룹 E (XPE)가 있는 환자에서 회복 결함을 야기한다. DDB1은 또한 표적 단백질의 유비퀴틴화 및 후속적인 프로테아솜 분해를 매개하는 수많은 별개의 DCX (DDB1-CUL4-X-박스) E3 유비퀴틴-단백질 리가제 복합체의 성분으로서 기능하는 것으로 보인다. CRBN은 또한 대뇌 피질의 질환에 대한 치료제 개발을 위한 표적으로 확인되었다. WO 2010/137547 A1 참고.
CRBN은 치료 화합물, 예컨대 탈리도마이드, 포말리도마이드, 및 레날리도마이드에 결합하는 주요 분자 표적으로서 확인되었다. 이들 약물은 CRBN을 표적으로 하고 유비퀴틴 리가제의 기질 특이성을 변경하여 특정 암 세포에서 임상 활성을 구동한다. 결합된 기질은 CRBN-CRL4 복합체에 의해 유비퀴틴화되어, 26S 프로테아좀에 의해 그것의 분해로 이어진다. CRBN 하류 기질의 확인 및 이들 기질과 CRBN의 상호작용을 이해하는 것은 효능 및/또는 독성의 분자 기전을 정의할 것이고 개선된 효능 및 독성 프로파일을 갖는 약물로 이어질 수있다.
3. 발명의 요약
일 양태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; 및 (b) 상기 화합물이 SALL4 단백질의 분해를 유도하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 것; 및 (f) SALL4의 분해를 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) SALL4 분해의 수준을 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 것; 및 (f) 기준 화합물과 비교하여 SALL4의 감소된 분해를 나타내는 (또는 유도하는) 화합물을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 SALL4의 분해를 유도하는 세레블론 개질 화합물이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드에 의한 SALL4 분해에 비교하여 감소된다.
또 다른 양태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것; (c) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것; (c) 기준 화합물과 비교하여 SALL4와 세레블론 사이의 감소된 상호작용을 초래하는 (또는 유도하는) 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 상호작용 (또는 결합) SALL4 및 세레블론을 유도하는 세레블론 개질 화합물이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드에 의한 SALL4 분해에 비교하여 감소된다.
일 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 탈리도마이드의 존재에서 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용에 비교하여 감소된다.
일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3)와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정된다.
또 다른 양태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것; (c) SALL4의 유비퀴틴화를 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것 샘플에서; (c) 기준 화합물과 비교하여 SALL4의 유비퀴틴화의 감소된 수준을 나타내는 (유도하는) 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은은 SALL4의 유비퀴틴화를 유도하는 세레블론 개질 화합물이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 일 특정한 실시형태에서, SALL4 유비퀴틴화는 탈리도마이드에 의한 SALL4 유비퀴틴화에 비교하여 감소된다.
본원에 제공된 다양한 방법 중 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 상기 암은 혈액학적 암이다. 다른 실시형태에서, 상기 암은 고형 암이다. 일부 실시형태에서, 상기 암은 다발성 골수종, 림프종 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 상기 암은 다발성 골수종이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 상기 암은 림프종이다. 여전히 또 다른 특정한 실시형태에서, 상기 암은 백혈병이다. 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이 아니다. 일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 비-기형발생 치료, 예를 들어 기준 화합물로의 치료에 비교하여 비-기형발생이거나 또는 감소된 기형발생성을 갖는 세레블론 개질 화합물로 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, 기형발생성은 탈리도마이드로 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 세레블론 상호작용을 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 세레블론 상호작용을 유도하는 세레블론 개질 화합물로 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 세레블론 상호작용은 탈리도마이드로 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 유비퀴틴화를 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 유비퀴틴화를 유도하는 세레블론 개질 화합물로 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 유비퀴틴화는 탈리도마이드로 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 분해를 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 분해를 유도하는 세레블론 개질 화합물로 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드로 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 양태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하고; 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
여전히 또 다른 양태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하고, 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
여전히 또 다른 양태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용이 기형발생성에 대한 잠재력을 나타내는, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것을 포함하는 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4와 세레블론 사이의 물리적 결합이다.
일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3)와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432 (서열번호: 11)와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정된다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1a는 특정 SALL4 아연 핑거 도메인 (a.a. 405-432)이 탈리도마이드-의존 방식에서 세레블론-CRL4에 의해 우세하게 유비퀴틴화된다는 것을 도시한다 (DMSO는 음성 대조군임). Ikaros 아연 핑거 도메인 (a.a. 140-168)의 유비퀴틴화가 양성 대조군으로 사용되었다.
도 1b는 세레블론-결합 Ikaros 및 ZFP91 아연 핑거와 함께 개별 SALL4 아연 핑거의 정렬을 도시한다. 주요 글리신의 위치가 강조되어 있다.
도 1c는 인간 및 토끼 SALL4 아연 핑거는 시험관내 세레블론-CRL4의 직접적인, 탈리도마이드-의존적 기질이고, 반면에 마우스 SALL4는 인식되지 않는다는 것을 도시한다. 패널 a는 박스된 아연 핑거 도메인을 갖는 SALL4A 단백질의 개략도이다. 글리신 데그론-함유 아연 핑거는 별표로 강조된다. 패널 b는 개별 MBP-태깅된 SALL4 아연 핑거가 탈리도마이드의 부재 (DMSO, 비히클 대조군) 또는 존재 (thal)에서 세레블론-CRL4에 의한 유비퀴틴화에 대해 시험되었다는 것을 도시한다. 유비퀴틴화 반응은 SDS-PAGE와 이어서 항-MBP 웨스턴 블랏에 의해 분리되었다. SALL4 아연 핑거 2 (ZF2, a.a. 410-432)는 SALL4 아연 핑거 4 (ZF4, a.a. 594-616)의 약한 유비퀴틴화로, 탈리도마이드-의존 방식에서 세레블론-CRL4에 의해 효율적으로 유비퀴틴화되었다. 패널 c는 SALL4 아연 핑거의 유비퀴틴화는 베타-헤어핀 세레블론 결합 모티프에서 주요 글리신에 의존적이다는 것을 도시한다. MBP-태깅된 WT 및 G416A SALL4 아연 핑거 2가 항-MBP 항체로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅에 의해 분리 전에 유비퀴틴화에 대해 시험되었다. 주요 글리신의 돌연변이는 유비퀴틴화를 상당히 감소시켜, 이 SALL4 아연 핑거가 확립된 글리신-함유 베타-헤어핀 모티프를 사용하여 세레블론에 결합한다는 것을 나타낸다. "-"는 탈리도마이드를 포함하지만 ATP를 결하는 완전한 반응을 나타낸다. 패널 d는 토끼 SALL4는 토끼 세레블론에 의해 표적화될 수 있고, 반면에 마우스 SALL4는 마우스 또는 인간 세레블론에 의해 표적화될 수 없다는 것을 도시한다. 인간 SALL4 아연 핑거 2 또는 이종상동성 토끼 및 마우스 아연 핑거가 표시된 바와 같이 인간, 토끼, 또는 마우스 세레블론에 의한 시험관내 유비퀴틴화에 대해 시험되었다. 토끼 세레블론에 의한 토끼 아연 핑거 2 (a.a. 362-389) 유비퀴틴화는 인간 SALL4 유비퀴틴화가 인간 세레블론에 의한 것에 유사한 효율을 갖는다. 그에 반해서, 마우스 SALL4 아연 핑거 2 (a.a. 415-437)는 마우스 또는 인간 세레블론에 의해 효율적으로 유비퀴틴화되지 않았다. "-"는 탈리도마이드를 포함하지만 ATP를 결하는 완전한 반응을 나타낸다. 패널 b-d에서의 결과는 각각 3개의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
도 1d는 SALL4 아연 핑거 2 (a.a. 410-432)에서 G416A 및 SALL4 아연 핑거 4 (a.a. 594-616)에서 G600A의 돌연변이가 Ikaros 및 ZFP91 세레블론-결합 아연 핑거에서 유사한 돌연변이에 유사하게, 각각의 아연 핑거의 유비퀴틴화를 상당히 감소시켜, SALL4 아연 핑거가 확립된 글리신-함유 모티프를 사용하여 세레블론에 결합한다는 것을 나타내는 것을 도시한다. MBP-태깅된 야생형 및 글리신 돌연변이체 SALL4 아연 핑거가 개별적으로 정제되고 항-MBP 항체로 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅에 의한 분리 전 정제된 세레블론-CRL4에 의한 시험관내 유비퀴틴화에 대해 시험되었다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
도 1e는 종 간에 아미노산 차이를 보이는 인간, 토끼 및 마우스 세레블론의 정렬을 도시한다. E377 및 V388은 인간에서 결합하는 기질에 대해 중요하고 마우스에서 결합하는 기질에 대해 분열성인 것으로 밝혀졌고, 강조되어 있다. 토끼는 이들 위치에서 인간 아미노산을 갖는다. 다수의 서열 정렬은 CLUSTAL O (1.2.4)를 사용하여 생성되었다.
도 1f는 종 간에 아미노산 차이를 보이는 인간, 토끼 및 마우스 SALL4의 정렬을 도시한다. 세레블론-CRL4 + 탈리도마이드에 의해 강하게 유비퀴틴화된 인간 아연 핑거 2가 강조되어 있다. 세레블론 결합에 대한 주요 글리신 잔기가 표시되어 있다. 다수의 서열 정렬은 CLUSTAL O (1.2.4)를 사용하여 생성되었다.
도 1g는 인간과 아미노산 서열 차이가 강조된, SALL4 아연 핑거 2 골격 (좌측), 및 탈리도마이드의 존재에서 결합된 SALL4 아연 핑거를 갖는 세레블론 (우측)의 구조 모델을 도시한다. SALL4 아연 핑거 2는 토끼에서 100% 보존되었지만, 마우스에서는 5개 아미노산 차이를 갖는다. 토끼 세레블론은 기질 결합 부위를 둘러싸는 영역에서 아미노산 차이를 보이지 않았고, 반면에 마우스 세레블론은 탈리도마이드-결합 포켓을 둘러싸는 2개의 아미노산 차이 (E377V 및 V388I)를 함유하고 세레블론 신기질 결합을 방해한다.
도 1h는 마우스 SALL4 아연 핑거가 인간 또는 마우스 세레블론에 의해 효율적으로 유비퀴틴화되지 않는다는 것을 도시한다. 패널 a는 박스된 아연 핑거 도메인을 갖는 마우스 SALL4A 단백질의 개략도를 도시한다. 글리신 데그론-함유 아연 핑거는 별표로 강조된다. 패널 b는 개별 MBP-태깅된 SALL4 아연 핑거가 탈리도마이드의 부재 (DMSO, 비히클 대조군) 또는 존재 (thal)에서 마우스 세레블론 (좌측 패널) 또는 인간 세레블론 (우측 패널)에 의한 유비퀴틴화에 대해 시험되었다는 것을 도시한다. 유비퀴틴화 반응은 SDS-PAGE와 이어서 항-MBP 웨스턴 블랏에 의해 분리되었다. 인간, 토끼, 및 마우스 간에 100% 보존된 ZFP91 세레블론-결합 아연 핑거 (a.a. 395-423) 및 인간 SALL4 아연 핑거 2 ( ZF2, a.a. 410-432)가 비교하기 위해 도시되어 있고, 둘 모두는 탈리도마이드-의존 방식에서 인간 세레블론에 의해 효율적으로 유비퀴틴화된다. 패널 c는 인간, 토끼, 및 마우스 간에 100% 보존된 ZFP91 세레블론-결합 아연 핑거 (a.a. 395-423)가 인간, 토끼, 및 마우스 세레블론에 의한 유비퀴틴화에 대해 시험되었다는 것을 도시한다. ZFP91은 마우스 세레블론에 의해서는 아니지만, 인간 및 토끼 세레블론에 의해 효율적으로 유비퀴틴화될 수 있다. 이것은 ZFP91이 야생형 마우스에서는 아니지만, 인간, 토끼, 및 인간화된 세레블론 마우스에서 분해될 것이다는 것을 나타낸다. 패널 b 및 c에서의 결과는 3개의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
도 2는 세포에서 SALL4 분해가 화합물- 및 세레블론-의존적이고, G416에서 A416으로의 돌연변이가 이 SALL4의 분해를 방해한다는 것을 도시한다.
도 3은 세포에서 세레블론에 대한 SALL4 결합이 공-면역침강에 의해 실증된 바와 같이, 화합물-의존적이고 G416의 돌연변이에 의해 방해된다는 것을 도시한다.
도 4는 짧은 또는 긴 노출 (각각 S.E 및 L.E.) 후 다양한 암 세포주에서 내인성 SALL4의 화합물-의존적 분해를 도시한다.
도 5는 SALL4 IHC 염색에 의해 나타낸 바와 같이, 탈리도마이드가 토끼 고환에서 SALL4 수준에서의 용량 의존적 감소를 유발한다는 것을 도시한다.
도 6은 SALL4 IHC 염색에 의해 나타낸 바와 같이, 탈리도마이드가 토끼 배아에서 SALL4 수준의 하향조절을 유발한다는 것을 도시한다. 임신한 암컷 토끼는 180 mg/kg 탈리도마이드로 처리되었고 수정 12일 후 배아 검사되었다. 배아는 고정되고 SALL4 (최상부 패널) 및 비멘틴 C (최하부 패널)로 염색되고 면역조직화학에 의해 검사되었다. 모든 조직은 헤마톡실린 블루로 대조염색되었다. 이미지는 각각의 그룹에 대해 n = 10개 배아의 대표적인 것이다.
도 7a는 iPS 세포에서 SALL4 단백질 수준의 감소가 탈리도마이드 및 셀레론에 의존적이다는 것을 도시한다. CRBN 야생형 (WT) 및 CRBN 넉아웃 (-/-) 인간 iPS 세포의 전체 세포 용해물의 면역블랏 분석이 수행되었다. 세포는 지시된 농도에서 16시간 동안 DMSO 비히클 대조군 (-) 또는 탈리도마이드 (Thal)로 처리되었다 (n = 4, 생물학적 복제).
도 7b는 iPS 세포에서 SALL4 단백질 수준에서의 탈리도마이드-의존적 감소가 네딜화 및 프로테아솜 둘 모두에 의존성이다는 것을 도시한다. 6시간 동안 1 μM MLN4924 또는 10 μM MG132의 존재 또는 부재에서 DMSO (-) 또는 Thal (+)로 처리된 인간 iPS 세포의 전체 세포 용해물의 면역블랏 분석이 수행되었다 (n = 2, 생물학적 복제).
도 7c는 GST-CRBN 및 SALL4 변이체를 안정적으로 발현하는 lenti-X-293 HEK 세포의 전체 세포 용해물의 면역블랏 분석을 도시한다. 세포는 16시간 동안 표시된 바와 같이 40 μM 탈리도마이드 (+) 또는 DMSO 비히클 대조군 (-)으로 처리되었다 (n = 2, 생물학적 복제).
도 7d는 GST-CRBN 및 SALL4 변이체를 안정적으로 발현하는 lenti-X-293 HEK 세포의 항 -HA 면역침전물 (최상부 패널) 및 전체 세포 용해물 (최하부 패널)의 면역블랏 분석을 도시한다. 모든 세포는 8시간 동안 표시된 바와 같이 1 μM MLN4924, 및 40 μM 탈리도마이드 (+) 또는 DMSO 비히클 대조군 (-) 중 어느 하나로 처리되었다 (n = 2 생물학적 복제).
도 7e는 인간 iPS 세포에서 SALL4 mRNA 수준의 qRT-PCR 분석이 SALL4 단백질 수준에서의 감소가 전사 하향조절에 기인하기 않는다는 것을 입증하는 것을 도시한다. 정량적 RT-PCR 분석은 16시간 동안 DMSO 또는 20 μM 탈리도마이드 (THA)로 처리된 인간 iPS 세포에 대해 수행되었다. SALL4 및 POU5F1 (OCT4)의 상대 mRNA 수준은 GAPDH로 정규화되었다 (n = 2, 생물학적 복제).
도 8은 야생형 마우스 또는 인간 세레블론을 발현하는 마우스에서가 아닌, 토끼에서 탈리도마이드 처리시 생체내 SALL4 단백질 수준 감소를 도시한다. SALL4 및 ZFP91 단백질 수준은 토끼, 야생형 마우스, 및 인간화된 세레블론 마우스 고환에서 면역조직화학에 의해 검사되었다. 좌측 패널은 150mg/kg 탈리도마이드로 토끼의 처리는 ZFP91과 SALL4 양자의 분해를 야기하였다는 것을 도시한다. 중간 패널은 1000 mg/kg 탈리도마이드로 야생형 마우스의 처리는 ZFP91 또는 SALL4의 현저한 분해를 유발하지 않았다는 것을 도시한다. 우측 패널은 1000 mg/kg 탈리도마이드로 huCRBN 마우스의 처리는 SALL4가 아닌 ZFP91의 분해를 유발했다는 것을 도시한다. HuCRBN 마우스는 7일 동안 처리되었고 고환이 수집되고 면역조직화학에 의해 검사되었다 (종당 처리 그룹당 n = 3마리 동물).
도 9는 처리되지 않은 및 탈리도마이드-처리된 토끼 배아의 지아에서 SALL4 mRNA 수준이 유사하였다는 것을 도시한다. 토끼 배아 지아에서 원위치 혼성화 (ISH)에 의해 SALL4 mRNA 전사체가 시각화되었다.
도 10은 인간화된 세레블론 녹-인 마우스의 개략도를 도시한다.
도 11은 탈리도마이드로 처리된 huCRBN 마우스에서 사지 결함이 관찰되지 않았다는 것을 도시한다. 비히클 처리된 마우스로부터의 골격의 사진이 좌측에 도시되어 있고, 1000 mg/kg 탈리도마이드로 처리된 huCRBN 형질전환 마우스가 우측에 도시되어 있다. 태아는 뼈 시각화를 위해 알리자린 레드 S로 준비되었다.
5. 발명의 상세한 설명
본원에 제공된 방법은, 부분적으로, SALL4가 세레블론-CRL4 유비퀴틴화의 직접적이고 화합물-의존적 기질이다는 발견에 기초한다. 예를 들어, 하기 섹션 6에서의 실시예에서 나타낸 바와 같이, SALL4는 발달 동안 토끼 고환 및 토끼 배아에서 탈리도마이드 처리에 의해 하향조절된다. 본원에 제시된 데이터는 SALL4 하향조절이 탈리도마이드와 같은 세레블론 개질 화합물로의 치료에 의해 유도된 기형발생 효과의 주요 원인임을 나타낸다. 따라서, SALL4 수준을 사용하여 세레브론 변형 화합물의 독성을 결정할 수 있고, 그것에 의해 생식 독성 및/또는 배아병증의 감소된 위험을 갖는 화합물의 스크리닝 및 선택을 허용한다.
5.1 정의
용어들 "세레블론" 또는 "CRBN" 및 유사한 용어들은 인간 CRBN 단백질 (예를 들어, 인간 CRBN 동형체 1, 유전자은행 기탁 번호 NP_057386; 또는 인간 CRBN 동형체 2, 유전자은행 기탁 번호 NP_001166953, 이들 각각은 본원에 전체적으로 참고로 포함됨)과 같은, 임의의 CRBN의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 ("폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용됨) 및 이의 SNP 변이체를 포함한 관련된 폴리펩타이드를 지칭한다. 관련된 CRBN 폴리펩타이드는 대립유전자 변이체 (예를 들어, SNP 변이체), 스플라이스 변이체, 단편, 유도체, 치환 변이체, 결실 변이체, 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 동족체를 포함하며, 특정 실시형태에서, 이것은 CRBN 활성을 보유하고/하거나 항-CRBN 면역 반응을 생성하기에 충분하다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어들 "화합물" 및 "처리 화합물"은 상호교환적으로 사용된다. 화합물의 비-제한적인 예는 하기 섹션 5.4에 개시된 것을 포함한다. 본 개시내용의 예시적인 화합물 또는 처리 화합물은 세레블론 개질 화합물이다.
용어 "세레블론 개질 화합물" (또는 "CRBN 개질제")은 CRBN E3 유비퀴틴-리가제 복합체를 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "세레블론 개질 화합물"은 CRBN에 직접적으로 결합하거나, CRBN 단백질의 구조적 변화를 유도하거나, 또는 CRBN 단백질 표면의 변화를 초래할 수 있다. 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 CRBN E3 유비퀴틴-리가제 복합체에서 다른 서브유닛에 직접적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "면역조절 화합물" 또는 "면역조절 약물"은 일반적으로 어떤 방식으로 면역 반응을 변경할 수 있는 분자 또는 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "암"은, 비제한적으로, 고형 암 및 혈액 매개 암을 포함한다. 용어 "암"은 비제한적으로, 방광, 뼈, 혈액, 뇌, 유방, 자궁경부, 가슴, 결장, 엔트로메트리움, 식도, 눈, 헤드, 신장, 간, 림프절, 폐, 입, 목, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 피부, 위, 고환, 목, 및 자궁의 암을 포함한, 조직 또는 기관의 질환을 지칭한다. 특정 암은, 여기에 제한되지 않는 않지만, 진전된 악성종양, 아밀로이드증, 신경교세포종, 수막종, 혈관주위세포종, 다중 뇌 전이, 다형상 교모세포종, 교모세포종, 뇌간 신경아교종, 불량한 예후 악성 뇌종양, 악성 신경아교종, 재발성 악성 신경아교종, 역형성 별아교세포종, 역형성 희소돌기아교세포종, 신경내분비 종양, 직장 선암종, 3 및 4기 결장직장암을 포함한 결장직장암, 절제불가능 결장직장 암종, 전이성 간세포 암종, 카포시 육종, 핵형 급성 골수모세포 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 피부 B-세포 림프종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 저등급 여포성 림프종, 악성 흑색종, 악성 중피종, 악성 늑막 삼출 중피종 증후군, 복막 암종, 유두상 장액 암종, 부인과 육종, 연조직 육종, 경피증, 피부 혈관염, 랑게르한스 세포 조직구증, 평활근육종, 섬유이형성증 골화성 진행성, 호르몬 불응성 전립선암, 절제된 고위험 연조직 육종, 간세포 암종, 발덴스트롬의 거대글로불린혈증, 무증상 골수종, 무통성 골수종, 나팔관 암, 안드로겐 비의존성 전립선암, 안드로겐 의존성 IV기 비-전이성 전립선암, 호르몬-비민감성 전립선암, 화학요법-비민감성 전립선암, 유두상 갑상선 암종, 여포성 갑상선 암종, 수질 갑상선 암종, 및 평활근종을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "혈액 매개 암" 또는 "혈액성 암"은 신체의 혈액-형성 및 면역계-골수 및 림프 조직의 암을 지칭한다. 이러한 암은 백혈병, 림프종 (비-호지킨 림프종), 호지킨 질환 (또한 소위 호지킨 림프종) 및 골수종을 포함한다. 일 실시형태에서, 골수종은 다발성 골수종이다. 일부 실시형태에서, 백혈병은, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병, 골수이형성증, 골수증식성 장애, 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수이형성 증후군 (MDS), 인간 림프친화성 바이러스-1형 (HTLV-1) 백혈병, 비만세포증, 또는 B-세포 급성 림프아구성 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 림프종은, 예를 들어, 미만성 큰 B-세포 림프종 (DLBCL), B-세포 면역모세포성 림프종, 작은 비-절단된 세포 림프종, 인간 림프친화성 바이러스-1형 (HTLV-1) 백혈병/림프종, 성인 T-세포 림프종, 주변 T-세포 림프종 (PTCL), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), AIDS-관련된 림프종, 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, T-세포/조직구 풍부한 큰 B-세포 림프종, 형질전환된 림프종, 원발성 종격동 (흉선) 큰 B-세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 리히터의 형질전환, 결절 변연부 림프종, 또는 ALK-양성 큰 B-세포 림프종이다. 일 실시형태에서, 혈액학적 암은, 예를 들어, DLBCL을 포함한 무통성 림프종, 여포성 림프종, 또는 변연부 림프종이다. 림프종은 새로 진단되거나, 재발하거나, 종래의 요법에 대해 불응성 및/또는 내성일 수 있다.
용어 "백혈병"은 혈액-형성 조직의 악성 신생물을 지칭한다. 백혈병은, 비제한적으로, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 및 급성 골수모세포 백혈병을 포함한다. 백혈병은 새로 진단되거나, 재발하거나, 종래의 요법에 대해 불응성 및/또는 내성일 수 있다.
