KR20200091658A - Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a Zika virus detection method using a monoclonal antibody pair. A sandwich immunoassay-based monoclonal antibody chip of the present invention can be usefully used to diagnose Zika virus infection or to confirm presence or absence of Zika virus through detection of a protein biomarker constituting Zika virus. The Zika virus detection method using the monoclonal antibody pair includes the following steps of: fixing a capture antibody; touching a biological sample; touching a probe antibody; and detecting complex formation.

Description

단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법{Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair}Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair}

본 발명은 지카 바이러스(Zika Virus)를 구성하는 단백질 바이오마커(Biomarker) 검출을 통해 지카 바이러스 감염증을 진단하거나, 지카 바이러스의 존재 유무를 확인하는데 활용될 수 있는 기술이다. 또한 종래의 여러 종류의 면역분석법과 달리, 지카 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커에만 특이적으로 결합하는 1쌍의 단일클론항체를 이용하여 다른 플라비바이러스(Flavivirus)와 교차반응(Cross-Reactivity) 없이 오직 지카 바이러스만을 선택적으로 검출이 가능한 기술이다. 본 발명은 조직(Tissue), 혈액(Blood), 체액(Body Fluid), 소변(Urine), 타액(Saliva) 등과 같은 임상적 평가에 사용될 수 있는 검체(Clinical Specimen)는 물론, 연구용 시료나 식품 내에 존재하는 지카 바이러스의 존재 유무 판단 및 지카 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커의 양을 객관적으로 분석하는데 활용될 수 있는 기술이다.The present invention is a technique that can be used to diagnose a Zika virus infection through the detection of a protein biomarker (Zio Virus) constituting the Zika virus, or to confirm the presence or absence of a Zika virus. In addition, unlike several types of immunoassays, a pair of monoclonal antibodies that specifically bind only to the protein biomarker constituting the Zika virus is used without cross-reactivity with other Flaviviruses . It is a technology that can selectively detect only Zika virus. The present invention can be used in clinical evaluations such as tissue, blood, body fluid, urine, saliva, etc., as well as in clinical samples or food. It is a technique that can be used to objectively analyze the amount of protein biomarkers that make up the presence and absence of existing Zika virus.

지카 바이러스(Zika Virus)는 대표적인 모기매개(Mosquito-Borne) 바이러스 중의 하나다. 지카 바이러스는 단일 (+)가닥 RNA 바이러스(Single Positive-Stranded RNA Virus)로, 플라비비리데과(Flaviviridae Family)의 하위 속인 플라비바이러스속(Flavivirus Genus)에 해당한다(Rodenhuis-Zybert et al., Cell. Mol. Life Sci. (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786., Guzman et al. Nat. Rev. Dis. Primers (2016) Vol. 2, pp. 16055.). 플라비바이러스속에는 여러 종(Species)의 바이러스가 있으며, 진드기매개 바이러스(Tick-Borne Virus) 및 모기매개 바이러스(Mosquito-Borne Virus)로 나뉠 수 있다. 모기매개 바이러스에는 지카 바이러스 외에도 뎅기 바이러스(Dengue Virus), 황열 바이러스(Yellow Fever Virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis Virus), 세인트루이스뇌염 바이러스(St. Louis Encephalitis Virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus) 등이 있다.Zika Virus is one of the representative Mosquito-Borne viruses. Zika virus is a single positive-stranded RNA virus, which belongs to the Flavivirus Genus, a subgenus of the Flaviviridae family (Rodenhuis-Zybert et al ., Cell.Mol . Life Sci. (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786., Guzman et al . Nat. Rev. Dis. Primers (2016) Vol. 2, pp. 16055.). There are several species of viruses in the genus Flavivirus, and can be divided into tick-borne virus and mosquito-borne virus. In addition to the Zika virus, mosquito-borne viruses include Dengue Virus, Yellow Fever Virus, Japanese Encephalitis Virus, St. Louis Encephalitis Virus, and West Nile Virus. And so on.

플라비바이러스는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm 이며, 약 10,000~11,000개의 염기(Base)로 구성되어 있다. 외피 단백질(Envelope Protein)과 정이십면체형의 캡시드 단백질(Icosahedral-Like Nucleocapsid Protein)은 대칭형태이며, 바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(Structural Protein)과 비구조단백질(Non-Structural Protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(Capsid Protein), 전구체 막 단백질(Precursor Membrane Protein), 막 단백질(Membrane Protein), 외피 단백질(Envelope Protein) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(Non-Structural Protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다 (https://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). 따라서 플라비바이러스에 해당하는 지카 바이러스를, 항체를 이용하여 검출하고자 할 경우 지카 바이러스의 외부에 노출되어 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B, 비구조단백질 4A 및 4B 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다.Flaviviruses all have a common structure. Spherical structure, the size is 40~65 nm, and it is composed of about 10,000~11,000 bases. Envelope Protein and Icosahedral-Like Nucleocapsid Protein are symmetrical, and the appearance of the virus can be observed with an electron microscope. Proteins constituting the flavivirus can be largely classified into structural proteins and non-structural proteins, and the structural proteins include capsid proteins, precursor membrane proteins, and membranes. Protein (Membrane Protein), envelope protein (Envelope Protein), etc., non-structural protein 1 (Non-Structural Protein 1, NS1), non-structural protein 2A (NS2A), non-structural protein 2B (NS2B), non-structural protein 3 ( NS3), non-structural protein 4A (NS4A), non-structural protein 4B (NS4B), non-structural protein 5 (NS5). Although the functions or roles of all proteins have not yet been identified, it has been found that precursor membrane proteins, envelope proteins, nonstructural proteins 1, parts of nonstructural proteins 2A and 2B, and parts of nonstructural proteins 4A and 4B are exposed outside the virus. Yes (https://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). Therefore, when a Zika virus corresponding to a Flavivirus is to be detected by using an antibody, it is exposed to the outside of the Zika virus, and thus it is an envelope protein, non-structural protein 1, and non-structural protein 2A that is easy to access and bind (or react with) the antibody. And 2B, non-structural proteins 4A and 4B, may be useful biomarkers (targets, target substances).

