KR20200094795A - Crispr 활성화에 의한 유도 만능 세포의 생성 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 표적화에 의해 성인 체세포를 유도 만능 줄기세포로 재프로그래밍하고 전사 인자의 이소성 발현에 의존하지 않고 내인성 유전자좌를 리모델링하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
Description
관련 출원
본 출원은 2017년 12월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/611,202호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 개시는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
분야
특정 전사 인자의 조절을 통해 성인 체세포를 만능 줄기세포로 재프로그래밍하는 능력은 기본적인 생물학적 연구에 큰 관심을 끌고 있고, 또한 유도 만능 줄기세포(iPSC)가 여러 질병 및 장애를 치료하기 위해 신체의 임의의 세포 타입으로 분화될 수 있는 재생 의학(reproductive medicine)에 대한 큰 희망을 가지고 있다. 이러한 분야에서의 지속적인 도전은 전사 인자의 이소성 발현에 의존하지 않고 iPSC를 생성시키는 것이다. 본 개시내용은 내인성 유전자좌를 표적화하고 리모델링함으로써 만능 줄기세포를 유도하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다.
만능 줄기세포는 재생 의학을 위한 큰 가능성을 가지고 있다. 내인성 염색질 리모델링이 만능성 유도로 어떻게 야기시키는 지에 대한 더 나은 이해가 중요한 관심사이다. 통상적으로, 분화된 체세포는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c- Myc(OSKM)의 이소성 발현에 의해 유도 만능 줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍될 수 있다[Takahashi and Yamanaka, 2006]. 과발현된 Oct4, Sox2, 및 Klf4는 게놈 전반에 걸쳐 내인성 유전자좌에 초기에 결합하고 이를 전체적으로 리모델링하고[Soufi et al., 2012], 최종적으로, 만능성 조절 회로의 확립으로 이어진다.
그러나, 내인성 염색질에 대한 정밀한 리모델링 사건이 만능성으로의 재프로그래밍을 촉발시키는 것은 거의 알려져 있지 않다. 이를 위하여, 다수의 만능성-관련 유전자좌의 동시 리모델링이 필요한지 또는 단일 유전자좌의 정밀한 리모델링이 iPSC 유도를 위해 충분한지의 여부는 명확하지 않다. 또한, Oct4, Sox2, 및 Klf4는 재프로그래밍을 위해 요구되는 다수의 유전자의 원위 구성요소를 표적화하지만[Soufi et al., 2012], 이러한 원위 구성요소의 리모델링이 만능성 유도에 어떤 영향을 미치는 지에 대해서는 이해가 부족하다. 또한, 후생적 리모델링(epigenetic remodeling)은 세포 재프로그래밍의 중심 메커니즘이지만[Smith et al., 2016], iPSC 유도가 임의의 규정된 내인성 유전자좌의 후생적 조작에 의해 시작될 수 있는 경우에 결정되지 않는다. 마지막으로, 방법론적 한계로 인해, 만능성이 내인성 유전자좌의 정밀한 리모델링에 의해 유도될 수 있는지에 대한 직접적인 증거는 존재하지 않는다.
최근에, 박테리아로부터 타입 II 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 구조 반복서열(CRISPR) 및 CRISPR-연관 9(Cas9) 뉴클레아제 시스템(CRISPR/Cas9 시스템)은 포유류 세포에서 유전자 편집을 위한 강력한 도구로서 변경되었다[Cong et al., 2013; Jinek et al., 2012; Mail et al., 2013b]. 뉴클레아제-비활성화된 형태의 Cas9(dCas9)는 전사활성화 도메인과 융합될 때 프로그래밍 가능한 합성 전사 인자로서 조작되었다. 이러한 시스템은 CRISPR 활성화(CRISPRa) 시스템으로 불리워진다[Chavez et al., 2015; Gilbert et al., 2013; Konermann et al., 2015; Tanenbaum et al., 2014; Zalatan et al., 2015]. 이러한 시스템은 보고에 따르면, 높은 정밀도로 침묵화된 염색질 유전자좌(silenced chromatic locus)를 표적화하고 다운스트림 유전자 전사를 증진시키기 위해 개척 인자로서 기능할 수 있다[Polstein et al., 2015]. 이러한 특징과 함께, CRISPRa 시스템은 하나의 계통에서 다른 계통 특이적 세포로의 세포 재프로그래밍을 위한 내인성 염색질 유전자좌를 정밀하게 리모델링하기 위한 유리한 도구를 제공한다[Black et al., 2016; Chakraborty et al., 2014]. 그러나, 이러한 시스템이 모든 계통의 세포에 대한 전체 범위의 분화 가능성을 갖는 유도 만능 줄기세포를 생성시킬 수 있는 지의 여부 및/또는 이러한 시스템이 이를 생성하기 위해 어떻게 작동될 수 있는 지는 알려져 있지 않다.
본 개시내용은 유도 만능 줄기세포(iPSC)가 체세포에서 선택적 내인성 유전자좌를 표적화하고 리모델링함으로써 생성될 수 있다는 본 명세서에서의 발견으로 예측되고, 부분적으로, 비-iPSC에서 적어도 하나의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 적어도 하나의 내인성 유전자좌를 표적화하고 iPSC를 생성시키기 위해 CRISPR 활성화 시스템 및 적어도 하나의 sgRNA를 사용하여 비-iPSC에서 선택적 내인성 유전자좌를 리모델링하는 것을 포함하는 iPSC를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 iPSC를 생성시키는 방법은 재프로그래밍된 비-iPSC 세포를, TGFβR 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자와 접촉시키고; 선택적으로, 생성된 iPSC를, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하지만 TGFβR 억제제를 포함하지 않는 소분자와 접촉시키는 것을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 활성화 시스템은 적어도 하나의 전사 활성인자와 융합된 뉴클레아제-비활성화된 Cas9(dCas9)를 포함한다. 다른 실시형태에서, CRISPR 활성화 시스템은 적어도 하나의 전사 활성인자에 dCas9를 연결시키는 펩타이드의 탠덤 어레이를 더 포함한다. 일 실시형태에서, 펩타이드의 탠덤 어레이는 SunTag 어레이이다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 전사 활성인자는 단순 포진 VP16 전사 활성인자 도메인의 테트라머(VP64)이다. 일 실시형태에서, CRISPR 활성화 시스템은 dCas9-SunTag-VP64이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 dCas9, dCas9에 융합된 SunTag 어레이, 및 SunTag 어레이에 부착된 p300의 적어도 하나의 아세틸트랜스퍼라제 활성 도메인(p300코어)를 포함하는, CRISPR 활성화 시스템을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 dCas9, SunTag 어레이, 및 p300코어를 포함하는 CRISPR 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 생성시키는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 내인성 유전자좌는 Oct4, Sox2, Klf4 , c-Myc, Lin28, Nanog, Nr5a2, Glis1, Cebpa, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 단일 내인성 유전자좌는 표적화되고 리모델링된다. 일부 실시형태에서, 단일 내인성 유전자좌는 Oct4 또는 Sox2이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터, sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서, sgRNA를 표적화하는 Sox2 프로모터, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터는 서열번호 1 내지 6, 57 및 58로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서는 서열번호 7 내지 11로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Sox2 유전자는 서열번호 12 내지 21 및 59로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 Klf4 유전자이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Klf4 유전자는 서열번호 22 내지 31 및 60으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 c-Myc 유전자이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 c- Myc 유전자는 서열번호 32 내지 41 및 61로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 Nr5a2 유전자이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Nr5a2는 서열번호 42 내지 45로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 Glis1 유전자이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Glis1 유전자는 서열번호 46 내지 50으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 sgRNA는 sgRNA를 표적화하는 Cebpa 유전자이다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Cebpa 유전자는 서열번호 51 내지 56으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Lin28 프로모터를 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA 표적화하는 Lin28은 서열번호 62를 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Nanog 프로모터를 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA 표적화하는 Nanog는 서열번호 63을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 EEA-모티프를 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA 표적화하는 EEA-모티프는 서열번호 64를 포함한다.
일부 실시형태에서, 비-iPSC는 체세포, 예를 들어, 섬유아세포, 피부 세포, 제대혈 세포, 말초 혈액 세포 또는 신장 상피 세포이다. 일부 실시형태에서, 비-iPSC는 포유류 세포이다. 다른 실시형태에서, 비-iPSC는 인간 세포이다.
도 1은 유전자 활성화에 의한 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서의 만능성 네트워크의 확립을 나타낸다. (A) 유전자 활성화에서 dCas9-SunTag-VP64 복합물을 도시한 도식. (B) OG2 MEF에서 재프로그래밍 절차를 도시한 도식. (C) OG2 MEF는 EGFP-양성 콜로니를 형성하기 위해 재프로그래밍되었다. 0일에 MEF 및 7일 및 15일에 재프로그래밍된 콜로니의 모폴로지가 도시되어 있다(스케일 막대, 200㎛). (D) 12시간에 걸친 내인성 Oct4 및 Sox2 전사. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 던네트 시험(Dennett test)을 이용한 일원 ANOVA에 의해 결정되었다. **p<0.01. (E) 인시투(in situ) 및 계대배양 1 및 20에서의 EGFP 신호를 나타낸 콜로니(스케일 막대, 200㎛). (F) EGFP-양성 콜로니에서의 Nanog, Sox2, 및 SSEA-1 염색(스케일 막대, 200㎛). (G) 확립된 CRISPR iPSC 및 R1 마우스 배아 줄기(R1 ES) 세포에서의 만능성 유전자 발현.
도 2는 Sox2 유전자의 활성화가 MEF에서 iPSC를 생성시키기에 충분함을 나타낸다. (A) 전사 인자(Oct4, Sox2, Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물, 및 히스톤 H3K27ac의 분포의 결합 피크와 함께 Sox2 프로모터에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (B) 4일에 면역형광 염색에 의해 Sox2 단백질의 검출(스케일 막대: 100㎛). (C) 명시된 sgRNA의 존재 하에서의 Sox2 활성화. O-71 및 O-127은 Oct4 프로모터를 표적화하는 반면, S-84, S-136, 및 S-148은 Sox2 프로모터를 표적화한다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01. (D) sgRNA O-71, O-127, S-84, S-136, 또는 S-148로 Oct4 또는 Sox2 프로모터를 표적화함으로부터 생성된 콜로니의 수. 3회의 독립된 시험이 도시된다. (E) S-84로 Sox2 유전자를 활성화시킴으로써 인시투 및 iPSC 라인에서의 EGFP-양성 콜로니의 생성(스케일 막대, 200㎛). (F) S-84로 생성된 EGFP-양성 콜로니에서의 Nanog, Sox2, 및 SSEA-1 염색(스케일 막대, 200㎛). (G) -17 세포주 및 R1 ES 세포에서 만능성 유전자 발현의 비교. (H) S-17 라인의 수컷 핵형. (I) 내지 (K) 생체내에서 만능성 S-17의 특징분석. 키메라 마우스는 S-17 세포로 생성되었으며(J), 이러한 세포는 강렬한 EGFP 신호에 의해 나타낸 생식선 조직에 기여하였고(I) 생식계열 전파에 능력을 갖는다(K).
도 3은 Sox2 프로모터의 리모델링이 S-17 MEF에서 만능성에 대한 리프로그래밍을 촉발시킴을 나타낸다. (A) S-17 MEF의 생성을 도시한 도식. (B) S-17 MEF에서 독시사이클린과 함께 또는 이의 없이 12일에 걸쳐 Sox2 활성화. (C) 0, 4, 8 및 12일에 Sox2 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (D) 독시사이클린의 존재 하에서의 면역형광 염색에 의한 Sox2 발현의 검출(스케일 막대: 100㎛). (E) S-17 MEF는 EGFP-양성 콜로니를 형성하기 위해 재프로그래밍되었으며, iPSC 라인이 확립됨(스케일 막대: 200㎛). (F) 렌티바이러스 SunTag 재프로그래밍 및 S-17 MEF 재프로그래밍의 효율 비교. (G) S-17 MEF 재프로그래밍에서 12일에 걸친 Oct4, Nanog, 및 Rex1의 유전자 발현. (H) 0, 4, 8 및 12일에 Oct4 , Nanog, 및 Rex1 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (I) 0, 4, 8 및 12일에 Oct4 인핸서에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (J) S-17 MEF 재프로그래밍에서 Sox2 의존성. 4개의 상이한 농도(0, 0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖)의 독시사이클린이 사용되었으며, Sox2 활성화(좌측) 및 재프로그래밍 효율(우측)이 도시되어 있다. (K) S-17 MEF 재프로그래밍에서 Oct4 및 Sox2 리모델링의 상승효과. Oct4 유전자 활성화(좌측) 및 재프로그래밍 효율(우측)이 시험되었다. (L) 만능성 유전자가 과발현되었을 때(OE) 4일 및 12일에 전체(좌측) 및 내인성 Sox2(우측) 발현. 3가지 조건이 시험되었으며: Oct4 단독, Sox2 단독 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4), mCherry(mCh)의 과발현이 대조군으로서 사용되었다. (M) S-17 MEF의 재프로그래밍 효율 및 만능성 유전자 과발현의 비교. (B), (C), (G), (H), (I) 및 (K)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (B)에서 p값은 본페로니 시험으로 이원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (C), (G), (H) 및 (I)에서 p값은 던네트 시험으로 일원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (K)에서 p값은 짝을 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; *p<0.05.
도 4는 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링이 MEF를 iPSC로 재프로그래밍함을 나타낸다. (A) 전사 인자(Oct4 , Sox2 , Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물의 결합 피크, 및 히스톤 H3K27ac 및 DNase 과민성 사이트(DHS)의 분포와 함께 Oct4 프로모터 및 인핸서에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (B) 4일에 Oct4 인핸서 및 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3개의 상이한 사이트가 시험되었다: 전사 시작 사이트의 2.7kb, 1.4kb 및 0.2kb 업스트림. (C) 16일에 걸친 O-127, O-2066, 또는 O-127-2066 sgRNA의 존재 하에서의 내인성 Oct4 전사. (D) Oct4 프로모터(O-127), 인핸서(O-2135, O-2066, O-1965), 또는 프로모터 및 인핸서의 리모델링으로부터 동시에 생성된 콜로니의 수(O-127-2135, O-127-2066, O-127-1965). 4회의 독립 실험이 나타난다. 실험 3의 O-127-2135 배양물 및 실험 4의 O-127-2066/1965에서 콜로니가 관찰되지 않았다. (E) Oct4 프로모터 및 인핸서(O-127-2066)의 동시 리모델링으로부터 인시투 및 p0 iPSC에서 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (F) Oct4-EGFP-양성 콜로니에서의 Nanog , Sox2, 및 Rex1 발현(스케일 막대, 200㎛). (G) D-9 세포주 및 R1 ES 세포에서의 만능성 유전자 발현의 비교. (H) D-9 라인의 핵형 분석. (I) 내지 (K) 생체내에서 만능성 D-9 라인의 특징분석. 키메라 마우스는 D-9 세포로 생성되었으며(J), 이러한 세포는 강력한 EGFP 신호에 의해 나타낸 생식선 조직에 기여하였고(I), 생식계열 전파에 능숙하였다(K). (B) 및 (C)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01.
도 5는 마우스 ES 세포 및 MEF를 분화시키는데 SunTag 시스템에 의한 유전자 활성화를 나타낸다. (A), (B) 전사 인자(Oct4 , Sox2 , Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물의 결합 피크 및 히스톤 H3K27ac의 분포와 함께 Oct4 프로모터 및 인핸서(A) 및 Sox2 프로모터(B)에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (C) Sox2 전사 시작 사이트의 500 bp 업스트림 및 100 bp 다운스트림의 게놈 DNA 서열(서열번호 175). sgRNA(청색) 및 전사 인자(음영) 결합 사이트는 강조된다. (D), (E) 마우스 ES 세포를 분화시키는데 sgRNA를 사용한 Oct4 , Sox2 , Klf4 , c- Myc , Nr5a2 , Glis1, 및 Cebpa의 전사 활성화. 실험 절차를 도시한 도식적 다이어그램(D) 및 각 sgRNA를 사용한 배수 전사 활성화(E)가 나타난다. Gal4 sgRNA는 음성 대조군으로서 사용되었다. (F), (G) MEF에서 sgRNA를 사용한 Oct4 및d Sox2의 전사 활성화. 실험 절차(F) 및 선택된 sgRNA를 사용한 배수 전사 활성화(G)가 도시된다. Gal4 sgRNA는 음성 대조군으로서 사용되었다. sgRNA 표적화 Oct4 프로모터(Oct4 Pro)는 O-71 및 O-127을 포함하며, sgRNA 표적화 Oct4 인핸서(Oct4 Enh)는 O-1965, O-2066, 및 O-2135를 포함한다. sgRNA를 표적화하는 Sox2 프로모터(Sox2 Pro)는 S-84, S-136, 및 S-148을 포함한다. (H) 파네이트, Chir99021, A83-01, 및 포스콜린의 소분자 조합(PCAF)으로서의 Oct4 및 Sox2 활성화. (E), (G), 및 (H)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (E) 및 (G)에서의 p값은 던네트 시험으로의 일원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (H)에서의 p값은 짝을 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. *p<0.05; **p<0.01; ns, 유의미하지 않음.
