CN111511902A - 通过crispr激活生成诱导性多能细胞 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及通过在不依赖于转录因子的异位表达的情况下靶向和重塑内源基因座将成人体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法和组合物。

Description

通过CRISPR激活生成诱导性多能细胞
相关申请
本申请要求2017年12月28日提交的美国临时申请第62/611,202号的优先权，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
通过调控特定转录因子将成人体细胞重编程为多能干细胞的能力是基础生物研究非常感兴趣的，并且对于再生医学也具有很大的希望，其中诱导性多能干细胞(iPSC)可分化成身体的任何细胞类型以治疗多种疾病和病症。本领域中的持续难题是在不依赖于转录因子的异位表达的情况下生成iPSC。本公开提供通过靶向和重塑内源基因座诱导多能干细胞的新的方法和组合物。
背景技术
多能干细胞对于再生医学具有极大的前景。更好地理解内源染色质重塑如何引起多能性诱导引起了极大的兴趣。常规地，可通过Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)的异位表达将分化的体细胞重编程成诱导性多能干细胞(iPSC)(Takahashi和Yamanaka,2006)。过表达的Oct4、Sox2和Klf4首先结合于整个基因组中的内源基因座并且对其进行整体重塑(Soufi等人,2012)，最终使得确立多能调节回路。
然而，很大程度上未知内源染色质上的哪一件精确重塑事件触发了朝向多能性的重编程。首先，尚不清楚是否需要同时重塑许多多能性相关基因座，或者单个基因座的精确重塑是否足以用于iPSC诱导。另外，Oct4、Sox2和Klf4靶向重编程所需的许多基因的远端元件(Soufi等人,2012)，但人们对这些远端元件的重塑如何影响多能性诱导的了解却很少。此外，表观遗传重塑是细胞重编程的中心机制(Smith等人,2016)，但尚未确定iPSC诱导是否可由任何定义的内源基因座的表观遗传操纵引发。最后，由于方法论限制，没有直接证据表明多能性是否可由内源基因座的精确重塑诱导。
最近，将来自细菌的II型规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关9(Cas9)核酸酶系统(CRISPR/Cas9系统)重新建构成哺乳动物细胞中的基因编辑的有力工具(Cong等人,2013；Jinek等人,2012；Mail等人,2013b)。Cas9的核酸酶去激活形式(dCas9)在与反式激活结构域融合时已被工程改造为可编程合成转录因子。这一系统被称为CRISPR激活(CRISPRa)系统(Chavez等人,2015；Gilbert等人,2013；Konermann等人,2015；Tanenbaum等人,2014；Zalatan等人,2015)。据报导，这一系统可充当先锋因子，以高精确度靶向沉默染色质基因座并且促进下游基因转录(Polstein等人,2015)。在这些特点的情况下，CRISPRa系统提供有利工具，其用以精确重塑内源染色质基因座，从而将细胞从一个谱系重编程成另一谱系特异性细胞(Black等人,2016；Chakraborty等人,2014)。但这一系统是否能够工作和/或这一系统可以如何工作以生成对所有谱系的细胞具有全范围的分化潜能的诱导性多能干细胞是未知的。
发明内容
本公开基于本文的发现预测诱导性多能干细胞(iPSC)可通过在体细胞中靶向和重塑选择性内源基因座生成，并且部分地是针对生成iPSC的方法，其包含：在非iPSC中使用至少一个单向导RNA(sgRNA)靶向至少一个内源基因座，并且使用CRISPR激活系统和至少一个sgRNA重塑非iPSC中的选择性内源基因座以生成iPSC。在一些实施例中，生成iPSC的上述方法进一步包含使经历重编程的非iPSC细胞与包含TGFβR抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的小分子接触；和任选地使所生成的iPSC与包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂但不包含TGFβR抑制剂的小分子接触。
在一些实施例中，CRISPR激活系统包含与至少一个转录激活子融合的核酸酶去激活Cas9(dCas9)。在其它实施例中，CRISPR激活系统进一步包含使dCas9与至少一个转录激活子连接的肽的串联阵列。在一个实施例中，肽的串联阵列是SunTag阵列。在一个实施例中，至少一个转录激活子是单纯疱疹病毒VP16转录激活子结构域的四聚体(VP64)。在一个实施例中，CRISPR激活系统是dCas9-SunTag-VP64。
在其它方面，本公开提供CRISPR激活系统，其包含dCas9、与dCas9融合的SunTag阵列和与SunTag阵列附接的p300的至少一个乙酰基转移酶活性结构域(p300core)。
在其它方面，本公开提供使用包含dCas9、SunTag阵列和p300core的CRISPR激活系统生成iPSC的方法。
在一些实施例中，至少一个内源基因座是Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、Nr5a2、Glis1、Cebpa或其任何组合。
在一些实施例中，靶向和重塑单个内源基因座。在一些实施例中，单内源基因座是Oct4或Sox2。
在一些实施例中，至少一个sgRNA是靶向Oct4启动子的sgRNA、靶向Oct4增强子的sgRNA、靶向Sox2启动子的sgRNA或其组合。在一些实施例中，靶向Oct4启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:1-6、57和58。在一些实施例中，靶向Oct4增强子的sgRNA选自SEQ ID NO:7-11。在一些实施例中，靶向Sox2基因的sgRNA选自SEQ ID NO:12-21和59。
在一个实施例中，至少一个sgRNA是靶向Klf4基因的sgRNA。在一些实施例中，靶向Klf4基因的sgRNA选自SEQ ID NO:22-31和60。在一个实施例中，至少一个sgRNA是靶向c-Myc基因的sgRNA。在一些实施例中，靶向c-Myc基因的sgRNA选自SEQ ID NO:32-41和61。在一个实施例中，至少一个sgRNA是靶向Nr5a2基因的sgRNA。在一些实施例中，靶向Nr5a2基因的sgRNA选自SEQ ID NO:42-45。在一个实施例中，至少一个sgRNA是靶向Glis1基因的sgRNA。在一些实施例中，靶向Glis1基因的sgRNA选自SEQ ID NO:46-50。在一个实施例中，至少一个sgRNA是靶向Cebpa基因的sgRNA。在一些实施例中，靶向Cebpa基因的sgRNA选自SEQ ID NO:51-56。在一些实施例中，sgRNA靶向Lin28启动子。在一些实施例中，靶向Lin28的sgRNA包含SEQ ID NO:62。在一些实施例中，sgRNA靶向Nanog启动子。在一些实施例中，靶向Nanog的sgRNA包含SEQ ID NO:63。在一些实施例中，sgRNA靶向EEA-基序。在一些实施例中，靶向EEA-基序的sgRNA包含SEQ ID NO:64。
在一些实施例中，非iPSC是体细胞，例如成纤维细胞、皮肤细胞、脐带血细胞、外周血细胞或肾上皮细胞。在一些实施例中，非iPSC是哺乳动物细胞。在其它实施例中，非iPSC是人类细胞。
附图说明
图1证实通过基因激活在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中建立多能性网络。(A)描绘了基因激活中的dCas9-SunTag-VP64复合物的方案。(B)描绘了OG2MEF中的重编程过程的方案。(C)重编程OG2MEF以形成EGFP阳性菌落。展示第0天的MEF以及第7天和第15天的重编程的菌落的形态(比例尺，200μm)。(D)在12天内的内源Oct4和Sox2转录。数据表示平均值±SD(n＝4)。通过Dunnett检验的单因素方差分析确定p值。**p<0.01。(E)在原位以及第1代和第20代展示EGFP信号的菌落(比例尺，200μm)。(F)EGFP阳性菌落中的Nanog、Sox2和SSEA-1染色(比例尺，200μm)。(G)在已建立的CRISPR iPSC和R1小鼠胚胎干(R1 ES)细胞中的多能基因表达。
图2证实激活Sox2基因足以在MEF中生成iPSC。(A)描绘Sox2启动子的sgRNA靶向位点以及转录因子(Oct4、Sox2、Nanog)的结合峰、组蛋白乙酰基转移酶p300、介体复合物和组蛋白H3K27ac的分布的方案(Whyte等人,2013)。(B)通过第4天的免疫荧光染色检测Sox2蛋白(比例尺：100μm)。(C)在指定sgRNA存在下的Sox2激活。O-71和O-127靶向Oct4启动子，而S-84、S-136和S-148靶向Sox2启动子。数据表示平均值±SD(n＝4)。通过未配对的t检验确定p值。**p<0.01。(D)通过用sgRNA O-71、O-127、S-84、S-136或S-148靶向Oct4或Sox2启动子生成的菌落数。展示三次独立实验。(E)通过用S-84激活Sox2基因的EGFP阳性菌落原位和iPSC系的生成(比例尺，200μm)。(F)用S-84生成的EGFP阳性菌落中的Nanog、Sox2和SSEA-1染色(比例尺，200μm)。(G)S-17细胞系和R1 ES细胞中的多能性基因表达的比较。(H)S-17系的雄性核型。(I)-(K)体内多能S-17系的表征。用S-17细胞生成嵌合小鼠(J)，并且这些细胞促成由强烈的EGFP信号表示的性腺组织(I)，并且对于生殖系传递呈感受态(K)。
图3证实Sox2启动子的重塑触发了S-17 MEF中朝向多能性的重编程。(A)展示S-17MEF生成的方案。(B)在S-17 MEF中用或不用强力霉素的情况下12天内的Sox2激活。(C)在第0天、第4天、第8天和第12天在Sox2启动子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。(D)在强力霉素存在下通过免疫荧光染色检测Sox2表达(比例尺：100μm)。(E)将S-17 MEF重编程以形成EGFP阳性菌落，并且建立iPSC系(比例尺：200μm)。(F)慢病毒SunTag重编程和S-17 MEF重编程的效率的比较。(G)在S-17 MEF重编程中在12天内Oct4、Nanog和Rex1的基因表达。(H)在第0天、第4天、第8天和第12天在Oct4、Nanog和Rex1启动子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。(I)在第0天、第4天、第8天和第12天在Oct4增强子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。(J)S-17 MEF重编程中的Sox2依赖性。使用了四种不同浓度(0、0.01、0.1和1μg/ml)的强力霉素，并且展示Sox2激活(左)和重编程效率(右)。(K)在S-17 MEF重编程中Oct4和Sox2重塑的协同作用。检查了Oct4基因激活(左)和重编程效率(右)。(L)多能基因过表达(OE)时第4天和第12天的总(左)和内源Sox2(右)表达。测试了三种条件：单独的Oct4、单独的Sox2和OSK(Oct4、Sox2和Klf4)，并且将mCherry(mCh)的过表达用作对照。(M)比较S-17 MEF和多能基因过表达的重编程效率。(B)、(C)、(G)、(H)、(I)和(K)中的数据表示平均值±SD(n＝4)。通过Bonferroni检验的单因素方差分析确定(B)中的p值，通过Dunnett检验的单因素方差分析确定(C)、(G)、(H)和(I)中的p值，并且通过未配对的t检验确定(K)中的p值。**p<0.01；*p<0.05。
图4证实Oct4启动子和增强子的同时重塑将MEF重编程为iPSC。(A)描绘Oct4启动子的sgRNA靶向位点以及转录因子(Oct4、Sox2、Nanog)的结合峰、组蛋白乙酰基转移酶p300、介体复合物和组蛋白H3K27ac和DNA酶过敏位点(DHS)的分布的方案(Whyte等人,2013)。(B)第4天在Oct4增强子和启动子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。检查了三个不同的位点：转录起始位点的2.7kb、1.4kb和0.2kb上游。(C)在16天内在O-127、O-2066或O-127-2066sgRNA存在下的内源Oct4转录。(D)由Oct4启动子(O-127)、增强子(O-2135、O-2066、O-1965)或同时启动子和增强子(O-127-2135、O-127-2066、O-127-1965)的重塑生成的菌落数。展示四次独立实验。在实验3的O-127-2135培养物和实验4的O-127-2066/1965中未观察到菌落。(E)来自Oct4启动子和增强子(O-127-2066)的同时重塑的EGFP阳性菌落原位和P0iPSC的形态(比例尺，200μm)。(F)Oct4-EGFP阳性菌落中的Nanog、Sox2和Rex1表达(比例尺，200μm)。(G)D-9细胞系和R1 ES细胞中的多能性基因表达的比较。(H)D-9系的核型分析。(I)-(K)体内多能D-9系的表征。用D-9细胞生成嵌合小鼠(J)，并且这些细胞促成由强烈的EGFP信号表示的性腺组织(I)，并且对于生殖系传递呈感受态(K)。(B)和(C)中的数据表示平均值±SD(n＝4)。通过未配对的t检验确定p值。**p<0.01。
图5证实SunTag系统在分化小鼠ES细胞和MEF中的基因激活。(A)、(B)描绘Oct4启动子和增强子(A)和Sox2启动子(B)的sgRNA靶向位点以及转录因子(Oct4、Sox2、Nanog)的结合峰、组蛋白乙酰基转移酶p300、介体复合物和组蛋白H3K27ac的分布的方案(Whyte等人,2013)。(C)Sox2转录起始位点的500bp上游和100bp下游的基因组DNA序列(SEQ ID NO:175)。sgRNA(蓝色)和转录因子(呈阴影)结合位点突出显示。(D)、(E)在分化小鼠ES细胞中使用sgRNA转录激活Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nr5a2、Glis1和Cebpa。展示描绘实验过程(D)和使用每个sgRNA进行倍数转录激活(E)的示意图。Gal4sgRNA用作阴性对照。(F)、(G)在MEF中使用sgRNA转录激活Oct4和Sox2。展示实验过程(F)和使用所选sgRNA的倍数转录激活(G)。Gal4sgRNA用作阴性对照。靶向Oct4启动子(Oct4Pro)的sgRNA包括O-71和O-127，并且靶向Oct4增强子(Oct4Enh)的sgRNA包括O-1965、O-2066和O-2135。靶向Sox2启动子(Sox2Pro)的sgRNA包括S-84、S-136和S-148。(H)用Parnate、Chir99021、A83-01和毛喉素(Forskolin)(PCAF)的小分子组合进行Oct4和Sox2激活。(E)、(G)和(H)中的数据表示平均值±SD(n＝4)。通过采用Dunnett检验的单因素方差分析确定(E)和(G)中的p值，并且通过未配对的t检验确定(H)中的p值。*p<0.05；**p<0.01；ns，不显著。
图6证实激活Sox2基因足以在MEF中生成iPSC。(A)从sgRNA池中去除靶向指定基因的sgRNA时的EGFP阳性菌落数。(B)在第3天使用一个sgRNA和多个Oct4、Sox2和Glis1的sgRNA进行激活的比较。(C)在第3天使用O-127、S-84、G-215或所有(OSG)对Oct4、Sox2和Glis1进行的转录激活。(D)来自一起靶向Oct4、Sox2和Glis1启动子的EGFP阳性菌落原位和P0iPSC的形态(比例尺，200μm)。(E)来自一起靶向Oct4、Sox2和Glis1启动子的EGFP阳性菌落的Nanog、Sox2和SSEA-1染色(比例尺，200μm)。(F)由靶向Oct4、Sox2和Glis1启动子生成的EGFP阳性菌落数。展示三次独立实验。(G)检查S-84sgRNA的脱靶效应。检查了前10个预测标靶的转录。(B)和(C)中的数据表示平均值±SD(n＝4)。通过未配对的t检验确定p值。**p<0.01；*p<0.05；ns，不显著。
图7证实Sox2启动子的重塑触发了MEF中朝向多能性的重编程。(A)在OG2和129个MEF中用S-84进行Sox2激活的比较。数据表示平均值±SD(n＝4)。通过未配对的t检验确定p值。**p<0.01。(B)在第4天在129个MEF中染色Sox2蛋白(比例尺：200μm)。(C)在129个MEF中生成重编程的菌落(比例尺：200μm)。(D)确定12个已建立的CRISPR iPSC系中sgRNA盒的拷贝数。如图所示，克隆8是S-17系。(E)S-17 MEF中BFP的流式细胞术检查。(F)在用或不用强力霉素以进行S-17 MEF重编程的情况下在第4天Sox2阳性细胞的百分比。(G)在S-17 MEF重编程中检查S-84sgRNA的脱靶效应。通过qPCR检查了前10个预测标靶的转录。(H)慢病毒SunTag和S-17 MEF重编程效率的变异系数(CV)比较。(I)比较在用或不用PCAF混合液的情况下的重编程效率。(J)当多能基因过表达(OE)时，在第4天Sox2启动子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。测试了三种条件：单独的Oct4、单独的Sox2和OSK(Oct4、Sox2和Klf4)，并且将mCherry过表达(mCh OE)用作阴性对照。(K)OSK过表达和S-17 MEF重编程效率的变异系数(CV)比较。(L)S-17 TTF可重编程。展示了在Oct4-EGFP激活的情况下，第0天的S-17 TTF以及第7天和第14天的重编程菌落的形态(比例尺：200μm)。