용어 "골수이형성 증후군"은 혈액의 세포 구성요소 (적혈구, 백혈구 (림프구 이외의 것) 및 혈소판 (또는 그것의 선조 세포, 거핵구)) 중 하나 이상의 생산에서의 비정상을 특징으로 하는 혈액학적 병태를 지칭하고, 하기 장애를 포함한다: 불응성 빈혈 (RA); 관상 철아구가 있는 RA (RARS); 과잉의 모세포가 있는 RA (RAEB); 다계열 이형성증이 있는 불응성 혈구감소증 (RCMD), 단계열 이형성증이 있는 불응성 혈구감소증 (RCUD); 분류불능 골수이형성 증후군 (MDS-U), 단리된 del(5q) 염색체 비정상과 연관된 골수이형성 증후군, 요법-관련된 골수성 신생물 및 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML).
본원에서 사용된 바와 같은, "전골수구성 백혈병" 또는 "급성 전골수구성 백혈병"은 골수 세포주에서 성숙한 혈구의 결핍과 전골수구로 불리는 과잉의 미성숙한 세포가 있는 골수의 악성종양을 지칭한다. 이것은 일반적으로 염색체 15 및 17의 영역의 교환에 의해 마킹된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "급성 림프아구성 백혈병"으로도 알려져 있는, "급성 림프구성 백혈병 (ALL)"은 초기 비과립 백혈구, 또는 림프구의 비정상 성장 및 발달에 의해 야기된 악성 질환을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, "T- 세포 백혈병"은 T 림프구 또는 T 세포로 불리는 림프양 시스템의 특정 세포가 악성인 질환을 지칭한다. T 세포는 바이러스-감염된 세포, 외부 세포, 및 암 세포를 정상적으로 공격할 수 있고 면역 반응을 조절하는 물질을 생산할 수 있는 백혈구이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어들 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 환자가 명시된 질환 또는 장애을 앓고 있는 동안 발생하고, 질환 또는 장애의 중증도, 질환 또는 장애의 증상을 감소시키거나, 또는 질환 또는 장애의 진행을 지연시키거나 늦추는 작용을 지칭한다. 일 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 화합물의 "치료 유효량"은 치료에서 치료적 이점 또는 질환 또는 장애의 관리를 제공하거나, 또는 질환 또는 장애의 존재와 연관된 하나 이상의 증상을 지연하거나 최소화하는데 충분한 양이다. 화합물의 치료 유효량은 치료에서 치료적 이점 또는 질환 또는 장애의 관리를 제공하는, 치료제의 단독으로 또는 다른 요법과 조합한 양을 의미한다. 용어 "치료 유효량"은 전체적인 요법을 개선하거나, 질환 또는 장애의 증상 또는 원인을 감소 또는 회피하거나, 또는 다른 치료제의 치료적 효능을 향상시키는 양을 포괄할 수 있다. 본 용어는 또한 생물학적 분자 (예를 들어, 단백질, 효소, RNA, 또는 DNA), 세포, 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의료적 반응을 유도하기에 충분한 화합물의 양을 지칭하며, 이것은 연구자, 수의사, 의사, 또는 임상의에 의해 모색되어 진다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조절하다"는 활성 또는 기능을 향상시키거나 또는 축소시키는 것과 같이 분자의 활성 또는 생물학적 기능을 조절하는 것을 지칭한다.
본원에서 교환가능하게 사용된 바와 같이, 용어들 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합을 통해 연결된, 연속적 배열에서 3개 또는 그 초과 아미노산의 폴리머를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩타이드, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 또한 펩타이드를 지칭할 수 있다. 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산은 자연적으로 유래될 수 있거나, 또는 합성될 수 있다. 폴리펩타이드는 생물학적 샘플로부터 정제될 수 있다. 폴리펩타이드, 단백질, 또는 펩타이드는 또한 개질된 폴리펩타이드, 단백질, 및 펩타이드, 예를 들어, 글리코폴리펩타이드, 당단백질, 또는 글리코펩타이드; 또는 리포폴리펩타이드, 지질단백질, 또는 리포펩타이드를 포괄한다.
용어 "수준"은 분자의 양, 축적 또는 속도를 지칭한다. 수준은 예를 들어 유전자에 의해 인코딩된 메신저 RNA (mRNA)의 합성의 양 또는 속도, 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질의 합성의 양 또는 속도, 또는 세포 또는 생체액에 축적된 생물학적 분자의 합성의 양 또는 속도에 의해 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "수준"은 정상상태 또는 비-정상상태 조건 하에서 결정된 샘플 중 분자의 절대량 또는 분자의 상대량을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어들 "결정", "측정", "평가", "판단" 및 "검증"은 일반적으로 임의의 측정 형태를 지칭하고, 요소가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 이들 용어들은 정량적 및/또는 정성적 결정을 포함한다. 판단은 상대적이거나 절대적일 수 있다. "존재를 결정하는 것"은 그것이 존재하는지 부재하는지 여부를 결정하는 것뿐만 아니라 존재하는 것의 양을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
용어들 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 2개의 자연 발생 핵산의 것에 유사한 서열 특이적 방식에서 자연 발생 핵산과 혼성화할 수 있고, 예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기 상호작용에 참여할 수 있는, 합성으로 생산된 화합물로 구성된 임의의 길이의 폴리머를 기술하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "염기들" (또는 "염기")은 "뉴클레오타이드들" (또는 "뉴클레오타이드"), 즉, 폴리뉴클레오타이드의 단량체 서브유닛과 동의어이다. 용어들 "뉴클레오사이드" 및 "뉴클레오타이드"는 알려진 퓨린 및 피리미딘 염기뿐만 아니라 개질된 다른 복소환형 염기를 함유하는 이들 모이어티를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 변형은 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 알킬화된 리보오스 또는 다른 헤테로사이클을 포함한다. 또한, 용어들 "뉴클레오사이드" 및 "뉴클레오타이드"는 종래의 리보오스 및 데옥시리보스 당뿐만 아니라, 또한 다른 당류를 함유하는 이들 모이어티를 포함한다. 개질된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 또한 , 예를 들어, 하이드록실기 중 하나 이상이 할로겐 원자 또는 지방족 기로 대체되거나, 또는 에테르, 아민, 등으로 작용화된 당 모이어티에 대한 개질을 포함한다. "유사체"는 문헌에서 유사한 구조또는 다른 유사한 용어를 갖는, 모방체, 유도체인 것으로 인식되는 구조적 특징을 갖는 분자를 지칭하고, 예를 들어, 비-천연 뉴클레오타이드를 포함한 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 모방체 예컨대 2'-개질된 뉴클레오사이드, 펩타이드 핵산, 올리고머성 뉴클레오사이드 포스포네이트, 및 첨가된 치환체 기, 예컨대 보호기 또는 연결 모이어티를 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "결합하다"는 직접 또는 간접적 부착을 나타낸다. 용어 "결합하다"는 특정 실시형태에서 두 분자 사이의 직접적인 물리적 상호작용을 의미한다. 화학 구조의 맥락에서, "결합하다"는 (예를 들어, 분자의 연결 기 또는 임의의 다른 개재하는 부분을 통해) 2개 모이어티를 직접적으로 연결하거나 또는2개 모이어티를 간접적으로 연결하는 화학 결합의 존재를 지칭할 수 있다. 본 화학 결합은 공유결합, 이온 결합, 배위 착물, 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 또는 소수성 적층일 수 있거나, 또는 다수 유형의 화학 결합의 특성을 나타낼 수 있다. 특정 사례에서, "결합하다"는 부착이 직접적인 실시형태 및 부착이 간접적인 실시형태를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은, "세레블론에 결합하다"는 세레블론에 직접적으로 결합하는 것 및 CRBN E3 유비퀴틴-리가제 복합체에서 다른 서브유닛에 결합하는 것 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은, 꼭 그렇지는 않지만, 전형적으로 유체 형태로 하나 이상의 관심 있는 구성요소를 함유하는 물질 또는 물질의 혼합물에 관한 것이다. 샘플은 생체내 또는 원위치에서 수득 또는 수집된, 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플을 포함한, 생물학적 대상체로부터 수득된 샘플을 지칭하는 "생물학적 샘플"일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 이환 세포 또는 조직, 예를 들어 전암성 또는 암 세포 또는 조직을 함유하는 생물학적 대상체의 영역으로부터의 샘플을 포함한다. 이러한 샘플은, 여기에 제한되지는 않지만, 포유동물로부터 단리된 기관, 조직, 및 세포일 수 있다. 다른 예시적인 샘플은, 여기에 제한되지는 않지만, 세포 용해물, 세포 배양, 세포주, 단리된 단백질 (복합체에서의 것을 포함함), 합성 단백질 (복합체에서의 것을 포함함), 세포 추출물, 조작된 세포 (예를 들어, 유전자 개질된 또는 형질감염된 세포), 박테리아 세포 (예를 들어 E. 콜리 세포), 곤충 세포 (예를 들어, 스포도프테라 프루지페르다 세포), 태아 세포, 태아 조직, 제브라피쉬, 조직, 경구 조직, 위장 조직, 장기, 소기관, 생체액, 혈액 샘플, 소변 샘플, 피부 샘플, 골수 샘플, 순환 종양 세포, 종양 세포, 및 기타 동종의 것, 그리고 이들의 하나 이상의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 용어가 지칭하는 화합물의 무독성 산 및 염기 부가 염을 포괄한다. 허용가능한 무독성 산 부가 염은 당업계에서 공지된 유기 및 무기 산으로부터 유래된 것들을 포함하고, 이것은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 메탄설폰산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 석신산, 시트르산, 말산, 말레산, 소르브산, 아코니트산, 살리실산, 프탈산, 색전성 산, 에난틱산, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 본질상 산성인 화합물은 다양한 약제학적으로 허용가능한 염기와 염을 형성할 수 있다. 이러한 산성 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염을 제조하기 위해 사용될 수 있는 염기는 무독성 염기 부가 염, 즉, 약리적으로 허용가능한 양이온을 함유하는 염 예컨대, 비제한적으로, 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속 염 (특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 또는 칼륨 염)을 형성하는 것들이다. 적합한 유기 염기는, 여기에 제한되지는 않지만, N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루마인 (N-메틸글루카민), 라이신, 및 프로카인을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "용매화물"은 비-공유 분자간 힘에 의해 결합된 용매의 화학양론적 또는 비-화학양론적 양을 추가로 포함하는 본원에 제공된 화합물 또는 이의 염을 의미한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "공-결정"은 결정 격자에 1 초과 화합물을 함유하는 결정형을 의미한다. 공-결정은 비-이온성 상호작용을 통해 결정 격자에서 함께 결합된 2 또는 그 초과 비-휘발성 화합물의 결정성 분자 복합체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은, 공-결정은 (본원에서 카운터-분자(들)로 언급된) 치료 화합물 및 하나 이상의 추가의 비-휘발성 화합물(들)을 함유하는 결정성 분자 복합체인 약제학적 공-결정을 포함한다. 약제학적 공-결정에서 카운터-분자는 전형적으로 무독성의 약제학적으로 허용가능한 분자, 예컨대, 예를 들어, 식품 첨가물, 보존제, 약제학적 부형제, 또는 다른 활성 약제학적 성분 (API)이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 공-결정은 API의 화학 구조 완전성을 손상함이 없이 의약품의 특정한 물리화학 특성 (예를 들어, 용해도, 용해 속도, 생체이용률, 및/또는 안정성)을 향상시킨다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., MRS Bulletin 2006, 31,875-879]; 문헌 [Trask, Mol . Pharmaceutics 2007, 4(3):301-309]; 문헌 [Schultheiss & Newman, Crystal Growth & Design 2009, 9(6):2950-2967]; 문헌 [Shan & Zaworotko, Drug Discovery Today 2008, 13(9/10):440-446]; 및 문헌 [Vishweshwar et al., J. Pharm . Sci . 2006, 95(3):499-516] 참고.
본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체"는 본 발명의 모든 거울상이성질체로/입체이성질체적으로 순수한 및 거울상이성질체로/입체이성질체적으로 풍부한 화합물을 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체적으로 순수한"은 화합물 중 하나의 입체이성질체를 포함하고 그 화합물의 다른 입체이성질체가 실질적으로 없는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물은 화합물의 반대편 거울상이성질체가 실질적으로 없을 것이다. 2개의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물은 화합물의 다른 부분입체이성질체가 실질적으로 없을 것이다. 전형적인 입체이성질체적으로 순수한 화합물은 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 80중량 % 초과와 화합물의 다른 입체이성질체의 약 20중량 % 미만, 더 바람직하게는 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 90중량 % 초과와 화합물의 다른 입체이성질체의 약 10중량 % 미만, 더욱 더 바람직하게는 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 95중량 % 초과와 화합물의 다른 입체이성질체의 약 5중량 % 미만, 그리고 가장 바람직하게는 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 97중량 % 초과와 화합물의 다른 입체이성질체의 약 3중량 % 미만을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체적으로 풍부한"은 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 60중량 % 초과, 바람직하게는 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 70중량 % 초과, 더 바람직하게는 화합물의 하나의 입체이성질체의 약 80중량 % 초과를 포함하는 조성물을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "거울상이성질체로 순수한"은 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물을 의미한다. 유사하게, 용어 "입체이성질체적으로 풍부한"은 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 입체이성질체적으로 풍부한 조성물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 용어 "전구약물"은 생물학적 조건 (시험관내 또는 생체내) 하에서 가수분해하거나, 산화하거나, 또는 그렇지 않으면 반응하여 화합물을 제공할 수 있는 화합물의 유도체를 의미한다. 전구약물의 예는, 여기에 제한되지는 않지만, 생체가수분해성 모이어티 예컨대 생체가수분해성 아미드, 생체가수분해성 에스테르, 생체가수분해성 카바메이트, 생체가수분해성 카보네이트, 생체가수분해성 우레이드, 및 생체가수분해성 포스페이트 유사체를 포함하는 화합물을 포함한다. 전구약물의 다른 예는 -NO, -NO2, -ONO, 또는 -ONO2 모이어티를 포함하는 화합물을 포함한다. 전구약물은 전형적으로 잘-알려진 방법, 예컨대 문헌 [Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff, ed., 5th ed. 1995)], 및 문헌 [Design of Prodrugs (H. Bundgaard, ed., Elselvier, New York 1985)]에 기재된 것들을 사용하여 제조될 수 있다.
화합물은 원자 중 하나 이상에서 비천연 비의 원자 동위원소를 함유할 수 있다는 것이 또한 인식되어야 한다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예컨대 예를 들어 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I), 황-35 (35S), 또는 탄소-14 (14C)로 방사선표지될 수 있거나, 또는 예컨대 중수소 (2H), 탄소-13 (13C), 또는 질소-15 (15N)가 동위원소로 풍부할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, "동위이성질체"는 동위원소로 풍부한 화합물이다. 용어 "동위원소로 풍부한"은 그 원자의 천연 동위원소 조성 이외의 동위원소 조성을 갖는 원자를 지칭한다. "동위원소로 풍부한"은 또한 그 원자의 천연 동위원소 조성 이외의 동위원소 조성을 갖는 적어도 하나의 원자를 함유하는 화합물을 지칭할 수 있다. 용어 "동위원소 조성"은 주어진 원자에 대해 존재하는 각각의 동위원소의 양을 지칭한다. 방사선표지되고 동위원소로 풍부한 화합물은 치료제, 예를 들어,　암 및 염증 치료제, 연구 시약, 예를 들어, 결합 검정 시약, 및 진단제, 예를 들어, 생체내 조영제로 유용하다. 방사성이든 아니든, 본원에서 기재된 바와 같은 화합물의 모든 동위원소 변동은 본원에 제공된 실시형태의 범위 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 화합물의 동위이성질체가 제공되고, 예를 들어, 동위이성질체는 중수소, 탄소-13, 또는 질소-15 풍부한 화합물이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 동위이성질체는 중수소 풍부한 화합물이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 동위이성질체는 중수소화가 키랄 중심 상에서 발생한 중수소 풍부한 화합물이다. 일부 실시형태에서, 중수소화가 키랄 중심 상에서 발생한, 본원에 제공된 화합물의 동위이성질체가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 중수소화가 키랄 중심 상에서 발생한, 화합물 C의 동위이성질체가 본원에 제공된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정 또는 결정되는 방법에 부분적으로 의존하는, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 에러를 의미한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3, 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 50%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.05% 이내를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어들 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같은, 대상체는 포유동물 예컨대 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트, 등) 또는 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 인간)일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 갖는 포유동물 (예를 들어, 인간)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태를 전개할 위험이 있는 포유동물 (예를 들어, 인간)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 화합물과 관련하여 "선택하는" 및 "선택된"은 사전결정된 기준을 갖는 특정한 화합물에 기초하여 (기인하여) 화합물의 군으로부터 특정 화합물이 구체적으로 선택된다는 것을 의미하기 위해 사용된다. 화합물은 화합물의 라이브러리 또는 집합을 스크리닝함에 의해 선택될 수 있다.
도시된 구조와 그 구조에 주어진 명칭 사이에 불일치가 있는 경우, 도시된 구조에 더 많은 가중치가 부여된다는 점에 유의해야 한다. 또한, 구조 또는 구조의 일부의 입체화학이 예를 들어 굵은선 또는 점선으로 표시되지 않는 경우, 구조 또는 구조의 일부는 그 구조의 모든 입체이성질체를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 제공된 실시형태의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 당업계에서 통상인의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 상담에 특히 적합한 텍스트의 예는 하기 문헌을 포함한다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989); Glover, ed., DNA Cloning, Volumes I and II (1985); Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Hames & Higgins, eds., Nucleic Acid Hybridization (1984); Hames & Higgins, eds., Transcription and Translation (1984); Freshney, ed., Animal Cell Culture: Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer Verlag, N.Y., 2d ed. 1987); 및 Weir & Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (1986).
5.2 화합물을 특징화하거나 선택하는 방법
Sal-유사 단백질 4 (SALL4)는 Spalt-유사 (SALL) 유전자 계열인, SALL4의 구성원에 의해 인코딩된 전사 인자이다. SALL4 발현은 마우스에서 7 또는 8-세포기 같이 조기인, 발달에서 초기에 개시하고 (Elling et al., PNAS, 103 (44):16319-16324 (2006); Koshiba-Takeuchi et al., Nat Genetics, 38: 175-183 (2006)), 배반포를 통하거나 또는 성인 인간 및 다른 포유동물의 고환 같은, 특정 줄기 세포 유형에서 더 길게 지속한다 (Eildermann et al., Cells Tissues Organs, 196(3):206-20 (2012); Gassei et al., Plos One, 8(1):e53976 (2013)).
SALL4는 사지 형태발생을 조절하는 배아 전사 인자이다. 발달 동안 감소된 기능적 SALL4 단백질 수준은 사지 기형을 특징으로 하는 몇 가지 인간 증후군의 원인인 것으로 밝혀졌다. 인간에서, SALL4에서의 기능상실 돌연변이는 Okihiro (Duane Radial Ray로도 알려져 있음), IVIC (Oculootoradial로도 알려져 있음), Holt-Oram, 및 Acro-신장-안구 증후군을 야기하고, 이 모두는 가변 정도의 귀, 눈, 심장, 및 신장 결함과 함께 팔뚝 비정상을 특징으로 한다 (Borozdin et al., J Med Genet, 41: e113 (2004); Borozdin et al., J Med Genetics, 41:e102 (2004); Kholase et al., Human Mutat ., 26(3):176-83 (2005); Al-Baradie et al., Am J Hum Genet., 71: 1195-1199 (2002); Kohlase et al., J Med Genet., 40(7):473-8 (2003); 및 Kohlase et al., Birth Defects Res A Clin Mol Teratol ., 70(8):550-1 (2004)). 이들 증후군과 연관된 SALL4 돌연변이는 상염색체가 우세하고, 감소된 SALL4 활성을 야기하는 것으로 예상된다 (Borozdin et al., J Med Genet, 41: e113 (2004); Koshiba-Takeuchi et al., Nat Genetics, 38: 175-183 (2006)). 따라서, SALL4의 할프로결핍 (halploinsufficiency)은 병원성 기전이다는 것과 Sall4 단백질 수준에서 훨씬 작은 감소가 발달 비정상을 야기하는 것으로 기대될 수 있다는 것을 나타낸다.
SALL4의 적어도 2개의 동형체 ―SALL4A 및 SALL4B가 있다. 본원에 제공된 방법은 SALL4A가 세레블론-CRL4 유비퀴틴화의 직접적인, 화합물-의존적 기질이다는 발견에 부분적으로 기초한다. 하기 섹션 6에서의 실시예는 SALL4A가 시험관내 및 생체내 세레블론-CRL4 유비퀴틴화의 직접적이고 화합물-유도된 표적이다는 것을 입증한다.
따라서, 본원에 개시된 데이터는 세레블론 개질 화합물-유도된 기형발생성의 구동자로서 SALL4 (또는 SALL4A) 분해를 확인한다. SALL4의 수준은 세레블론 개질 화합물의 독성을 결정하기 위해 사용될 수 있고, 그것에 의해 감소된 생식 독성의 위험이 있는 세레블론 개질 화합물의 스크리닝 및 선택을 허용한다. 더 구체적으로, 상당히 감소된 SALL4의 분해를 유도 또는 초래하지 않는 세레블론 개질 화합물은 이러한 화합물이 감소된 생식 독성의 위험을 가질 수 있기 때문에 특정 환자를 치료하는데 바람직할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "SALL4"는 동형체 A 또는 SALL4A를 지칭한다. 인간 SALL4A의 아미노산 서열 (식별자: Q9UJQ4-1)은 아래와 같다:
MSRRKQAKPQ HINSEEDQGE QQPQQQTPEF ADAAPAAPAA GELGAPVNHP GNDEVASEDE ATVKRLRREE THVCEKCCAE FFSISEFLEH KKNCTKNPPV LIMNDSEGPV PSEDFSGAVL SHQPTSPGSK DCHRENGGSS EDMKEKPDAE SVVYLKTETA LPPTPQDISY LAKGKVANTN VTLQALRGTK VAVNQRSADA LPAPVPGANS IPWVLEQILC LQQQQLQQIQ LTEQIRIQVN MWASHALHSS GAGADTLKTL GSHMSQQVSA AVALLSQKAG SQGLSLDALK QAKLPHANIP SATSSLSPGL APFTLKPDGT RVLPNVMSRL PSALLPQAPG SVLFQSPFST VALDTSKKGK GKPPNISAVD VKPKDEAALY KHKCKYCSKV FGTDSSLQIH LRSHTGERPF VCSVCGHRFT TKGNLKVHFH RHPQVKANPQ LFAEFQDKVA AGNGIPYALS VPDPIDEPSL SLDSKPVLVT TSVGLPQNLS SGTNPKDLTG GSLPGDLQPG PSPESEGGPT LPGVGPNYNS PRAGGFQGSG TPEPGSETLK LQQLVENIDK ATTDPNECLI CHRVLSCQSS LKMHYRTHTG ERPFQCKICG RAFSTKGNLK THLGVHRTNT SIKTQHSCPI CQKKFTNAVM LQQHIRMHMG GQIPNTPLPE NPCDFTGSEP MTVGENGSTG AICHDDVIES IDVEEVSSQE APSSSSKVPT PLPSIHSASP TLGFAMMASL DAPGKVGPAP FNLQRQGSRE NGSVESDGLT NDSSSLMGDQ EYQSRSPDIL ETTSFQALSP ANSQAESIKS KSPDAGSKAE SSENSRTEME GRSSLPSTFI RAPPTYVKVE VPGTFVGPST LSPGMTPLLA AQPRRQAKQH GCTRCGKNFS SASALQIHER THTGEKPFVC NICGRAFTTK GNLKVHYMTH GANNNSARRG RKLAIENTMA LLGTDGKRVS EIFPKEILAP SVNVDPVVWN QYTSMLNGGL AVKTNEISVI QSGGVPTLPV SLGATSVVNN ATVSKMDGSQ SGISADVEKP SATDGVPKHQ FPHFLEENKI AVS (서열번호: 1).