도 6은 Sox2 유전자의 활성화가 MEF에서 iPSC를 생성시키기에 충분함을 나타낸다. (A) 명시된 유전자를 표적화하는 sgRNA가 sgRNA 툴로부터 제거되었을 때 EGFP-양성 콜로니의 수. (B) 3일에 Oct4 , Sox2, 및 Glis1에 대한 하나의 sgRNA 및 다수의 sgRNA를 사용한 활성화의 비교. (C) 3일에 O-127, S-84, G-215, 또는 모두(OSG)를 사용한 Oct4 , Sox2, 및 Glis1의 전사 활성화. (D) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 함께 표적화하는 것으로부터 인시투 및 p0 iPSC에서 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (E) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 함께 표적화하는 것으로부터 EGFP-양성 콜로니의 Nanog , Sox2, 및 SSEA-1 염색(스케일 막대: 200㎛). (F) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 표적화하는 것으로부터 생성된 EGFP-양성 콜로니의 수. 3회 독립 실험이 나타난다. (G) S-84 sgRNA의 표적외(off-taget) 효과의 검사. 상부 10개의 예측된 표적의 전사가 검사되었다. (B) 및 (C)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; *p<0.05; ns, 유의미하지 않음.
도 7은 Sox2 프로모터의 리모델링이 MEF에서 만능성으로 재프로그래밍을 촉발시킴을 나타낸다. (A) OG2 및 129 MEF에서 S-84로 Sox2 활성화의 비교. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 짝으로 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01. (B) 4일에 129 MEF에서 Sox2 단백질의 염색(스케일 막대: 200㎛). (C) 129 MEF에서 재프로그래밍된 코로니의 생성(스케일 막대: 200㎛). (D) 12개의 확립된 CRISPR iPSC 라인에서 sgRNA 카세트의 카피 수 결정. 클론 8은 명시된 바와 같은 S-17 라인이다. (E) S-17 MEF에서 BFP의 유세포 분석 검사. (F) S-17 MEF 재프로그래밍을 위한 독시사이클린과 함께 또는 이러한 것이 없는 4일에 Sox2-양성 세포의 백분율. (G) S-17 MEF 재프로그래밍에서 S-84 sgRNA의 표적외 효과의 검사. 상부 10개의 예측된 표적의 전사는 qPCR에 의해 검사되었다. (H) 렌티바이러스 SunTag 및 S-17 MEF의 재프로그래밍 효율의 변동 계수(CV) 비교. (I) PCAF 칵테일로의 또는 이러한 것이 없는 재프로그래밍 효율의 비교. (J) 만능성 유전자가 과발현될 때(OE) 4일에 Sox2 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3가지 조건이 시험되었으며: Oct4 단독, Sox2 단독, 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4), mCherry 과발현(mCh OE)은 음성 대조군으로서 사용되었다. (K) OSK 과발현 및 S-17 MEF의 재프로그래밍 효율의 변동 계수(CV) 비교. (L) S-17 TTF는 재프로그래밍 가능하였다. 0일에 S-17 TTF 및 7 및 14일에 재프로그래밍된 콜로니의 모폴로지는 Oct4-EGFP의 활성화와 함께 나타낸다(스케일 막대: 200㎛).
도 8은 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링이 MEF를 iPSC로 재프로그래밍하는 것을 나타낸다. (A) 2개의 sgRNA 표적화 Sox2(S-148) 및 c- Myc(M-154)를 도입함으로써 ES 세포를 분화시키는데 이중-sgRNA 카세트의 기능 검증. (B) 재프로그래밍의 8일에 Oct4 단백질 염색(스케일 막대: 200㎛). (C) O-127(좌측) 및 O-2066(우측)의 표적외 효과의 시험. 각 sgRNA에 대한 상부 10개의 예측된 표적의 전사는 qPCR에 의해 시험되었다. (D) 만능성 유전자가 과발현되었을 때(OE), 4 및 12일에 전체(좌측) 및 내인성(우측) Oct4의 전사. 2가지 조건이 시험되었다: Oct4 단독 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4). mCherry는 음성 대조군으로서 사용되었다. (E) dCas9-SunTag-p300코어 및 이의 기능을 도시한 도식. (F) dCas9-SunTag-VP64 및 dCas9-SunTag-p300코어 시스템에 대한 5일에 Oct4 인핸서 및 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3개의 상이한 사이트가 시험되었다: 전사 시작 사이트의 2.7kb, 1.4kb 및 0.2kb 업스트림. (G) 15일에 걸친 dCas9-SunTag-VP64 또는 dCas9-SunTag-p300코어로의 Oct4의 전사 활성화. (H) dCas9-SunTag-p300코어로 Oct4 프로모터 및 인핸서의 아세틸화를 조작함으로써 생성된 인시투 및 p1 iPSC(D-16)에서의 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (I) D-16 세포주 및 R1 ES 세포에서 만능성 유전자 발현의 비교. (A), (D), 및 (G)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (A) 및 (D)에서의 p값은 본페로니 시험으로 이원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (G)에서의 p값은 짝을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; ns, 유의미하지 않음.
도 9는 CRISPRa가 시간에 따라 만능성 모폴로지를 채택하고 유지하는 인간 iPSC 콜로니를 생성시킴을 나타낸다. 상부 패널은, EEA가 EEA가 없이 생성된 hiPSC(28일의 하부 패널)와 비교하여 iPSC 생성에서 포함될 때 더욱 견고함을 나타낸다.
도 10은 CRISPRa 생성 인간 iPSC 콜로니에서 만능성 유전자의 발현을 나타낸다. A: EEA 없이 생성된 28일 hiPSC, 및 MOI=1.2; 및 B: EEA로 생성된 28일 hiPSC, 및 MOI=1.2; C: EEA로 생성된 21일 hiPSC, 및 MOI=6.
도 11은 Oct4(Pou5f1), Sox2, Lin28, Nanog, 및 Rex1을 포함하는 표적화된 또는 비-표적화된 내인성 유전자 둘 모두의 증가된 발현에 의해 나타낸, 시간에 따른 재프로그래밍된 집단에서 내인성 만능성 프로그램이 활성화됨을 나타낸다.
도 12는 만능성 유전자 TRA-1-81의 발현이 유세포 분석법에 의해 나타낸 바와 같이 시간에 따라 재프로그래밍된 집단 내에서 증가함을 나타낸다.
도 2는 Sox2 유전자의 활성화가 MEF에서 iPSC를 생성시키기에 충분함을 나타낸다. (A) 전사 인자(Oct4, Sox2, Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물, 및 히스톤 H3K27ac의 분포의 결합 피크와 함께 Sox2 프로모터에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (B) 4일에 면역형광 염색에 의해 Sox2 단백질의 검출(스케일 막대: 100㎛). (C) 명시된 sgRNA의 존재 하에서의 Sox2 활성화. O-71 및 O-127은 Oct4 프로모터를 표적화하는 반면, S-84, S-136, 및 S-148은 Sox2 프로모터를 표적화한다. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01. (D) sgRNA O-71, O-127, S-84, S-136, 또는 S-148로 Oct4 또는 Sox2 프로모터를 표적화함으로부터 생성된 콜로니의 수. 3회의 독립된 시험이 도시된다. (E) S-84로 Sox2 유전자를 활성화시킴으로써 인시투 및 iPSC 라인에서의 EGFP-양성 콜로니의 생성(스케일 막대, 200㎛). (F) S-84로 생성된 EGFP-양성 콜로니에서의 Nanog, Sox2, 및 SSEA-1 염색(스케일 막대, 200㎛). (G) -17 세포주 및 R1 ES 세포에서 만능성 유전자 발현의 비교. (H) S-17 라인의 수컷 핵형. (I) 내지 (K) 생체내에서 만능성 S-17의 특징분석. 키메라 마우스는 S-17 세포로 생성되었으며(J), 이러한 세포는 강렬한 EGFP 신호에 의해 나타낸 생식선 조직에 기여하였고(I) 생식계열 전파에 능력을 갖는다(K).
도 3은 Sox2 프로모터의 리모델링이 S-17 MEF에서 만능성에 대한 리프로그래밍을 촉발시킴을 나타낸다. (A) S-17 MEF의 생성을 도시한 도식. (B) S-17 MEF에서 독시사이클린과 함께 또는 이의 없이 12일에 걸쳐 Sox2 활성화. (C) 0, 4, 8 및 12일에 Sox2 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (D) 독시사이클린의 존재 하에서의 면역형광 염색에 의한 Sox2 발현의 검출(스케일 막대: 100㎛). (E) S-17 MEF는 EGFP-양성 콜로니를 형성하기 위해 재프로그래밍되었으며, iPSC 라인이 확립됨(스케일 막대: 200㎛). (F) 렌티바이러스 SunTag 재프로그래밍 및 S-17 MEF 재프로그래밍의 효율 비교. (G) S-17 MEF 재프로그래밍에서 12일에 걸친 Oct4, Nanog, 및 Rex1의 유전자 발현. (H) 0, 4, 8 및 12일에 Oct4 , Nanog, 및 Rex1 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (I) 0, 4, 8 및 12일에 Oct4 인핸서에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. (J) S-17 MEF 재프로그래밍에서 Sox2 의존성. 4개의 상이한 농도(0, 0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖)의 독시사이클린이 사용되었으며, Sox2 활성화(좌측) 및 재프로그래밍 효율(우측)이 도시되어 있다. (K) S-17 MEF 재프로그래밍에서 Oct4 및 Sox2 리모델링의 상승효과. Oct4 유전자 활성화(좌측) 및 재프로그래밍 효율(우측)이 시험되었다. (L) 만능성 유전자가 과발현되었을 때(OE) 4일 및 12일에 전체(좌측) 및 내인성 Sox2(우측) 발현. 3가지 조건이 시험되었으며: Oct4 단독, Sox2 단독 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4), mCherry(mCh)의 과발현이 대조군으로서 사용되었다. (M) S-17 MEF의 재프로그래밍 효율 및 만능성 유전자 과발현의 비교. (B), (C), (G), (H), (I) 및 (K)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (B)에서 p값은 본페로니 시험으로 이원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (C), (G), (H) 및 (I)에서 p값은 던네트 시험으로 일원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (K)에서 p값은 짝을 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; *p<0.05.
도 4는 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링이 MEF를 iPSC로 재프로그래밍함을 나타낸다. (A) 전사 인자(Oct4 , Sox2 , Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물의 결합 피크, 및 히스톤 H3K27ac 및 DNase 과민성 사이트(DHS)의 분포와 함께 Oct4 프로모터 및 인핸서에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (B) 4일에 Oct4 인핸서 및 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3개의 상이한 사이트가 시험되었다: 전사 시작 사이트의 2.7kb, 1.4kb 및 0.2kb 업스트림. (C) 16일에 걸친 O-127, O-2066, 또는 O-127-2066 sgRNA의 존재 하에서의 내인성 Oct4 전사. (D) Oct4 프로모터(O-127), 인핸서(O-2135, O-2066, O-1965), 또는 프로모터 및 인핸서의 리모델링으로부터 동시에 생성된 콜로니의 수(O-127-2135, O-127-2066, O-127-1965). 4회의 독립 실험이 나타난다. 실험 3의 O-127-2135 배양물 및 실험 4의 O-127-2066/1965에서 콜로니가 관찰되지 않았다. (E) Oct4 프로모터 및 인핸서(O-127-2066)의 동시 리모델링으로부터 인시투 및 p0 iPSC에서 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (F) Oct4-EGFP-양성 콜로니에서의 Nanog , Sox2, 및 Rex1 발현(스케일 막대, 200㎛). (G) D-9 세포주 및 R1 ES 세포에서의 만능성 유전자 발현의 비교. (H) D-9 라인의 핵형 분석. (I) 내지 (K) 생체내에서 만능성 D-9 라인의 특징분석. 키메라 마우스는 D-9 세포로 생성되었으며(J), 이러한 세포는 강력한 EGFP 신호에 의해 나타낸 생식선 조직에 기여하였고(I), 생식계열 전파에 능숙하였다(K). (B) 및 (C)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01.
도 5는 마우스 ES 세포 및 MEF를 분화시키는데 SunTag 시스템에 의한 유전자 활성화를 나타낸다. (A), (B) 전사 인자(Oct4 , Sox2 , Nanog), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 p300, 매개체 복합물의 결합 피크 및 히스톤 H3K27ac의 분포와 함께 Oct4 프로모터 및 인핸서(A) 및 Sox2 프로모터(B)에 대한 sgRNA 표적화 사이트를 도시한 도식[Whyte et al., 2013]. (C) Sox2 전사 시작 사이트의 500 bp 업스트림 및 100 bp 다운스트림의 게놈 DNA 서열(서열번호 175). sgRNA(청색) 및 전사 인자(음영) 결합 사이트는 강조된다. (D), (E) 마우스 ES 세포를 분화시키는데 sgRNA를 사용한 Oct4 , Sox2 , Klf4 , c- Myc , Nr5a2 , Glis1, 및 Cebpa의 전사 활성화. 실험 절차를 도시한 도식적 다이어그램(D) 및 각 sgRNA를 사용한 배수 전사 활성화(E)가 나타난다. Gal4 sgRNA는 음성 대조군으로서 사용되었다. (F), (G) MEF에서 sgRNA를 사용한 Oct4 및d Sox2의 전사 활성화. 실험 절차(F) 및 선택된 sgRNA를 사용한 배수 전사 활성화(G)가 도시된다. Gal4 sgRNA는 음성 대조군으로서 사용되었다. sgRNA 표적화 Oct4 프로모터(Oct4 Pro)는 O-71 및 O-127을 포함하며, sgRNA 표적화 Oct4 인핸서(Oct4 Enh)는 O-1965, O-2066, 및 O-2135를 포함한다. sgRNA를 표적화하는 Sox2 프로모터(Sox2 Pro)는 S-84, S-136, 및 S-148을 포함한다. (H) 파네이트, Chir99021, A83-01, 및 포스콜린의 소분자 조합(PCAF)으로서의 Oct4 및 Sox2 활성화. (E), (G), 및 (H)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (E) 및 (G)에서의 p값은 던네트 시험으로의 일원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (H)에서의 p값은 짝을 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. *p<0.05; **p<0.01; ns, 유의미하지 않음.
도 6은 Sox2 유전자의 활성화가 MEF에서 iPSC를 생성시키기에 충분함을 나타낸다. (A) 명시된 유전자를 표적화하는 sgRNA가 sgRNA 툴로부터 제거되었을 때 EGFP-양성 콜로니의 수. (B) 3일에 Oct4 , Sox2, 및 Glis1에 대한 하나의 sgRNA 및 다수의 sgRNA를 사용한 활성화의 비교. (C) 3일에 O-127, S-84, G-215, 또는 모두(OSG)를 사용한 Oct4 , Sox2, 및 Glis1의 전사 활성화. (D) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 함께 표적화하는 것으로부터 인시투 및 p0 iPSC에서 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (E) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 함께 표적화하는 것으로부터 EGFP-양성 콜로니의 Nanog , Sox2, 및 SSEA-1 염색(스케일 막대: 200㎛). (F) Oct4 , Sox2, 및 Glis1 프로모터를 표적화하는 것으로부터 생성된 EGFP-양성 콜로니의 수. 3회 독립 실험이 나타난다. (G) S-84 sgRNA의 표적외(off-taget) 효과의 검사. 상부 10개의 예측된 표적의 전사가 검사되었다. (B) 및 (C)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 쌍을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; *p<0.05; ns, 유의미하지 않음.
도 7은 Sox2 프로모터의 리모델링이 MEF에서 만능성으로 재프로그래밍을 촉발시킴을 나타낸다. (A) OG2 및 129 MEF에서 S-84로 Sox2 활성화의 비교. 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. p값은 짝으로 이루어지 않는 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01. (B) 4일에 129 MEF에서 Sox2 단백질의 염색(스케일 막대: 200㎛). (C) 129 MEF에서 재프로그래밍된 코로니의 생성(스케일 막대: 200㎛). (D) 12개의 확립된 CRISPR iPSC 라인에서 sgRNA 카세트의 카피 수 결정. 클론 8은 명시된 바와 같은 S-17 라인이다. (E) S-17 MEF에서 BFP의 유세포 분석 검사. (F) S-17 MEF 재프로그래밍을 위한 독시사이클린과 함께 또는 이러한 것이 없는 4일에 Sox2-양성 세포의 백분율. (G) S-17 MEF 재프로그래밍에서 S-84 sgRNA의 표적외 효과의 검사. 상부 10개의 예측된 표적의 전사는 qPCR에 의해 검사되었다. (H) 렌티바이러스 SunTag 및 S-17 MEF의 재프로그래밍 효율의 변동 계수(CV) 비교. (I) PCAF 칵테일로의 또는 이러한 것이 없는 재프로그래밍 효율의 비교. (J) 만능성 유전자가 과발현될 때(OE) 4일에 Sox2 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3가지 조건이 시험되었으며: Oct4 단독, Sox2 단독, 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4), mCherry 과발현(mCh OE)은 음성 대조군으로서 사용되었다. (K) OSK 과발현 및 S-17 MEF의 재프로그래밍 효율의 변동 계수(CV) 비교. (L) S-17 TTF는 재프로그래밍 가능하였다. 0일에 S-17 TTF 및 7 및 14일에 재프로그래밍된 콜로니의 모폴로지는 Oct4-EGFP의 활성화와 함께 나타낸다(스케일 막대: 200㎛).
