KR20200093580A - 포스포릴 구아니딘 올리고뉴클레오티드를 이용한 템플릿-기반 효소적 dna 합성 방법 및 그의 이행을 위한 반응 혼합물 - Google Patents
포스포릴 구아니딘 올리고뉴클레오티드를 이용한 템플릿-기반 효소적 dna 합성 방법 및 그의 이행을 위한 반응 혼합물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 분자 생물학, 생명공학 및 분자 진단 분야에 관한 것이다. 본 발명은 유전적, 바이러스성, 및 기타 질병의 진단을 포함하는 핵산을 검출하는데 사용되는 PCR 및 RT-PCR 시스템의 개발 및 최적화에 사용될 수 있다. 제안된 방법의 본질은 올리고뉴클레오티드의 중성 유도체, 즉 구아니딘 또는 치환된 구아니딘 잔기가 인 원자에 도입된 하나 이상의 인산염 그룹을 포함하는 포스포릴 구아니딘이 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 및 역전사와 PCR의 조합(RT-PCR)을 포함하는 템플릿-기반 증폭을 위한 프라이머로 사용된다는 것이다. 본 발명은 PCR 공정에서 보다 신뢰할 수 있고 특이적이며 선택적인 결과를 얻을 수 있게 하며, 특히, 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 변형된 인산염 그룹의 위치 및 개수의 서로 다른 조합을 이용하여 DNA 증폭의 부산물의 수율을 감소시킴으로써 PCR의 민감도를 높이고 그리고/또는 의도적으로 억제하는 것을 포함하여 PCR 생성물의 수율을 조절할 수 있다.
Description
본 발명은 분자 생물학 및 분자 진단 분야에 관한 것이다. 본 발명의 목적은, 올리고뉴클레오티드들의 새로운 유도체들, 즉 인 원자에 구아니딘 또는 치환된 구아니딘 잔기를 가지는 하나 이상의 인산염 그룹을 함유하는 포스포릴 구아니딘의, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 PCR과 역전사의 조합을 포함하는 템플릿-기반 증폭 프로세스의 프라이머로서의 사용에 관한 것이다.
용어 및 정의:
즉시 사용 가능한 반응 혼합물은 일반적으로 일상적인 연구 작업을 해결하기 위해 설계된 핵산 증폭 단계에 필요한 구성 요소의 미리 준비된 혼합물이다.
템플릿-기반 효소적 DNA 합성(template-based enzymatic DNA synthesis)은 DNA 폴리머라제에 의해 촉매처리되는 추가뉴클레오티드 유닛을 순차적으로 삽입함으로써 3' 말단에 프라이머를 연장하는 프로세스이다.
키트는 연구 실험 또는 진단 분석의 일환으로 일상적인 작업을 수행하기 위한 프로토콜과 함께 즉시 사용 가능한 반응 혼합물의 사전 제작된 세트이다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 및 단일 튜브에서 역전사 후 PCR(RT-PCR)을 위한 키트는 분자 및 의학 생물학 분야에서 널리 사용된다.
프라이머는 부분적으로 또는 완전히 뉴클레오티드 성질을 갖는 단위로 구성된 올리고머이며, 상기 올리고머는 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용을 하는 상보적인 상호작용 및 촉매작용의 원리에 의해 DNA 템플릿을 인식하는 구조의 단편을 포함하고, 적어도 하나의 추가적인 단량체 단위에 의해 3' 말단상에서 연장될 수 있다.
PG 올리고뉴클레오티드들은 구아니딘 또는 치환된 구아니딘 잔기가 인 원자상에 도입된 하나 이상의 인산염 그룹을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 유도체들이다.
약어 및 규칙
BSA ― 소 혈청 알부민;
DTT ― 디티오트레이톨;
DNA ― 데옥시리보핵산;
ds ― 이중 가닥;
snRNA ― 소핵 RNA;
NA ― 핵산(DNA 또는 RNA);
RT ― 역전사;
RT-PCR ― 역전사와 조합된 PCR, 또는 역전사 후 PCR;
bp ― 염기 쌍(뉴클레오티드 쌍);
PCR ― 폴리머라제 연쇄 반응;
복귀효소 ― RNA 의존성 DNA 폴리머라제;
RNA ― 리보핵산;
Tris ― 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄;
PG ― 포스포릴 구아니딘 그룹;
Klenow 단편 ― 폴리머라제 및 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성을 보유하고, 5'-3'-엑소뉴클레아제 활성을 상실한 대장균 유래의 세균성 DNA 폴리머라제 I의 큰 단백질 단편;
Ct ― 임계값 주기;
GFP ― 녹색 형광 단백질;
k eff ― 증폭 계수;
LNA ― "잠긴(locked)" 핵산;
ROX, BHQ2, FAM, TAMRA ― 형광 염료;
RCA ― 회전환(rolling circle) 증폭 반응;
SD ― 표준 편차;
SYBR Green I, SYTO-13 ― DNA-삽입성 형광 염료;
KRAS ― Ras 단백질 패밀리의 일원인 원(原)종양 형성 유전자(proto-oncogene).
올리고뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 위한 프라이머로서 널리 사용되며, 이는 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 의해 경계가 결정되는 DNA 단편의 복제 개수를 증가시킬 수 있다[1, 2].
프라이머의 구조는 크게 합리적인 디자인 체계 내에서 설립된 기준들을 엄격하게 준수하면서 자신의 순서를 선택하도록 강제함으로써 PCR의 효율성을 결정한다. 대부분의 경우, 원형(native) 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 프라이머로 사용된다. 표준 올리고뉴클레오티드 이외에, 다수의 올리고뉴클레오티드 유도체가 프라이머로서 제안되었고, PCR의 효율을 변화시키기 위해 변형된(modified) 단편이 도입되었다. 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오티드 유도체는 소위 "협동(cooperative)" 프라이머의 일부로서 "잠긴" 핵산(LNA)[3] 또는 올리고에틸렌글리콜 포스포디에스테르[4]에 기초한 뉴클레오티드 단위들을 함유하는 유도체들을 포함한다. 또한, 이러한 변형의 존재는 DNA 템플릿과 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머 사이에서 형성된 복합체의 용융 온도에 크게 영향을 미친다. 예를 들어, LNA 단위는 용융 온도를 증가시키고, 헥사에틸렌글리콜은 이를 감소시킨다.
당인산(sugar-phosphate) 골격(backbone)의 구조를 변화시키는 것 외에도, PCR의 효율에 영향을 미치는 대안적 옵션으로서 헤테로사이클릭 질소 염기의 변형[5], 증폭된 DNA를 가진 프라이머 복합체의 안정성을 증가시키는 비-뉴클레오티드 부분들의 도입이 있다[6].
PCR 정확도를 높이는 또 다른 방법은 3'-말단 단편의 일시적인 보호와 함께 올리고뉴클레오티드 유도체를 프라이머로 사용하는 것이며, 이는 화학 약제 또는 물리적 자극, 예를 들어 빛 또는 온도 [7, 8]의 작용 하에 제거될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체에 기초한 전술한 유형의 프라이머의 단점은 추가적인 단량체 변형자(monomeric modifier)를 미리 획득할 필요가 있다는 것이며, 그 후 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성 중에 사용될 수 있을 것이다.
모르폴리노와 펩티딜 뉴클레오티드와 같은 완전 비하전(fully uncharged) 올리고뉴클레오티드 유도체들은 프라이머로 사용되지 않는데, 당인산 골격은 효소에 의해 인식되지 않으며[9], 그 합성은 시간과 자원 측면에서 훨씬 까다롭다.
부분적 비하전(partially uncharged) 올리고뉴클레오티드들, 예를 들어, 포스포트리에스테르의 잔기들을 함유하는, 즉, 산소 원자들 중 하나 대신에 지방족 알코올의 잔기를 가지는 것은, DNA 증폭을 위한 프라이머로서 사용될 수 있으나, 이들의 획득에는 합성 후 차단 해제(deblocking) 및 합성된 올리고뉴클레오티드의 분리에 특수한 포스포아미드 뉴클레오티드 단량체들 및 비표준 조건을 사용해야만 한다[10]. 다양한 DNA 폴리머라제를 사용하는 프라이머 연장 및 DNA 단편 증폭의 다양한 온도 모드에서의 반응 혼합물에 있어서 부분적 비하전(partially uncharged) 올리고뉴클레오티드의 광범위한 사용에 관한 예는 기록된 바 없다.
제안된 방법에 가장 가까운 방법, 즉 프로토타입은, 인터뉴클레오티드 인산염 그룹 내의 인 원자 상에 산소 원자 대신 도입된 치환체, 즉 인산화물 잔기를 가진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재 하에서 증폭하는 방법[11]이다. 이러한 유형의 골격 변형을 가진 프라이머는 표준 뉴클레오티드 단량체를 이용하여 제조될 수 있으나, 특수 산화제를 사용해야 한다. 프로토타입의 단점은 다음과 같은 시스템 사용에 대한 제한된 조건들이다:
- 포스포로티오에이트 함유 프라이머는 DNA 검출에만 사용된다;
- 프로토타입에서, 사용되는 효소 세트가 제한된다, 즉, 폴리머라제 결핍 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 제한된다(즉, 수정 활성(corrective activity)을 가지는 폴리머라제의 사용이 비특이적 증폭의 감소로 이어지지 않는다); 그리고 55~61℃의 범위에서만 상기 프라이머를 연장할 수 있다;
- 증폭 반응의 조건은 열 순환 모드이다;
- DNA 생성물 검출에 사용되는 변형된 올리고뉴클레오티드 내로 5'-말단 태그를 도입하여야 한다.