인간 SALL4A의 코딩 서열은 아래와 같다:
1 atgtcgaggc gcaagcaggc gaaaccccag cacatcaact cggaggagga ccagggcgag
61 cagcagccgc agcagcagac cccggagttt gcagatgcgg ccccagcggc gcccgcggcg
121 ggggagctgg gtgctccagt gaaccaccca gggaatgacg aggtggcgag tgaggatgaa
181 gccacagtaa agcggcttcg tcgggaggag acgcacgtct gtgagaaatg ctgtgcggag
241 ttcttcagca tctctgagtt cctggaacat aagaaaaatt gcactaaaaa tccacctgtc
301 ctcatcatga atgacagcga ggggcctgtg ccttcagaag acttctccgg agctgtactg
361 agccaccagc ccaccagtcc cggcagtaag gactgtcaca gggagaatgg cggcagctca
421 gaggacatga aggagaagcc ggatgcggag tctgtggtgt acctaaagac agagacagcc
481 ctgccaccca ccccccagga cataagctat ttagccaaag gcaaagtggc caacactaat
541 gtgaccttgc aggcactacg gggcaccaag gtggcggtga atcagcggag cgcggatgca
601 ctccctgccc ccgtgcctgg tgccaacagc atcccgtggg tcctcgagca gatcttgtgt
661 ctgcagcagc agcagctaca gcagatccag ctcaccgagc agatccgcat ccaggtgaac
721 atgtgggcct cccacgccct ccactcaagc ggggcagggg ccgacactct gaagaccttg
781 ggcagccaca tgtctcagca ggtttctgca gctgtggctt tgctcagcca gaaagctgga
841 agccaaggtc tgtctctgga tgccttgaaa caagccaagc tacctcacgc caacatccct
901 tctgccacca gctccctgtc cccagggctg gcacccttca ctctgaagcc ggatgggacc
961 cgggtgctcc cgaacgtcat gtcccgcctc ccgagcgctt tgcttcctca ggccccgggc
1021 tcggtgctct tccagagccc tttctccact gtggcgctag acacatccaa gaaagggaag
1081 gggaagccac cgaacatctc cgcggtggat gtcaaaccca aagacgaggc ggccctctac
1141 aagcacaagt gtaagtactg tagcaaggtt tttgggactg atagctcctt gcagatccac
1201 ctccgctccc acactggaga gagacccttc gtgtgctctg tctgtggtca tcgcttcacc
1261 accaagggca acctcaaggt gcactttcac cgacatcccc aggtgaaggc aaacccccag
1321 ctgtttgccg agttccagga caaagtggcg gccggcaatg gcatccccta tgcactctct
1381 gtacctgacc ccatagatga accgagtctt tctttagaca gcaaacctgt ccttgtaacc
1441 acctctgtag ggctacctca gaatctttct tcggggacta atcccaagga cctcacgggt
1501 ggctccttgc ccggtgacct gcagcctggg ccttctccag aaagtgaggg tggacccaca
1561 ctccctgggg tgggaccaaa ctataattcc ccaagggctg gtggcttcca agggagtggg
1621 acccctgagc cagggtcaga gaccctgaaa ttgcagcagt tggtggagaa cattgacaag
1681 gccaccactg atcccaacga atgtctcatt tgccaccgag tcttaagctg tcagagctcc
1741 ctcaagatgc attatcgcac ccacaccggg gagagaccgt tccagtgtaa gatctgtggc
1801 cgagcctttt ctaccaaagg taacctgaag acacaccttg gggttcaccg aaccaacaca
1861 tccattaaga cgcagcattc gtgccccatc tgccagaaga agttcactaa tgccgtgatg
1921 ctgcagcaac atattcggat gcacatgggc ggtcagattc ccaacacgcc cctgccagag
1981 aatccctgtg actttacggg ttctgagcca atgaccgtgg gtgagaacgg cagcaccggc
2041 gctatctgcc atgatgatgt catcgaaagc atcgatgtag aggaagtcag ctcccaggag
2101 gctcccagca gctcctccaa ggtccccacg cctcttccca gcatccactc ggcatcaccc
2161 acgctagggt ttgccatgat ggcttcctta gatgccccag ggaaagtggg tcctgcccct
2221 tttaacctgc agcgccaggg cagcagagaa aacggttccg tggagagcga tggcttgacc
2281 aacgactcat cctcgctgat gggagaccag gagtatcaga gccgaagccc agatatcctg
2341 gaaaccacat ccttccaggc actctccccg gccaatagtc aagccgaaag catcaagtca
2401 aagtctcccg atgctgggag caaagcagag agctccgaga acagccgcac tgagatggaa
2461 ggtcggagca gtctcccttc cacgtttatc cgagccccgc cgacctatgt caaggttgaa
2521 gttcctggca catttgtggg accctcgaca ttgtccccag ggatgacccc tttgttagca
2581 gcccagccac gccgacaggc caagcaacat ggctgcacac ggtgtgggaa gaacttctcg
2641 tctgctagcg ctcttcagat ccacgagcgg actcacactg gagagaagcc ttttgtgtgc
2701 aacatttgtg ggcgagcttt taccaccaaa ggcaacttaa aggttcacta catgacacac
2761 ggggcgaaca ataactcagc ccgccgtgga aggaagttgg ccatcgagaa caccatggct
2821 ctgttaggta cggacggaaa aagagtctca gaaatctttc ccaaggaaat cctggcccct
2881 tcagtgaatg tggaccctgt tgtgtggaac cagtacacca gcatgctcaa tggcggtctg
2941 gccgtgaaga ccaatgagat ctctgtgatc cagagtgggg gggttcctac cctcccggtt
3001 tccttggggg ccacctccgt tgtgaataac gccactgtct ccaagatgga tggctcccag
3061 tcgggtatca gtgcagatgt ggaaaaacca agtgctactg acggcgttcc caaacaccag
3121 tttcctcact tcctggaaga aaacaagatt gcggtcagct aa (서열번호: 2).
일 양태에서, 본원에 제공된 방법은 SALL4 단백질의 분해를 결정하는 것에 기초한다.
일부 실시형태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; 및 (b) 샘플에서 화합물이 SALL4 단백질의 분해를 유도하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 기형발생 효과의 감소된 위험을 갖는 세레블론 개질 화합물을 동정하기 위한 세레블론 개질 화합물 (또는 셀브론 개질 치료 화합물)의 집합을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물을 특징화하고, 더 구체적으로 세레블론 개질 화합물 (또는 세레블론 개질 치료 화합물)이 기형발생 효과를 유도할 수 있는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
따라서, 특정 실시형태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하여 세레블론 개질 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하는 것; 및 (f) 기준 화합물과 비교하여 SALL4의 분해를 유도하지 않는 세레블론 개질 화합물 또는 SALL4의 감소된 분해를 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시형태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 것; 및 (f) SALL4의 분해를 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
다른 실시형태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 것; 및 (f) 감소된 SALL4의 분해를 나타내는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드에 의한 SALL4 분해에 비교하여 감소된다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드에 의한 SALL4 분해에 비교하여 감소된다.
특정 실시형태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하여 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 실시형태에서, (a) 샘플을 얻는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것; (c) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (d) 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것; (e) 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 것; 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법은 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것에 기초한다.
특정 실시형태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것; (c) 기준 화합물과 비교하여 SALL4의 유비퀴틴화를 유도하지 않는 세레블론 화합물 또는 감소 수준의 SALL4의 유비퀴틴화를 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것; (c) SALL4의 유비퀴틴화를 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
다른 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 것; (c) 감소된 수준의 SALL4의 유비퀴틴화를 나타내는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, SALL4 유비퀴틴화는 기준 화합물에 의한 SALL4 유비퀴틴화에 비교하여 감소된다. 일 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 유비퀴틴화는 탈리도마이드에 의한 SALL4 유비퀴틴화에 비교하여 감소된다.
일부 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하고, 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 화합물에 의해 유도된 SALL4의 유비퀴틴화는 기형발생성에 대한 잠재력을 나타낸다. 일부 실시형태에서 SALL4의 유비퀴틴화의 더 높은 정도는 화합물이 기형발생 효과를 보다 유도하기 쉽다는 것을 나타낸다.
여전히 또 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법은 SALL4와 세레블론 간의 상호작용 (또는 결합)을 결정하는 것에 기초한다.
세레블론은 특정 세레블론 개질 화합물, 예를 들어, 탈리도마이드, 포말리도마이드, 및 레날리도마이드에 결합하는 주요 분자 표적으로 확인되었다. 이들 화합물은 세레블론을 표적으로 하고, 유비퀴틴 리가제의 기질 특이성을 변경하여, 특정 암 세포에서 임상 활성을 촉진한다. 결합된 기질은 세레블론-CRL4 복합체에 의해 유비퀴틴화되어, 26S 프로테아솜에 의한 그것의 분해로 이어진다. 따라서, SALL4의 분해는 또한 세레블론 개질 화합물로 치료 시 SALL4와 세레블론 간의 상호작용 (또는 결합) , 및/또는 세레블론 개질 화합물로 치료 시 SALL4의 유비퀴틴화를 분석함에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것; (c) 기준 화합물과 비교하여 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 유도하지 않는 세레블론 개질 화합물 또는 SALL4와 세레블론 사이의 감소된 상호작용을 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) 샘플에서 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것; (c) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 유도하지 않는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다.
다른 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것; (c) SALL4와 세레블론 사이의 감소된 상호작용을 초래하는 화합물을 선택하는 것을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법이 본원에 제공된다. 일 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 기준 화합물의 존재에서 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용에 비교하여 감소된다. 일 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 탈리도마이드의 존재에서 SALL4 및 세레블론 상호작용에 비교하여 감소된다.
특정 실시형태에서, (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하고, 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 것을 포함하는, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 실시형태에서, (a) 화합물을 샘플에 투여하는 것; (b) SALL4와 CRBN 사이의 상호작용이 기형발생성에 대한 잠재력을 나타내는, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것을 포함하는, 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 것은 SALL4와 세레블론 사이의 물리적 상호작용 또는 결합을 결정하는 것을 포함한다.
하기 섹션 6의 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 개시내용은 세레블론 개질 화합물의 존재에서 세레블론에 대한 결합에 직접적으로 관여된 SALL4 단백질의 적어도 일부분으로 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3) 또는 이의 단편 (예를 들어, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432 (서열번호: 11))을 동정하고; 그리고 이 영역 내의 돌연변이 (예를 들어, G416A)는 화합물로 치료 시 세레블론과 SALL4 사이의 상호작용을 방해하기 쉽다는 것을 입증한다. 따라서, 세레블론 개질 화합물의 존재에서 세레블론과 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3) 또는 이의 단편 (예를 들어, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432 (서열번호: 11)) 사이의 상호작용은 SALL4가 세레블론 개질 화합물로 치료에 의해 분해될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432를 포함하는 아미노산 단편이 사용된다. 특정 실시형태에서, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432를 포함하는 아미노산 단편이 사용된다.
특정 검정에서, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 또는 이의 단편 (예를 들어, SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432) 내의 하나 이상의 아미노산이 세레블론 개질 화합물의 존재에서 세레블론의 특정 아미노산에 대한 그것의 결합에 관하여 분석된다. 일부 실시형태에서, 분석된 아미노산은 G416이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 T405이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 G406이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 E407이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 R408이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 P409이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 F410이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 V411이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 C412이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 S413이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 V414이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 H417이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 R418이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 F419이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 T420이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 T421이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 K422이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 G423이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 N424이다. 다른 실시형태에서, 아미노산은 L425이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 K426이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 V427이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 H428이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 F429이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 H430이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 R431이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산은 H432이다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 단백질 분해의 결정은 당해 분야의 숙련가에 알려진 임의의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부는 세레블론 개질 화합물의 투여 후 SALL4의 단백질 수준을 참조 수준에 비교함에 의해 결정된다. 본 참조는 대조군 샘플을 사용함에 의해 제조될 수 있고, 본 대조군 샘플은 샘플과 동일한 출처로부터의 것이다. 본원에 제공된 다양한 방법의 다른 실시형태에서, 본 참조 수준은 세레블론 개질 화합물의 투여 전 샘플에서 SALL4의 단백질 수준을 측정함에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 본 참조 수준은 사전-결정된 수준이다. 일부 실시형태에서, 본 참조 수준은 참조 세레블론 개질 화합물, 예를 들어 탈리도마이드, 레날리도마이드 또는 포말리도마이드의 존재에서 SALL4 수준이다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 샘플에 세레블론 개질 화합물의 투여 이전에 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 것, 샘플에 세레블론 개질 화합물의 투여 후 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 것, 제1 수준 대 제2 단백질 수준을 비교하는 것, 및 (화합물이 SALL4 단백질의 분해를 유도하지 않는다는 것을 나타내는) 제2 수준이 제1 수준보다 상당히 더 낮지 않은지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물을 샘플에 투여하는 것은 시험관내 수행된다. 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물을 샘플에 투여하는 것은 생체내 수행된다. 일 실시형태에서, 샘플은 기간, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 55분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 20, 또는 그 초과 일 동안 화합물과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 여기에 제공된 샘플은 생체내 또는 원위치에서 수득되거나, 또는 집합된 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플일 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 이환 세포 또는 조직, 예를 들어, 전암성 또는 암 세포 또는 조직, 예를 들어 종양을 함유하는 환자의 영역으로부터 수득될 수 있다. 이러한 샘플, 여기에 제한되지는 않지만, 환자로부터 단리된 기관, 조직, 및 세포일 수 있다. 예시적인 샘플은 여기에 제한되지는 않지만 세포 용해물, 세포 배양, 조직, 경구 조직, 위장 조직, 장기, 소기관, 생체액, 혈액 샘플, 소변 샘플, 피부 샘플, 골수 샘플, 순환 종양 세포, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 샘플은 세포 용해물, 세포 배양, 세포주, 단리된 단백질, 합성 단백질, 세포 추출물, 조작된 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 태아 세포, 태아 조직, 제브라피쉬, 및 기타 동종의 것, 그리고 이의 하나 이상의 조합으로부터 선택된 샘플일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 다양한 방법은 대상체 또는 개체 (예를 들어, 환자)로부터의 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플)을 사용한다. 상기 대상체는 환자, 예컨대, 암 (예를 들어, 림프종, MM, 또는 백혈병)이 있는 환자일 수 있다. 상기 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간일 수 있다. 상기 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있고, 성인, 아동, 영아, 또는 태아일 수 있다. 샘플은 암 (예를 들어, 림프종, MM, 또는 백혈병)의 활성 상태 동안, 또는 암 (예를 들어, 림프종, MM, 또는 백혈병)이 불활성일 때 한번에 분석될 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체로부터 1 초과 샘플이 수득될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 샘플은 대상체로부터의 체액을 포함한다. 체액의 비-제한적인 예는 혈액 (예를 들어, 전혈), 혈장, 양수, 안방수, 담즙, 귀지, 쿠퍼액, 사정전 유체, 유미, 유미즙, 암컷 사정액, 간질액, 림프, 월경, 모유, 점액, 흉막액, 고름, 타액, 피지, 정액, 혈청, 땀, 눈물, 소변, 질 윤활, 구토물, 물, 배설물, 내부 체액 (뇌 및 척수를 둘러싸는 뇌척수액을 포함함), 활막 유체, 세포내액 (세포 내부의 유체), 및 유리액 (안구 내 유체)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 혈액 샘플은, 예를 들어, 문헌 [Innis et al, eds., PCR Protocols (Academic Press, 1990)]에 기재된 바와 같은 통상적인 기술을 수득될 수 있다. 백혈구는 통상적인 기술 또는 상업적으로 이용가능한 키트, 예를 들어, RosetteSep 키트 (Stein Cell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)를 사용하여 혈액 샘플로부터 분리될 수 있다. 백혈구의 하위-모집단, 예를 들어, 단핵 세포, B 세포, T 세포, 단핵구, 과립구, 또는 림프구가 통상적인 기술, 예를 들어, 자석으로 활성화된 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 오번 소재) 또는 형광으로 활성화된 세포 분류 (FACS) (Becton Dickinson, 캘리포니아주 산호세 소재)를 사용하여 추가로 단리될 수 있다.
일 실시형태에서, 혈액 샘플은 약 0.1 mL 내지 약 10.0 mL, 약 0.2 mL 내지 약 7 mL, 약 0.3 mL 내지 약 5 mL, 약 0.4 mL 내지 약 3.5　mL, 또는 약 0.5 mL 내지 약 3 mL이다. 또 다른 실시형태에서, 혈액 샘플은 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 6.0, 약 7.0, 약 8.0, 약 9.0, 또는 약 10.0 ml이다.
일부 실시형태에서, 본 방법에서 사용된 샘플은 생검 (예를 들어, 종양 생검)을 포함한다. 생검은 임의의 장기 또는 조직, 예를 들어, 피부, 간, 폐, 심장, 결장, 신장, 골수, 치아, 림프절, 모발, 비장, 뇌, 유방, 또는 다른 기관으로부터 될 수 있다. 대상체로부터 샘플을 분리하기 위해, 예를 들어, 개방 생검, 폐쇄 생검, 코어 생검, 절개 생검, 절제 생검, 또는 세침 흡인 생검을 위해, 당해 분야의 숙련가에 알려진 임의의 생검 기술이 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 샘플은 대상체가 질환 또는 장애에 대한 치료를 받기 전에 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체가 질환 또는 장애에 대한 치료를 받는 동안에 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체가 질환 또는 장애에 대한 치료를 받은 후에 대상체로부터 수득된다. 다양한 실시형태에서, 치료는 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 샘플은 복수의 세포, 예컨대 암 (예를 들어, 림프종, MM, 또는 백혈병) 세포를 포함한다. 이러한 세포는 임의의 유형의 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 혈구 (예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)), 림프구, B 세포, T 세포, 단핵구, 과립구, 면역 세포, 또는 암 세포를 포함할 수 있다.
B 세포 (B 림프구)는, 예를 들어, 혈장 B 세포, 메모리 B 세포, B1 세포, B2 세포, 변연-구역 B 세포, 및 여포성 B 세포를 포함한다. B 세포는 면역글로불린 (항체) 및 B 세포 수용체를 발현할 수 있다.
특이적 세포 모집단은 상업적으로 이용가능한 항체 (예를 들어, Quest Diagnostic (San Juan Capistrano, 캘리포니아 소재) 또는 Dako (덴마크 소재)로부터의 항체)의 조합을 사용하여 수득될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서의 세포는 PBMC이다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 샘플은 질환 조직으로부터의 것, 예를 들어, 암 (예를 들어, 림프종, MM, 또는 백혈병)이 있는 개체로부터의 것이다.
특정 실시형태에서, 세포주로부터의 샘플은 화합물의 효과를 평가하거나, 작용 기전을 연구하거나, 또는 참조 수준을 확립하는 것 등을 위해 질환 모델로 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포는 암 세포주로부터의 것이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 백혈병 세포주가 샘플로 사용된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, AML 세포주가 샘플로 사용된다. 일 실시형태에서, AML 세포주는 KG-1 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 KG-1a 세포주이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 KASUMI-1 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 NB4 세포주이다. 일 실시형태에서, AML 세포주는 MV-4-11 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 MOLM-13 세포주이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 HL-60 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 U-937 세포주이다. 일 실시형태에서, AML 세포주는 OCI-AML2 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 OCI-AML3 세포주이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 HNT-34 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 ML-2 세포주이다. 일 실시형태에서, AML 세포주는 AML-193 세포주이다. 또 다른 실시형태에서, AML 세포주는 F36-P 세포주이다. 다른 예시적인 백혈병 세포주는 비제한적으로 8E5 세포주, CCRF-CEM 세포주, CCRF-HSB-2 세포주, MOLT-3 세포주, CEM/C2 세포주 , CEM/C1 세포주, TALL-104 세포주, THP-1 세포주, Kasumi-3 세포주, BDCM 세포주, NCI-BL2122 세포주, JAA-F11 세포주, 31E9 세포주, RBL-2H3 세포주, MV-4-11 세포주, BCP-1 세포주, JVM-13 세포주, KU812 세포주, MYA-1 세포주, Mo-B 세포주, MM.1S 세포주, RBL-1 세포주, 및 WEHI-3 세포주를 포함한다.
다른 실시예에 대해, 림프종 및 혈액 세포주가 샘플로 사용된다. 예시적인 세포주는 비제한적으로 Daudi 세포주, GA-10 세포주, HCC38BL 세포주, HCC2218BL 세포주, HH 세포주, Toledo 세포주, FeT-J 세포주, NK-92 세포주, Mino 세포주, JVM-2 세포주, EML-3C 세포주, IB4 세포주, 63D3 세포주, C1R-B7 세포주, OKT5 세포주, 및 1H3 세포주를 포함한다.
다른 실시형태에서, 방광암 세포주, 예컨대 HT-1376 세포주, SCaBER 세포주, T24 세포주, RT4 세포주, TMB-54 세포주, 및 HT1197.T 세포주가 샘플로 사용된다.
다른 실시형태에서, 골암 세포주, 예컨대 SUP-B15 세포주, Hs 696 세포주, K-562 세포주, MEG-01 세포주, TF-1 세포주, RD-ES 세포주, SAML-2 세포주, FDC-P1 세포주, D-17 세포주, HOS 세포주, UMR-106 세포주, SK-ES-1 세포주, KM703 세포주, 및 BBm 세포주가 샘플로 사용된다.
다른 실시형태에서, 뇌암 세포주, 예컨대 SW1088 세포주, CHLA-02-ATRT 세포주, U-118 MG 세포주, HCN-2 세포주, RG2 세포주, LN-229 세포주, C6 세포주, 3G5 세포주, M059K 세포주, X22 세포주, SCP 세포주, OA1 세포주, 및 NE-GFP-4C 세포주가 샘플로 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 유방암 세포주, 예컨대 Hs 281.T 세포주, MDA-MB-468 세포주, CAMA-1 세포주, SK-BR-3 세포주, RBA 세포주, UACC-1179 세포주, NMU 세포주, BT-483 세포주, T-47D 세포주, ZR-75-30 세포주, MCF10A 세포주, 및 EMT6 세포주가 샘플로 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 결장암 세포주 예컨대 RKO가 샘플 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 부인과 암 세포주 예컨대 HeLa 229가 샘플로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 두경부 암 세포주 예컨대 FaDu가 샘플로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 간 암 세포주 예컨대 Capan-1이 샘플로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 폐암 세포주 예컨대 Calu-3이 샘플로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 췌장 암 세포주 이러한 HPAC가 샘플로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 육종 세포주 예컨대 SK-LMS-1이 샘플로 사용된다. 다른 암 모델로부터의 세포주가 또한 본 개시내용에서 포함된다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포의 수는 단일 세포 내지 약 109 세포의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법에서 사용된 세포의 수는 약 1 x 104, 약 5 x 104, 약 1 x 105, 약 5 x 105, 약 1 x 106, 약 5 x 106, 약 1 x 107, 약 5 x 107, 약 1 x 108, 약 5 x 108, 또는 약 1 x 109이다.
수 및 세포 유형은, 예를 들어, 표준 세포 검출 기술 예컨대 유세포측정, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어, 조직 특이적 또는 세포-마커 특이적 항체로 염색), 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)를 사용하여 세포 표면 마커에서의 변화를 측정함에 의해, 광 또는 공초점 현미경검사를 사용하여 세포의 형태를 검사함에 의해, 및/또는 당해 분야에서 잘 알려진 기술, 예컨대 PCR 및 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함에 의해 모니터링될 수 있다. 이들 기술은 또 하나 이상의 특정 마커에 대해 양성인 세포를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포의 서브셋이 본원에 제공된 방법에서 사용된다. 세포의 특정 모집단을 분류하고 분리하는 방법은 당업계에서 잘알려져 있고 세포 크기, 형태, 또는 세포내 또는 세포외 마커에 기초할 수 있다. 이러한 방법은, 여기에 제한되지는 않지만, 유세포측정, 유동 분류, FACS, 비드 기초 분리 예컨대 자기 세포 분류, 크기-기반 분리 (예를 들어, 체, 다수의 장애물, 또는 필터), 미세유체공학 디바이스에서 분류, 항체-기반 분리, 침강, 친화도 흡착, 친화도 추출, 밀도 구배 원심분리, 레이저 포착 현미절개, 등을 포함한다. 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 특성에 기초하여, 세포를 포함한 입자를 분리하는 잘-알려진 방법이다 (Kamarch, Methods Enzymol . 151:150-165 (1987)). 개별 입자에서 형광 모이어티의 레이저 여기는 작은 전하가 혼합물로부터 양성 및 음성 입자의 전자기 분리를 허용하게 한다. 일 실시형태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드는 뚜렷한 형광 라벨로 표지된다. 세포는 세포 정렬기를 통해 가공되어, 사용된 항체에 결합하는 그것의 능력에 기초하여 세포의 분리를 허용한다. FACS 분류된 입자는 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별적인 웰 안으로 직접적으로 침착되어 분리 및 클로닝을 촉진할 수 있다.