지카 바이러스는 2015년 이후 브라질을 시작으로, 미국, 유럽, 아시아 국가에 거주하고 있는 인류에게 커다란 고통과 공포를 안겨주었다. 세계보건기구(World Health Organization)에 따르면, 브라질에서만 150만명 이상의 감염자가 발생했고, 전 세계의 감염자를 포함하면 수 백만명에 이르는 것으로 보고됐다(Samarasekera et al., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 521-524.). 지카 바이러스의 감염 증상은 다른 플라비바이러스들과 마찬가지로 발열, 충혈, 구토, 설사, 근육통 등의 경미한 증상으로 알고 있었지만, 최근 발생한 전 세계 대발생(Outbreaks) 과정을 거치면서 신생아소두증(microcephaly)나 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome)과 같은 신경계에 치명적인 질병을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한 다른 플라비바이러스와 달리 단순히 모기에 물리는 것 뿐만 아니라, 성적인(sexual) 접촉을 통해서도 감염될 수 있는 것으로 보고됐다 (Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 1531-1539.).The Zika virus, which began in Brazil since 2015, has brought great suffering and fear to humans living in the United States, Europe and Asian countries. According to the World Health Organization, more than 1.5 million people have been infected in Brazil alone, and millions of people worldwide have been reported (Samarasekera et al ., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 521-524.). Zika virus infection symptoms, like other flaviviruses, were known to be minor symptoms such as fever, hyperemia, vomiting, diarrhea, and muscle pain.However, as the recent outbreaks of the world have progressed, microcephaly or guileen It has been found to cause fatal diseases in the nervous system, such as Guillain-Barre Syndrome. It has also been reported that unlike other flaviviruses, it can be infected not only by mosquito bites, but also through sexual contact (Honein et al ., JAMA) (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro . (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al ., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 1531-1539.).

지구온난화에 의한 열대, 아열대, 온대 지역의 확대로 인해 지카 바이러스의 주요 숙주(Host)인 각다귀속(Aedes Genus)에 해당하는 흰줄 숲모기(Aedes albopictus) 및 이집트 숲모기(Aedes aegypti)의 서식지가 확대되고 있다(Kraemer et al., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347.). 지카 바이러스와 마찬가지로 뎅기 바이러스도 숙주가 같기 때문에, 뎅기 바이러스의 분포로 미루어 짐작해보면 전 세계 인구 중 약 40%(25억명)의 인구가 지카 바이러스의 감염 위험에 노출되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 현재까지 아시아, 중남미, 북미, 오세아니아, 아프리카 대륙의 약 86개 국가에서 지카 바이러스 감염 환자가 발생한 것으로 보고되고 있으며, 감염된 환자의 약 80% 정도는 불현성 감염이며, 증상은 3-7일 정도 경미하게 진행된다고 알려져 있다. 또한 주요 증상은 반점구진성 발진이며, 관절통, 근육통, 결막염, 발열, 두통 등이 동반될 수 있다고 알져 있으며, 아직까지 특별한 예방주사나, 백신, 치료제는 없다(대한민국 질병관리본부(KCDC) 감염병관리 > 질병정보 > 지카 바이러스 감염증(Zika Virus Disease) (2018)). 따라서 신속한 조기 진단을 통한 충분한 휴식 및 수분 섭취나 진통제 및 해열제 복용이 매우 중요하다.Due to the expansion of tropical, subtropical, and temperate regions due to global warming, white-edged forest mosquitoes ( Aedes Genus), the main host of the Zika virus ( Aedes Genus) Albopictus ) and Egyptian forest mosquitoes ( Aedes aegypti ) are expanding habitats (Kraemer et al ., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347.). Since the dengue virus, like the Zika virus, has the same host, it can be estimated from the distribution of the dengue virus that approximately 40% (2.5 billion) of the world's population is at risk of infection. To date, there have been reported cases of Zika virus infection in about 86 countries in Asia, Central and South America, North America, Oceania, and the African continent. About 80% of those infected are non-contagious, and the symptoms are mild, about 3-7 days. It is said to proceed. Also, the main symptom is spot papular rash, and it is known that joint pain, muscle pain, conjunctivitis, fever, headache, etc. can be accompanied, and there are no special preventive injections, vaccines, or treatments yet (KCDC) > Disease Information> Zika Virus Disease (2018). Therefore, it is very important to take sufficient rest and moisture through rapid early diagnosis or to take painkillers and antipyretics.

지카 바이러스 검출 기술 및 지카 바이러스 감염증 진단 기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역분석법(Immunoassay), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular Diagnostics), 3) 바이러스 배양법과 같이 크게 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 분석법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법도 검출하고자하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or Antibody) Detection) 및 항원 검출법(Antigen Detection)으로 다시 세분화 할 수 있다. 특히 미국 CDC (Centers for Disease Control and Prevention)에서는 혈청학적 검출법인 MAC-ELISA (IgM Antibody Capture ELISA)를 지카 바이러스 감염 여부 확인을 위한 표준 진단법 중의 하나로 권고하고 있다(미국 CDC, https://www.cdc.gov/zika/hc-providers/types-of-tests.html). Zika virus detection technology and Zika virus infection diagnosis technology are largely 1) immunoassay using antigen-antibody reaction (Immunoassay), 2) molecular diagnostic method for detecting nucleic acid (gene) of virus, 3) virus culture method There are three major categories. Among these, the immunoassay method has an advantage of being able to detect rapidly because the assay method is relatively simple and the time required for analysis is shorter than that of the molecular diagnosis method or the virus culture method. The immunoassay can also be further subdivided into serological (or antibody) detection and antigen detection according to the type of substance to be detected. In particular, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) recommends serological detection method MAC-ELISA (IgM Antibody Capture ELISA) as one of the standard diagnostic methods for determining whether Zika is infected (US CDC, https://www. cdc.gov/zika/hc-providers/types-of-tests.html).