반면, 효소 반응에 인산화 구아니딘을 사용하면, 다음과 관련된 상기한 부류의 화합물들의 속성으로 인해 효율적이다:
- 그들의 합성은, 합성 프로토콜에서 전구체들의 추가의 아미도포스파이트 단량체들의 도입을 필요로 하지 않으며, 표준 자동화된 DNA/RNA 합성기에서 수행된다;
- 올리고뉴클레오티드 내의 인산화 구아니딘 그룹(PG)의 수 및 위치는 제한되지 않으며, 자동화된 합성에 의해 설정 및 제어되기 때문에, 완전히 변형된 유도체들 및 부분적으로 치환된 포스포디에스테르 잔기들을 가지는 유도체들을 모두 얻을 수 있다;
- PG의 존재는 용액의 적당한 이온 강도 조건하에서 NA/NA 복합체들의 용융 온도에 큰 변화를 초래하지 않는다;
- 산소 원자들 중 하나(생리적 조건하에서 음전하) 대신에 구아니딘 그룹(적어도 8개의 원자들)을 도입하면, 본 명세서의 실시예 1에 나타낸 바와 같이 인 원자 상의 치환체의 부피를 현저히 증가시키고, 생리적 조건 하에서 PG를 비하전 상태로 되게 한다;
- 올리고뉴클레오티드 내로의 PG의 도입은 광범위한 pH 범위에서 화학적 안정성을 가진 상기 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 뉴클레아제의 작용에 대한 내성을 부여한다;
- 포스포릴 구아니딘 그룹의 위치 및 수를 변형함으로써, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 광범위한 물리화학적 특성을 갖는 올리고뉴클레오티드들을 얻을 수 있다.
본 발명이 유사 선행기술들과 가장 다른 점은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구조 내로 하나 이상의 포스포릴 구아니딘 부분(moiety)들을 도입하는 것이다. 산소 원자 중 하나 대신에 구아니딘 그룹을 도입하면, 인 원자상의 치환체의 부피를 현저하게 증가시키고, 생리적 조건하에서 비하전 상태인 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 형성한다. 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체에서 인 원자 상에 부피가 크고 중성인 그룹이 존재하면, 템플릿-기반 효소적 DNA 합성을 위한 프라이머로서의 그것의 기질 특성들의 변화를 유도한다. 반응의 초기 단계에서, 프라이머 구조체 중의 포스포릴 구아니딘 부분은 DNA 또는 RNA 기질과 폴리머라제의 프라이머-템플릿 복합체의 구조를 교란시켜서, 효소 작용의 효율을 변화시킨다. 그 결과, 포스포릴 구아니딘 부분을 갖는 프라이머를 이용하는 것은 템플릿-기반 효소적 DNA 합성의 반응 생성물의 최종 수율, 조성 또는 축적 속도에 영향을 미친다. 특히, PCR에서 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체를 이용하여 표적 생성물의 반응 민감도 및 축적 특이성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 템플릿-기반 효소적 합성을 초기화하기 위한 프라이머에 사용되는 포스포릴 구아니딘 부분들은 상기한 유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트 포함 올리고뉴클레오티드와는 유의미한 차이를 제공한다.
청구된 발명의 기술적 결과는 분석된 핵산 서열의 검출에 대한 신뢰성, 감수성 및 특이성을 증가시키고, 또한 템플릿-기반 DNA 합성을 위한 방법을 단순화한다.
상기한 기술적 결과는 적어도 하나의 단위 포스포릴 구아니딘(phosphoryl guanidine) 그룹을 포함하는 프라이머가 핵산의 템플릿-기반 효소적 합성에 사용된다는 사실에 의해 달성된다. 상기 프라이머의 일반적인 구조는 도 1A에 도시되어 있으며, 여기서 Z는 포스포릴 구아니딘 그룹이다.
특정 응용 분야에서, 전술한 방법에 의한 템플릿-기반 효소적 DNA 합성은 DNA 및 RNA를 모두 1차 템플릿으로 사용하여 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 열순환 및 등온 프로토콜, 특히 회전환(rolling circle) 메커니즘에 의한 증폭 프로세스에서 모두 구현될 수 있다. 제안된 PCR 방법을 연구 및 진단 목적으로 적용하고자 하는 수요가 가장 많을 것으로 여겨진다. 특히, 대립유전자(allele) 특이적 PCR을 이용한 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 검출d; 본 발명의 방법을 사용하여 상기 방법의 민감도 및 특이성을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 역전사 반응들에 있어서 포스포릴 구아니딘 올리고뉴클레오티드를 이용한 효소적 DNA 합성은 독립적으로 그리고 후속 PCR과 조합하여 수요가 있을 것으로 여겨진다.
일반적인 실험실 사례에서, 일상적인 프로토콜은 종종 원하는 결과를 달성하기 위해 실험 단계별 수행을 위한 지침과 함께 상업적으로 입수가능한 즉시 사용 가능한 반응 혼합물 및 세트를 사용하여 구현된다. 전술한 방법에 따른 템플릿-기반 효소적 DNA 합성은 주요 단계를 제시하거나 연구 또는 의학적 진단 목적을 위한 실험을 수행하기 위한 보다 복잡한 프로토콜의 필수적인 부분이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 PCR 및 RT-PCR에 기초한 핵산의 검출 및 정량화를 위한 개선된 시스템을 구축하기 위해 전술한 기준을 충족하는 포스포릴 구아니딘 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 개시한다.
청구된 발명은 다음 도면에 도시된다:
도 1 및 도 2는 실시예에서 사용되는 화합물에 대한 설명을 나타낸다. 도 1은 프라이머 및 비전하 포스포릴 구아니딘 그룹(Z)의 구조를 일반 형태(A)와; 구아니딘 잔기(g"), N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(g'), 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-이민(g), N,N'-비스(테트라메틸렌)구아니딘(g"')을 가지는 사용된 포스포릴 구아니딘 그룹의 예(B)로 도시한다. 도 2는 본 발명의 실시예에서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열 및 구조를 나타내며, 여기서 g", g, g는 포스포릴 구아니딘 그룹, [32P]는 방사성 표지, *는 형광 표지(FAM 또는 TAMRA)이다.
도 3은 PG 올리고뉴클레오티드가 프라이머(A) 또는 템플릿(B)으로서 작용하는 본 발명의 실시예에서 사용되는 모델 시스템을 도시하며, 여기서 g는 포스포릴 구아니딘 그룹이다.
도 4는 열순환(1) 및 등온(2) 모드에서 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 올리고뉴클레오티드 포스포릴 구아니딘 유도체를 프라이머로 사용하는 실시예를 도시한다. 본 도면은 열순환 모드에서 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M30/Z 복합체의 전기 영동 분석 결과(A)(해당 시스템은 도 3a에 도시되어 있음); 등온 모드에서 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M40/T 복합체의 반응의 전체 사이즈 생성물(full-size product)의 축적 정도(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음)를 제시하고; 프라이머 서열 Z0÷ZF 및 T0÷T는 도 2에 제시되어 있다.
도 5는 중온성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 포스포릴 구아니딘 유도체의 사용의 실시예를 도시한다. T5 파지(phage) DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M40/T 복합체의 반응의 전체 사이즈 생성물의 축적 정도(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음); 프라이머 서열 T0÷T3는 도 2에 제시되어 있다.
도 6은 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로 작용하는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체의 능력(ability)을 나타낸다. 본 도면은 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 Z/N 8 복합체의 전기영동 분석 결과(해당 시스템은 도 3B에 도시되어 있음)를 나타내고; 프라이머 서열 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있다.
도 7은 중온성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로 작용하는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 능력을 나타낸다. 클레노브(Klenow) 단편의 존재 하에서 Z/N 8 복합체의 전기 영동 분석(해당 시스템은 도 3B에 도시되어 있음)의 결과; 프라이머 서열들 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있다.
도 8은 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체를 프라이머들로서 사용할 때의 PCR 효율의 변화를 나타낸다. 본 도면의 표는 프라이머 쌍들의 시스템에서의 증폭 계수들을 나타내며, 여기서 올리고뉴클레오티드들 중 하나는 표준 프라이머 시스템(Q0-Z0)과 비교하여 적어도 하나의 포스포릴 구아니딘 부분을 포함한다. 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. PCR 효율 계수 값들은 3개 이상의 독립적인 실험들의 결과로부터 얻어진다. SD는 표준 편차이다.
도 9는 초기 프라이머에서 포스포릴 구아니딘 부분들을 사용하여 성장하는 상보적인 DNA 가닥의 길이를 조절할 수 있는 가능성을 도시한다. 본 도면은 자동화된 모세관 분석기에서 수행된 단편 분석에 의한, 해당 프라이머 쌍들의 존재하에서 eGFP 유전자 단편의 PCR 생성물들의 길이의 분석 결과를 제시하고(다이어그램의 캡션: Q0-Z0 ― 변형되지 않은 프라이머 쌍; Q0-ZH2 및 Q0-ZH1 ― 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 갖는 변형되지 않은 프라이머 쌍들), 여기서 *는 FAM 형광 라벨이고, 프라이머 서열들 Q0, Z0, ZH1 및 ZH2는 도 2에 제시되어 있다.
도 10은 "핫 스타트(hot start)" 기술과의 조합을 포함하는 Taq-DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR의 비특이적 생성물들의 축적 가능성을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체의 능력을 입증한다. 본 도면은 표준 조건들(A)과 지연된 "핫" 스타트의 조건(B) 하에서 Taq-DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR의 전기영동 분석 결과를 제시하며, 여기서 M은 100 내지 400bp의 DNA 길이의 마커를 의미하고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 비특이적 생성물들의 용융 영역은 점선으로 표시된다.