SALL4 단백질의 수준은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 SALL4의 단백질 수준을 검출하고 정량하는 방법이 본원에 제공된다.
SALL4의 수준을 측정하기 위해 몇 개의 단백질 검출 및 정량 방법이 사용될 수 있다. 임의의 적합한 단백질 정량 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체-기반 방법이 사용된다. 사용될 수 있는 예시적인 방법은, 여기에 제한되지는 않지만, 면역블로팅 (웨스턴 블랏), 현장 진단 기술/플랫폼, ELISA, 면역조직화학, 유세포측정, 세포측정 비드 어레이, 질량 분광법, 크로마토그래피, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 기타 동종의 것을 포함한다. 직접적인 ELISA, 간접적인 ELISA, 및 샌드위치 ELISA를 포함한, 몇 가지 유형의 ELISA가 통상적으로 사용된다.
단백질 수준의 검출에 대해, 예를 들어, 프로브 (예를 들어, 결합 단백질, 예를 들어, 구체적으로 SALL4와 상호작용할 수 있는 항체)의 수단에 의해, 샘플에서 폴리펩타이드 생성물을 검출하기 위한 수많은 잘 알려진 방법이 있다. 표지된 항체, 이의 결합부, 또는 다른 결합 파트너가 사용될 수 있다. 항체는 기원에서 단클론성 또는 다클론성일 수 있거나, 또는 생합성으로 생산될 수 있다. 결합 파트너는 또한 자연 발생 분자이거나 또는 합성으로 생산될 수 있다. 복합체화된 단백질의 양은 당업계에서 기재된 표준 단백질 검출 방법론을 사용하여 결정된다. 면역학적 검정 설계, 이론 및 프로토콜의 상세한 검토는 문헌 [Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984]을 포함하여, 당업계에 수많은 교과서에서 발견될 수 있다.
표지된 항체를 갖는 단백질을 검출하기 위한 다양한 면역조직화학 검정이 이용가능하다. 직접적인 라벨은 항체에 부착된 형광 또는 발광성 태그, 금속, 염료, 방사성핵종, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 간접적인 라벨은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 수소 페록시다아제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 1-단계 검정에서, 표적 단백질 SALL4는 표지된 항체로 고정화되고 인큐베이션된다. 표지된 항체는 고정화된 표적 분자에 결합한다. 미결합된 분자를 제거하기 위해 세정 후, 샘플은 표지의 존재에 대해 분석된다. 수많은 면역조직화학 방법이 현장 진단 포맷 및 소형으로 합체되고, 이들 모두는 단백질의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩타이드에 대해 특이적인 고정화된 항체의 사용이 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 항체는 다양한 고형 지지체, 예컨대 자기 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 검정 장소의 표면 (예컨대 미세적정 웰들), 고체 기판 재료의 조각 (예컨대 플라스틱, 나일론, 종이), 및 기타 동종의 것 상에 고정화될 수 있다. 검정 스트립은 항체 또는 복수의 항체를 고형 지지체 상에 어레이로 코팅함에 의해 제조될 수 있다. 이 스트립은 그 다음 테스트 샘플에 침지되고 세정 및 검출 단계를 통해 처리되어 측정가능한 신호, 예를 들어, 착색된 점을 생성할 수 있다.
2-단계 검정에서, 고정화된 표적 단백질 SALL4는 비표지된 항체로 인큐베이션될 수 있다. 존재할 경우, 비표지된 항체 복합체는 그 다음 비표지된 항체에 대해 특이적인 제2의 표지된 항체에 결합된다. 샘플은 세정되고 표지의 존재에 대해 분석된다. 항체를 표지하기 위해 사용된 마커의 선택은 적용에 따라 다양할 것이다. 그러나, 마커의 선택은 당해 분야의 숙련가에게 쉽게 결정가능하다.
항체는 방사선 원자, 효소, 발색단 또는 형광 모이어티, 또는 비색계 태그로 표지될 수 있다. 태깅 표지의 선택 또한 원하는 검출 한계에 의존할 것이다. 효소 검정의 것 (ELISA)은 전형적으로 효소 기질과 효소-태깅된 복합체의 상호작용에 의해 형성된 유색 생성물의 검출을 허용한다. 방사선 원자의 일부 예는 32P,　125I,　3H, 및　14P를 포함한다. 효소의 일부 예는 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 포함한다. 발색단 모이어티의 일부 예는 플루오레세인 및 로다민을 포함한다. 항체는 당해 분야에서 알려진 방법에 의해 이들 라벨에 접합될 수 있다. 예를 들어, 효소 및 발색단 분자는 커플링제, 예컨대 디알데하이드, 카보디이미드, 디말레이미드, 및 기타 동종의 것의 수단에 의해 항체에 접합될 수 있다. 대안적으로, 콘주게이션은 리간드-수용체 쌍을 통해 발생할 수 있다. 일부 적합한 리간드-수용체 쌍은, 예를 들어, 바이오틴-아비딘 또는 -스트렙타비딘, 및 항체-항원을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 표적 단백질 SALL4의 수준을 검출하기 위한 샌드위치 기술의 사용을 고려한다. 본 기술은 관심 있는 단백질을 결합할 수 있는 2가지 항체를 요한다: 예를 들어, 고형 지지체 상에 고정화된 하나 및 일부 쉽게 검출가능한 화합물로 표지되지만 용액에서 유리하는 하나. 제2 항체에 대해 사용될 수 있는 화학 표지의 예는, 여기에 제한되지는 않지만, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 및 반응물 또는 효소 기질에 노출될 때 착색되거나 또는 전기화학적으로 활성인 생성물을 생성하는 효소 또는 다른 분자를 포함한다. SALL4 단백질을 함유하는 샘플이 이 시스템에 위치되면, 폴리펩타이드는 고정화된 항체 및 표지된 항체 둘 모두에 결합한다. 그 결과는 지지체의 표면 상에 "샌드위치" 면역 복합체이다. 복합체화된 단백질은 비결합된 샘플 구성요소 및 과잉 표지된 항체를 세정하고 지지체의 표면 상의 단백질에 복합체화된 표지된 항체의 양을 측정에 의해 검출된다. 샌드위치 면역검정은 검출의 한계가 우수한 라벨이 사용된 경우 매우 특이적이고 아주 민감하다.
닷 블랏팅은 프로브로서 항체를 사용하여 원하는 단백질을 검출하기 위해 당업자에 의해 일상적으로 실시된다 (Promega Protocols and Applications Guide, Second Edition, 1991, Page 263, Promega Corporation). 샘플은 닷 블랏 장치를 사용하여 멤브레인에 적용된다. 표지된 프로브는 멤브레인으로 인큐베이션되고, 단백질의 존재가 검출된다.
웨스턴 블랏 분석은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, Chapter 18, Cold Spring Harbor Laboratory). 웨스턴 블랏에서, 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 겔은 멤브레인으로 이전된다. 멤브레인은 원하는 단백질의 검출을 위해 표지된 항체로 인큐베이션된다.
상기에 기재된 검정은, 비제한적으로, 면역블로팅, 면역확산, 면역전기영동, 또는 면역침강과 같은 단계들을 포함한다. 단백질 또는 폴리펩타이드에 항체의 특이적 면역학적 결합이 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, SALL4의 수준을 결정하기 위해 자동 분석기 (예를 들어, 자동 서열분석 기계)가 사용된다. 모든 그와 같은 방법은 당업자에 의해 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, SALL4 단백질의 수준 또는 존재는 질량 분광분석법 (MS)에 의해 분석 및/또는 결정된다. 전형적으로, 단백질의 질량 분광분석법 (MS) 분석은 이온의 질량-대-전하 비를 측정하여 단순 및 복합 혼합물에서 분자를 동정하고 정량한다. 질량 분광분석기는 이온 소스, 질량 분석기 및 이온 검출기를 갖는다. 이들 구성요소의 특성은 질량 분광분석기의 목적, 필요한 데이터의 유형, 및 샘플의 물리적 특성에 기초하여 다양하다. 샘플은 액체, 가스 또는 건조된 형태에서 질량 분광분석기 안으로 장입되고 그 다음 이온 소스 (예를 들어, APCI, DART, ESI)에 의해 증발 및 이온화된다. 이들 분자가 받는 전하는 질량 분광분석기가 이온을 시스템의 잔여부 전반에 걸쳐 가속시킬 수 있도록 한다. 이온은 질량 분석기로부터 전기 및/또는 자기장을 만나, 그것의　m/z에 기초하여 개별 이온의 경로를 편향시킨다. 통상적으로 사용된 질량 분석기는 비과시간 [TOF], 오비트랩, 사중극자 및 이온 트랩을 포함하고, 각각의 유형은 특이적 특성을 갖는다. 질량 분석기는 전반적인 분석을 위해 샘플에서 모든 피분석물을 분리하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 이들은 특정한 이온 만을 검출기로 편향시키는 필터처럼 사용될 수 있다. 질량 분석기에 의해 성공적으로 편향된 이온은 그 다음 이온 검출기에 부딪힌다. 가장 흔한, 이들 검출기는 각각의 이온이 검출기 플레이트에 부딪힐 때 전자의 캐스케이드를 방출하는 전자 멀티플라이어 또는 마이크로채널 플레이트이다. 이 캐스케이드는 개선된 민감도를 위해 각각의 이온 적중의 증폭을 초래한다. 이 전체 공정은 극도의 진공 하에서 수행되어, 샘플 이온과 충돌하여 그것의 경로를 변경하거나 비-특이적 반응 생성물을 생성할 수 있는 가스 분자와 중성 및 오염성 비-샘플 이온을 제거한다. 질량 분광분석기는 전형적으로 이온 진동 주파수를 측정하고 이미지 전류 검출을 사용하여 질량 스펙트럼을 얻는 컴퓨터-기반 소프트웨어 플랫폼에 연결된다. 데이터 분석 프로그램은 이온을 검출하고 그것의 개별　m/z　값　및 상대 존재비에 의해 이들을 구성한다. 이들 이온은 그런 다음 그것의　m/z　값을 기준으로 분자의 동일성을 예측하는 확립된 데이터베이스를 통해 식별될 수 있다.
특정 실시형태에서, 샘플, 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 SALL4의 RNA (예를 들어, mRNA) 수준을 검출하고 정량화하는 방법이 본원에 제공된다.
mRNA 수준을 검출 또는 정량하는 몇 개의 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 여기에 제한되지는 않지만, 노던 블랏, 리보뉴클레아제 보호 검정, PCR-기반 방법, 및 기타 동종의 것을 포함한다. mRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 프로브를 제조하기 위해 mRNA 서열이 사용될 수 있다. 프로브는 그 다음 임의의 적합한 검정, 예컨대 PCR-기반 방법, 노던 블랏팅, 딥스틱 검정, 및 기타 동종의 것을 사용하여 샘플에서 mRNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플에서 핵산 검정이 준비될 수 있다. 검정은 전형적으로 고형 지지체 및 상기 지지체와 접촉하는 적어도 하나의 핵산을 함유하며, 여기서 상기 핵산은 환자에서 화합물 치료 동안 변경된 발현을 갖는 mRNA의 적어도 일부분에 상응한다. 본 검정은 또한 샘플에서 mRNA의 변경된 발현을 검출하는 수단을 가질 수 있다.
본 검정 방법은 원하는 mRNA 정보의 유형에 따라 다양할 수 있다. 예시적인 방법은 여기에 제한되지는 않지만 노던 블랏 및 PCR-기반 방법 (예를 들어, qRT-PCR)을 포함한다. qRT-PCR과 같은 방법은 또한 샘플에서 mRNA의 양을 정확하게 정량할 수 있다.
샘플에서 mRNA의 존재를 결정하기 위해 임의의 적합한 검정 플랫폼이 사용될 수 있다. 예를 들어, 검정은 딥스틱, 멤브레인, 칩, 디스크, 테스트 스트립, 필터, 마이크로구형체, 슬라이드, 다중-웰 플레이트, 또는 광섬유의 형태로 될 수 있다. 검정 시스템은 mRNA에 해당하는 핵산이 부착되는 고형 지지체를 가질 수 있다. 본 고형 지지체는, 예를 들어, 플라스틱, 실리콘, 금속, 수지, 유리, 멤브레인, 입자, 침전물, 겔, 폴리머, 시트, 구형체, 다당류, 모세관, 필름, 플레이트, 또는 슬라이드를 포함할 수 있다. mRNA를 검출하기 위한 키트로서 검정 구성요소가 준비되고 함께 포장될 수 있다.
핵산은, 원한다면, 표지된 mRNA의 모집단을 제조하기 위해 표지될 수 있다. 일반적으로, 샘플은 당해 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 (예를 들어, DNA 리가제, 말단 전달효소를 사용하거나, 또는 RNA 골격을 라벨링하는 것, 등에 의해) 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (Wiley & Sons, 3rd ed. 1995)]; 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed. 2001)] 참고. 일부 실시형태에서, 샘플은 형광 표지로 표지된다. 예시적인 형광 염료는, 여기에 제한되지는 않지만, 크산텐 염료, 플루오레세인 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 6-카복시플루오레세인 (FAM), 6 카복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인 (JOE)), 로다민 염료 (예를 들어, 로다민 110 (R110), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카복시로다민 (TAMRA), 6-카복시-X-로다민 (ROX), 5-카복시로다민 6G (R6G5 또는 G5), 6-카복시로다민 6G (R6G6 또는 G6)), 시아닌 염료 (예를 들어, Cy3, Cy5 및 Cy7), 알렉사(Alexa) 염료 (예를 들어, Alexa-fluor-555), 쿠마린, 디에틸아미노쿠마린, 엄벨리페론, 벤즈이미드 염료 (예를 들어, Hoechst 33258), 펜안트리딘 염료 (예를 들어, 텍사스 레드), 에티듐 염료, 아크리딘 염료, 카바졸 염료, 펜옥사진 염료, 포르피린 염료, 폴리메틴 염료, BODIPY 염료, 퀴놀린 염료, 피렌, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 에오신 염료, 테트라메틸로다민, 리스사민, 나프토플루오레세인, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
전형적인 mRNA 검정 방법은 1) 표면-결합된 대상 프로브를 획득하는 단계; 2) 특이적 결합을 제공하기에 충분한 조건 하에서 표면-결합된 프로브에 mRNA의 모집단을 혼성화하는 단계; (3) 후-혼성화 표면-결합된 프로브에 구체적으로 결합되지 않은 핵산을 제거하기 위해 세정하는 단계; 및 (4) 혼성화된 mRNA를 검출하는 단계의 단계들을 함유할 수 있다. 각각의 이들 단계들에서 사용된 시약 및 사용을 위한 그것의 조건은 특정한 적용에 따라 다양할 수 있다.
혼성화는 원하는 대로 엄격성에서 다양할 수 있는, 적합한 혼성화 조건 하에서 수행될 수 있다. 전형적인 조건은 상보성 결합 구성원 사이, 즉, 샘플에서 표면-결합된 대상 프로브와 상보성 mRNA 사이의 단단한 표면 상에 프로브/표적 복합체를 생성하기에 충분하다. 특정 실시형태에서, 엄격한 혼성화 조건이 이용될 수 있다.
혼성화는 전형적으로 엄격한 혼성화 조건 하에서 수행된다. 표준 혼성화 기술 (예를 들어, 프로브에 샘플에서 표적 mRNA의 특이적 결합을 제공하기에 충분한 조건 하에서)은 문헌 [Kallioniemi et al., Science 1992, 258:818-821] 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/18186에 기재되어 있다. 일반적인 기술에 대한 몇 개의 가이드가, 예를 들어, 문헌 [Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parts I and II (Elsevier, Amsterdam 1993)]에서 이용가능하다. 원위치 혼성화에 적합한 기술의 설명에 대해, 문헌 [Gall et al., Meth . Enzymol. 1981, 21:470-480; Angerer et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Vol 7, pgs 43-65 (Plenum Press, New York, Setlow and Hollaender, eds. 1985)]을 참고한다. 온도, 염 농도, 폴리뉴클레오타이드 농도, 혼성화 시간, 세정 조건의 엄격성, 및 기타 동종의 것을 포함한 적절한 조건의 선택은 샘플의 출처, 포획제의 동일성, 기대된 상보성의 정도, 등을 포함한 실험 디자인에 의존할 것이고 당해 분야의 숙련가에 대해서 일상적인 실험과정으로 결정될 수 있다.
통상적인 기술자는 대안적이지만 비교가능한 혼성화 및 세정 조건이 유사한 엄격성의 조건을 제공하기 위해 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
mRNA 혼성화 절차 후, 표면 결합된 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 미결합된 핵산을 제거하기 위해 세정된다. 세정은 상기에 기재된 바와 같이 세정 조건이 전형적으로 엄격한 임의의 편리한 세정 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다. 프로브에 표적 mRNA의 혼성화가 그 다음 표준 기술을 사용하여 검출된다.
다른 방법, 예컨대 PCR-기반 방법이 또한 SALL4의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. PCR 방법의 예는 미국 특허 번호 6,927,024에서 발견될 수 있으며, 이것은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다. RT-PCR 방법의 예는 미국 특허 번호 7,122,799에서 발견될 수 있으며, 이것은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다. 형광 원위치 PCR의 방법은 미국 특허 번호 7,186,507에 기재되어 있으며, 이것은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다.
일부 실시형태에서, 정량적 역전사-PCR (qRT-PCR)이 RNA 표적의 검출 및 정량화 둘 모두를 위해 사용될 수 있다 (Bustin et al., Clin . Sci . 2005, 109:365-379). qRT-PCR에 의해 수득된 정량적 결과는 일반적으로 정성적 데이터보다 더 많이 정보제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, qRT-PCR-기반 검정은 세포 기반 검정 동안 mRNA 수준을 측정하는데 유용할 수 있다. qRT-PCR 방법은 또한 환자 요법을 모니터링하는데 유용하다. qRT-PCR-기반 방법의 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,101,663에서 발견될 수 있으며, 이것은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다.
아가로스 겔에 의한 규칙적 역전사효소-PCR 및 분석에 대조적으로, qRT-PCR은 정량적 결과를 제공한다. qRT-PCR의 추가의 이점은 사용의 상대적인 용이성과 편리성이다. Applied Biosystems 7500과 같은 qRT-PCR용 기기가 상업적으로 이용가능하여, TaqMan® 서열 검출 화학과 같은 시약이 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, TaqMan® 유전자 발현 검정이 제조자의 지침에 따라 사용될 수 있다. 이들 키트는 인간, 마우스, 및 랫트 mRNA 전사체의 신속하고, 신뢰할 수 있는 검출 및 정량화를 위해 사전-제형화된 유전자 발현 검정이다. 예시적인 qRT-PCR 프로그램은, 예를 들어, 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 15초 동안 95℃의 40 사이클, 그 다음 1 동안 60℃이다.
특정 앰플리콘 축적과 연관된 형광 신호가 역치를 가로지르는 사이클 수 (CT로 칭함)를 결정하기 위해, 데이터는, 예를 들어, 7500 실시간 PCR 시스템 서열 검출 소프트웨어를 사용하는 것 대 비교 CT 상대적인 정량화 계산 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 출력은 발현 수준의 배수-변화로 표현된다. 일부 실시형태에서, 역치 수준은 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 역치 수준은 기준선 이상이지만 증폭 곡선의 지수 성장 영역 이내에 있도록 충분히 낮게 설정된다.
SALL4와 세레블론 사이의 세레블론 개질 화합물 유도된 상호작용은 당해 분야의 숙련가에게 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용을 분석하기위한 다양한 방법 및 접근법은 여기에서 기술하기에는 너무 많지만, 예시적인 방법이 아래에 간략하게 기재되어 있다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하기 위해 공-면역침강 (Co-IP) 및 풀-다운 검정 같은 물리적 방법이 사용된다. Co-IP는 단일 단백질의 면역침강 (IP)과 본질적으로 동일한 방식으로 수행되지만, 단, 항체에 의해 침전된 표적 단백질이 용해물로부터 결합 파트너/단백질 복합체를 함께-침전시키기 위해 사용된다. 상호작용하는 단백질은 지지체에 고정화된 항체에 의해 결합된 표적 항원에 결합된다. 면역침강된 단백질 및 그것의 결합 파트너는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 웨스턴 블랏 분석에 의해 통상적으로 검출된다.
풀-다운 검정은 방법론에서 공-면역침강에 유사하다. 이들 두 접근법 간의 하나의 차이는 co-IP는 단백질 복합체를 포착하기 위해 항체를 사용하는 반면, 풀-다운 검정은 "미끼" 단백질을 사용하여 미끼에 결합하는 용해물 내 임의의 단백질를 정제하기 위해 것이다.
다른 실시형태에서, 일시적 단백질-단백질 상호작용을 결정하기에 유용한 방법, 예를 들어, 세포 내의 단일 캐스케이드 또는 다른 대사 기능의 일부로서 단지 간단히 발생하는 이들 상호작용이 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하기 위해 본원에서 사용된다.
예를 들어, 가교결합 상호작용 단백질은 상호작용 복합체의 구성요소를 안정화시키거나 영구적으로 인접시키는 접근법이다. 상호작용의 구성요소가 공유적으로 가교결합되면, 다른 단계들 (예를 들어, 세포 용해, 친화도 정제, 전기영동 또는 질량 분광분석법)이 사용되어 원래의 상호작용 복합체를 유지하면서 단백질-단백질 상호작용을 분석할 수 있다. 동종이중작용성, 아민-반응성 가교결합제가 세포에 첨가되어 잠재적으로 상호작용하는 단백질을 함께 가교결합시킬 수 있으며, 이는 웨스턴 블랏팅에 의해 용해 후 분석될 수 있다. 가교결합제는 세포내 단백질을 가교결합시키기 위해 DSS와 같은 막 투과성일 수 있거나, 또는 이들은 세포-표면 단백질을 가교결합시키기 위해 BS3과 같은 비-막 투과성일 수 있다. 게다가, 일부 가교결합제는 가교결합를 역전시키기 위해 DSP 또는 DTSSP와 같은 환원제에 의해 절단될 수 있다. 대안적으로, SDA 생성물 또는 설포-SDA와 같은 광활성가능한 기를 함유하는 이종이중작용성 가교결합제는 특정 자극 후와 같이 발생할 수 있는 일시적 상호작용을 포착하는데 사용될 수 있다. 광활성화는 또한 광활성 아미노산 예컨대 L-광-류신 또는 L-광-메티오닌으로 대사 라벨링 후 또한 될 수 있다. 단백질 사이의 가교결합 부위는, 특히 MS-절단가능 가교결합제 예컨대 DSSO 또는 DSBU가 사용된 경우 질량 분광분석법을 사용하여 높은 정확성에 의해 맵핑될 수 있다.
특정 실시형태에서, 표지 운반 단백질 상호작용 분석이 본 방법에서 사용될 수 있다. 표지 운반은 표지된 가교결합제와 상호작용하는 분자 (즉, 미끼와 먹이 단백질)를 가교결합시키고 그 다음 미끼와 먹이 사이의 연결을 절단하여 표지가 먹이에 부착된 상태로 유지되도록 하는 것을 포함한다. 신규한 비-동위원소 시약 및 방법은 지속하여 이 기술이 임의의 연구자에 의해 보다 접근가능하고 간단히 수행하도록 한다.
다른 실시형태에서, 파-웨스턴 블랏 분석이 본 방법에서 사용된다. 파-웨스턴 블랏 분석에서, 단백질-단백질 상호작용은 각각 표적 단백질-특이적 항체 대신에 정제되고, 태깅된 유인 단백질로 전기영동된 단백질을 인큐베이팅함에 의해 검출된다. 문헌 ["Overview of Protein-Protein Interaction Analysis," Pierce Protein Methods (Thermo Fisher Scientific 웹사이트로부터 이용가능함)] 참고.