특히, 지카 바이러스는 같은 생물학적 속에 해당하는 뎅기 바이러스와 마찬가지로 감염 초기에는 발열, 발진, 구토, 근육통 등의 공통적인 증상을 나타내 감염증을 구별하기 어렵지만, 일부 병증이 진행되거나 심각한 경우에는 뎅기 바이러스는 출혈열, 쇼크 등을 나타내는 반면 지카 바이러스의 경우 소두증(Microcephaly), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 신경계 손상 등을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 두 바이러스의 정확한 구별이 필요하다(Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) pp. 1531-1539.). 또한 지카 바이러스 및 뎅기 바이러스의 최초 감염(Primary Infection), 2차 감염(Secondary Infection) 및 교차 감염(Cross Infection)에 따른 감염 증상 및 면역 반응이 일부 달라질 수 있는 것으로 보고되고 있기 때문에, 지카 바이러스와 뎅기 바이러스에 대한 구별이 더욱 중요한 상황이다(Bardina et al., Science (2017) Vol. 356, pp. 175-180., Tsai et al., Clin . Infect. Dis . (2017) Vol. 65, pp. 1829-1836., Herrera et al., mBIO (2018) Vol. 9, e00755-18.). In particular, the Zika virus, like the dengue virus, which belongs to the same biological genus, has common symptoms such as fever, rash, vomiting, and muscle pain in the early stages of infection, but it is difficult to distinguish infectious diseases. While Zika virus is known to cause shock, it is known to cause microcephaly, Guillain-Barre syndrome, and nervous system damage, so it is necessary to accurately distinguish the two viruses (Honein et al. , JAMA) (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al. , Lancet (2016) pp. 1531-1539.). In addition, Zika virus and Dengue virus are reported to have different infection symptoms and immune responses due to primary infection, secondary infection, and cross infection. The distinction between viruses is a more important situation (Bardina et al. , Science (2017) Vol. 356, pp. 175-180., Tsai et al., Clin . Infect. Dis . (2017) Vol. 65, pp. 1829-1836., Herrera et al ., mBIO (2018) Vol. 9, e00755-18.).

하지만 지카 바이러스와 뎅기 바이러스는 약 70% 이상이 동일하거나 특징이 유사한 아미노산으로 구성되어 있기 때문에, 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 궁극적으로 지카 바이러스만을 특이적으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다(최재원 외, 한국콘텐츠학회논문지 (2018), Vol. 18, pp. 99-113.). 또한 IgM의 경우 지카 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵고, IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 이전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-Positive)의 결과를 초래할 수 있다. 그렇기 때문에 지카 바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커로 정하여, 오직 지카 바이러스의 단백질 바이오마커와 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 지카 바이러스의 조기 검출 및 특이 진단에 유리하다고 할 수 있다.However, since Zika virus and Dengue virus are composed of amino acids with about 70% or more identical or similar characteristics, a serological detection method for detecting immunoglobulins such as IgM or IgG generated in the body due to viral infection Ultimately, there is a disadvantage that it is difficult to specifically detect only the Zika virus (Choi Jae-won et al., Journal of the Korea Contents Association (2018), Vol. 18, pp. 99-113.). In addition, it is difficult to diagnose early because IgM is not formed immediately after infection with Zika virus, but because it is created over several days. In the case of IgG, it takes longer to generate than IgM. It can be an antibody, which can result in false-positive results. Therefore, it can be said that the specific protein constituting the Zika virus is defined as a biomarker, and the antigen detection method using a monoclonal antibody capable of binding only the Zika virus protein biomarker is advantageous for early detection and specific diagnosis of the Zika virus.

따라서 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위해, 지카 바이러스의 단백질 바이오마커와는 결합하지만 다른 플라비바이러스들의 바이오마커와는 결합하지 않는 단일클론항체 쌍 및 이를 이용한 샌드위치 면역분석법(Sandwich Immunoassay)을 개발하였으며, 이의 용도에 대해 기술하고자 한다.Therefore, the present inventors have developed a monoclonal antibody pair that uses a protein biomarker of Zika virus but does not bind a biomarker of other flaviviruses and a sandwich immunoassay (Sandwich Immunoassay) using the same. And its purpose will be described.

대한민국 공개특허 제10-2018-0056343호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2018-0056343

본 발명의 목적은 지카 바이러스의 검출 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for detecting Zika virus.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 In order to solve the above problems, the present invention

지카 바이러스(Zika virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 포획 항체(capture antibody)를 고정하는 단계;Immobilizing a capture antibody specifically binding to non-structural protein 1 (NS1) of Zika virus;

개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계; Contacting a biological sample isolated from the subject;

지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체(probe antibody)를 접촉하는 단계; 및Contacting a probe antibody specifically binding to Zika virus non-structural protein 1; And

지카 바이러스 비구조단백질 1과 포획 항체 및 지카 바이러스 비구조단백질 1과 프로브 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법을 제공한다. It provides a method for detecting a Zika virus using a pair of monoclonal antibodies comprising detecting the complex formation between the Zika virus non-structural protein 1 and the capture antibody and the Zika virus non-structural protein 1 and the probe antibody.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 지카 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.In one embodiment of the present invention, the Zika virus non-structural protein 1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로브 항체는 형광물질, 양자 점(Quantum dot), 금속 나노입자(Metal Nanoparticle), 겨자무 과산화효소(Horseradish Peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase), 라만 리포터(Raman Reporter), 란탄족 원소(Lanthanide), 전기화학발광 태그(Electrochemiluminescence Tag), 탄소 나노튜브(Carbon Nanotube) 또는 그래핀(Graphene)에 컨쥬게이션한 것이다.In one embodiment of the invention, the probe antibody is a fluorescent substance, quantum dots (Quantum dot), metal nanoparticles (Metal Nanoparticle), mustard radish peroxidase (Horseradish Peroxidase), alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase), Raman It is a reporter (Raman Reporter), lanthanide element (Lanthanide), electrochemiluminescence tag (Electrochemiluminescence Tag), carbon nanotube (Carbon Nanotube) or graphene (Graphene) is conjugated.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로브 항체는 형광물질에 컨쥬게이션한 것이다.In one embodiment of the present invention, the probe antibody is conjugated to a fluorescent material.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 포획 항체와 프로브 항체는 동종(Same Species)의 항체 쌍인 것이다. In one embodiment of the present invention, the capture antibody and probe antibody are pairs of antibodies of the same species.

상기 동종의 항체 쌍은 마우스 항체-마우스 항체 쌍(Mouse Antibody-Mouse Antibody Pair), 토끼 항체-토끼 항체 쌍(Rabbit Antibody-Rabbit Antibody Pair), 래트 항체- 래트 항체 쌍(Rat Antibody-Rat Antibody Pair) 또는 산양 항체-산양 항체 쌍(Goat Antibody-Goat Antibody Pair)일 수 있다.The same antibody pair is mouse antibody-mouse antibody pair (Mouse Antibody-Mouse Antibody Pair), rabbit antibody-rabbit antibody pair (Rabbit Antibody-Rabbit Antibody Pair), rat antibody-rat antibody pair (Rat Antibody-Rat Antibody Pair) Or it may be a goat antibody-goat antibody pair (Goat Antibody-Goat Antibody Pair).

