KR20220119383A

KR20220119383A - 세포 재프로그래밍 방법

Info

Publication number: KR20220119383A
Application number: KR1020227021153A
Authority: KR
Inventors: 라이언 리스터; 샘 벅베리; 호세 폴로; 샤오동 리우
Original assignee: 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아; 모나쉬 유니버시티
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2022-08-29
Also published as: WO2021102500A1; CA3159518A1; US20220403343A1; AU2019476150A1; JP2023511643A

Abstract

본 발명은 다능성 상태로의 체세포 재프로그래밍을 촉진하도록 조정된 제1 배양 조건에서 체세포를 배양하는 단계; 상기 세포에서 저메틸화된 DNA 상태를 촉진하도록 조정된 제2 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 제3 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계를 순서대로 포함하여, 체세포로부터 유도 다능성 줄기 (iPSC)를 제조하는, 유도 다능성 줄기 (iPSC)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 방법으로부터 제조된 세포 및 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 재프로그래밍 방법

본 발명은 체세포(somatic cell)를 다능성(pluripotent) 상태로 재프로그래밍하기 위한 개선된 방법, 및 그러한 방법으로부터 제조된 세포 및 조성물에 관한 것이다.

체세포를 인간 배아 줄기 세포(embryonic stem cell) (ESC)와 밀접하게 비슷한 다능성 세포로 재프로그래밍하는 것은 생물의학 연구 및 재생의학에서 큰 잠재력을 지닌 기술분야이다.

유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell) (iPSC) 기술은 전형적으로 다능성 세포를 생성하기 위해, 체세포의 유전자 조작 또는 체세포에 정의된 인자의 도입을 포함한다. 이어서, 이들 방법에 의해 제조된 iPSC는 iPSC에 특이적 분화 조건의 적용을 통해, 임의의 수의 상이한 세포 유형을 제조하는 데 사용할 수 있다.

세포 재프로그래밍은 ESC의 후생유전체(epigenome)와 밀접하게 비슷하도록 체세포 후생유전체를 재설정하는 것을 필요로 한다. 그러나, 여러 연구는 현재의 재프로그래밍 접근 방식을 사용하여, iPSC는 전형적으로 원래 체세포의 DNA 메틸화와 같은 후생유전학적 패턴(epigenetic pattern)을 유지하며, 따라서 ESC와 후생유전학적으로 구별된다는 것을 밝혀냈다. 다시 말해서, iPSC는 그들이 유래된 체세포의 후생유전학적 기억을 보유한다.

게다가, 재프로그래밍 공정 동안 iPSC-특이적 후생유전학적 이상(epigenetic abnormalities)이 빈번히 발생한다. 이들은 비정상적(abnormal)/비정상의(aberrant) 후생유전학적 (예를 들어 DNA 메틸화) 패턴 및 원래 세포 또는 ESC에 존재하지 않는 상태이다. 이들 비정상의 DNA 메틸화 패턴은 광범위한 iPSC 계대배양(passaging)을 통해 안정적이고, iPSC 분화를 통해 전달될 수 있으며 유래된 분화된 세포에서 부적절한 전사 활성과 연결된다.

체세포의 후생유전학적 기억과 비정상의 후생유전학적 (예를 들어, DNA 메틸화) 상태는 제조된 iPSC에 기능적으로 영향을 주고, 전사를 변경하고 원래의 체세포 계통으로 iPSC 분화 잠재력을 편향시킨다. 따라서, iPSC는 분화와 기능에 영향을 미칠 수 있는 후생유전체 상태 및 후생유전체 기억을 가지고 있다. 추가로, 불완전한 후생유전학적 재프로그래밍은 iPSC 기술 및 치료 적용의 경우 상당한 제한이 될 수 있다.

따라서, 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 개선된 방법이 필요하다.

본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은 이 선행 기술이 임의의 관할권에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성하거나 이 선행 기술이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고, 관련 있는 것으로 간주되고/거나, 선행 기술의 다른 부분과 조합될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 승인 또는 제안이 아니다.

제1 측면에서, 본 발명은

(a) 다능성 상태로의 체세포 재프로그래밍을 촉진하도록 조정된 제1 배양 조건에서 체세포를 배양하는 단계;

(b) 상기 세포에서 저메틸화된(hypomethylated) DNA 상태를 촉진하도록 조정된 제2 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 배양 조건에서 배양하는 것이 세포가 확립된 나이브(

) 다능성 상태를 달성할 수 있도록 하기에 불충분한 기간 동안인 것인 단계; 및

(c) 프라이밍된(primed) 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 제3 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계,

를 순서대로 포함하여, 체세포로부터 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 제조하는, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 제조하는 방법을 제공한다.

두 번째 측면에서, 본 발명은

(a) 체세포에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시키는 단계이며, 여기서 인자가 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 것인 단계;

(b) 제1 배양 배지에서 상기 세포를, 다능성 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계;

(c) 저메틸화된 DNA 상태를 유도하도록 조정된 제2 배지에서 상기 세포를, 상기 세포의 후생유전체 프로파일(epigenomic profile)을 재설정하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계; 및

(d) 프라이밍된 다능성 상태를 유도하도록 조정된 제3 배양 배지에서 상기 세포를, 프라이밍된 다능성 상태로 상기 세포를 전환시키기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계

를 순서대로 포함하여, 체세포를 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)로 재프로그래밍하는, 체세포를 유도 다능성 세포 (iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은

(c) 저메틸화된 DNA 상태를 유도하도록 조정된 배양 배지와 상기 세포를 접촉시키고 저메틸화된 DNA 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 세포를 프라이밍된 배양 배지와 접촉시키고 프라이밍된 다능성 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계

본 발명의 방법은 iPSC에서 비정상의 후생유전학적 패턴의 생성 가능성을 최소화하거나 감소시키는 데 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC는 통상적인 재프로그래밍 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC보다 배아 줄기 세포 (ESC)의 것과 더 밀접하게 비슷한 후생유전체 프로파일을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 세포의 후생유전체 프로파일을 재설정하는 것은 ESC의 후생유전학적 프로파일과 비슷한 후생유전학적 프로파일을 확립하는 것을 지칭한다.

임의의 실시양태에서, 저메틸화된 DNA 상태를 나타내는 세포는 나이브 다능성 세포일 수 있다.

본 발명에 따라 수득되거나 수득가능한 세포의 후생유전체 프로파일은 본 방법에 따라 수득된 iPSC의 적어도 일부에 대한 게놈 메틸화 패턴을 결정하고 이것을 ESC의 메틸화 패턴과 비교함으로써 ESC의 프로파일과 비교할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC는 ESC의 비(non)-CG DNA 메틸화 프로파일과 유사한 비-CG DNA 메틸화 프로파일을 특징으로 한다. 본 발명의 임의의 측면에서, 언급된 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC는 ESC의 H3K9me3 메틸화 상태와 비슷한 세포에서 H3K9me3 메틸화 상태를 확립한다. 본 발명의 임의의 측면에서, 후생유전학적 프로파일을 재설정하는 것은 ESC에서 DNA 메틸화 및/또는 전위 요소(transposable element)의 발현의 수준과 유사한 전위 요소 DNA 메틸화 및/또는 발현의 수준을 지칭한다.

본 발명의 임의의 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC는 본원의 표 3 또는 4 중 어느 하나에 정의된 유전자좌에서 ESC의 메틸화 수준과 유사한, CG DNA 메틸화 수준 및/또는 전위 요소에 대한 CG DNA 메틸화 수준을 갖는다.

본 발명의 임의의 측면에서, 체세포는 인간 체세포이고 상기 방법에 따라 제조된 iPSC는 인간 iPSC이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 시작하기 위해 세포를 배양하는 시간의 기간은 (본 발명의 제1 측면에 따라) 체세포를 제1 배양 배지와 접촉시킨 후 또는 (본 발명의 제2 또는 제3 측면에 따라) 하나 이상의 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시킨 후 적어도 1일이다. 시간의 기간은 세포를 제1 배양 배지와 접촉시키거나, 하나 이상의 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시킨 후 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 초과일 수 있다. 임의의 실시양태에서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 시작하기 위해 세포를 배양하는 시간의 기간은 그것이 체세포와 연관된 하나 이상의 마커(marker) 및/또는 특성의 감소를 가능하게 하는 한 임의의 시간의 기간일 수 있다.

저메틸화된 DNA 상태를 유도하도록 조정된, 제2 배양 배지 또는 제2 배양 조건은 세포의 전체적인 DNA 저메틸화를 촉진하는 임의의 배양 조건 또는 배지일 수 있다. 특정 실시양태에서, 배양 조건 또는 배지는 나이브 다능성 상태 또는 나이브 다능성 상태의 특징, 예를 들어 전체적인 DNA 저메틸화를 나타내는 상태를 촉진하도록 조정된 임의의 배양 배지를 포함할 수 있다. 이러한 배지의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 추가로 기재되어 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 나이브 배지는 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제, 및 ROCK 억제제를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 전체적인 DNA 저메틸화는 체세포 (분화된) 세포 유형, 또는 임의로 프라이밍된 인간 ESC에서 관찰된 메틸화 수준과 비교하여, 세포의 게놈에 걸친 DNA 메틸화의 평균 수준의 감소를 지칭한다.

프라이밍된 배지 (또는 제3 배양 조건 또는 제3 배양 배지)는 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 임의의 배양 배지를 포함할 수 있다. 이러한 배지의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 추가로 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 프라이밍된 배지는 에센셜(Essential) 8, KSR/FGF2, mTeSR, AKIT 또는 B8로부터 선택된다.

임의의 측면에서, 제2 배양 조건/배양 배지에서 세포를 배양하는 것은 다능성의 발달에 충분하지 않은 시간의 기간 동안일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 임의의 측면에서 단계 c)의 시기선택은 세포에 대한 나이브 다능성 표현형을 달성하기에는 충분하지 않으나 세포에서 전체적인 DNA 저메틸화를 달성하기에는 충분한 시간의 기간 동안 DNA 저메틸화를 유도하기 위한 배지 또는 나이브 배지와 세포를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 다시 말해서, 단계 d)의 시기선택, 즉 세포를 프라이밍된 배지와 접촉시키는 것은 세포가 재프로그래밍을 완료하기 전에 그리고 세포가 나이브 다능성 표현형을 달성하기 전에 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 c)의 시기선택은 일단 세포가 전체적인 DNA 저메틸화를 달성했으나 본원에 기재된 바와 같은 나이브 다능성의 마커를 포함한, 나이브 다능성 마커 중 하나 이상의 마커를 발현하지 않은 때이다.

본 발명의 제2 및 제3 측면의 대안적인 실시양태에서, 단계 c)의 시기선택은 세포가 본원에 기재된 바와 같은 나이브 다능성의 하나 이상의 마커를 발현하는 경우를 포함한 확립된 나이브 다능성 세포가 된 후일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "나이브 다능성 상태" 또는 "나이브 다능성 표현형"은 또한 둥근, 돔-형상(round, dome-shaped)인 세포를 포함하는 세포 형태 또는 표현형을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 나이브 다능성 상태는 또한 전체적인 DNA 저메틸화를 갖는 세포를 포함할 수 있다. 나이브 다능성 상태는 KLF2, KLF4, TFCP2L1, TBX3, REX1, GBX2, STELLA (DPPA3), KLF17, DPPA5, TFCP2L1, MAEL, UTF1, ZFP57, DNMT3L, FGF4, FOXR1, ARGFX, TRIM60, DDX43, BRDT, ALPPL2, KHDC3L, KHDC1L 및 PRAP1로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 또는 모든 마커, 또는 표 5를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 나이브 다능성의 기타 마커의 발현을 또한 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "프라이밍된 다능성 상태" 또는 "프라이밍된 다능성 표현형"은 전형적으로 편평 세포 콜로니(flat cell colony)의 존재를 특징으로 하는 세포 표현형 또는 형태를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 프라이밍된 다능성 상태는 착상 후(post-implantation) 배반엽상피(epiblast) 특이적 전사 인자의 하나 이상의 mRNA를 발현하는 다능성 세포를 지칭한다. 예를 들어, 프라이밍된 세포는 SFP, EOMES, BRACHYURY, OTX2, ZIC2, ZIC3, ZIC5, DNMT3B, KDR, CDH2, CER1, COL2A1, DAZL, TCF7L1, SOX11, SALL2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 모두를 발현할 수 있다, 또는 표 5를 포함하여 본원에 기재된 바와 같은 프라이밍된 다능성 상태의 기타 마커를 발현할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에서, 재프로그래밍을 겪는 세포는 0.5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일의 기간 동안 제2 배양 조건 또는 제2 배양 배지에서 배양된다. 이어서 세포를 제3 배지, 제3 배양 조건 또는 프라이밍된 배양 배지로 옮긴다.

본 발명의 임의의 측면에서, 재프로그래밍을 겪는 세포는 적어도 약 0.5일, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일 또는 약 21일의 기간 동안 제2 배양 배지 또는 나이브 배양 배지에서 배양된다. 이어서 세포를 제3 배지, 제3 배양 조건 또는 프라이밍된 배양 배지로 옮긴다.

본 발명의 임의의 측면의 바람직한 실시양태에서, 제2 배양 조건 또는 제2 배양 배지에서 세포의 배양은 적어도 5일 동안이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 나이브 배지 (제2 배양 배지 또는 제2 배양 조건)에서 세포의 배양은 약 21일 이하 동안이다.

본 발명의 임의의 측면에서, 제2 배양 배지, 또는 나이브 배지와 접촉된 세포는 0.5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일 또는 그 초과의 기간 동안 제3 배양 배지 또는 프라이밍된 배양 배지에서 배양된다.

본 발명의 임의의 측면에서, 제2 배양 배지, 또는 나이브 배지와 접촉된 세포는 적어도 약 0.5일, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일 또는 약 21일 동안 제3 배양 배지 또는 프라이밍된 배양 배지에서 배양된다.

체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 임의의 방법 (즉, 본 발명의 제1 측면의 단계 a) 또는 본 발명의 제2 및 제3 측면의 단계 a) 및 b)를 수행하는 방법)은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 이와 같이, 본 발명은 다능성으로의 재프로그래밍을 촉진하기 위한 특정한 배양 조건, 또는 관련 인자의 단백질 발현 또는 양을 증가시키기 위한 특정한 방법, 또는 체세포가 다능성으로의 재프로그래밍을 시작하도록 하는 배양 조건에 의해 제한되지는 않는다. 이러한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 추가로 기재되어 있다.

특정 실시양태에서, 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하는 것은 세포를 다능성을 유도하는 소분자 조합과 접촉시키는 것을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 인자는 전사 인자이다.

다능성과 연관된 임의의 전사 인자가 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 특정 예에서, 전사 인자는 인자: OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC 중 하나 이상을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 전사 인자는 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC(OSKM) 중 4가지 모두, 또는 그의 변이체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 체세포, 예를 들어 섬유모세포(fibroblast)를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 전사 인자는 또한 인자 LIN28 및/또는 NANOG를 포함한다. 특정 실시양태에서, OCT4, SOX2, KLF4, MYC, LIN28 및 NANOG 각각의 단백질 발현은 체세포에서 증가된다.

전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 인자의 단백질 발현 또는 양은 세포를 인자의 발현을 증가시키는 작용제(agent)와 접촉시킴으로써 증가된다. 바람직하게는, 작용제는 뉴클레오티드 서열, 단백질, 앱타머(aptamer) 및 소분자, 리보솜, RNAi 작용제 및 펩티드-핵산 (PNA) 및 그의 유사체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 외인성이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 전사 인자의 발현을 증가시키기 위한 전사 활성화 시스템(예를 들어, 유전자 조절 시스템 예컨대 CRISPR/Cas9 또는 TALEN에서 사용하기 위한 gRNA)의 사용을 고려한다.