도 11은 초기 프라이머 서열에 상보적인 가닥의 합성에서 변형된 단량체와 효소의 상호작용에 의해 포스포릴 구아니딘 부분의 존재가 돌연변이를 일으키지 않는다는 것을 나타낸다. 본 도면은 기본(native) 올리고뉴클레오티드 프라이머들 Q0(오른쪽 컬럼) 및 Z0(왼쪽 컬럼)을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들(중앙 도면에 표시됨)을 포함하는 쌍들 및 표준 프라이머들(Q0-Z0)의 쌍들의 존재 하에서의 증폭 후의 DNA 생성물들의 Sanger 시퀀싱 결과를 제시한다. 프레임은 초기 프라이머의 영역을 나타내고; 모든 프라이머의 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 12는 사람의 체액: 전혈 및 혈장에서 결정되는 DNA를 포함하는 상용 PCR 시스템에서 사용되는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 위한 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용 효율을 나타낸다. 본 도면은 한 쌍의 표준 프라이머(Q0-Z0) 및 한 쌍의 포스포닐 구아니딘 유도체들을 사용하여, 시스템 I(DNA-의존성 DNA 폴리머라제 Pfu) 및 시스템 II(DNA-의존성 DNA 폴리머라제 Pfu 및 Taq의 혼합물)(패널 A), 시스템 III(사람의 체액에서의 PCR을 위한 상용 시스템)(패널 B)에서 PCR의 전기 영동 분석의 결과를 제시한다. M은 100 내지 500bp까지의 DNA 길이의 마커이고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 13은 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(revertases)를 위한 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용 가능성을 도시한다. 본 도면은 삽입성 염료 SYBR 및 SYTO-13 존재 하에서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 mMLV 및 HIV-p66를
이용하여 역전사 후 증폭 반응의 임계 사이클(threshold cycle) 값들을 제시(색으로 강조)하며, 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 14는 원스텝(one-step) RT-PCR 시스템에서 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용가능성 및 장점을 나타낸다. 본 도면은, RT 생성물들에 대해 한쌍의 표준 프라이머들(U0-V0) 및 인간 세포의 총 RNA에서 인간 snRNA의 U12 서열에 특이적인 포스포릴 구아니딘 유도체들의 쌍들(UH1-VH1; UH1-WH1)을 사용하는 PCR을 실시한 생성물들의 전기 영동 분석(A) 결과 및 열 변성 곡선(B)을 제시한다. M은 100 내지 400bp의 DNA 길이의 마커이고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있으며, 비특이적 생성물들의 이동성(mobility) 영역은 점선으로 표시된다.
도 15는 회전환 증폭 반응(RCA)에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 사용한 결과를 도시한다. 본 도면은 표준 프라이머(D0) 및 플라스미드 pUC19의 서열에 특이적인 포스포릴 구아니딘 유도체(D2 및 D3)를 이용한 회전환 반응 생성물들의 전기영동 분석(A) 결과 및 증폭 계수들을 제시하고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. "K-"는 프라이머없이 수행된 대조 반응의 결과에 해당한다. M은 초기 플라스미드의 이동성에 대한 대조군이다.
도 16은 대립 유전자(allele) 특이적 PCR에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 사용한 돌연변이의 식별에서 선택성의 증가를 나타낸다. 본 도면은 표준 프라이머(S0+S) 및 한 쌍의 표준 및 포스포릴 구아니딘 유도체(S1+S)의 존재 하에서 대립 유전자 특이적 PCR에 의한 게놈 DNA에서 KRAS 유전자의 단일 뉴클레오티드 돌연변이(T/C)를 식별하는 실험의 개략적 도식을 제시한다. 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. ΔCt 값은 프라이머 명칭 옆에 표시된다.
도 1 및 도 2는 실시예에서 사용되는 화합물에 대한 설명을 나타낸다. 도 1은 프라이머 및 비전하 포스포릴 구아니딘 그룹(Z)의 구조를 일반 형태(A)와; 구아니딘 잔기(g"), N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(g'), 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-이민(g), N,N'-비스(테트라메틸렌)구아니딘(g"')을 가지는 사용된 포스포릴 구아니딘 그룹의 예(B)로 도시한다. 도 2는 본 발명의 실시예에서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열 및 구조를 나타내며, 여기서 g", g, g는 포스포릴 구아니딘 그룹, [32P]는 방사성 표지, *는 형광 표지(FAM 또는 TAMRA)이다.
도 3은 PG 올리고뉴클레오티드가 프라이머(A) 또는 템플릿(B)으로서 작용하는 본 발명의 실시예에서 사용되는 모델 시스템을 도시하며, 여기서 g는 포스포릴 구아니딘 그룹이다.
도 4는 열순환(1) 및 등온(2) 모드에서 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 올리고뉴클레오티드 포스포릴 구아니딘 유도체를 프라이머로 사용하는 실시예를 도시한다. 본 도면은 열순환 모드에서 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M30/Z 복합체의 전기 영동 분석 결과(A)(해당 시스템은 도 3a에 도시되어 있음); 등온 모드에서 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M40/T 복합체의 반응의 전체 사이즈 생성물(full-size product)의 축적 정도(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음)를 제시하고; 프라이머 서열 Z0÷ZF 및 T0÷T는 도 2에 제시되어 있다.
도 5는 중온성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 포스포릴 구아니딘 유도체의 사용의 실시예를 도시한다. T5 파지(phage) DNA 폴리머라제의 존재 하에서 M40/T 복합체의 반응의 전체 사이즈 생성물의 축적 정도(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음); 프라이머 서열 T0÷T3는 도 2에 제시되어 있다.
도 6은 열안정성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로 작용하는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체의 능력(ability)을 나타낸다. 본 도면은 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 Z/N 8 복합체의 전기영동 분석 결과(해당 시스템은 도 3B에 도시되어 있음)를 나타내고; 프라이머 서열 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있다.
도 7은 중온성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로 작용하는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 능력을 나타낸다. 클레노브(Klenow) 단편의 존재 하에서 Z/N 8 복합체의 전기 영동 분석(해당 시스템은 도 3B에 도시되어 있음)의 결과; 프라이머 서열들 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있다.
도 8은 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체를 프라이머들로서 사용할 때의 PCR 효율의 변화를 나타낸다. 본 도면의 표는 프라이머 쌍들의 시스템에서의 증폭 계수들을 나타내며, 여기서 올리고뉴클레오티드들 중 하나는 표준 프라이머 시스템(Q0-Z0)과 비교하여 적어도 하나의 포스포릴 구아니딘 부분을 포함한다. 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. PCR 효율 계수 값들은 3개 이상의 독립적인 실험들의 결과로부터 얻어진다. SD는 표준 편차이다.
도 9는 초기 프라이머에서 포스포릴 구아니딘 부분들을 사용하여 성장하는 상보적인 DNA 가닥의 길이를 조절할 수 있는 가능성을 도시한다. 본 도면은 자동화된 모세관 분석기에서 수행된 단편 분석에 의한, 해당 프라이머 쌍들의 존재하에서 eGFP 유전자 단편의 PCR 생성물들의 길이의 분석 결과를 제시하고(다이어그램의 캡션: Q0-Z0 ― 변형되지 않은 프라이머 쌍; Q0-ZH2 및 Q0-ZH1 ― 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 갖는 변형되지 않은 프라이머 쌍들), 여기서 *는 FAM 형광 라벨이고, 프라이머 서열들 Q0, Z0, ZH1 및 ZH2는 도 2에 제시되어 있다.
도 10은 "핫 스타트(hot start)" 기술과의 조합을 포함하는 Taq-DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR의 비특이적 생성물들의 축적 가능성을 감소시키는 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체의 능력을 입증한다. 본 도면은 표준 조건들(A)과 지연된 "핫" 스타트의 조건(B) 하에서 Taq-DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR의 전기영동 분석 결과를 제시하며, 여기서 M은 100 내지 400bp의 DNA 길이의 마커를 의미하고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 비특이적 생성물들의 용융 영역은 점선으로 표시된다.
도 11은 초기 프라이머 서열에 상보적인 가닥의 합성에서 변형된 단량체와 효소의 상호작용에 의해 포스포릴 구아니딘 부분의 존재가 돌연변이를 일으키지 않는다는 것을 나타낸다. 본 도면은 기본(native) 올리고뉴클레오티드 프라이머들 Q0(오른쪽 컬럼) 및 Z0(왼쪽 컬럼)을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들(중앙 도면에 표시됨)을 포함하는 쌍들 및 표준 프라이머들(Q0-Z0)의 쌍들의 존재 하에서의 증폭 후의 DNA 생성물들의 Sanger 시퀀싱 결과를 제시한다. 프레임은 초기 프라이머의 영역을 나타내고; 모든 프라이머의 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 12는 사람의 체액: 전혈 및 혈장에서 결정되는 DNA를 포함하는 상용 PCR 시스템에서 사용되는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 위한 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용 효율을 나타낸다. 본 도면은 한 쌍의 표준 프라이머(Q0-Z0) 및 한 쌍의 포스포닐 구아니딘 유도체들을 사용하여, 시스템 I(DNA-의존성 DNA 폴리머라제 Pfu) 및 시스템 II(DNA-의존성 DNA 폴리머라제 Pfu 및 Taq의 혼합물)(패널 A), 시스템 III(사람의 체액에서의 PCR을 위한 상용 시스템)(패널 B)에서 PCR의 전기 영동 분석의 결과를 제시한다. M은 100 내지 500bp까지의 DNA 길이의 마커이고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 13은 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(revertases)를 위한 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용 가능성을 도시한다. 본 도면은 삽입성 염료 SYBR 및 SYTO-13 존재 하에서 RNA-의존성 DNA 폴리머라제 mMLV 및 HIV-p66를
이용하여 역전사 후 증폭 반응의 임계 사이클(threshold cycle) 값들을 제시(색으로 강조)하며, 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
도 14는 원스텝(one-step) RT-PCR 시스템에서 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들의 사용가능성 및 장점을 나타낸다. 본 도면은, RT 생성물들에 대해 한쌍의 표준 프라이머들(U0-V0) 및 인간 세포의 총 RNA에서 인간 snRNA의 U12 서열에 특이적인 포스포릴 구아니딘 유도체들의 쌍들(UH1-VH1; UH1-WH1)을 사용하는 PCR을 실시한 생성물들의 전기 영동 분석(A) 결과 및 열 변성 곡선(B)을 제시한다. M은 100 내지 400bp의 DNA 길이의 마커이고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있으며, 비특이적 생성물들의 이동성(mobility) 영역은 점선으로 표시된다.