본 발명의 일 실시예에서, 상기 단일클론항체 쌍은 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체인 것이다. In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody pair is a probe antibody that specifically binds to Zika virus non-structural protein 1 and a probe antibody that specifically binds Zika virus non-structural protein 1.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 포획 항체의 농도는 0.1 μg/ml 내지 200 μg/ml인 것이다.In one embodiment of the present invention, the concentration of the capture antibody is 0.1 μg/ml to 200 μg/ml.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 생물학적 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨인 것이다.In one embodiment of the invention, the biological sample is tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine.

본 발명의 샌드위치 면역분석법 기반의 지카 바이러스의 검출방법은 지카 바이러스(Zika Virus)를 구성하는 단백질 바이오마커(Biomarker) 검출을 통해, 지카 바이러스(Zika Virus) 감염증을 진단하거나, 지카 바이러스의 존재 유무를 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.The method for detecting Zika virus based on the sandwich immunoassay method of the present invention diagnoses Zika Virus infection or detects the presence or absence of Zika virus through detection of a protein biomarker constituting Zika Virus. It can be useful for verification.

도 1은 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과 사진이다.
도 2는 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과 사진이다.
도 3은 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 해리상수(결합친화도)에 대한 결과 그래프이다.
도 4는 지카 바이러스 비구조단백질 1에 Alexa Fluor 546 형광 염료(Fluorescent Dye)를 표지(Labeling)한 다음, 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 수행한 결과 사진이다.
도 5는 단일클론항체 칩을 이용한 최적의 포획 항체(Capture Antibody)-프로브 항체(Probe Antibody) 쌍 선별과정에 대한 모식도(도 5a) 및 결과 사진(도 5b)이다.
도 6은 단일클론항체 칩을 이용한 지카 바이러스 비구조단백질 1의 검출 결과에 대한 사진 및 그래프이다.Figure 1 is a photo of the result of staining with Coomassie Blue after performing a polyacrylamide gel electrophoresis of the non-structural protein 1 of Zika virus.
Figure 2 is a result of staining with Coomassie Blue, after performing polyacrylamide gel electrophoresis of a monoclonal antibody against the non-structural protein 1 of Zika virus.
Figure 3 is a graph of the results of the dissociation constant (binding affinity) of the monoclonal antibody to the non-structural protein 1 of Zika virus.
Figure 4 is a photo of the result of performing a polyacrylamide gel electrophoresis after labeling the Alexa Fluor 546 fluorescent dye (Fluorescent Dye) on Zika virus non-structural protein 1.
FIG. 5 is a schematic diagram (FIG. 5A) and a result photograph (FIG. 5B) of the selection process of an optimal capture antibody-probe antibody pair using a monoclonal antibody chip.
FIG. 6 is a photograph and graph of the detection results of Zika virus non-structural protein 1 using a monoclonal antibody chip.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하도록 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 지카 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 지카 바이러스 또는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 다른 플라비바이러스(특히 뎅기 바이러스)와의 교차반응 없이 특이적으로 검출할 수 있는 검출(또는 진단)용 조성물, 키트 또는 검출방법(또는 진단방법) 등으로 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to a method for detecting Zika virus, a composition for detection (or diagnosis) capable of specifically detecting Zika virus or non-structural protein 1 of Zika virus without cross-reaction with other flaviviruses (especially dengue virus), It can be useful as a kit or detection method (or diagnostic method).

본 발명은 The present invention

지카 바이러스(Zika virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 포획 항체(capture antibody)를 고정하는 단계;Immobilizing a capture antibody specifically binding to non-structural protein 1 (NS1) of Zika virus;

개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계; Contacting a biological sample isolated from the subject;

지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체(probe antibody)를 접촉하는 단계; 및Contacting a probe antibody specifically binding to Zika virus non-structural protein 1; And

지카 바이러스 비구조단백질 1과 포획 항체 및 지카 바이러스 비구조단백질 1과 프로브 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법을 제공한다. It provides a method for detecting a Zika virus using a pair of monoclonal antibodies comprising detecting the complex formation between the Zika virus non-structural protein 1 and the capture antibody and the Zika virus non-structural protein 1 and the probe antibody.

본 발명은 종래의 여러 종류의 면역분석법과 달리, 지카 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커에만 특이적으로 결합하는 1쌍의 단일클론항체를 이용하여 다른 플라비바이러스(Flavivirus)와 교차반응(Cross-Reactivity) 없이 오직 지카 바이러스만을 선택적으로 검출하는데 활용될 수 있다. 또한 동종(Same Species)의 항체 쌍을 이용하기 때문에 항체 간의 교차반응(Cross-Reactivity)이 없어 종래에 샌드위치 면역분석법(Sandwich Immunoassay)에 주로 이용되는 이종(Different Species)의 항체시스템을 이용할 필요가 없다는 장점이 있다(ex) 토끼 항체-마우스 항체 쌍(Rabbit Antibody-Mouse Antibody Pair), 산양 항체-마우스 항체 쌍(Goat Antibody-Mouse Antibody Pair), 산양 항체-토끼 항체 쌍(Goat Antibody-Rabbit Antibody Pair) 등). 더 나아가 샌드위치 면역분석법에 이용되는 2 종류의 항체 중에서 1 종류를 직접적인 프로브(Probe)로 이용하기 때문에, 현재 이용되는 대부분의 방법인 2차 항체(Secondary Antibody) 시스템을 이용할 필요가 없다는 장점이 있다.The present invention, unlike the prior art several types of immunoassays of the reaction using the monoclonal antibody of the pair that binds only to the specific protein biomarkers that make up the Dermalogica virus intersects other flaviviruses (Flavivirus) (Cross-Reactivity ) Can be used to selectively detect only Zika virus. In addition, since it uses the same type of antibody pair, there is no cross-reactivity between antibodies, so there is no need to use the antibody system of a different species, which is mainly used for sandwich immunoassay. There are advantages (ex) Rabbit Antibody-Mouse Antibody Pair, Goat Antibody-Mouse Antibody Pair, Goat Antibody-Rabbit Antibody Pair Etc). Furthermore, since one of the two types of antibodies used in the sandwich immunoassay is used as a direct probe, there is an advantage in that there is no need to use a secondary antibody system, which is the most used method.