전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 전사 인자의 단백질 발현 또는 양은 전사 인자를 인코딩(encoding)하거나 이의 기능적 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산을 세포에 도입함으로써 증가된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 전사 인자 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 플라스미드에 의해 세포에 도입된다. 하나 이상의 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 사용될 수 있다. 따라서, 필요한 하나 이상의 전사 인자의 발현 또는 양을 증가시킬 목적으로 하나 이상의 플라스미드가 사용될 수 있음은 명백하다. 다시 말해서, 핵산 서열은 단일 플라스미드 내에 또는 상에 있을 수 있거나, 2개 이상의 플라스미드로 체세포에 제공될 수 있다.

본 발명의 임의의 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 하나 이상의 전사 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드는 에피솜 플라스미드(episomal plasmid)일 수 있다.

바람직하게는, 핵산은 이종 프로모터를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스(non-viral) 벡터와 같은 벡터에 있다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않는 게놈을 포함하는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 또는 센다이 바이러스(센다이 virus)일 수 있다.

본 발명의 임의의 실시양태에서, 인자의 단백질 발현 또는 양은 체세포를 세포에서 상기 인자의 발현을 증가시키기 위한 하나 이상의 작용제와 접촉시킴으로써 체세포에서 증가된다. 특정 실시양태에서, 인자의 단백질 발현 또는 양은 상기 전사 인자를 인코딩하는 하나 이상의 벡터로 체세포를 형질도입 또는 형질감염시킴으로써 체세포에서 증가된다. 벡터는 통합 또는 비통합 바이러스 벡터를 포함한, 바이러스 벡터일 수 있다. 추가 실시양태에서, 벡터는 에피솜 벡터일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 단리된 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 세포 집단(population)을 제공하며, 여기서 본 발명은 세포의 적어도 5%가 iPSC이고 그러한 iPSC는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 것인 세포 집단을 제공한다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 iPSC이고 그러한 iPSC는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득가능하다.

본 발명의 임의의 방법에서, 상기 방법은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC를 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 세포를 분화시키는 단계는 분화된 세포 또는 다능성 상태에서가 아닌 세포의 적어도 하나의 특성을 갖는 세포를 생성하기 위한 충분한 시간 동안 및 조건 하에 iPSC를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 생성된 분화된 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 생성된 단리된 분화된 세포를 제공한다. 추가로 여전히, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 생성된 분화된 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 세포의 적어도 5%가 분화된 세포이고 그러한 분화된 세포가 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 생성되는 것인 세포 집단을 제공한다. 바람직하게는, 집단내 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포이고 그러한 분화된 세포가 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 생성된다.

본 발명은 또한 iPSC가 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 것인, iPSC의 집단/iPSC로부터 생성된 분화된 세포로부터 유래된 세포의 오르가노이드(organoid) 또는 다른 조직화된 집합체(organised collection)를 제공한다.

본 발명은 또한

· 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한, 단리된 iPSC 또는 iPSC의 집단;

· 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한, 하나 이상의 iPSC로부터 유래된, 단리된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단; 또는

· iPSC가 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 것인, iPSC의 집단/iPSC로부터 생성된 분화된 세포로부터 유래된 세포의 오르가노이드;

및 제약상 허용되는 부형제

를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한

iPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게

를 투여하는 것을 포함하는, iPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 다능성 줄기 세포, 또는 그로부터 유래된 분화된 세포의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에서, 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 iPSC의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 따라 iPSC를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 서면 설명서를 포함한다. 키트는 또한 본원에 정의된 바와 같은 제1, 제2 및/또는 제3 배양 배지를 포함한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 시약 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가로 여전히, 키트는 본 발명의 방법에 따라 제조된 iPSC를 분화시키기 위한 서면 설명서 및/또는 시약을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 임의의 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행되는 하나 이상의 또는 모든 단계를 가질 수 있다.

문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 "포함하는", "포함한다" 및 "포함된"과 같은 상기 용어의 변형은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다.

선행 단락에 기재된 본 발명의 추가 측면 및 상기 측면의 추가 실시양태는 예로서 그리고 첨부 도면을 참조하여 주어진, 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.

도 1. 비정상의 DNA 메틸화의 획득은 프라이밍된 재프로그래밍의 13일 후에 발생하며 나이브 iPSC에는 부재한다. a) iPSC와 ESC 간에 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 시험하는 데 사용된 세포주를 나타내는 표. 열(column)은 DMR 시험에 사용된 각각의 세포주에 사용된 배양 배지를 나타낸다. b) 바플롯(Barplot)은 iPSC와 ESC 간에 검출된 DMR의 수를 나타낸다. 기억 DMR은 섬유모세포와 iPSC 간에 어떤 DMR도 검출되지 않은 것들이다. iPSC DMR은 메틸화 수준이 ESC와 섬유모세포 간에 유의하게 상이한 것들이다. 고(hyper) 및 저-메틸화된 DMR은 수준이 각각 ESC와 비교하여 더 높고 그리고 더 낮은 iPSC인 것들이다. c) 플롯은 전구체(progenitor) 섬유모세포 상태와 비교하여 모든 DMR에 걸쳐 평균 DNA 메틸화 변화를 나타낸다. 각각의 점은 개별 샘플을 나타낸다. d) 기억 및 iPSC DMR에 대한 모든 샘플에 걸쳐 DMR 중 DNA 메틸화 수준을 나타내는 히트맵(Heatmap). 행(row)은 상관관계 클러스터링에 의해 정렬된다. e) TCERG1L 및 iPSC DMR에 대한 전사 시작 부위에 플랭킹(flanking)한 DNA 메틸화 수준을 나타내는 게놈 브라우저 플롯. 플롯은 이 iPSC DMR의 경우 비정상의 DNA 메틸화가 프라이밍된 재프로그래밍의 13일 후에 축적되고 나이브 재프로그래밍에서 나타나지 않음을 나타낸다.
도 2. 나이브-투-프라이밍된((

-to-primed) 재프로그래밍은 체세포 기억을 지우고 ESC와 더 밀접하게 비슷한 세포를 제조한다. a) 일시적-나이브-처리(transient-

-treatment) (TNT) 프라이밍된 iPSC 또는 나이브-투-프라이밍된 iPSC를 제조하는 두 가지 구별되는 전략을 도시하는, 나이브-투 프라이밍된 재프로그래밍의 개략도. b) DMR 클래스에 의해 분리된 나이브-투-프라이밍된 및 TNT 프라이밍된 재프로그래밍에 의해 수정된 CG-DMR의 수. c) 나이브-투-프라이밍된 및 TNT-프라이밍된 iPSC 재프로그래밍이 iPSC와 ESC 간에 DNA 메틸화 차이를 감소시킴을 나타내는, iPSC와 ESC 간에 DMR에서 DNA 메틸화 수준의 차이를 나타내는 히스토그램. 수직 파선은 mCG 수준의 20% 델타를 나타내며, 이는 DMR 유의성의 규모 역치(magnitude threshold)이다. d) 바플롯은 억압적 염색질(repressive chromatin) 도메인에서 CG-DMR의 농축화(enrichment)의 순열 시험으로부터 결정된 농축화 z-점수를 나타낸다. e) 업셋 플롯(upset plot)은 섬유모세포-특이적 억압적 염색질과 교차하는 DMR에 대한 높은 정도의 CG-DMR 수정을 나타낸다. f) 상단 패널은 비-CG DMR에서 CA 메틸화 수준의 집계(aggregate) 프로파일 플롯이며, 이는 TNT-프라이밍된 iPSC및 나이브-투-프라이밍된 iPSC가 ESC와 매우 유사한 비-CG 메틸화 프로필을 나타낸다. 하단 패널은 프라이밍된 iPSC와 비교하여 TNT-프라이밍된 iPSC 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC 둘 다에서 비-CG DMR에서 더 적은 H3K9me3 ChIP-seq 농축화를 나타낸다.
도 3. 나이브-투-프라이밍된 재프로그래밍은 더 낮은 전위 요소 (TE) 발현을 야기한다. A) TE에서 DNA 메틸화 수준의 히스토그램은 DNA 메틸화가 프라이밍된 iPSC와 비교할 때 나이브-투-프라이밍된 iPSC에서 더 높고 ESC와 더 유사함을 나타낸다. 각각의 TE의 모든 카피에 대해 커버리지-가중(Coverage-weighted) DNA 메틸화 수준 (mCG/CG)을 계산하였다. 공여자 32F로부터 유래된 세포에 대해 나타낸 iPSC 데이터. B) TE 발현의 덴드로그램(Dendrogram)은 나이브-투-프라이밍된 iPSC가 프라이밍된 iPSC보다 ESC와 더 밀접하게 비슷함을 나타낸다. C) 프라이밍된 iPSC와 나이브-투-프라이밍된 iPSC 간에 TE 차등 발현 시험은 TE 발현이 나이브-투-프라이밍된 iPSC에서 하향-조절됨을 나타낸다. 바플롯은 유전자 및 TE에 대해 차등적으로 발현된 특색의 수를 나타낸다. 화산 플롯은 군 간에 발현 차이의 규모 및 유의성을 나타낸다. 수직 파선은 로그-배수 변화도(log-fold change) > 1 (즉, 절대 배수 변화도 > 2)를 나타낸다. D) 차등적으로 발현된 TE의 대부분은 LINE 및 LTR 요소이며 나이브-투-프라이밍된 iPSC에서 억압된다. 점은 LINE, LTR 및 SINE TE 클래스에서 각각의 패밀리에서 TE에 대한 y축의 변화 규모를 나타낸다. E) 바플롯은 (D)에서 표지된 TE에 대한 정규화된 TE 발현 (백만당 카운트)을 나타낸다. 모든 경우에, 나이브-투-프라이밍된 iPSC TE 발현은 프라이밍된 iPSC보다 H9 ESC의 발현에 더 비슷하다. F) DMR에서 전위 요소 패밀리에서의 DNA 메틸화 분포. 메틸화는 모든 샘플에 대한 각각의 TE에 대한 mCG/CG로서 계산된 다음에 TE 패밀리에 의해 그룹핑된다. TE에서 수정된 DMR을 나타냈다.
도 4. 프라이밍된 iPSC 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC로부터 유래된 배아체(embryoid bodies)의 분화 채점표 평가는 나이브-투-프라이밍된 iPSC가 프라이밍된 iPSC와 비교하여 중배엽 계통에 대한 더 적은 분화 편향을 나타냄을 나타낸다 (섬유모세포는 중배엽 기원이며 공여자 체세포 세포 유형이었다).
도 5. A) 이미지는 프라이밍된 iPSC (좌측) 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC (우측)로부터 신경 줄기 세포 (NSC)의 생성을 나타낸다. 이것은 프라이밍된 iPSC를 NSC로 분화하면 NSC 콜로니 사이의 공간에서 섬유모세포-유사 세포를 생성하며, 이들은 나이브-투-프라이밍된 iPSC로부터 NSC를 분화시킬 때 상당히 감소됨을 나타낸다. B) 프라이밍된 iPSC, TNT-프라이밍된 iPSC, 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC로부터 유래된 NSC 배양에 대한 단일 세포 RNA-seq 실험으로부터 검출된 세포 유형의 비율. 데이터는 나이브-투-프라이밍된 세포 및 TNT-프라이밍된 세포 둘 다가 마커 유전자 발현을 특징으로 하는 바와 같은 섬유모세포-유사 세포가 실질적으로 더 적음을 나타낸다.
도 6. 유세포 분석법 분석은 MEL1 hESCs, MEL1-유래된 프라이밍된 iPSC, MEL1-유래된 TNT-프라이밍된 iPSC, MEL1-유래된 나이브-투-프라이밍된 iPSC (p4) 및 MEL1-유래된 나이브-투-프라이밍된 iPSC (p10)의 피질 뉴런 분화의 8일차 (D8) 및 16일차 (D16)에 NCAM 양성 집단의 백분율을 나타낸다.

이제 본 발명의 특정 실시양태를 상세히 참조할 것이다. 본 발명이 실시양태와 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명을 그러한 실시양태로 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 수정, 및 균등물을 포함하도록 의도된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 기재된 방법 및 재료에 결코 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특색들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적인 측면을 구성한다.

본 명세서를 해석할 목적으로, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함하며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.

통상적인 방법에 따르면, 인간 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 및 배아 줄기 세포 (ESC)는 대개 이식 후 ESC와 비슷한, "프라이밍된" 다능성 상태로 유지된다. 그러나, 이들 "프라이밍된" iPSC는 전형적으로 ESC의 것과 구별되는 후생유전체 기억을 특징으로 한다. 추가로, 프라이밍된 iPSC는 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 포함하는 iPSC-특이적 비정상의 DNA 메틸화 상태의 존재를 특징으로 한다.

본 발명자들은 체세포를 프라이밍된 또는 나이브 iPSC로 재프로그래밍하는 동안 DNA 메틸화 역학(dynamics) 및 패턴의 경로를 포괄적으로 매핑하였다. 이러한 새로운 지식에 기초하여, 본 발명자들은 iPSC의 메틸화 프로파일에서 후생유전학적 기억 및 수차(aberration)를 실질적으로 수정하는 신규 공정을 개발하였다. 따라서, 본 발명자들은 통상적인 iPSC와 비교하여 후생유전학적 및 전사 특성 및 분화 잠재력에서 ESC와 더 밀접하게 비슷한 iPSC를 생성하기 위한 신규 방법을 개발하였다. 이 신규 방법 또는 공정으로 생성된 iPSC는 본원에서 "나이브-투-프라이밍된 iPSC" (NtoP iPSC) 또는 "일시적-나이브-처리-프라이밍된 iPSC" (TNT-프라이밍된 iPSC)로 지칭될 수 있다.

공급원 (체세포) 세포를 재프로그래밍하는 방법에 관계없이, 인간 iPSC를 생성하기 위한 표준 접근법은 프라이밍된 또는 나이브 배지에서 iPSC를 생성하는 것이다. 그러나, 본 발명자들은 재프로그래밍 공정 동안, 바람직하게는 짧은 시간의 기간 동안 세포를 나이브 배지에 노출시킨 후, 배지를 교환하고, 세포를 프라이밍된 배지에 위치시키는 공정을 개발하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 프라이밍된 상태 (인간 iPSC에서 가장 통상적으로 사용되는 다능성 상태)에 있으나, 통상적인 방법을 사용하여 생성된 iPSC와 비교하여 진정한(bona fide) ESC와 더 유사한 iPSC를 발생시킨다. 특히, 하기 이점 중 하나 이상 또는 모두를 가질 수 있다:

· iPSC-특이적 DMR (iDMR)의 존재 하에 유의한 감소 ;

· 기억 DMR의 존재 하에 유의한 감소 ;

· 비-CG DMR에서 비-CG 메틸화를 ESC와 유사한 수준으로 수정;

· 전위 요소에서 비정상의 메틸화의 존재 하에 유의한 감소;

· 섬유모세포 라미나(lamina) 연관 도메인 (여기서 원래 체세포 유형은 섬유모세포임)과 연관이 있는, 비-CG DMR에서 H3K9me3 ChIP-seq 신호의 감소;

· 통상적인 프라이밍된 iPSC와 비교하여 전위 요소의 발현 감소;

· 원래 체세포 유형의 계통으로의 분화 편향 감소;

· 프라이밍된 세포 (여기서 원래 체세포 유형은 섬유모세포임)와 비교할 때 나이브-투-프라이밍된 및 TNT-프라이밍된 iPSC를 신경 줄기 세포 (NSC)로 분화하는 동안 나타나는 섬유모세포-유사 세포의 수가 더 적음;

· 유전적으로 일치하는 ESC와 상이한 세포 유형으로 유사한 분화 효율.