도 15는 회전환 증폭 반응(RCA)에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 사용한 결과를 도시한다. 본 도면은 표준 프라이머(D0) 및 플라스미드 pUC19의 서열에 특이적인 포스포릴 구아니딘 유도체(D2 및 D3)를 이용한 회전환 반응 생성물들의 전기영동 분석(A) 결과 및 증폭 계수들을 제시하고; 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. "K-"는 프라이머없이 수행된 대조 반응의 결과에 해당한다. M은 초기 플라스미드의 이동성에 대한 대조군이다.
도 16은 대립 유전자(allele) 특이적 PCR에서 프라이머로서 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체들을 사용한 돌연변이의 식별에서 선택성의 증가를 나타낸다. 본 도면은 표준 프라이머(S0+S) 및 한 쌍의 표준 및 포스포릴 구아니딘 유도체(S1+S)의 존재 하에서 대립 유전자 특이적 PCR에 의한 게놈 DNA에서 KRAS 유전자의 단일 뉴클레오티드 돌연변이(T/C)를 식별하는 실험의 개략적 도식을 제시한다. 프라이머 서열들은 도 2에 제시되어 있다. ΔCt 값은 프라이머 명칭 옆에 표시된다.
핵산의 템플릿-기반 합성의 효소 반응에서 변형된 올리고뉴클레오티드의 사용은 반응의 전반적인 수율에 영향을 미치는 다양한 효과를 수반할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 알려진 화학적 변형의 대부분은 효소와 핵산 기질의 상호 작용을 교란시킨다. 이러한 맥락에서, 올리고뉴클레오티드의 완전 비하전 유도체들은 결코 프라이머로 사용되지 않았으며, 이는 그러한 유도체들의 당인산 골격이 효소에 의해 인식되지 않을 것이라는 것이 문헌[9]에서 명백하게 보고되었기 때문이다.
본 발명은 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 시스템에서 포스포릴 구아니딘 부분을 사용한 프라이머의 사용 가능성을 설명한다. 유사체와 비교하여, 포스포릴 구아니딘 부분을 포함하는 프라이머를 이용한 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법[12-14]은 본 발명에 개시된 다양한 장점을 조합하고, 그러한 조합은 기술적 결과의 달성을 보장한다.
포스포릴 구아니딘 그룹(Z)을 포함하는 프라이머의 일반적인 구조는 도 1A에 도시되어 있으며, 여기서 각각의 치환기 R1, R2, R3 및 R4는 수소 원자 H 또는 선택적으로 치환된 유기 라디칼일 수 있다. 각각의 치환기 R1, R2, R3 및 R4는 H, C1~10 알킬, C2~10 알케닐, C2~10 알키닐, -C6~10 아릴 또는 -C5~10 헤테로아릴(예를 들어, 도 1A, g", g') 그룹으로부터 독립적으로 선택된다; 여기서 각 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌이 더 치환될 수 있다; 또한 R1 및 R2는, 그들이 결합되는 원자와 함께, 5~8원 헤테로사이클을 형성하거나; 일부 경우에, R1 및 R2는, 그들이 결합되는 원자와 함께, 5~8원 헤테로사이클, 특히 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린을 형성하는 것이 바람직한데, 이는 치환기들의 크기는 템플릿-기반 합성의 개시에 필요한 효소와 PG 올리고뉴클레오티드의 상호 작용을 차단해서는 안되기 때문이다. 바람직하게는, R1 및 R2는, 그들이 결합되는 원자와 함께, 5원 헤테로사이클, 예를 들어 피롤리딘(도 1, g"')을 형성한다. 일부 경우에, R2 및 R3는 함께 2~4원 알킬렌 또는 헤테로알킬렌 사슬을 형성하고, R1 및 R4는 각각 H 및 C1~4 알킬을 포함하는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 경우에, R2와 R3는 함께 CH2-CH2 사슬을 형성하고, R1 및 R4는 -H 또는 메틸이다(예를 들어, 도 1, g). 본 발명에 포함되는 바람직한 화합물들의 일부는 도 1B에 나타낸 구아니딘(g"), N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(g'), 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-이민(g), 또는 N,N'-비스(테트라메틸렌)구아니딘(g"') 잔기를 포함하는 PG 화학식에 해당한다.
도 1. 일반 형태의 프라이머와 비하전 포스포릴 구아니딘 그룹(Z)의 구조(A); 구아니딘(g"), N,N,N',N'-테트라메틸구아니딘(g'), 1,3-디메틸이미다졸리딘-2-이민(g), 또는 N,N'-비스(테트라메틸렌)구아니딘(g"') 잔기를 포함하는 사용된 포스포릴 구아니딘 그룹의 예(B).
PG-변형 프라이머의 구성 알고리즘은 올리고뉴클레오티드 내로 적어도 하나의 포스포릴 구아니딘 부분의 도입을 포함하고, 올리고뉴클레오티드의 완전 비하전 포스포릴 구아니딘 유도체를 프라이머로 사용할 수 있도록 한다(도 2). 그러나, 프라이머에서 포스포릴 구아니딘 부분의 존재는 프라이머 및 최종 생성물에 추가적인 특성을 제공하는 추가적인 작용기들의 도입을 배제하지 않는다. 예를 들어, 템플릿-기반 DNA 합성의 반응 생성물의 추가 검출을 위해, PG-변형 프라이머에 형광 표지 및 방사성 표지의 도입 가능성이 제시된다.
프라이머로 사용되는 (모든) 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 주요 특성 및 선택 기준 중 하나는 (초기 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 템플릿으로서 작용하는 경우), 상보적인 가닥의 3'-말단 영역의 합성 반응을 개시하기 위해 프라이머-템플릿 복합체를 형성하는 능력 및 상기 합성 반응을 위한 템플릿으로서 작용하는 능력이다. 인 원자 상의 치환기의 부피의 변화 뿐 아니라, 음으로 하전된 인터유닛(inter-unit) 인산염 그룹을 중성 그룹으로 대체하는 것은, DNA 및 RNA 템플릿과 상호 작용하는 올리고뉴클레오티드의 능력, 및 DNA-또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 연장되는 능력에 영향을 미친다. 본 발명은 프라이머로서 작용함과 동시에 상보적인 가닥의 연장 과정에서 템플릿의 특성을 제공하는 포스포릴 구아니딘 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증하는 실시예에 대한 설명을 포함한다. 템플릿-기반 DNA 합성, 특히 분자 진단, 생명 공학 및 유전 공학에서 DNA 증폭의 다양한 응용은 광범위한 DNA 폴리머라제의 사용을 시사한다. 포스포릴 구아니딘은, RNA-의존성 DNA 폴리머라제(실시예 11, 12) 뿐 아니라, 열주기(thermocyclic) 및 등온(isothermal) 모드의 조건 하에서 3'→5'/5'→3' 엑소뉴클레아제 활성의 존재와 무관하게, 중온성 및 고온성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제들 의 광범위한 기질로서 작용하는 것으로 나타났다.
본 발명은 폴리머라제 (효소적) 반응을 위한 다양한 온도(온도 프로토콜)에서 포스포릴 구아니딘 부분을 갖는 프라이머들의 사용 가능성을 나타낸다. 본 발명에 따른 새로운 부류의 프라이머들의 기재된 특성은 핵산의 검출 및 정량화를 위한 서로 다른 프로토콜에 기초한 합성 및 진단을 위한 시스템의 개발에 사용될 수 있다.
역전사 반응과 이어지는 PCR에서 RNA의 증폭뿐 아니라, PCR 반응에서 DNA의 증폭을 위한 PG-변형 프라이머들의 사용이 가장 요구되는 것으로 여겨진다. 미리 선택된 수와 위치의 포스포릴 구아니딘 부분을 갖는 프라이머를 사용하여 얻은 결과는 반응의 비특이적 생성물의 수율을 감소시킴으로써 증가된 특이성 및 민감성을 입증한다. 포스포릴 구아니딘 부분을 포함한 프라이머를 이용한 PCR 및 RT-PCR에 의한 핵산의 정성적 및 정량적 측정 결과의 품질을 향상시키는 주요 특징은, 종종 "프라이머-다이머"로 분류되는, 짧은 비특이적 생성물의 수율의 감소이다(실시예 8, 10, 12). 상기 기재된 특성은 핵산의 정량화의 민감도 및 신뢰성의 수준을 감소시킬 것이다. 부산물의 수율을 줄이는 것은 또한 반응 혼합물의 다른 구성 요소, 예를 들어, "핫 스타트" 기술을 개선하기 위한 이미 알려진 솔루션과 포스포릴 구아니딘 부분과 프라이머의 사용을 결합함으로써 달성될 수 있다. PCR에서 사용될 때, 포스포릴 구아니딘은 증폭 계수를 변경할 수 있다. PG-변형 단량체의 위치, 개수 및 주파수에 따라, 증폭 효율은 변형되지 않은 프라이머를 이용한 표준 반응과 같은 수준이거나 증폭을 완전히 제거하는 수준까지 현저하게 감소될 수 있다. 증폭 효율에 미치는 영향은 프라이머 뉴클레오티드 서열이 템플릿으로 작용하는 경우 두 가지 주요 단계인 중합 반응의 개시 및 상보적 가닥의 연장 단계에서 변형된 단량체의 참여로 인한 것일 수 있다. 약간의(10~15% 이내) 증폭 효율의 감소를 허용하는 변형된 단량체의 위치와 수를 선택할 때, 포스포릴 구아니딘 부분을 사용한 프라이머의 사용은, 특정 문제를 해결하기 위하여 표준(변형되지 않은) 프라이머로부터 전환할 때 증폭 프로토콜, 특히 PCR 및 RT-PCR의 변경을 필요로 하지 않는다. 또한, 실시예는 효소 반응에서 PG 변형 및 표준 프라이머의 동시 사용 가능성을 입증한다(도 10, 실시예 8). 또한, 포스포릴 구아니딘 부분을 포함하는 프라이머를 이용한 템플릿-기반 효소적 합성이 "회전환" 메커니즘에 의해 DNA의 등온 증폭 프로토콜에서 성공적으로 구현될 수 있음을 보여주었다. 대립 형질 특이적 PCR에서 PG 변형 프라이머의 사용은 게놈 내 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 검출의 신뢰성을 증가시킬 수 있다.