도 8은 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링이 MEF를 iPSC로 재프로그래밍하는 것을 나타낸다. (A) 2개의 sgRNA 표적화 Sox2(S-148) 및 c- Myc(M-154)를 도입함으로써 ES 세포를 분화시키는데 이중-sgRNA 카세트의 기능 검증. (B) 재프로그래밍의 8일에 Oct4 단백질 염색(스케일 막대: 200㎛). (C) O-127(좌측) 및 O-2066(우측)의 표적외 효과의 시험. 각 sgRNA에 대한 상부 10개의 예측된 표적의 전사는 qPCR에 의해 시험되었다. (D) 만능성 유전자가 과발현되었을 때(OE), 4 및 12일에 전체(좌측) 및 내인성(우측) Oct4의 전사. 2가지 조건이 시험되었다: Oct4 단독 및 OSK(Oct4 , Sox2, 및 Klf4). mCherry는 음성 대조군으로서 사용되었다. (E) dCas9-SunTag-p300코어 및 이의 기능을 도시한 도식. (F) dCas9-SunTag-VP64 및 dCas9-SunTag-p300코어 시스템에 대한 5일에 Oct4 인핸서 및 프로모터에서의 히스톤 H3K27 아세틸화 수준. 3개의 상이한 사이트가 시험되었다: 전사 시작 사이트의 2.7kb, 1.4kb 및 0.2kb 업스트림. (G) 15일에 걸친 dCas9-SunTag-VP64 또는 dCas9-SunTag-p300코어로의 Oct4의 전사 활성화. (H) dCas9-SunTag-p300코어로 Oct4 프로모터 및 인핸서의 아세틸화를 조작함으로써 생성된 인시투 및 p1 iPSC(D-16)에서의 EGFP-양성 콜로니의 모폴로지(스케일 막대, 200㎛). (I) D-16 세포주 및 R1 ES 세포에서 만능성 유전자 발현의 비교. (A), (D), 및 (G)에서의 데이터는 평균 ± SD(n = 4)를 나타낸다. (A) 및 (D)에서의 p값은 본페로니 시험으로 이원 ANOVA에 의해 결정되었으며, (G)에서의 p값은 짝을 이루어지 않은 t 검정에 의해 결정되었다. **p<0.01; ns, 유의미하지 않음.
도 9는 CRISPRa가 시간에 따라 만능성 모폴로지를 채택하고 유지하는 인간 iPSC 콜로니를 생성시킴을 나타낸다. 상부 패널은, EEA가 EEA가 없이 생성된 hiPSC(28일의 하부 패널)와 비교하여 iPSC 생성에서 포함될 때 더욱 견고함을 나타낸다.
도 10은 CRISPRa 생성 인간 iPSC 콜로니에서 만능성 유전자의 발현을 나타낸다. A: EEA 없이 생성된 28일 hiPSC, 및 MOI=1.2; 및 B: EEA로 생성된 28일 hiPSC, 및 MOI=1.2; C: EEA로 생성된 21일 hiPSC, 및 MOI=6.
도 11은 Oct4(Pou5f1), Sox2, Lin28, Nanog, 및 Rex1을 포함하는 표적화된 또는 비-표적화된 내인성 유전자 둘 모두의 증가된 발현에 의해 나타낸, 시간에 따른 재프로그래밍된 집단에서 내인성 만능성 프로그램이 활성화됨을 나타낸다.
도 12는 만능성 유전자 TRA-1-81의 발현이 유세포 분석법에 의해 나타낸 바와 같이 시간에 따라 재프로그래밍된 집단 내에서 증가함을 나타낸다.
본 개시내용은 CRISPR 활성화 시스템으로 내인성 유전자좌를 표적화하고 리모델링함으로써 유도 만능 줄기세포(iPSC)의 생성에 관한 것이다.
본 개시가 기술된 특정 실시형태로 제한되지 않고 이러한 것이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용의 범위가 단지 첨부된 청구범위에 의해 제한되기 때문에, 본 명세서에서 사용되는 용어가 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 것으로서 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위해 다양한 섹션으로 나누어지며, 임의의 섹션에서 발견된 본 개시내용은 다른 섹션에서의 것과 조합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질이 또한, 본 개시내용의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술되어 있다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 함께 방법 및/또는 물질을 개시하고 기술하기 위해 참조에 의해 포함된다.
I. 정의
본 개시내용의 이해를 촉진하기 위해, 다수의 용어들이 하기에서 정의된다. 달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어의 표현은 단지 단수 독립체를 지칭하는 것으로 의도되지 않고, 특정 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생성하다"는 염색체 구조, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA), 폴리펩타이드의 아미노산 서열(예를 들어, 단백질), 유전자의 전사 수준, 염색체 영역의 후생적 변형, 단백질의 전사 수준, 및 RNA의 전사 수준을 변경시키는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 임의의 조작을 통해 이의 자연 발생 상태로부터 생물학적 조성물(예를 들어, 세포)의 생산 및/또는 변경을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재프로그래밍(reprogramming)" 또는 "탈분화(dedifferentiation)" 또는 "세포 효능을 증가시키는 것(increasing cell potency)" 또는 "발달 효능을 증가시키는 것"은 세포의 효능을 증가시키거나 세포를 덜 분화된 상태로 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효능을 갖는 세포는 비-재프로그래밍된 상태에서 동일한 세포와 비교하여 더 큰 발달 가소성을 갖는다(즉, 더 큰 많은 세포 타입으로 분화할 수 있다). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍된 상태에서 동일한 세포보다 더 적은 분화된 상태를 갖는 것이다.
용어 "만능(pluripotent)" 또는 "만능성"은 신체에서 자가-재생하고 다수의 조직 또는 모든 계통 세포 타입으로 분화하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 3가지 배엽 각각, 즉, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기세포의 타입이다. 만능성은 완전한 유기체를 생성하지 못할 수 있는 불완전하게 또는 부분적으로 만능 세포(예를 들어, 외배엽 줄기세포 또는 EpiSC) 내지 완전한 유기체를 생성시킬 수 있는 더욱 원시적이고 더욱 만능성의 세포(예를 들어, 배아 줄기세포)의 범위에서 발달 효능의 연속체이다.
만능성은 부분적으로, 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기세포 모폴로지; (ii) 비제한된 자가-재생에 대한 가능성; (iii) SSEA1(단지 마우스), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 만능 줄기세포 마커의 발현; (iv) 모두 3가지 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력; (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배양체의 형성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
종래에 2가지 타입의 만능성이 기술되었다: 후기 배반포의 외배엽 줄기세포(EpiSC)와 유사한 "프라이밍된(primed)" 또는 "준안정한" 상태의 만능성, 및 초기/이식전 배반포의 내부 세포 물질과 유사한 "미경험(Naive)" 또는 "바닥(Ground)" 상태의 만능성. 두 만능성 상태가 상기에 기술된 바와 같은 특징을 나타내지만, 미경험 또는 바닥 상태는 추가로 (i) 암컷 세포에서 X-염색체의 사전-비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일 세포 배양 동안 개선된 클론화 및 생존; (iii) DNA 메틸화의 전체적인 감소; (iv) 발달 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억제성 염색질 마크 침적의 감소; 및 (v) 프라이밍된 상태의 만능 세포에 비해 분화 마커의 발현 감소를 나타낸다. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현되고, 이후에 얻어진 만능 세포로부터 침묵 또는 제거된 세포 재프로그래밍의 표준 방법론은 일반적으로 만능성의 프라이밍된 상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건 하에서, 이러한 세포는 외인성 전사유전자 발현이 유지되지 않는 경우 프라이밍된 상태로 유지되며, 여기서, 바닥 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 만능 줄기세포" 또는, iPSC는 줄기세포가 덜 분화된 상태를 갖는 세포로 유도되거나 변경된, 즉, 인공적으로 재프로그래밍되어 특정의 줄기세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 배양체 형성, 기형종 형성, 살아있는 키메라 형성과 같은 만능성의 특징을 나타내고, 모두 3개의 생식 또는 피부층, 즉, 내배엽(예를 들어, 내부 위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽(예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(예를 들어, 표피 조직 및 신경계)으로 분화할 수 있는, 분화된 성인, 신생아 또는 태아 세포로부터 생성됨을 의미한다. 생성된 iPSC는 이러한 것이 자연에서 발견되는 것과 같은 세포로 지칭되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "만능 줄기세포 모폴로지"는 배아 줄기세포의 전통적인 모폴로지 특징을 지칭한다. 일반적인 배아 줄기세포 모폴로지는 높은 핵-대-세포질 비율, 핵소체의 주목할 만한 존재, 및 통상적인 세포간 간격과 함께 형상이 둥글고 작은 것으로 특징된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비-iPSC"는 분화되거나 일부 분화된 상태의 임의의 세포를 지칭하는 것으로서, 배아 줄기세포(ESC) 또는 iPSC가 아니다. 비-iPSC는 내부 장기, 피부, 뼈, 혈액, 신경 조직 및 결합 조직을 포함하는, 신체의 임의의 비-생식계열 조직으로부터 유래할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "CRISPR/Cas 시스템"은 외래 핵산에 대한 방어를 위해 박테리아로부터 유래된 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 광범위한 진정 세균 및 고세균 유기체에서 발견되고, 타입 I, II, 및 III 서브-타입을 포함한다. CRISPR 관련 뉴클레아제는 cas, cpf, cse, csy, csn, csd, cst, csh, csa, csm, 및 cmr을 포함하는 패밀리로부터 유래한다. 야생형 타입 II CRISPR/Cas 시스템은 외래 핵산을 인식하고 분열시키기 위해, 때때로 전사활성화 crRNA(tracrRNA)뿐만 아니라 CRISPR RNA(crRNA)와 복합체의 RNA-매개 뉴클레아제를 사용한다. crRNA 및 tracrRNA가 Cas9의 경우에 필요한 경우에, 예를 들어, crRNA 및 tracrRNA는 Cas9와 조합될 때, sgRNA 내의 가이드 서열과 표적 DNA 서열 사이에서 상보적 염기 쌍을 통해 DNA 표적을 발견하고 본열시키는 단일-가이드 RNA(sgRNA) 분자로 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레아제-비활성화된 Cas9" 또는 "dCas9"는 변형된 Cas9 뉴클레아제를 지칭하며, 여기서, 뉴클레아제 활성은 이의 촉매적 RuvC 및 HNH 도메인에서 잔기를 돌연변이화함으로써 비활성화되었다. 촉매적 도메인의 비활성화는 특정 표적 DNA 서열로 이펙터 또는 마커를 전달하기 위해 RNA-프로그래밍 가능한 뉴클레아제로부터의 Cas9를 RNA-프로그래밍 가능한 DNA 인지 복합물로 전환시킬 수 있다. 유사한 조작은 다른 CRISPR 관련 뉴클레아제에 적용 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 활성화 시스템" 또는 "CRISPRa"는 유전자 전사를 상향조절하기 위해 변형된 CRISPR/Cas 시스템을 지칭하며, 여기서, 비활성화된 Cas 뉴클레아제는 전사 활성인자의 다수의 카피, 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 모집하기 위해 전사 활성인자, 예를 들어, 단순 포진 VP16 전사 활성인자 도메인, VP64 활성인자(VP16의 조작된 테트라머), p65의 활성화 도메인, 다수의 전사 활성인자의 상승적 조합, 스캐폴딩 펩타이드와 융합된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 가이드 폴리뉴클레오타이드" 또는 "sgPNA"는 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용되는 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼합 서열을 지칭한다. 용어 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"는 CRISPR/Cas 시스템과 함께 사용되는 RNA 서열을 지칭한다. sgPNA는 Cas9, 및 요망되는 표적 DNA 서열에 대해 상보적인 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 결합 사이트를 함유한다. 표적 DNA 서열과 sgPNA의 염기 쌍은 DNA 서열로 CRISPR 관련 뉴클레아제를 모집한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적화"는 유전자, 프로모터, 인핸서, 오픈 리딩 프레임, 또는 임의의 다른 염색체 영역을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 염색체 유전자좌에서 임의의 조성 및/또는 길이의 핵산 서열(즉, 표적)을 동정하는 과정을 지칭한다. 사전-동정된 핵산 서열에 대해 상보적인 가이드 서열을 함유한 sgRNA는 이후에 설계되고 합성된다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 사전-동정된 핵산 서열에 대해 sgRNA의 상보적인 염기 쌍을 기초로 하여 사전-동정된 핵산 서열을 갖는 내인성 유전자좌 부근으로 CRISPR 활성화 시스템을 유도한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "리모델링하다" 또는 "리모델링"은 전사 수준에서 유전자의 발현의 임의의 변형을 지칭한다. 예시적인 유전자 리모델링은 유전자의 염색질 구조를 변경시키고, 유전자의 프로모터에 전사 활성인자를 모집하고, 유전자의 인핸서에 전사 활성인자를 모집하고, 특정 효소(예를 들어, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제)에 의해 유전자의 히스톤 변형을 변경시키는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
II. 세포
본 발명은 비-iPSC, 예를 들어, 체세포가 CRISPR 활성화를 통해 내인성 유전자좌에서 만능성-관련 유전자를 단독으로 또는 조합하여 활성화시킴으로써 만능성으로 재프로그래밍될 수 있다는 발견을 근거로 한다.
본 개시내용의 비-iPSC는 줄기세포, 생식 세포, 또는 iPSC가 아닌 신체의 임의의 세포를 포함한다. 비-iPSC의 비제한적인 예는 내부 장기, 피부, 뼈, 혈액, 신경 조직, 및 결합 조직을 포함하는, 신체의 임의의 비-생식계열 조직으로부터 유래된 체세포이다. 일부 실시형태에서, 체세포는 태아 체세포이다. 일부 실시형태에서, 체세포는 성인 체세포이다. 일부 실시형태에서, 비-iPSC는 용이하게 접근 가능하고 최소 침습을 필요로 하는 세포 타입, 예를 들어, 섬유아세포, 피부 세포, 제대혈 세포, 말초 혈액 세포, 및 신장 상피 세포로부터 유래된다.
본 개시내용의 비-iPSC는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있지만, 비-인간 영장류, 뮤린(즉, 마우스 및 래트), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 비-iPSC는 인간 비-iPSC이다.
III. 내인성 유전자좌의
표적화
및 리모델링
본 개시내용은 적어도 하나의 sgRNA 표적화 요망되는 유전자좌를 갖는 CRISPR 활성화 시스템을 사용하여 내인성 유전자좌를 표적화하고 리모델링하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 만능성-연관 유전자이다. 다른 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 비-만능성-연관 유전자이다. 만능성-연관 유전자의 비제한적인 예는 Oct4 , Sox2 , Nanog , Klf4 , c- Myc , Lin28 , Nr5a2 , Glis1 , Cebpa , Esrrb, 및 Rex1이다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 Oct4 또는 Sox2이다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌는 Oct4 , Sox2 , Nanog , Klf4 , c- Myc 및 Lin28의 조합이다.