세포

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성(pluripotent)" 또는 "다능성(pluripotency)"은, 적절한 조건 하에, 3가지 배아층 (germinal layer) (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 세포 계통과 연관된 특성을 집합적으로 나타내는 세포 유형으로, 분화할 수 있는 자손을 생성하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 다능성 줄기 세포는 출생 전, 출생 후 또는 성체 동물의 많은 또는 모든 조직에 기여할 수 있다. 8-12주령 SCID 마우스에서 기형종(teratoma)을 형성하는 능력과 같이 관련 기술분야에서 허용되는 표준 시험을 사용하여 세포 집단의 다능성을 확립할 수 있으나, 다양한 다능성 줄기 세포 특성의 확인이 또한 다능성 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "다능성 상태", "다능성 줄기 세포 특성" 또는 "다능성 세포의 하나 이상의 특성"에 대한 언급은 다능성 줄기 세포를 다른 세포와 구별하는 세포의 특성을 지칭한다. 적절한 조건 하에, 3가지 배아층 (germinal layer) (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 세포 계통과 연관된 특성을 집합적으로 나타내는 세포 유형으로, 분화할 수 있는 자손을 생성하는 능력은 다능성 줄기 세포의 특성이다. 분자 마커의 특정 조합의 발현 또는 비발현이 또한 다능성 줄기 세포 특성이다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포는 하기 비제한적 목록의 마커 중 적어도 1, 2 또는 3개, 및 임의로 모두를 발현한다: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, SO2, E-카드헤린(cadherin), UTF-1, OCT4 (POU5F1), REX1, 및 NANOG.

다능성 줄기 세포와 연관된 세포 형태는 또한 다능성 줄기 세포 특성이다. 다능성 세포는 전형적으로 자기-재생 능력, 3개의 배엽층의 세포 유형을 생성하는 능력 및 OCT4 (POU5F1), NANOG 및 SOX2와 같은 다능성 마커의 발현을 특징으로 한다. 다능성 세포는 전형적으로 분명한 경계를 가진 편평한 (프라이밍 상태일 때) 또는 돔-형상인 (나이브 상태일 때) 콜로니에서 성장한다. 이것은 체세포, 예를 들어 크고 길쭉한 섬유모세포의 형태와 대조될 수 있다. 나이브 및 프라이밍된 다능성 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커는: OCT4 (POU5F1), SOX2, NANOG, KLF4, EPCAM, 및 PRDM14를 포함한다.

나이브 다능성 세포에 의해서만 발현되거나 프라이밍된 다능성 세포에 의해서만 발현되는 마커는 본원의 표 5에 열거되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 말단 분화되지 않은 세포를 지칭하며, 즉 보다 특정한, 특수화된 기능을 갖는 다른 세포 유형으로 분화할 수 있다. 상기 용어는 배아 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 수임(committed)/전구체 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 오르가노이드는 줄기 세포 또는 기관 전구체로부터 발달하고, 생체내와 유사한 방식으로 세포 분류 및 공간적으로 제한된 계통 투입(lineage commitment)을 통해 자기-조직화되고, 다음을 포함한 특성을 나타내는 기관-특이적 세포 유형의 집합체이다: 다수 기관-특이적 세포 유형; 기관의 일부 특정 기능 (예를 들어, 수축, 신경 활동, 내분비 분비, 여과, 배설)을 반복할 수 있음; 그의 세포는 함께 그룹핑되고 기관과 유사하게 공간적으로 조직화된다. 오르가노이드는 다양한 질환 프로세스, 약물 스크리닝, 및 상이한 환경 자극에 대한 반응을 포함한 기본적인 생물학적 프로세스를 연구하는 도구로서 사용될 수 있다.

T어 "CG" 또는 "CpG"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 시토신 뉴클레오티드가 DNA 분자 내의 염기의 선형 서열 (선형 가닥)에서 구아닌 뉴클레오티드의 상류에서 발생하는 DNA 분자의 영역을 지칭한다. DNA 분자에서 선형 가닥을 형성하는 뉴클레오티드는 인산염을 통해 연결된다. 따라서 CG 부위는 CpG 부위로도 지칭된다. CpG 표기법은 시토신과 구아닌의 선형 서열을 시토신과 구아닌의 CG 염기-쌍형성(pairing)과 구별하기 위해 추가로 사용되며, 여기서 시토신과 구아닌은 DNA 분자의 반대 가닥에 위치한다. CpG 디뉴클레오티드의 시토신은 메틸화되어 5-메틸시토신을 형성할 수 있다. 포유동물에서, 유전자 내에서 시토신을 메틸화하면 유전자가 턴오프(turn off)될 수 있다. DNA 분자 내의 시토신에 메틸 기를 부가하는 효소를 DNA 메틸트랜스퍼라제라고 지칭한다.

비-CpG 부위는 시토신 뉴클레오티드가 구아닌이 아닌 뉴클레오티드의 상류에서 발생하는 DNA 분자의 선형 서열이다. 비-CpG 시토신 메틸화는 뉴클레오티드가 CG 디뉴클레오티드 서열의 일부를 형성하지 않는 시토신 부위에서 발생할 수 있다.

DNA 메틸화는 구아닌 (CpG 부위)에 인접하여 발견될 때 시토신 뉴클레오티드에서 주로 발생하는, 유전자 침묵과 연관된 후생유전학적 표시이다. CpG 부위는 특정 게놈 영역에서 클러스터링을 나타낸다. CpG 밀도가 높은 이들 클러스터는 CpG 섬으로 공지되어 있으며, 종종 유전자 프로모터 영역에서 발견된다. 비록 정확한 메커니즘은 아직 정의되지 않았지만, 메틸화가 유전자 침묵의 "기억" 표시를 제공하며, 한편 전사 차단은 연관된 히스톤 변형에 의해 수행된다는 증거가 있다.

CpG 부위는 또한 DNA의 비코딩(noncoding) 게놈 영역과 유전자 본체 내에서 발견된다. 여기서, 메틸화는 DNA 안정화와 LINE1과 같은 전위 요소의 움직임 방지에 중요한 역할을 한다. LINE1은 인간 게놈에서 풍부하게 발견되는 레트로트랜스포손(retrotransposon)이며, 게놈의 17.88%에 상응하는 대략 500,000개 카피가 있다. 게놈에 풍부하기 때문에, LINE1 메틸화는 전체적인 DNA 메틸화에 대한 대리 척도로서 검증되었다.

iPSC를 생성하는 선행 기술 방법은 ESC의 게놈과 비교하여 고(hyper)- 또는 저-메틸화된 DMR을 포함하는 CpG 부위를 발생시킬 수 있다. 비-CpG 과대메틸화된 DMR은 인간 ESC의 상응하는 영역에 비해 메틸화된 비-CpG 부위가 더 많은 프라이밍된 iPSC 게놈의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 지칭한다 (여기서 iPSC는 선행 기술의 방법에 의해 수득됨). 비-CpG 저메틸화된 DMR은 인간 ESC의 상응하는 영역에 비해 메틸화된 비-CpG 부위가 더 적은 프라이밍된 iPSC 게놈 (여기서 iPSC는 선행 기술의 방법에 의해 수득됨)의 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)을 지칭한다. 비-CpG 저메틸화 또는 고메틸화 DMR은 전형적으로 길이가 약 100 bp 내지 4000 kb이다.

유사하게, iPSC를 생성하는 선행 기술 방법은 고메틸화된 CG-DMR 및 저메틸화된 CG-DMR를 발생시킬 수 있다. CpG 고메틸화 또는 저메틸화된 DMR은 전형적으로 길이가 약 100 bp에서 4000 kb이다.

본 발명의 방법은 통상적인 방법을 사용하여 수득된 iPSC에서 관찰된 하나 이상의 비정상의 DMR의 수정을 가능하게 한다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 임의의 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 iPSC는 ESC에 대한 동일한 유전자좌에서의 DNA 메틸화 프로파일과 더 밀접하게 비슷한 전위 요소에 대해 CpG DNA 메틸화 수준, 비-CpG 메틸화 수준 및/또는 CpG DNA 메틸화 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 유전자좌는 본원의 표 3 또는 표 4 중 어느 하나에 정의된 영역 중 하나 이상이다.

임의의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 ESC에서와 동일하거나 실질적으로 동일한 LINE1 레트로트랜스포손에서 메틸화 수준을 갖는 iPSC를 제공한다.

불완전한 iPSC 재프로그래밍과 연관된 CpG 고- 또는 저메틸화 DMR의 비제한적 예는 본원에 참조로 포함된 US 9,428,811에 기재되어 있다. US 9,428,811에 기재된 DMR 중 하나 이상이 본 발명에 따라 체세포를 재프로그래밍함으로써 수정된다는 것이 이해될 것이다.

ESC의 등가 시그니처와 관련된 세포의 후생유전체 시그니처를 확인하는 방법은 또한 US 9,428,811에 기재되어 있으며, 본 발명의 방법에 따라 사용되어, 생성된 iPSC (또는 본 발명의 방법의 공정 동안 수득된 중간체)가 ESC와 유사한 후생유전체 프로파일을 갖는다는 것을 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 통상의 기술자는 세포가 저메틸화되었거나 ESC의 것과 비슷한 후생유전체 상태로 전이되었으며 제3 배양 배지로 전이될 수 있음을 확인하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이, 제2 배양 배지와 접촉된 세포의 후생유전체 프로파일을 결정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 체세포는 저메틸화를 촉진하도록 조정된 제2 배양 조건 또는 배양 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함하여, 다능성 상태로 재프로그래밍된다. 조건은 나이브 다능성 상태를 촉진하는 배지의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 세포가 나이브 다능성 상태에 도달하기 전에, 세포는 바람직하게는 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하기 위해 제3 배양 조건/배지로 전이된다는 것이 이해될 것이다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 제2 배양 배지와 접촉되거나 제2 배양 조건에 노출된 세포는, 제3 배양 배지와 접촉되기 전에 게놈 전반에 걸친 저메틸화를 갖는다. 바람직하게는 게놈 전반에 걸친 저메틸화는 프라이밍된 다능성 줄기 세포의 메틸화 상태보다 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 이하, 바람직하게는 50% 이하이다.

저메틸화는 통상적인 (프라이밍된) PSC에서 손실되는 인간 배아의 원시 세포의 구별되는 특성이다. 세포는 본 발명의 방법에 따라, 나이브 배지에 일시적으로 노출된 것에 반응하여 전체적인 탈메틸화를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 세포는 CpG 게놈 전반에 걸친 메틸화에서 적어도 10-90%, 바람직하게는 적어도 약 50%의 감소를 나타낼 수 있다. 메틸화 수준은 나이브 배지와 접촉되지 않은 프라이밍된 iPSC의 메틸화와 비교하여 측정할 수 있다. 메틸화 수준은 뉴클레오시드 질량 분석법 또는 심층 서열분석과 커플링된 중아황산염 전환에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명에 따라 제2 배양 배지와 접촉된 세포는 또한 제2 배양 배지와 접촉되지 않은 프라이밍된 iPSC와 비교하여, H3K9me3과 같은 유전자 침묵과 연관된 히스톤 변형의 더 낮은 수준을 가질 수 있다. 히스톤 변형 수준은 심층 서열분석 (ChIP-seq)과 커플링된 정량적 면역염색 또는 염색질 면역침전에 의해 측정될 수 있다.

나이브 상태의 여성 세포는 X 염색체의 가역적 후생유전학적 소거, 보다 구체적으로 X 염색체의 탈메틸화 및 XX 나이브 세포, 바람직하게는 XX 세포의 80% 이상에서 H3K27me3 병소의 부재를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포의 나이브 상태로부터 프라이밍된 상태로의 전환은 대부분의 세포에서, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70% 또는 그 초과까지 H3K27me3 병소를 회복시킨다.

통상의 기술자는 줄기 세포와 관련하여 용어 "나이브" 및 "프라이밍된"에 익숙할 것이다. 이들 용어는 배반엽상피 개체발생의 초기 및 후기 단계를 설명하고 ESC 및 EpiSC 유도체를 설명하기 위해 10년 초과 전에 확인되었다. 본원에 사용된 바와 같이, 나이브 다능성 상태는 착상 전 배아와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다. 일부 상황에서, 용어 "나이브 상태"는 용어 "기본 상태(ground state)와 상호교환적으로 사용된다. 나이브 상태 세포는 체세포와 비교하여 실질적으로 후생유전학적으로 재설정되고 착상 전(pre-implantation) 배반엽상피의 발달적 정체성 및 기능적 능력을 갖는 균질한 다능성 줄기 세포의 안정적인 자기-재생 배양이다.

특정 실시양태에서, 나이브 다능성 세포는 착상 전 배반엽상피 특이적 전사 인자의 mRNA 및 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 나이브 세포는 KLF2, KLF4, TFCP2L1, TBX3, REX1, GBX2, STELLA (DPPA3), KLF17, DPPA3, DPPA5, TFCP2L1, MAEL, UTF1, ZFP57, DNMT3L, FGF4, FOXR1, ARGFX, TRIM60, DDX43, BRDT, ALPPL2, KHDC3L, KHDC1L 및 PRAP1 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 모두를 발현할 수 있다. 나이브 다능성 상태의 지표가 되는 다른 마커는 표 5에 나타냈다.

특정 실시양태에서, 프라이밍된 다능성 세포는 착상 후 배반엽상피 특이적 전사 인자의 mRNA 및 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 프라이밍된 세포는 SFP, EOMES, BRACHYURY, OTX2, ZIC2, ZIC3, ZIC5, DNMT3B, KDR, CDH2, CER1, COL2A1, DAZL, TCF7L1, SOX11, SALL2 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 모두를 발현할 수 있다. 프라이밍된 다능성 상태의 지표가 되는 다른 마커는 표 5에 나타냈다.

나이브 및 프라이밍된 다능성 상태를 확인한 이후로, 두 상태 모두에서 다능성 세포를 유지하기에 적합한 다수의 상이한 배양 배지가 개발되었다. 통상의 기술자는 이러한 배지에 익숙할 것이며, 그의 예는 여기에 추가로 제공된다.

더욱이, 나이브 세포는 그들의 형태에 의해 특징지어질 수 있다. 나이브 표현형은 전형적으로 빽빽하게-채워진, 둥근 돔의 외관을 특징으로 한다. 세포는 또한 조밀한 굴절성 콜로니를 형성하는 것으로 기술될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라서, 제2 배양 배지에서 배양되는 세포는 이들이 제3 배양 배지로 전이될 때 나이브 세포의 전형적인 형태가 발달하지 않았다.

본원에 사용된 바와 같이, "나이브 다능성 상태" 또는 "나이브 다능성 표현형"은 둥근 돔-형상인 세포를 포함하는 세포 표현형을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 나이브 다능성 상태는 착상 전 배아와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 "프라이밍된 다능성 상태" 또는 "프라이밍된 다능성 표현형"은 전형적으로 분명한 경계를 갖는 편평한 세포 콜로니의 존재를 특징으로 하는 세포 표현형을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 프라이밍된 다능성 상태는 착상 후 배아의 배반엽상피와 더 밀접하게 비슷한 다능성 상태를 지칭한다.

"유도 다능성 줄기 세포"는 비-다능성 세포로부터 인공적으로 유래된 다능성 줄기 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "비-다능성 세포"는 다능성 세포가 아닌 포유동물 세포를 지칭한다. 용어 "비-다능성 세포", "체세포" 및 "분화된 세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 세포의 예는 분화된 세포뿐만 아니라 전구 세포를 포함한다. 분화된 세포의 예는 골수, 피부, 골격근, 지방 조직 및 말초 혈액으로부터 선택된 조직으로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 세포 유형은 섬유모세포, 간세포, 근모세포(myoblast), 뉴런, 조골세포, 파골세포, 및 T-세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 방법에 따르면, 임의의 비-다능성 세포 (즉, 임의의 분화된 또는 체세포)가 iPSC를 생성하기 위한 출발 세포로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 추가로, 본 발명에 따라 수득가능하거나 수득된 iPSC는 비-다능성 상태로 분화될 수 있다.