생거(Sanger) 방법에 의한 시퀀싱을 사용하여, 포스포릴 구아니딘 부분의 존재는 변형된 단량체와 효소의 상호 작용으로 인한 돌연변이 형성을 일으키지 않는 것으로 나타났다. 상기 특성은 핵산의 증폭, 미리 정의된 서열의 구성 및 기본 구조의 결정과 관련된 연구 및 실질적인 문제를 해결하기위한 PG-변형 프라이머의 적용 가능성을 제시한다.
가닥들 중 하나의 3'-말단 영역의 합성, 특히 "점착성(sticky)" 말단의 형성에 대한 제어는, 주어진 뉴클레오티드 서열을 갖는 인공 DNA 분자들을 구성함에 있어서 다수의 유전 공학적 과제를 해결하기 위한 관심 대상이다. 예를 들어, "점착성"-말단의 PCR 생성물은 발현 플라스미드 DNA 벡터의 구성에 사용될 수 있다. 본 발명은 전체 사이즈의 상보적 가닥을 획득하고, 3'-말단 유닛 부분의 합성을 방지할 수 있는 가능성을 보여준다.
증폭 시스템의 구성 요소들을 선택하는 중요한 변수는 템플릿으로 다양한 개체, 예를 들어, 인간과 동물의 질병의 진단에 필요한 전신 체액(예를 들어, 혈액과 혈액)뿐 아니라 합성 핵산, 플라스미드 DNA, 총 RNA, 및 세포와 조직의 게놈 DNA, 바이러스 핵산을 사용하여 반응을 수행할 수 있는 가능성이다. 본 발명을 예시하는 실시예에서, 템플릿의 상이한 변이체를 가진 PG-변형 프라이머의 성공적인 사용이 제시되고, 이는 얻어진 기술적 결과의 광범위한 구현 가능성을 제공한다.
종종, 상업적으로 입수가능한 즉시 사용 가능한 반응 혼합물이 일상적인 과제를 해결하기 위한 실험실 실험에 포함된다; 또한, 복잡한 단계별 조작은 일반적으로 실험을 수행하고 과학적 또는 진단적 결과를 달성하기 위해 필요한 구성 요소들 및 지침을 포함하는 시약 세트를 사용하여 수행된다. 실용적인 목적을 위해, 포스포릴 구아니딘 부분을 갖는 프라이머들을 이용한 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법은, 연구 및 진단 작업 모두를 해결하기 위한 요구되는 핵산의 검출 및 증폭을 위해 즉시 사용이 용이한 반응 혼합물 및 시약 또는 반응 혼합물 세트를 사용하여 구현될 수 있다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드의 포스포릴 구아니딘 유도체를 이용한 핵산의 증폭 단계는 그들의 구현, 예를 들어, 고성능 방법을 이용한 유전자 발현의 차동 분석을 위한 DNA 라이브러리의 제조를 위한 보다 복잡한 프로토콜 및 시약 세트의 일부가 될 수 있다. 제안된 방법의 사용은 템플릿-기반 DNA 합성의 일부 단계의 결과를 개선할 뿐만 아니라 개별 응용 분야에서 비특이적 부산물로부터의 중간 정제와 같은 일부 단계를 생략할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않는 구체적 구현을 위한 다음과 같은 실시예들에 의해 보다 상세히 예시된다. 실시예들로부터 발생하는 본 발명의 청구의 범위 내에 속하는 본 발명의 수많은 구체예들은 상기한 발명의 설명 및 다음의 실시예들에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 템플릿-기반 DNA 합성 반응에서 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드에서 특정 그룹 또는 특정 그룹과 위치의 조합의 적합성을 경험적으로 그리고 독립적으로 결정할 것이다.
실시예 1. 아래에 사용된 시스템에 대한 설명.
PG 올리고뉴클레오티드 및 변형되지 않은 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 도 2에 제시되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 8개 내지 40개의 뉴클레오티드 단위를 포함하고 있다. 포스포릴 구아니딘 그룹(PG)은 변형되지 않은(g'), 분지된(g'), 잠긴(g) 잔기 및 부피가 큰 치환기(g"')를 갖는 구아니딘 잔기로 제시된다(도 1B). 올리고뉴클레오티드 내의 PG의 수는 하나부터 100%까지 다양하다(도 2).
PG 올리고뉴클레오티드는 프라이머 올리고뉴클레오티드(도 3A) 또는 템플릿(도 3B) 역할을 하며, 형광 표지(* ―FAM 또는 TAMRA) 또는 방사성 표지([32P])를 포함한다.
원형(native) 올리고뉴클레오티드 및 PG 올리고뉴클레오티드(도 2), eGFP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA; 미리 첨가된 플라스미드 DNA를 포함하는 인간 전혈 및 혈장 제제; C형 간염 바이러스 RNA(HCV); 인간 유방 선암세포 MCF-7의 총 RNA; 플라스미드 pUC19; 인간 게놈 DNA가 템플릿으로 사용되었다.
3'→5'/5'→3' 엑소뉴클레아제 핵활성 유무와 무관하게 중온성 및 고온성 효소들이 DNA 폴리머라제로 사용되었다: Taq DNA 폴리머라제, T5 파지 DNA 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리머라제 I(클레노브 단편), DNA 폴리머라제 Pfu, RNA 의존DNA 폴리머라제(역전사 효소s) MMLV 및 HIV-p66; DNA 폴리머라제 phi29.
실시예 2. 열순환(1) 및 등온(2) 모드에서 열안정성 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 프라이머로의 PG 올리고뉴클레오티드.
(1) PG 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 입증하기 위해(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음), 반응 혼합물(10μl)은 다음을 포함하였다: 원형 올리고뉴클레오티드 M 30 (10μM); 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드 Z0 또는 PG 올리고뉴클레오티드 Z1÷ZH1(10μM, 프라이머 서열들 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있다); 트리포스페이트 세트(각각 0.1mM), dATP, dCTP, dGTP, 및 형광 표지된 dUTP(플루오레세인-6-아미노티오카보닐-[5-(3-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트]); 1.8mM MgCl2, Tris-HCl(10mM) pH 8.8, KCl(50mM); 0.1% Tween-20, Taq DNA 폴리머라제(2 단위 활성). 반응은 열순환 모드에서 수행하였다: 95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 30초(32 사이클). 25분 후, 아세톤 중의 2% 과염소산 리튬 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 모든 시료를 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 분석에 의해 분리하였고, 전기영동 분석 결과는 형광 스캐너를 사용하여 기록하였다(도 4A). DNA 템플릿에 대한 PG 올리고뉴클레오티드의 연장 효율(도 4A에서 Z1~ZF 레인들)을 원형 올리고뉴클레오티드 Z0(도 4A에서 Z0 레인)와 비교하였다.
(2) PG 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 입증하기 위해(해당 시스템은 도 3A에 도시되어 있음), 반응 혼합물(10μl)은 다음을 포함하였다: 원형 올리고뉴클레오티드 M40(30μM), 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 T0÷T3(10μM, 프라이머 서열들 T0÷T3는 도 2에 제시되어 있음); 트리포스페이트 세트(각각 0.2mM), 1.8mM MgCl2, Tris-HCl(10mM) pH 8.8, KCl(50mM); 0.1% Tween-20, Taq DNA 폴리머라제(1 단위 활성). 반응은 37℃에서 20~120분 동안 등온 모드(도 4B)에서 수행되었고, 아세톤 중의 2% 과염소산 리튬 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 모든 시료는 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기동분석에 의해 분리되었다. 반응의 전체 사이즈 생성물의 축적 정도는 레인 내의 모든 밴드의 총 강도(intensity)에 대한 반응 생성물에 해당하는 밴드 내의 강도의 비율로 계산하였다. 모든 실험에서의 상대적 판정 오차는 15%를 초과하지 않았다(도 4B).
PG 올리고뉴클레오티드가 열안정성 Taq DNA 폴리머라제의 존재 하에서 프라이머로서 작용할 수 있고, 열순환 온도 모드 조건 하에서, 자연 올리고뉴클레오티드 프라이머(Z0)와 같이 전체 사이즈 생성물로까지 연장할 수 있음을 알 수 있었다(도 4A). 연장 효율의 감소는 3'-말단에 가까운 두 개의 연속 PG를 포함하는 올리고뉴클레오티드(Z1, 2)에서 관찰되었다. 등온 조건(도 4B)에서, 유사한 결과가 관찰되었다: 올리고뉴클레오티드 T1 및 T2에 대한 반응의 전체 사이즈 생성물의 축적 정도는 T0에 근접하였다. 상기 반응의 전체 사이즈 생성물의 축적 정도의 감소는 3' 말단에 가까운 PG를 포함하는 올리고뉴클레오티드(T3)에 대해 관찰되었다.