일부 실시형태에서, iPSC를 생성시키는 방법은 만능성-연관 유전자를 표적화하는 CRISPR 활성화 시스템과 함께 적어도 하나의 sgRNA를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Oct4 , Sox2 , Nanog , Klf4 , c- Myc , Lin28 , Nr5a2, Glis1, Cebpa , Esrrb, 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택된 만능성-연관 유전자를 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Oct4 , Sox2 , Nanog, Klf4 , c- Myc , Lin28, Nr5a2 , Glis1, 및 Cebpa로 이루어진 군으로부터 선택된 만능성-연관 유전자를 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 만능성-연관 유전자의 프로모터 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 만능성-연관 유전자의 인핸서 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Oct4 유전자의 프로모터 영역, Oct4 유전자의 인핸서 영역, Sox2 유전자의 프로모터 영역, 또는 이들의 조합을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Oct4 전사 시작 사이트(transcription start site; TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Oct4 TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Oct4 TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림에서 Oct4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Oct4 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림, 또는 이들 사이의 임의의 영역에서 Oct4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Oct4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Sox2 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Sox2 TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Sox2 TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림의 Sox2 프로모터 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Sox2 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림의 Sox2 프로모터 영역의 영역, 또는 이들 사이의 임의의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Sox2 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Nanog 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Nanog TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nanog TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Nanog TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nanog TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nanog TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Nanog TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림의 Nanog 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Nanog 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림의 Nanog 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Nanog 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Klf4 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Klf4 TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Klf4 TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림의 Klf4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Klf4 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림의 Klf4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역, 또는 이들 사이의 임의의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Klf4 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 c- Myc 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, c- Myc TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, c- Myc TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, c-Myc TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, c- Myc TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, c- Myc TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 c- Myc TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림의 c- Myc 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 c- Myc 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림의 c- Myc 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역 또는 이들 사이의 임의의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 c- Myc 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Nr5a2 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Nr5a2 TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Nr5a2 TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림에서 Nr5a2 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Nr5a2 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림에서 Nr5a2 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역 또는 이들 사이의 임의의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Nr5a2 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Cebpa 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Cebpa TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Cebpa TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림에서 Cebpa 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Cebpa 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림에서 Cebpa 프로모터 및/또는 인핸서 영역, 또는 이들 사이의 임의의 영역에서 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Cebpa 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Esrrb 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Esrrb TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Esrrb TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림에서 Esrrb 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Esrrb 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림에서 또는 이들 사이의 임의의 영역에서 Esrrb 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 임의의 상기 sgRNA는 인간 Esrrb 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Rex1 전사 시작 사이트(TSS)의 약 1- 내지 약 5000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 100-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 200-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 400-bp 내지 약 4000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 500-bp 내지 약 3000-bp 업스트림, Rex1 TSS의 약 600-bp 내지 약 2000-bp 업스트림, 또는 Rex1 TSS의 약 700-bp 내지 약 1000-bp 업스트림에서 Rex1 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Rex1 전사 시작 사이트(TSS)의 약 10-bp, 약 20-bp, 약 30-bp, 약 40-bp, 약 50-bp, 약 60-bp, 약 70-bp, 약 80-bp, 약 90-bp, 약 100-bp, 약 110-bp, 약 120-bp, 약 130-bp, 약 140-bp, 약 150-bp, 약 160-bp, 약 170-bp, 약 180-bp, 약 190-bp, 약 200-bp, 약 300-bp, 약 400-bp, 약 500-bp, 약 600-bp, 약 700-bp, 약 800-bp, 약 900-bp, 약 1000-bp, 약 1500-bp, 약 2000-bp, 2500-bp, 약 3000-bp, 3500-bp, 약 4000-bp, 4500-bp, 약 5000-bp 업스트림에서, 또는 이들 사이의 임의의 영역에서 Rex1 프로모터 및/또는 인핸서 영역의 영역을 표적화한다.
일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터는 서열번호 1 내지 6, 57, 및 58로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서는 서열번호 7 내지 11로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Sox2 프로모터는 서열번호 12 내지 21 및 59로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Klf4 유전자는 서열번호 22 내지 31 및 60으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 c- Myc 유전자는 서열번호 32 내지 41 및 61로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Nr5a2 유전자는 서열번호 42 내지 45로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Glis1 유전자는 서열번호 46 내지 50으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Cebpa 유전자는 서열번호 51 내지 56으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Lin28 유전자는 서열번호 62를 포함한다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 Nanog 유전자는 서열번호 63을 포함한다. 다른 실시형태에서, sgRNA를 표적화하는 EEA-모티프는 서열번호 64를 포함하며, 여기서, EEA-모티프는 PRD-유사 호메오도메인 TR 결합 사이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 만능성 유전자의 전사와 관련된 조절 영역이다.
IV.
CRISPR
활성화 시스템
본 개시내용은 박테리아 CRISPR/Cas 시스템으로부터 기원한 CRISPR 활성화 시스템에 대해 예측된다. CRISPR 활성화 시스템은 이의 뉴클레아제 활성을 비활성화된 타입 II Cas를 포함하고, 유전자 전사를 조절하기 위해 이펙터와 융합되었다. 일부 실시형태에서, dCas는 적어도 하나의 전사 활성인자로 융합된다. 일부 실시형태에서, dCas는 다수의 전사 활성인자와 dCas를 연결시키기 위해 스캐폴딩 구조로서 기능하는 펩타이드의 탠덤 어레이와 융합된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드의 탠덤 어레이는 SunTag 어레이이다. 다른 실시형태에서, 전사활성인자는 단순 포진 VP16 전사 활성인자 도메인의 테트라머(VP64)이다. 일 실시형태에서, CRISPR 활성화 시스템은 SunTag CRISPR 활성화 시스템으로도 공지된, dCas-SunTag-VP64이다.
일부 실시형태에서, CRISPR 활성화 시스템은 SunTag 어레이와 융합된 dCas9, 및 SunTag 어레이에 부착된 p300의 적어도 하나의 아세틸트랜스퍼라제 활성 도메인(p300코어)을 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC를 생성시키는 방법은 내인성 유전자좌의 히스톤 아세틸화를 개질시켜, 유전자의 전사를 조절하기 위해 dCas9, SunTag 어레이, 및 p300코어를 포함하는 CRISPR 활성화 시스템을 사용하는 것을 포함한다. 당업자에게 공지된 다른 CRISPR 활성화 시스템 및/또는 전사활성인자가 iPSC를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
실시예
하기 실시예는 개시의 특정 실시형태를 추가로 예시하는 것으로 의도된다. 실시예는 당업자에게 제공하기 위해 제시되고 이의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
실시예 1. dCas9-SunTag-VP64로 내인성 Oct4 및 Sox2의 활성화
내인성 유전자좌의 리모델링이 만능성으로의 재프로그래밍을 개시하는 지의 여부 또는 방법을 결정하기 위해, SunTag CRISPR 활성화 시스템을 사용하여 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 내인성 만능성 유전자좌를 정밀하게 리모델링하였다. 다수의 VP64를 하나의 표적화 사이트로 모집함으로써 dCas9-SunTag-VP64를 이의 향상된 염색질-리모델링 활성에 대해 선택하였다(도 1A)[Tanenbaum et al., 2014]. dCas9 발현을 Tet-On 프로모터에 의해 조절하였다. 만능성 유도 및 유지의 중심 역할로 인해 Oct4 및 Sox2 유전자좌를 표적으로서 선택하였다.
MEF를 E13.5 마우스 배아로부터 제조하였다. 배아 회수 후에, 두부, 사지, 및 내부 장기, 특히, 생식선을 해부 현미경 아래에서 제거하였다. 배아의 나머지 바디를 2개의 칼날로 잘게 자르고, 0.05% 트립신-EDTA에서 15분 동안 소화시켰다. 이후에, MEF 배지를 첨가하여 트립신화를 중지하였다. 여러 차례 피펫팅함으로써 조직의 추가 분리를 수행하였다. 이후에, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 확장을 위해 15 cm 접시 상에 플레이팅하였다(P0). 모든 시험을 위해 P3 전에 MEF 세포를 사용하고, 10% FBS 및 비-필수 아미누산이 보충된 DMEM 중에서 배양하였다.
Oct4 및 Sox2 프로모터뿐만 아니라 Oct4 인핸서를 표적화하기 위해 sgRNA를 소화시켰다. ssRNA의 활성화 효과 이외에, 만능성 인자 및 전사 기구의 결합 사이트에 근접하지만 중첩되지 않은 것, 만능 줄기세포에서의 히스톤 H3K27 아세틸화, 및 매개체 복합물에 의해 매개된 프로모터-인핸서 루프를 형성할 이의 가능성을 포함하는 표적화된 게놈 서열과 관련하여 다수의 인자를 고려하였다(도 5A 내지 도 5C).
sgRNA 작제물을 위하여, 특정 sgRNA 서열을 포함하는 72-bp oligo를 프라이머 sgRNA-F(서열번호 173 --GTATCCCTTGGAGAACCACCT) 및 sgRNA-R(서열번호 174 --TGCTGTTTCCAGCTTAGCTCT)로의 PCR 증폭을 위해 합성하였다. 증폭된 단편을 정제하고, BstXI 및 BlpI로 소화된 pSLQ1373 작제물과 함께 Gibson Assembly Cloning Kit 프로토콜(NEB)에 따른 재조합 반응을 위해 사용하였다.
표적 유전자의 전사 활성화의 수준을 분화하는 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서 렌티바이러스에 의해 전달된 각각 설계된 Oct4 및 Sox2 sgRNA로 시험하였다(도 5D). HEK293T/17 세포(ATCC® CRL-11268)를 10% FBS가 보충된 DMEM 중에서 배양하고, 트랜스펙션을 위해 약 70% 컨플루언시에 도달하기 위해 1일 전에 플레이팅하고, VSV-G 엔벨로프 발현 플라스미드 pMD2.G(Addgene, 12259) 및 psPAX2(Addgene, 12260)를 렌티바이르서 패키징을 위해 사용하였다. 고려되는 유전자를 갖는 플라스미드(1.8㎍)를 6-웰 플레이트의 각 웰에서 psPAX2(1.35㎍) 및 pMD2.G(0.45㎍)와 혼합하고, 10.8㎕ FU유전자 HD(Promega)를 트랜스펙션을 위해 첨가하였다. 5시간 후에, 배지를 다시 채웠다. 바이러스를 함유한 상청액을 48시간에 수확하고, 0.45-㎛ 필터로 통과시켜 세포 파편을 제거하고, 즉시 사용을 위해 1 부피의 새로운 배지와 혼합하였다. SunTag 시스템을 위해, 3가지 성분(dCas9, VP64 및 Tre3G)을 위한 렌티바이러스를 독립적으로 패키징하고, 사용할 때 혼합하였다. SunTag 형질도입을 2 라운드의 렌티바이러스 감염에서 수행하였으며, 제1 라운드는 SunTag 시스템(dCas9, VP64 및 Tre3G)에 대한 것이며, 제2 라운드는 sgRNA에 대한 것이다. 배지를 각 감염 후에 다시 채웠다.
먼저, 마우스 ES 세포를 dCas9-SunTag-VP64 시스템 및 sgRNA와 함께 형질도입하였다. Oct4 및 Sox2가 ES 세포에서 고도로 발현되기 때문에, Oct4 및 Sox2 발현을 낮추기 위해 4일 동안 1㎛ 레티노산이 보충된 MEF 배지에서 ES 세포를 분화하도록 유도하였다. 한편, dCas9-SunTag-VP64 시스템을 독시사이클린으로 유도하였다. Oct4 발현의 분석에서는, 전사 시작 사이트(TSS)에 근접한 좁은 프로모터 영역 및 원위 인핸서의 200-bp 영역을 표적화하는 sgRNA가 전사를 증가시킬 수 있음을 나타내었다(도 5E). Sox2 프로모터와 관련하여, sgRNA 활성은 sgRNA가 TSS에 더 가까울수록 유전자 활성화가 높아지는 현저한 경향을 나타내었다(도 5E).
선택된 sgRNA 및 dCas9-SunTag-VP64를 또한 MEF에 형질도입하였다(도 5F). MEF 세포를 8시간 동안 또는 밤새 5 ㎍/㎖ 폴리브렌(Millipore)의 존재 하에서 렌티바이러스 상청액과 함께 인큐베이션하였다. Oct4 TSS의 127- 및 71-bp 업스트림을 표적화하는 sgRNA O-127 및 O-71을 조합하여 프로모터를 표적화하였다. 유사하게, O-1965, O-2066, 및 O-2135를 조합하여, Oct4 인핸서를 표적화하고, 별도로, S-84, S-136, 및 S-148를 조합하여 Sox2 프로모터를 표적화하였다. 독시사이클린에 의한 dCas9 유도 4일 후에, Oct4 프로모터의 표적화는 Oct4 전사에서 약 100배 증가로 이어졌으며, 인핸서의 표적화는 적당한 활성화를 야기시켰다(도 5G). Sox2 프로모터에 대해, 약 15배 활성화가 검출되었다(도 5G). 이는, 특정 sgRNA에 의해 가이딩하는 경우에, dCas9-SunTag-VP64가 MEF에서 침묵 내인성 Oct4 및 Sox2 유전자를 활성화시킬 수 있음을 시사한다.
sgRNA 카세트로부터 청색 형광 단백질(BFP)을 검출함으로써, 바이러스 역가를 1차 MEF 세포에서 수행하였으며, 감염 다중도(multiplicity of infection; MOI)를 포아송 분포(Poisson distribution)로 계산할 수 있다[Arai et al., 1999]:
P(k)=e
-m
m
k
/k!
상기 식에서 m은 MOI이며, k는 바이러스 입자 수이며, p(k)는 k개의 바이러스 입자에 의해 감염된 세포의 분율이다. 개시된 실험에 대하여, MEF의 대략 70%는 BFP에 대해 양성이었으며, MOI는 1.20이었다. 유사하게, 명시된 수의 sgRNA 바이러스 입자에 의해 감염된 세포의 분율은 하기와 같다:
실시예 2. dCas9-SunTag-VP64로의 유전자 활성화에 의한 MEF에서 만능성 네트워크의 확립
다음으로, 만능성 네트워크가 MEF에서 완전히 재활성화되고 확립될 수 있는 지의 여부를 시험하였다. SunTag 재프로그래밍 시스템을 2가지 방식으로 최적화하였다. 첫째로, 상응하는 sgRNA를 첨가함으로써 더 많은 유전자를 표적화하였다. Klf4, c- Myc(Takahashi and Yamanaka, 2006), Nr5a2(Heng et al., 2010), Glis1(Maekawa et al., 2011), 및 Cebpa(Di Stefano et al., 2014)를 선택하였다. 각 프로모터에 대하여, 4 내지 10개의 sgRNA를 분화 ES 세포에서 설계하고 시험하였다(도 5E). 각 프로모터에 대한 1 내지 3개의 sgRNA를 이전 Oct4 / Sox2 sgRNA 풀에 포함시켰다(표 1 참조). 둘째로, 파네이트, Chir99021, A83-01, 및 포스콜린(PCAF)으로 이루어진 소분자 칵테일을 재프로그래밍 배지 내에 첨가하였다. 이러한 화학적 칵테일은 Oct4 및 Sox2 전사를 4일에 3 내지 4배 더욱 증가하였다(도 5H).
만능성 네트워크의 재활성화를 모니터링하기 위해, E13.5에서 유래된 OG2 마우스(B6; CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J, Jackson Laboratory)로부터의 MEF 세포를 사용하였다. OG2 MEF는 안정한 Oct4-EGFP 리포터를 보유하고, 내인성 Oct4가 능동적으로 전사될 때 강력한 EGFP 신호를 나타낸다[Szabo et al., 2002]. MEF 세포를 형질 도입하기 24시간 전에 10,000개 세포/㎠의 밀도로 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 시딩하였다. dCas9-SunTag-VP64 및 sgRNA 풀(총 18 sgRNA, 표 1 참조)의 형질 도입 후, 세포를 24시간 동안 MEF 배지에서 회수하였다. 재프로그래밍을 출발하기 위해, MEF 배지를 1 ㎍/㎖ 독시사이클린이 보충된 재프로그래밍 배지(10㎛ 파네이트, 3㎛ Chir99021, 1㎛ A83-01, 및 10㎛ 포스콜린이 보충된 ES 배지)로 교체하였다. 이는 0일로서 나타내었다(도 1B). 3일에, 세포를 37℃에서 20분 동안 1 ㎎/㎖ 콜라게나제 B(Roche)로 처리하고, 이후에, 5분 동안 0.05% 트립신으로 처리하고, 새로운 웰(30,000개의 세포/㎠) 상에 재플레이팅하고, 재프로그래밍의 종료까지 추가로 배양하였다. 4일에 출발하여, Oct4 및 Sox2의 전사는 더욱 더 강력하게 되었다(도 1D). 7일까지, 재프로그래밍 클러스터가 나타났으며, 2주 후에, EGFP-양성 콜로니는 가시적이었다(도 1C). 그러한 콜로니는 또한 Nanog , Sox2, 및 SSEA-1에 대해 양성이었다(도 1F). 전체 과정 동안, 배지를 첫 12일 동안 격일로 다시 채웠다. 그 후에, 정상 ES 배지를 사용하였고, 매일 교체하고, EGFP-양성 콜로니는 대개 16일과 18일 사이에 iPSC 유도를 위해 준비하였다.
이후에, EGFP-양성 콜로니를 피더 세포 상에서 확장시켜 CRISPR iPSC 라인을 생성하였다. iPSC 유도를 위해, 재프로그래밍 배양물을 37℃에서 20분 동안 1 ㎎/㎖ 콜라게나제 B(Roche)와 함께 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 현미경 아래에서 집어들고, 단일-세포 현탁액을 위해 5 내지 10분 동안 0.05% 트립신에서 소화시켰다. 이후에, 세포를 정상 ES 배지 중에서 피더 상에 시딩하고, 이러한 세포는 P0 iPSC로서 간주된다. CRISPR iPSC는 강력한 EGFP 신호를 갖는 통상적인 마우스 ES-유사 돔형 콜로니를 형성하였다(도 1E). Oct4 , Sox2 , Nanog , Esrrb , Nr5a2 , 및 Utf1을 포함하는 만능성 유전자의 패널은 고도로 발현되었다(도 1G). 이러한 세포는 EGFP 신호 또는 ES 모폴로지를 잃는 어떠한 징후도 없이 20회 이상의 계대배양 동안 계대배양될 수 있다(도 1E). 이러한 데이터는 만능성이 이러한 CRISPR iPSC에서 확립되었음을 나타낸다.