체세포는 성체 세포 또는 성체 또는 비-배아 세포의 하나 이상의 검출가능한 특성을 나타내는 성체로부터 유래된 세포일 수 있다. 질병에 걸린 세포는 질환 또는 병태의 하나 이상의 검출가능한 특성을 나타내는 세포일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "체세포"는 말단 분화된 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "체세포"는 생식계열 세포와 대조적으로, 유기체의 신체를 형성하는 임의의 세포를 지칭한다. 포유동물에서, 생식계열 세포 ("생식자(gamete)"라고도 공지됨)는 수정 중에 융합되어 전체 포유동물 배아가 발달하는 접합체라고 칭해지는 세포를 제조하는 정자와 난자이다. 포유동물 신체의 다른 모든 세포 유형은 - 정자와 난자, 그것들이 만들어지는 세포 (생식모세포(gametocyte) 및 미분화 줄기 세포를 제외하고 - 체세포이다: 내부 기관, 피부, 뼈, 혈액, 및 결합 조직은 모두 체세포로 구성되어 있다. 일부 실시양태에서 체세포는 "비-배아 체세포"이며, 이는 배아에 존재하지 않거나 배아로부터 수득되지 않고 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 생기지 않는 체세포를 의미한다. 일부 실시양태에서 체세포는 "성체 체세포"이며, 이는 배아 또는 태아 이외의 유기체에 존재하거나 그로부터 수득되거나 시험관내에서 이러한 세포의 증식으로부터 생긴 세포를 의미한다. 체세포는, 예를 들어, 텔로머라제 역전사효소 (TERT)의 수준을 증가시킴으로써 세포의 무제한 공급을 제공하기 위해 불멸화될 수 있다. 예를 들어, TERT의 수준은 내인성 유전자로부터 TERT의 전사를 증가시킴으로써, 또는 임의의 유전자 전달 방법 또는 시스템을 통해 트랜스진을 도입함으로써 증가될 수 있다.

인간, 개체를 포함한, 태아, 신생아, 청소년 또는 성체 영장류로부터의 세포를 포함한, 분화된 체세포는 본 발명의 방법에서 적합한 체세포이다. 적합한 체세포는 골수 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유모세포 세포, 조혈 세포, 각질형성세포, 간 세포, 장 세포, 중간엽 세포, 골수 전구체 세포 및 비장 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 체세포는 자체 증식하고 혈액 줄기 세포, 근육/뼈 줄기 세포, 뇌 줄기 세포 및 간 줄기 세포를 포함한, 다른 유형의 세포로 분화할 수 있는 세포일 수 있다. 적합한 체세포는 전사 인자를 코딩하는 유전 물질을 포함한 전사 인자의 흡수를 수용하거나, 과학 문헌에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 수용적으로 만들 수 있다. 흡수-증진 방법은 세포 유형 및 발현 시스템에 따라 달라질 수 있다. 적합한 형질도입 효율을 갖는 수용 체세포를 제조하기 위해 사용되는 예시적인 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 시작 체세포는 약 24시간의 배가 시간을 가질 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포 (바람직하게는 진피 섬유모세포 또는 심장), 각질형성세포 (바람직하게는 표피 각질형성세포), 단핵구 또는 내피 세포이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된 세포"는 그것이 원래 발견된 유기체로부터 제거된 세포 또는 그러한 세포의 후손을 지칭한다. 임의로 세포는 예를 들어 다른 세포의 존재 하에 시험관내에서 배양되었다. 임의로 세포는 나중에 제2 유기체에 도입되거나 그것이 단리된 유기체 (또는 세포가 유래된 세포)에 재도입된다.

본원에 사용된 바와 같은 단리된 세포 집단과 관련하여 용어 "단리된 집단"은 혼합 또는 이종 세포 집단으로부터 제거 및 분리된 세포 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 세포가 그로부터 단리되거나 농축화된 이종 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 세포 집단이다.

통상의 기술자는 또한 체세포가 체세포의 전형적인 형태적 특성을 손실할 때 체세포가 다능성 상태로 재프로그래밍을 시작했을 때를 결정할 수 있을 것이다. 다시 말하자면, 통상의 기술자는 섬유모세포를 포함한 체세포의 형태학적 특성에 익숙할 것이다.

체세포는 또한 다능성 세포의 적어도 하나의 특성을 나타낼 때 다능성 상태로 재프로그래밍되는 것으로 결정될 수 있다. 다능성 세포 (예를 들어, iPSC 또는 ESC)의 하나 이상의 특성은 임의의 하나 이상의 ESC 마커의 상향-조절 및/또는 세포 형태의 변화를 포함한다. 전형적으로 iPSC/ESC-유사 세포로 전환된 세포는 iPSC/ESC의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 특성을 나타낼 것이다.

개체가 생성된 다능성 세포, 또는 그로부터 유래된 분화된 세포로 처리되어야 하는 일부 실시양태에서, 개체 자신의 비-다능성 세포를 사용하여 본 발명의 방법에 따른 다능성 세포를 생성한다.

세포는, 예를 들어, 인간 또는 인간이 아닌 포유동물로부터의 것일 수 있다. 예시적인 비인간 포유동물은 마우스, 래트, 고양이, 개, 토끼, 기니피그, 햄스터, 양, 돼지, 말 및 소를 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

재프로그래밍

통상의 기술자는 다능성 상태로의 체세포의 재프로그래밍을 촉진하기 위한 표준 기술에 익숙할 것이다.

체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 체세포의 재프로그래밍은 전형적으로 재프로그래밍 인자 (전사 인자 포함)의 발현에 이어서, 분화 마커의 손실 및 다능성 마커의 획득을 촉진하기 위한 특정한 조건에서의 배양을 포함한다.

체세포를 재프로그래밍하기 위한 적합한 방법의 예는 관련 기술분야에 충만하며, WO 2009/101407, WO 2014/200030, WO 2015/056804, WO 2014/200114, WO 2014/065435, WO 2013/176233, WO 2012/060473, WO 2012/036299, WO 2011/158967, WO 2011/055851, WO 2011/037270, WO 2011/090221에 예시되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 방법에 따라 체세포 (예를 들어, 섬유모세포)를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 특히 바람직한 전사 인자, 및 이의 핵산 서열을 하기 표 1에 나타냈다. 그러나, 본 발명은 체세포를 재프로그래밍하기 위해 표 1에 언급된 전사 인자의 사용에 제한되지는 않는다는 것이 이해될 것이다.

본원에 언급되는 전사 인자 및 기타 단백질 인자는 HUGO 유전자 명명 위원회(Gene Nomenclature Committee) (HGNC) 기호에 의해 언급된다. 표 1은 본원에 언급된 전사 인자에 대한 예시적인 앙상블 유전자(Ensemble Gene) ID 및 유니프롯(Uniprot) ID를 제공한다. 뉴클레오티드 서열은 앙상블l 데이터베이스 (Flicek et al. (2014). Nucleic Acids Research Volume 42, Issue D1. Pp. D749-D755) 버전 83으로부터 유래된다. 또한, 본 발명에 사용하기 위해 고려되는 것은 본원에 언급된 전사 인자의 임의의 변이체, 상동체, 오르토로그 또는 파라로그이다.

통상의 기술자는 또한 (프라이밍된 다능성 상태와 비교하여) 나이브 다능성 상태로 체세포를 재프로그래밍하는 능력에 익숙할 것이다. 본 발명의 방법은 나이브 또는 프라이밍된 다능성 상태로의 재프로그래밍을 촉진하도록 처리된 세포에 적용되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 방법은 체세포를 나이브 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위해 체세포에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현을 증가시키는 것을 포함한다.

통상의 기술자는 이 정보가 예를 들어 체세포에서 전사 인자의 증가된 양을 제공하거나 체세포에서 전사 인자를 재조합적으로 발현하기 위한 핵산 (재조합 폴리뉴클레오티드 포함) 등을 제공할 목적으로 본 발명의 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

<표 1>

본원에 지칭된 전사 인자의 예시적인 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 확인하는 수탁 번호.

본 발명은 본원에 기재된 전사 인자의 변이체의 사용을 고려한다. 변이체는 전장(full length) 폴리펩티드의 단편 또는 자연 발생 스플라이스 변이체일 수 있다. 변이체는 폴리펩티드의 단편과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드일 수 있으며, 여기서 단편은 전장 야생형 폴리펩티드 또는 그의 도메인이 표적 세포 유형으로 체세포 유형의 전환을 촉진하는 능력과 같은 관심의 기능적 활성을 갖는 한 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 이다. 일부 실시양태에서, 도메인은 서열의 임의의 아미노산 위치에서 시작하여 C-말단을 향해 연장되는 길이가 적어도 100, 200, 300, 또는 400개 아미노산이다. 단백질의 활성을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 관련 기술분야에 공지된 변형은 피하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 변이체에는 전장 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단 부분이 결여되어 있으며, 예를 들어 어느 한 말단으로부터 10, 20, 또는 50개 이하의 아미노산이 결여되어 있다. 일부 실시양태에서 폴리펩티드는 성숙한 (전장) 폴리펩티드의 서열을 가지며, 이는 정상적인 세포내 단백질분해 처리 동안 (예를 들어, 동시-번역 또는 번역 후 처리) 동안 신호 펩티드와 같은 하나 이상의 부분이 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 단백질을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제하는 것에 의한 것이 아닌 단백질을 제조하는 일부 실시양태에서, 단백질은 키메라 폴리펩티드이며, 이는 이것이 2종 이상의 상이한 종으로부터의 부분을 함유함을 의미한다. 단백질을 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제하는 것에 의한 것이 아닌 단백질을 제조하는 일부 실시양태에서, 단백질은 유도체이며, 이는 단백질이 단백질과 관련이 없는 추가 서열을 포함하는 것을 의미하며, 이는 그러한 서열이 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 한이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 폴리펩티드 변이체, 단편, 또는 유도체가 관련 기술분야에 공지된 검정을 사용하여 기능적인지 여부를 알고 있거나, 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, 체세포를 표적 세포 유형으로 전환시키는 전사 인자의 변이체의 능력은 실시예에서 본원에 개시된 바와 같은 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 편리한 검정은 루시페라제와 같은 검출가능한 마커를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 전사 인자 결합 부위를 함유하는 리포터 구축물(construct)의 전사를 활성화하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 기능적 변이체 또는 단편은 전장 야생형 폴리펩티드의 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과를 갖는다.

전사 인자의 양을 증가시키는 것과 관련하여 용어 "양을 증가시킨다"는 관심 세포 (예를 들어, 섬유모세포와 같은 체세포)에서 전사 인자의 양을 증가시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자의 양은 전사 인자의 양이 대조군 (예를 들어, 상기 발현 카세트 중 어느 것도 도입되지 않은 섬유모세포)에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과일 때 관심 세포(예: 하나 이상의 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하는 발현 카세트가 도입된 세포)에서 "증가된다. 그러나, 전사 인자 (또는 이를 코딩하는 프리(pre)-mRNA 또는 mRNA)의 전사, 번역, 안정성 또는 활성의 양, 속도 또는 효율을 증가시키는 임의의 방법을 포함한 전사 인자의 양을 증가시키는 임의의 방법이 고려된다. 게다가, 전사 발현의 음성 조절인자의 하향-조절 또는 간섭, 기존 번역 (예를 들어, SINEUP)의 효율성 증가가 또한 고려된다.

본 발명은 재조합 유전학 분야의 일상적인 기술에 의존한다. 본 발명의 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 텍스트는 문헌 [Sambrook et al.,　Molecular Cloning, A Laboratory Manual　(3rd ed. 2001); Kriegler,　Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual　(1990)]; 및 [Current 프로토콜s in Molecular Biology　(Ausubel et al., eds., 1994))]을 포함한다.

2개 이상의 단백질이 세포에서 발현되어야 하는 경우, 하나 또는 다중 발현 카세트가 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 발현 카세트가 다중 폴리펩티드를 발현하는 경우, 폴리시스트론 발현 카세트가 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 재프로그래밍 전사 인자 단백질을 코딩하는 발현 카세트는 벡터의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 예시적인 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 및 바이러스 벡터 (아데노바이러스, AAV, 또는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함한다.

핵산 및 벡터

본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 핵산 또는 벡터는 표 1에서 상기 언급된 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

용어 "발현"은 해당되는 경우, 예를 들어, 전사, 번역, 접힘, 변형 및 처리를 포함하나 이에 제한되지 않는, RNA 및 단백질 생성 및 적절한 경우 단백질 분비에 관련된 세포 프로세스를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된" 또는 "부분적으로 정제된"은, 핵산 또는 폴리펩티드의 경우에, 그의 천연 공급원에서 발견되는 바와 같은 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하고/하거나 세포에 의해 발현될 때 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하거나 분비된 폴리펩티드의 경우에 분비될 것인 적어도 하나의 다른 성분 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 시험관내 전사/번역을 사용하여 합성된 것은 "단리된" 것으로 간주된다.

용어 "벡터"는 숙주 또는 체세포로의 도입을 위해 DNA 서열이 삽입될 수 있는 운반체 DNA 분자를 의미한다. 바람직한 벡터는 이들이 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지향할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 따라서, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 관심 유전자의 발현에 필요한 필수 조절 영역을 함유하는 특수화된 벡터이다. 일부 실시양태에서, 관심 유전자는 벡터 내의 또 다른 서열에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터가 사용된다면, 바이러스 벡터는 복제 결함이 있는 것이 바람직하며, 이는 예를 들어 복제를 코딩하는 모든 바이러스 핵산을 제거함으로써 달성될 수 있다. 복제 결함 바이러스 벡터는 여전히 그의 감염 특성을 유지하고 복제 아데노바이러스 벡터와 유사한 방식으로 세포에 유입되나, 일단 세포에 유입되면 복제 결함 바이러스 벡터는 번식하거나 증식하지 않는다. 벡터는 또한 리포솜 및 나노입자 및 DNA 분자를 세포에 전달하기 위한 기타 수단을 포함한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열의 발현에 영향을 미치도록 코딩 서열에 대해 적절한 위치에서 DNA 분자에 위치하는 것을 의미한다. 이와 동일한 정의가 때때로 발현 벡터에서 코딩 서열 및 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)의 배열에 적용된다. 용어 "작동적으로 연결된"은 발현될 폴리뉴클레오티드 서열 앞에 적절한 시작 신호 (예를 들어, ATG)를 갖고, 발현 제어 서열의 제어 하에 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 정확한 판독 프레임을 유지하고, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 원하는 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함한다.

용어 "바이러스 벡터"는 세포 내로 핵산 구축물의 운반체로서 바이러스, 또는 바이러스-연관 벡터의 사용을 지칭한다. 구축물은 감염 또는 세포로의 형질도입을 위해, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함한, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 또는 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 또는 기타와 같은 복제되지 않는 결함이 있는 바이러스 게놈에 통합 및 패키징될 수 있다. 벡터는 세포의 게놈에 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 구축물은 원하는 경우 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 구축물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들어 EPV 및 EBV 벡터에 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노바이러스"는 아데노비리다 과의 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드와 이중-가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기 (90-100 nm)의 외피가 없는 (네이키드) 정20면체 바이러스이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "비-통합 바이러스 벡터"는 숙주 게놈 내로 통합되지 않는 바이러스 벡터를 지칭하고; 바이러스 벡터에 의해 전달되는 유전자의 발현은 일시적이다. 숙주 게놈에 통합이 거의 또는 전혀 없기 때문에 비-통합 바이러스 벡터는 게놈의 무작위 지점에 삽입하여 DNA 돌연변이를 생성하지 않는 이점이 있다. 예를 들어, 비-통합 바이러스 벡터는 염색체 외부에 남아 있고 그 유전자를 숙주 게놈에 삽입하지 않아, 잠재적으로 내인성 유전자의 발현을 방해한다. 비-통합 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 알파바이러스, 피코르나바이러스 및 백시니아 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 바이러스 벡터는 그들 중 임의의 것이 일부 드문 상황에서 바이러스 핵산을 숙주 세포의 게놈에 통합할 수 있는 가능성에도 불구하고, 용어가 본원에 사용된 바와 같이 "비-통합" 바이러스 벡터이다. 중요한 것은 본원에 기재된 방법에 사용된 바이러스 벡터가 대체로 또는 이용된 조건 하에 그의 수명 주기의 주요 부분으로서 그들의 핵산을 숙주 세포의 게놈에 통합하지 않는다는 것이다.