图8证实Oct4启动子和增强子的同时重塑将MEF重编程为iPSC。(A)通过引入两个靶向Sox2(S-148)和c-Myc(M-154)的sgRNA，双sgRNA盒在分化ES细胞中的功能验证。(B)在重编程的第8天进行Oct4蛋白染色(比例尺：200μm)。(C)检查O-127(左)和O-2066(右)的脱靶效应。通过qPCR检查每种sgRNA的前10个预测标靶的转录。(D)在多能基因过表达(OE)时在第4天和第12天，总(左)和内源(右)Oct4的转录。测试了两种条件：单独的Oct4和OSK(Oct4、Sox2和Klf4)。mCherry用作阴性对照。(E)描绘dCas9-SunTag-p300core和其功能的方案。(F)对于dCas9-SunTag-VP64和dCas9-SunTag-p300core系统，在第5天Oct4增强子和启动子处的组蛋白H3K27乙酰化水平。检查了三个不同的位点：转录起始位点的2.7kb、1.4kb和0.2kb上游。(G)用dCas9-SunTag-VP64或dCas9-SunTag-p300core在15天内转录激活Oct4。(H)由用dCas9-SunTag-p300core操控Oct4启动子和增强子的乙酰化生成的EGFP阳性菌落原位和P1iPSC(D-16)的形态(比例尺，200μm)。(I)D-16细胞系和R1 ES细胞中的多能性基因表达的比较。(A)、(D)和(G)中的数据表示平均值±SD(n＝4)。通过Bonferroni检验的双因素方差分析确定(A)和(D)中的p值，并且通过未配对的t检验确定(G)中的p值。**p<0.01；ns，不显著。
图9证实CRISPRa生成人类iPSC菌落，其随时间采用并且维持多能形态。上图展示，与不使用EEA生成的hiPSC相比，iPSC生成中包括EEA时的hiPSC形态特征更为稳固(下图是第28天)。
图10证实多能性基因在CRISPRa生成的人类iPSC菌落中的表达。A：第28天，不用EEA生成的hiPSC，并且MOI＝1.2的情况下；B：第28天，用EEA生成的hiPSC，并且MOI＝1.2；C：第21天，用EEA生成的hiPSC，并且MOI＝6。
图11证实随着时间的推移，内源多能性编程在重编程的群体中被激活，这表现为包括Oct4(Pou5f1)、Sox2、Lin28、Nanog和Rex1的靶向或非靶向内源基因的表达增加。
图12证实多能性基因TRA-1-81的表达在重编程的群体内随时间增加，如流式细胞术所示。
具体实施方式
本公开涉及通过用CRISPR激活系统靶向和重塑内源基因座生成诱导性多能干细胞(iPSC)。
应理解，本公开并不限于所描述的特定实施例，因而其可发生变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不意欲为限制性的，因为本公开的范围将仅受到所附权利要求书限制。
本公开具体实施方式仅为了读者的方便而分成多个部分，并且任何部分中所发现的公开内容可与另一部分中的公开内容组合。尽管在本公开的实践或测试中也可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。本文提及的所有公开都以引入的方式并入以公开案和描述与所列公开案结合的方法和/或材料。
I.定义
为了便于理解本公开，下面定义多个术语。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。如“一(a/an)”和“所述(the)”等术语并不意欲仅指代单数实体，而是包括具体实例可用于说明的一般类别。
如本文所用，术语“生成”是指通过任何操纵从其天然存在的状态产生和/或改变生物组合物(例如细胞)，所述任何操纵包括但不限于改变染色体结构、多核苷酸(例如，DNA或RNA)的核苷酸序列、多肽(例如，蛋白质)的氨基酸序列、基因的转录水平、染色体区的表观遗传修饰、蛋白质的转录水平和RNA的转录水平。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。举例来说，具有提高的细胞效能的细胞具有与非重编程状态下相同细胞相比更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞为与非重编程状态下相同细胞相比分化状态较低的细胞。
术语“多能”或“多能性”是指细胞自我更新和分化成体内多种组织或所有谱系细胞类型的能力。举例来说，胚胎干细胞是一种类型多能干细胞，其能够形成三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一种的细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
多能性可部分地通过评定细胞的多能性特征测定。多能性特征包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标记物的表达，所述标记物包括但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/凸素(prominin)、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，并且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上所述的特征，但所述初始或基础状态进一步展现；(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活；(ii)在单一细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调节基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标记物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源多能性基因引入体细胞中，表达，并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特征。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源转基因表达(其中观察到基础状态的特征)，否则这类细胞保持激发状态。
如本文所用，术语“诱导性多能干细胞”或iPSC意指干细胞由分化的成人、新生儿或胎儿细胞产生，所述细胞已被诱导或改变，即人工重编程成以下的细胞：具有较低分化状态；展现多能性特征，例如表达某些干细胞基因和蛋白质、染色质甲基化模式、类胚胎体形成、畸胎瘤形成、可存活嵌合体形成；并且能够分化成所有三种胚层或真皮层的组织：内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)。所产生的iPSC并非指如其在自然界中被发现的细胞。
如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特点。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比例高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
如本文所用，术语“非iPSC”是指呈分化或部分分化状态的任何细胞，并且不是胚胎干细胞(ESC)或iPSC。非iPSC可以来自身体的任何非生殖系组织，包括内脏组织、皮肤组织、骨骼组织、血液组织、神经组织和结缔组织。
如本文所用，“CRISPR/Cas系统”是指源自用于防御外来核酸的细菌的系统。CRISPR/Cas发现于广泛范围的真细菌和古细菌生物体中，并且包括I型、II型和III型亚型。CRISPR相关核酸酶来自包括以下的家族：cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr。野生型II型CRISPR/Cas系统将RNA介导的核酸酶用于与CRISPR RNA(crRNA)、有时以及转录激活的crRNA(tracrRNA)复合，从而识别和裂解外来核酸。在需要crRNA和tracrRNA两者时，在Cas9的情况下，例如，crRNA和tracrRNA可被工程改造为单向导RNA(sgRNA)分子，其在与Cas9组合时通过sgRNA内的向导序列与标靶DNA序列之间的互补碱基配对找到并且裂解DNA标靶。如本文所用，术语“核酸酶去激活Cas9”或“dCas9”是指经过修饰的Cas9核酸酶，其中核酸酶活性已通过使残基在其催化RuvC和HNH结构域中突变来禁用。禁用催化结构域可使Cas9从RNA可编程核酸酶转化成RNA可编程DNA识别复合物，从而将效应子或标记物递送到特定标靶DNA序列上。类似操纵适用于其它CRISPR相关核酸酶核酸酶。如本文所用，术语“CRISPR激活系统”或“CRISPRa”是指已经过修饰以上调基因转录的CRISPR/Cas系统，其中去激活的Cas核酸酶与转录激活子融合，所述转录激活子例如单纯疱疹病毒VP16转录激活子结构域、VP64激活子(工程改造的VP16四聚体)、p65的激活结构域、多个转录激活子的协同组合、募集多个转录激活子拷贝的支架肽或组蛋白乙酰基转移酶。
如本文所用，术语“单向导多核苷酸”或“sgPNA”是指与CRISPR/Cas系统结合使用的DNA、RNA或DNA/RNA混合序列。术语“单向导RNA”或“sgRNA”是指与CRISPR/Cas系统结合使用的RNA序列。sgPNA含有包括Cas9的CRISPR相关核酸酶的结合位点和与所期望的标靶DNA序列互补的向导序列。sgPNA与标靶DNA序列的碱基配对将CRISPR相关核酸酶募集到DNA序列。
如本文所用，术语“靶向”是指在染色体基因座鉴别任何组成和/或长度的核酸序列(即标靶)的方法，所述染色体基因座包括但不限于基因、启动子、增强子、开放阅读框或任何其它染色体区。然后设计并且合成含有与预先鉴别出的核酸序列互补的向导序列的sgRNA。在一些实施例中，基于sgRNA与预先鉴别出的核酸序列的互补碱基配对，sgRNA将CRISPR激活系统引导到具有预先鉴别出的核酸序列的内源基因座的附近。
如本文所用，术语“重塑(remodel/remodeling)”是指在转录水平下对基因表达的任何修饰。例示性基因重塑包括但不限于改变基因的染色质结构、将转录激活子募集到基因的启动子、将转录激活子募集到基因的增强子并且利用特定酶(例如，组蛋白乙酰基转移酶)改变基因的组蛋白修饰。
II.细胞
本发明基于发现预测通过在内源基因座利用CRISPR激活单独或以组合方式激活多能性相关基因，非iPSC(例如体细胞)可重编程为多能性。
本公开的非iPSC包括并非干细胞、生殖细胞或iPSC的身体的任何细胞。非iPSC的非限制性实例是衍生自身体的任何非生殖系组织(包括内脏组织、皮肤组织、骨骼组织、血液组织、神经组织和结缔组织)的体细胞。在一些实施例中，体细胞是胎儿体细胞。在一些实施例中，体细胞是成人体细胞。在一些实施例中，非iPSC衍生自可易于获取并且需要极小侵袭的细胞类型，例如成纤维细胞、皮肤细胞、脐带血细胞、外周血细胞和肾上皮细胞。
本公开的非iPSC可衍生自哺乳动物，优选人类，但包括但不限于非人类灵长类动物、鼠类(即，小鼠和大鼠)、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、山羊等。在一些实施例中，非iPSC是人类非iPSC。
III.靶向和重塑内源基因座
本公开涉及使用CRISPR激活系统与至少一个靶向所期望的基因座的sgRNA靶向和重塑内源基因座。在一些实施例中，内源基因座是多能性相关基因。在其它实施例中，内源基因座是非多能性相关基因。多能性相关基因的非限制性实例是Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc、Lin28、Nr5a2、Glis1、Cebpa、Esrrb和Rex1。在一些实施例中，内源基因座是Oct4或Sox2。在一些实施例中，内源基因座是Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc和Lin28的组合。
在一些实施例中，生成iPSC的方法包含与靶向多能性相关基因的CRISPR激活系统结合使用至少一个sgRNA。在一些实施例中，sgRNA靶向选自由以下组成的群组的多能性相关基因：Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc、Lin28、Nr5a2、Glis1、Cebpa、Esrrb和Rex1。在一些实施例中，sgRNA靶向选自由以下组成的群组的多能性相关基因：Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc、Lin28、Nr5a2、Glis1和Cebpa。
在一些实施例中，sgRNA靶向多能性相关基因的启动子区。在一些实施例中，sgRNA靶向多能性相关基因的增强子区。在一些实施例中，sgRNA靶向Oct4基因的启动子区、Oct4基因的增强子区、Sox2基因的启动子区或其组合。
在一些实施例中，sgRNA靶向Oct4启动子区和/或增强子区在Oct4转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Oct4TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Oct4TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Oct4TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、Oct4TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Oct4TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Oct4TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Oct4TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Oct4启动子区和/或增强子区在Oct4转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Oct4启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Sox2启动子区在Sox2转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Sox2TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Sox2TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Sox2TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、Sox2TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Sox2TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Sox2TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Sox2TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Sox2启动子区在Sox2转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Sox2启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Nanog启动子区和/或增强子区在Nanog转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Nanog TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、NanogTSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Nanog TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、NanogTSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Nanog TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、NanogTSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Nanog TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Nanog启动子区和/或增强子区在Nanog转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Nanog启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Klf4启动子区和/或增强子区在Klf4转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Klf4TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Klf4TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Klf4TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、Klf4TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Klf4TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Klf4TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Klf4TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Klf4启动子区和/或增强子区在Klf4转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Klf4启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向c-Myc启动子区和/或增强子区在c-Myc转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、c-Myc TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、c-MycTSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、c-Myc TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、c-MycTSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、c-Myc TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、c-MycTSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或c-Myc TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向c-Myc启动子区和/或增强子区在c-Myc转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类c-Myc启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Nr5a2启动子区和/或增强子区在Nr5a2转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Nr5a2TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Nr5a2TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Nr5a2启动子区和/或增强子区在Nr5a2转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Nr5a2启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Cebpa启动子区和/或增强子区在Cebpa转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Cebpa TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、CebpaTSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Cebpa TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、CebpaTSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Cebpa TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、CebpaTSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Cebpa TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Cebpa启动子区和/或增强子区在Cebpa转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Cebpa启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，靶向Esrrb启动子区和/或增强子区在Esrrb转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Esrrb TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Esrrb TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Esrrb TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、EsrrbTSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Esrrb TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Glis1TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Esrrb TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Esrrb启动子区和/或增强子区在Esrrb转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。在一些实施例中，以上sgRNA中的任一者靶向人类Esrrb启动子区和/或增强子区的区域。
在一些实施例中，sgRNA靶向Rex1启动子区和/或增强子区在Rex1转录起始位点(TSS)的约1-bp与约5000-bp上游之间、Rex1TSS的约100-bp与约4000-bp上游之间、Rex1TSS的约200-bp与约3000-bp上游之间、Rex1TSS的约400-bp与约4000-bp上游之间、Rex1TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Rex1TSS的约500-bp与约3000-bp上游之间、Rex1TSS的约600-bp与约2000-bp上游之间或Rex1TSS的约700-bp与约1000-bp上游之间的区域。在一些实施例中，sgRNA靶向Rex1启动子区和/或增强子区在Rex1转录起始位点(TSS)的约10-bp、约20-bp、约30-bp、约40-bp、约50-bp、约60-bp、约70-bp、约80-bp、约90-bp、约100-bp、约110-bp、约120-bp、约130-bp、约140-bp、约150-bp、约160-bp、约170-bp、约180-bp、约190-bp、约200-bp、约300-bp、约400-bp、约500-bp、约600-bp、约700-bp、约800-bp、约900-bp、约1000-bp、约1500-bp、约2000-bp、2500-bp、约3000-bp、3500-bp、约4000-bp、4500-bp、约5000-bp上游的区域或其间任何区域。
在一些实施例中，靶向Oct4启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:1-6、57和58。在一些实施例中，靶向Oct4增强子的sgRNA选自SEQ ID NO:7-11。在一些实施例中，靶向Sox2启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:12-21和59。在一些实施例中，靶向Klf4基因的sgRNA选自SEQ IDNO:22-31和60。在其它实施例中，靶向c-Myc基因的sgRNA选自SEQ ID NO:32-41和61。在其它实施例中，靶向Nr5a2基因的sgRNA选自SEQ ID NO:42-45。在其它实施例中，靶向Glis1基因的sgRNA选自SEQ ID NO:46-50。在其它实施例中，靶向Cebpa基因的sgRNA选自SEQ IDNO:51-56。在其它实施例中，靶向Lin28基因的sgRNA包含SEQ ID NO:62。在其它实施例中，靶向Nanog基因的sgRNA包含SEQ ID NO:63。在另一个实施例中，靶向EEA-基序的sgRNA包含SEQ ID NO:64，其中EEA-基序是与多能性基因的转录相关的调节区，包括但不限于PRD样同源结构域TR结合位点。
IV.CRISPR激活系统
本公开基于源自细菌CRISPR/Cas系统的CRISPR激活系统进行预测。CRISPR激活系统包含II型Cas，其已对其核酸酶活性进行去激活，并且已与效应子融合以调节基因转录。在一些实施例中，dCas与至少一个转录激活子融合。在一些实施例中，dCas与充当支架结构以使dCas与多个转录激活子连接的肽的串联阵列融合。在一些实施例中，肽的串联阵列是SunTag阵列。在其它实施例中，反式激活子是单纯疱疹病毒VP16转录激活子结构域的四聚体(VP64)。在一个实施例中，CRISPR激活系统是dCas-SunTag-VP64，也称为SunTag CRISPR激活系统。
在一些实施例中，CRISPR激活系统包含与SunTag阵列融合的dCas9和p300的与SunTag阵列附接的至少一个乙酰基转移酶活性结构域(p300core)。在其它实施例中，生成iPSC的方法包含使用包含dCas9、SunTag阵列和p300core的CRISPR激活系统以修饰内源基因座的组蛋白乙酰化，从而调节基因的转录。应理解，本领域技术人员已知的其它CRISPR激活系统和/或反式激活子可用于生成iPSC。
实例
以下实例意欲进一步说明本公开的某些实施例。提出实例以向本领域的普通技术人员提供，并且并不意欲限制其范围。
实例1.用dCas9-SunTag-VP64激活内源Oct4和Sox2
为了确定重塑内源基因座是否和如何引发朝向多能性的重编程，使用SunTagCRISPR激活系统精确重塑小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的内源多能性基因座。通过将多个VP64募集到一个靶向位点，针对其增强的染色质重塑活性选择dCas9-SunTag-VP64(图1A)(Tanenbaum等人,2014)。dCas9表达受Tet-On启动子控制。Oct4和Sox2基因座由于其在多能性诱导和维持中的重要作用被选择作为标靶。
MEF由E13.5小鼠胚胎制备。胚胎恢复后，在解剖显微镜下去除头部、肢体和内脏，尤其是性腺。将剩余的胚胎体用两个刀片细细切碎，并且在0.05％胰蛋白酶-EDTA中消化15分钟。然后加入MEF培养基以终止胰蛋白酶消化。通过上下移液几次进行组织的进一步解离。然后通过离心收集细胞，并且将其接种在15cm培养皿上以进行扩增(P0)。MEF细胞在P3之前用于所有测试，并且在补充有10％FBS和非必需氨基酸的DMEM中培养。
设计sgRNA以靶向Oct4和Sox2启动子以及Oct4增强子。除了sgRNA的激活作用外，还考虑了多种因素，关于所靶向的基因组序列，包括其与多能因子和转录机制的结合位点相近但不重叠、多能干细胞中的组蛋白H3K27乙酰化和其形成由介体复合物介导的启动子-增强子回路的潜能(图5A-5C)。
对于sgRNA构建体，合成72-bp寡核苷酸，包括特定sgRNA序列，以利用引物sgRNA-F(SEQ ID NO:173--GTATCCCTTGGAGAACCACCT)和sgRNA-R(SEQ ID NO:174--TGCTGTTTCCAGCTTAGCTCT)进行PCR扩增。经过扩增的片段被纯化，并且根据吉布森组装克隆试剂盒(Gibson Assembly Cloning Kit protocol)方案(NEB)与用BstXI和BlpI消化的pSLQ1373构建体用于重组反应。
靶基因的转录激活水平利用由分化小鼠胚胎干(ES)细胞中的慢病毒递送的每个经过设计的Oct4和Sox2sgRNA进行检查(图5D)。HEK293T/17细胞(
Figure BDA0002551876110000211
CRL-11268)在补充10％FBS的DMEM中培养，并且提前1天接种以达到转染的约70％融合度，并且表达质粒pMD2.G(Addgene,12259)和psPAX2(Addgene,12260)的VSV-G包膜用于慢病毒包装。对于六孔盘中的每个孔，具有所关注基因的质粒(1.8μg)与psPAX2(1.35μg)和pMD2.G(0.45μg)混合，并且添加10.8μl FUGENE HD(普洛麦格公司(Promega))以用于转染。5小时后，更新培养基。含有病毒的上清液在48小时时收集，穿过0.45μM的过滤器以去除细胞碎片，并且与1体积的新鲜培养基混合以立即使用。对于SunTag系统，三种组分的慢病毒(dCas9、VP64和Tre3G)独立地包装并且在使用时混合。SunTag转导在两轮慢病毒感染中进行，第一轮是Suntag系统(dCas9、VP64和Tre3G)并且第二轮是sgRNA。每次感染后都更新培养基。
小鼠ES细胞首先用dCas9-SunTag-VP64系统和sgRNA转导。因为Oct4和Sox2在ES细胞中高度表达，所以诱导ES细胞以在补充有1μM视黄酸的MEF培养基中分化4天以降低Oct4和Sox2表达。同时，dCas9-SunTag-VP64系统用强力霉素(doxycycline)诱导。Oct4表达的分析展示，靶向靠近转录起始位点(TSS)的狭窄启动子区和远端增强子的200-bp区域的sgRNA可增加转录(图5E)。对于Sox2启动子，sgRNA活性展示更接近TSS的sgRNA具有更高的基因激活的显著趋势(图5E)。
所选sgRNA和dCas9-SunTag-VP64也转导到MEF中(图5F)。MEF细胞在5μg/ml凝聚胺(polybrene)(密理博公司(Millipore))的存在下与慢病毒上清液一起培育8小时或过夜。靶向Oct4TSS的127-bp和71-bp上游的sgRNA O-127和O-71组合以靶向启动子。类似地，O-1965、O-2066和O-2135组合以靶向Oct4增强子，并且分别将S-84、S-136和S-148组合以靶向Sox2启动子。利用强力霉素进行dCas9诱导4天后，靶向Oct4启动子使得Oct4转录增加约100倍，并且靶向增强子引起适度激活(图5G)。对于Sox2启动子，检测到约15倍的激活(图5G)。这表明，由特定sgRNA引导，dCas9-SunTag-VP64可激活MEF中的沉默内源Oct4和Sox2基因。
通过从sgRNA盒中检测蓝色荧光蛋白质(BFP)，病毒滴定在原代MEF细胞中进行，并且可以用泊松分布(Arai等人,1999)计算感染复数(MOI)：
P(k)＝e-mmk/k！
其中m是MOI，k是病毒颗粒数，并且P(k)是k个病毒颗粒感染的细胞的分数。对于公开实验，约70％的MEF对于BFP呈阳性，并且MOI是1.20。类似地，由指定数目个sgRNA病毒颗粒感染的细胞的分数如下：
病毒颗粒数 细胞分数
0 0.3012
1 0.3614
2 0.2169
3 0.0867
4 0.0260
5 0.0062
… …
实例2.通过用dCas9-SunTag-VP64进行基因激活在MEF中建立多能性网络
接下来检查了多能性网络能否在MEF中完全再激活和建立。SunTag重编程系统以两种方式进行优化。首先，通过添加相应sgRNA靶向更多基因。选择Klf4、c-Myc(Takahashi和Yamanaka,2006)、Nr5a2(Heng等人,2010)、Glis1(Maekawa等人,2011)和Cebpa(DiStefano等人,2014)。对于每个启动子，4-10个sgRNA在分化的ES细胞中设计和测试(图5E)。每个启动子的1-3个sgRNA包括于先前Oct4/Sox2sgRNA池中(参见表1)。其次，将由Parnate、Chir99021、A83-01和毛喉素PCAF)组成的小分子混合液添加到重编程培养基中。这种化学混合液在第4天将Oct4和Sox2转录进一步增加3-4倍(图5H)。
表1.本公开中所用的sgRNA序列*
Figure BDA0002551876110000231
Figure BDA0002551876110000241
Figure BDA0002551876110000251
*18-sgRNA池中的sgRNA是粗体