모든 iPSC 라인을 5% ES-FBS(Invitrogen) 및 15% KO-혈청 대체물(Invitrogen), 1% GlutaMAXTM(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen), 55㎛ 2-머캅토에탄올(Sigma), 10 ng/㎖ 백혈병 억제 인자(Stemgent), 3㎛ CHIR99021, 및 1㎛ PD0325901을 함유한 KO-DMEM(Invitrogen) 중에서 피더 상에서 유지시켰다.
실시예
3.
CRISPR
iPSC를
확립시키기 위한
Sox2
유전자의 단일-
유전자좌
표적화
CRISPR iPSC 생성을 위해 요구되는 필수 유전자좌를 동정하기 위해, 개개 유전자좌 각각을 표적화하는 sgRNA 표적화를 풀로부터 하나씩 제거하였다. 이러한 18-sgRNA 풀에서, sgRNAs 표적화 Oct4 , Sox2, 또는 Glis1 프로모터 또는 Oct4 인핸서의 제거는 EGFP-양성 콜로니의 수의 급격한 감소를 야기시켰으며(도 6A), 이는 만능성 유도에서 이러한 유전자좌에 대한 잠재적인 역할을 나타낸다.
다음으로, Oct4 , Sox2 , 및 Glis1 프로모터를 함께 표적화하는 것이 iPSC를 생성시키기에 충분한지의 여부를 결정하였다. 각 유전자를 표적화하는 단일 sgRNA는 동일한 유전자를 표적화하는 2- 또는 3-sgRNA의 조합과 비교하여 60% 내지 심지어 180%의 유전자 활성화를 달성할 수 있기 때문에(도 6B), 하나의 sgRNA는 각 유전자의 프로모터, Oct4에 대해 O-127, Sox2에 대해 Oct4, S-84, 및 Glis1에 대해 G-215를 표적화하기 위해 선택되었다. 이러한 방법은 재프로그래밍 시스템을 단순화하였고, 표적외 효과를 잠재적으로 감소시켰다. OSG(O-127, S-84, 및 G-215)의 조합은 3개의 유전자를 적절하게 활성화시킬 수 있다(도 6C). 2주 후에, EGFP-양성 콜로니는 관찰되었으며, iPSC 라인이 확립될 수 있다(도 6D 및 도 6E).
OSG 재프로그래밍 동안, 놀랍게도, S-84 단독이 사용되었을 때 EGFP-양성 콜로니가 나타났다는 것이 주목되었는데(도 6F), Sox2 프로모터 단독을 표적화하는 것이 만능성 유도를 위해 충분할 수 있다는 것을 시사한다. S-84의 임의의 표적외 효과의 가능성을 배제하기 위해, S-84의 상부 10개의 예측된 표적을 시험하였다. sgRNA의 표적외는 CCTop-CRISPR/Cas9 표적 온라인 예측기에 의해 예측되었다[Stemmer et al., 2015]. 각 예측을 위해, 코어 서열은 12 bp에서 셋팅되었다. 코어 서열의 최대 미스매치는 2 bp이었으며, 모든 미스매치의 최대 미스매치는 4 bp이었다. S-84에 대하여, 단지 Sox2 유전자는 상당히 활성화되었다(도 6G). Sox2 단백질을 또한 4일에 검출하였다(도 2B). 추가적으로, 재프로그래밍 절차를 다른 2개의 Sox2-표적화 sgRNA, S-136 및 S-148로 반복하였다(도 2A). 이러한 2개의 sgRNA는 개별적으로 내인성 Sox2 전사를 활성화하였으며(도 2C), EGFP-양성 콜로니가 수득되었다(도 2D).
이러한 iPSC에서 만능성의 진위(authenticity)를 이후에 시험하였다. 이러한 EGFT-양성 콜로니 내에서, Nanog 및 SSEA-1 단백질을 또한, 검출하였으며, CRISPR iPSC 라인을 확립하였다(도 2E 및 도 2F). 라인 S-17에 대하여, 중요한 만능성 인자의 발현은 R1 마우스 ES (R1 ES) 세포에서의 것과 유사하였다(도 2G). iPSC 라인의 핵형 분석을 세포주 유전학에서 수행하였으며, Giemsa 결합을 분석하였다. 생성된 iPSC는 또한 핵형적으로 정상이었다(도 2H).
만능성에 대한 더욱 엄격한 검정을 수행하였으며, 여기서, S-17 세포를 B6 Albino(B6(Cg)-Tyrc-2J/J, Jackson Labs) 백그라운드의 배반포 내에 주사하였다. EGFP-양성 세포는 71.4%(7개 중 5개) E13.5 배아의 생식선 영역에서 발견될 수 있다(도 2I). 살아서 태어난 키메라는 46.2%(13마리 중 6마리)의 비율로 생성되었다(도 2J). 더욱 중요하게, B6 Albino 암컷 마우스(6주령)를 사용하여 생식계열 전파 시험을 위해 키메라 마우스(4 내지 8주령)와 짝짓기하였으며, S-17 세포는 또한 생식계열 적격이었다(도 2K). 이러한 데이터는, 단일 sgRNA에 의한 Sox2 프로모터의 단일-유전자좌 표적화가 MEF를 진짜 만능 줄기세포로 재프로그래밍하기에 충분하다고 결론지었다.
R1 ES 세포를 5% ES-FBS(Invitrogen) 및 15% KO-혈청 대체물(Invitrogen), 1% GlutaMAXTM(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(Invitrogen), 55㎛ 2-머캅토에탄올(Sigma), 10 ng/㎖ 백혈병 억제 인자(Stemgent), 3㎛ CHIR99021, 및 1㎛ PD0325901을 함유한 KO-DMEM(Invitrogen) 중에서 피더 상에서 유지시켰다. 미세주사를 위해, iPSC를 무피더(feeder-free) N2B27 조건(50% DMEM/F12, 50% Neurobasal Medium, 0.5% N2 배지, 1% B27 배지, 0.1mM 2-머캅토에탄올, 10 ng/㎖ 백혈병 억제 인자, 25 ㎍/㎖ BSA, 3㎛ CHIR99021, 및 1㎛ PD0325901) 하에서 유지시켰다. 주사일에, 세포를 배반포 주사 배지(25mM HEPES-완충 DMEM 플러스 10% FBS, pH 7.4)에 현탁시켰다.
키메라 마우스 생성 및 생식계열 전파 시험을 위해, 과잉 배란된 4주령 암컷 B6(Cg)-Tyrc-2J/J(B6-albino) 마우스(Jackson Laboratory)를 배반포 제조를 위해 B6(Cg)-Tyrc-2J/J 수컷과 짝짓기하였다. 상실배(성교후 2.5일)를 수집하고, 5% CO2 중 37℃에서 KSOM 배지(Millipore)에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침에, 배반포를 iPSC 주사를 위해 준비시키고, 대략 10 내지 20개의 세포를 각 배반포를 위해 주사하였다. 주사된 배반포를 1 내지 2시간 동안 5% CO2 중 37℃에서 KSOM 배지에서 배양하고, 이후에, 성교후 2.5일 상상임신 CD1 암컷 마우스의 자궁 내에 이식하였다(Charles River, Stock #022). 키메라 마우스는 모자이크 코트 컬러(mosaic coat color)에 의해 식별될 수 있다. 수컷 키메라 마우스는 또한 암컷 B6(Cg)-Tyrc-2J/J 마우스와 짝짓기하고, 검정색 코트 컬러를 갖는 새끼는 성공적인 생식계열 전파로서 간주된다. 생식선 기여를 위해, 주사된 배아는 이식후 10일에 회복되었다(E13.5). 각 배아의 생식선 영역을 수집하고, EGFP 신호에 대해 현미경 아래에서 시각화하였다. 모든 동물 절차는 샌프란시스코의 캘리포니아 대학교의 동물 보호 및 사용 위원회에서 승인받았다.
실시예 4. S17 MEF는 더 높은 효능 및 더 낮은 편차로 재프로그래밍 가능함
렌티바이러스 형질 도입을 갖는 재프로그래밍 효율은 OG2 및 129 마우스 (129S2/SvPasCrl, Charles River) 유래 MEF(0 내지 0.013%) 둘 모두에서 비교적 낮았고, 가변적이었다(도 2C, 도 6A, 도 6F, 도 7A 내지 도 7C). 이는 SunTag 성분의 비효율적인 전달과 세포 내로 전달된 성분의 랜덤 카피 수로 인한 것일 수 있다. 이는 확립된 iPSC 라인의 게놈에서 sgRNA 카세트의 다양한 카피 수에 의해 반영되었으며, 여기서, 12개의 라인 중에서 세포당 1 내지 5개의 카피가 발견되었다(도 7D). 게놈에서 sgRNA 카세트의 정량화를 위해, 정량적 RT-PCR(qPCR) 프라이머를 게놈에서 Sox2 유전자 및 sgRNA 카세트의 증폭을 위해 설계하였다(표 2 참조). Sox2의 증폭을 이용하여 각 세포주에 대해 게놈을 정규화하였다. 표적을 함유한 플라스미드를 표준 곡선 생성을 위해 사용하였다. 일련의 플라스미드 희석(10pg, 1pg, 0.1pg 및 0.01pg)에 대해 플라스미드 카피 수에 대해 Ct값을 플롯팅함으로써 표준 곡선을 생성하고, 대략 30ng의 게놈 DNA에서 Sox2 유전자 및 sgRNA 카세트의 카피 수를 표준 곡선을 기초로 하여 계산하였다. 이후에, Sox2 유전자(2개 카피/세포)로 정규화함으로써 sgRNA 카피 수를 계산하였다.
변동성을 감소시키고 효율을 향상시키기 위해, 단일 콜로니로부터 유래된 CRISPR iPSC 라인을 사용하여 2차 MEF를 생성하였다. S-17 iPSC를 청색 형광 단백질(BFP)로 표지하고, B6 배반포에 주사하고, 2차 MEF를 E13.5 배아로부터 유도하였다(도 3A). MEF의 약 절반(52.4%)은 유세포 분석에 의해 나타난 S-17 iPSC에서 비롯된 것이며(도 7E), 그 동안에, 세포를 트립신처리하여 FACS 완충제(DPBS 중 2% FBS) 중 단일 세포 현탁액을 형성시키고, 현탁액을 40㎛ 세포 여과기(cell strainer)를 통해 여과하고, 이후에 MACSQuant VYB 유세포 분석기로 시험하였다. 데이터를 FlowJo v10로 분석하였다. 이러한 유래된 2차 MEF는 S-17 MEF로 불리워진다. 독시사이클린 유도와 관련하여, 내인성 Sox2는 qPCR 및 면역형광 염색 둘 모두에 의해 용이하게 검출되었으며, Sox2는 독시사이클린의 부재 하에서 검출되지 않았다(도 3B 및 도 3D). 표적외 유전자가 유의미하게 상승되지 않았다(도 7G). 이러한 데이터는, SunTag 시스템이 S-17 MEF에서 Sox2를 활성화시키기 위해 적절하게 기능하는 것으로 나타났다.
다음으로, S-17 MEF가 재프로그래밍가능한지의 여부를 시험하였다. Sox2 전사는 4일에 상당히 상향조절되었고, 8일까지 R1 ES 세포와 유사한 수준까지 빠르게 증가되었다(도 3B). Sox2 상향 조절 후에, 다른 코어 만능성 인자, Oct4 , Nanog, 및 Rex1이 또한 활성화되었다. 이의 전사는 8일에 검출되었고, 그 후에 급격하게 상승되었다(도 3G). 한편, 모폴로지 변화는 4일로부터 관찰되었으며, EGFP-양성 콜로니는 7일에 볼 수 있었다(도 3E). iPSC 라인이 또한 확립될 수 있다(도 3E). S-17 MEF와 관련하여, 재프로그래밍 효율(0.1%)은 렌티바이러스 방법으로 40배까지 증가되었다(도 3F). 예상되는 바와 같이, 훨씬 더 낮은 변동성이 관찰되었다(도 7H).
qPCR(표 2 참조)을 위하여, 전체 RNA를 QiaShredder(Qiagen)를 구비한 RNeasy Plus 미니 키트를 이용하여 샘플로부터 명시된 횟수로 추출하고, DNA-부재 키트(Ambion)로 처리하여 게놈 DNA를 제거하였다. RNA를 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 이용하여 역전사하였다. 정량적 PCR을 7500 고속 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 상에서 iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)를 이용하여 수행하였다. 모든 반응을 4회 반복하여 수행하였다. 모든 데이터를 Prism 7을 이용하여 통계학적으로 분석하였다. 면역형광 염색을 위하여, 세포를 DPBS로 3차례 세척하고, 4℃에서 30분 동안 4% PFA로 고정시켰다. 당나귀 혈청(DPBS 중 10%)을 4℃에서 1시간 동안 블로킹을 위해 사용하였다. 항체를 1% BSA를 함유한 DPBS 중에 희석시켰다. 하기 1차 항체를 염색을 위해 사용하였다: 항-Sox2(1:1000, Millipore, AB5603), 항-Oct4(1:1000, Santa Cruz, sc-5279), 항-Nanog(1:500, Abcam, 80892), 및 항-SSEA-1(1:200, Stemgent, 09-0095).
또한, 더욱 분화된 꼬리끝 섬유아세포(tail tip fibroblast: TTF)가 재프로그래밍 가능한지의 여부를 시험하였다. S-17 TTF를 14월령 성인 키메라 마우스로부터 유도하였다. 꼬리를 벗기고, 1㎜ 조각으로 잘게 자르고, 6㎝ 접시에서 배양하였다. 배지를 섬유아세포가 이식편으로부터 나올 때까지 3일마다 절반씩 교체하였다. 유도된 TTF를 10% FBS 및 비-필수 아미노산이 보충된 DMEM 중에 유시키고, 이후에, 계대배양하고, 사용할 준비를 하였다(P1). 독시사이클린의 존재 하에서, TTF는 모폴로지 변화를 겪었으며, EGFP-양성 콜로니는 2주에 수득되었다(도 7L). 이러한 관찰은 S-17 MEF 및 TTF 둘 모두가 재프로그래밍 가능함을 나타낸다.
S-17 MEF 또는 마우스 TTF로 재프로그래밍하기 위해, MEF 또는 TTF를 젤라틴-코팅 플레이트 상에 5,000개의 세포/㎠의 밀도로 시딩하였다. 24시간 후에, 배지를 1 ㎍/㎖ 독시사이클린을 함유한 재프로그래밍 배지로 스위칭하였다. 이는 0일로서 나타내었다. 배지를 14일까지 격일마다 교체하였다. EGFP-양성 콜로니를 재프로그래밍 효율 계산을 위해 카운팅하거나 iPSC 라인 유도를 위해 사용하였다.
실시예
5.
Sox2
프로모터의 리모델링은 S-17
MEF에서 만능성을 향한
재프로그래밍을 촉발시킴
독시사이클린 없이, Sox2의 활성화는 검출되지 않을 수 있으며, 콜로니가 수득되지 않았다(도 3B 및 도 3J). PCAF 칵테일이 배지로부터 제거되었을 때, EGFP-양성 콜로니는 여전히 생성되었지만(도 7I), 효율은 더 낮았다. 이러한 관찰은, 내인성 Sox2 활성화가 S-17 MEF 재프로그래밍을 위한 트리거(trigger)라고 결론지었다.
다음으로, 재프로그래밍이 Sox2 수준에 대해 용량 의존적인 지의 여부를 시험하였다. Sox2를 일련의 독시사이클린 농도, 예를 들어, 0, 0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖로 활성화시켰다. Sox2 수준은 독시사이클린 농도와 양의 상관관계를 나타내었으며, 재프로그래밍 효율은 Sox2 수준에 대해 명확하게 의존적이었다(도 3J).
다수의 후생적 변형제를 모집함으로써 VP64가 유전자 전사 및 염색질 리모델링을 증진시키기 때문에(Hirai et al., 2010), SunTag 시스템이 Sox2 프로모터를 후생적으로 리모델링하는 지의 여부 및 방법을 시험하였다. 염색질-면역침전(ChIP)을 Sox2 프로모터에 대해 H3K27 아세틸화(H3K27ac) 항체로 수행하였다. 변형된 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라, 모든 ChIP 실험을 EZ-ChIP 염색질 면역침전 키트(Millipore, 17-371)로 수행하였다. 간단하게, 약 2×106개의 세포를 10㎖의 성장 배지 중에서 0.275㎖의 37% 폼알데하이드로 가교시켰다. 1㎖의 1.25M 글리신(10×)을 첨가하여 미반응된 폼알데하이드를 켄칭하였다. 0.12㎖의 SDS 용해 완충제를 각 샘플을 위해 사용하였다. 이후에, 게놈 DNA를 최적화된 조건으로 Covaris S2 소니케이터 상에서 100 내지 500 bp의 길이로 전단하였다. 1.5㎍의 H3K27 아세틸화 항체(Abcam, ab4729) 및 15㎕의 자성 단백질 A/G 비드(Millipore 16-663)를 각 샘플에 대해 사용하였다. 최종적으로, DNA 단편을 50㎕의 용리 완충제 C로 용리시켰으며, 이를 다운스트림 qPCR을 위해 사용하였다.