본 발명은 조직(Tissue), 혈액(Blood), 체액(Body Fluid), 소변(Urine), 타액(Saliva) 등과 같은 임상적 평가에 사용될 수 있는 검체(Clinical Specimen)는 물론, 연구용 시료나 식품 내에 존재하는 지카 바이러스의 존재 유무 판단 및 지카 바이러스를 구성하는 단백질 바이오마커의 양을 객관적으로 분석하는데 활용될 수 있으며, 분석을 위한 시료 요구량이 1 ㎕ 내외 밖에 되지 않기 때문에 기존 방법들에 비해 경제적이다.The present invention can be used in clinical evaluations such as tissue, blood, body fluid, urine, saliva, etc., as well as in clinical samples or food. It can be used to objectively analyze the presence or absence of the present Zika virus and the amount of protein biomarkers that make up the Zika virus, and is economical compared to the existing methods because the sample requirement for analysis is only about 1 μl.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 지카 바이러스 검출방법 및 지카 바이러스 감염증의 진단 방법은 '포획(Capture) 단일클론항체'-'지카 바이러스 비구조단백질 1'-'프로브(Probe) 단일클론항체'로 이어지는 즉, 항체-항원-항체 복합체(Complex) 형성을 확인하여 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 검출할 수 있다.In addition, the Zika virus detection method and the Zika virus infectious disease diagnosis method according to an embodiment of the present invention include'Capture monoclonal antibody'-'Zika virus non-structural protein 1'-'Probe monoclonal antibody' In other words, the formation of the antibody-antigen-antibody complex can be confirmed to detect the non-structural protein 1 of the Zika virus.

여기서, 상기 ‘항체-항원-항체 복합체’ 형성은 비색법(Colorimetric Method), 전기화학법(Electrochemical Method), 형광법(Fluorometric Method), 발광법(Luminometry), 입자계수법(Particle Counting Method), 흡광법(Absorbance Measurement), 분광법(Spectrometric Method), 라만분광법(Raman Spectroscopic Method), 표면플라즈몬공명법(Surface Plasmon Resonance Method), 간섭계법(Interferometric Method), 육안측정법(Visual Assessment) 및 섬광계수법(Scintillation Counting Method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Here, the'antibody-antigen-antibody complex' formation is a colorimetric method, an electrochemical method, a fluorescence method, a luminometry, a particle counting method, an absorption method ( Absorbance Measurement, Spectrometric Method, Raman Spectroscopic Method, Surface Plasmon Resonance Method, Interferometric Method, Visual Assessment and Scintillation Counting Method It can be detected by a method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

일반적으로 항체, 항체의 절편(단편, 일부분), 유사 기능물과 같은 물질들의 경우 면역진단기술에서 핵심적인 역할을 하는 물질(원료)이다. 면역진단기술의 경우, 외부 생명체(또는 물질)로부터 기인하거나 생체 내의 변이로 인해 생성된 항원(Antigen)을 검출하거나, 상기 항원으로부터 생성된 항체(Antibody) 검출을 통한 방법이 일반적이다. 특히, 지카 바이러스 검출(또는 진단)을 위한 면역진단기술의 경우 지카 바이러스 감염으로부터 체내에 생성된 항체(이뮤노글로불린)의 일종인 IgA, IgM, IgG 중의 하나 혹은 그 이상, 또는 이들의 비율을 검출하는 것이 보편적으로 이용되고 있다 (Zhang et al., Nat. Med. (2017) Vol. 23, pp. 548-550., Balmaseda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2017) Vol. 114, pp. 8384-8389.). 하지만, 체내에 생성된 항체를 검출할 경우, 이들은 세포융합기술에 의해서만 만들어질 수 있는 단일클론항체가 아닌 '다클론항체(Polyclonal Antibody, pAb)'이기 때문에 지카 바이러스의 비구조단백질 1 뿐만 아니라 다른 진드기매개 바이러스, 모기매개 바이러스의 비구조단백질 1과 교차반응을 할 수 있다. 특히 지카 바이러스와 같은 속에 해당하는 뎅기 바이러스와 같은 플라비바이러스들의 비구조단백질 1과도 결합(또는 반응)할 수 있다. 따라서 체내에 생성된 IgA, IgM 또는 IgG와 같은 항체 검출을 통한 지카 바이러스의 구별 진단은 불가능하다.In general, in the case of substances such as antibodies, fragments of antibodies (fragments, portions), and similar functions, substances that play a key role in immunodiagnostic techniques (raw materials). In the case of an immunodiagnostic technique, a method through detecting an antigen originating from an external living body (or substance) or a mutation in the living body or detecting an antibody generated from the antigen is common. In particular, in the case of an immunodiagnostic technique for detecting (or diagnosing) Zika virus, one or more of IgA, IgM, IgG, which is a type of antibody (immunoglobulin) produced in the body from Zika virus infection, or a ratio thereof is detected. Is commonly used (Zhang et al ., Nat. Med. (2017) Vol. 23, pp. 548-550., Balmaseda et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2017) Vol. 114, pp. 8384-8389.). However, when detecting antibodies produced in the body, these are polyclonal antibodies (pAb) rather than monoclonal antibodies that can only be produced by cell fusion technology, so Zica virus' non-structural protein 1 as well as other ticks It can cross-react with the non-structural protein 1 of the mediator virus and the mosquito-borne virus. In particular, it can also bind (or react) with non-structural protein 1 of flaviviruses, such as dengue virus, corresponding to the genus Zika virus. Therefore, it is impossible to diagnose the Zika virus through detection of antibodies such as IgA, IgM or IgG produced in the body.

또한, 항체검출을 통한 진단기술의 경우(특히 IgG), 체내에서 검출 가능한 항체가 충분히 생성되기까지 1~2주 정도 혹은 그 이상의 시간이 소요되기 때문에, 조기진단이 불가능하다는 단점이 있다. 그러나 비구조단백질 1은 바이러스 감염 초기부터 바이러스 복제(또는 증식)과정에서 상대적으로 비율이 높아지는 단백질로 알려져 있기 때문에, 감염 후 7~10일 이내의 지카 바이러스 특이적인 조기진단에 매우 유용하다. 바이러스 검출(또는 진단)기술 외에도 지카 바이러스의 예방, 치료, 역가측정 등 관련 연구 및 개발에서 유용하게 사용될 수 있다.In addition, in the case of diagnostic technology through antibody detection (especially IgG), it takes about 1 to 2 weeks or more to generate sufficiently detectable antibodies in the body, so there is a disadvantage that early diagnosis is impossible. However, since non-structural protein 1 is known as a protein having a relatively high rate in the virus replication (or proliferation) process from the beginning of viral infection, it is very useful for early diagnosis specific to Zika virus within 7-10 days after infection. In addition to virus detection (or diagnosis) technology, it can be useful in related research and development, such as prevention, treatment, and titer measurement of Zika virus.