실시예 3. 중온성 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드.
PG 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 입증하기 위해(시스템은 도 3A에 도시되어 있음), 반응 혼합물(5μl)은 다음을 포함하였다: 원형 올리고뉴클레오티드 M40(30 μM), 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 T0~T3(10μM, 프라이머 서열 T0~T3은 도 2에 제시되어 있음); 트리포스페이트 세트(각각 0.2mM), MgCl2(20mM), Tris-HCl(50mM) pH 8.0, NaCl(100μM), DTT(5mM), 0.1mg/ml BSA; T5 파지 DNA 폴리머라제(500μM). 반응은 6~60분 동안 수행되었고, 전기 영동용 시료를 적용하는 데 사용되는 7mM EDTA를 포함하는 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 모든 시료는 실시예 2(2)와 유사하게 분리 및 분석하였다. 모든 실험에서의 상대적 판정 오차는 15%를 초과하지 않았다(도 5).
전체 사이즈 생성물로 연장시키는 PG 올리고뉴클레오티드의 연장 효율은 원형 올리고뉴클레오티드(T0)의 경우보다 낮았지만, 모든 PG 올리고뉴클레오티드가 등온 모드에서 중온성 T5 파지 DNA 폴리머라제의 존재 하에서 프라이머로서 작용할 수 있었음을 알 수 있었다(도 5).
실시예 4. 열안정 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로서 PG 올리고뉴클레오티드.
PG 올리고뉴클레오티드를 템플릿으로 사용하는 것을 입증하기 위해(시스템은 도 3B에 도시되어 있음) 반응 혼합물(10μl)은 다음을 포함하였다: 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드 Z0 또는 PG 올리고뉴클레오티드 Z1÷ZF(10μM, 프라이머 서열들 Z0÷ZF는 도 2에 제시되어 있음), 형광 표지된 원형 프라이머 FAM-N 8 (10μM, 서열은 도 2에 제시되어 있음), dNTP 트리포스페이트의 완전한 세트(10mM), Taq DNA 폴리머라제(2 단위 활성), 1.8mM MgCl2, Tris-HCl(10mM) pH 8.8, KCl(50mM), 0.1% Tween-20. 반응은 열주기 모드에서 수행하였다: 95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 30초(32 사이클). 반응은 실시예 2(1)과 유사하게 중지 및 분석하였다.
모든 PG 올리고뉴클레오티드가 열순환 모드에서 열안정 Taq DNA 폴리머라제의 존재에서 템플릿으로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 6). PG-올리고뉴클레오티드의 PG와 3'말단 사이의 거리가 증가함에 따라 전체 사이즈 생성물로의 원형 올리고뉴클레오티드의 연장 효율이 증가하였다. 연속(ZH1)또는 교차 변형된(alternating modified) PG(ZH2, ZF)를 포함하는 PG 올리코뉴클레오티드는 전체 사이즈 생성물의 수율에 최대의 영향을 미쳤다.
실시예 5. 중온성 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 반응에서 템플릿으로서의 PG 올리고뉴클레오티드.
PG 올리고뉴클레오티드를 템플릿으로 사용하는 것을 입증하기 위해(시스템은 도 3B에 도시되어 있음), 반응 혼합물(10μl)은 다음을 포함하였다: 10μM의 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드 Z0 또는 PG 올리고뉴클레오티드 Z1~ZF(프라이머 서열들 Z0~ZF는 도 2에 도시되어 있음), TAMRA 표지된 원형 프라이머 *N 8 10μM(도 2), dNTP 트리포스페이트의 완전한 세트(10mM), 클레노브 단편(2 단위 활성), Tris-HCl(50mM), pH 7.6, MgCl2(10mM), DTT(5mM). 반응은 37℃의 등온 모드에서 30분간 수행하였다. 반응은 실시예 2와 유사하게 중지 및 분석되었다.
모든 PG 올리고뉴클레오티드가 중온성 중합효소, 즉 클레노브 단편의 존재 하에, 등온 모드에서 템플릿으로서 작용할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 7). 전체 사이즈 생성물로의 원형 올리고뉴클레오티드의 연장 효율은 PG와 원형 올리고뉴클레오티드의 3'말단 사이의 거리가 증가함에 따라 증가하였다. 연속된 포스포릴 구아니딘 그룹들을 포함하는 PG 올리고뉴클레오티드(ZH1)는 전체 사이즈 생성물의 수율에 최대의 영향을 미쳤다.
실시예 6. 프라이머로 PG 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 이용할 때의 PCR 효율.
eGFP 유전자 단편의 증폭은 50mM Tris-HCl pH 8.5, 50mM KCl, 0.2mM의 각 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 2mM MgCl2, 0.03 단위 활성/μl Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 반응용 완충용액에서 수행되었다.
증폭 모드는 95℃에서 5분간, 47 사이클:95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 10초였다.
10-9g 내지 10-17g의 eGFP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 10배 희석물을 템플릿으로 사용하였다.
도 8에 나타낸 쌍들은, 표준 원형 올리고뉴클레오티드들 및 PG 올리고뉴클레오티드들을 기초로 하며, 프라이머(전사+역전사)로 사용되었다. PG 올리고뉴클레오티드들은 올리고뉴클레오티드 가닥에서 포스포릴 구아니딘 단위의 수 및 위치가 달랐다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 각 프라이머의 농도는 500nM이었다.
증폭 효율은 LightCycler 96 계측기(Roche, 스위스)에서 삽입형 염료 SYBR Green I의 존재 하에서 실시간 PCR에 의해 결정되었다.
증폭 효율은 프로그램 LightCycler 96 소프트웨어 버전 1.1.0.1320에 구현된 상관성 Ct(lg C0)의 선형화 좌표접근법(여기서, Ct는 임계 사이클, C0은 템플릿의 초기 농도)을 사용하여 증폭 계수값(keff)에 기초하여 비교되었다. 증폭 계수값은 도 8에 도시되어 있다(3개 이상의 독립적인 실험들로부터 얻어진 PCR 효율 계수의 값이 주어짐; SD는 표준 편차). 프라이머 구조에서 단일 PG(프라이머 Z1÷Z9 참조)가 증폭 효율에 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 포스포릴 구아니딘 그룹의 영향은 프라이머 가닥에서의 위치에 의해 결정되었다. 연속적으로 배치된 PG(프라이머 ZH1)는 keff을 현저하게, 즉 1.44로 감소시켰다. "하나 건너 다음(next-but-one)" 위치(변형된 포스포릴 구아니딘 단위가 번갈아 나옴)에 변형을 도입하면 전체 사이즈의 생성물의 축적이 보장되었다.
실시예 7. 성장하는 DNA 가닥의 길이 결정.
eGFP 유전자 단편의 증폭은 실시예 6에서 이미 설명한 바와 같이 반응 완충용액에서 수행되었다.
증폭 모드는 95℃에서 5분, 28 사이클: 95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 10초였다.
반응 당 10-10g의 양으로 eGFP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 템플릿으로 사용하였다.
(*Q0 - Z0), (*Q0 - ZH1), (*Q0 - ZH2) 쌍들 (여기서, *는 형광 FAM 표지임)이 프라이머로 사용되었다. PG 올리고뉴클레오티드 서열은 도 2에 제시되어 있다. 각 프라이머의 농도는 500nM이었다.
단편 분석을 사용하여 PCR 생성물의 정확한 길이를 결정하는 것은 자동화된 모세관 분석기에서 수행되었다. 도 9에 제시된 데이터는 올리고뉴클레오티드 Z0 및 ZH2를 사용하여 228bp의 길이를 가진 전체 사이즈 PCR 생성물을 얻을 수 있음을 보여준다. 동시에, 올리고뉴클레오티드 ZH1을 사용하면, 5' 말단 전에 상보적 가닥(8) 뉴클레오티드들의 합성의 종료로 이어지고, 이는 "점착성" 말단들을 갖는 DNA 분자의 형성으로 이어진다.
실시예 8. 표준 및 PG 변형 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여
Taq
-DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR의 특이적 및 비특이적 생성물 축적의 비교.
eGFP 유전자 단편의 증폭은 실시예 6에서 이미 설명한 바와 같이 반응 완충용액에서 수행되었다.
증폭 모드는 실시예 7에 이미 설명되어 있다.
사용된 템플릿은 실시예 6에 이미 설명되어 있다.
표준 원형 올리고뉴클레오티드들(Q0-Z0)의 쌍, 변형된 PG 올리고뉴클레오티드들(QH2-ZH2)의 상, 표준 올리고뉴클레오티드와 변형된 올리고뉴클레오티드(QH2-Z0)의 쌍, 및 3가지 올리고뉴클레오티드들의 혼합물(Z0-QH2/Q0, 마지막 것들은 50/50%의 비율)이 프라이머로 사용되었다(전사-역전사). 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 각 프라이머의 농도는 500nM이었다.
PCR 생성물의 분석은 아가로즈 겔 전기영동법(도 10A 및 10B, M은 100~400 bp의 DNA 길이의 마커) 및 iQ5 계측기(Bio-Rad, USA)에서 삽입성 염료 SYBR Green I의 존재 하에 PCR 생성물의 열 변성(도 10B)에 의해 수행되었다.
변형된 PG 올리고뉴클레오티드(QH2-ZH2) 쌍을 사용하는 것은 신뢰성을 증가시키고, 이는 원형 올리고뉴클레오티드(Q0-Z0), 및 원형 뉴클레오티드와 변형된 올리고뉴클레오티드의 혼합물(QH2-Z0과 Z0-QH2/Q0)을 사용하는 것과 비교하여 비특이적 생성물의 형성을 현저히 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 10A 및 도 10B).