본원에 기재된 벡터는 요법에 사용하기 위한 그의 안전성을 증가시키고, 원하는 경우 선택 및 농축화 마커를 포함하고, 그에 함유된 뉴클레오티드 서열의 발현을 최적화하기 위해 과학 문헌에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 구축 및 조작될 수 있다. 벡터는 벡터가 체세포 유형에서 자기-복제할 수 있도록 하는 구조적 구성요소를 포함해야 한다. 예를 들어, 공지된 엡슈타인 바(Epstein Barr) oriP/핵 항원-1 (EBNA-I) 조합 (예를 들어, 그 전문이 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된 문헌 [Lindner, S.E. and B. Sugden, The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human 세포, Plasmid 58:1 (2007)] 참조)은 벡터 자기-복제를 지원하기에 충분하며 포유동물, 특히 영장류 세포에서 기능하는 것으로 공지된 다른 조합이 또한 이용될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 발현 벡터의 구축물을 위한 표준 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며 그 전문이 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된 간행물 [Sambrook J, et al., "Molecular cloning: a laboratory manual," (3rd ed. Cold Spring harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001)]에서 찾을 수 있다.

본 발명의 방법에서, 전환에 필요한 관련 전사 인자를 인코딩하는 유전 물질은 하나 이상의 재프로그래밍 벡터를 통해 체세포 내로 전달된다. 각각의 전사 인자는 체세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 트랜스진(transgene)으로서 체세포에 도입될 수 있다.

적합한 재프로그래밍 벡터는 플라스미드와 같은 에피솜 벡터를 포함하여 본원에 기재된 임의의 것으로, 감염성 또는 복제-적격 바이러스를 생성하기에 충분한 바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 코딩하지 않지만, 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 수득된 구조적 요소를 함유할 수 있다. 하나 또는 복수개의 재프로그래밍 벡터가 단일 체세포에 도입될 수 있다. 하나 이상의 트랜스진이 단일 재프로그래밍 벡터에 제공될 수 있다. 하나의 강력한 구성적 전사 프로모터는 발현 카세트로서 제공될 수 있는 복수개의 트랜스진에 대한 전사 제어를 제공할 수 있다. 벡터 상의 별도의 발현 카세트는 별도의 강력한 구성적 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있으며, 이는 동일한 프로모터의 카피일 수 있거나 구별되는 프로모터일 수 있다. 다양한 이종 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 전사 인자의 원하는 발현 수준과 같은 인자에 따라 사용될 수 있다. 하기에 예시된 바와 같이, 세포에서 별개의 강도를 갖는 별개의 프로모터를 사용하여 별개의 발현 카세트의 전사를 제어하는 것이 유리할 수 있다. 전사 프로모터를 선택할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 프로모터(들)가 침묵하는 속도이다. 통상의 기술자는 유전자(들)의 생성물이 재프로그래밍 방법에서 그 역할을 완료하거나 실질적으로 완료한 후 하나 이상의 트랜스진 또는 트랜스진 발현 카세트의 발현을 감소시키는 것이 유리할 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 프로모터는 인간 EF1α 신장 인자 프로모터, CMV 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터 및 CAG 닭 알부민 프로모터, 및 다른 종으로부터의 상응하는 상동 프로모터이다. 인간 체세포에서 EF1α와 CMV는 둘 다 강력한 프로모터이나, CMV 프로모터는 EF1α 프로모터보다 더 효율적으로 억제되어 전자의 제어 하에 있는 트랜스진의 발현이 후자의 제어 하에 있는 트랜스진의 발현보다 더 빨리 턴오프된다. 전사 인자는 재프로그래밍 효율을 조정하기 위해 변할 수 있는 상대적 비로 체세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 복수개의 트랜스진이 단일 전사체 상에 인코딩되는 경우, 내부 리보솜 진입 부위는 전사 프로모터로부터 원위인 도입유전자(들)의 상류에 제공된다. 인자의 상대적 비가 전달된 인자에 따라 달라질 수 있긴 하지만, 본 개시내용을 소유한 통상의 기술자는 인자의 최적 비율을 결정할 수 있다.

통상의 기술자는 복수개의 벡터를 통하지 않고 단일 벡터를 통해 모든 인자를 도입하는 유리한 효율성이 있으나, 전체 벡터 크기가 증가함에 따라 벡터를 도입하는 것이 점점 더 어려워진다는 것을 이해할 것이다. 통상의 기술자는 또한 벡터 상의 전사 인자의 위치가 그의 시간적 발현, 및 생성된 재프로그래밍 효율에 영향을 미칠 수 있음을 또한 이해할 것이다. 이와 같이, 출원인은 벡터의 조합에 대해 인자의 다양한 조합을 사용하였다. 재프로그래밍을 지원하기 위해 이러한 여러 조합이 여기에 표시된다.

재프로그래밍 벡터(들)의 도입 후 그리고 체세포가 재프로그래밍되는 동안, 도입된 트랜스진이 전사되고 번역되는 동안 벡터는 표적 세포에서 지속될 수 있다. 트랜스진 발현은 표적 세포 유형으로 재프로그래밍된 세포에서 유리하게 하향조절되거나 턴오프될 수 있다. 재프로그래밍 벡터(들)는 염색체외(extra-chromosomal)에 남을 수 있다. 극히 낮은 효율로, 벡터(들)는 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 하기 실시예는 예시를 위한 것이지만 본 발명을 제한하는 것은 결코 아니다.

본 발명과 함께 사용하기 위한 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 핵산 (예를 들어, DNA)이 본원에 기재된 바와 같거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같은 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입될 수 있는 거의 임의의 방법을 포함하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Stadtfeld and Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009)]). 이들 방법은 생체외 형질감염과 같은 DNA의 직접 전달 (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), 임의로 지질-기반 형질감염 시약 예컨대 퓨진(Fugene)6 (로슈(Roche)) 또는 리포펙타민 (인비트로겐(Invitrogen))과 함께, 주사에 의해 (미국 특허 번호 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 각각 본원에 참조로 포함됨), 미세주사 포함 (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; U.S. Pat. No. 5,789,215, 본원에 참조로 포함됨); 전기천공법에 의해 (U.S. Pat. No. 5,384,253, 본원에 참조로 포함됨; 문헌 [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984]); 인산칼슘 침전에 의해 (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985);(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); 직접 음파 로딩에 의해 (Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); 리포솜 매개 형질감염에 의해 (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) 및 수용체 매개 형질감염 (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); 및 이러한 방법의 임의의 조합을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.

세포 내로 회합된 분자의 도입을 매개할 수 있는 다수의 폴리펩티드가 이전에 기재되었으며 본 발명에 적합화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langel (2002) Cell 페네트라틴g Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Pharmacology and Toxicology Series]을 참조한다. 막을 통한 수송을 향상시키는 폴리펩티드 서열의 예는 초파리 동종단백질 안테나피디아 전사 단백질 (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34, 1991; Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8, 1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4, 1993), 단순 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22 (Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33, 1997); HIV-1 전사 활성화제 TAT 단백질 (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel and Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988); 카포시 FGF 신호 서열 (kFGF); 단백질 형질도입 도메인-4 (PTD4); 페네트라틴( Penetratin), M918, 트랜스포르탄(Transportan)-10; 핵 국소화 서열, PEP-1 펩티드; 양친매성 펩티드 (예를 들어, MPG 펩티드); 미국 특허 번호 6,730,293에 기재된 바와 같은 전달 증진 수송체 (30, 40, 또는 50개 아미노산의 인접 세트에서 적어도 5-25개의 인접 아르기닌 또는 5-25개 이상의 아르기닌을 포함하는 펩티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않음); 충분한, 예를 들어, 적어도 5개의 구아니디노 또는 아미디노 모이어티를 갖는 펩티드를 포함하나만 이에 제한되지는 않음); 및 상업적으로 입수가능한 페네트라틴(Penetratin)™ 1 펩티드, 및 프랑스 파리의 다이토스. 에스. 아,(Daitos S.A.)로부터 입수가능한 벡토셀(Vectocell)® 플랫폼의 다이아토스 펩티드 벡터 ("DPV")를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, WO/2005/084158 및 WO/2007/123667 및 여기에 설명된 추가 수송체를 참조한다. 이들 단백질은 원형질막을 통과할 수 있을 뿐만 아니라 본원에 기재된 전사 인자와 같은 다른 단백질의 부착은 이들 복합체의 세포 흡수를 자극하기에 충분하다. 작용제

본원에 사용된 바와 같은 용어 "작용제"는 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는, 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. "작용제"는 합성 및 자연-발생 단백질성 및 비단백질성 실체를 제한 없이 포함한, 임의의 화학물질, 실체 또는 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 앱타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물, 예를 들어, 제한 없이 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머, 및 그의 변형 및 조합 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 마크롤리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그의 유사체를 포함한 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로사이클릭 모이어티를 포함한다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지되어 있거나 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.

세포 또는 유기체에서 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 용어 "외인성"은 인공적 또는 자연적 수단에 의해 세포 또는 유기체에 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하거나; 또는 세포와 관련하여, 단리된 후 인공적 또는 자연적 수단에 의해 다른 세포 또는 유기체에 도입된 세포를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포로부터 유래하거나 유기체 또는 세포 내에서 자연적으로 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가 카피일 수 있다. 외인성 세포는 다른 유기체의 것일 수 있거나, 이는 동일한 유기체의 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 천연 세포의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 있거나, 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹된 것이다. 외인성 핵산은 또한 에피솜 벡터와 같은 염색체외일 수 있다.

체세포 유형을 다능성 상태로 재프로그래밍하는 데 필요한 하나 이상의 전사 인자의 양을 증가시키는 능력에 대해 하나 이상의 후보 작용제를 스크리닝하는 것은 전사 인자의 생성물 또는 발현을 허용하는 시스템을 후보 작용제와 접촉시키고 전사 인자의 양이 증가했는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 시스템은 생체내, 예를 들어 유기체의 조직 또는 세포, 또는 시험관내, 유기체 또는 시험관내 전사 검정으로부터 단리된 세포, 또는 세포 또는 조직의 생체외일 수 있다. 전사 인자의 양은 단백질 또는 RNA (예를 들어, mRNA 또는 pre-mRNA)의 양을 결정함으로써 직접 또는 간접적으로 측정할 수 있다. 후보 작용제는 전사 인자를 코딩하는 유전자의 전사의 임의의 단계를 증가시키거나 상응하는 mRNA의 번역을 증가시킴으로써 전사 인자의 양을 증가시키는 기능을 한다. 대안적으로, 후보 작용제는 전사 인자를 인코딩하는 유전자의 전사의 리프레서의 억제 활성 또는 전사 인자를 인코딩하는 mRNA 또는 전사 인자 자체의 단백질의 분해를 야기하는 분자의 활성을 감소시킬 수 있다.

적합한 검출 수단은 표지, 예컨대 방사성뉴클레오티드, 효소, 조효소, 형광제, 화학발광제, 발색체, 효소 기질 또는 보조인자, 효소 억제제, 보결분자단 복합체, 자유 라디칼, 입자, 염료 등의 사용을 포함한다. 이러한 표지된 시약은 방사선면역검정, 효소 면역검정, 예를 들어 ELISA, 형광 면역검정 등과 같은 널리 공지된 다양한 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 및 4,233,402를 참조한다.

본 발명의 방법은 고처리량 스크리닝 적용을 포함한다. 예를 들어, 전사 인자의 생성물 또는 발현을 허용하는 시스템의 분취량이 다중-웰 플레이트의 상이한 웰 내의 복수개의 후보 작용제에 노출되는 본 발명에 따른 검정 중 어느 하나를 포함하는 고처리량 스크리닝 검정이 사용될 수 있다. 추가로, 본 개시내용에 따른 고처리량 스크리닝 검정은 임의의 종류의 소형화된 분석 시스템에서 복수개의 후보 작용제에 노출되는 전사 인자의 생성물 또는 발현을 허용하는 시스템의 분취량을 포함한다.

본 개시내용의 방법은 플레이트, 마이크로칩 또는 슬라이드당 24, 48, 96 또는 384-웰과 같은 다중-웰 플레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 허용 되는 소형화 방법을 통해 검정 시스템에서 "소형화"될 수 있다. 검정은 유리하게 더 적은 양의 시약 및 기타 재료를 포함하는 마이크로칩 지지체 상에서 수행할 크기가 줄어들 수 있다. 고처리량 스크리닝에 도움이 되는 공정의 모든 소형화는 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 임의의 방법에서, iPSC, 또는 그로부터 유래된 분화된 세포는 체세포가 수득된 동일한 포유동물로 전달될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 방법에 사용되는 체세포는 자가 세포일 수 있으며, 즉 iPSC 또는 그로부터 유래된 분화된 세포가 투여될 동일한 개체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, iPSC 세포는 동종으로 다른 개체로 옮겨질 수 있다. 바람직하게는, 세포는 개체의 의학적 상태를 치료 또는 예방하는 방법에서 대상체에 자가조직이다.

세포 배양

다능성으로 유도될 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 배양될 수 있다. 일반 지침은 예를 들어 문헌 [Maherali, et al.,　Cell Stem Cell　3:595-605 (2008)]에서 찾을 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 피더 세포(feeder cell)와 접촉하여 배양된다. 예시적인 피더 세포는 섬유모세포, 예를 들어, 마우스 배아 섬유모세포 (MEF) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 피더 세포 상에서 세포를 배양하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 피더 세포의 부재 하에 배양된다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 분자 테더(tether)를 통해 고체 배양 표면 (예를 들어, 배양 플레이트)에 직접 부착될 수 있다. 본 발명자들은 세포가 피더 세포에서 배양된 다른 방식으로 동일하게 처리된 세포의 효율에 비해 고체 배양 표면에 직접 부착될 때 다능성으로 유도된 세포를 배양하는 것이 다능성으로의 유도 효율이 훨씬 더 크다는 것을 발견하였다(즉, 더 많은 부분의 세포가 다능성을 달성함). 예시적인 분자 테더는 마트리겔, 세포외 기질 (ECM), ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴, 또는 콜라겐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그러나 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이것이 비제한적인 목록이고 다른 분자를 사용하여 세포를 고체 표면에 부착할 수 있음을 인식할 것이다. 테더를 고체 표면에 초기 부착하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

통상의 기술자는 다음에 대한 배양 배지 조성 및 배양 조건에 익숙할 것이다:

· 다능성 상태로의 세포 재프로그래밍 촉진;

· 나이브 다능성 상태 촉진; 및

· 프라이밍된 다능성 상태 촉진.

한 실시양태에서, 나이브 다능성 상태와 같은 저메틸화된 DNA 상태를 촉진하기 위한 배지는 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제 및 ROCK 억제제를 포함한다.

MEK 억제제에 대한 언급은 일반적으로 MEK 억제제를 의미한다. MEK 억제제는 MEK1, MEK2 및 MEK5를 포함한 단백질 키나제의 MEK 패밀리의 임의의 구성원을 억제할 수 있다. 적합한 MEK 억제제의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 PD184352 및 PD98059, MEK1 및 MEK2 U0126 및 SL327의 억제제를 포함한다. 특히, PD184352와 PD0325901은 다른 공지된 MEK 억제제와 비교하여 특이성과 효능이 높은 것으로 밝혀졌다.