따라서 본 발명자들은 항체검출이 아닌 항원검출을 통한 진단기술을 개발하고자, 지카 바이러스 특이적 검출을 위한 샌드위치 면역분석법 기반을 이용한 검출방법을 제공하고자 한다.Therefore, the present inventors intend to develop a diagnostic technique through antigen detection, not antibody detection, and to provide a detection method using a sandwich immunoassay method for specific detection of Zika virus.

본 발명에서 ‘지카 바이러스의 비구조단백질 1’은 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체ㆍ돌연변이체뿐만 아니라 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다. 또한 ‘지카 바이러스의 비구조단백질 1’은 종(Species)이나 혈청형(Serotype), 균주(Strain), 데이터베이스(Database)에 따라 일부 차이가 있을 수 있기 때문에, 비구조단백질 1을 암호화하는 부위의 일부, 암호화 부위의 전ㆍ후 아미노산 서열 일부가 포함되거나 생략될 수 있다. In the present invention, "the non-structural protein 1 of Zika virus" includes the protein itself, its genetic recombinant protein and their artificial mutants and mutants, as well as natural forms and functional equivalents thereof. In addition, since the'non-structural protein 1 of Zika virus' may differ depending on the species, serotype, strain, or database, a part of the region encoding the non-structural protein 1, Part of the amino acid sequence before and after the coding site may be included or omitted.

본 발명의 일 실시예에서 상기 지카 바이러스의 비구조단백질 1은 지카 바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 362개의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열을 포함한다.In one embodiment of the present invention, the non-structural protein 1 of the Zika virus consists of 362 amino acid sequences encoding the non-structural protein 1 among about 3,400 amino acids encoding the protein of the Zika virus, and the amino acid sequence is the sequence of SEQ ID NO: 1 It includes.

본 명세서에서 사용된 용어 ‘항체’는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예컨대 재조합으로 제조된, 전장의 이뮤노글로불린(Full-Length IgG)의 특이성 및 결합력을 보유하는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역(Variable Domain)의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 이뮤노글로불린 및 이뮤노글로불린 단편을 나타낸다. 따라서 항체는 이뮤노글로불린의 항원 결합 도메인과 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질(또는 펩타이드)을 포함한다. 상기 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간유래 항체, 비-인간유래 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 항체는 Fab 단편, Fab‘ 단편, F(ab’)2 단편, Fv 단편, 이황화결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd‘ 단편, 단일사슬 Fv (scFv), 단일사슬 Fab (scFab), 디아바디(Diabody), 나노바디(Nanobody), 미니바디(Minibody) 또는 상기 중 임의의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.The term'antibody', as used herein, is a variable region of an immunoglobulin molecule that retains the specificity and binding capacity of a full-length immunoglobulin (Full-Length IgG), either natural or partially or fully synthesized, e.g., recombinantly. Immunoglobulin and immunoglobulin fragments, including any fragment comprising at least a portion of (Variable Domain). Thus, an antibody includes any protein (or peptide) that has a binding domain that is homologous or substantially homologous to the antigen binding domain of an immunoglobulin. The antibody may include, but is not limited to, synthetic antibodies, recombinantly produced antibodies, bispecific antibodies, multispecific antibodies, human derived antibodies, non-human derived antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies or fragments thereof. It does not work. For example, the antibody is Fab fragment, Fab' fragment, F(ab') 2 fragment, Fv fragment, disulfide bond Fv (dsFv), Fd fragment, Fd' fragment, single chain Fv (scFv), single chain Fab ( scFab), a diabody, a nanobody, a minibody, or any antigen-binding fragment of the above.

특히 본 발명의 항체는 ‘단일클론항체’로서, 본 발명의 용어 ‘단일클론항체’란 당해 분야에 공지된 용어로 단일 항원선 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 다클론항체는 일반적으로 교차반응이 있어 특이성이 낮고, 항혈청의 로트(Lot)마다 항체가 및 특이성이 변동하는 결점이 있기 때문에, 다클론항체를 이용한 진단시약의 제조는 본질적으로 품질관리가 어렵다는 문제점이 있는 반면, 단일클론항체는 항원-항체결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다. 또한, 본 발명의 단일클론항체는 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 특이적으로 결합한다. 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 일 실시예에서 측정된 본 발명의 단일클론항체의 지카 바이러스 비구조단백질 1에 대한 해리상수(KD)는 1.0×10-10 M 내지 1.0×10-8 M이며, 측정방법에 따라 해리상수의 차이가 날 수 있으므로 본 발명의 단일클론항체는 1×10-11 M 내지 1×10-7 M 범위의 해리 상수를 가질 수 있다. In particular, the antibody of the present invention is a'monoclonal antibody', and the term'monoclonal antibody' of the present invention means a highly specific antibody directed against a single antigenic line site (epitope) in terms known in the art. Typically, monoclonal antibodies are directed against a single epitope on an antigen, unlike polyclonal antibodies that contain different antibodies directed against different epitopes. Since polyclonal antibodies generally have a cross-reaction and have low specificity, and there are defects in which antibody titers and specificities fluctuate for each lot of antiserum, the manufacturing of diagnostic reagents using polyclonal antibodies is inherently difficult in quality control. On the other hand, monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays using antigen-antibody binding, and because they are produced by the culture of hybridomas, they are not contaminated by other immunoglobulins. It has other advantages. In addition, the monoclonal antibody of the present invention specifically binds to the non-structural protein 1 of Zika virus. Although not limited thereto, the dissociation constant (K D ) for the Zika virus non-structural protein 1 of the monoclonal antibody of the present invention measured in one embodiment of the present invention is 1.0×10 -10 M to 1.0×10 -8 M, Since the dissociation constant may vary depending on the measurement method, the monoclonal antibody of the present invention may have a dissociation constant ranging from 1×10 -11 M to 1×10 -7 M.

본 발명의 단일클론항체는 종래 기술인 하이브리도마 생산방법에 따라 제작하였으며, ‘Kohler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.’ 에 상세하게 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 지카 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스의 비장세포(항체 생산세포)를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The monoclonal antibody of the present invention was produced according to the prior art hybridoma production method, and is described in'Kohler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.' It is described in detail in. In one embodiment of the present invention, spleen cells (antibody-producing cells) of mice immunized with Zica virus nonstructural protein 1 were fused with myeloma cells to produce hybridomas, but the present invention is not limited thereto.