为了监测多能性网络的再激活，使用源自E13.5的OG2小鼠(B6；CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J，杰克逊实验室(Jackson Laboratory))的MEF细胞。OG2MEF具有稳定的Oct4-EGFP报告子，并且在内源Oct4主动转录时表现出强烈的EGFP信号(Szabo等人,2002)。转导前24小时，将MEF细胞以10,000个细胞/平方厘米的密度接种到明胶涂布的盘上。转导dCas9-SunTag-VP64和sgRNA池(总计18个sgRNA，参见表1)之后，使细胞在MEF培养基中恢复24小时。为了开始重编程，将MEF培养基更换为补充有1μg/ml强力霉素的重编程培养基(补充有10μM Parnate、3μM Chir99021、1μM A83-01和10μM毛喉素的ES培养基)。这被表示为第0天(图1B)。在第3天，细胞在37℃下用1mg/ml胶原蛋白酶B(罗奇(Roche))处理20分钟，并且然后用0.05％胰蛋白酶处理5分钟，重新接种到新的孔上(30,000个细胞/平方厘米)，并且进一步培养直到重编程结束。从第4天开始，Oct4和Sox2的转录变得越来越稳固(图1D)。在第7天之前，出现了重编程簇，并且在2周后，EGFP阳性菌落可见(图1C)。这些菌落也对Nanog、Sox2和SSEA-1呈阳性(图1F)。在整个过程期间，前12天每隔一天更新一次培养基。之后，每天使用正常的ES培养基并且进行更换，并且EGFP阳性菌落通常准备好在第16天与第18天之间进行iPSC衍生。
然后，EGFP阳性菌落在饲养细胞上扩展以生成CRISPR iPSC系。对于iPSC衍生，重编程培养物在37℃下与1mg/ml胶原蛋白酶B(罗奇)一起培育20分钟。单一菌落在显微镜下挑取，且在0.05％胰蛋白酶中消化5-10分钟以用于单细胞悬浮液。然后将细胞接种在普通ES培养基中的饲养层上，并且将这些细胞视为P0iPSC。CRISPR iPSC形成具有强EGFP信号的典型小鼠ES样圆顶形菌落(图1E)。高度表达一组多能性基因，包括Oct4、Sox2、Nanog、Esrrb、Nr5a2和Utf1(图1G)。这些细胞可以传代20次以上，没有任何损失EGFP信号或ES形态的迹象(图1E)。这些资料证实多能性已在这些CRISPR iPSC中建立。
将所有iPSC系维持在具有5％ES-FBS(英杰公司(Invitrogen))和15％KO-血清替代物(英杰公司)、1％GlutaMAXTM(英杰公司)、1％非必需氨基酸(英杰公司)、55μM 2-巯基乙醇(西格玛(Sigma))、10ng/ml白血病抑制因子(干细胞试剂公司(Stemgent))、3μMCHIR99021和1μM PD0325901的KO-DMEM(英杰公司)中的饲养层上。
实例3.单基因座靶向Sox2基因以建立CRISPR iPSC
为鉴别CRISPR iPSC生成所需的必需基因座，将靶向每个单独基因座的sgRNA逐一从池中去除。在这个18-sgRNA池中，靶向Oct4、Sox2或Glis1启动子或Oct4增强子的sgRNA的去除导致EGFP阳性菌落数量急剧减少(图6A)，表明这些基因座在多能性诱导中的潜在作用。
接下来，确定一起靶向Oct4、Sox2和Glis1启动子是否足以生成iPSC。由于与靶向相同基因的两个或三个sgRNA的组合相比，靶向每个基因的单一sgRNA可以实现60％到甚至180％的基因激活(图6B)，因此选择一个sgRNA以靶向每个基因的启动子：Oct4的O-127、Sox2的S-84和Glis1的G-215。这种方法简化了重编程系统，并且可能降低脱靶效应。OSG(O-127、S-84和G-215)的组合可以正确激活这三个基因(图6C)。2周后，观察到EGFP阳性菌落，并且可以建立iPSC系(图6D和图6E)。
在OSG重编程期间，令人惊讶地注意到，在仅使用S-84时，出现了EGFP阳性菌落(图6F)，这表明仅靶向Sox2启动子可能足以进行多能性诱导。为了排除S-84脱靶效应的可能性，检查了S-84的前10个预测标靶。sgRNA的脱靶通过CCTop-CRISPR/Cas9靶在线预测器进行预测(Stemmer等人,2015)。对于每次预测，将核心序列设置为12bp。核心序列的最大错配为2bp，并且所有错配的最大错配为4bp。对于S-84，仅Sox2基因被显著激活(图6G)。在第4天也检测到Sox2蛋白(图2B)。另外，用另外两个靶向Sox2的sgRNA(S-136和S-148)重复重编程过程(图2A)。这两个sgRNA分别激活内源Sox2转录(图2C)，并且获得EGFP阳性菌落(图2D)。
然后检查了这些iPSC中多能性的真实性。在这些EGFP阳性菌落中，还检测到Nanog和SSEA-1蛋白，并且建立了CRISPR iPSC系(图2E和2F)。对于S-17系，关键多能因子的表达与R1小鼠ES(R1 ES)细胞中的表达类似(图2G)。在细胞系遗传学中进行iPSC系的核型分析，并且分析吉姆萨结合(Giemsa binding)。所生成的iPSC也是核型正常的(图2H)。
进行了更严格的多能性分析，其中将S-17细胞注射到B6白化(B6(Cg)-Tyrc-2J/J，杰克逊实验室)背景的囊胚中。在71.4％(5/7)E13.5胚胎的性腺区域中发现了EGFP阳性细胞(图2I)。以46.2％的比例(6/13)生成活产的嵌合体(图2J)。更重要的是，使用B6白化雌性小鼠(6周)与嵌合小鼠(4-8周)交配以进行生殖系传递测试，并且S-17细胞也呈生殖系感受态(图2K)。这些数据得出结论，由单一sgRNA对Sox2启动子的单基因座靶向足以将MEF重编程为真正的多能干细胞。
将R1 ES细胞维持在具有5％ES-FBS(英杰公司)和15％KO-血清替代物(英杰公司)、1％GlutaMAXTM(英杰公司)、1％非必需氨基酸(英杰公司)、55μM 2-巯基乙醇(西格玛(Sigma))、10ng/ml白血病抑制因子(干细胞试剂公司(Stemgent))、3μM CHIR99021和1μMPD0325901的KO-DMEM(英杰公司)中的饲养层上。对于显微注射，将维持在无饲养层的N2B27条件(50％DMEM/F12、50％神经基质培养基、0.5％N2培养基、1％B27培养基、0.1mM 2-巯基乙醇、10ng/ml白血病抑制因子、25μg/ml BSA、3μM CHIR99021和1μM PD0325901)下。在注射当天，将细胞悬浮在囊胚注射培养基(25mM HEPES缓冲的DMEM加10％FBS，pH 7.4)中。
对于嵌合小鼠生成和生殖系传递测试，将超排卵的4周龄雌性B6(Cg)-Tyrc-2J/J(B6白化)小鼠(杰克逊实验室)与B6(Cg)-Tyrc-2J/J雄性交配以用于囊胚制备。将桑椹胚(交配后2.5天)收集，并且在5％CO2中在37℃下于KSOM培养基(密理博公司)中培养过夜。第二天早上，囊胚准备好用于iPSC注射，并且每个囊胚注射约10-20个细胞。所注射的囊胚在5％CO2中在37℃下于KSOM培养基中培养1-2小时，并且然后植入交配后2.5天的假孕CD1雌性小鼠(查尔斯河(Charles River)，Stock#022)的子宫中。嵌合小鼠可通过嵌合体皮毛颜色鉴别。雄性嵌合小鼠与雌性B6(Cg)-Tyrc-2J/J小鼠进一步交配，并且黑色皮毛的幼鼠被视为成功的生殖系传递。为了促成性腺，在植入后10天(E13.5)恢复所注射的胚胎。收集每个胚胎的性腺区域，并且在显微镜下目测EGFP信号。由旧金山市的加利福尼亚大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准所有动物程序。
实例4.S-17 MEF可重编程，效率更高并且变化更少
慢病毒转导的重编程效率在OG2和129小鼠(129S2/SvPasCrl，查尔斯河)衍生的MEF中相对较低并且可变(0-0.013％)(图2C、图6A、图6F、图7A-7C)。这可能是因为SunTag组分的递送效率低以及递送到细胞中的组分的随机拷贝数。这通过已建立的iPSC系的基因组中的sgRNA盒的不同拷贝数反映出来，其中在12个系中每个细胞发现一个到五个拷贝(图7D)。为了定量基因组中的sgRNA盒，设计定量RT-PCR(qPCR)引物以扩增基因组中的Sox2基因和sgRNA盒(参见表2)。Sox2的扩增用于对每个细胞系的基因组进行标准化。含有标靶的质粒用于标准曲线生成。通过针对一系列质粒稀释液(10pg、1pg、0.1pg和0.01pg)的质粒拷贝数绘制Ct值来生成标准曲线，并且根据标准曲线计算约30ng的基因组DNA中Sox2基因和sgRNA盒的拷贝数。然后通过对Sox2基因进行标准化来计算sgRNA拷贝数(2个拷贝/细胞)。
表2.qPCR的引物序列(与所有图有关)
Figure BDA0002551876110000291
Figure BDA0002551876110000301
Figure BDA0002551876110000311
为了降低可变性并且提高效率，使用来源于单个菌落的CRISPR iPSC系生成二级MEF。S-17 iPSC用蓝色荧光蛋白(BFP)标记，并且注射到B6囊胚中，不去二级MEF来源于E13.5胚胎(图3A)。大约一半的MEF(52.4％)源自流式细胞术揭示的S-17 iPSC(图7E)，在此期间，以胰蛋白酶处理细胞以形成FACS缓冲液中的单细胞悬浮液(DPBS中2％FBS)，并且悬浮液在由MACSQuant VYB流式细胞仪检查之前过滤通过40μm的细胞过滤器。利用FlowJov10分析数据。这些衍生的二级MEF被称为S-17 MEF。在强力霉素诱导下，通过qPCR和免疫荧光染色都可轻松检测到内源Sox2，而在没有强力霉素的情况下未检测到Sox2(图3B和图3D)。没有脱靶基因显著升高(图7G)。这些数据证实，SunTag系统适当地用以激活S-17 MEF中的Sox2。
接下来检查S-17 MEF是否可重编程。Sox2转录在第4天显著上调，并且在第8天之前迅速增加到与R1 ES细胞相当的水平(图3B)。Sox2上调后，其它核心多能因子Oct4、Nanog和Rex1也被激活。其转录在第8天检测到，并且然后显著升高(图3G)。同时，从第4天开始观察到形态变化，并且在第7天可见EGFP阳性菌落(图3E)。还可以建立iPSC系(图3E)。在S-17MEF的情况下，比起慢病毒方法，重编程效率(0.1％)提高了40倍(图3F)。如所预期，观察到低得多的可变性(图7H)。
对于qPCR(参见表2)，总RNA在指定的时间使用带有QiaShredder(Qiagen)的RNeasy Plus mini试剂盒从样品中提取，并且用无DNA试剂盒(Ambion)处理以去除基因组DNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(拜耳雷德(Bio-Rad))对RNA进行反转录。使用iQTMSYBR Green Supermix(拜耳雷德)在7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))上进行定量PCR。所有反应都重复进行四次。所有数据都使用Prism 7进行统计分析。对于免疫荧光染色，将细胞用DPBS洗涤三次，并且在4℃下用4％PFA固定30分钟。使用驴血清(10％于DPBS中)在4℃下封闭1小时。将抗体在含1％BSA的DPBS中稀释。使用以下一级抗体以进行染色：抗Sox2(1:1000，密理博公司，AB5603)、抗Oct4(1:1000，Santa Cruz，sc-5279)、抗Nanog(1:500，Abcam，80892)和抗SSEA-1(1:200，干细胞试剂公司，09-0095)。
还测试更多分化的尾尖成纤维细胞(TTF)是否可重编程。S-17 TTF来源于14个月大的成年嵌合小鼠。将尾巴去皮，切成1mm的小块，并且在6cm的培养皿中培养。每3天更换一半培养基，直到成纤维细胞从移植片中迁移出来。将衍生的TTF维持在补充有10％FBS和非必需氨基酸的DMEM中，并且然后传代并且准备好使用(P1)。在强力霉素的存在下，TTF经历了形态变化，并且在两周内获得了EGFP阳性菌落(图7L)。这些观察结果表明，S-17 MEF和TTF都是可重编程的。
为了用S-17 MEF或小鼠TTF进行重编程，将MEF或TTF以5,000个细胞/平方厘米的密度接种到涂有明胶的培养盘上。24小时后，将培养基切换为含1μg/ml强力霉素的重编程培养基。这标示为第0天。每隔一天更换一次培养基，直到第14天。将EGFP阳性菌落计数以进行重编程效率计算或用于iPSC系衍生。
实例5.Sox2启动子的重塑触发了S-17 MEF中朝向多能性的重编程
在无强力霉素的情况下，无法检测到Sox2的激活，并且也没有获得菌落(图3B和图3J)。当从培养基中去除PCAF混合液时，尽管效率较低，但仍生成EGFP阳性菌落(图7I)。这一观察结果得出结论，内源Sox2激活是S-17 MEF重编程的触发因素。
接下来检查重编程是否与Sox2水平剂量相关。用一系列强力霉素浓度(例如0、0.01、0.1和1μg/ml)激活Sox2。Sox2水平展示与强力霉素浓度正相关，并且重编程效率明显取决于Sox2水平(图3J)。
由于VP64通过募集多种表观遗传修饰剂来促进基因转录和染色质重塑(Hirai等人,2010)，因此检查了SunTag系统是否以及如何能够表观遗传重塑Sox2启动子。使用针对Sox2启动子的H3K27乙酰化(H3K27ac)抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP)。按照配备有具有修饰的试剂盒的方案，使用EZ-ChIP染色质免疫沉淀试剂盒(密理博公司，17-371)进行所有ChIP实验。简单来说，使约2×106个细胞与0.275ml的37％甲醛交联进入10ml的生长培养基中。加入1ml 1.25M甘氨酸(10×)以淬灭未反应的甲醛。每个样品使用0.12ml SDS裂解缓冲液。然后在优化条件下，在Covaris S2 Sonicator上将基因组DNA剪切为100-500bp的长度。每个样品使用1.5μg H3K27乙酰化抗体(Abcam，ab4729)和15μL磁性蛋白A/G珠粒(密理博公司16-663)。最后，用50μl洗脱缓冲液C洗脱DNA片段，将其用于下游qPCR。
早在第4天，H3K27ac水平就已经升高了两倍，并且其在第8天和第12天进一步提高(图3C)。这表明靶向Sox2的SunTag系统在Sox2启动子处引起逐渐和持续的表观遗传重塑。还测试了Oct4、Nanog和Rex1的启动子的表观遗传重塑，并且其H3K27ac水平以4天的潜伏时间显著增加，与基因转录类似(图3G和图3H)。有趣的是，Oct4的增强子展示H3K27ac水平的同时升高(图3I)。这些数据表明，Sox2的激活促进其它关键基因的后续诱导以用于多能性建立。
然后测试了在S-17 MEF中对Oct4启动子的额外靶向是否会促进重编程效率。O-127的转导导致Oct4转录显著增加，并且重编程效率也增加(图3K)。这种协同作用支持了Oct4和Sox2在多能性诱导中协同合作的概念。
还比较了S-17 MEF重编程和使用过表达因子的传统重编程。与S-17 MEF不同，过表达的因子在第4天未能表观遗传重塑Sox2启动子(图7J)，并且在第4天和第12天未能有效检测到内源基因座的Sox2转录(图3L)。3周后，Oct4或Sox2的过表达未能生成任何菌落，并且Oct4、Sox2和Klf4(OSK)的过表达生成的EGFP阳性菌落比S-17 MEF稍多，实验之间的变化更多(图3M和图7K)。
实例6.Oct4启动子和增强子的同时重塑将MEF重编程为iPSC
Oct4的启动子和增强子的重塑对于多能性诱导很重要，并且仅靶向启动子不足以生成EGFP阳性菌落(图6A和图2C)。考虑到关键多能性因子以及p300和介体复合物在小鼠ES细胞中的Oct4远端增强子处富集(图4A)，假设多能性诱导将需要同时重塑Oct4启动子和增强子。
为了测试所述假设，使用了转录两个靶向不同位点的sgRNA的双sgRNA盒(图8A)。O-127-2066盒以单细胞水平靶向Oct4启动子(O-127)和增强子(O-2066)。为了生成双sgRNA构建体，使用具有单sgRNA构建体作为模板的引物mU6-T2H-F(SEQ ID NO:167ctaggatccattaggcGGGTACAGTGCAGGGGAA)和mU6-T2H-R2(SEQ ID NO:168atacggttatccacgcGGCCGCCTAATGGATCCT)扩增含有第二sgRNA的片段。将这一片段纯化，并且用于与含有由NotI消化的第一个sgRNA的另一个构建体进行重组反应。第二个mU6-sgRNA盒在相同转录方向上位于第一个的下游。
O-127-2066引起具有升高水平的H3K27ac的Oct4启动子和增强子同时重塑(图4B)。O-127-2066的基因转录水平在第4天和第8天与O-127类似(图4C)。但是，在第8天后，Oct4转录在O-127-2066培养物中进一步升高。特别地，当细胞在第7天和第11天重新接种以允许细胞扩增时，群体中的总体Oct4表达急剧增加(图4C)。对于O-127和O-2066培养物，第8天后弱的Oct4表达在很大程度上保持不变(图4C)。因此，在第12天之前，在O-127-2066培养物中观察到EGFP阳性菌落，并且这些菌落也表达了Nanog、Sox2和SSEA-1，表明所获得的核心多能性网络(图4E和图4F)。iPSC系可以来源于这些菌落(图4E)。同时，在O-127或O-2066培养物中未发现菌落(图4D)。
检查了潜在脱靶的激活。检查了sgRNA O-127和O-2066的前10个预测标靶，并且未检测到脱靶基因的显著激活(图8C)。还平行测试了另外两个双sgRNA盒O-127-1965和O-127-2135，并且观察到类似的结果(图4D)。这些数据有力地支持通过内源Oct4启动子和增强子的同时重塑诱导多能性。