여전히 또 다른 실시형태에서, 두 단백질 사이의 상호작용을 결정하기 위해 형광 공명 에너지 전달　(FRET) 검정 (또는 공명 에너지 전달(RET) 검정 또는 전자적 에너지 전달　(EET) 검정)이 사용된다. 간단히, 본 검정은 에너지가 2개의 감광성 분자 사이에서 전달될 수 있다는 점에 기초한다. 초기에 그것의 전자적 여기 상태에서, 공여체 발색단은 비복사 쌍극자-쌍극자 커플링을 통해 에너지를 수용체 발색단으로 전달할 수 있다. 이 에너지 전달의 효율은 공여체와 수용체 사이의 거리의 여섯 번째 힘에 반비례하여, FRET가 거리의 작은 변화에 매우 민감하게 한다. FRET 효율의 측정은 두 형광단이 서로 특정한 거리 내에 있는지를 결정하는데 사용될 수 있고, 따라서 두 분자 사이의 상호작용을 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정 및/또는 확인하기 위해 다양한 방법의 조합이 사용될 수 있다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, SALL4 단백질의 유비퀴틴화 수준을 결정하기 위해 유비퀴틴화 검정이 사용된다. 당해 분야의 숙련가에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있고 본 개시내용에서 포함된다. 하나의 예시적인 유비퀴틴화 검정은 유비퀴틴 경로 표적을 조사하기 위한 시스바이오 바이오어세이스(Cisbio Bioassays)의 HTRF® 시약을 사용한다. HTRF 유비퀴틴 검정은 Eu3+-크립테이트 또는 바이오틴 중 어느 하나로 표지된 유비퀴틴을 사용한다. XL665 콘주게이트의 첨가시, HTRF 신호는 유비퀴틴화의 수준에 비례하고, 24시간 초과 동안 안정하게 유지된다. HTRF 유비퀴틴 검정은 효소적 및 HTRF 검출 단계들인, 두 가지 기본 상태를 갖는다. 효소적 단계에서, 표적 단백질은 유비퀴틴 효소 (E2 & E3) 및 Eu3+-표지된 유비퀴틴과 함께 인큐베이션된다. 반응은 E1 효소의 첨가로 개시한다. 검출 단계에서, 유비퀴틴화된 표적 단백질은 그 다음 효소적 반응을 중단시키기 위해 EDTA를 함유하는 XL665-표지된 시약의 첨가에 의해 검출된다. 또 다른 예시적인 유비퀴틴화 검정이 아래의 섹션 6.1에 제공된다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 암을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 스크리닝 방법은 암을 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 확인하기 위한 것이다. 본원에 제공된 암은 임의의 세레블론 개질 화합물에 의해 치료가능한 모든 암 유형을 포함한다. 본원에 제공된 암은 (여기에 제한되지는 않지만) 방광, 뼈, 혈액, 뇌, 유방, 자궁경부, 가슴, 결장, 자궁내막, 식도, 눈, 머리, 신장, 간, 림프절, 폐, 입, 목, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 피부, 위, 고환, 목, 및 자궁의 암을 포함한다. 특정 암은, 여기에 제한되지는 않지만, 진전된 악성종양, 아밀로이드증, 신경교세포종, 수막종, 혈관주위세포종, 다중 뇌 전이, 다형상 교모세포종, 교모세포종, 뇌간 신경아교종, 불량한 예후 악성 뇌종양, 악성 신경아교종, 재발성 악성 신경아교종, 역형성 별아교세포종, 역형성 희소돌기아교세포종, 신경내분비 종양, 직장 선암종, 3기 및 4기 결장직장암을 포함한 결장직장암, 절제불가능 결장직장 암종, 전이성 간세포 암종, 카포시 육종, 핵형 급성 골수모세포 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 피부 B-세포 림프종, 미만성 큰 B-세포 림프종, 저등급 여포성 림프종, 악성 흑색종, 악성 중피종, 악성 늑막 삼출 중피종 증후군, 복막 암종, 유두상 장액 암종, 부인과 육종, 연조직 육종, 경피증, 피부 혈관염, 랑게르한스 세포 조직구증, 평활근육종, 섬유이형성증 골화성 진행성, 호르몬 불응성 전립선암, 절제된 고위험 연조직 육종, 절제불가능 간세포 암종, 발덴스트롬의 거대글로불린혈증, 무증상 골수종, 무통성 골수종, 나팔관 암, 안드로겐 비의존성 전립선암, 안드로겐 의존성 IV기 비-전이성 전립선암, 호르몬-비민감성 전립선암, 화학요법-비민감성 전립선암, 유두상 갑상선 암종, 여포성 갑상선 암종, 수질 갑상선 암종, 및 평활근종을 포함한다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 암은 고형 암 또는 혈액 매개 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 암이다. 일부 실시형태에서, 고형 암은 전이성이다. 일부 실시형태에서, 고형 암은 간세포 암종, 흑색종, 전립선암, 난소암, 또는 교모세포종이다.
다른 실시형태에서, 상기 암은 혈액 매개 종양 또는 혈액학적 암이다. 특정 실시형태에서, 혈액 매개 종양은 전이성이다. 이러한 암은 골수종, 백혈병, 림프종 (비-호지킨 림프종), 및 호지킨 질환 (또한 소위 호지킨 림프종)을 포함한다. 일 실시형태에서, 골수종은 다발성 골수종 (MM)이다. 일부 실시형태에서, 백혈병은, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 T-세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병, 골수이형성증, 골수증식성 장애, 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수이형성 증후군 (MDS), 인간 림프친화성 바이러스-1형 (HTLV-1) 백혈병, 비만세포증, 또는 B-세포 급성 림프아구성 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 림프종은, 예를 들어, 미만성 큰 B-세포 림프종 (DLBCL), B-세포 면역모세포성 림프종, 작은 비-절단된 세포 림프종, 인간 림프친화성 바이러스-1형 (HTLV-1) 백혈병/림프종, 성인 T-세포 림프종, 주변 T-세포 림프종 (PTCL), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), AIDS-관련된 림프종, 여포성 림프종, 소림프구성 림프종, T-세포/조직구 풍부 큰 B-세포 림프종, 형질전환된 림프종, 원발성 종격동 (흉선) 큰 B-세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 리히터의 형질전환, 결절 변연부 림프종, 또는 ALK-양성 큰 B-세포 림프종이다. 일 실시형태에서, 혈액학적 암은, 예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 또는 변연부 림프종을 포함한 무통성 림프종이다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 암이 아닌 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용된다. 일부 이러한 실시형태 실시형태에서, 본 질환 또는 장애는 비-기형발생 치료, 예를 들어 비-기형발생인 세레블론 개질 화합물로 치료 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 기형발생성을 갖는 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, 기형발생성은 탈리도마이드로의 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 세레블론 상호작용을 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 세레블론 상호작용을 유도하는 세레블론 개질 화합물로의 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 세레블론 상호작용은 탈리도마이드로의 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 유비퀴틴화를 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 유비퀴틴화를 유도하는 세레블론 개질 화합물로의 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 유비퀴틴화는 탈리도마이드로의 치료에 비교하여 감소된다.
또 다른 실시형태에서, 질환 또는 장애는 SALL4 분해를 유도하지 않거나, 또는 기준 화합물로의 치료에 비교하여 감소된 SALL4 분해를 유도하는 세레블론 개질 화합물로의 치료를 요하는 질환 또는 장애이다. 일부 실시형태에서, 기준 화합물은 탈리도마이드이다. 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 포말리도마이드이다. 또 다른 실시형태에서, 기준 화합물은 레날리도마이드이다. 특정한 실시형태에서, SALL4 분해는 탈리도마이드로의 치료에 비교하여 감소된다.
본원에 제공된 세레블론 개질 화합물 (또는 치료 화합물)은 세레블론 및/또는 그것의 기질과 세레블론의 결합을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 세레블론에 직접적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 세레블론 단백질에서 구조적 변화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 세레블론 단백질의 기질 특이성 또는 친화도를 변화시킨다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 세레블론 단백질 표면의 특성을 변화시킨다.
일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 면역조절 화합물이다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 탈리도마이드, 또는 이의 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물; 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체이다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 레날리도마이드, 또는 이의 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물; 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체이다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 치료 화합물은 포말리도마이드, 또는 이의 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물; 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체이다.
특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물인 것으로 결정된 화합물을 스크리닝하거나 감소된 기형발생 효과를 갖는 하나 이상의 세레블론 개질 화합물을 선정 또는 동정하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 직접적으로 세레블론에 결합한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 세레블론에 화합물의 결합을 결정 또는 확인하는 것을 추가로 포함한다. 세레블론에 화합물의 결합은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 인간 세레블론에 결합한다. 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 마우스 세레블론에 결합한다. 다른 종으로부터의 세레블론에 결합하는 세레블론 개질 화합물이 또한 본 개시내용에 포함된다.
일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 세레블론 구조적 변화 (예를 들어, 세레블론의 화합물-결합 포켓 내)를 유도하거나 또는 그렇지 않으면 세레블론 표면의 특성을 변경시키는 것으로 결정되었다.
특정 실시형태에서, 화합물이 세레블론 개질 화합물인지 또는 화합물이 세레블론에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 방법은 (a) (i) 세레블론 및 기준 화합물의 제1 결정 구조를 획득하는 것, 및 (ii) 원자 좌표의 제1 세트를 획득하기 위해 x-선 회절에 의해 제1 결정의 3차원 구조를 결정하는 것; (b) (i) CRBN 및 화합물을 포함하는 제2 결정을 획득하는 것, 및 (ii) 원자 좌표의 제2 세트를 획득하기 위해 x-선 회절에 의해 제2 결정의 3차원 구조를 결정하는 것; 및 (c) 상기 원자 좌표의 제1 세트를 상기 원자 좌표의 제2 세트와 비교하는 것을 포함하며; 여기서 원자 좌표에서의 차이는 세레블론 구조적 변화를 유도하거나 또는 그렇지 않으면 세레블론 표면의 특성을 변경시키는 화합물인 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 원자 좌표의 제1 세트 및/또는 상기 원자 좌표의 제2 세트는 화합물 결합 도메인을 한정한다. 특정 실시형태에서, 원자 좌표에서의 차이는 원자 거리에서의 차이를 분석함에 의해 결정된다.
특정 실시형태에서, 기준 화합물은 세레블론 개질 화합물이 아니다. 특정 실시형태에서, 기준 화합물은 세레블론에 결합하지 않고, 따라서 세레블론 및 기준 화합물의 결정 구조는 세레블론의 형태가 화합물에 의해 변화되지 않은 대조 결정 구조를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 화합물이 세레블론 개질 화합물인지 또는 화합물이 세레블론에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 방법은 (a) 세레블론 및 기준 화합물의 제1의 3-차원 구조를 획득하는 것; (b) 세레블론 및 화합물의 제2의 3-차원 구조를 획득하는 것; 및 (c) 상기 제1의 3-차원 구조를 상기 제2의 3-차원 구조와 비교하는 것을 포함하며; 여기서 제1 및 제2의 3-차원 구조에서의 차이는 CRBN 구조적 변화를 유도하거나 또는 그렇지 않으면 CRBN 표면의 특성을 변경시키는 화합물인 것을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 기준 화합물은 세레블론 개질 화합물이 아니고 제1의 3-차원 구조는 화합물에 결합되지 않는 세레블론의 대조 구조이다.
실시형태에서, 구조적 변화 또는 변경은 x-선 결정학에 의해 평가된다. 다른 실시형태에서, 3-차원 구조는 NMR 분광법, 이중 분극화 간섭법, 진동 분광법, 또는 동결-전자 현미경검사에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 세레블론은 DDB1, Cul4, Roc1, 또는 이들의 임의의 조합에 추가로 결합된다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 검정 (예를 들어, 생물학적 검정)에서 세레블론 개질 화합물 (또는 선택된 화합물)을 분석, 특성규명 및 시험하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 세레블론 개질 화합물 (또는 선택된 화합물)의 치료적 효과를 시험하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 제공된 다양한 방법의 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 그것의 치료적 효과를 평가하기 위해 대상체에게 본원에 제공된 방법에 기초하여 선택 및/또는 특성규명된 세레블론 개질 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 질환 또는 장애, 예컨대 암을 치료하기 위해 대상체에게 본원에 제공된 방법에 기초하여 선택 및/또는 특성규명된 세레블론 개질 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 이전에 암에 대해 치료되었지만 표준 요법에 대해 비-반응하는 환자, 뿐만 아니라 이전에 치료되지 않은 환자를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본 발명은 또한, 비록 일부 질환 또는 장애가 특정 나이 군에서 보다 일반적이지만, 환자의 연령에 무관하게 환자를 치료하는 방법을 포괄한다. 본 발명은 문제가 되고 있는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 시도로 수술을 받은 환자뿐만 아니라 그렇지 않은 환자를 치료하는 방법을 추가로 포괄한다.
특정 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 암 환자는 이종 임상 징후 및 다양한 임상 결과를 가지기 때문에, 환자에게 제공된 치료는 환자의 예후에 따라 다양할 수 있다. 숙련된 임상의는 암이 있는 개별 환자를 치료하기 위해 효과적으로 사용될 수 있는, 특이적 이차 제제, 수술의 유형, 및 비-약물 기초 표준 요법의 유형을 과도한 실험과정 없이 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시형태에서, 화합물의 치료적 또는 예방적으로 유효량은 약 0.005 내지 약 1,000 mg/일, 약 0.01 내지 약 500 mg/일, 약 0.01 내지 약 250 mg/일, 약 0.01 내지 약 100 mg/일, 약 0.1 내지 약 100 mg/일, 약 0.5 내지 약 100 mg/일, 약 1 내지 약 100 mg/일, 약 0.01 내지 약 50 mg/일, 약 0.1 내지 약 50 mg/일, 약 0.5 내지 약 50 mg/일, 약 1 내지 약 50 mg/일, 약 0.02 내지 약 25 mg/일, 또는 약 0.05 내지 약 10 mg/일이다.
특정 실시형태에서, 치료적 또는 예방적으로 유효량은 약 0.1, 약 0.2, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 40, 약 45, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 또는 약 150 mg/일이다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 병태에 대한 치료 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물, 호변이성질체, 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 동위이성질체, 전구약물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체의 권고된 매일 용량 범위는, 예를 들어, 단일의 1일 1회 용량, 또는 하루 종일 분할 용량으로 제공된 약 0.1 mg 내지 약 50 mg/일의 범위내로 된다. 일부 실시형태에서, 투약은 약 1 mg 내지 약 50 mg/일의 범위이다. 다른 실시형태에서, 투약은 약 0.5 mg 내지 약 5　mg/일의 범위이다. 특정한 1일당 용량은 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 mg/일을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 권고된 개시 투약량은 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 50 mg/일일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 권고된 개시 투약량은 0.5, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mg/일일 수 있다. 용량은 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50　mg/일로 확대될 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료적 또는 예방적으로 유효량은 약 0.001 내지 약 100 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 50 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 25 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 9　mg/kg/일, 0.01 내지 약 8 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 7 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 6 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 4　mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 3 mg/kg/일, 약 0.01 내지 약 2 mg/kg/일, 또는 약 0.01 내지 약 1 mg/kg/일이다.
투여된 용량은 또한 mg/kg/일 이외의 단위로 표현될 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여에 대해 용량은 mg/m2/일 표현될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 제공된 대상체의 키 또는 체중 또는 둘 모두에 대해 용량을 mg/kg/일로부터 mg/m2/일로 전환하는 방법을 쉽게 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 65 kg 인간에 대한 1 mg/kg/일의 용량은 38 mg/m2/일에 대략 동등하다.
특정 실시형태에서, 투여된 세레블론 개질 화합물의 양은 약 0.001 내지 약 500 μM, 약 0.002 내지 약 200 μM, 약 0.005 내지 약 100 μM, 약 0.01 내지 약 50 μM, 약 1 내지 약 50 μM, 약 0.02 내지 약 25 μM, 약 0.05 내지 약 20　μM, 약 0.1 내지 약 20 μM, 약 0.5 내지 약 20 μM, 또는 약 1 내지 약 20 μM의 범위인, 정상 상태에서 화합물의 혈장 농도를 제공하기에 충분하다.
다른 실시형태에서, 투여된 세레블론 개질 화합물의 양은 약 5 내지 약 100 nM, 약 5 내지 약 50 nM, 약 10 내지 약 100 nM, 약 10 내지 약 50 nM, 또는 약 50 내지 약 100 nM의 범위인, 정상 상태에서 화합물의 혈장 농도를 제공하기에 충분하다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "정상 상태에서 혈장 농도"는 세레블론 개질 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물, 호변이성질체, 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 동위이성질체, 전구약물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체의 투여 기간 후 도달된 농도이다. 일단 정상 상태가 도달되면, 화합물의 혈장 농도의 시간-의존적 곡선 상에 소수의 피크 및 골이 있다.
특정 실시형태에서, 투여된 세레블론 개질 화합물의 양은 약 0.001 내지 약 500 μM, 약 0.002 내지 약 200 μM, 약 0.005 내지 약 100 μM, 약 0.01 내지 약 50 μM, 약 1 내지 약 50 μM, 약 0.02 내지 약 25 μM, 약 0.05 내지 약 20 μM, 약 0.1 내지 약 20 μM, 약 0.5 내지 약 20 μM, 또는 약 1 내지 약 20 μM의 범위인, 화합물의 최대 혈장 농도 (피크 농도)를 제공하기에 충분하다.
특정 실시형태에서, 투여된 세레블론 개질 화합물의 양은 약 0.001 내지 약 500 μM, 약 0.002 내지 약 200 μM, 약 0.005 내지 약 100 μM, 약 0.01 내지 약 50 μM, 약 1 내지 약 50 μM, 약 0.01 내지 약 25 μM, 약 0.01 내지 약 20 μM, 약 0.02 내지 약 20 μM, 약 0.02 내지 약 20 μM, 또는 약 0.01 내지 약 20 μM의 범위인, 화합물의 최소 혈장 농도 (골(trough) 농도)를 제공하기에 충분하다.
특정 실시형태에서, 투여된 세레블론 개질 화합물의 양은 약 100 내지 약 100,000 ng*hr/mL, 약 1,000 내지 약 50,000 ng*hr/mL, 약 5,000 내지 약 25,000 ng*hr/mL, 또는 약 5,000 내지 약 10,000 ng*hr/mL의 범위인, 화합물의 곡선하 면적 (AUC)을 제공하기에 충분하다.
치료되어 지는 질환 및 대상체의 상태에 의존하여, 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내, CIV, 시스템내 주입 또는 주사, 피하 주입, 또는 이식), 흡입, 비강, 질, 직장, 설하, 또는 국소 (예를 들어, 경피 또는 국소) 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 본원에 제공된 화합물은 단독으로 또는, 적합한 투약량 단위에서 각각의 투여 경로에 대해 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제, 캐리어, 아쥬반트, 및 비히클과 함께 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 비경구로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물은 정맥내로 투여된다.
세레블론 개질 화합물은 단일 용량 (예를 들어, 단일 볼러스 주입)으로, 또는 경시적으로 (예를 들어, 경시적으로 연속적 주입 또는 경시적으로 분할된 볼러스 용량) 전달될 수 있다. 세레블론 개질 화합물은 필요하면 반복적으로, 예를 들어, 환자가 안정한 질환 또는 퇴행을 경험할 때까지, 또는 환자가 질환 진행 또는 허용될 수 없는 독성을 경험할 때까지 투여될 수 있다. 예를 들어, 고형 암의 안정한 질환은 일반적으로 측정가능한 병변의 수직 직경이 마지막 측정으로부터 25% 또는 그 초과로 증가되지 않았다는 것을 의미한다 (Therasse et al., J. Natl . Cancer Inst ., 92(3):205-216 (2000)). 안정한 질환 또는 이의 결여는 당해 분야에서 알려진 방법 예컨대 환자 증상의 평가, 신체 검사, 및 X-선, CAT, PET, MRI 스캔, 또는 다른 통상적으로 허용된 평가 양식을 사용하여 이미지화된 종양의 가시화에 의해 결정된다.
본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 하루에 1회 (QD) 또는 다중 일일 용량 예컨대 매일 2회 (BID), 매일 3회 (TID), 및 매일 4회 (QID)로 분할하여 투여될 수 있다. 또한, 투여는 연속적 (즉, 연속 일 또는 모든 일 동안 매일) 또는, 예를 들어, 주기로 (즉, 일, 주, 또는 개월의 화합물 없는 휴식) 간헐적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "매일"은, 예를 들어, 기간 동안 치료 화합물이 각각의 일에 1 회 또는 1 회 초과로 투여된다는 것을 의미하도록 의도된다. 용어 "연속적"은 적어도 10일 내지 52주의 중단되지 않은 기간 동안 치료 화합물이 매일 투여된다는 것을 의미하도록 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "간헐적" 또는 "간헐적으로"는 규칙적 또는 불규칙한 간격으로 중단 및 개시하는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 세레블론 개질 화합물의 간헐적 투여는 주당 1 내지 6일 동안 투여, 주기로 투여 (예를 들어, 2 내지 8 연속적인 주 동안 매일 투여, 그 다음 최대 1 주 동안 무 투여로 휴지기), 또는 격일로 투여이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "사이클링"은 세레블론 개질 화합물이 휴지기를 갖지만 매일 또는 계속해서 투여된다는 것을 의미하도록 의도된다. 특정 실시형태에서, 휴지기는 치료 기간과 동일한 길이이다. 다른 실시형태에서, 휴지기는 치료 기간과 상이한 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사이클링의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주이다. 사이클링의 일부 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30 일의 기간 동안 매일 투여되고, 휴지기가 이어진다. 특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 4주 주기 중 5일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 4주 주기 중 10일의 기간 동안 매일 투여된다.
일부 실시형태에서, 투여 빈도는 약 일일 복용에서 약 매월 복용의 범위 내이다. 특정 실시형태에서, 투여는 하루에 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 격일 1회, 매주 2회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 또는 4주마다 1회이다. 일 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 하루에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 1일 2회 투여된다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 화합물은 1일 3회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 화합물은 1일 4회 투여된다.
특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 1일 내지 6개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 4주, 1주 내지 3주, 또는 1주 내지 2주 동안 1일당 1회 투여된다. 특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 1주, 2주, 3주, 또는 4주 동안 1일당 1회 투여된다. 일 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 1주 동안 1일당 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 세레블론 개질 화합물은 2주 동안 1일당 1회 투여된다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 3주 동안 1일당 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 4주 동안 1일당 1회 투여된다.
특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 약제학적 조성물에 제형화되고 약제학적 조성물의 형태로 환자에게 투여된다.
본원에 제공된 다양한 방법의 일부 실시형태에서, 본 방법은 치료 유효량의 제2 활성제 또는 지지 케어 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 제2 활성제는 대분자 (예를 들어, 단백질) 또는 소분자 (예를 들어, 합성 무기, 유기금속, 또는 유기 분자)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 활성제는 조혈 성장 인자, 사이토카인, 항암제 (예를 들어, 관문 억제제), 항생제, cox-2 억제제, 면역조절 제제, 면역억제제, 코르티코스테로이드, 암 항원에 특이적으로 결합하는 치료적 항체 또는 약리적으로 활성 돌연변이체, 또는 이의 유도체이다. 특정 실시형태에서, 항암제는 관문 억제제이다.
일부 실시형태에서, 제2 활성제는 세레블론 개질 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물, 호변이성질체, 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 동위이성질체, 전구약물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체의 투여와 연관된 역효과를 경감시킬 수 있는 소분자이다. 많은 소분자 제2 활성제는 세레블론 개질 화합물, 또는 이의 입체이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물, 호변이성질체, 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 동위이성질체, 전구약물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체와 함께 (예를 들어, 전, 후, 또는 동시에) 투여될 때 상승작용 효과를 제공할 수 있는 것으로 여겨진다. 소분자 제2 활성제의 예는, 여기에 제한되지는 않지만, 항암제, 항생제, 면역억제제, 및 스테로이드를 포함한다.
5.3 키트
본원에 제공된 임의의 방법을 수행하기 위한 키트가 또한 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, SALL4 (또는 그것의 변이체)의 수준을 결정하기 위한 제제를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 키트는 세레블론 개질 화합물로 치료 후 SALL4의 분해를 결정하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, SALL4 (또는 그것의 변이체)의 유비퀴틴화를 결정하기 위한 제제를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 키트는 세레블론 개질 화합물로 치료 후 SALL4의 유비퀴틴화를 결정하기 위한 것이다.
여전히 또 다른 양태에서, 세레블론 또는 이의 단편과 SALL4 또는 이의 단편 사이의 상호작용을 결정하기 위한 제제를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 키트는 세레블론 개질 화합물로 치료 후 세레블론 또는 이의 단편과 SALL4 또는 이의 단편 사이의 상호작용을 결정하기 위한 것이다.