4일째에, H3K27ac 수준은 이미 2배 상승되었으며, 이는 8일 및 12일에 추가로 증가되었다(도 3C). 이는 Sox2 표적화 SunTag 시스템이 Sox2 프로모터에서 점진적이고 일정한 후생적 리모델링을 야기시킴을 나타낸다. Oct4 , Nanog 및 Rex1의 프로모터의 후생적 리모델링이 또한 시험되었으며, 이의 H3K27ac 수준은 유전자 전사와 유사한, 4일 잠재기로 유의미하게 증가하였다(도 3G 및 도 3H). 흥미롭게도, Oct4의 인핸서는 H3K27ac 수준의 동시 상승을 나타내었다(도 3I). 이러한 데이터는, Sox2의 활성화가 만능성 확립을 위해 다른 중요한 유전자의 후속 유도를 촉진시켰음을 시사한다.
이후에, S-17 MEF에서 Oct4 프로모터의 추가적인 표적화가 재프로그래밍 효율을 증진시키는 지의 여부를 시험하였다. O-127의 형질 도입은 Oct4 전사의 유의미한 증가를 초래하였으며, 재프로그래밍 효율이 또한 증가되었다(도 3K). 이러한 상승적 효과는, Oct4 및 Sox2가 만능성 유도에서 협력한다는 사상을 지지하였다.
과발현된 인자를 사용한 S-17 MEF 재프로그래밍 및 전통적인 재프로그래밍이 또한 비교되었다. S-17 MEF와는 달리, 과발현된 인자는 4일에 Sox2 프로모터를 후생적으로 리모델링하는 데 실패하였으며(도 7J), 내인성 유전자좌에서 Sox2 전사가 4일 및 12일에 효과적으로 검출되지 않았다(도 3L). 3주 후에, Oct4 또는 Sox2의 과발현은 임의의 콜로니를 생성시키는데 실패하였으며, Oct4 , Sox2 및 Klf4(OSK)의 과발현은 실험 간에 더 큰 편차를 가지면서 S-17 MEF보다 약간 더 많이 EGFP-양성 콜로니를 생성시켰다(도 3M 및 도 7K).
실시예
6.
Oct4
프로모터 및
인핸서의
동시 리모델링은
MEF를
iPSC로
리프로그래밍함
Oct4의 프로모터 및 인핸서의 리모델링은 만능성 유도를 위해 중요하였으며, 프로모터 단독의 표적화는 EGFP-양성 콜로니의 생성을 위해 충분하였다(도 6A 및 도 2C). 중요한 만능성 인자뿐만 아니라 p300 및 매개체 복합물이 마우스 ES 세포에서 Oct4 원위 인핸서에서 풍부하다는 것을 고려하면(도 4A), Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링이 만능성 유도를 위해 필요하다고 가설을 세웠다.
가설을 시험하기 위해, 2개의 sgRNA 표적화 상이한 사이트를 전사한 이중-sgRNA 카세트가 사용되었다(도 8A). O-127-2066 카세트는 단일-세포 수준에서 Oct4 프로모터(O-127) 및 인핸서(O-2066)를 표적화하였다. 이중-sgRNA 작제물을 생성하기 위해, 제2 sgRNA를 함유한 단편은 주형으로서 단일 sgRNA 작제물과 함께 프라이머 mU6-T2H-F(서열번호 167 ctaggatccattaggcGGGTACAGTGCAGGGGAA) 및 mU6-T2H-R2(서열번호 168 atacggttatccacgcGGCCGCCTAATGGATCCT)를 사용하여 증폭되었다. 이러한 단편은 정제되고, NotI에 의해 소화된 제1 sgRNA를 함유한 다른 작제물과의 재조합 반응을 위해 사용되었다. 제2 mU6-sgRNA 카세트는 동일한 전사 방향으로 제1 mU6-sgRNA 카세트의 다운스트림에 있다.
O-127-2066은 상승된 수준의 H3K27ac를 갖는 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링으로 이어졌다(도 4B). O-127-2066에 의한 유전자 전사의 수준은 4일 및 8일에 O-127과 유사하였다(도 4C). 그러나, 8일 후에, Oct4 전사는 O-127-2066 배양물에서 추가로 상승되었다. 특히, 세포가 세포 팽창을 가능하게 하기 위해 7일 및 11일에 재플레이팅되었을 때, 집단에서 전체 Oct4 발현은 급격하게 증가하였다(도 4C). O-127 및 O-2066 배양물을 위해, 약한 Oct4 발현은 8일 후에 크게 변하지 않았다(도 4C). 이에 따라, 12일까지, EGFP-양성 콜로니가 O-127-2066 배양물에서 관찰되었으며, 그러한 콜로니는 또한 Nanog , Sox2 및 SSEA-1을 발현시켰는데, 이는 획득된 코어 만능성 네트워크를 나타내는 것이다(도 4E 및 도 4F). iPSC 라인은 이러한 콜로니로부터 유도될 수 있다(도 4E). 한편, 콜로니가 O-127 또는 O-2066 배양물에서 발견되지 않았다(도 4D).
잠재적인 표적외의 활성화를 시험하였다. sgRNAs O-127 및 O-2066에 대한 상부 10개의 예측된 표적이 시험되었으며, 표적외 유전자의 유의미한 활성화는 검출되지 못하였다(도 8C). 다른 2개의 이중 sgRNA 카세트 O-127-1965 및 O-127-2135는 또한 동시에 시험되었으며, 유사한 결과가 관찰되었다(도 4D). 이러한 데이터는 만능성이 내인성 Oct4 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링에 의해 유도되었음을 강력히 지지하였다.
진짜 만능 줄기세포주가 또한 달성되었다. D-9 라인은 R1 ES 세포 및 정상 핵형에 대한 만능성 유전자의 유사한 발현을 나타내었다(도 4G 및 도 4H). B6-알비노 배반포에 D-9 세포의 주사 후에, 살아서 태어난 키메라 마우스는 자손 새끼(offspring pup) 중에서 60%의 비율로 생성되었다(10마리 중 6마리)(도 4J). 이러한 라인은 75% E13.5 배아의 생식선 영역에 상당히 기여하였으며(8마리 중 6마리)(도 4I), 생식계열 전파는 수컷 새끼의 50%에서 확인되었다(4마리 중 2마리)(도 4K).
실시예
7.
Oct4
프로모터 및
인핸서에서
히스톤
아세틸화의
후생적 리모델링은 MEF를 iPS 세포로 재프로그래밍한다.
VP64에 의한 염색질 리모델링은 전사 기구를 모집하는 이의 주요 기능으로 인한 것이다. 후생적 리모델링이 재프로그래밍을 개시하는 데 충분한지의 여부를 더욱 엄격하게 결정하기 위해, Oct4 프로모터 및 인핸서의 히스톤 아세틸화는 특정 조작에 의해 증가되었다. 히스톤 H3K27 아세틸화가 Oct4 프로모터 및 인핸서 영역을 동시에 마킹하기 때문에 히스톤 아세틸화가 조작되었다(도 4A). p300코어는 단지, p300의 아세틸트랜스퍼라제 활성 도메인을 가지고, 표적의 히스톤 아세틸화를 향상시키는 것으로 입증되었다[Hilton et al., 2015]. 이에 따라, VP64는 dCas9-SunTag-p300코어 시스템을 생성시키기 위해 p300코어로 대체되었다(도 8E).
p300코어의 클로닝을 위해, 골격은 SbfI-HF 및 RsrII(NEB)와의 소화에 의해 pSLQ1711-pPGK- ScFV(GCN4)-sfGFP-VP64로부터 유도되고, 겔 정제 키트(Qiagen)를 이용하여 회수되었다. 링커를 갖는 83-bp SV40 핵 국소화 사이트(nuclear localization site; NLS)는 sfGFP와 p300코어 사이에 정방향 프라이머(서열번호 169 TACAAAGGTGGAGGTCGGACCGaaggcagcggctcccccaag) 및 역방향 프라이머(서열번호 170 AAATCGTCTAAAGCATCcgaccctccgccggaaccgccca)로 클로닝되고 첨가되었다. p300코어는 정방향 프라이머(서열번호 171 AGTGGGCGGTTCCGGCGGAGGGTCGattttcaaaccagaagaactacgac) 및 역방향 프라이머(서열번호 172 TATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTAgtcctggctctgcgtgtgcagctc)를 갖는 Phusion® 고충실도 DNA 폴리머라아제(NEB)를 이용하여 주형 pcDNA-dCas9-p300 코어(Addedene 61357)로부터 PCR-증폭되었다. 이후에, 83-bp SV4 NLS 및 링커를 함유한 골격, 및 p300코어는 Gibson 어셈블리 클로닝 키트(NEB)를 이용하여 어셈블링되었다.
재프로그래밍 실험은 dCas9-SunTag-p300코어 시스템으로 수행되었다. p300코어 배양물은 Oct4 프로모터 및 인핸서에서 VP64 대응물과 유사한 H3K27ac 수준을 나타내었지만, Oct4 전사의 단지 1/30은 5일에 p300코어 배양물에서 검출되었다(도 8F 및 도 8G). 이는 전사 기구를 모집하는 p300코어의 불능에 의해 설명될 수 있다. 이후에, 배양물은 9일 및 14일에 계대배양되었다. 흥미롭게도, 10일까지, Oct4 수준은 VP64 및 p300코어 배양물에서 유사하였다(도 8G). 이에 따라, EGFP-양성 콜로니는 p300코어 배양물에서 생성되었으며, iPSC 라인이 생성되었다(도 8H 및 도 8I). 이러한 관찰은, p300코어로 히스톤 아세틸화의 조작이 VP64와 유사한 염색질 리모델링을 야기시켰지만, 전사 활성화의 상당한 지연을 야기시킴을 나타낸다. 함께, 이러한 결과는, Oct4 프로모터 및 인핸서의 후생적 리모델링이 VP64 또는 p300코어mf 통해, 만능성에 대한 재프로그래밍을 촉발시키기에 충분함을 나타낸다.
이소성 단백질의 고아범위한 결합으로, 만능성에 대한 재프로그래밍을 촉발시키는 내인성 염색질 상에 리모델링 사건을 식별하는 것이 상당히 어렵다. 이에 대한 통찰력을 얻기 위해, CRISPRa 시스템, dCas9-SugTag-VP64 또는 dCas9-SunTag-p300코어는 내인성 염색질의 특정 사이트를 정밀하게 리모델링하기 위해 사용되었다. 처음으로, Oct4 또는 Sox2인 단일 유전자의 표적화된 리모델링이 만능성으로의 재프로그래밍을 시작하기에 충분하며, 진짜 만능 줄기세포주가 확립되었다. CRISPR iPSC-유래 S-17 MEF 및 TTF는 또한, 재프로그래밍 가능하였는데, 내인성 Sox2의 활성화가 만능성 유도를 위해 중요한 사건임을 시사한다. Oct4의 프로모터 및 인핸서의 동시 리모델링은 또한 만능성을 유도하기에 충분하였다. 마지막으로, 히스톤 아세틸화를 증가시킴으로써 Oct4 프로모터 및 인핸서의 후생적 조작은 iPSC 유도를 촉발시키기에 충분하였다.
본 연구에서, iPSC는 단일 유전자, Oct4 또는 Sox2를 표적화함으로써 CRISPRa 시스템으로 생성되었다. 내인성 만능성 유전자의 활성화는 종래에 CRISPRa 시스템으로 시험되었지만, iPSC가 확립되지 않았다. 종래 연구는 Oct4 프로모터의 일시적 활성화만을 나타내었다. 인핸서가 표적화되었기 때문에, 적어도 부분적으로 iPSC가 생성되지 않은 것으로 고려된다. 본 개시내용에서, sgRNA는 새로 설계되었으며, sgRNA 표적 사이트는 다수의 파라미터를 기초로 하여 선택되었다(도 5A 내지 도 5C). 무려 VP64의 24개의 카피가 표적화 사이트에 모집될 수 있기 때문에, 사용되는 SunTag 시스템은 유전자 활성화 및 염색질 리모델링에서 매우 효율적일 수 있다. 결과적으로, Oct4 활성화의 100배 증가가 관찰되었으며, 이는 이전 연구보다 훨씬 높았다[Hu et al., 2014]. 추가적으로, 소분자는 재프로그래밍 효율을 더욱 향상시켰다(도 7H). 최근에, 2가지 연구에서는 VP64dCas9VP64 시스템으로 내인성 MyoD 또는 BAM( B rn2, A scl1 및 M yt1L)을 활성화시킴으로써 근육 및 신경 세포의 생성이 보고되었다[Black et al., 2016; Chakraborty et al., 2014]. 본 개시내용은 CRISPRa 방법으로 처음으로 만능 줄기세포를 확립하였다.
본 개시내용은, 내인성 Oct4 또는 Sox2의 직접 리모델링이 만능성으로의 재프로그래밍을 촉발시키기에 충분하다는 것을 기계적으로 지정하였다. 이는 iPSC 생성을 위한 대안적인 방식을 제공할 뿐만 아니라 만능성 유도의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. Sox2 연구에서는 내인성 Sox2의 활성화가 만능성 유도를 위한 중요한 사건이라는 것을 입증하였다. Sox2 활성화가 S-17 MEF 재프로그래밍을 위해 요구되며, Sox2의 리모델링이 다른 중요한 만능성 유전자 활성화에 선행되었으며, 재프로그래밍 효율이 Sox2 수준에 의존적이라는 것이 명확하였다(도 3B, 도 3C, 도 3G 내지 도 3I 및 도 3J). 한편, S-17 집단의 20%가 내인성 Sox2를 활성화시켰지만, 단지 0.1%가 EGFP-양성 콜로니로 재프로그래밍될 수 있는데(도 3F 및 도 7F), 이는 내인성 Sox2의 단독 활성화가 CRISPRa 맥락에서 만능 세포 운명에 결정적인 것이 아님을 시사한다. Oct4 프로모터를 추가로 활성화시키는 것은 EGFP-양성 콜로니를 생성시키는 효율을 향상시켰는데(도 3K), 이는 만능성 유도에서 재프로그래밍하는 다수의 만능성 유전자의 협력성을 시시하는 것이다. 특히, Oct4 연구에서, 인핸서 영역의 리모델링은 만능성 유도를 위해 요구되었다. 견고한 전사 활성화는 프로모터 리모델링으로부터 관찰되었으며, 보통의 유전자 활성화는 인핸서 리모델링으로부터 관찰되었다. 그러나, 인핸서의 리모델링은 후기 단계에서 Oct4의 추가 유도를 위해 필수적인 것으로 보인다(도 4C). 이는, Oct4 프로모터가 빠른 트리거로서 기능하며, 인핸서가 잠재적이지만 더 높은 Oct4 전사를 위해 요구된 조절 인자임을 시사한다. 인핸서 리모델링이 미경험 마우스에 나타난 바와 같이 프로모터-인핸서 루프의 확립을 용이하게 하였는 지의 여부는 추가로 조사되어야 한다[Kagey et al., 2010]. 다른 흥미로운 점은 이러한 인핸서가 만능 줄기세포에서 특이적으로 발견된 231개의 수퍼인핸서 중 하나라는 것이다[Whyte et al., 2013]. 본 개시내용은 만능성 유도에서 수퍼인핸서에 대한 기능적 증거를 제공하였다.
dCas9-SunTag-p300코어로의 iPSC의 생성은, 히스톤아세틸화가 iPSC 생성에서 필수적인 역할을 함을 나타내었다. 세포 재프로그래밍은 동적 후생적 변화를 수반하지만, 재프로그래밍이 규정된 게놈 사이트의 후생적 조작을 통해 달성될 수 있는 지의 여부가 종래에는 알려지지 않았다. 만능 줄기세포에서, 히스톤 H3K27 아세틸화는 Oct4의 프로모터 및 인핸서 둘 모두에서 매우 풍부하며, 이는 단지 한 타입의 후생적 변형을 조작함으로써 이러한 문제를 해결하기 위한 항목(entry)을 제공한다. 본 개시내용에서, iPSC는 프로모터 및 인핸서의 dCas9-SunTag-p300코어 동시 표적화를 통해 생성되었다. 이는 또한, 후생적 변형의 사이트-특이적 조작에 의해 세포 운명을 변화시키는 방법을 만들었다. p300 이외에, 수 개의 다른 후생적 인자[즉, Tet1, Dnmt3a, KRAB, 및 LSD1]는 활성화 또는 침묵화 유전자 둘 모두에 대한 후생유전체 편집에서 기능적인 것으로 입증되었다[Kearns et al., 2015; Liu et al., 2016; Thakore et al., 2015]. 이러한 확장된 CRISPR 도구는 향후 상이한 타입의 DNA 및 히스톤 변형을 표적화함으로써 세포 운명을 조작할 가능성을 더 높인다.