还获得了真正的多能干细胞系。D-9系展示多能性基因的表达与R1 ES细胞和正常核型类似(图4G和图4H)。在将D-9细胞注射到B6白化囊胚中之后，在后代幼鼠中以60％的比例生成活产的嵌合小鼠(6/10)(图4J)。这一系显著促成75％E13.5胚胎的性腺区域(6/8)(图4I)，并且在50％的雄性幼鼠中(2/4)确认生殖系传递(图4K)。
实例7.Oct4启动子和增强子的组蛋白乙酰化的表观遗传重塑将MEF重编程为iPS 细胞
VP64的染色质重塑是因为其在募集转录机制中的主要功能。为了更严格地确定表观遗传重塑是否足以引发重编程，通过特定操纵增加了Oct4启动子和增强子的组蛋白乙酰化。因为组蛋白H3K27乙酰化同步地标记Oct4启动子和增强子区域，所以操纵组蛋白乙酰化(图4A)。p300core仅具有p300的乙酰基转移酶活性结构域，并且证明用以增强标靶的组蛋白乙酰化(Hilton等人,2015)。因此，将VP64替换为p300core以生成dCas9-SunTag-p300core系统(图8E)。
为了克隆p300core，骨架通过用SbfI-HF和RsrII(NEB)消化从pSLQ1711-pPGK-ScFV(GCN4)-sfGFP-VP64衍生出，并且使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)检索。将具有连接子的83-bp SV40核定位位点(NLS)克隆，并且利用正向引物(SEQ ID NO:169TACAAAGGTGGAGGTCGGACCGaaggcagcggctcccccaag)和反向引物(SEQ ID NO:170AAATCGTCTAAAGCATCcgaccctccgccggaaccgccca)添加在sfGFP与p300core之间。p300core使用
Figure BDA0002551876110000361
高保真度DNA聚合酶(NEB)与正向引物(SEQ ID NO:171AGTGGGCGGTTCCGGCGGAGGGTCGattttcaaaccagaagaactacgac)和反向引物(SEQ ID NO:172TATCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTAgtcctggctctgcgtgtgcagctc)从模板pcDNA-dCas9-p300核心(Addgene 61357)开始进行PCR扩增。然后，使用吉布森组装克隆试剂盒(NEB)组装含有83-bp SV4NLS和连接子的骨架和p300core。
利用dCas9-SunTag-p300core系统进行重编程实验。p300core培养物在Oct4启动子和增强子处呈现出与VP64对应物类似的H3K27ac水平，但在第5天在p300core培养物中只检测到1/30的Oct4转录(图8F和图8G)。这可以通过p300core无法募集转录机制来解释。然后在第9天和第14天传代培养物。有趣的是，在第10天之前，Oct4水平在VP64和p300core培养物中相当(图8G)。因此，在p300core培养物中产生EGFP阳性菌落，并且生成iPSC系(图8H和图8I)。这些观察结果表明，用p300core操纵组蛋白乙酰化会使得染色质重塑类似于VP64，尽管转录激活中存在明显的潜伏时间。总之，这些结果表明，通过VP64或p300core对Oct4启动子和增强子进行表观遗传重塑足以触发朝向多能性的重编程。
在异位蛋白的大量结合的情况下，很难鉴别出触发朝向多能性的重编程的内源染色质上的重塑事件。为了对此有所了解，使用CRISPRa系统dCas9-SugTag-VP64或dCas9-SunTag-p300core来精确重塑内源染色质的特定位点。首次发现，单基因Oct4或Sox2的靶向重塑足以引发朝向多能性的重编程，并且建立了真正的多能干细胞系。CRISPR iPSC衍生的S-17 MEF和TTF也是可重编程的，表明内源Sox2的激活是多能性诱导的关键事件。Oct4的启动子和增强子的同时重塑也足以诱导多能性。最后，通过增加组蛋白乙酰化对Oct4启动子和增强子进行表观遗传操纵足以触发iPSC诱导。
在本研究中，iPSC通过靶向单基因Oct4或Sox2利用CRISPRa系统生成。先前已经使用CRISPRa系统检查了内源多能基因的激活，但尚未建立iPSC。先前的研究表明，Oct4启动子仅短暂激活。可以预期，至少部分地因为未能靶向增强子而未能生成iPSC。在本公开中，重新设计sgRNA，并且基于多个参数选择sgRNA靶位点(图5A-5C)。所使用的SunTag系统在基因激活和染色质重塑方面可能非常有效，因为可以将多达24个VP64拷贝募集到靶向位点。结果，观察到Oct4激活增加了100倍，这比以前的工作要高得多(Hu等人,2014)。另外，小分子进一步提高了重编程效率(图7H)。最近，两项研究报道了通过使用VP64dCas9VP64系统激活内源MyoD或BAM(Brn2、Ascl1和Myt1L)来生成肌肉和神经元细胞(Black等人,2016；Chakraborty等人,2014)。本公开首次使用CRISPRa方法建立多能干细胞。
本公开在机械上指定内源Oct4或Sox2的直接重塑足以触发朝向多能性的重编程。这不仅为iPSC生成提供了替代方式，而且还提供了对多能性诱导分子机制的见解。Sox2研究证明，内源Sox2的激活是多能性诱导的关键事件。很显然，S-17 MEF重编程需要Sox2激活，Sox2的重塑在其它关键多能基因激活之前，并且重编程效率视Sox2水平而定(图3B、图3C、图3G-3I和图3J)。同时，尽管20％的S-17群体激活内源Sox2，但仅0.1％可重编程为EGFP阳性菌落(图3F和图7F)，这表明内源Sox2的唯一激活在CRISPRa情况下不是多能细胞命运的决定因素。进一步激活Oct4启动子提高了生成EGFP阳性菌落的效率(图3K)，支持在多能性诱导中多个多能基因重编程的协同作用。在Oct4研究中，值得注意的是，多能性诱导需要增强子区的重塑。从启动子重塑观察到稳固的转录激活，并且从增强子重塑观察到适度的基因激活。然而，增强子的重塑对于在后期进一步诱导Oct4似乎是必不可少的(图4C)。这表明Oct4启动子充当快速触发子，而增强子是潜在但更高的Oct4转录所需的调节子。如在初始小鼠ES细胞中所见，增强子重塑是否促进启动子-增强子回路的建立还需要进一步研究(Kagey等人,2010)。另一个有趣的一点是，这种增强子是在多能干细胞中发现的231种超级增强子之一(Whyte等人,2013)。本公开为多能诱导中的超级增强子提供了功能证据。
用dCas9-SunTag-p300core生成iPSC揭示了组蛋白乙酰化在iPSC生成中起着至关重要的作用。细胞重编程涉及动态表观遗传变化，但是先前不知道是否可以通过对定义的基因组位点进行表观遗传操纵来实现重编程。在多能干细胞中，组蛋白H3K27乙酰化在Oct4的启动子和增强子处都高度富集，这为通过仅操纵一种类型的表观遗传修饰来解决这一问题提供了入口。在本公开中，通过同时靶向启动子和增强子的dCas9-SunTag-p300core生成iPSC。这也为通过表观遗传修饰的位点特异性操纵改变细胞命运提供一种方式。除p300外，其它几种表观遗传因子(即Tet1、Dnmt3a、KRAB和LSD1)也已被证实在激活或沉默基因的表观基因组编辑中起作用(Kearns等人,2015；Liu等人,2016；Thakore等人,2015)。将来，这些扩展的CRISPR工具通过靶向不同类型的DNA和组蛋白修饰提供了更多操纵细胞命运的可能性。
总之，这些数据表明，使用CRISPRa系统(本文中为SunTag系统)，内源Oct4或Sox2基因座的精确重塑足以引发朝向多能性的重编程。这些研究不仅证实了用CRISPR激活生成iPSC，而且阐明了对细胞重编程的机械理解。可以预期，重编程策略也将在其它细胞类型的生成中和在其它模型系统(例如人类细胞)中起作用，这在以下实例中得到进一步证实。
实例8.用CRISPR激活生成人类iPSC
成纤维细胞培养和维持 与新生儿包皮(FTc1007；DFMF030811)分离的人类真皮成纤维细胞在人类成纤维细胞(hFib)生长培养基(具有的10％胎牛血清(FBS)、具有1％Glutagro、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％青霉素/链霉素(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁(Corning,Manassas,VA))的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM))中的0.1％猪明胶(密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))上培养。使用Accutase解离试剂(加利福尼亚州圣地亚哥创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies,Inc.,San Diego,CA))进行成纤维细胞的常规酶促传代。在37℃下将细胞维持在5％CO2和5％O2中。
质粒构建 用于人类sgRNA表达的慢病毒质粒使用含有人类U6启动子的合成
Figure BDA0002551876110000391
(衣阿华州科勒尔维尔集成DNA技术(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA))、特定gRNA和用于
Figure BDA0002551876110000392
(马萨诸塞州伊普威治新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs Inc.,Ipswich,MA))的适当的同源序列构建，并且组装到先前实例中所用的dCas9-Suntag-VP64质粒中。表3中列出特定gRNA序列。
表3.用于人类基因组靶向的gRNA序列
基因标靶 人类gRNA序列 SEQ ID
Oct4启动子 GGGGGAGAAACTGAGGCGA 57
Oct4启动子 TCTGTGGGGGACCTGCACTG 58
Sox2启动子 GTGGCTGGCAGGCTGGCTCT 59
Klf4启动子 GCTGCCATAGCAACGATGGA 60
c-Myc启动子 GGTTCCCAAAGCAGAGGGCG 61
Lin28启动子 GTGTCAGAGACCGGAGTTGT 62
Nanog启动子 GATTAACTGAGAATTCACAA 63
EEA-基序 CCCAGCACTTTGGG 64
慢病毒包装 在用慢病毒包装质粒转染之前24小时接种HEK293T细胞(ATCC CRL-3216)以在转染时达到70％-80％的融合度。使用Lipofectamine 3000转染试剂(纽约格兰德岛生命技术(Life Technologies,Grand Island,NY))进行转染。在16小时更换培养基。在转染后第2天和第3天收集含有病毒的上清液。然后将上清液通过0.45μM的过滤器，并且在4℃下以20,000×g离心1.5小时。将浓缩病毒重新悬浮于DMEM(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)中，并且将等分试样储存在-80℃下。所有病毒都独立包装，并且在两轮单独感染中使用时组合。包装所有构建体以与dCas9-Suntag-VP64系统一起使用。
病毒滴定 使用在前一天接种的293T细胞中的一系列稀释液进行病毒滴定。细胞在以下生长培养基中被感染：具有10％FBS(纽约格兰德岛生命技术)的DMEM(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)，其补充有5μg/mL凝聚胺(马萨诸塞州伯林顿密理博公司)和10mM HEPES(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)。将细胞以600xg离心90分钟，并且然后再培育4-6小时，此时将转导培养基替换为新鲜的生长培养基。通过检测由sgRNA盒表达的蓝色荧光蛋白(BFP)来测量滴定度。使用下式选择呈现BFP表达的阳性信号在1％与20％之间的样品进行滴度计算：
Figure BDA0002551876110000401
使用一种包括例示性dCas9-Suntag-VP64系统和sgRNA的CRISPR激活方法对人类成纤维细胞进行重编程，并且将这些sgRNA设计为靶向与多能性基因转录和胚胎基因组激活相关的调节DNA元件。如先前实例中所述，Suntag系统的所有慢病毒组分都单独包装，并且通过两轮单独的感染引入，第一轮将dCas9、VP64和Tre3G组合在一起，并且第二轮将sgRNA组合在一起。使用各种浓度的病毒进行比较。在第二轮之前，为了富集第一轮感染的细胞群，将转导的细胞用1μg/mL强力霉素处理24小时，并且批量分选以表达GFP-VP64和dCas9-10XGCN4-P2A-mCherry。对于每一轮感染，以5,000或10,000个细胞/平方厘米的密度接种细胞。在含有以下的培养基中接种之后24小时进行转导：具有20％基因敲除血清替代物(Knockout Serum Replacement；KOSR)(纽约格兰德岛生命技术)、1％Glutagro、1％NEAA、1％青霉素/链霉素、10ng/mL碱性人类成纤维细胞生长因子(bFGF)(纽约格兰德岛生命技术)和100μMβ-巯基乙醇(纽约格兰德岛生命技术)的DMEM/F-12(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)，补充有4μg/mL凝聚胺(马萨诸塞州伯林顿密理博公司)和10mM HEPES(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)。感染后，将细胞以600xg离心90分钟，并且然后再培育4-6小时，此时将感染培养基替换为含有1μg/mL强力霉素的hFib培养基，开始诱导(第1天)。在第5天，使用Accutase(加利福尼亚州圣地亚哥创新细胞技术公司)将细胞以7,500个细胞/平方厘米的密度传代到0.1％猪明胶(密苏里州圣路易斯西格玛-奥德里奇公司)涂布的6孔盘上，中断强力霉素处理，并且将培养基更换为包含TGFβ受体抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的培养基。在第13天和第21天，使用Accutase(加利福尼亚州圣地亚哥创新细胞技术公司)再次将细胞以7,500个细胞/平方厘米的密度传代到Matrigel(弗吉尼亚州马纳萨斯康宁)涂布的6孔盘上，并且将培养基更换为包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂但不包含TGFβ受体抑制剂的另一培养基。例示性TGFβ受体抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂是本领域已知的(参见例如WO2015134652)。特定实例包括用于TGFβ受体抑制剂的SB431542and A-83-01；用于MEK抑制剂的PD0325901和PD98059；用于GSK3抑制剂的CHIR99021和BIO；和用于ROCK抑制剂的噻唑维(thiazovivin)和Y27632。
早在第8天并且随着时间的推移，观测到假定的iPSC展现高的核与细胞质比和ESC样菌落形态(图9)。如图9中所示，与在无EEA的情况下获得的CRISPRa-hiPSC克隆相比，在CRISPR激活系统中包括EEA sgRNA似乎生成具有更稳固形态特征的hiPSC克隆。在用或不用EEA的情况下生成的CRISPRa-hiPSC中的形态观察与在两种条件下所见的多能性基因表达水平一致(见图10A和B)。基于多能性标记物的表达和多谱系分化潜能，进一步表征由CRISPRa系统生成的iPSC菌落。在第10天和第21天收集样品进行RNA分析，并且在第21天进行流式细胞术。在第19天固定细胞进行免疫荧光染色，并且在第21天进行碱性磷酸酶染色。每天或隔天进行培养基更换。将细胞在37℃下在5％CO2和5％O2中培养。使用EVOS FL核心成像系统(沃尔瑟姆马萨诸塞州赛默飞世尔(Thermofisher,Waltham,MA))进行相衬成像。图10展示在CRISPRA-hiPSC菌落中建立了例如TRA-1-81、NANOG、SSEA-4和OCT4的内源多能性基因的表达。
使用RNeasy Plus Mini试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚凯杰)分离总RNA。定量PCR反应使用TaqMan RNA-to-CT 1步式试剂盒(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司((Applied Biosystems,Foster City,CA))在96孔盘的每孔20μL的反应物体积中进行，并且在StepOnePlus qPCR系统和QuantStudio 3qPCR系统(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)上加以分析。反应重复进行两次。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内部参考基因对结果进行标准化。使用2^ΔΔCt法定量相对基因表达，并且数据使用StepOne软件v2.3和QuantStudio设计和分析软件v1.4.1(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)以及GraphPad Prism 7(加利福尼亚州拉荷亚格拉夫帕德软件公司(GraphPad SoftwareInc.,La Jolla,CA))进行统计学分析。Nanog、Oct4、Lin28、Sox2、Rex1和Gapdh的引物和探针用于内源基因表达评估。图11展示，内源多能性编程通过不仅激活所靶向内源基因(例如Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)而且激活未靶向的内源基因(例如Rex1)随时间在重编程群体中激活。图12中的TRA-1-81表达的流式细胞术分析也证实，已建立的hiPSC的多能状态在各种MOI条件下通过CRISPRa获得。