본 명세서상의 ‘검출’은 항체-항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소, 금속 나노입자, 란탄족(Lanthanide) 원소, 라만 리포터(Raman Reporter), 전기화학적 태그, 자성입자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 바람직하게는, 항체-항원-항체 복합체를 형광(Fluorescence) 측정 기반을 이용하여 검출할 수 있다. 'Detection' in the present specification is for detecting an antibody-antigen-antibody complex and uses various markers. Specific examples are selected from the group consisting of enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, radioactive isotopes, metal nanoparticles, lanthanide elements, Raman reporters, electrochemical tags, and magnetic particles. . However, it is not necessarily limited to these. Preferably, the antibody-antigen-antibody complex can be detected using a fluorescence measurement base.

또한 본 명세서상의 ‘검출’은 표지체를 사용하지 않는 비표지(label-free) 방식으로도 가능하다. 구체적으로는 표면플라즈몬공명(Surface Plasmon Resonance), 등온 적정 칼로리메트리(Isothermal Titration Calorimetry), 바이오-층 간섭계법(Bio-Layer Interferometry) 중 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. In addition, the'detection' in the present specification may be a label-free method without using a label. Specifically, it is selected from Surface Plasmon Resonance, Isothermal Titration Calorimetry, and Bio-Layer Interferometry. However, it is not necessarily limited to these.

본 발명의 지카 바이러스의 검출을 위한 단일클론항체 쌍은, 이용되는 항체가 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.The monoclonal antibody pair for detection of the Zika virus of the present invention can also use a fragment of a monoclonal antibody as long as the antibody used can selectively recognize the non-structural protein 1 of the Zika virus. Such antibody fragments may include F(ab') 2 , Fab, Fab', Fv fragments, and the like.

또한 본 발명의 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.In addition, a monoclonal antibody or fragment thereof that selectively recognizes the non-structural protein 1 of the Zika virus of the present invention and tools and reagents used for immunological analysis may be included. Tools/reagents used in immunological analysis include suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, and the like. In addition, when the labeling substance is an enzyme, a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction stopper may be included.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polymers such as polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, magnetic fine particles plated with metal in latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.

본 발명의 일 실시예로서 상기 단일클론항체 쌍을 생물학적 시료와 접촉시켜, 항체-항원-항체 복합체 형성을 형광을 통해 확인함으로써, 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 검출하는 지카 바이러스의 검출 및 지카 바이러스 감염증의 진단 방법에 대하여 개시된다.As an embodiment of the present invention, by detecting the antibody-antigen-antibody complex formation through fluorescence by contacting the monoclonal antibody pair with a biological sample, detection of Zika virus and Zika virus infection to detect non-structural protein 1 of Zika virus It is disclosed about the diagnostic method.

본 발명에서 ‘생물학적 시료’란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 지카 바이러스의 비구조단백질 1의 발현 여부를 측정할 수 있다.In the present invention, the term “biological sample” includes tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, and urine. Whether or not these biological samples are manipulated or unmanipulated can be reacted with antibodies of the present invention or the same epitope with antibodies having specificity to determine whether Zica virus non-structural protein 1 is expressed.

'항체-항원-항체 복합체'는 생물학적 시료중의 지카 바이러스의 비구조단백질 1의 존재 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 지카 바이러스의 비구조단백질 1과 단일클론항체 쌍과의 결합물을 의미한다. 또한 지카 바이러스 자체와 상기 단일클론항체의 결합물을 의미한다.'Antibody-antigen-antibody complex' refers to a combination of a non-structural protein 1 of the Zika virus and a monoclonal antibody pair reacted to confirm the presence or absence of the non-structural protein 1 of the Zika virus in a biological sample. It also means the combination of the Zika virus itself and the monoclonal antibody.

상기한 항체-항원-항체 복합체의 형성은 비색법(Colorimetric Method), 전기화학법(Electrochemical Method), 형광법(Fluorometric Method), 발광법(Luminometry), 입자계수법(Particle Counting Method), 흡광법(Absorbance Measurement), 분광법(Spectrometric Method), 라만분광법(Raman Spectroscopic Method), 표면플라즈몬공명법(Surface Plasmon Resonance Method), 간섭계법(Interferometric Method), 육안측정법(Visual Assessment) 및 섬광계수법(Scintillation Counting Method)으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The formation of the antibody-antigen-antibody complex described above is a colorimetric method, an electrochemical method, a fluorescence method, a luminometry, a particle counting method, and an absorption measurement. ), Spectrometric Method, Raman Spectroscopic Method, Surface Plasmon Resonance Method, Interferometric Method, Visual Assessment and Scintillation Counting Method It can be detected by a method selected from the group, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이하에서 설명되는 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 예시로서 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the embodiments described below are examples for specifying the contents of the present invention, and the present invention will not be limited thereby.

< 실시예 1: 지카 바이러스의 비구조단백질 1 준비 >< Example 1: Preparation of non-structural protein 1 of Zika virus >

지카 바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,400개 아미노산 중에서 비구조단백질 1을 암호화하는 362개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였다.Of about 3,400 amino acids encoding the protein of the Zika virus, a protein consisting of 362 amino acid sequences encoding non-structural protein 1 was prepared.

본 발명의 비구조단백질 1의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된다.The amino acid sequence of the non-structural protein 1 of the present invention is represented by SEQ ID NO: 1.

비구조단백질 1은 순수 분리ㆍ정제를 위해 N말단에 폴리히스티딘이 연결된 형태(His-Tagged)를 이용하였으며, 배큘로바이러스-곤충세포 시스템(Baculovirus-Insect Cells)을 이용하여 발현되어 Ni-NTA 레진(Nickel-Nitrilotriacetic Acid Resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(Affinity Chromatography) 방법으로 비구조단백질 1을 순수 분리ㆍ정제하였다. 분리ㆍ정제된 비구조단백질 1은 단백질 전기영동 기술인 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE)를 통해 확인하였다. Non-structural protein 1 used a form of polyhistidine linked to the N-terminus (His-Tagged) for pure separation and purification, and was expressed using a baculovirus-insect cell system to express Ni-NTA resin ( Nickel-Nitrilotriacetic Acid Resin) was used to purify and separate non-structural protein 1 by affinity chromatography (Affinity Chromatography). The separated and purified non-structural protein 1 was confirmed through polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), a protein electrophoresis technique.

도 1은 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행한 후, Coomassie Blue로 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 1에 나타낸 바와 같이 362개 아미노산의 분자량 부근인 약 45 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에서 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 확인할 수 있었다. Figure 1 shows the results of staining with Coomassie Blue after protein electrophoresis (SDS-PAGE). As shown in FIG. 1, the non-structural protein 1 of the Zika virus was confirmed in the vicinity of about 45 kilodaltons (kDa), which is near the molecular weight of 362 amino acids.