요약하면, 이러한 데이터는, CRISPRa 시스템, 여기에서 SunTag 시스템의 사용, 내인성 Oct4 또는 Sox2 유전자좌의 정밀한 리모델링이 만능성으로의 재프로그래밍을 시작하는 데 충분하다는 것을 나타낸다. 이러한 연구는 CRISPR 활성화로의 iPSC의 생성을 나타낼 뿐만 아니라, 세포 재프로그래밍의 기계적 이해를 해명한다. 재프로그래밍 전략이 또한, 다른 세포 타입의 생성에서 및 다른 모델 시스템, 예를 들어, 인간 세포에서 연구할 것으로 고려되며, 이는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예
8.
CRISPR
활성화로 인간
iPSC의
생성
섬유아세포 배양 및 유지. 신생아 포피로부터 단리된 인간 피부 섬유아세포(FTc1007; DFMF030811)를 인간 섬유아세포(hFib) 성장 배지: 1% 글루타그로(Glutagro), 1% 비-필수 아미노산(NEAA), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Corning, 버지니아 머내서스 소재)과 함께 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에서 0.1% 돼지 젤라틴(Sigma-Aldrich, 미주리 세인트 루이스 소재) 상에서 배양하였다. 섬유아세포의 일상적인 효소 계대배양을 Accutase 해리 시약(Innovative Cell Technologies, Inc., 캘리포니아 샌디에고 소재)을 사용하여 수행하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 및 5% O2 중에서 유지시켰다.
플라스미드 작제화. 인간 sgRNA 발현을 위한 렌티바이러스 플라스미드를 인간 U6 프로모터, 특정 gRNA, 및 NEBuilder®에 대한 적절한 동족 서열(New England Biolabs Inc., 메사추세츠 입스위치 소재)을 함유한 합성된 gBlocks®(Integrated DNA Technologies, 아이오와 코럴빌 소재)를 사용하여 작제화하고, 이전 실시예에서 사용된 dCas9-Suntag-VP64 플라스미드에 어셈블링하였다. 특정 gRNA 서열은 표 3에 나열되었다.
렌티바이러스 패키징. 트랜스펙션 시에 70 내지 80% 컨플루언스에 도달하기 위해 렌티바이러스 패키징 플라스미드로의 트랜스펙션하기 24시간 전에 HEK293T 세포(ATCC CRL-3216)를 플레이팅하였다. 트랜스펙션을 Lipofectamine 3000 트랜스펙션 시약(Life Technologies, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)을 사용하여 수행하였다. 배지를 16시간에 교체하였다. 바이러스를 함유한 상청액을 트랜스펙션후 2일 및 3일에 수집하였다. 이후에, 상청액을 0.45㎛ 필터를 통해 통과시키고, 4℃에서 1.5시간 동안 20,000×g에서 원심분리하였다. 농축된 바이러스를 DMEM(Corning, 버지니아 머내서스 소재) 중에 재현탁시키고, 분취액을 -80℃에서 저장하였다. 모든 바이러스를 독립적으로 패키징하고, 2개의 별도의 감염 라운드에서 사용될 때 조합하였다. 모든 작제물을 dCas9-Suntag-VP64 시스템과 함께 사용하기 위해 패키징하였다.
바이러스 적정. 바이러스 적정을 전날에 시딩된 293T 세포에서 일련의 희석을 이용하여 수행하였다. 세포를 성장 배지, 즉, 5 ㎍/㎖ 폴리브렌(Millipore, 매사추세츠 벌링턴 소재) 및 10mM HEPES(Corning, 버지니아 머내서스 소재)가 보충된 10% FBS(Life Technologies, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)를 함유한 DMEM(Corning, 버지니아 머내서스 소재) 중에서 감염시켰다. 세포를 90분 동안 600×g로 원심분리하고, 이후에, 추가 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하였으며, 이때, 형질 도입 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. sgRNA 카세트로부터 발현된 청색 형광 단백질(BFP)을 검출함으로써 적정을 측정하였다. BFP 발현에 대한 1% 내지 20% 포지티브 신호를 나타낸 샘플을 하기 수학식을 이용한 역가 계산을 위해 선택하였다:
인간 섬유아세포를 만능성 유전자 전사 및 배아 게놈 활성화와 관련된 조절 DNA 요소를 표적화하도록 설계된 예시적인 dCas9-Suntag-VP64 시스템 및 sgRNA를 포함하는 CRISPR 활성화 방법을 이용하여 재프로그래밍하였다. SunTag 시스템을 위한 모든 렌티바이러스 성분을 개별적으로 패키징하고, 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 제1 라운드에서 dCas9, VP64, 및 Tre3G를 조합하고 제2 라운드에서 함께 sgRNA와 조합하는 2개의 별도의 감염 라운드를 통해 도입하였다. 비교를 위해 다양한 농도의 바이러스를 사용하였다. 제2 라운드 이전에, 제1 라운드 감염된 세포 집단을 풍부하게 하기 위해, 형질 도입된 세포를 24시간 동안 1 ㎍/㎖ 독시사이클린으로 처리하고, GFP-VP64 및 dCas9-10XGCN4-P2A-mCherry의 발현을 위해 벌크-분류하였다. 각 감염 라운드를 위하여, 세포를 5,000 또는 10,000개의 세포/㎠의 밀도로 시딩하였다. 형질 도입을 4 ㎍/㎖ 폴리브렌(Millipore, 매사추세츠 벌링턴 소재) 및 10mM HEPES(Corning, 버지니아 머내서스 소재)가 보충된, 20% 녹아웃 혈청 대체물(KOSR)(Life Technologies, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재), 1% 글루타그로, 1% NEAA, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10 ng/㎖ 염기성 인간 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Life Technologies, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재), 및 100㎛ β-머캅토에탄올(Life Technologies, 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)을 함유한 DMEM/F-12(Corning, 버지니아 머내서스 소재)를 함유한 배지에서 시딩하고 24시간 후에 수행하였다. 감염 후, 세포를 90분 동안 600×g로 원심분리하고, 이후에, 추가 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하고, 이때, 유도(1일)를 시작하기 위해 감염 배지를 1 ㎍/㎖ 독시사이클린을 함유한 hFib 배지로 교체하였다. 5일에, 세포를 7,500개의 세포/㎠의 밀도로 0.1% 돼지 젤라틴(Sigma-Aldrich, 미주리 세인트 루이스 소재) 코팅 6-웰 플레이트 상에서 Accutase(Innovative Cell Technologies, Inc., 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 계대배양하고, 독시사이클린 처리를 중단하고, 배지를 TGFβ 수용 인자 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제, 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지로 교체하였다. 13일 및 21일에, 세포를 다시 Accutase(Innovative Cell Technologies, Inc., 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 계대배양하고, 7,500개의 세포/㎠의 밀도로 Matrigel(Corning, 버지니아 머내서스 소재) 코팅 6-웰 플레이트 상에 시딩하고, 배지를 GSK3 억제제, MEK 억제제, 및 ROCK 억제제를 포함하지만 TGFβ 수용 인자 억제제를 포함하지 않은 다른 배지로 교체하였다. 예시적인 TGFβ 수용 인자 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제, 및 ROCK 억제제는 당해 분야에 공지되어 있다[예를 들어, WO2015134652호 참조]. 특정 예는 TGFβ 수용 인자 억제제를 위한 SB431542 및 A-83-01; MEK 억제제를 위한 PD0325901 및 pD98059; GSK3 억제제를 위한 CHIR99021 및 BIO; 및 ROCK 억제제를 위한 티아조비빈 및 Y27632를 포함한다.
8일째에 그리고 시간에 따라, 추정되는 iPSC를 높은 핵 대 세포질 비율 및 ESC-유사 콜로니 모폴로지를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 9). 도 9에 도시된 바와 같이, CRISPR 활성화 시스템에서 EEA sgRNA의 포함은 EEA 없이 수득된 CRISPRa-hiPSC 클론과 비교하여 더욱 견고한 모폴로지 특성을 갖는 hiPSC 클론을 생성시키는 것으로 보인다. EEA와 함께 또는 이의 없이 생성된 CRISPRa-hiPSC에서 모폴로지의 관찰은 2가지 조건 하에서 나타난 만능성 유전자 발현 수준과 일치한다(도 10A 및 도 10B 참조). CRISPRa 시스템으로부터 생성된 iPSC 콜로니는 만능성 마커의 발현 및 다중계통 분화 가능성을 기초로 하여 추가로 특징되었다. 샘플을 10일 및 21일에 RNA 분석을 위해 수집하고, 21일에 유세포 분석을 위해 수집하였다. 세포를 19일에 면역형광 염색을 위해 및 21일에 알칼리 포스파타아제 염색을 위해 고정시켰다. 배지 교체를 매일 또는 격일로 수행하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2 및 5% O2에서 배양하였다. 위상 대비 이미징을 EVOS FL Core Imaging System(Thermofisher, 매사추세츠 월섬 소재)을 이용하여 수행하였다. 도 10은 TRA-1-81, NANOG, SSEA-4 및 OCT4와 같은 내인성 만능성 유전자의 발현이 CRISPRA-hiPSC 콜로니에서 확립된다는 것을 도시한 것이다.
전체 RNA는 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, 캘리포니아 발렌시아 소재)를 이용하여 단리되었다. 정량적 PCR 반응은 96-웰 플레이트의 웰 당 20㎕의 반응 부피에서 TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 이용하여 수행되고, StepOnePlus qPCR System 및 QuantStudio 3 qPCR System(Applied Biosystems, 캘리포니아 포스터 시티 소재) 상에서 분석되었다. 반응은 2회 수행되었다. 결과는 내부 기준 유전자로서 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)에 대해 정규화되었다. 상대적 유전자 발현은 2^ΔΔCt 방법을 이용하여 정량화되었으며, 데이터는 StepOne Software v2.3 및 QuantStudio Design and Analysis Software v1.4.1(Applied Biosystems, 캘리포니아, 포스터 시티 소재) 및 GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc., 캘리포니아 라 호이아 소재)을 이용하여 통계학적으로 분석되었다. Nanog, Oct4, Lin28, Sox2, Rex1, 및 Gapdh를 위한 프라이머 및 프로브는 내인성 유전자 발현 평가를 위해 사용되었다. 도 11은, 내인성 만능성 프로그램이, Oct4 , Sox2 , Lin28 및 Nanog와 같은 표적화된 내인성 유전자뿐만 아니라 표적화되지 않은 것, 예를 들어, Rex1을 활성화시킴으로써, 시간에 따라 재프로그래밍된 집단에서 활성화됨을 도시한 것이다. 도 12에서 TRA-1-81 발현의 유세포 분석은 또한, 다양한 MOI 조건과 함께 CRISPRa를 통해 수득된 hiPSC의 확립된 만능성 상태를 나타낸다.
본 발명이 상기 실시형태와 함께 기술되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하는 것으로 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내의 다른 양태, 장점 및 개질은 본 발명이 관련된 당업자에게 명백하게 될 것이다.
또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠시 군으로 기술되는 경우에, 당업자는 본 발명이 또한 이에 의해 마쿠시 군의 임의의 개별 구성원 또는 하위군 구성원의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참조에 의해 도입되는 것과 동일한 정도로 전문이 명확하게 참조에 의해 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다.
참고문헌
SEQUENCE LISTING
<110> FATE THERAPEUTICS, INC.
<120> GENERATION OF INDUCED PLURIPOTENT CELLS BY CRISPR ACTIVATION
<130> 13601-222-228
<140> TBA
<141> 2018-12-27
<150> US 62/611,202
<151> 2017-12-28
<160> 175
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-321 for targeting Oct4 promoter
<400> 1
cagcccactc agccatcctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-248 for targeting Oct4 promoter
<400> 2
atccgagcaa ctggtttgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-226 for targeting Oct4 promoter
<400> 3
gtgtccggtg acccaaggca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-157 for targeting Oct4 promoter
<400> 4
ggacaggaca acccttagga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-127 for targeting Oct4 promoter
<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-71 for targeting Oct4 promoter
<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-2135 for targeting Oct4 enhancer
<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-2066 for targeting Oct4 enhancer
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-2014 for targeting Oct4 enhancer
<400> 9
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-1965 for targeting Oct4 enhancer
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<210> 11
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA O-1914 for targeting Oct4 enhancer
<400> 11
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<210> 12
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA S-430 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<220>
<223> sgRNA S-398 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<223> sgRNA S-348 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA S-326 for targeting Sox2 promoter
<400> 15
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<210> 16
<211> 20
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<220>
<223> sgRNA S-276 for targeting Sox2 promoter
<400> 16
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA S-262 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<220>
<223> sgRNA S-192 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<223> sgRNA S-148 for targeting Sox2 promoter
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<223> sgRNA S-136 for targeting Sox2 promoter
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA S-84 for targeting Sox2 promoter
<400> 21
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<210> 22
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-475 for targeting Klf4 promoter
<400> 22
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<210> 23
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-380 for targeting Klf4 promoter
<400> 23
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<210> 24
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-309 for targeting Klf4 promoter
<400> 24
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<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-293 for targeting Klf4 promoter
<400> 25
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<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-271 for targeting Klf4 promoter
<400> 26
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<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-249 for targeting Klf4 promoter
<400> 27
gctccagccc gccagctgcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-232 for targeting Klf4 promoter
<400> 28
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<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-171 for targeting Klf4 promoter
<400> 29
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<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-147 for targeting Klf4 promoter
<400> 30
gctaccatgg caacgcgcag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA K-67 for targeting Klf4 promoter
<400> 31
cgcgcgccgc cacagggagg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-444 for targeting cMyc promoter
<400> 32
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<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-395 for targeting cMyc promoter
<400> 33
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<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-347 for targeting cMyc promoter
<400> 34
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<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-305 for targeting cMyc promoter
<400> 35
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<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-249 for targeting cMyc promoter
<400> 36
acaaccgtac agaaagggaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-242 for targeting cMyc promoter
<400> 37
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<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-175 for targeting cMyc promoter
<400> 38
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<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-154 for targeting cMyc promoter
<400> 39
cagcccagta ctccggctcc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-124 for targeting cMyc promoter
<400> 40
ggctcctcct cctctttccc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA M-82 for targeting cMyc promoter
<400> 41
cgagttccca aagcagaggg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA Nr-404 for targeting Nr5a2 promoter
<400> 42
ccgccctctc acggaagcgg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA Nr-157 for targeting Nr5a2 promoter
<400> 43
gggcgtggag cccaggaagg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA Nr-61 for targeting Nr5a2 promoter
<400> 44
gatggaatgt tcaagtggga 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA Nr-60 for targeting Nr5a2 promoter
<400> 45
tcccacttga acattccatc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA G-419 for targeting Glis1 promoter
<400> 46
gggaggagca gaatcccgcc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA G-215 for targeting Glis1 promoter
<400> 47
gggctgccgg accaagccaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA G-179 for targeting Glis1 promoter
<400> 48
gagcggctgt gggcagcagc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA G-118 for targeting Glis1 promoter
<400> 49
ggccgtggcg gtggcggcgg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA G-47 for targeting Glis1 promoter
<400> 50
gccgcgggcg cagcggctcg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-345 for targeting Cebpa
<400> 51
gctcccgggc tccctagtgt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-282 for targeting Cebpa
<400> 52
cacacacgtg gtccgtggtt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-177 for targeting Cebpa
<400> 53
gtgctagtgg agagagatcg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-135 for targeting Cebpa
<400> 54
ggaaagtcac aggagaaggc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-100 for targeting Cebpa
<400> 55
gccagtagga tggtgcctgc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA C-70 for targeting Cebpa
<400> 56
cgagacccgt ttggacacca 20
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting OCT4 promoter
<400> 57
ggggagaaac tgaggcga 18
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting OCT4 promoter
<400> 58
tctgtggggg acctgcactg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting Sox2 promoter
<400> 59
gtggctggca ggctggctct 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting Klf4 promoter
<400> 60
gctgccatag caacgatgga 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting c-Myc promoter
<400> 61
ggttcccaaa gcagagggcg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting Lin28A promoter
<400> 62
gtgtcagaga ccggagttgt 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting NANOG promoter
<400> 63
gattaactga gaattcacaa 20
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human gRNA sequence for targeting EEA-motif
<400> 64
cccagcactt tggg 14
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Oct4 (total)
<400> 65
atcgccaatc agcttgg 17
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Oct4 (total)
<400> 66
agaaccatac tcgaaccaca tcc 23
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Oct4 (endogenous)
<400> 67
taggtgagcc gtctttccac 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Oct4 (endogenous)
<400> 68
gcttagccag gttcgaggat 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Sox2 (total)
<400> 69
acagatgcaa ccgatgcacc 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Sox2 (total)
<400> 70
tggagttgta ctgcagggcg 20
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Sox2 (endogenous)
<400> 71
gagaagtttg gagcccgag 19
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Sox2 (endogenous)
<400> 72
gatctggcgg agaatagttg g 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Klf4
<400> 73
gcacacctgc gaactcacac 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Klf4
<400> 74
ccgtcccagt cacagtggta a 21
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene c-Myc
<400> 75
ccaccagcag cgactctga 19
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene c-Myc
<400> 76
tgcctcttct ccacagacac c 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Nr5a2
<400> 77
atgggaagga agggacaatc 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Nr5a2
<400> 78
atacaaactc ccgctgatcg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Glis1
<400> 79
ctccaagcat ccacactgtt 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Glis1
<400> 80
gacaggatgc ctgaagcaag 20
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Cebpa
<400> 81
caagaacagc aacgagtacc g 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Cebpa
<400> 82