应理解，尽管本发明已经结合以上实施例进行描述，但是前述描述和实例意欲说明而非限制本发明的范围。对于本发明涉及的本领域的普通技术人员来说，本发明范围内的其它方面、优点以及修改将为清楚的。
另外，在根据马库什组描述本发明的特点或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或子组成员描述本发明。
本文中提及的所有公开案、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式明确并入，其程度如同每个文献是以引用的方式个别地并入一般。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
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序列表
<110> 菲特治疗公司
<120> 通过CRISPR激活生成诱导性多能细胞
<130> 13601-222-228
<140> TBA
<141> 2018-12-27
<150> US 62/611,202
<151> 2017-12-28
<160> 175
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-321
<400> 1
cagcccactc agccatcctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-248
<400> 2
atccgagcaa ctggtttgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-226
<400> 3
gtgtccggtg acccaaggca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-157
<400> 4
ggacaggaca acccttagga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-127
<400> 5
aacctccgtc tggaagacac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4启动子的sgRNA O-71
<400> 6
gggtggagga gcagagctgt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4增强子的sgRNA O-2135
<400> 7
agacaggact gctgggctgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4增强子的sgRNA O-2066
<400> 8
gccctgggag gaactgggtg 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4增强子的sgRNA O-2014
<400> 9
cccagggagg ttgagagttc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4增强子的sgRNA O-1965
<400> 10
gcatgatagc tctgccctgg 20
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Oct4增强子的sgRNA O-1914
<400> 11
taaggaaggg ctaggacgag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-430
<400> 12
caactagtat ttcaggaagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-398
<400> 13
gcaaggccca tgggtggttc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-348
<400> 14
cttggataca taagggtgga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-326
<400> 15
agagccaata ttccgtagca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-276
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tttacccact tccttcgaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-262
<400> 17
cacggcgcac gcctgttcga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-192
<400> 18
gcgggcccgc agccggccgc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-148
<400> 19
gcgctctgct gggctcggct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-136
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<220>
<223> 靶向Sox2启动子的sgRNA S-84
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<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-475
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<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-380
<400> 23
tgggctcgaa agtcctgcca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-309
<400> 24
ccacgccgta ctcccagcgc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-293
<400> 25
ggcgacggcg gctccggcgc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-271
<400> 26
caccgccgcc ggcgtcagca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-249
<400> 27
gctccagccc gccagctgcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-232
<400> 28
gcctggctgg cgtcacggcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-171
<400> 29
taaacaaact ccgcgcacgt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-147
<400> 30
gctaccatgg caacgcgcag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的sgRNA K-67
<400> 31
cgcgcgccgc cacagggagg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-444
<400> 32
gacgaacgaa tgagttatct 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-395
<400> 33
ccaggcgtct ctctaaggct 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-347
<400> 34
acacaatacg ccatgtaccc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-305
<400> 35
tgcggtgact gatatacgca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-249
<400> 36
acaaccgtac agaaagggaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-242
<400> 37
tagtcctttc cctttctgta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-175
<400> 38
cgctattact gtttacaccc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-154
<400> 39
cagcccagta ctccggctcc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-124
<400> 40
ggctcctcct cctctttccc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向cMyc启动子的sgRNA M-82
<400> 41
cgagttccca aagcagaggg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Nr5a2启动子的sgRNA Nr-404
<400> 42
ccgccctctc acggaagcgg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Nr5a2启动子的sgRNA Nr-157
<400> 43
gggcgtggag cccaggaagg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Nr5a2启动子的sgRNA Nr-61
<400> 44
gatggaatgt tcaagtggga 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Nr5a2启动子的sgRNA Nr-60
<400> 45
tcccacttga acattccatc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Glis1启动子的sgRNA G-419
<400> 46
gggaggagca gaatcccgcc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Glis1启动子的sgRNA G-215
<400> 47
gggctgccgg accaagccaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Glis1启动子的sgRNA G-179
<400> 48
gagcggctgt gggcagcagc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> s靶向Glis1启动子的sgRNA G-118
<400> 49
ggccgtggcg gtggcggcgg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Glis1启动子的sgRNA G-47
<400> 50
gccgcgggcg cagcggctcg 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-345
<400> 51
gctcccgggc tccctagtgt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-282
<400> 52
cacacacgtg gtccgtggtt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-177
<400> 53
gtgctagtgg agagagatcg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-135
<400> 54
ggaaagtcac aggagaaggc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-100
<400> 55
gccagtagga tggtgcctgc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Cebpa的sgRNA C-70
<400> 56
cgagacccgt ttggacacca 20
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向OCT4启动子的人类gRNA序列
<400> 57
ggggagaaac tgaggcga 18
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向OCT4启动子的人类gRNA序列
<400> 58
tctgtggggg acctgcactg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Sox2启动子的人类gRNA序列
<400> 59
gtggctggca ggctggctct 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Klf4启动子的人类gRNA序列
<400> 60
gctgccatag caacgatgga 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向c-Myc启动子的人类gRNA序列
<400> 61
ggttcccaaa gcagagggcg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向Lin28A启动子的人类gRNA序列
<400> 62
gtgtcagaga ccggagttgt 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向NANOG启动子的人类gRNA序列
<400> 63
gattaactga gaattcacaa 20
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向EEA-基序的人类gRNA序列
<400> 64
cccagcactt tggg 14
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（总）的qPCR的正向引物
<400> 65
atcgccaatc agcttgg 17
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（总）的qPCR的反向引物
<400> 66
agaaccatac tcgaaccaca tcc 23
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（内源性）的qPCR的正向引物
<400> 67
taggtgagcc gtctttccac 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（内源性）的qPCR的反向引物
<400> 68
gcttagccag gttcgaggat 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（总）的qPCR的正向引物
<400> 69
acagatgcaa ccgatgcacc 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（总）的qPCR的反向引物
<400> 70
tggagttgta ctgcagggcg 20
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（内源性）的qPCR的正向引物
<400> 71
gagaagtttg gagcccgag 19
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（内源性）的qPCR的反向引物