비특이적 생성물의 완전한 부재는, 원형 프라이머와 비교하여, 변형된 PG 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 대해 지연된 "핫" 스타트를 갖는 PCR 시스템을 사용하여 달성되었다(도 10B).
실시예 9. 성장하는 DNA 가닥에서의 돌연변이 분석.
eGFP 유전자 단편의 증폭은 실시예 6에서 이미 설명한 바와 같이 반응 완충용액에서 수행되었다.
증폭 모드는 실시예 7에 이미 설명되어 있다.
사용된 템플릿은 실시예 6에 이미 설명되어 있다.
(Q0-Z0), (Q0-ZH1), (QH2-ZH2)의 쌍들이 프라이머로 사용되었다(전사-역전사). 올리고뉴클레오티드 서열은 도 2에 제시되어 있다.
증폭이 완료된 후, 형광 표지된 터미네이터 BigDye 3.1을 사용하여 표준 절차에 따라 Sanger의 방법에 의한 PCR 생성물 정제 및 시퀀싱을 수행하였다. 원형 올리고뉴클레오티드 프라이머들(Q0 및 Z0)이 시퀀싱에 사용되었다. 도 11은, 원형 올리고뉴클레오티드 프라이머들 Q0(오른쪽 컬럼) 및 Z0(왼쪽 컬럼)을 사용하여, 중앙에 나타난 프라이머 쌍의 존재 하에서의 증폭 후, DNA 생성물의 Sanger 시퀀싱의 결과를 나타낸다. 프레임은 초기 프라이머들의 영역을 나타낸다.
원형 프라이머 쌍의 존재 하에서 성장하는 DNA 가닥의 뉴클레오티드 조성은, 하나의 프라이머 또는 두 프라이머 모두가 PG를 포함하는 프라이머 쌍의 존재 하에서 수득된 조성물에 대응하는 것을 알 수 있었다(도 11). 초기 프라이머에서 PG의 존재는 프라이머 영역에서 상보적 가닥을 연장할 때 성장하는 DNA 가닥에서 돌연변이를 일으키지 않았다. 동시에, 인접한 위치에 연속된 PG의 존재는 변형된 템플릿에서 성장하는 가닥의 연장을 종료시키고, 단일 가닥의 "점착성 말단"을 형성하여, 실시예 7에 설명된 바와 같이, 최종 생성물의 길이를 제어할 수 있었다.
실시예 10. 상용 PCR 시스템에서 사용된 DNA 폴리머라제의 프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드의 사용.
PG 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 것을 입증하기 위해 3개의 상용 시스템을 선택하였다. DNA 폴리머라제 Pfu(Sileks, 러시아)를 포함하는 시스템 I; 긴 단편의 PCR("원거리(long range)" 유형의 PCR)에 대한 폴리머라제 Taq 및 Pfu(Biolabmix, 러시아)의 혼합물을 포함하는 시스템 II; 폴리머라제 "인블러드"(Evrogen, 러시아)를 포함하는 전혈 "인블러드 PCR 키트"(Evrogen, 러시아)에서의 PCR을 위한 시스템 Ⅲ.
시스템 I 및 II의 경우, eGFP 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 1ng을 템플릿으로 사용하였고, 증폭은 95℃에서 5분간 예비 변성, 32 사이클: 95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 10초 동안 72°C로 수행하였다.
시스템 III의 경우, 2%의 비율로 체액(혈장만) 1μl 당 0.2ng의 플라스미드 DNA를 미리 첨가한 인간 전혈 및 혈장의 조제물을 템플릿으로 사용하였고, 25μl의 반응 혼합물 총 부피의 5%, 10%, 20%, 및 25%를 템플릿으로 사용하였다. 증폭은 95℃에서 5분, 26 사이클: 95℃에서 10초, 61℃에서 10초, 72℃에서 10초로 수행하였다.
사용된 프라이머 쌍들은 (Q0- Z0), (Q0- ZH2), (QH2 - Z0), (QH2 - ZH2)였다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다.
아가로즈 겔 전기영동에 의한 PCR 생성물의 분석 결과는 도 12에 제시된다(여기서, M은 100~500bp의 DNA 길이의 마커임). 다양한 상용 폴리머라제 및 완충 혼합물의 존재 하에서 PG 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용함으로써, 주어진 길이의 PCR 생성물이 특이적으로 형성되었을 알 수 있었다(도 12A 및 도 12B). PG 올리고뉴클레오티드는 체액에서의 PCR에 적합했다. 본 결과에 따라 상용 PCR 시스템에 사용되는 다양한 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는 PCR에서 프라이머로 PG 변형 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 효율적으로 사용할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 11. RNA-의존성 DNA 폴리머라제(역전사효소; revertases)에 대한 프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드.
본 실시예는, 원형 올리고뉴클레오티드(P0)와 비교하여, C형 간염 바이러스(HCV) RNA의 검출을 위한 프라이머로서 플루오레세인으로 표지된 PG 올리고뉴클레오티드들(P7~P24)의 사용 가능성을 입증하였다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 변형된 PG 프라이머들은 (올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서부터) 7개 내지 21개의 연속된 PG를 포함한다.
HCV에 감염된 기증자의 신선한 혈액 혈청이 분석을 위한 출발물질로 사용되었다. HCV RNA는 "RealBest" Extraction 100 키트(Vector-Best, 러시아)를 사용하여 분리하고, 역전사 단계에서 원형 올리고뉴클레오티드(P0) 또는 PG 올리고뉴클레오티드(P7-P21) 및 역전사 효소(MMLV 또는 HIV-p66)를 사용하여 기재된 절차에 따라 RT-PCR 반응에 도입하였다. 역전사 반응(50μl)은, PG 올리고뉴클레오티드들(0.5 μM), MgCl2(3mM), Tris-HCl(50mM) pH 8.0, (NH4)2SO4(10mM), KCl(30mM), 0.01% Tween-20, dNTP 트리포스페이트 세트(각각 0.4mM), BSA 100μg/ml, MMLV 또는 HIV-p66(10 단위 활성)의 혼합물에서 수행되었다. 역전사 반응은 다음 온도 모드에서 적어도 2개의 중복유전자(duplicates)에서 수행되었다: 45℃에서 30분, 95℃에서 3분.
다음으로, 수득된 cDNA는 HCV 특이적 단편의 PCR에 사용하였다. PCR은 다음과 같은 조성의 혼합물에서 수행되었다: 프라이머 CTCCCGGGAGAGCCATAG 및 TCCAAGAAAGGACCCGGTC(각 0.5μM), 버퍼(MgCl2(3mM), Tris-SO4(50mM) pH 8.0, (NH4)2SO4(10mM), KCl(30mM), 0.01% Tween-20), Taq DNA 폴리머라제(1 단위 활성), 형광 표지된 가수분해성 프로브 5'-ROX-TCTGCGGAACCGGTGAGTACACCG-(BHQ2)(0.25μM), SYBR Green I(1/10000로 희석) 또는 SYTO-13(10/2500으로 희석). 증폭은 50℃에서 2분, 49 사이클: 94℃에서 10초, 60℃에서 20초, 5℃에서 5초, 95℃에서 1분으로 수행되었다. CFX96 계측기(BioRad, USA)와 RealBest HCV RNA 키트를 이용한 HCV 검출 과정은 두 채널을 통해 실시간 모드로 수행되었다: ROX는 형광으로 표지된 가수분해성 프로브의 특이적 검출이며, FAM은 SYBR Green I 염료(도 13, 일반 스타일) 또는 SYTO-13(도 13, 굵게 착색된 하이라이트로 표시)을 사용하는 dsDNA의 비특이적 검출이다. 증폭의 결과로, PCR 완충 조건 하에서 86~88℃의 용융점을 가지는 79bp DNA 단편이 수득되었다.
프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드 및 원형 올리고뉴클레오티드의 기질 특성의 비교는 반응 임계 사이클값 Ct(threshold cycle)를 결정함으로써 수행되었고, 이는 도 13에 도시되어 있다. Ct 값은 실시예 6에 이미 설명한 바와 같이 계산되었다. PG 올리고뉴클레오티드가 RNA-의존성 DNA 폴리머라제(MMLV 및 HIV-p66 역전사 효소)를 사용하여 분석된 RNA 템플릿 상에서 cDNA를 획득할 때 프라이머로서 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 12. 원스텝 RT-PCR 시스템에서 DNA 폴리머라제의 프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드.
MMLV 역전사 효소 및 열안정성 DNA-의존성 Taq DNA 폴리머라제, 인간 U12 snRNA 서열에 특이적인 프라이머들을 포함하는 원스텝 RT-PCR "BioMaster RT-PCR SYBR Blue(2×)"(Biolabmix, 러시아)을 위한 시스템이 사용되었다.
원형 올리고뉴클레오티드들(U0, V0) 및 PG 올리고뉴클레오티드들(UH1, VH1, WH1)을 프라이머로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 각 프라이머의 농도는 480~700nM이었다.
RT-PCR은 6ng/μl 내지 8pg/μl의 농도 범위에서 인간 유방 선암 세포 MCF-7의 총 RNA 조제물에서 수행되었다.
역전사(reverting) 반응은 45℃에서 45분 동안 수행되었다.
증폭 모드는 95℃에서 5분, 48 사이클: 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초였다.
RT-PCR 생성물의 분석은 열 변성 및 수평 겔 전기영동에 의해 1.5% 겔에서 수행되었고, 이어서 브롬화 에티듐으로 뉴클레오티드 물질의 가시화를 수행하였다(도 14A, 100~400bp DNA 길이의 마커가 있음). 분석된 프라이머 쌍들의 경우, 겉보기 효율 계수는 (U0-V0) 쌍에서 1.7, (UH1-VH1) 쌍에서 1.63, 및 (UH1- WH1) 쌍에서 1.56으로 결정되었다.