단백질 키나제 C (PKC) 억제제의 예는 G

6983 (3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 (Gschwendt et al., 1996 FEBS Lett 392:77-80)을 포함한다. 또 다른 바람직한 PKC 억제제는 Ro-31-8425이다. 바람직하게는 PKC 억제제는 배지에 0.01 내지 10 μM, 0.1 내지 5 μM, 바람직하게는 1 내지 4 μM의 일정 농도로 존재한다.

GSK3 억제에 대한 언급은 하나 이상의 GSK3 효소의 억제를 의미한다. GSK3 효소 패미리는 널리 공지되어 있으며 다수의 변이체가 설명되어 있다. 특정 실시양태에서, GSK3β는 억제된다. GSK3-α 억제제도 사용할 수 있다. 광범위한 GSK3 억제제가 공지되어 있으며, 예를 들어 억제제 CHIR 98014, CHIR 99021, AR-AO144-18, TZD-8, SB21676763 및 SB415286이다.

억제제는 통상적인 수단에 의해 또는 통상적인 공급원으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 제공되거나 수득될 수 있다. 억제제는 소분자 억제제 또는 간섭 RNA (RNAi)일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 키나제 억제제를 확인하기 위한 다양한 방법 및 검정에 익숙할 것이다.

STAT3 활성화제의 예는 LIF, 바람직하게는 hLIF를 포함한다.

MEK 억제제, GSK3 억제제 및 LIF의 조합은 2iL로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 ROCK 억제제는 Rho-결합 키나제의 억제제를 지칭한다. 이러한 억제제의 예는 트랜스-N-(4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카복사미드로도 공지되어 있는, ((1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥산 카르복사미드, 1-(5-이소퀴놀루닐) (설포닐) 호모피페라진 (1-(5-이소퀴놀리닐설포닐)호모피페라진)을 포함한다. 전형적으로 ROCK 억제제의 양은 약 0.1 내지 50 μM, 바람직하게는 약 1 내지 10 μM일 것이다.

발현 또는 활성의 "억제제", "활성화제" 및 "조정제"는 각각 기재된 표적 단백질의 발현 또는 활성에 대한 시험관내 및 생체내 검정을 사용하여 확인된 억제, 활성화 또는 조정 분자, 예를 들어, 리간드, 작용제, 길항제, 및 이들의 동족체 및 모방체를 지칭하는 데 사용된다. 용어 "조정제"는 억제제 및 활성화제를 포함한다. 억제제는 예를 들어, 발현을 억제하거나 이에 결합하거나, 자극 또는 프로테아제 억제제 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하고, 감소, 예방, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 기재된 표적 단백질, 예를 들어 길항제의 활성을 하향 조절하는 제제이다. 활성화제는 예를 들어 기재된 표적 단백질의 발현을 유도 또는 활성화하거나 기재된 표적 단백질 (또는 인코딩 폴리뉴클레오티드), 예를 들어 효능제를 예를 들어 결합, 자극, 증가, 개방, 활성화, 촉진, 활성화 또는 프로테아제 억제제 활성을 향상시키거나, 감작화하거나 상향 조절하는 작용제이다. 조정제는 자연 발생 및 합성 리간드, 길항제 및 효능제 (예를 들어, 작용제 또는 길항제로서 기능하는 작은 화학 분자, 항체 등)를 포함한다. 억제제 및 활성화제에 대한 이러한 검정은 예를 들어, 추정 조정제 화합물을 기재된 표적 단백질을 발현하는 세포에 적용한 다음에, 상기 기재된 바와 같이 기재된 표적 단백질 활성에 대한 기능적 효과를 결정하는 것을 포함한다. 잠재적인 활성화제, 억제제 또는 조정제로 처리된 기재된 표적 단백질을 포함하는 샘플 또는 분석을 억제제, 활성화제 또는 조절제가 없는 대조군 샘플과 비교하여 효과의 정도를 조사한다. 대조군 샘플 (조정제로 처리되지 않음)에는 100%의 상대 활성 값이 지정된다. 기재된 표적 단백질의 억제는 대조군에 대한 활성 값이 약 80%, 임의로 50% 또는 25, 10%, 5% 또는 1일 때 달성된다. 기재된 표적 단백질의 활성화는 대조군에 대한 활성 값이 110%, 임의로 150%, 임의로 200, 300%, 400%, 500%, 또는 1000-3000% 또는 그 초과일 때 달성된다.

본원에 사용된 바와 같이, "억제하다", "방지하다" 또는 "감소하다", 또는 "억제하는", "방지하는" 또는 "감소시키는"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 처리되지 않은 세포 (조직 또는 대상)와 비교하여 처리된 세포 (조직 또는 대상)에서 측정된 파라미터 (예를 들어, 활성, 발현, 미토콘드리아 호흡, 미토콘드리아 산화, 산화적 인산화)의 감소를 나타낸다. 치료 전과 후 사이에 동일한 세포, 조직 또는 대상체를 또한 비교할 수 있다. 감소는 검출할 수 있을 정도로 충분한다. 일부 실시양태에서, 처리된 세포의 감소는 처리되지 않은 세포와 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%이거나, 완전히 억제된다. 일부 실시양태에서, 측정된 파라미터는 처리되지 않은 세포와 비교하여 처리된 세포에서 검출가능하지 않다 (즉, 완전히 억제된다).

적합한 배양 배지의 예는 하기 표 2에 요약되었다:

<표 2>

상이한 세포 유형을 배양하는 데 사용할 수 있는 세포 배양 배지

본원에 사용된 바와 같이, hPGCLC 유도 배지는 인간 원시 생식 세포(primordial germ cell)-유사 세포 유도 배지를 지칭한다. 이 배지는 세포에서 전체적인 저메틸화 상태를 촉진하는 데 사용될 수 있음이 이해될 것이다.

RSeT™ 배지는 피더 의존- 및 저산소 조건에서 나이브-유사 hPSC의 유지에 사용되는 정의된 세포 배양 배지이다. RSeT™ 배지는 사전-스크리닝된 품질 성분을 포함하고 bFGF 또는 TGFβ를 함유하지 않는다. 인간 배아 줄기 (ES) 세포 및 인간 유도 다능성 줄기 (iPS) 세포와 상용성이다.

RSeT™ 배지에서 배양된 hPSC는 굴절 가장자리가 있는 빽빽하게 채워진, 돔형 콜로니과 같은 나이브-유사 상태의 특색을 나타낸다. KLF2, KLF4, 및 TFCP2L1과 같은 나이브-유사 hPSC와 연관된 주요 전사체는 RSeT™ 배지에서 배양된 hPSC에서 발현 증가를 나타낸다. RSeT™ hPSC는 mTeSR™1에서 배양하여 프라이밍된 상태로 다시 전환시킬 수 있으며 표준 기술을 사용하여 분화시킬 수 있다.

예시적인 t2iLGoY 배지:

· 2 mM L-글루타민 (깁코)이 보충된, DMEM/F-12 (깁코(Gibco)) 및 뉴로베이살(Neurobasal) 배지 (깁코)의 50:50 혼합물,

· 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (깁코),

· 0.5% N2 보충제 (깁코),

· 1% B27 보충제 (깁코),

· 1% 펜-스트렙 (깁코),

· 10 ng/ml 인간 LIF (사내 제작),

· 250 μM L-아스코르브산 (시그마),

· 10 μg/ml 재조합 인간 인슐린 (시그마),

· 1 μM PD0325901 (밀테니 바이오텍),

· 1 μM CHIR99021 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)),

· 2.5 μM G

6983 (토크리스(Tocris)),

· 10 μM Y-27632 (압캠).

분화

본 발명은 또한 본 발명에 따라 제조된 iPSC로부터 분화된 세포를 생성하는 방법을 포함한다.

분화된 세포는 약물 발견 및 개발, 최기형성 및 독성 시험; 임상 세포 치료에 적용하기 위한 조직 줄기 세포 및 보다 성숙한 세포의 공급원; 진단, 예후 및 환자 치료의 발전을 촉진하기 위해 발달 장애, 유전 질환 및 정량적 특성에 대한 유전 및 후생유전학의 상대적 기여도 분석; 생체 공학 또는 인간-동물 키메라에 대한 혈통/기관 특이적 기여에 의한 이식을 위한 조직 및 기관의 생성에 적용될 수 있는 인간 발달 및 질환의 세포 배양 모델을 생성하는 데 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 iPSC는 뉴런, 성상세포, 희돌기교세포, 각질형성세포, 상피 세포, 심근세포, 섬유모세포, B 세포, T 세포, 대식세포, 조혈 줄기 세포, 망막 상피 세포, 평활근 세포, 골격 세포, 족세포, 신장 세포, 간세포, 췌장 β-섬, 폐 폐포 세포, 지방세포, 연골세포 및 골세포를 포함하나 이에 제한되지는않는 임의의 체세포에 분화될 수 있다.

추가로 여전히, 본 발명에 따라 제조된 iPSC는 원시 생식 세포(primordial germ cell) (PGC) 및 생식자로 분화될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따라 생성된 iPSC를 구별하기 위한 표준 방법에 익숙할 것이다. iPSC의 분화에 대한 지침서를 제공하는 통상의 기술자가 이용할 수 있는 문헌이 풍부하다. iPSC를 체세포 유형으로 분화하기 위한 분화 배지를 포함하는 키트가 또한 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)을 포함하여 상업적으로 이용가능하다.

체세포 유형으로의 성공적인 분화는 체세포의 특성인 하나 이상의 마커의 존재를 결정함으로써 결정할 수 있다. 추가로, 성공적인 분화는 표적 세포 유형의 특성인 다능성 상태에서 분화된 형태로의 형태 변화를 관찰함으로써 결정할 수 있다.

본 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단이 통상적인 방법 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 제2 배양 배지 또는 제2 배양 조건에 일시적 노출 없이)에 따라 생성된 iPSC의 분화에 의해 수득된 분화된 세포, 또는 분화된 세포의 집단과 비교하여 체세포 (즉, 본 발명의 단계 a)를 거친 체세포)의 특성이 더 적은 세포를 특징으로 할 수 있다. 추가로, 분화된 세포의 집단은 체세포의 특성을 갖는 더 적은 수의 세포를 가질 수 있다.

보다 구체적으로, 그리고 실시예에서 추가로 입증된 바와 같이, 선행 기술의 방법에 따라 수득된 프라이밍된 iPSC로부터 분화된 세포 집단은 전형적으로 공급원 세포의 특성을 보유하는 세포의 서브세트를 포함한다. 다시 말해서, 섬유모세포에서 재프로그래밍하는 경우, 프라이밍된 배지에서 재프로그래밍할 때 섬유모세포로부터 생성된 iPSC로부터 수득된 임의의 분화된 세포는 전형적으로 형태 및 유전자 발현 특성 둘 다에서 섬유모세포와 비슷한 일부 세포를 포함한다. 본 발명에 따라 생성된 iPSC는 재프로그래밍에서 사용된 원래 공급원 세포의 특성을 갖는 분화된 세포의 가능성을 감소시키는 후생유전학적 프로파일을 갖는다.

제약 조성물 및 기타 응용

특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따라 생성된 iPSC를 사용하여 생성된 임의의 세포, 조직 및/또는 기관/오가노이드의 사용을 고려한다.

본 발명의 단리된 세포는 질환 모델링, 약물 스크리닝 및 환자-특이적 세포 기반 요법에 추가로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 제조된 단리된 iPSC 또는 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 수득된 단리된 분화된 세포가 제공된다.

세포를 도입하는 것은 치료가 필요한 대상체에 직접 주사를 통해 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "이를 필요로 하는 대상체"는 병리학 진단을 받은 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)를 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 이 용어는 병리를 발병할 위험이 있는 개체를 포함한다. 수의학적 용도가 또한 고려된다. 대상체는 임의의 성별 또는 신생아, 유아, 청소년, 청춘기, 성인 및 노인을 포함한 모든 연령에 있을 수 있다.

본 발명에 따라 수득하거나 수득가능한 iPSC, 또는 그로부터 수득된 분화된 세포는 그 자체로 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합된 제약 조성물로 대상체에 이식될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 구축물은 그 자체로 또는 제약 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "제약 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 함께 본원에 기재된 활성 성분 중 하나 이상의 작용제를 지칭한다. 제약 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

본원에서 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과에 대해 책임이 있는 본 발명의 세포를 지칭한다.

이하에, 상호교환적으로 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "제약상 허용되는 담체"는 유기체에 유의한 자극을 일으키지 않고 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다.

본원에서, 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 제약 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜의 유형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 부양, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 관련 기술분야에 널리 공지된 공정에 의해 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 활성 성분을 제약상 사용될 수 있는 제제로 처리하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택한 투여 경로에 따라 다르다.

주사를 위해, 제약 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염 완충제와 같은 생리학적으로 상용성인 완충제로 제제화될 수 있다.

전형적으로, 제약 조성물은 예를 들어 제약 조성물을 환자의 조직 영역에 직접 주사함으로써 전신적 방식보다는 국소적으로 투여된다.

본원에 기재된 제약 조성물은 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여(unit dosage) 형태, 예를 들어 앰플 또는 임의로 첨가된 방부제와 함께 다중 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 제약 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 게다가, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참깨유와 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 제약 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 치료 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다.

본 발명의 조성물은 원하는 경우 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 주사기일 수 있다. 주사기는 세포가 미리 패킹되어 있을 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여의 지침서가 포함될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식으로 용기와 연관된 고지에 의해 수용될 수도 있으며, 이러한 고지는 수의학. 예를 들어, 그러한 통지는 미국 식품의약국 (FDA)이 처방약에 대해 승인한 라벨 또는 승인된 제품 삽입서일 수 있다. 상용성인 약제학적 운반체에 제제화된 본 발명의 작용제를 포함하는 조성물은 또한 상기에서 추가로 상세히 기재된 바와 같이 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 지시된 상태의 치료를 위해 라벨링될 수 있다.

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 포함한다.

실시예

실시예 1: 체세포를 iPSC로 재프로그래밍 ("일시적 나이브 치료" 프로토콜)

1차 성인 인간 진피 섬유모세포 (HDFa, 라이프 테크놀로지즈)를 핵 재프로그래밍 실험을 위해 LSGS (깁코)가 보충된 배지 106에서 확장시켰다.

초기 계대 단계 (< P6)에서의 섬유모세포 세포를 DMEM (깁코), 10% FBS (히클론(Hyclone)), 1% 비필수 아미노산 (깁코), 1 mM 글루타맥스(Glutamax) (깁코), 1% 펜-스트렙 (깁코), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (깁코) 및 1 mM 피루브산나트륨 (깁코)을 함유하는 섬유모세포 배지에서 혈질도입 전 웰당 50,000-70,000개 세포로 6-웰 플레이트에 시딩하였다.

48시간 후, 형질도입에 필요한 바이러스의 부피 (MOI)를 결정하기 위해 한 웰의 세포를 트립신 처리하여 계수하였다. 4개의 전사 인자인 OCT4, SOX2, cMYC, KLF4로 이루어진 시토튠(CytoTune)2.0 iPSC 센다이(Sendai) 재프로그래밍 키트 (인비트로겐)를 사용하여 형질도입을 수행하였다.

24시간 후, 바이러스를 제거하고 격일로 배지 교체를 수행하였다. 형질도입 7일 후, TrypLE 익스프레스 (라이프 테크(Life tech))를 사용하여 세포를 수확하고 섬유모세포 배지에서 방사선조사된 MEF 피더 층에 다시 시딩한 다음에, 다음 날 배지를 나이브 배지 (2iLGoY, Guo et al., 표 2 참조)로 전환하였다.