예를 들어, 키트는 SALL4의 존재 (또는 부재) 또는 양을 검출할 수 있는 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 항체, 표지된 화합물 또는 다른 제제)를 포함할 수 있다. 본 키트는 또한 지침을 포함할 수 있다.
프로브는 유전자 서열, 핵산 생성물, 또는 폴리펩타이드 생성물에 구체적으로 혼성화할 수 있다. 개시된 키트는 또한, 예를 들어, 완충제, 보존제, 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 검출가능한 제제 (예를 들어, 효소 또는 기질)를 검출하기 위해 필요한 구성요소를 포함할 수 있다. 키트는 또한 함유된 테스트 샘플에 분석 및 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는 일반적으로 개별 용기 내에 봉입되고, 모든 다양한 용기는 사용 지침과 함께 단일 패키지 내에 있다.
본원에 제공된 다양한 키트의 특정 실시형태에서, 키트는 또한 샘플을 얻기 위한 도구 또는 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 도구 또는 제제는 종양 생검, 결절 생검, 혈액, 또는 골수, 비장, 간, 뇌, 또는 유방으로부터의 생검으로부터 샘플을 얻기 위한 것이다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 세포 배양, 세포주, 조직, 장기, 소기관, 생체액, 혈액 샘플, 소변 샘플, 또는 피부 샘플일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 키트는 SALL4의 핵산 (예를 들어, mRNA)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 세정 용액을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 혼성화 검정을 수행하기위한 시약, 핵산 단리 또는 정제 수단, 검출 수단뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 키트를 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 키트는 재택 사용, 임상적 사용 또는 연구 사용으로 맞춤구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, SALL4의 단백질 수준을 검출하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 키트는 특이 단백질을 인식하는 항체로 코팅된 딥스틱, 세정 용액, 검정을 수행하기 위한 시약, 단백질 단리 또는 정제 수단, 검출 수단뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 키트를 사용하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 키트는 재택 사용, 임상적 사용 또는 연구 사용으로 맞춤구성될 수 있다.
이러한 키트는, 예를 들어, 딥스틱, 멤브레인, 칩, 디스크, 테스트 스트립, 필터, 마이크로구형체, 슬라이드, 다중-웰 플레이트 또는 광섬유를 이용할 수 있다. 키트의 고형 지지체는, 예를 들어, 플라스틱, 실리콘, 금속, 수지, 유리, 멤브레인, 입자, 침전물, 겔, 폴리머, 시트, 구형체, 다당류, 모세관, 필름, 플레이트, 또는 슬라이드일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 키트는 고형 지지체, 본 지지체에 부착된 핵산으로, 여기서 상기 핵산은 핵산 중 적어도 20, 50, 100, 200, 350, 또는 그 초과 염기에 상보성인 핵산, 및 생물학적 샘플에서 유전자의 발현을 검출하기 위한 수단을 포함한다.
특정한 실시형태에서, 약제학적 또는 검정 키트는 용기 안에 화합물 또는 이의 약제학적 조성물을 포함하고, 하나 이상의 용기 안에 핵산을 단리하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 약제학적 또는 검정 키트는 용기 안에 화합물 또는 약제학적 조성물을 포함하고, 하나 이상의 용기 안에 RT-PCR, qRT-PCR, 심화 서열분석, 또는 마이크로어레이를 수행하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 마이크로어레이, 유세포측정, 또는 면역형광에 의해 단백질의 발현을 검출하기 위한 수단을 이용한다. 다른 실시형태에서, 단백질의 발현은 ELISA-기반 방법론 또는 당해 분야에서 알려진 다른 유사한 방법에 의해 측정된다.
또 다른 특정한 실시형태에서, 약제학적 또는 검정 키트는 용기 안에 화합물 또는 이의 약제학적 조성물을 포함하고, 하나 이상의 용기 안에 단백질을 단리하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 약제학적 또는 검정 키트는 용기 안에 화합물 또는 약제학적 조성물을 포함하고, 하나 이상의 용기 안에 유세포측정 또는 ELISA를 수행하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 유전자 산물의 존재도를 측정하는데 필요한 물질을 공급하는 SALL4를 측정하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 RNA 또는 단백질을 측정하기 위해 필요한 물질 및 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 마이크로어레이를 포함하며, 상기 마이크로어레이는 하나 이상의 유전자 산물에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 및/또는 DNA 및/또는 RNA 단편으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 RNA 생성물 또는 RNA 생성물의 cDNA 복제 중 어느 하나의 PCR을 위한 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 PCR을 위한 프라이머뿐만 아니라 qPCR을 위한 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 다수의 프라이머 및 다수의 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 일부 프로브는 다수의 유전자 산물을 동시에 측정하는 것을 허용하도록 상이한 형광단을 갖는다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 RNA로부터 cDNA를 생성하기 위한 물질 및 시약을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 단백질 생성물에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 생물학적 샘플로부터 RNA 및/또는 단백질을 분리하기 위한 물질 및 시약을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트는 생물학적 샘플로부터 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하기위한 물질 및 시약을 포함할 수 있다.
핵산 마이크로어레이 키트의 경우, 본 키트는 일반적으로 고형 지지체 표면에 부착된 프로브를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 프로브는 올리고뉴클레오타이드 또는 150개의 뉴클레오타이드 내지 800 개의 뉴클레오타이드의 범위인 프로브를 포함한 더 긴 프로브일 수 있다. 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 프로브는 유전자 산물 중 하나 이상에 대해 특이적이다. 마이크로어레이 키트는 검정을 수행하기 위한 지침 및 검정을 수행하여 생성된 데이터를 해석 및 분석하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
정량적 PCR의 경우, 키트는 일반적으로 특정 핵산 서열에 특이적인 사전-선택된 프라이머를 포함한다. 정량적 PCR 키트는 또한 핵산을 증폭하기에 적합한 효소 (예를 들어, Taq 중합효소와 같은 중합효소), 데옥시뉴클레오타이드 및 증폭 반응에 필요한 완충제를 포함할 수 있다. 정량적 PCR 키트는 또한 상태와 관련되거나 이를 나타내는 핵산 서열에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다. 프로브는 형광단으로 표지되거나 되지 않을 수 있다. 프로브는 켄쳐 분자로 표지되거나 되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 정량적 PCR 키트는 또한 효소 (예를 들어, 역전사효소 예컨대 AMV, MMLV, 및 기타 동종의 것)를 포함한, 역-전사 RNA에 대해 적합한 구성요소 및 역전사 반응을 위해 필요한 데옥시뉴클레오타이드 및 완충제와 함께 역전사를 위한 프라이머를 포함한다. 정량적 PCR 키트의 각각의 구성요소는 일반적으로 그 자체의 적합한 용기 안에 있다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각각의 개별 시약, 효소, 프라이머 및 프로브에 적합한 별개의 용기를 포함한다. 또한, 정량적 PCR 키트는 반응을 수행하기 위한 지침 및 반응을 수행하여 생성된 데이터를 해석 및 분석하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
항체-기반 키트의 경우, 본 키트는, 예를 들어: (1) 관심 있는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 결합하는 (고형 지지체에 부착될 수 있거나 부착되지 않을 수 있는) 제1 항체; 및, 선택적으로, (2) 제1 항체 또는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 결합하고, 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지, 방사성 동위원소, 또는 효소)에 접합되는 제2의, 상이한 항체를 포함할 수 있다. 본 항체-기반 키트는 또한 면역침강을 수행하기 위한 비드를 포함할 수 있다. 항체-기반 키트의 각각의 구성요소는 일반적으로 그 자체의 적합한 용기 안에 있다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각각의 항체 및 시약에 적합한 별개의 용기를 포함한다. 또한, 항체-기반 키트는 검정을 수행하기 위한 지침 및 검정을 수행하여 생성된 데이터를 해석 및 분석하기 위한 방법을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 제공된 키트는 세레블론 개질 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 입체이성질체, 동위이성질체, 전구약물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체를 포함한다. 키트는 비제한적으로 본원에 개시된 것들을 포함하여, 추가의 활성제를 더 포함할 수 있다.
본원에 제공된 키트는 화합물을 투여하기 위해 사용되는 디바이스를 더 포함할 수 있다. 이러한 디바이스의 예는, 여기에 제한되지는 않지만, 주사기, 드립 백, 패치, 및 흡입기를 포함한다.
키트는 이식을 위한 세포 또는 혈액뿐만 아니라 하나 이상의 활성 성분을 투여하기 위해 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 비히클을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분이 비경구 투여를 위해 반드시 재구성되어야 하는 고체 형태로 제공된 경우, 키트는 활성 성분이 비경구 투여에 적합한 미립자-유리 멸균 용액을 형성하도록 용해될 수 있는 적합한 비히클의 밀봉된 용기를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 비히클의 예는, 여기에 제한되지는 않지만, 주사용 물 USP; 수성 비히클 (예컨대, 비제한적으로, 염화나트륨 주입, 링거 주입, 덱스트로스 주입, 덱스트로스 및 염화나트륨 주입, 및 락테이트화된 링거 주입); 수-혼화성 비히클 (예컨대, 비제한적으로, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜); 및 비-수성 비히클 (예컨대, 비제한적으로, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 참께 오일, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트)을 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 키트의 특정 실시형태에서, 고상 지지체는 단백질 정제, 샘플 라벨링, 또는 고상 검정을 수행하기 위해 사용된다. 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 적합한 고상의 예는 비드, 입자, 콜로이드, 단일 표면, 튜브, 다중-웰 플레이트, 미세적정 플레이트, 슬라이드, 멤브레인, 겔, 및 전극을 포함한다. 고상이 미립자 물질 (예를 들어, 비드)인 경우, 일 실시형태에서, 이것은 고상 지지체의 평행한 가공을 허용하도록 다중-웰 플레이트의 웰들 안에 분포된다.
개시된 키트는 유전적 구성요소의 존재 또는 부재 및 단백질의 존재 또는 부재 또는 이들의 수준을 동시에 측정하기에 유용한 다중 키트일 수 있다.
5.4 화합물
본원에 제공된 화합물은 세레블론 개질 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 CRBN E3 유비퀴틴-리가제 복합체를 직접적으로 또는 간접적으로 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 세레블론에 직접적으로 부착하고 CRBN 단백질에서 구조적 변화를 유도할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 세레블론 개질 화합물은 CRBN E3 유비퀴틴-리가제 복합체에서의 다른 서브유닛에 직접적으로 결합할 수 있다.
본원에 제공된 방법에 대한 화합물은, 여기에 제한되지는 않지만, 특정 암을 포함한 몇 가지 유형의 인간 질환을 치료하는데 유용할 수 있는 화합물의 군인, 면역조절 화합물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "면역조절 화합물" 또는 "면역조절 제제"는 LPS 유도된 단핵구 TNF-α, IL-1ß, IL-12, IL-6, MIP-1α, MCP-1, GM-CSF, G-CSF, 및 COX-2 생산을 억제하는 특정한 작은 유기 분자를 포괄할 수 있다. 특정한 이론에 의한 제한됨 없이, 본원에 개시된 면역조절 화합물에 의해 발휘된 생물학적 효과 중 하나는 골수 세포 TNF-α 생산의 감소이다. 본원에 개시된 면역조절 화합물은 TNF-α mRNA의 분해를 증진할 수 있다. 또한, 이론에 의한 제한됨 없이, 본원에 개시된 면역조절 화합물은 또한 T 세포의 강력한 공동자극인자일 수 있고 용량 의존 방식으로 세포 증식을 극적으로 증시킬 수 있다. 본원에 개시된 면역조절 화합물은 또한 CD4+ T 세포 서브셋 상에서보다 CD8+ T 세포 서브셋 상에서 더 큰 공통자극 효과를 가질 수 있다. 또한, 본 화합물은 골수성 세포 반응에 대해 항-염증성 특성을 가질 수 있지만, 여전히 T 세포를 효율적으로 공동-자극하여 더 많은 양의 IL-2, IFN-γ를 생성하고, T 세포 증식 및 CD8+ T 세포 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 또한, 특정한 이론에 의한 제한됨 없이, 본원에 개시된 면역조절 화합물은 사이토카인 활성화를 통해 간접적으로 및 자연 살해 ("NK") 세포 및 자연 살해 T ("NKT") 세포 상에 직접적으로 둘 모두로 작용할 수 있고, NK 세포의 능력을 증가시켜 유익한 사이토카인 예컨대, 비제한적으로, IFN-γ를 생산하고 NK 및 NKT 세포 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다.
본원에 제공된 예시적인 면역조절 화합물은 여기에 제한되지는 않지만 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드, 또는 이들의 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물; 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 공-결정, 포접체, 또는 다형체를 포함한다.
본원에 개시된 다양한 면역조절 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 함유하고, 거울상이성질체의 라세미 혼합물 또는 부분입체이성질체의 혼합물로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 형태의 사용뿐만 아니라 이들 형태의 혼합물의 사용이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 동등하거나 동등하지 않은 양의 특정 면역조절 화합물의 거울상이성질체를 포함하는 혼합물이 사용될 수 있다. 이들 이성질체는 표준 기술 예컨대 키랄 칼럼 또는 키랄 분할제를 사용하여 비대칭으로 합성 또는 분할될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977)]; 문헌 [Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)]; 및 문헌 [Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972)] 참고.
기재된 모든 화합물은 상업적으로 구매되거나 본원에 개시된 특허 또는 특허 공보에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 광학적으로 순수한 화합물은 공지된 분할제 또는 키랄 칼럼뿐만 아니라 다른 표준 합성 유기 화학 기술을 사용하여 비대칭적으로 합성 또는 분할될 수 있다.
본원에 제공된 다양한 조성물 및 방법의 특정 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 본원에 제공된 면역조절 화합물이다. 다른 실시형태에서, 세레블론 개질 화합물은 면역조절 화합물이 아니다.
도시된 구조와 그 구조에 주어진 명칭 사이에 불일치가 있는 경우, 도시된 구조에 더 많은 가중치가 부여된다는 점에 유의해야 한다. 또한, 구조 또는 구조의 일부의 입체화학이 예를 들어 굵은선 또는 점선으로 표시되지 않는 경우, 구조 또는 구조의 일부는 그의 모든 입체이성질체를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
예를 들어, 하나 이상의 시약, 예컨대, 비제한적으로, 핵산 프라이머, 고형 지지체, 및 기타 동종의 것과 관련하여 상기-열거된 실시형태의 임의의 조합이 또한 본원에 제공된 다양한 방법 및/또는 키트 중 어느 하나에 관계하여 고려된다는 점에 유의한다.
본 발명의 특정 실시형태는 하기 비-제한적인 예에 의해 설명된다.
6. 실시예
하기 실시예는 달리 상세히 기재된 경우를 제외하고는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려지고 일상적인 표준 기술을 사용하여 수행된다. 실시예는 단지 설명적인 것으로 의도된다.
6.1 방법
단백질 발현 및 정제
MBP-융합된 WT 및 돌연변이체 단백질이 2XYT 배지 (Teknova)를 사용하여 E.콜리 BL21 (DE3) 스타(Star) 세포 (Life Technologies)에서 발현되었다. 세포는 16℃에서 18시간 동안 OD600 　0.6에서 유도되었다. 세포는 정제를 위해 펠릿화되고, 냉동되고, 해동되고, 그리고 150 μM 아연 아세테이트, 40,000 U 벤조나제 (Novagen), 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (San Diego Bioscience)을 함유하는 B-PER 박테리아 단백질 추출 완충제 (Thermo Fisher)에서 재현탁되었다. 용해물은 비드가 세정되기 전에 4℃에서 1시간 동안 아밀로스 수지 (NEB)로 인큐베이션되었다. 단백질은 200 mM NaCl, 50 mM 트리스 pH 7.5, 3 mM TCEP, 10% 글리세롤, 150 μM 아연 아세테이트, 및 10 mM 말토스를 함유하는 완충제로 용출되었다.
세레블론 - DDB1 정제
ZZ-도메인-6xHis-트롬빈-태깅된 인간 세레블론 (아미노산 40 - 442) 및 전장 인간 DDB1이 50 uM 아연 아세테이트의 존재에서 ESF921 배지 (Expression Systems)에서 SF9 곤충 세포에서 공-발현되었다. 세포는 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 2 mM TCEP, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (San Diego Bioscience), 및 40,000 U 벤조나제 (Novagen)를 함유하는 완충제에서 재현탁되었고, 30초 동안 초음파처리되었다. 용해물은 30,000 rpm에서 30분 동안 고속 회전에 의해 정화되었고, 정화된 용해물은 Ni-NTA 친화도 수지 (Qiagen)로 1시간 동안 인큐베이션되었다. 복합체는 500 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용출되었고, 그리고 밤새 트롬빈 절단 (Enzyme Research)에 의해 제거된 ZZ-도메인-6xHis 태그는 10 mM 이미다졸 완충제에 투석으로 조합되었다. 절단된 융출물은 Ni-NTA 친화도 수지 (Qiagen)로 인큐베이션되었고, 통과액은 ANX HiTrap 이온 교환 칼럼 (GE Healthcare) 상에서 추가의 정제를 위해 200 mM NaCl에 희석되었다. ANX 칼럼은 10 칼럼 부피 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl, 3 mM TCEP와, 이어서 10 칼럼 부피의 50 mM 비스-트리스 pH 6.0, 200 mM NaCl, 3 mM TCEP로 세정되었고, 세레블론-DDB1 피크는 210 mM NaCl에서 용출되었다. 이 피크는 수집되었고 10 mM HEPES pH 7.0, 240 mM NaCl, 및 3 mM TECP를 함유하는 완충제에서 Sephacryl S-400 16/60 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다. 세레블론-DDB1 복합체는 30 mg/mL로 농축되었다.
전장 인간 세레블론, 전장 마우스 세레블론, 및 전장 토끼 세레블론이 50 uM 아연 아세테이트의 존재에서 ESF921 배지에서 SF9 곤충 세포 내에서 전장 인간 DDB1과 함께 공-발현되었다. 세포는 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 2 mM TCEP, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (San Diego Bioscience), 및 40,000 U 벤조나제 (Novagen)를 함유하는 완충제에서 재현탁되었고, 30초 동안 초음파처리되었다. 용해물은 30,000 rpm에서 30분 동안 고속 회전에 의해 정화되었고, 정화된 용해물은 Ni-NTA 친화도 수지 (Qiagen)로 1시간 동안 인큐베이션되었다. 복합체는 500 mM 이미다졸을 함유하는 완충제로 용출되었고, 그리고 밤새 트롬빈 절단 (Enzyme Research)에 의해 제거된 ZZ-도메인-6xHis 태그는 10 mM 이미다졸 완충제에 투석으로 조합되었다. 절단된 융출물은 Ni-NTA 친화도 수지 (Qiagen)로 인큐베이션되었고, 통과액은 10 mM HEPES pH 7.0, 240 mM NaCl, 및 3 mM TECP를 함유하는 완충제에서 Sephacryl S-400 16/60 칼럼 (GE Healthcare) 상에서 추가의 정제를 위해 200 mM NaCl에 희석되었다.
아연 핑거 단백질 정제
개별적으로 정제된 MBP-융합된 아연 핑거 도메인에 대한 도메인 경계는 항상 텍스트에서 명명된 바와 같이 아연 핑거 도메인에 대해 5개 아미노산 N-말단 및 1개 아미노산 C-말단을 포함한다 (모두 Uniprot Isoform 1로부터 넘버링함). MBP-융합된 WT 및 돌연변이체 SALL4, Ikaros, 및 ZFP91 아연 핑거 도메인 단백질은 2XYT 배지 (Teknova)를 사용하여 E. 콜리 BL21 (DE3) 스타(Star) 세포 (Life Technologies)에서 발현되었다. 세포는 16℃에서 18시간 동안 OD600 　0.6에서 유도되었다. 세포는 정제를 위해 펠릿화되고, 냉동되고, 해동되고, 그리고 150 μM 아연 아세테이트, 40,000 U 벤조나제 (Novagen), 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (San Diego Bioscience)을 함유하는 B-PER 박테리아 단백질 추출 완충제 (Thermo Fisher)에서 재현탁되었다. 용해물은 비드가 세정되기 전에 4℃에서 1시간 동안 아밀로스 수지 (NEB)로 인큐베이션되었다. 단백질은 200 mM NaCl, 50 mM 트리스 pH 7.5, 3 mM TCEP, 10% 글리세롤, 150 μM 아연 아세테이트, 및 10 mM 말토스를 함유하는 완충제로 용출되었다.
시험관내 유비퀴틴화 검정
정제된 E1, E2, 유비퀴틴, Cul4A-Rbx1, 세레블론-DDB1, 및 GSPT1 단백질이 시험관내 MBP-융합된 WT 및 돌연변이체 단백질의 유비퀴틴화를 재구성하기 위해 사용되었다. 말토스 친화도 수지 (NEB)에 의해 정제된 기질 단백질은 30 uM의 근사치 농도에서 인큐베이션되었다. 유비퀴틴화 구성요소를 간단히 기재했다: 인간 세레블론-DDB1 (세레블론 아미노산　 40-442 및 전장 DDB1) 및 6Xhis-DDB1 단독이 50 μM 아연 아세테이트의 존재에서 SF9 곤충 세포에서 공-발현되었고, 니켈 친화도 수지 (Qiagen), HiTrap ANX 칼럼 이온 교환 (GE Healthcare), 및 Sephacryl 400 16/60 크기 배제 크로마토그래피 (GE Healthcare)에 의해 정제되었다. 인간 전장 Cul4A 및 Rbx1은 SF9 곤충 세포에서 공-발현되었고 니켈 친화도 수지 및 Superdex 200 16/60 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 재조합 인간 Ube1 E1 (E-305), UbcH5a E2 (E2-616), 및 유비퀴틴 (U-100H)은 R&D 시스템으로부터 구매되었다. 구성요소는 유비퀴틴화 검정 완충제 (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2)에서 표시된 바와 같이 100 μM 화합물과 함께 또는 없이, 10 mM ATP, 1 μM Ube1, 25 μM UbcH5a, 200 μM Ub, 1 μM Cul4-Rbx1, 25 μM GSPT1, 및 1 μM 세레블론-DDB1의 최종 농도로 혼합되었다. 30분 동안 E1, E2, ATP 및 유비퀴틴의 사전 인큐베이션, 및 실온에서 5분 동안 MBP-기질, CRBN-DDB1, Cul4-Rbx1, 및 화합물의 별도의 사전-인큐베이션 후, 2개의 사전-인큐베이션을 혼합함에 의해 유비퀴틴화 반응이 개시되었다. 반응물은 2시간 동안 30 C에서 인큐베이션되었고 SDS-PAGE에 의한 분리와 이어서 쿠마씨 염색 또는 면역블랏 분석이 이어졌다.
인간 iPS 세포 배양
인간 iPS 세포주 ACS-1019 및 ACS-1011 (건강한 공여체로부터 유래됨)은 ATCC로부터 수득되었다. hiPSC는 제조자의 지침에 따라 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션된 박층의 매트리겔 (BD Biosciences)로 코팅된 세포 배양판에서 mTESR-1 medium (Stem Cell Technologies)에서 유지되었다. 세포는 유리 피펫으로 기계적인 통과를 통하여 그리고 2 내지 3일 마다 디스파제(Dispase) 또는 액큐타제(Accutase)로 효소적으로 소화로 분할되었다.
CRISPR - 매개된 세레블론 녹아웃
인간 iPSC, ACS-1019가 CRISPR-Cas9를 발현하는 렌티바이러스 벡터 및 세레블론을 표적화하는 작은 가이드 RNA로 4일 동안 형질도입되었다. 수득한 콜로니는 증폭되었고 항-CRBN65 항체 (Celgene)로 면역블랏 분석에 의해 세레블론 녹아웃에 대해 선별되었다.
실시간 PCR
총 RNA는 제조자의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트(Mini Kit) (Qiagen)를 사용하여 인간 iPS 세포로부터 추출되었고, SuperScript™ IV 제1-가닥 합성 시스템 (ThermoFisher)을 사용하여 랜덤 프라이머로 제1-가닥 cDNA 안으로 역-전사되었다. 실시간 PCR은 SALL4 (#4351372), POU5F1(#4331182) 및 GAPDH (#4326317E)에 대해 TaqMan 유전자 발현 검정 프로브를 갖는 ViiA 7 실시간 PCR 시스템 (ThermoFisher)을 사용하여 3중으로 수행되었다.