<400> 72
gatctggcgg agaatagttg g 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Klf4的qPCR的正向引物
<400> 73
gcacacctgc gaactcacac 20
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因Klf4的qPCR的反向引物
<400> 74
ccgtcccagt cacagtggta a 21
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因c-Myc的qPCR的正向引物
<400> 75
ccaccagcag cgactctga 19
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因c-Myc的qPCR的反向引物
<400> 76
tgcctcttct ccacagacac c 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nr5a2的qPCR的正向引物
<400> 77
atgggaagga agggacaatc 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nr5a2的qPCR的反向引物
<400> 78
atacaaactc ccgctgatcg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Glis1的qPCR的正向引物
<400> 79
ctccaagcat ccacactgtt 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Glis1的qPCR的反向引物
<400> 80
gacaggatgc ctgaagcaag 20
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Cebpa的qPCR的正向引物
<400> 81
caagaacagc aacgagtacc g 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Cebpa的qPCR的反向引物
<400> 82
gtcactggtc aactccagca c 21
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nanog的qPCR的正向引物
<400> 83
cctccagcag atgcaagaac tc 22
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nanog的qPCR的反向引物
<400> 84
cttcaaccac tggtttttct gcc 23
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Dppa2的qPCR的正向引物
<400> 85
tcaacgagaa ccaatctgag ga 22
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Dppa2的qPCR的反向引物
<400> 86
gcgtagcgta gtctgtgttt g 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Esrrb的qPCR的正向引物
<400> 87
ctcgccaact cagattcgat 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Esrrb的qPCR的反向引物
<400> 88
agaagtgttg cacggctttg 20
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Fgf4的qPCR的正向引物
<400> 89
cgtggtgagc atcttcggag tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Fgf4的qPCR的反向引物
<400> 90
ccttcttggt ccgcccgttc tta 23
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Lin28的qPCR的正向引物
<400> 91
tgttctgtat tgggagtgag c 21
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Lin28的qPCR的反向引物
<400> 92
gcttgcattc cttggcatg 19
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tet1的qPCR的正向引物
<400> 93
tctcactcat gttgcgggac cc 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tet1的qPCR的反向引物
<400> 94
cgtcggagtt gaaatgggcg aa 22
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Utf1的qPCR的正向引物
<400> 95
tgtcccggtg actacgtct 19
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Utf1的qPCR的反向引物
<400> 96
cccagaagta gctccgtctc t 21
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Actin的qPCR的正向引物
<400> 97
atggagggga atacagccc 19
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Actin的qPCR的反向引物
<400> 98
ttctttgcag ctccttcgtt 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-2.7k）的qPCR的正向引物
<400> 99
tggcctggaa ctcagaaatc 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-2.7k）的qPCR的反向引物
<400> 100
tctgccccct ttaagagtca 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-1.4k）的qPCR的正向引物
<400> 101
cccaggctca gaactctgtc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-1.4k）的qPCR的反向引物
<400> 102
tgctcctaca ccatgctctg 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-0.2k）的qPCR的正向引物
<400> 103
ttgaaaatga aggcctcctg 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Oct4（ChIP-0.2k）的qPCR的反向引物
<400> 104
agcgctatct gcctgtgtct 20
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（ChIP-0.4k）的qPCR的正向引物
<400> 105
cttgggtcta acttctcgtc tg 22
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sox2（ChIP-0.4k）的qPCR的反向引物
<400> 106
gtgtgccatt gtttctgcg 19
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nanog（ChIP-0.5k）的qPCR的正向引物
<400> 107
ccaacttact aaggtagccc g 21
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Nanog（ChIP-0.5k）的qPCR的反向引物
<400> 108
ctttcagcac tcagcgtttc 20
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rex1（ChIP-0.5k）的qPCR的正向引物
<400> 109
ccccgctaca aagtacacta g 21
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rex1（ChIP-0.5k）的qPCR的反向引物
<400> 110
ctagaccgtt tgtagtcagt gg 22
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ctnnbl1的qPCR的正向引物
<400> 111
agaacgacag tgagaaggtt g 21
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ctnnbl1的qPCR的反向引物
<400> 112
cattgtctat gatctcccca cg 22
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tbc1d22b的qPCR的正向引物
<400> 113
ttctgtttat ctgggccatc c 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tbc1d22b的qPCR的反向引物
<400> 114
gtcaaagttc tccacgtcct c 21
<210> 115
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Phf20的qPCR的正向引物
<400> 115
agtgtgaaga gtgccagtg 19
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Phf20的qPCR的反向引物
<400> 116
ctcagccact ccttgtcata c 21
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rgr的qPCR的正向引物
<400> 117
gtacctatac gcagccatcg 20
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rgr的qPCR的反向引物
<400> 118
ttcctctaca gaccatctcc c 21
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zp3r的qPCR的正向引物
<400> 119
actgtcctga aatatacctg cc 22
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zp3r的qPCR的反向引物
<400> 120
actttcccat tgaccaactc g 21
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Lmbr1的qPCR的正向引物
<400> 121
gcggtgggta tgaaaggag 19
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Lmbr1的qPCR的反向引物
<400> 122
aggaaacgat gtagagaatg gc 22
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因D130040H23Rik的qPCR的正向引物
<400> 123
gacctacagc aacctcactg 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因D130040H23Rik的qPCR的反向引物
<400> 124
gcaaaggctt taccacactg 20
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Gli3的qPCR的正向引物
<400> 125
ttcagcaagt ggttcctatg g 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Gli3的qPCR的反向引物
<400> 126
ctgtcggctt aggatctgtt g 21
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Vav3的qPCR的正向引物
<400> 127
tgtcaaaccc tctccatgtg 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Vav3的qPCR的反向引物
<400> 128
tctttggtcc tgtgccttac 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Renbp的qPCR的正向引物
<400> 129
cacagtgaag ccatgattgc 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Renbp的qPCR的反向引物
<400> 130
agccaaacca ttccccatac 20
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rab11fip4os1的qPCR的正向引物
<400> 131
gtctctgatg gaaggatgct g 21
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Rab11fip4os1的qPCR的反向引物
<400> 132
gccttaattt gttttgcctc gg 22
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Styk1的qPCR的正向引物
<400> 133
gaaaatcatg aagagaccca gc 22
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Styk1的qPCR的反向引物
<400> 134
catcggcaga tctagaagca g 21
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Cyb5a的qPCR的正向引物
<400> 135
cagaagcaca aagacagcaa g 21
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Cyb5a的qPCR的反向引物
<400> 136
aaattctcgg tagcatcacc c 21
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zak的qPCR的正向引物
<400> 137
gtaatggaga agtggatcgt gg 22
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zak的qPCR的反向引物
<400> 138
ttcgttctgt cccactgtat g 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tec的qPCR的正向引物
<400> 139
gaaacagcaa catccccaaa g 21
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tec的qPCR的反向引物
<400> 140
cttccccttt gtactgaccg 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Fbn2的qPCR的正向引物
<400> 141
acctgaatcc caacatctgc 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Fbn2的qPCR的反向引物
<400> 142
ccaatctcac actcgtccac 20
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zfp653的qPCR的正向引物
<400> 143
ccacctctat agccagcatt g 21
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Zfp653的qPCR的反向引物
<400> 144