PG-변형 프라이머들을 사용할 때, 더 낮은 용융점을 가진 비특이적 증폭 생성물들이 훨씬 더 적게 형성되었음을 알 수 있었다(도 14B). 얻어진 결과들은, 원스텝 RT-PCR 시스템에서 PG 올리고뉴클레오티드들을 프라이머로 사용하는 것, 즉 PG-변형 프라이머들의 사용에 의해 (RNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는) RT 단계 및 (DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매작용되는) 증폭 단계에서 씨드(seeds)로 작용할 수 있음을 보여주었다.
실시예 13. 회전환(rolling circle) 메커니즘(RCA)에 의한 증폭 반응에서 프라이머로서의 PG 올리고뉴클레오티드.
본 실시예는 PG 올리고뉴클레오티드 및 자연 올리고뉴클레오티드를 사용할 때 회전환 메커니즘(RCA)에 의한 DNA 증폭 반응의 효율을 비교하여 제시한다.
DNA 플라스미드 pUC19(0.2ng)의 증폭은, Tris-HCl(50mM) pH 7.5, MgCl2(10mM), (NH4)2SO4(10mM), DTT(4mM)를 포함하는 반응 완충용액에서, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 세트(각각 0.2mM), BSA(200ng/μl), 삽입형 염료 SYBR Green I, DNA 폴리머라제 phi29(0.5 단위 활성/μl)의 존재 하에서 수행되었다.
증폭 모드는 30℃에서 14시간이었다.
PG 올리고뉴클레오티드들(D2 및 D3) 및 원형 올리고뉴클레오티드(D0)를 프라이머로 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 서열들은 도 2에 제시되어 있다. 변형된 PG 프라이머들은 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 2개, 최대 3개의 연속 PG를 포함하고 있었다.
증폭 생성물들은 마커(M)로서 200ng의 플라스미드 pUC19를 사용하여 0.8% 아가로즈에서 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였다. 그 분석 결과는 도 15A에 제시되어있고, "K-"는 프라이머가 없는 대조 반응의 결과에 해당한다. PG 올리고뉴클레오티드들의 경우, 증폭 생성물의 축적이 관찰되었음을 알 수 있었다(도 15A). 동시에, 증폭 생성물(각 프라이머 D2, D3 및 D0에 대해)은 3×10-6배로 희석되었고, 얻어진 용액 50μl를, 105개 뉴클레오티드 길이의 pUC9 사이트에 대한 형광 표지된 가수분해성 프로브의 존재 하에, 실시간 모드로 9개의 중복 유전자에서 PCR 방법에 의하여 증폭 계수를 평가하는데 사용하였다. 이어서, 임계 반응 사이클의 평균값(Ct), 및 특이적 프라이머의 Ct와 증폭 반응의 초기 조건에 해당하는 초기 템플릿의 희석물(0.2ng의 DNA 플라스미드 pUC19의 증폭) 사이의 차이(ΔCt)를 계산하였다.
얻어진 ΔCt값은 초기 조건의 효율이 1이라는 가정 하에 RCA 증폭 계수를 계산하는데 사용되었다(도 11B). 표에 제시된 데이터를 비교할 때, PG 올리고뉴클레오티드들(D2 및 D3)을 사용할 때 원래의 원형 프라이머(D0)보다 증폭 계수가 더 높았으며, 다시 말해, 9.4에 비해 각각 247.3 및 29.9로 더 높은 것으로 나타났다.
실시예 14. 대립유전자-특이적 PCR에서 프라이머로서 PG 올리고뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 검출의 선택성 증가.
템플릿의 증폭은 Tris-HCl(65mM) pH 8.9; (NH4)2SO4 (24mM); MgSO4 (3mM), 0.05% Tween-20, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 세트(각각 0.2mM), Taq DNA 폴리머라제(0.03 단위 활성/μl), 형광 표지된 가수분해성 프로브 5'-HEX- CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ2-3' (100nM)를 포함하는 완충용액에서 수행되었다.
증폭 모드는 95℃에서 3분, 50 사이클: 95℃에서 10초, 60℃에서 40초였다.
KRAS 유전자 단편(GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTG(G/A)CGTAGGCAAGAG TGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATG)에 돌연변이 c.38G>A(G13D)를 포함하는 대조 플라스미드를 추가하거나 추가하지 않은 대장암 조직을 가진 조직학적 블록으로부터 분리된 인간 게놈 DNA 2ng을, 게놈 DNA에서 KRAS 유전자 단편의 총량에 대하여 1.1%의 양으로 템플릿으로 사용하였다.
올리고뉴클레오티드 쌍(전사 +역전사)이 프라이머로 사용되었다: 원형 올리고뉴클레오티드들(S0+S 및 S1+S), 여기서 S와 S0는 자연 올리고뉴클레오티드, S1은 PG 올리고뉴클레오티드이다. 각 프라이머를 300nM의 농도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 프라이머 구조는 도 2에 제시되어 있다. 프라이머의 쌍(S0+S 및 S1+S)의 존재 하에서 대립유전자 특이적 PCR 방법을 사용하는 템플릿에서의 단일 뉴클레오티드 돌연변이(T/C)의 검출의 개략적 개념은 도 16에 도시되어 있다.
돌연변이 검출의 선택성은 LightCycler 96 계측기(Roche, 스위스)를 사용하여 실시간 PCR에 의해 결정되었다.
프라이머의 각 쌍에 대해, 임계값 반응 싸이클(Ct)의 평균값, 및 1.1% 돌연변이를 포함하는 시료와 돌연변이를 포함하지 않는 시료 사이의 차이(ΔCt)를 계산하였다. (S1+S)쌍의 ΔCt는 9.27, (S0+S)는 4.42(도 16, ΔCt 값은 해당 프라이머의 명칭 옆에 표시)인 것으로 나타났다. 따라서, PG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 쌍의 선택성이 원형 올리고뉴클레오티드에 기초한 쌍의 선택성보다 높았다는 결론을 내릴 수 있다.
참고 문헌 목록
1.
Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. - 1985. - V. 230. - P. 1350-1354.
2.
Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. - 1987. - V. 155. - Р. 335-350.
3.
Ballantyne K.N., van Oorschot R.A., Mitchell R.J. Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance // Genomics. - 2008. - V. 91. - P. 301-305.
4.
Brent C. Satterfield cooperative primers : 2.5 million-fold improvement in the reduction of non-specific amplification // J. Mol. Diagn. - 2014. - V. 16. - P. 163-173.
5.
Bodepudi V., Schoenbrunner N.J., Will S. Methods and reagents for reducing non-specific amplification // WO 2013091835 A1, 2013. 06. 27.
6.
Schneider U.V., Mikkelsen N.D., Lindqvist A., Okkels L.M., JøN., Lisby G. Improved efficiency and robustness in qPCR and multiplex end-point PCR by twisted intercalating nucleic acid modified primers // PLoS One. - 2012. - V. 7. - e38451.
7.
Wanli Bi. Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide // US 8,334,099 B2. 2012. 12. 18.
8.
Lebedev A.V., Paul N., Yee J., Timoshchuk V.A., Shum J., Miyagi K., Kellum J., Hogrefe R.I., Zon G. Hot start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance // Nucleic Acids Res. - 2008. - V. 36. - e131.
9.
Summerton J., Stein D., Huang S.B., Matthews P., Weller D., Partridge M. Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. - 1997. - V. 7. - P. 63-70.
10.
Chan H.W.-H., Yang Y.-S., Chen W.-Y. Partially neutral single-stranded oligonucleotide // US 20170015699 A1, 2017. 01.
11.
Robinson P.S., Holme J., Jain N. Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group // WO2013140107 A1, 26 September 2013.
12.
Stetsenko D., Kupryushkin M., Pyshnyi D. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis // WO 2016028187 A1, 2016. 02. 25.
13.
Kupryushkin MS, Pyshnyi DV, Stetsenko D.A. Phosphoryl guanidines. A new class of nucleic acid analogues // Acta Naturae. ― 2014. ― V. 6. ― No. 4. ― P. 116-118.
14.
Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova T.V., Kuznetsova A.A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V, Fedorova O.S. New Oligonucleotide Derivatives as Unreactive Substrate Analogues and Potential Inhibitors of Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease APE1 // Molecular BioSystems. - 2016. - V. 12. - N 1. - P. 67-75.
Claims (9)
- 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법으로서, 합성 반응을 시작하기 위해 하기 일반식(I)로 표시되는 적어도 하나의 인터유닛(inter-unit) 포스포릴 구아니딘 그룹을 포함하는 프라이머를 사용하는 방법:
(I)
X는 상기 인터유닛 포스포릴 구아니딘 그룹의 5' 측의 올리고머(프라이머)의 하나의 단위 또는 단위들의 가닥이고,
Y는 상기 인터유닛 포스포릴 구아니딘 그룹의 3' 측의 올리고머(프라이머)의 하나의 단위 또는 단위들의 가닥이고,
각각의 치환기 R1, R2, R3 및 R4는 수소 원자(H) 또는 임의로 치환된 유기 라디칼일 수 있다. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 핵산의 증폭에 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄 반응을 수행하기 위해 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 역전사에 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 역전사 단계 및 그에 이어지는 중합효소 연쇄 반응 단계 모두에서 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 회전환 메커니즘에 의한 핵산의 증폭에 사용되는 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법. - 제1항에 따른 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법을 위한 반응 혼합물.
- 제1항에 따른 템플릿-기반 효소적 DNA 합성 방법을 위한 반응 혼합물들의 세트.
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