5일 후 돔-형상의 콜로니가 분명해지면, 아큐타제(Accutase) (스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))를 사용하여 중간 세포를 수확하고 나이브 조건에서 비트로넥틴 (라이프 테크) 코팅된 플레이트에 다시 시딩하였다. 다음 날, 배지를 프라이밍된 배지 (에센셜 8 (라이프 테크))로 전환하였다. 대안적으로, 나이브로부터 프라이밍으로의 배지 전환은 세포를 분할하지 않고 수행할 수 있었다. 배양물이 전면생장되면, 세포를 0.5 mM EDTA/PBS 용액 (인비트로겐)을 사용하여 수확하고, 비트로넥틴/E8 피더가 없는 인간 다능성 줄기 세포 배양 시스템을 유지하였다. 세포를 37℃, 5% O₂및 5% CO₂인큐베이터에서 배양하고 배지는 매일 교체하였다. 세포를 4-5일마다 계대하였다.

실시예 2: 확립된 iPSC에서 후생유전체 수정 ("나이브-투-프라이밍된 프로토콜")

초기 계대 단계 (< P6)에서의 섬유모세포 세포를 DMEM (깁코), 10% FBS (히클론), 1% 비필수 아미노산 (깁코), 1 mM 글루타맥스 (깁코), 1% 펜-스트렙 (깁코), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (깁코) 및 1 mM 피루브산나트륨 (깁코)을 함유하는 섬유모세포 배지에서 혈질도입 전 웰당 50,000-70,000개 세포로 6-웰 플레이트에 시딩하였다.

48시간 후, 형질도입에 필요한 바이러스의 부피 (MOI)를 결정하기 위해 한 웰의 세포를 트립신 처리하여 계수하였다. 4개의 전사 인자인 OCT4, SOX2, cMYC, KLF4로 이루어진 시토튠 2.0 iPSC 센다이 재프로그래밍 키트 (인비트로겐)를 사용하여 형질도입을 수행하였다.

24시간 후, 바이러스를 제거하고 격일로 배지 교체를 수행하였다. 형질도입 7일 후, TrypLE 익스프레스 (라이프 테크(Life tech))를 사용하여 세포를 수확하고 섬유모세포 배지에서 방사선조사된 MEF 피더 층에 다시 시딩한 다음에, 다음 날 배지를 나이브 배지 (2iLGoY)로 전환하였다.

형질도입 후 16-18일 (즉, 나이브 조건에서 8-10일 후)에, 나이브 iPSC를 아큐타제 (스템 셀 테크놀로지즈)를 사용하여 수확하고 10회 초과 계대배양하여 확립된 나이브 iPSC를 수득하였다.

확립된 나이브 iPSC에 대한 나이브 표현형은 나이브 다능성-연관 마커에 대한 유세포 분석법, 면역염색에 의해 확인하였다.

이어서 나이브 iPSC를 아큐타제 (스템 셀 테크놀로지즈)를 사용하여 수확하고 나이브 조건에서 비트로넥틴 (라이프 테크) 코팅 플레이트에 다시 시딩하였다. 배지는 다음날 에센셜 8 (라이프 테크) 배지로 전환하였다. 배양물이 전면생장되면, 세포를 0.5 mM EDTA/PBS 용액 (인비트로겐)을 사용하여 수확하고, 비트로넥틴/E8 피더가 없는 인간 다능성 줄기 세포 배양 시스템을 유지하였다. 세포를 37℃, 5% O₂및 5% CO₂에서 배양하였다.

실시예 3: 상이한 재프로그래밍 단계에서 iPSC의 후생유전학적 프로파일링

재프로그래밍 동안 비정상의 DMR의 획득

1. 전체 게놈 중아황산염 서열분석 (MethylC-seq에 의한) 및 DNA 메틸화 분석

FACS 단리된 세포를 사용하여 DNA 메틸화 분석을 수행하였다. 게놈 DNA는 제조업체의 지침서에 따라 DNeasy 혈액 및 조직 키트로 단리하였다. 라이브러리는 문헌 (Urich et al. (2015) Nature Protocols 10:3 p475-483)에 기재된 바와 같이,로 0.5% (w/w) 메틸화되지 않은 람다 파지 DNA를 가진 게놈 DNA를 사용하여 제조하였으며, 코바리스(Covaris) S2 초음파처리기로 평균 길이 200 bp로 단편화하였다. 단편을 말단-복귀시키고, A-꼬리화하고, 메틸화된 일루미나(Illumina) TruSeq 어댑터 또는 BIOO 넥스트플렉스(Nextflex) 어댑터에 라이게이션한 후에 EZ DNA-메틸화 골드 키트 (지모 리서치(Zymo Research))를 사용하여 중아황산염 전환을 수행하였다. 이어서 라이브러리 단편을 KAPA HiFi 우라실(Uracil)+ DNA 폴리머라제 (KAPA 바이오시스템즈(Biosystems))를 사용하여 4 내지 9주기의 PCR 증폭에 적용하였다. 서열분석은 일루미나 HiSeq 1500 또는 NovaSeq 6000 상에서 수행하였다. 서열분석 어댑터는 옵션 mink = 3, qtrim = r, trimq = 10 minlength = 20을 사용하여 BBduk로 트리밍(trimmed)한 후 -n 1 옵션을 사용하여 Bowtie2 및 BSseeker2를 사용하여 hg19에 정렬하였다 ((Chen et al. (2010) BMC Bioinformatics 11 p203; Langmead et al. (2009) Genome Biology 10:3 R25). BSseeker2를 사용한 메틸화 정량화 전에 삼바바(Sambaba)를 사용하여 PCR 복제물을 제거하였다 (Chen et al. 2010; Tarasov et al.(2015) Bioinformatics 31:2 p2032-3024). CG 디뉴클레오티드에 대한 판독 카운트는 하류 분석 전에 두 가닥 모두에 대해 집계되었다. 차등적으로 메틸화된 영역 (DMR)은 DMReq 알고리즘 (Korthauer et al. (2018) Biostatistics 20:3 p367-383)을 사용하여 통계적으로 결정되었으며, 메틸화 차이가 20%보다 크고 DMR P-값이 < 0.05이면 DMR이 유의한 것으로 간주하였다. PMD는 MethylSeekR (Burger et al. (2013) Nucleic Acids Research 41:16 e155)에서 구현된 바와 같이 섬유모세포 메틸화 프로파일 및 숨겨진 마르코프 모델을 사용하여 결정하였다. 모든 비-CG DNA 메틸화 값은 스파이크 람다 파지 DNA 메틸화 수준에 의해 결정된 비전환율에 대해 수정되었다.

재프로그래밍 중 비정상의 DMR의 획득은 프라이밍된 iPSC 라인과 ESC 라인 사이에서 DMR을 먼저 호출하여 확인되었다. 이는 4개의 ESC 복제물 (KSR 배지에서 32F 계대 3; KSR 배지에서 32F 계대 10;, E8 배지에서 32F 계대 26;, E8 배지에서 38F 계대 20) 및 5 ESC 복제물 (mTeSR1 배지에서 H1; KSR 배지에서 HESO7; KSR 배지에서 HESO8; mTeSR1 배지에서 H9; E8 배지에서 H9)을 포함하였다. 후속적으로, DMR은 프라이밍된 iPSC 라인과 전구 섬유모세포 사이에서도 호출되었다 (2개 복제물; 1 x 32F 섬유모세포 및 1 x 38F 섬유모세포). DMR은 두 가지 클래스로 분류되었다. 첫 번째 클래스는 '기억 DMR'로 지정되었으며 iPSC와 ESC 간에 유의하게 상이한 것으로 결정된 영역이며 섬유모세포와 iPSC 간에 호출되는 DMR과 겹치지 않았다. 이들 영역에서, iPSC의 메틸화 수준은 ESC보다 섬유모세포와 더 유사하였다. DMR의 두 번째 부류는 'iPSC DMR'로 지정되었으며 iPSC와 ESC 간에 유의하게 상이한 것으로 또한 결정되고 DMR과 겹치는 영역도 iPSC와 섬유모세포 사이에 유의하게 상이한 것으로 결정되었다. 이 영역에서 iPSC의 메틸화 수준은 ESC 및 전구 섬유모세포와 구별되었다.

나이브-투-프라이밍된 재프로그래밍은 체세포 기억을 지우고 ESC와 더 매우 비슷한 세포를 생성한다.

DNA 메틸화와 관련하여, 나이브-투-프라이밍된 iPSC 또는 TNT-프라이밍된 iPSC의 DMR은 상기 영역의 평균 메틸화 수준이 ESC 계통과 비교하여 20% 미만일 때 ESC와 더 밀접하게 유사하다. 유전자 및 전위 요소 발현과 관련하여, 나이브-투-프라이밍 세포와 ESC 라인 간의 차이는 2배 미만이다.

RNA-서열분석 (RNA-seq)

RNA 추출을 QIAcube (Qiagen)를 가진 ~2-20 × 10⁴개 세포로부터 RNeasy 마이크로 키트 (퀴아젠, Cat#74004)를 사용하여 수행하였다. RNA의 농도는 Qubit 2.0 형광계 (써모피셔)에서 Qubit RNA HS 검정 키트 (써모피셔, Cat#Q32855)로 측정하였다. ~25 ng의 RNA를 사용하여 라이브러리 구축에 SPIA 키트 (NuGen)를 구측한 후 제조업체의 지침서에 따라 HiSeq 1500 또는 HiSeq 3000 시퀀서 (일루미나)로 서열분석하였다. 서열분석 라이브러리는 50nt 길이 리드 및 20-30M의 표적 판독 수를 사용하여 단일 말단 형식으로 서열분석되었다. RNA-seq 판독을 HISAT2에서 hg19로 정렬하고 (Kim et al., (2015) Nature Methods 12:4 357-360), 인간 게놈에 대한 권장 파라미터를 사용하여 TEtranscripts (Jin et al., (2015) Bioinformatics 31:22 p3593-3599)로 유전자 및 전위 요소 정량화를 수행하였다. TMM 정규화와 함께 edgeR (Robinson et al., (2010) Bioinformatics 26:1 139-140)을 사용하여 유전자 및 전위 요소의 차등 발현을 계산하였다. 차등 발현은 발현 차이가 >2이고 오류 발견율이 <0.01인 유전자 또는 전위 요소로 정의되었다.

도 3A는 통상적인 방법에 따라 생성된 ESC 및 iPSC와 비교하여 나이브-투-프라이밍된 세포의 TE에서 DNA 메틸화 수준의 히스토그램을 나타낸다. 도 3B는 나이브-투-프라이밍된 iPSC를 나타내는 TE 발현이 프라이밍된 iPSC보다 ESC와 더 밀접하게 비슷함을 나타내는 덴드로그램을 나타낸다.

차별화 채점표 평가

채점표 검정 (인비트로겐)의 제조업체 지침서에 따라 배아체 분화를 수행하였다. 간단히 말해서, 다능성 세포를 세포 클럼프로 분리한 다음에, EB 분화 배지가 있는 비부착 접시로 옮겼다. 7일 후 EB를 수확하고 용해하고 QIAcube (퀴아젠)/RNeasy 마이크로 키트 (퀴아젠)로 전체 RNA를 추출하고 SuperScript III cDNA 합성 키트 (인비트로겐)를 사용하여 역전사하였다. 이어서 cDNA를 TaqMan 유전자 발현 매스터 믹스(Gene Expression Master Mix) (써모 피셔)와 함께 384-웰 채점표 (인비트로겐)에 첨가하고 7900HT 실시간 PCR 시스템 (써모 피셔)을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 결과 데이터는 hPSCs 채점표 분석 소프트웨어 (써모 피셔)를 사용하여 분석되었다.

프라이밍된 iPSC 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC로부터 유래된 배아체에 대한 분화 채점표를 도시하는 도 4에 표시된 데이터는 프라이밍된 iPSC와 비교하여 중배엽 계통에 대한 분화 편향이 더 적은 것으로 나타났다 (섬유모세포가 중배엽 기원이 되고 다능성으로 재프로그래밍하기 전에 체세포 유형이 됨).

실시예 4: 나이브-투-프라이밍된 iPSC의 분화

MEL1-hESC-섬유모세포-유래된 iPSC로부터 피질 뉴런 분화

분화 2일 전 (2일차), hiPSC를 10 μM Y-27632 (시그마-알드리치)가 보충된 E8 배지에서 저밀도 (0.5-1 x 10⁴개 세포/cm²)로 마트리겔 (BD 바이오사이언시즈) 코팅된 배양 용기에 플레이팅하였다. 0일차에, E8 배지를 2% B27 (비타민 A 없음) (라이프 테크놀로지즈) 및 100 ng/ ml LDN (스템 셀 테크놀로지즈)가 보충된 DDM 배지 (1X N2 보충제 (라이프 테크놀로지즈)로 보충된 DMEM/F12 + 글루타맥스 보충제, 0.1 mM 비필수아미노산 (라이프 테크놀로지즈), 1 mM 피루브산나트륨 (라이프 테크놀로지즈), 500 μg/ml 소 혈청 알부민 (라이프 테크놀로지즈), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (라이프 테크놀로지즈) 및 50 U/ml Pen/Strep) (라이프 테크놀로지즈)로 변경하고 이틀마다 보충하였다. NCAM (밀테니 바이오텍) 양성 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의해 8일차 및 16일차에 평가하였다..

iPSC로부터 신경 줄기 세포 (NSC) 생성

iPSC를 쿨트렉스(Cultrex) (알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 코팅된 TC 접시에서 E8 배지 (라이프 테크놀로지즈)에서 배양하고 5일마다 1:10으로 분할하였다. 콜로니는 PBS (시그마) 중 0.5 mM EDTA로 기계적으로 분해하였다. 분할 후 24시간 동안 10 μM ROCK 억제제 (셀렉켐(Selleckchem))를 첨가하였다.

분할 후, 콜로니를 침강에 의해 수집하고 ROCK 억제제가 포함된 E8 배지에 재현탁하고 페트리 접시에서 배양하여 현탁액에서 배아체(EB)를 형성하였다. 24시간 후, 배지를 신경 유도를 위해 10 μM SB-431542 (셀렉켐), 1 μM 도르소모르핀 (셀렉켐)이 보충된, 20% 녹아웃 혈청 대체물 (라이프 테크놀로지즈), 1 mM 베타-메르캅토에탄올 (Sigma), 1% 비필수 아미노산 (NEAA, 라이프 테크놀로지즈), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지즈) 및 1% 글루타맥스 (라이프 테크놀로지즈), 뿐만 아니라 3 μM CHIR 99021 (케이먼 케미컬(Cayman Chemical)) 및 0.5 μM PMA (시그마)를 가진 녹아웃 DMEM (라이프 테크놀로지즈)로 변경하였다. 배지를 3일차에 N2B27 배지 (50% DMEM-F12 (라이프 테크놀로지즈), 1:200 N2 보충제 (알앤디 시스템즈)를 가진 50% 뉴로베이살 (라이프 테크놀로지즈), 비타민 A (밀테니 바이오텍) 없이 1% 페니실린/스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지즈)으로 보충된 1:100 B27 보충제 및 동일한 소분자 보충제로 보충된 1% 글루타맥스 (라이프 테크놀로지즈) 보충제로 교체하였다. 4일차에, SB-431542 및 도르소모르핀을 철회하고 150 μM 아스코르브산 (AA; 시그마)를 추가하였다. 6일차에, EB를 1,000 μL 피펫으로 분쇄하여 더 작은 조각으로 만들고 NSC 확장 배지 (CHIR, PMA, 및 AA가 있는 N2B27) 웰당 약 10-15의 밀도로 쿨트렉스 코팅된 12-웰에 플레이팅하였다. 추가 5일 후, 트립신-EDTA(라이프 테크놀로지즈) 및 트립신 억제제 (시그마)를 사용하여 1:5의 비로 세포를 새로운 쿨트렉스 코팅된 웰에 분할하였다. 추가 5일 후에, 세포를 37℃에서 10분 트립신처리하여 10x 3' 단일 세포 RNA-seq v3 워크플로에 대한 단일 세포 현탁액 생성하였다 (10x 유전체학).