플라스미드
인간 SALL4의 코딩 서열이 Genscript에 의해 시험관내 합성되었고 BP 재조합을 통해 pDONR223 안으로 서브클로닝되어 pDONR223-SALL4를 생성하였다. 그런 다음, 중첩 PCR을 통한 부위 지향된 돌연변이유발이 수행되어 pDONR223-SALL4-G416A 및 pDONR223-SALL4-G600A를 생성하였다. 다음으로, pDONR223-SALL4, pDONR223-SALL4-G416A 및 pDONR223-SALL4-G600A는 게이트웨이 재조합을 통해 pLOC-EF1α-3xHA-게이트웨이-IRES-Pur 안으로 셔틀되어 pLOC-EF1α-3xHA-SALL4-IRES-Pur, pLOC-EF1α-3xHA-SALL4-G416A-IRES-Pur 및 pLOC-EF1α-3xHA-SALL4-G600A-IRES-Pur를 생성하였다. 인간 CRBN의 코딩 서열이 인간 cDNA 클론 (Dharmacon)으로부터 PCR-증폭되었고, BP 재조합을 통해 pDONR223 안으로 셔틀되어 pDONR223-CRBN을 생성하였다. 그런 다음, pDONR223-CRBN이 pDEST27 (Invitrogen) 안으로 셔틀되어 pDEST27-CRBN을 생성하였다.
렌티바이러스 생산 및 감염
렌티바이러스 플라스미드는 Lipofectamine® 2000을 사용하여 lenti-X-293 세포 (Clontech) 안으로 제2 세대 패키징 시스템 (ABM)으로 공동형질감염되었다. 16시간의 인큐베이션 후, 배지는 20% FBS로 보충된 신선한 DMEM 배지로 변화되었다. 형질감염 2일 후, 바이러스 상청액이 수집되었고 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 통해 정화되고 그 다음 0.45 마이크론 셀룰로스 아세테이트 또는 나일론 필터 단위를 통해 여과되었다. 세포는 ~0.5의 감염의 다중도에서 렌티바이러스로 감염되었다. 12시간 후, 바이러스 상청액이 제거되고 완전한 배양 배지가 세포에 첨가되었다. 48시간 이후, 세포는 1-2 μg/mL 퓨로마이신 또는 10-20 μg/mL 블라스티사이딘으로 추가의 3일 동안 인큐베이션되어 렌티바이러스 벡터가 안정적으로 통합된 세포를 선택하였다.
CRBN 및 SALL4의 공동- 면역침강
Lenti-X-293 세포는 GST-CRBN을 인코딩하는 pDEST27-CRBN, 및 블라스티사이딘 내성 유전자를 함유하는 pLOC 공(empty) 벡터 (Thermo Fisher)로 공동형질감염되었다. 형질감염 2일 후, 세포는 트립신화되고 희석을 한정하여 96-웰 플레이트 안으로 씨딩되었다. 2주 동안 블라스티사이딘 (20 μg/mL)으로 셀렉틴 후, 단일 클론이 선택되고, 팽창되고 항-CRBN65 항체로 면역블랏 분석을 통하여 GST-CRBN의 과발현에 대해 선별되었다. 다음으로, GST-CRBN 인간을 안정적으로 발현하는 lenti-X-293 세포가 SALL4 야생형 및 변이체를 발현하는 렌티바이러스로 감염되어 GST-CRBN 및 SALL4를 안정적으로 발현하는 lenti-x-293 세포를 생성하였다. 그런 다음, 세포는 1 μM MLN4924의 존재에서 8시간 동안 DMSO 또는 40 μM 탈리도마이드로 처리되었고, 완충제 B [50 mM 트리스 (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10% 글리세롤, 1 X 완전한 울트라 프로테아제 억제제 (Roche), 및 1 X PhosphoSTOP (Roche)]에서 용해되었다. 전체의 세포 추출물은 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 통해 정화되었고, 이어서 항-HA 친화도 수지 (Roche)로 4℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 완충제 B로 6회 동안 항-HA 수지를 세정한 후, 항-HA 면역침전물이 90℃에서 5분 동안 2 x LDS 장입 완충제에서 비등시킴에 의해 용출되고 그 다음 면역블랏 분석을 거쳤다.
세포 SALL4의 분해
GST-CRBN 및 SALL4 변이체를 안정적으로 발현하는 Lenti-x-293 세포는 DMSO 또는 40 μM 탈리도마이드로 16시간 동안 처리되었다. 세포는 그 다음 빙랭 1 X PBS로 2회 세정되고, 완충제 A [50 mM 트리스. CL, 150 mM NaCl, 1% 트리톤-x 100, 완전한 프로테아제 억제제 정제 (Roche), 포스파타제 억제제 정제 (Roche)]에 용해되었다. 전체의 세포 추출물이 수확되고 면역블랏 분석을 거쳤다.
수컷 뉴질랜드 백색 토끼에서 탈리도마이드 치료
수컷 뉴질랜드 백색 토끼는 고환 퇴행을 조사하기 위해 56일 동안 30 또는 150 mg/kg/일 중 어느 하나로 비히클 (탈이온수 내 1% 카복시메틸셀룰로스), 또는 탈리도마이드로 처리되었다. 고환은 마지막 복용량 24시간 후 수집되었고, 10% NBF에 고정되고, 가공되고, 파라핀에 포매되고 면역조직화학을 위해 4 마이크론으로 절단되었다.
생체내 토끼 배아 연구
모든 동물은 IACUC 승인된 절차에 따라 수용되고 사육되었다. 토끼는 처리되지 않은 상태로 있거나 (시점당 n=4) 또는 GD7에서 시작하여 1일당 180mg/kg의 탈리도마이드 (시점당 n=5)를 투여받았다. 탈리도마이드 기형발생성 연구 (Christian MS, birth defect research, 2007)에서 이전에 보고된 발견에 기초하여 용량 수준과 민감한 임신 기간이 선택되었다.
초기 임신 (GD 8-12) 동안 대조군과 탈리도마이드 처리된 토끼에서 이식 빈도에서 유의미는 없었다. Thal 처리된 그룹에 대한 이식 부위의 평균 수는 8일차, 9일차, 10일차, 11일차 및 12일차 각각에 대해 8.2, 10.4, 8.75, 7.4, 및 8.8이었다. 대조군 그룹에 대한 이식 부위의 평균 수는 8일차, 9일차, 10일차, 11일차 및 12일차 각각에 대해 8.5, 7.25, 7, 9.5, 및 7.5였다.
배아 수집 동안 재흡수 부위, 배아 사망률 및 총 관찰이 기록되었다. 배아 사망률은 심장박동의 부재에 기초되었다. 대조군에는 재흡수 부위 또는 배아 및 태반 비정상이 없었다. 탈리도마이드 처리된 토끼에서 GD9, 10, 11 및 12에서 재흡수 및 배아 사망률이 주목되었고, GD12에서 가장 확연하였다. 8일차에, 5마리 토끼로부터 41개 이식 부위 모두가 모두 정상으로 나타났다. 9일차에, 1/5 토끼가 영향을 받았으며 총 52개 이식 부위 중 1개 재흡수 부위가 있었다. 10일차에, 1/5 토끼가 영향을 받았으며 총 38개 이식 부위 중에서 1개 재흡수 부위가 있었다. 11일차에, 37개 이식 부위 중 2개 재흡수 부위 (5.41%) 및 2개 죽은 배아 (5.41%)로, 3/5 토끼가 영향을 받았다. 12일차에, 45개 이식 부위 중 3개 재흡수 부위 (6.98%) 및 11개 죽은 배아 (25.58%)로, 5/5 토끼가 영향을 받았다.
탈리도마이드의 최대 혈장 농도를 보장하기 위해 마지막 탈리도마이드 용량 3시간 후 각각의 토끼에서 제왕 절개가 수행되었다 (CMax = 3시간) (Hui et al, Reproductive Toxicology, 2014). 자궁이 제거되었고, 이식 부위가 카운트되었고 그리고 배아 절개 동안 사망률 및 재흡수가 기록되었다. GD8 배아는 해부되지 않았고 태반 부위 및 자궁 벽에 부착된 원위치에 고정되었다. 전체 이식 부위가 가공되고, 파라핀에 포매되고 면역조직화학을 위해 4 마이크론으로 절단되었다. GD 9-12 배아는 태아 막으로 수집되고, 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 동안 고정되고 70% 에탄올로 옮겨졌다. 고정 후 태아 막이 제거되고 배아가 가공되고, 파라핀에 포매되고 면역조직화학 및 원위치 혼성화 절차를 위해 4 마이크론으로 절단되었다.
토끼 배아는 SALL4에 대해 염색되었고, 마우스 고환은 SALL4 및 ZFP91에 대해 염색되었다. 면역조직화학 (IHC)은 Bond Polymer Refine Detection 시스템 (Leica Microsystems, DS9800)을 사용하여 Bond-III 자동화 슬라이드 염색기 (Leica Microsystems, 일리노이주 버팔로 그로브 소재) 상에서 수행되었다. 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 조직은 4 마이크론 두께로 절단되었고 Bond-Max 기기 상에서 탈파라핀화되었다. 항원 회수는 20분 동안 100℃에서 Epitope Retrieval 2 (ER2, pH 9.0)로 수행되었다. 슬라이드는 5분 동안 실온에서 Peroxide Block으로 내인성 페록시다아제 활성에 대해 차단되었다. 섹션은 그 다음 1:100 희석에서 60분 동안 실온에서 마우스 단클론성 항-SALL4 EE-30 항체 (Santa Cruz, sc-101147), 또는 0.25ug/ml에서 토끼 단클론성 항-ZFP91 항체 (Celgene 구입 클론 122-8-6)로 인큐베이션되었다. 마우스 고환에 대해, 일차 항체는 15분 동안 실온에서 인큐베이션되었고, 포스트-프라이머리 (Post-Primary) 및 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 표지된 폴리머는 기기의 디폴트 조건에서 인큐베이션되었다. 토끼 조직에 대해, SALL4 일차 항체는 60분 동안 인큐베이션되었고, 포스트-프라이머리-HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Bethyl Laboratories, A90-116P)는 1:200 희석에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션되었다. 토끼 조직에 대한 ZAFP91 염색을 위해, 하기 차단 단계들이 포함되었다: 30분 동안 TBS 내 1% T-X100, 30분 동안 TBS 내 2% 정상 염소 혈청 플러스 1% BSA, 60분 동안 TBS 1% NGS 내에 1/10 희석된 염소 항-토끼 Fab 단편-비접합되고 (JacksonImmunoResearch; cat# 111-007-003), 이어서 2% NGS 플러스 1% BSA로 TBS에서 희석된 일차 ZFP91 항체 45분 동안 인큐베이션. 바이오티닐화된 이차 염소 항-토끼 Fab 단편 (JacksonImmunoResearch; cat# 111-067-003)은 15분 동안 1% NGS로 TBS 내 1/800 희석에서 사용되었고 Bond Intense R 시스템으로 스트렙타비딘-HRP 검출이 따랐다. 항원-항체 복합체는 그 다음 과산화수소 기질 및 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB) 색원체로 시각화되었다. 슬라이드는 헤마톡실린으로 대조염색되었고, 탈수되고 티슈-텍 필름 (Tissue-Tek Film) 자동화 커버슬립퍼에 의해 커버슬립되었다.
SALL4 RNA에 대한 원위치 혼성화 ( ISH )
완전 자동화 SALL4 ISH 검정이 결합 연구 검출 시스템 (BOND Research Detection System)을 갖는 Leica BOND RX IHC & ISH 염색기 (Leica, Cat. No. DS9455) 상에서 수행되었다. 포르말린 고정 파라핀 포매된 (FFPE) 토끼 배아는 4 마이크론 두께로 절단되었고, 60℃에서 1시간 동안 베이킹되었고 그 다음 72℃에서 탈랍 용액에서 탈파라핀화되었다. 항원 회수는 15분 동안 95℃에서 Epitope Retrieval 2 (ER2, pH 9.0)에서 수행되었다. 구입-설계된 토끼 SALL4 표적 프로브가 슬라이드 상에 적용되었고 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. SALL4 신호는 그 다음 BOND RX 디폴트 ACD ISH 프로토콜을 사용하여 RNAscope LS 다중 형광 시약 키트 (ACD, Cat. No. 322800)로 증폭되었다. SALL4 신호는 30분 인큐베이션 동안 1:1500 희석에서 Opal TSA 형광단 570 (PerkinElmer, Cat. No. FP1488001KT)으로 검출되었다. 슬라이드는 그 다음 DAPI를 갖는 ProLong Diamond Antifade Mountant (Life Technology, 카탈로그 번호 P36966)를 사용하여 수작업으로 커버슬립되었다. 4X 배율에서 전체의 슬라이드 스캔이 완료된 후, Perkin Elmer Vectra 3.0 멀티스펙트럼 이미지 플랫폼을 사용하여 40x 배율 이미지가 획득되었다.
인간화된 세레블론 마우스
C57Bl/6Ntac 마우스가 이 연구에서 사용되었고 특이적 무병원체 조건하에서 타코닉 (Taconic)에서 유지되었다.
인간 CRBN 발현 마우스는 표적화를 증진하기 위해 네오마이신 카셋트 삽입 부위를 표적화하도록 설계된 XTN™ 2 TALEN (Transposogen)과 함께, 엑손 2로부터 인간 cDNA (Glu24), bGHpA 및 네오마이신 선별 카세트로 구성된 CRBN 공여체 벡터로 C57Bl/6Ntac JM8 ES 세포의 전기천공을 통해 생성되었다. 벡터는 마우스 CRBN 유전자의 스플라이싱을 방해하도록, CRBN이 bGHpA에서 종결된 내인성 쥣과 프로모터 및 전사체에 의해 유도되는 것이 가능하도록 설계되었다.
클론으로부터 PCR 생성물의 서열분석은 5' 및 3' 말단 둘 모두 상에 표적화를 확인했다. 표적화된 클론은 모세포 안으로 주입되었고 생성된 키메라는 네오마이신 저항 카셋트의 결실을 달성하도록 Cre 재조합효소 제거 마우스 (Taconic)에 사육되었다. 콜로니는 그 다음 동형접합성으로 사육되어졌다.
인간화된 세레블론 마우스에서 배아병증 결정
탈리도마이드는 6 내지 15 임신　일 [GD]에 하루에 1회, 0　(RO 탈이온수 내 1.0% [w/v] 카복시메틸셀룰로스 [1500-3000 cP]), 100, 300, 또는 1000 mg/kg/일의 용량 수준으로 경구 위관영양법에 의해 암컷 HOM　huCRBN 마우스에게 투여되었다. GD 15에서, 혈액 샘플이 생체분석 및 독성역학 평가를 위해 투약후 0.5, 1, 3, 6, 및 24시간에서 연구에 배정된 마우스의 하악밑 정맥으로부터 수집되었다. 모든 동물은 GD 18에서 예정된 검시를 위해 생존하였다. 마우스는 안락사되었고 검사되었고, 총 검시가 수행되었다. 난소 및 자궁은 체내 루테아, 이식 부위, 태반 (크기, 색상 및 형상), 살은 태아 및 죽은 태아, 및 초기 및 후기 재흡수의 수 및 분포에 대해 검사되었다. 태아는 펜타바르비탈 나트륨의 복강내 주입 (390 mg/mL)으로 안락사되었다. 태아는 칭량되었고 성별 및 외부 비정상에 대해 검사되었다. 늦은 재흡수는 가능한 정도로 외부 비정상 및 성별에 대해 검사되었다. 각각의 태아의 체중이 기록되었다. 태아는 연산구 수, 한배 새끼 수 및 자궁 분포로 개별적으로 확인되었다. 윌슨의 절개 기술의 순응을 사용함에 의해 각각의 한배 새끼에서 태아의 대략 절반이 내장 비정상에 대해 검사되었다. 각각의 태아는 Bouin의 용액에 고정되었다; 섹션은 알코올에 보관되었다. 알리자린 레드 S로 염색한 후 나머지 태아 (각각의 한배 새끼에서 태아의 대략 절반)는 골격 비정상에 대해 검사되었다. 검사 후, 골격 조제물은 보존제로 첨가된 티몰과 함께 글리세린에 유지되었다.
6.2 SALL4는 시험관내 탈리도마이드 및 세레블론 - CRL4의 직접적인 기질이다
SALL4는 7개 아연 핑거 도메인을 함유하며, 그 중 4개는 세레블론 기질 Ikaros 및 Aiolos와 동일한 위치에 글리신을 갖는다. 이 실시예에서, 이들 4개 글리신-함유 아연 핑거를 함유하는 4개 도메인이 완전하게 정제된, 시험관내 유비퀴틴화 시스템에서 세레블론-CRL4에 의한 화합물-의존적 유비퀴틴화에 대해 시험되었다 (도 1 참고). 제1 아연 핑거 도메인은 TGERPFVCSVCGHRFTTKGNLKVHFHRH (서열번호: 3)의 서열을 갖는, 아미노산 잔기 405-432를 포괄한다. 제2 아연 핑거 도메인은 TGERPFQCKICGRAFSTKGNLKTHLGVH (서열번호: 4)의 서열을 갖는, 아미노산 잔기 589-616을 포괄한다. 제3 아연 핑거 도메인은 RQAKQHGCTRCGKNFSSASALQIHERTH (서열번호: 5)의 서열을 갖는, 아미노산 잔기 865-892를 포괄한다. 제4 아연 핑거 도메인은 TGEKPFVCNICGRAFTTKGNLKVHYMTH (서열번호: 6)의 서열을 갖는, 아미노산 잔기 893-920을 포괄한다. Ikaros 아연 핑거 도메인 (아미노산 잔기 140-168)은 대조군으로 사용되었으며, 이것은 TGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHS (서열번호: 7)의 서열을 갖는다.
더 구체적으로, SALL4의 개별 아연 핑거 도메인은 E. 콜리에서 발현되었고 MBP 태그를 통해 정제되었다. 정제된 아연 핑거는 그 다음 세레블론 결합 및 유비퀴틴화에 대해 시험관내 유비퀴틴화 검정에서 시험되었다. 정제된 아연 핑거는 정제된 세레블론-CRL4 유비퀴틴 리가제 복합체 및 정제된 유비퀴틴화 캐스케이드 구성요소 Uba1, UbcH5a, UbcH5b, ATP, 및 유비퀴틴으로 인큐베이션되었다. 유비퀴틴화는 세레블론 개질 화합물 (탈리도마이드, "thal")의 존재에서만 관측되었고 DMSO 단독에서는 그렇지 않았다.
도 1a에서 나타낸 바와 같이, 일 아연 핑거 도메인인, 아미노산 405 내지 432는 Ikaros와 유사한 정도로 매우 강하게 탈리도마이드-의존 방식으로 유비퀴틴화되었다. 정제된 시스템에서 시험관내 유비퀴틴화는 SALL4 단백질이 유비퀴틴화에 대해 탈리도마이드-결합된 세레블론과 직접적으로 상호작용할 수 있다는 것과, 아연 핑거 a.a. 405-432 (서열번호: 3)는 세레블론에 대한 SALL4 결합의 주요 구동자이다는 것을 입증한다.
별개 실험에서, SALL4 단백질은 주요 위치에서 글리신을 함유하는 베타-헤어핀 모티프인, 세레블론에 대해 알려진 신기질의 결합을 매개하는 것으로 밝혀진 구조 특성의 존재에 대해 추가로 분석된다. Ikaros 및 Aiolos는 아연 핑거 도메인 내에 이 모티프를 담지한다. 이 실험에서 분석된 SALL4의 7개 아연 핑거 도메인은 도 1b에 도시되어 있다. 이들 중 4개는 세레블론 결합을 매개하기 위해 필요한 위치에 글리신을 함유한다 (도 1b 참고). 이들 4개 개별 아연 핑거의 인간 버전이 본 발명자들의 시험관내 세레블론-CRL4 유비퀴틴화 검정에서 시험하기 위해 발현되고 정제되었다 (도 1c 참고). 일 아연 핑거 도메인 (ZF2, 아미노산 410-432 (서열번호: 11))이 탈리도마이드-의존 방식에서 견고하게 유비퀴틴화되었고, 제2 아연 핑거 도메인 (ZF4, 아미노산 594-616)이 또한 탈리도마이드의 존재에서 유비퀴틴화되었지만, 보다 약하게 되었다. ZF2는 세레블론에 결합하는 것으로 밝혀진 Ikaros 및 ZFP91 아연 핑거 도메인과 유사한 정도로 유비퀴틴화되었다 (도 1d 참고). 바람직한 아연 핑거 도메인의 존재는 단일 아연 핑거 모티프가 세레블론 동원 및 분해를 매개하는 세레블론 기질 Ikaros 및 Aiolos를 크게 연상시킨다.
이들 아연 핑거의 유비퀴틴화가 다른 신기질에 대해 확립된 바와 같이, 글리신 잔기 (ZF2에서 G416 및 ZF4에서 G600)에 의존적인지 여부를 시험하기 위한 추가의 실험이 수행되었다 (도 1c 및 도 1d 참고). 양 아연 핑거의 유비퀴틴화는 알라닌으로 글리신의 돌연변이 시 상당히 감소되었으며, 이는 Ikaros에서 G151이 알라닌으로 그리고 ZFP91에서 G406이 알라닌으로 돌연변이 시 관측된 폐지된 유비퀴틴화와 일치하고 (도 1d 참고) 이들 SALL4 아연 핑거가 글리신-함유 베타-헤어핀 모티프를 사용하여 세레블론에 결합한다는 것을 나타낸다. 따라서 정제된 시스템에서 이들 유비퀴틴화 실험은 SALL4 아연 핑거가 유비퀴틴화를 위해 탈리도마이드-결합된 세레블론과 직접적으로 상호작용할 수 있어, ZF2 (아미노산 410-432)가 가장 상당한 세레블론 상호작용 아연 핑거이다는 것과, 이들 아연 핑거가 글리신-함유 베타 헤어핀 모티프를 통해 결합하는 것으로 보인다는 것을 입증한다.
탈리도마이드-유도된 기형발생성을 매개하는데 있어서 SALL4 유비퀴틴화의 역할을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 다음에 서열 차이가 토끼와 마우스 사이의 탈리도마이드-유도된 기형발생성에 대한 차별적인 민감성을 설명할 수 있는지를 검사하였다. 마우스 세레블론은 이전에 세레블론 신기질 결합을 방해하는 것으로 밝혀진 탈리도마이드 결합 포켓 주위에 2개의 아미노산 변이를 함유하고, 반면에 토끼 세레블론은 이들 돌연변이를 함유하지 않으며, 그것의 세레블론은 신기질 결합 부위를 둘러싸는 영역에서의 인간 세레블론으로 100% 보존된다 (도 1e 및 1g 참고). 인간 SALL4와 마우스 및 토끼 오쏘로그의 정렬은 ZF2가 인간과 토끼 사이에서 100% 보존되는 반면, 마우스에는 서열 변형이 있음을 나타낸다 (도 1f 및 1g 참고).
본 발명자들은 그 다음 토끼 및 마우스 SALL4 아연 핑거가 탈리도마이드 처리 시에 각각 토끼 및 마우스 세레블론에 의해 유비퀴틴화될 수 있는지를 시험하였다. 도 1c에서 나타낸 바와 같이, 토끼 아연 핑거 아미노산 357-385 (인간 ZF2에 대해 이종상동성)는 인간 단백질에 비교할만한 효율로, 탈리도마이드-의존 방식으로 토끼 세레블론에 의해 유비퀴틴화될 수 있었다. 그에 반해서, 마우스 SALL4 아연 핑거 아미노산 410-438 (인간 ZF2에 대해 이종상동성)은 마우스 세레블론에 의해 유비퀴틴화될 수 없었다. 기질 결합을 방해하는 마우스 세레블론에서 알려진 돌연변이가 주어진 경우, 본 발명자들은 그 다음 인간 세레블론이 마우스 SALL4를 인식할 수 있는지를 시험하였다. 인간 세레블론은 마우스 SALL4 아연 핑거를 유비퀴틴화할 수 없는 것으로 밝혀져, 마우스 SALL4에서의 돌연변이는 세레블론 결합에 해롭고, 따라서 SALL4 분해는 WT 및 인간 세레블론 (huCRBN) 형질전환 마우스 둘 모두에서 손상될 것임을 입증하였다. 사실상, 글리신-함유 베타-헤어핀 모티프를 담지하는 모든 4개 마우스 SALL4 아연 핑거가 시험될 때, 이들 중 어느 것도 마우스 세레블론 또는 인간 세레블론에 의해 효율적으로 유비퀴틴화되지 않았다 (도 1h 참고).