ccatccactt ctgcctctg 19
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ptgis的qPCR的正向引物
<400> 145
aggatgaagg aaaagcacgg 20
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ptgis的qPCR的反向引物
<400> 146
catgaggaag atggcatagg g 21
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Alg10b的qPCR的正向引物
<400> 147
caacttctac ttgctgtatt tgctc 25
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Alg10b的qPCR的反向引物
<400> 148
gacccagctt ctgtatagta aagg 24
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sh3pxd2a的qPCR的正向引物
<400> 149
aggaaatcag tgtggttgtc c 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Sh3pxd2a的qPCR的反向引物
<400> 150
agctccgagt tctcttgttt c 21
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tubb6的qPCR的正向引物
<400> 151
agaggcattt gaagacgagg 20
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tubb6的qPCR的反向引物
<400> 152
ccagtgacat gcttagacca g 21
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Eva1c的qPCR的正向引物
<400> 153
accaaatgtg tagttcccag g 21
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Eva1c的qPCR的反向引物
<400> 154
gaagactcgg ctattgacca g 21
<210> 155
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Pou3f1的qPCR的正向引物
<400> 155
gctctgtgca gtgaccc 17
<210> 156
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Pou3f1的qPCR的反向引物
<400> 156
gtaaaatcca aagcaaaacc gaataa 26
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Prickle2的qPCR的正向引物
<400> 157
aaccagagga aacgtgagaa c 21
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Prickle2的qPCR的反向引物
<400> 158
gtgatgcaaa cacagcgatg 20
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Map6的qPCR的正向引物
<400> 159
cagtgctacc aaacccgac 19
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因Map6的qPCR的反向引物
<400> 160
acagagcctt gatccttgtg 20
<210> 161
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tomm70a的qPCR的正向引物
<400> 161
cagtggcgga ttttgatgc 19
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Tomm70a的qPCR的反向引物
<400> 162
aacctttcat agctgcctgg 20
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ube2g1的qPCR的正向引物
<400> 163
aatggaggga agacagaaac g 21
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因Ube2g1的qPCR的反向引物
<400> 164
cagtgccatg tttctcaatt gg 22
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA盒（定量）的qPCR的正向引物
<400> 165
ctatgtggac tacagactgg aaag 24
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA盒（定量）的qPCR的反向引物
<400> 166
ctagggaggt cgcagtatct 20
<210> 167
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于生成双sgRNA构建体的引物mU6-T2H-F
<400> 167
ctaggatcca ttaggcgggt acagtgcagg ggaa 34
<210> 168
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于生成双sgRNA构建体的引物mU6-T2H-R2
<400> 168
atacggttat ccacgcggcc gcctaatgga tcct 34
<210> 169
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于克隆具有连接子的83-bp SV40核定位位点（NLS）的正向引物
<400> 169
tacaaaggtg gaggtcggac cgaaggcagc ggctccccca ag 42
<210> 170
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于克隆具有连接子的83-bp SV40核定位位点（NLS）的反向引物
<400> 170
aaatcgtcta aagcatccga ccctccgccg gaaccgccca 40
<210> 171
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增p300core的正向引物
<400> 171
agtgggcggt tccggcggag ggtcgatttt caaaccagaa gaactacgac 50
<210> 172
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增p300core的反向引物
<400> 172
tatcaagctt gcatgcctgc aggttagtcc tggctctgcg tgtgcagctc 50
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于合成72-bp sgRNA构建体的引物sgRNA-F
<400> 173
gtatcccttg gagaaccacc t 21
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于合成72-bp sgRNA构建体的引物sgRNA-R
<400> 174
tgctgtttcc agcttagctc t 21
<210> 175
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sox2转录起始位点的500 bp上游和100 bp下游的基因组DNA序列
<400> 175
acagagcgca gtgccgcgga tgagcgcaga aacaatggca caccacctcc ggctctgcca 60
gcttcctgaa atactagttg gacagtcgcc ctgaaccacc catgggcctt gccccaccct 120
ggccccagct tcccgcgccc catccaccct tatgtatcca agagagagcc aatattccgt 180
agcatggggg aaaggagctg tcgtcttggt gctgtttacc cacttccttc gaacaggcgt 240
gcgccgtgac ctgttgctga aaacgggggg cggggggggg ggatacaaag gttccccagc 300
ggccggctgc gggcccgcct cccccgcgcg gttcggggca cagcgctctg ctgggctcgg 360
ctcggcggcg cggcaggccc cgcccccttt catgcaaaac cctctggcga ggctgggctc 420
gggcgcagga gccggcgctc gctgattggc cgccggaaac ccatttattc cctgacagcc 480
cccatcacat ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc 540
agagaagaga gtgtttgcaa aaagggaaaa gtactttgct gcctctttaa gactagggct 600

Claims (14)

1.一种生成诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，其包含：
(a)在非iPSC中使用至少一个单向导RNA(sgRNA)靶向至少一个内源基因座；和
(b)使用CRISPR激活系统和所述至少一个sgRNA重塑所述非iPSC中的所述内源基因座；
从而生成iPSC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中
(a)所述至少一个内源基因座是Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nr5a2、Glis1、Cebpa、Lin28、Nanog或其任何组合；
(b)所述至少一个内源基因座包含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28和Nanog的组合；
(c)所述至少一个sgRNA靶向Oct4启动子、Oct4增强子、Sox2启动子、Klf4启动子、c-Myc启动子、Lin28启动子、Nanog启动子、EEA-基序或其组合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中
(a)所述内源基因座是Oct4；
(b)所述内源基因座是Sox2；
(c)靶向Oct4启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:1-6、57和58；
(d)靶向Oct4增强子的sgRNA选自SEQ ID NO:7-11；
(e)靶向Sox2启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:12-21和59；
(f)靶向Klf4启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:22-31和60；
(g)靶向c-Myc启动子的sgRNA选自SEQ ID NO:32-41和61；
(h)靶向Nr5a2基因的sgRNA选自SEQ ID NO:42-45；
(i)靶向Glis1基因的sgRNA选自SEQ ID NO:46-50；
(j)靶向Cebpa基因的sgRNA选自SEQ ID NO:51-56；
(k)靶向Lin28启动子的sgRNA包含SEQ ID NO:62；
(l)靶向Nanog启动子的sgRNA包含SEQ ID NO:63；和/或
(m)靶向EEA-基序的sgRNA包含SEQ ID NO:64。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述CRISPR激活系统包含
(a)与至少一个转录激活子融合的去激活的CRISPR相关核酸酶；和任选的
(b)使去激活的CRISPR相关核酸酶与所述至少一个转录激活子连接的肽的串联阵列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中
(a)所述CRISPR激活系统包含去激活的Cas9(dCas9)；
(b)所述肽的串联阵列是SunTag阵列；
(c)所述至少一个转录激活子包含单纯疱疹病毒VP16、VP16的四聚体(VP64)或p65。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述非iPSC是
(a)成纤维细胞、皮肤细胞、脐带血细胞、外周血细胞或肾上皮细胞；
(b)哺乳动物细胞；和/或
(c)人类细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含
(c)使步骤(b)的细胞与包含TGFβR抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的小分子接触；以及任选地
(d)使所生成的iPSC与包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂但不包含TGFβR抑制剂的小分子接触。
8.根据权利要求1所述的方法，其中与没有所述重塑相比，所述内源基因座的所述重塑产生100倍或更高水平的基因表达。
9.一种生成iPSC的方法，其包含：
(a)在非iPSC中使用靶向Sox2基因的sgRNA、靶向Oct4启动子的sgRNA和任选的靶向Oct4增强子的sgRNA或靶向EEA-基序的sgRNA中的至少一者靶向至少一个内源基因座，和
(b)使用CRISPR激活系统和靶向Sox2基因的sgRNA、靶向Oct4启动子的sgRNA和任选的靶向Oct4增强子的sgRNA或靶向EEA-基序的sgRNA中的所述至少一者重塑所述内源基因座；
从而生成iPSC。
10.一种CRISPR激活系统的组合物，其包含：
(a)dCas9；
(b)与所述dCas9融合的SunTag阵列；和
(c)与所述SunTag阵列附接的p300的至少一个乙酰基转移酶活性结构域(p300core)。
11.一种生成iPSC的方法，其包含：
(a)在非iPSC中使用至少一个sgRNA靶向至少一个内源基因座，和
(b)使用根据权利要求10所述的CRISPR激活系统和所述至少一个sgRNA重塑所述非iPSC中的所述内源基因座以生成iPSC。
12.根据权利要求11所述的方法，其中
(a)所述至少一个内源基因座是Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Nr5a2、Glis1、Cebpa或其任何组合；
(b)所述内源基因座是Oct4；
(c)所述内源基因座是Sox2；
(d)所述至少一个sgRNA靶向Oct4启动子、Sox2启动子或其组合；
(e)所述至少一个sgRNA靶向Oct4启动子，并且选自SEQ ID NO:1-6、57和58；
(f)所述至少一个sgRNA靶向Oct4增强子，并且选自SEQ ID NO:7-11；
(g)所述至少一个sgRNA靶向Sox2启动子，并且选自SEQ ID NO:12-21和59；
(h)所述至少一个sgRNA靶向Klf4启动子，并且任选地选自SEQ ID NO:22-31和60；
(i)所述至少一个sgRNA靶向c-Myc启动子，并且任选地选自SEQ ID NO:32-41和61；
(j)所述至少一个sgRNA靶向Nr5a2基因，并且任选地选自SEQ ID NO:42-45；
(k)所述至少一个sgRNA靶向Glis1基因，并且任选地选自SEQ ID NO:46-50；
(l)所述至少一个sgRNA靶向Cebpa基因，并且任选地选自SEQ ID NO:51-56；
(m)所述至少一个sgRNA靶向Lin28启动子，并且任选地包含SEQ ID NO:62；
(n)所述至少一个sgRNA靶向Nanog启动子，并且任选地包含SEQ ID NO:63；
(o)所述至少一个sgRNA靶向EEA-基序，并且任选地包含SEQ ID NO:64。
13.根据权利要求11所述的方法，其中
(a)所述非iPSC是成纤维细胞、皮肤细胞、脐带血细胞、外周血细胞或肾上皮细胞；
(b)所述非iPSC是哺乳动物细胞；和/或
(c)所述非iPSC是人类细胞。
14.一种生成iPSC的方法，其包含：
(a)在非iPSC中使用靶向Oct4启动子的sgRNA或靶向Oct4增强子的sgRNA中的至少一者靶向至少一个内源基因座，和
(b)使用根据权利要求23中所述的CRISPR激活系统和靶向Oct4启动子的sgRNA或靶向Oct4增强子的sgRNA中的所述至少一者重塑所述内源基因座以生成iPSC。
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