gtcactggtc aactccagca c 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Nanog
<400> 83
cctccagcag atgcaagaac tc 22
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Nanog
<400> 84
cttcaaccac tggtttttct gcc 23
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Dppa2
<400> 85
tcaacgagaa ccaatctgag ga 22
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Dppa2
<400> 86
gcgtagcgta gtctgtgttt g 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Esrrb
<400> 87
ctcgccaact cagattcgat 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Esrrb
<400> 88
agaagtgttg cacggctttg 20
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Fgf4
<400> 89
cgtggtgagc atcttcggag tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Fgf4
<400> 90
ccttcttggt ccgcccgttc tta 23
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Lin28
<400> 91
tgttctgtat tgggagtgag c 21
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Lin28
<400> 92
gcttgcattc cttggcatg 19
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Tet1
<400> 93
tctcactcat gttgcgggac cc 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Tet1
<400> 94
cgtcggagtt gaaatgggcg aa 22
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Utf1
<400> 95
tgtcccggtg actacgtct 19
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Utf1
<400> 96
cccagaagta gctccgtctc t 21
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Actin
<400> 97
atggagggga atacagccc 19
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Actin
<400> 98
ttctttgcag ctccttcgtt 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-2.7k)
<400> 99
tggcctggaa ctcagaaatc 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-2.7k)
<400> 100
tctgccccct ttaagagtca 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-1.4k)
<400> 101
cccaggctca gaactctgtc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-1.4k)
<400> 102
tgctcctaca ccatgctctg 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-0.2k)
<400> 103
ttgaaaatga aggcctcctg 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Oct4 (ChIP-0.2k)
<400> 104
agcgctatct gcctgtgtct 20
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Sox2 (ChIP-0.4k)
<400> 105
cttgggtcta acttctcgtc tg 22
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Sox2 (ChIP-0.4k)
<400> 106
gtgtgccatt gtttctgcg 19
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Nanog (ChIP-0.5k)
<400> 107
ccaacttact aaggtagccc g 21
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Nanog (ChIP-0.5k)
<400> 108
ctttcagcac tcagcgtttc 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Rex1 (ChIP-0.5k)
<400> 109
ccccgctaca aagtacacta g 21
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Rex1 (ChIP-0.5k)
<400> 110
ctagaccgtt tgtagtcagt gg 22
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Ctnnbl1
<400> 111
agaacgacag tgagaaggtt g 21
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Ctnnbl1
<400> 112
cattgtctat gatctcccca cg 22
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Tbc1d22b
<400> 113
ttctgtttat ctgggccatc c 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Tbc1d22b
<400> 114
gtcaaagttc tccacgtcct c 21
<210> 115
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Phf20
<400> 115
agtgtgaaga gtgccagtg 19
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Phf20
<400> 116
ctcagccact ccttgtcata c 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Rgr
<400> 117
gtacctatac gcagccatcg 20
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Rgr
<400> 118
ttcctctaca gaccatctcc c 21
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Zp3r
<400> 119
actgtcctga aatatacctg cc 22
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Zp3r
<400> 120
actttcccat tgaccaactc g 21
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Lmbr1
<400> 121
gcggtgggta tgaaaggag 19
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Lmbr1
<400> 122
aggaaacgat gtagagaatg gc 22
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene D130040H23Rik
<400> 123
gacctacagc aacctcactg 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene D130040H23Rik
<400> 124
gcaaaggctt taccacactg 20
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Gli3
<400> 125
ttcagcaagt ggttcctatg g 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Gli3
<400> 126
ctgtcggctt aggatctgtt g 21
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Vav3
<400> 127
tgtcaaaccc tctccatgtg 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Vav3
<400> 128
tctttggtcc tgtgccttac 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Renbp
<400> 129
cacagtgaag ccatgattgc 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Renbp
<400> 130
agccaaacca ttccccatac 20
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Rab11fip4os1
<400> 131
gtctctgatg gaaggatgct g 21
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Rab11fip4os1
<400> 132
gccttaattt gttttgcctc gg 22
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Styk1
<400> 133
gaaaatcatg aagagaccca gc 22
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Styk1
<400> 134
catcggcaga tctagaagca g 21
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Cyb5a
<400> 135
cagaagcaca aagacagcaa g 21
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Cyb5a
<400> 136
aaattctcgg tagcatcacc c 21
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Zak
<400> 137
gtaatggaga agtggatcgt gg 22
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Zak
<400> 138
ttcgttctgt cccactgtat g 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Tec
<400> 139
gaaacagcaa catccccaaa g 21
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Tec
<400> 140
cttccccttt gtactgaccg 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Fbn2
<400> 141
acctgaatcc caacatctgc 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Fbn2
<400> 142
ccaatctcac actcgtccac 20
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Zfp653
<400> 143
ccacctctat agccagcatt g 21
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Zfp653
<400> 144
ccatccactt ctgcctctg 19
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Ptgis
<400> 145
aggatgaagg aaaagcacgg 20
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Ptgis
<400> 146
catgaggaag atggcatagg g 21
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Alg10b
<400> 147
caacttctac ttgctgtatt tgctc 25
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Alg10b
<400> 148
gacccagctt ctgtatagta aagg 24
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Sh3pxd2a
<400> 149
aggaaatcag tgtggttgtc c 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Sh3pxd2a
<400> 150
agctccgagt tctcttgttt c 21
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Tubb6
<400> 151
agaggcattt gaagacgagg 20
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Tubb6
<400> 152
ccagtgacat gcttagacca g 21
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Eva1c
<400> 153
accaaatgtg tagttcccag g 21
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Eva1c
<400> 154
gaagactcgg ctattgacca g 21
<210> 155
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Pou3f1
<400> 155
gctctgtgca gtgaccc 17
<210> 156
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Pou3f1
<400> 156
gtaaaatcca aagcaaaacc gaataa 26
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Prickle2
<400> 157
aaccagagga aacgtgagaa c 21
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Prickle2
<400> 158
gtgatgcaaa cacagcgatg 20
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Map6
<400> 159
cagtgctacc aaacccgac 19
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Map6
<400> 160
acagagcctt gatccttgtg 20
<210> 161
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Tomm70a
<400> 161
cagtggcgga ttttgatgc 19
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Tomm70a
<400> 162
aacctttcat agctgcctgg 20
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of Gene Ube2g1
<400> 163
aatggaggga agacagaaac g 21
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of Gene Ube2g1
<400> 164
cagtgccatg tttctcaatt gg 22
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for qPCR of sgRNA cassette (quantification)
<400> 165
ctatgtggac tacagactgg aaag 24
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for qPCR of sgRNA cassette (quantification)
<400> 166
ctagggaggt cgcagtatct 20
<210> 167
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primers mU6-T2H-F to generate the dual-sgRNA constructs
<400> 167
ctaggatcca ttaggcgggt acagtgcagg ggaa 34
<210> 168
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primers mU6-T2H-R2 to generate the dual-sgRNA constructs
<400> 168
atacggttat ccacgcggcc gcctaatgga tcct 34
<210> 169
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer to clone an 83-bp SV40 nuclear localization
site (NLS) with a linker
<400> 169
tacaaaggtg gaggtcggac cgaaggcagc ggctccccca ag 42
<210> 170
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer to clone an 83-bp SV40 nuclear localization
site (NLS) with a linker
<400> 170
aaatcgtcta aagcatccga ccctccgccg gaaccgccca 40
<210> 171
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer to amplify p300core
<400> 171
agtgggcggt tccggcggag ggtcgatttt caaaccagaa gaactacgac 50
<210> 172
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer to amplify p300core
<400> 172
tatcaagctt gcatgcctgc aggttagtcc tggctctgcg tgtgcagctc 50
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sgRNA-F for synthesize 72-bp sgRNA construct
<400> 173
gtatcccttg gagaaccacc t 21
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer sgRNA-R for synthesize 72-bp sgRNA construct
<400> 174
tgctgtttcc agcttagctc t 21
<210> 175
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genomic DNA sequence of 500 bp upstream and 100 bp downstream
of Sox2 transcription start site
<400> 175
acagagcgca gtgccgcgga tgagcgcaga aacaatggca caccacctcc ggctctgcca 60
gcttcctgaa atactagttg gacagtcgcc ctgaaccacc catgggcctt gccccaccct 120
ggccccagct tcccgcgccc catccaccct tatgtatcca agagagagcc aatattccgt 180
agcatggggg aaaggagctg tcgtcttggt gctgtttacc cacttccttc gaacaggcgt 240
gcgccgtgac ctgttgctga aaacgggggg cggggggggg ggatacaaag gttccccagc 300
ggccggctgc gggcccgcct cccccgcgcg gttcggggca cagcgctctg ctgggctcgg 360
ctcggcggcg cggcaggccc cgcccccttt catgcaaaac cctctggcga ggctgggctc 420
gggcgcagga gccggcgctc gctgattggc cgccggaaac ccatttattc cctgacagcc 480
cccatcacat ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc 540
agagaagaga gtgtttgcaa aaagggaaaa gtactttgct gcctctttaa gactagggct 600
Claims (14)
- 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 생성시키는 방법으로서,
(a) 비-iPSC에서 적어도 하나의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 적어도 하나의 내인성 유전자좌를 표적화하는 단계; 및
(b) CRISPR 활성화 시스템 및 상기 적어도 하나의 sgRNA를 사용하여 상기 비-iPSC에서 상기 내인성 유전자좌를 리모델링하여, 상기 iPSC를 생성시키는 단계
를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서,
(a) 상기 적어도 하나의 내인성 유전자좌는 Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc, Nr5a2, Glis1, Cebpa, Lin28, Nanog, 또는 이들의 임의의 조합이고;
(b) 상기 적어도 하나의 내인성 유전자좌는 Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc, Lin28, 및 Nanog의 조합을 포함하며;
(c) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Oct4 프로모터, Oct4 인핸서, Sox2 프로모터, Klf4 프로모터, c- Myc 프로모터, Lin28 프로모터, Nanog 프로모터, EEA-모티프, 또는 이들의 조합을 표적화하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제2항에 있어서,
(a) 상기 내인성 유전자좌는 Oct4이고;
(b) 상기 내인성 유전자좌는 Sox2이고;
(c) 상기 sgRNA 표적화 Oct4 프로모터는 서열번호 1 내지 6, 57, 및 58로부터 선택되고;
(d) 상기 sgRNA 표적화 Oct4 인핸서는 서열번호 7 내지 11로부터 선택되고;
(e) 상기 sgRNA 표적화 Sox2 프로모터는 서열번호 12 내지 21 및 59로부터 선택되고;
(f) 상기 sgRNA 표적화 Klf4 프로모터는 서열번호 22 내지 31 및 60으로부터 선택되고;
(g) 상기 sgRNA 표적화 c- Myc 프로모터가 서열번호 32 내지 41 및 61로부터 선택되고;
(h) 상기 sgRNA 표적화 Nr5a2 유전자는 서열번호 42 내지 45로부터 선택되고;
(i) 상기 sgRNA 표적화 Glis1 유전자는 서열번호 46 내지 50으로부터 선택되고;
(j) 상기 sgRNA 표적화 Cebpa 유전자는 서열번호 51 내지 56으로부터 선택되고;
(k) 상기 sgRNA 표적화 Lin28 프로모터는 서열번호 62를 포함하고;
(l) 상기 sgRNA 표적화 Nanog 프로모터는 서열번호 63을 포함하고; 그리고/또는
(m) 상기 sgRNA 표적화 EEA-모티프는 서열번호 64를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 CRISPR 활성화 시스템은,
(a) 적어도 하나의 전사 활성인자와 융합된 비활성화된 CRISPR-관련 뉴클레아제; 및 선택적으로
(b) 상기 적어도 하나의 전사 활성인자에 비활성화된 CRISPR-관련 뉴클레아제를 연결시키는 펩타이드의 탠덤 어레이
를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제4항에 있어서,
(a) 상기 CRISPR 활성화 시스템은 비활성화된 Cas9(dCas9)를 포함하고;
(b) 상기 펩타이드의 탠덤 어레이는 SunTag 어레이이며;
(c) 상기 적어도 하나의 전사 활성인자는 단순 포진 VP16, VP16의 테트라머VP16(VP64), 또는 p65를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 비-iPSC는,
(a) 섬유아세포, 피부 세포, 제대혈 세포, 말초 혈액 세포 또는 신장 상피 세포;
(b) 포유류 세포; 및/또는
(c) 인간 세포인, iPSC를 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서,
(c) 단계 (b)의 상기 세포를, TGFβR 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자와 접촉시키는 단계; 및 선택적으로,
(d) 생성된 iPSC를, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하지만 TGFβR 억제제를 포함하지 않은 소분자와 접촉시키는 단계
를 더 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 내인성 유전자좌의 리모델링은 리모델링 없는 것과 비교하여 100배 이상의 유전자 발현 수준을 산출하는, iPSC를 생성시키는 방법.
- iPSC를 생성시키는 방법으로서,
(a) 비-iPSC에서 sgRNA를 표적화하는 Sox2 유전자, sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터, 및 선택적으로 sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서 또는 sgRNA를 표적화하는 EEA-모티프 중 적어도 하나를 사용하여 적어도 하나의 내인성 유전자좌를 표적화하는 단계, 및
(b) CRISPR 활성화 시스템 및 sgRNA를 표적화하는 Sox2 유전자, sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터, 및 선택적으로 sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서 또는 sgRNA를 표적화하는 EEA-모티프 중 적어도 하나를 사용하여 상기 내인성 유전자좌를 리모델링하여 iPSC를 생성시키는 단계
를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - CRISPR 활성화 시스템의 조성물로서,
(a) dCas9;
(b) 상기 dCas9에 융합된 SunTag 어레이; 및
(c) 상기 SunTag 어레이에 부착된 p300의 적어도 하나의 아세틸트랜스퍼라제 활성 도메인(p300코어)
을 포함하는, CRISPR 활성화 시스템의 조성물. - iPSC를 생성시키는 방법으로서,
(a) 비-iPSC에서 적어도 하나의 sgRNA를 사용하여 적어도 하나의 내인성 유전자좌를 표적화하는 단계, 및
(b) 제10항의 CRISPR 활성화 시스템 및 상기 적어도 하나의 sgRNA를 사용하여 상기 비-iPSC에서 상기 내인성 유전자좌를 리모델링하여 iPSC를 생성시키는 단계
를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제11항에 있어서,
(a) 상기 적어도 하나의 내인성 유전자좌는 Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc, Nanog, Lin28, Nr5a2, Glis1, Cebpa, 또는 이들의 임의의 조합이고;
(b) 상기 내인성 유전자좌는 Oct4이고;
(c) 상기 내인성 유전자좌는 Sox2이고;
(d) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Oct4 프로모터, Sox2 프로모터, 또는 이들의 조합을 표적화하고;
(e) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Oct4 프로모터를 표적화하고, 서열번호 1 내지 6, 57, 및 58로부터 선택되고;
(f) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Oct4 인핸서를 표적화하고, 서열번호 7 내지 11로부터 선택되고;
(g) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Sox2 프로모터를 표적화하고, 서열번호 12 내지 21 및 59로부터 선택되고;
(h) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Klf4 프로모터를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 22 내지 31 및 60으로부터 선택되고;
(i) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 c- Myc 프로모터를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 32 내지 41 및 61로부터 선택되고;
(j) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Nr5a2 유전자를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 42 내지 45로부터 선택되고;
(k) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Glis1 유전자를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 46 내지 50로부터 선택되고;
(l) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Cebpa 유전자를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 51 내지 56으로부터 선택되고;
(m) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Lin28 프로모터를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 62를 포함하고;
(n) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 Nanog 프로모터를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 63을 포함하며;
(o) 상기 적어도 하나의 sgRNA는 EEA-모티프를 표적화하고, 선택적으로 서열번호 64를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법. - 제11항에 있어서,
(a) 상기 비-iPSC는 섬유아세포, 피부 세포, 제대혈 세포, 말초 혈액 세포 또는 신장 상피 세포이고;
(b) 상기 비-iPSC는 포유류 세포이고; 그리고/또는
(c) 상기 비-iPSC는 인간 세포인, iPSC를 생성시키는 방법. - iPSC를 생성시키는 방법으로서,
(a) 비-iPSC에서 sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터 또는 sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서 중 적어도 하나를 사용하여 적어도 하나의 내인성 유전자좌를 표적화하는 단계, 및
(b) 제23항에 기재된 CRISPR 활성화 시스템, 및 sgRNA를 표적화하는 Oct4 프로모터 또는 sgRNA를 표적화하는 Oct4 인핸서 중 적어도 하나를 사용하여 상기 내인성 유전자좌를 리모델링하여 iPSC를 생성시키는 단계
를 포함하는, iPSC를 생성시키는 방법.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (5)
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Cited By (1)
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