6.3 SALL4는 생체내 탈리도마이드 및 세레블론 - CRL4의 직접적인 기질이고 세레블론에 대한 SALL4의 결합 및 SALL4의 분해는 SALL4의 잔기 G416에 의존한다
시험관내 분석에서 나타난 세레블론에 SALL4의 직접적인 결합 및 SALL4의 유비퀴틴화가 주어지면, 본 실시예는 세포에서의 결합 및 유비퀴틴화에 대해 추가로 시험했다. 인간 조직 배양 세포에서 전장 SALL4의 유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해가 분석되었다.
전장 인간 SALL4를 안정적으로 발현하는 세포가 세레블론의 존재 또는 부재에서 탈리도마이드, 레날리도마이드, 또는 포말리도마이드로 처리되었다. 더 구체적으로, CRISPR-cas9 세레블론 넉아웃 및 HA-태깅된 SALL4 또는 SALL4 돌연변이체의 안정한 발현을 갖는 Lenti-x 293 세포주가 GST-세레블론 또는 공 벡터 중 어느 하나로 형질감염되었다. 세포는 그 다음 화합물-의존적 SALL4의 분해를 모니터링하기 위해 탈리도마이드 (THAL), 레날리도마이드 (LEN), 또는 포말리도마이드 (POM)로 처리되었다. ZFP91은 세레블론을 발현하는 모든 세포주에서 화합물-의존적 분해를 나타내는 대조군 화합물-의존적 세레블론 기질로서 모니터링되었다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다.
SALL4 단백질 수준에서의 화합물-의존적 감소가 관측되었고 세레블론 발현에 의존적인 것으로 밝혀졌다 (도 2 참고). G416 (a.a. 405-432에서 아연 핑거에 존재하는 글리신) 또는 G600 (a.a. 589-616에서 아연 핑거에 존재하는 글리신) 중 어느 하나에서 알라닌으로 돌연변이된 SALL4가 그 다음 화합물-의존적 분해에 대해 모니터링되었다. G416A의 돌연변이는 SALL4를 안정화시키기에 충분하여, 화합물-유도된 SALL4 분해를 방지하는 반면, G600A의 돌연변이는 SALL4를 안정화시키기에는 충분하지 않아, 이는 세포에서 세레블론 결합 및 화합물-의존적 유비퀴틴화의 주요 구동자인 a.a. 405-432에서 아연 핑거와 일치하였다.
세포에서 세레블론에 대한 전장 SALL4의 결합이 그 다음 공동-면역침강에 의해 시험되었다 (도 3 참고). HA-태깅된 WT, G416A, 또는 G600A SALL4가 세포로부터 면역침강되었고, 공동-정제 세레블론의 수준은 웨스턴 블랏에 의해 평가되었다. 간단히, 세레블론의 CRISPR-cas9 넉아웃 및 HA-태깅된 SALL4 또는 SALL4 돌연변이체의 안정한 발현을 갖는 Lenti-x 293 세포주가 GST-세레블론 또는 공 벡터 중 어느 하나로 형질감염되었다. 세포는 그 다음 탈리도마이드 (THAL), 레날리도마이드 (LEN), 또는 포말리도마이드 (POM)로 처리되었고, SALL4는 항-HA 비드를 사용하여 침강되었다. 공동-정제 GST-세레블론의 양은 그 다음 웨스턴 블랏에 의해 평가되었다. WT SALL4 및 G600A SALL4 둘 모두는 세레블론에 대해 강한 화합물-의존적 결합을 나타낸 반면에, G416A 돌연변이체 SALL4는 결합을 상당히 방해하여, a.a. 405-432에서 SALL4 아연 핑거가 세레블론에 대한 SALL4 결합의 주요 구동자이다는 것을 확인하였다.
6.4 SALL4의 분해가 화합물 처리에 좌우된다
내인성 SALL4의 화합물-의존적 분해가 그 다음 확인되었다 (도　4 참고). 컬터드(cultered) NCCIT, NETRA-2 cl.D1 및 AN3-CA 암 세포주가 16시간 동안 지시된 농도에서 탈리도마이드, 레날리도마이드, 또는 포말리도마이드로 처리되었고 그 후 세포 샘플은 항-SALL4 항체 (EE-30, Santa Cruz)로 웨스턴 블랏에 의해 분석되었다. 항-SALL4 웨스턴 블랏의 짧은 노출 (S.E.) 및 긴 노출 (L.E.) 둘 모두가, 세레블론의 존재를 확인하는 항-세레블론 블랏, 및 항-액틴 로딩 대조군과 함께, 비교하기 위해 도시되어 있다.
내인성 SALL4는 이들 세포주에서 웨스턴 블랏에 의해 관측될 수 있고, 약물-의존적 분해는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 또는 포말리도마이드 중 어느 하나로 16시간 처리 후 모니터링되었다. 내인성 SALL4의 상당한 화합물-의존적 분해가 관측되었다.
6.5 SALL4의 생체내 분해
SALL4의 탈리도마이드 의존적 하향조절이 또한 생체내 토끼에서 관측되었다. 토끼는 탈리도마이드-유도된 기형발생성에 민감한 종인 것으로 이전에 실증되었다. 이 실시예에서, 성인 수컷 토끼가 30 또는 150 mg/kg 탈리도마이드로 처리되었다. 고환이 해부되고 SALL4 발현 수준에 대해 면역조직화학에 의해 후속으로 검사되었고 결과는 도 5에 도시되어 있다.
별도 실험에서, 임신한 토끼는 180 mg/kg에서 탈리도마이드로 처리되었다. 배아는 면역조직화학에 의해 SALL4 수준에 대해 후속으로 탐색되었고, 결과는 도 6에 도시되어 있다.
더 구체적으로, 5 내지 8 월령 사이의 성인 암컷 뉴질랜드 백색 토끼는 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이 8, 9, 10, 11 및 12 임신 일 (GD)에서 배아 수집을 위해 시간으로 짝지어졌다.
[표 1]. 탈리도마이드 처리된 토끼에서 이식 부위
Figure pct00001
SALL4 면역조직화학은 GD8 배아를 함유하는 자궁의 전체의 섹션 및 GD9-12 처리되지 않은 토끼 배아의 시상 섹션에 대해 수행되었고 모든 배엽 층에서 뚜렷한 분포의 패턴을 갖는 SALL4 단백질 발현을 나타내었다 (도 6 참고). 핵 SALL4는 태반, 자궁내막 또는 자궁 벽에서가 아닌 GD8에서 태아 막에서 관찰되었다. GD9-12 배아에서, SALL4는 탈리도마이드 기형발생성 연구에서 빈번하게 영향을 받는 배아 구조에서 관측된 높은 수준으로 유사하게 분포되었다. 신경관 및 시신 소포 (외배엽), 지아 및 메소네프론 (중배엽) 및 간과 폐 싹 (내배엽)에서 가장 높은 SALL4 수준이 관측되었다 (도 6 참고). SALL4 수준은 GD9, 10 및 11에서 전반적으로 높았고 GD12에서 하락하기 시작했다.
탈리도마이드 처리된 배아에서, GD12에서 가장 확연한 SALL4 수준에서의 현저한 감소가 있었다 (도 6 참고). 탈리도마이드 처리된 배아에서의 심한 비정상이 GD9부터 앞으로 관측되어 감수성 임신 기간에 걸쳐 배아에서의 적절한 탈리도마이드 노출을 나타낸다. 가장 흔한 발견은 태반, 태아 막 및 간과 폐 싹 근처의 배아의 복부, 오발생 머리, 팽창된 시신 소포, 팽창 및 접힌 신경관, 단축된 지아 및 비틀린 꼬리에 출혈을 포함했다. 따라서, SALL4 단백질 수준은 탈리도마이드-유도된 기형발생성을 나타내는 유기체에서 태아 발달 동안 관련된 조직에서의 탈리도마이드에 의해 감소된다.
따라서, 탈리도마이드로 치료는 수컷 토끼의 고환 (도 5 참고), 및 토끼 배아 (도 6 참고)에서 SALL4 수준의 용량-의존적 감소를 야기하는 것으로 실증되었다.
6.6 SALL4는 세레블론 - 및 프로테아솜 -의존 방식으로 인간 iPS 세포에서 분해된다
내인성 SALL4 단백질의 탈리도마이드 유도된 분해가 또한 인간 iPS 세포에서 관측되었다. SALL4 수준은 용량 의존 방식으로 탈리도마이드에 노출 시 감소되었고, CRISPR-매개된 유전자 편집을 통한 세레블론의 녹아웃은 인간 iPS 세포에서 탈리도마이드에 의해 유도된 SALL4의 하향조절을 완전히 차단했다 (도 7a). SALL4 단백질 수준에서 탈리도마이드-유도된 감소는 프로테아솜 억제제 MG132 및 nedd8 활성화 효소 억제제 MLN4924 (모든 CRL의 불활성화로 이어짐)에 의해 방지되어, SALL4 프로틴 수준에서의 감소가 유비퀴틴-매개된 프로테아솜 분해를 통해 발생한다는 것을 나타낸다 (도 7b). SALL4 수준에 대한 임의의 전사 효과를 배제하기 위해, 본 발명자들은 SALL4 mRNA 수준이 탈리도마이드 처리에 의해 감소되지 않았고 (도 7e), 대신 짐작컨대 신기질 GSPT1에 대해 보고된 바와 같이 단백질 고갈에 의한 항상성 조절로 인해 증가되는 것으로 확인되었다. 시험관내 유비퀴틴화에 의해 가장 효율적인 기질로 확인된, ZF2에 글리신 함유 데그론이 세포에서 SALL4 단백질의 고갈에 대한 원인이었는지 여부를 조사하기 위해, 탈리도마이드로 처리된 HEK 293 세포에서 이소성으로 발현된 SALL4 야생형, G416A, 및 G600A 돌연변이체 단백질의 분해가 시험되었다 (도 7c 참고). 시험관내 결과와 일치하여, G416A 돌연변이는 SALL4의 탈리도마이드 의존적 분해를 차단한 반면, G600A는 SALL4 분해에 영향을 미치지 않아, ZF2가 SALL4의 세레블론 결합 및 유비퀴틴화를 매개하는 주요 아연 핑거임을 확인하였다. 유사하게, 세레블론에 결합하는 야생형, G416A 및 G600A 돌연변이체 단백질의 능력이 공동-면역침강 (co-IP)에 의해 시험되었다 (도 7d 참고). 야생형 및 G600A 돌연변이체 SALL4는 세레블론에 결합할 수 있는 반면, G416A 돌연변이는 세포에서 세레블론 결합을 방해하였다. 종합해 보면, 이들 결과는 SALL4 단백질이 다른 신기질과 일치하는 방식으로 CRL4-CRBN E3 리가제로 동원되고, 'G-모티프' 데그론이 핵심 잔기 G416 주위의 아연 핑거 2에 위치한다는 것을 나타낸다.
6.7 SALL4는 huCRBN 마우스 고환에서가 아닌 토끼 고환에서 분해된다
본 실시예는 생체내 탈리도마이드에 의한 SALL4의 분해를 추가로 테스트하고 비교한다. SALL4는 태아 발달 동안 발현되지만, 발현은 고환에서 발견되는 줄기 세포와 같은 제한된 수의 성체 조직에서 유지한다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 SALL4 하향조절을 알려진 세레블론 신기질의 것과 비교하고자 했다. 탈리도마이드는 Ikaros의 분해를 촉발하는 데 단지 적당히 활성이고, CK1α의 분해를 촉발하지 않는다 (데이터는 여기에 도시되지 않음). 따라서 본 발명자들은 탈리도마이드에 민감하고, 면역조직화학에 의한 직접적인 비교를 가능하게 하기 위해 Ikaros보다 더 넓은 조직 분포를 갖는 세레블론 신기질을 모색했다. 상기에 기재된 바와 같이, ZFP91은 시험관내 유비퀴틴화 분석에서 CRL4-CRBN의 직접적인 기질인 것으로 확인되었다.
따라서, 성인 수컷 토끼 및 마우스가 면역조직화학에 의해 고환에서 SALL4 및 ZFP91 발현에서의 변화에 대해 시험되고 관찰되었다. 토끼 및 마우스에서, SALL4는 정자형의 형태적 특징을 갖는 정세관의 기저층을 따라 위치한 세포의 서브셋의 핵에서 높게 발현된다. 탈리도마이드-처리된 토끼에서, 150mg/kg/일에서 주지된 현저한 감소로 고환에서 SALL4 단백질 수준의 용량-의존적 감소가 있다 (도 8, 좌측 패널 참고). ZFP91 데그론은 토끼와 인간 사이에 보존되고, ZFP91은 처리된 토끼에서 상응하게 감손된다 (도 8, 좌측 패널 참고). 원위치 혼성화는 SALL4 mRNA 수준이 탈리도마이드 처리시 분해 기전과 일치하여 변경되지 않았음을 보여주었다 (도 9 참고).
마우스는 신기질 동원 및 분해를 차단하고, 탈리도마이드의 기형발생 효과에 저항성인 것으로 밝혀진 세레블론에서 종-특이적 아미노산 차이를 나타내는 것으로 알려져 있다. 탈리도마이드로 처리 시, WT 마우스는 SALL4 또는 ZFP91의 무 고갈을 나타냈다 (도 8, 중간 패널 참고). 세레블론 조절제에 대한 민감도를 부여하기 위해, 본 발명자들은 인간 세레블론을 발현하도록 조작된 형질전환 마우스를 구축하였다 (도 10 참고). ZFP91의 서열은 글리신 함유 신기질 데그론 주변 영역에서 인간과 마우스 사이에 보존되고, 따라서 ZFP91은 huCRBN 마우스에서 견고하게 하향조절된다 (도 8, 우측 패널 참고). 그에 반해서, SALL4 단백질 수준은 7일 동안 최대 1000mg/kg의 탈리도마이드로 처리 후 고환에서 변하지 않은 상태로 유지한다 (도 8, 우측 패널 참고). 이들 발견은 유비퀴틴화 속도에서의 차이가 마우스와 토끼 사이의 SALL4 단백질 서열에서의 차이에 의해 설명될 수 있음을 실증하는 시험관내 유비퀴틴화 데이터와 일치한다.
6.8 인간 세레블론 형질전환 마우스는 탈리도마이드 기형발생성을 나타내지 않는다
인간 세레블론이 마우스 SALL4 단백질에서의 서열 차이에 기인한 SALL4가 아닌, 마우스에서 ZFP91과 같은 보존된 신기질 단백질의 분해를 야기할 것이다는 것이 인지하여 (섹션 6.7 참고), 인간 형질전환 마우스 (huCRBN)에 대한 탈리도마이드의 기형발생 효과가 이 실시예에서 특성규명된다. 주요 조직발생의 기간 (6-15 임신 일) 동안 0 (대조군), 100, 300 및 1000 mg/kg/일의 투약량에서, 시간-매칭된 동종접합성 huCRBN 마우스 (10/그룹)에 탈리도마이드의 경구 투여는 태아에서의 어떠한 발달 비정상도 초래하지 않았다. 대조군, 100, 300 및 1000 mg/kg/일 그룹 각각에는 7, 9, 7 및 8마리의 살아있는 태아가 있었다. 연구 동안 약동학을 평가하여 탈리도마이드 노출 수준이 충분하였다는 것과 약물-처리된 그룹에서 상응하는 평균 혈장 노출 (곡선 하 면적)이 35,100, 78,600 및 143,000 ngㆍhr/mL였다는 것을 보장하였다. 태아는 발달 비정상의 징후에 대해 후속으로 검사되었고, 아무것도 보고되지 않았으며, 탈리도마이드 처리 및 처리되지 않은 huCRBN 마우스로부터의 골격 제조물의 비교가 도 11에 도시되어 있다.
이들 결과는 SALL4가 세레블론-CRL4 유비퀴틴화의 직접적인 화합물-의존적 기질임을 입증한다. 발달 동안 SALL4의 손실은 오키히로 (Okihiro), IVIC, Holt-Oram (홀트-오람) 및 아크로-신장-안구 증후군에서 사지 기형을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 결과는 SALL4 하향조절이 특정 화합물 처리, 예를 들어 탈리도마이드의 기형발생 효과의 주요 구동자임을 나타낸다. 따라서, SALL4를 사용하여 세레블론 조절 화합물의 독성을 측정할 수 있으며, 그것에 의해 생식 독성의 감소된 위험을 갖는 화합물의 선별 및 선택이 가능하다. SALL4 또는 그것의 돌연변이체의 존재는 또한 세레블론 조절 화합물로 치료하기 위한 환자를 선택하는데 사용될 수 있다.
전술한 것으로부터, 특이적 실시형태가 예시의 목적으로 본원에 기술되었지만, 본원에 제공된 것의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 인정될 것이다. 상기 언급된 모든 참고문헌은 그것의 전체로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CELGENE CORPORATION <120> METHODS FOR SCREENING CEREBLON MODIFYING COMPOUNDS <130> 14247-269-228 <140> To Be Assigned <141> Herewith <150> 62/617,112 <151> 2018-01-12 <150> 62/710,401 <151> 2018-02-16 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1053 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequences of human SALL4A <400> 1 Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Gln His Ile Asn Ser Glu Glu 1 5 10 15 Asp Gln Gly Glu Gln Gln Pro Gln Gln Gln Thr Pro Glu Phe Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly Glu Leu Gly Ala Pro Val Asn 35 40 45 His Pro Gly Asn Asp Glu Val Ala Ser Glu Asp Glu Ala Thr Val Lys 50 55 60 Arg Leu Arg Arg Glu Glu Thr His Val Cys Glu Lys Cys Cys Ala Glu 65 70 75 80 Phe Phe Ser Ile Ser Glu Phe Leu Glu His Lys Lys Asn Cys Thr Lys 85 90 95 Asn Pro Pro Val Leu Ile Met Asn Asp Ser Glu Gly Pro Val Pro Ser 100 105 110 Glu Asp Phe Ser Gly Ala Val Leu Ser His Gln Pro Thr Ser Pro Gly 115 120 125 Ser Lys Asp Cys His Arg Glu Asn 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Gln Ser Ser Leu Lys Met His Tyr 580 585 590 Arg Thr His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Gln Cys Lys Ile Cys Gly Arg 595 600 605 Ala Phe Ser Thr Lys Gly Asn Leu Lys Thr His Leu Gly Val His Arg 610 615 620 Thr Asn Thr Thr Val Lys Thr Gln His Ser Cys Pro Ile Cys Gln Lys 625 630 635 640 Lys Phe Thr Asn Ala Val Met Leu Gln Gln His Ile Arg Met His Met 645 650 655 Gly Gly Gln Ile Pro Asn Thr Pro Leu Pro Glu Ser Pro Cys Asp Phe 660 665 670 Thr Ala Pro Glu Pro Val Ala Val Ser Glu Asn Gly Ser Ala Ser Gly 675 680 685 Val Cys Gln Asp Asp Ala Ala Glu Gly Met Glu Ala Glu Glu Val Cys 690 695 700 Ser Gln Asp Val Pro Ser Gly Pro Ser Thr Val Ser Leu Pro Val Pro 705 710 715 720 Ser Ala His Leu Ala Ser Pro Ser Leu Gly Phe Ser Val Leu Ala Ser 725 730 735 Leu Asp Thr Gln Gly Lys Gly Ala Leu Pro Ala Leu Ala Leu Gln Arg 740 745 750 Gln Ser Ser Arg Glu Asn Ser Ser Leu Glu Gly Gly Asp Thr Gly Pro 755 760 765 Ala Asn Asp Ser Ser Leu Leu Val Gly Asp Gln Glu Cys Gln Ser Arg 770 775 780 Ser Pro Asp Ala Thr Glu Thr Met Cys Tyr Gln Ala Val Ser Pro Ala 785 790 795 800 Asn Ser Gln Ala Gly Ser Val Lys Ser Arg Ser Pro Glu Gly His Lys 805 810 815 Ala Glu Gly Val Glu Ser Cys Arg Val Asp Thr Glu Gly Arg Thr Ser 820 825 830 Leu Pro Pro Thr Phe Ile Arg Ala Gln Pro Thr Phe Val Lys Val Glu 835 840 845 Val Pro Gly Thr Phe Val Gly Pro Pro Ser Met Pro Ser Gly Met Pro 850 855 860 Pro Leu Leu Ala Ser Gln Pro Gln Pro Arg Arg Gln Ala Lys Gln His 865 870 875 880 Cys Cys Thr Arg Cys Gly Lys Asn Phe Ser Ser Ala Ser Ala Leu Gln 885 890 895 Ile His Glu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Val Cys Asn Ile 900 905 910 Cys Gly Arg Ala Phe Thr Thr Lys Gly Asn Leu Lys Val His Tyr Met 915 920 925 Thr His Gly Ala Asn Asn Asn Ser Ala Arg Arg Gly Arg Lys Leu Ala 930 935 940 Ile Glu Asn Pro Met Ala Ala Leu Ser Ala Glu Gly Lys Arg Ala Pro 945 950 955 960 Glu Val Phe Ser Lys Glu Leu Leu Ser Pro Ala Val Ser Val Asp Pro 965 970 975 Ala Ser Trp Asn Gln Tyr Thr Ser Val Leu Asn Gly Gly Leu Ala Met 980 985 990 Lys Thr Asn Glu Ile Ser Val Ile Gln Ser Gly Gly Ile Pro Thr Leu 995 1000 1005 Pro Val Ser Leu Gly Ala Ser Ser Val Val Ser Asn Gly Thr Ile 1010 1015 1020 Ser Lys Leu Asp Gly Ser Gln Thr Gly Val Ser Met Pro Met Ser 1025 1030 1035 Gly Asn Gly Glu Lys Leu Ala Val Pro Asp Gly Met Ala Lys His 1040 1045 1050 Gln Phe Pro His Phe Leu Glu Glu Asn Lys Ile Ala Val Ser 1055 1060 1065

Claims (16)

  1. (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계; 및
    (b) 세레블론 개질 화합물이 SALL4 단백질의 분해를 유도하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 얻는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 단계;
    (c) 상기 세레블론 개질 화합물을 상기 샘플에 투여하는 단계;
    (d) 상기 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 단계;
    (e) 상기 세레블론 개질 화합물이 SALL4의 분해를 유도하는지 여부를 결정하기 위해 SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하는 단계; 및
    (f) SALL4의 분해를 유도하지 않는 세레블론 개질 화합물 또는 기준 화합물과 비교하여 감소된 SALL4의 분해를 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 상기 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하는 단계;
    (c) SALL4의 유비퀴틴화를 유도하지 않는 세레블론 화합물 또는 기준 화합물과 비교하여 감소 수준의 SALL4의 유비퀴틴화를 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 세레블론 개질 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계;
    (d) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하는 단계;
    (c) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 유도하지 않는 세레블론 개질 화합물 또는 기준 화합물과 비교하여 감소된 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 유도하는 세레블론 개질 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 암은 혈액학적 암인, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 암은 고형 암인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 림프종 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종인, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 림프종인, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 백혈병인, 방법.
  12. 청구항 4에 있어서, 상기 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3)와 세레블론 사이의 상호작용 또는 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432 (서열번호: 11)와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정되는, 방법.
  13. 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 샘플을 얻는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 SALL4의 제1 단백질 수준을 결정하는 단계;
    (c) 상기 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계;
    (d) 상기 샘플에서 SALL4의 제2 단백질 수준을 결정하는 단계;
    (e) SALL4의 제1 수준과 제2 단백질 수준을 비교하여 화합물의 기형발생성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 SALL4의 유비퀴틴화의 수준을 결정하고, 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 세레블론 개질 화합물이 기형발생 효과를 유도하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 상기 세레블론 개질 화합물을 샘플에 투여하는 단계;
    (b) SALL4와 세레블론 사이의 상호작용을 결정하고, 그것에 의해 화합물의 기형발생성을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 SALL4와 세레블론 사이의 상호작용은 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 405-432 (서열번호: 3)와 세레블론 사이의 상호작용 또는 SALL4 단백질의 아미노산 잔기 410-432 (서열번호: 11)와 세레블론 사이의 상호작용에 의해 결정되는, 방법.
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