도 5A는 프라이밍된 iPSC 및 나이브-투-프라이밍된 iPSC의 NSC 이미지를 나타낸다. 이 이미지는 프라이밍된 iPSC에서 NSC로의 분화가 NSC 콜로니 사이의 공간에서 섬유모세포-유사 세포를 생성한다는 것을 나타낸다. 나이브-투-프라이밍된 iPSC를 NSC로 분화시킬 때 섬유모세포-유사 세포의 존재가 유의하게 감소한다.

도 6은 본 발명에 따라 생성된 MEL1-유래 iPSC (나이브-투-프라이밍된 및 TNT-프라이밍된), MEL1-유래 hESC 및 프라이밍된 iPSC로부터 생성된 MEL1-유래 iPSC의 유세포 분석법의 결과를 나타낸다. 결과는 TNT-프라이밍 및 나이브-투-프라이밍 iPSC에서 피질 신경 분화의 8일 및 16일차에 NCAM 양성 세포의 백분율이 프라이밍된 iPSC에서보다 ESC로부터 수득한 백분율과 더 밀접하게 비슷함을 나타낸다.

단일 세포 RNA-seq 및 해시 태깅

단일 세포 현탁액은 해시태그 항체와 함께 인큐베이션에 사용된 샘플당 200,000개 세포 및 혈구계를 사용하여 계산되었다. 세포를 40 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 800 g에서 5분 동안 원심분리하고, 1xDPBS (라이프 테크놀로지즈) 중 46 μl 세포 염색 완충제 (2% BSA (시그마), 0.01% 트윈 (시그마)와 Fc 차단 시약 (바이오레전드(Biolegend)) 4 μl를 얼음 위에서 10분간 인큐베이션하였다. 각각의 샘플에 상이한 TotalSeq-A 항인간 해시태그 항체 (바이오레전드) 0.2μg을 주입하고 얼음 위에서 30분간 항체 결합을 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 염색 완충제 1 ml를 첨가하고 샘플을 300 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 결합되지 않은 항체를 모두 제거하기 위해 총 3회 세척을 반복하였다. 세포를 다시 계수하고, 각각의 샘플에 대해 동일한 세포수를 조합하여 10,000개의 세포를 나타내는 것을 목표로 하는 10x 크로뮴 컨트롤러에 로딩에 적합한 세포 농도를 얻었다. 혼합된 세포 현탁액을 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 한 번 더 여과하고 제조업체의 지침서에 따라 10x 3' v3 화학에서 단일 세포 RNA-seq에 대해 처리하였다.

단일 세포 RNAseq에 대한 라이브러리는 표준 워크플로에 따라 만들었으며, 한편 해시태그 정보에 대한 HTO 라이브러리는 다음과 같이 생성되었다: cDNA 증폭 단계 동안, HTO 프라이머를 추가하여 HTO 바코드를 증폭하고, cDNA 증폭 PCR 후 첫 번째 클린-업 단계에서 상청액을 폐기하지 않았으나 HTO 라이브러리를 준비하는 데 사용하였다. HTO 제품을 2x SPRI를 사용하여 정제하고 10x SI-PCR 올리고 및 TruSeq Small RNA RPIx 프라이머로 8 PCR 주기 동안 증폭하여 약 18 0bp 크기의 라이브러리를 생성하였다.

단일 세포 RNA-seq (scRNA-seq) 분석

NovaSeq 6000 시퀀서 상에서 서열분석을 수행하여 단일 세포 RNA-seq 라이브러리에 대해 약 4억 2천만 개의 판독을 생성하고 HTO 라이브러리에 대해 약 4천만 개의 판독을 생성하였다. RNA-seq fastq 파일은 CellRanger count 3.1.0을 사용하여 처리하였으며, 한편 HTO fastq 파일은 CITE-seq-Count 1.4.3을 사용하여 처리하였다. 두 데이터 세트 모두는 Seurat 3.1에 로딩하였고 셀 바코드를 기반으로 교차하여 조합하였다. RNA 데이터를 로그 정규화하였으며, 가변 특색은 평균 분산에 의해 검출되었으며 한편 HTO 데이터는 중심 로그-비 변환에 의해 정규화하였다. HTOemux를 사용하여 단일 세포를 샘플 기원에 다시 할당하고 추가 분석으로부터 이중선 및 음성을 제외하였다. 가장 가변적인 상위 1000개 특색은 클러스터링 및 tSNE에 대해 0.6 해상도의 10차원을 사용하여 RNA 데이터의 크기 조정 및 PCA에 사용되었다.

클러스터 정체성은 중배엽 (BMP1, BMP4, HAND1, SNAI1, TGFB1, TGFB2), 내배엽 (CLDN6, FOXA1, NODAL), 신경 줄기 세포 (NES, RBFOX3, PAX3, PAX6, SOX1, SOX2) 또는 미토콘드리아 (낮은 UMI 카운트 및 농축화된 미토콘드리아 전사체)에 대한 마커의 발현을 기반으로 정의되었다. 각각의 세포에 대한 HTO ID를 사용하여 사용된 각각의 샘플 내에서 세포 정체성의 비율을 정의할 수 있을 것이다.

도 5B에 나타낸 데이터는 나이브-투-프라이밍된 및 TNT-프라이밍된 세포 둘 다 마커 유전자 발현을 특징으로 하는 섬유모세포-유사 세포가 실질적으로 더 적다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 개시되고 정의된 본 발명은 본문 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특색들 중 둘 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적 측면을 구성한다.

<표 3>

ESC, 프라이밍된-iPSC (프라이밍된), 나이브-투-프라이밍된 iPSC (NtoP), TNT-프라이밍된 iPSC (TNT), 및 섬유모세포에 대한 수정된 CG-DMR에서 요약된 CG DNA 메틸화 수준 값 (0 내지 1) .

<표 4>

프라이밍된 iPSC (프라이밍된), 나이브-투-프라이밍된 iPSC (NtoP), TNT-프라이밍된 iPSC (TNT), 및 ESC에서 수정된 CG-DMR와 교차하는 전위 요소 (TE)에 대한 요약된 CG DNA 메틸화 수준. 각각의 TE의 게놈 좌표, 뿐만 아니라 패밀리, 군 (클래스) 및 개별 TE 유형이 열거된다. 메틸화 수준 값은 수정된 CG-DMR과 임의의 겹치는 부분을 갖는이 TE에 대해, 열거된 좌표에 대한 전체 TE에 대해 mCG/CG (범위: 0 내지 1)로 계산된다. (표는 다음 페이지에서 시작된다).

표 5>

프라이밍 또는 나이브 다능성 상태에서만 발현되는 마커 유전자.

Claims

(a) 다능성 상태(pluripotent state)로의 체세포(somatic cell)의 재프로그래밍(reprogramming)을 촉진하도록 조정된(adapted) 제1 배양 조건에서 체세포를 배양하는 단계;
(b) 저메틸화된 DNA 상태(hypomethylated DNA state)를 촉진하도록 조정된 제2 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 제2 배양 조건에서 배양하는 것이 세포가 확립된 나이브(
) 다능성 상태를 달성할 수 있도록 하기에 불충분한 기간 동안인 것인 단계; 및
(c) 프라이밍된(primed) 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 제3 배양 조건에서 상기 세포를 배양하는 단계
를 순서대로 포함함으로써, 체세포로부터 유도 다능성 줄기 (iPSC)를 제조하는, 유도 다능성 줄기 (iPSC)를 제조하는 방법.
(a) 체세포에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시키는 단계로서, 여기서 인자가 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 것인 단계;
(b) 제1 배양 배지에서 상기 세포를, 다능성 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계;
(c) 저메틸화된 DNA 상태를 유도하도록 조정된 제2 배지에서 상기 세포를, 상기 세포의 후생유전학적 프로파일(epigenetic profile)을 재설정하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계; 및
(d) 프라이밍된 다능성 상태를 유도하도록 조정된 제3 배양 배지에서 상기 세포를, 프라이밍된 다능성 상태로 상기 세포를 전환시키기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계
를 순서대로 포함함으로써, 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는, 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는 방법.
(a) 체세포에서 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시키는 단계로서, 여기서 인자가 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기 위한 것인 단계;
(b) 제1 배양 배지에서 상기 세포를, 다능성 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 배양하는 단계;
(c) 저메틸화된 DNA 상태를 유도하도록 조정된 배양 배지와 상기 세포를 접촉시키고 저메틸화된 DNA 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계;
(d) 상기 세포를 프라이밍된 배양 배지와 접촉시키고 프라이밍된 다능성 상태로의 상기 세포의 재프로그래밍을 가능하게 하도록 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계
를 순서대로 포함함으로써, 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는, 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가 배아 줄기 세포의 후생유전체 프로파일과 적어도 75% 유사, 80% 유사, 90% 유사 또는 그 초과인 후생유전체 프로파일을 갖고, 임의로 여기서 후생유전체 프로파일은 비-CG 메틸화 수준을 참조하여 결정되는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포가 인간 체세포이고 상기 방법에 따라 제조된 iPSC가 인간 iPSC인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 시작하기 위해 세포를 배양하는 시간이 체세포를 제1 배양 배지와 접촉시킨 후 또는 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 적어도 1일인 방법.
제6항에 있어서, 시간이 세포를 제1 배양 배지와 접촉시키거나, 하나 이상의 인자의 단백질 발현, 또는 양을 증가시킨 후 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 초과인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 상태로의 재프로그래밍을 시작하기 위해 세포를 배양하는 시간이 체세포와 연관된 마커(marker) 및 특성의 감소를 촉진하는 임의의 시간의 기간일 수 있는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 조건 또는 제2 배양 배지가 나이브 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 임의의 배양 조건 또는 배지인 방법.
제9항에 있어서, 배지가 MEK 억제제, PKC 억제제, GSK3 억제제, STAT3 활성화제, 인간 백혈병 억제제 인자(human Leukaemia inhibitor factor) (hLIF) 및 ROCK 억제제를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 배지가 본원에 기재된 바와 같은 T2iLGoY, 5iLAF, RSeT, PXGL 및 NHSM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 배양 조건 또는 제3 배양 배지가 프라이밍된 다능성 상태를 촉진하도록 조정된 임의의 배양 배지를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 배지가 본원에 기재된 바와 같은 에센셜(Essential) 8, KSR/FGF2, mTeSR, AKIT 또는 B8로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 조건 또는 제2 배양 배지에서 세포의 배양이 21일 이하인 시간의 기간 동안인 방법.
제14항에 있어서, 시간의 기간이 13일 이하, 임의로 10일 이하, 또는 5일 이하인 방법.
제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계가 세포에 대한 나이브 다능성 상태를 달성하기에 충분하지 않은 시간의 기간 동안 및 조건에서 수행되고, 여기서 단계 d)가 세포가 재프로그래밍을 완료하기 전과 세포가 나이브 다능성 상태를 달성하기 전에 수행되는 방법.
제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계가 세포에 대한 나이브 다능성 상태를 달성하는 시간의 기간 동안 및 조건에서 수행되고, 여기서 단계 d)가 세포가 나이브 다능성 상태를 달성한 후에 수행되는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 나이브 다능성 상태가 둥근, 돔-형상(round, dome-shaped)인 세포를 포함하는 세포 표현형을 포함하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이밍된 다능성 상태가 편평 세포 콜로니(flat cell colony)의 존재를 특징으로 하는 세포 표현형을 포함하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 나이브 다능성 상태가 KLF2, KLF4, TFCP2L1, TBX3, REX1, GBX2, STELLA (DPPA3), KLF17, DPPA5, TFCP2L1, MAEL, UTF1, ZFP57, DNMT3L, FGF4, FOXR1, ARGFX, TRIM60, DDX43, BRDT, ALPPL2, KHDC3L, KHDC1L 및 PRAP1로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 또는 모든 마커의 발현을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이밍된 다능성 상태가 SFP, EOMES, BRACHYURY, OTX2, ZIC2, ZIC3, ZIC5, DNMT3B, KDR, CDH2, CER1, COL2A1, DAZL, TCF7L1, SOX11 및 SALL2로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 모든 마커의 발현을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제14항 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 제3 배양 배지 또는 제3 배양 조건과 접촉하기 전 0.5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일의 기간 동안 제2 배양 조건 또는 제2 배양 배지에서 배양되는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 적어도 약 0.5일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일 또는 약 21일 동안 제3 배양 배지 또는 제3 배양 조건에서 배양되는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)가 다능성 상태로 체세포를 재프로그래밍하기 위한 인자 중 하나 이상의 발현 또는 양을 증가시키기 위한 작용제(agent)와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 작용제가 뉴클레오티드 서열, 단백질, 앱타머(aptamer) 및 소분자, 리보솜, RNAi 작용제 및 펩티드-핵산 (PNA) 및 이의 유사체 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제25항에 있어서, 작용제가 핵산이고, 여기서 핵산이 벡터의 형태로 세포와의 접촉을 위해 제공되고, 바람직하게는 여기서 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인자가 이의 변이체의 전사 인자: OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC로부터 선택되는 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인자가 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC (OSKM) 중 4가지 모두, 또는 이의 변이체를 포함하는 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 전사 인자가 인자 LIN28 및/또는 NANOG를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 의해 수득되거나 수득가능한 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 또는 단리된 iPSC.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 세포의 집단(population)으로서, 바람직하게는 여기서 집단내 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 iPSC 및 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 이러한 iPSC인 세포의 집단.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 유래되는 분화된 세포 또는 단리된 분화된 세포, 원시 생식 세포(primordial germ cell) 또는 생식자(gamete).
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 유래되는 분화된 세포, 원시 생식 세포(primordial germ cell) 또는 생식자(gamate)의 집단으로서, 여기서 바람직하게는 집단내 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 분화된 세포이며, 이러한 분화된 세포가 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 수득가능한 iPSC로부터 유래되는 집단.
제32항 또는 제33항의 iPSC의 집단 또는 집단 분화된 세포로부터 유래되는 세포의 오르가노이드(organoid) 또는 조직화된 집합체(organised collection).
· 제30항의 iPSC 또는 단리된 iPSC;
· 제31항의 iPSC의 집단;
· 제32항의 분화된 세포 또는 단리된 분화된 세포;
· 제33항의 분화된 세포의 집단; 또는
· 제34항의 세포의 오르가노이드 또는 조직화된 집합체 또는 이의 일부;
및 제약상 허용되는 부형제
를 포함하는 제약 조성물.
iPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게
· 제30항의 iPSC 또는 단리된 iPSC;
· 제31항의 iPSC의 집단;
· 제32항의 분화된 세포 또는 단리된 분화된 세포;
· 제33항의 분화된 세포의 집단;
· 제34항의 세포의 오르가노이드 또는 조직화된 집합체 또는 이의 일부; 또는
· 제35항의 제약 조성물
을 투여하는 것을 포함하는, iPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
iPSC 또는 세포의 집단의 투여를 필요로 하는 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 제30항의 iPSC 또는 단리된 iPSC, 제31항의 iPSC의 집단, 제32항의 분화된 세포 또는 단리된 분화된 세포, 제33항의 분화된 세포의 집단, 제34항의 세포의 오르가노이드 또는 조직화된 집합체 또는 이의 일부; 또는 제35항의 제약 조성물.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따른 iPSC를 제조하기 위한 키트(kit)로서, 임의로 여기서 키트가 체세포 배양용 시약 및 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 서면 설명서를 포함하는 키트.