< 실시예 2: 하이브리도마 제작 및 단일클론항체 정제 >< Example 2: Hybridoma production and purification of monoclonal antibodies >

세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(Kohler et al., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre et al., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 실시예 1의 지카 바이러스의 비구조단백질 1이 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO2의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500(Polyethylene Glycol) 1 ㎖를 처리하고, 20 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지, 19 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 순차적으로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 첨가하여(107개의 Splenocytes 당 10 ㎖ HAT 배지) 세포를 현탁한 다음 세포배양용 96-well plate의 각각의 well에 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다. 상기 하이브리도마를 10일간 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면, 96-well plate의 각각의 well의 기존 HAT 배지를 제거한 다음 새로운 HAT 배지 150 ㎕를 첨가하여 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-well plate 내 각각의 well로부터 배지 100 ㎕를 취하여 지카 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 Indirect ELISA를 수행하여 반응성이 나타나는 하이브리도마들을 24-well plate에서의 배양을 거쳐 6-well plate로 옮겨 배양하였다. 추가적인 반응성 검사를 수행한 다음 하이브리도마 세포를 계수하여, 1개의 96-well plate 당 50개~100개의 하이브리도마 세포가 들어가도록 하여 서브-클로닝 과정을 진행하였다. 보다 확실한(안정한) 단일클론의 하이브리도마 세포주가 얻어질 때까지 같은 과정을 반복하여 클로닝을 수행하였다.Cell fusion is a well-known hybridoma production technology (Kohler et al ., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre et al ., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.). Spleen was extracted from mice immunized with the non-structural protein 1 of the Zika virus of Example 1, and then the spleen was pulverized with a tissue grinder to be suspended in RPMI 1640 medium to count splenocytes. Next, mouse myeloma cells (myeloma, Sp2/0-Ag14) in a T75 flask cultured in a cell incubator at 37°C and 5% CO 2 were collected and suspended in RPMI 1640 medium and counted in the same manner. The splenocytes and myeloma cells of the counted mice were transferred to one 50 ml tube so as to be 5:1 based on the number of cells, and then centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes to collect the cells. To the recovered cells, 50 ml of PEG1500 (Polyethylene Glycol) was treated with 1 ml, and 20 ml of 37°C RPMI 1640 medium and 19 ml of 37°C RPMI 1640 medium were sequentially added to react for 5 minutes at 37° C., resulting in cell fusion. To get up. The cells were recovered by centrifugation at 1,200 rpm for 5 minutes, and then the cells were suspended by adding RPMI 1640 medium (HAT medium) containing HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) (10 mL HAT medium per 10 7 Splenocytes). Then, it was dispensed into each well of a 96-well plate for cell culture. Then, the cells were cultured in a cell incubator under conditions of 37°C and 5% CO 2 . After culturing the hybridoma for 10 days, when it is confirmed that the fusion cells grow by forming a colony through the naked eye or a microscope, remove the existing HAT medium of each well of the 96-well plate, and then add 150 µl of new HAT medium. And further cultured for 3 days. Subsequently, 100 μl of medium was taken from each well in a 96-well plate, and indirect ELISA was performed using an enzyme immunosorbent assay plate coated with Zica virus' non-structural protein 1, and hybridomas exhibiting reactivity were observed in 24-well plates. After incubation, the cells were transferred to a 6-well plate and cultured. After performing an additional reactivity test, the hybridoma cells were counted, and the sub-cloning process was performed by entering 50 to 100 hybridoma cells per 96-well plate. The same procedure was repeated until cloning of a more stable (stable) monoclonal hybridoma cell line was obtained.

생후 12주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 Incomplete Freund's Adjuvant 500 ㎕와 상기 실시예 5로부터 얻어진 하이브리도마 세포주를 1 X 106 ~ 5 X 106 개의 세포가 되도록 멸균된 PBS (pH 7.4) 용액으로 현탁한 세포현탁액 500 ㎕를 각각 주입하였다. 약 1~2주 사이에 복수(Ascites) 생성으로 인해 부푼 마우스의 복강 내에 존재하는 하이브리도마로부터 생성된 다량의 단일클론항체가 포함되어 있는 복수를 채취하였다. 이는 실시예 일 뿐, 대량의 마우스 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체 획득이 가능하다. 채취한 마우스 복수를 원심분리기를 이용하여 3,000 rpm, 4℃ 조건으로 30분간 원심분리를 수행한 후, 일부 섞여있을 수 있는 혈구층(Blood Layer)과 지질층(Lipid Layer)을 제거하여 단일클론항체가 다량 포함되어 있는 복수층(Ascites Layer)만을 분리한다. 500 μl of Incomplete Freund's Adjuvant and the hybridoma cell line obtained from Example 5 into the intraperitoneal cavity of a 12-week-old female BALB/c mouse sterilized PBS (pH 7.4) solution to be 1 X 10 6 to 5 X 10 6 cells 500 µl of the suspended cell suspension was injected. Ascites were collected between about 1 and 2 weeks, and ascites containing a large amount of monoclonal antibodies generated from hybridomas present in the abdominal cavity of swollen mice were collected. This is only an example, and it is possible to obtain monoclonal antibodies through a large amount of mouse in vitro cell culture. After centrifugation of the collected mouse ascites for 30 minutes at 3,000 rpm and 4°C using a centrifuge, the monoclonal antibody is removed by removing the blood layer and lipid layer that may be partially mixed. Separate only the multiple layers (Ascites Layer).

상기의 과정을 통해 정제된 복수를 필터해준 다음, 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화해 준 Protein G 레진이 충진(Packing)되어 있는 컬럼(Column)에 흘려주었다. 복수를 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 모든 불순물을 제거한 다음, 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 양이 되도록 1 방울씩 떨어뜨려 주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 반복하여 고농도의 염을 제거해주었다. 투석이 완료된 단일클론항체는 필터를 통해 응집물(Aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 도 2에 나타낸 바와 같이 단백질 전기영동을 수행하여 Coomassie Blue 염색을 통해 고순도의 단일클론항체를 확인하였다. 도 2에서 볼 수 있는 것처럼, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy Chain)와 경쇄(Light Chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리ㆍ정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.After filtering the purified ascites through the above process, the protein G resin equilibrated with a 20 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4) solution was flowed into a column packed with Protein G resin. After the ascites were shed, impurities other than the non-specifically bound or intercalated monoclonal antibody were removed again using 20 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4). Then, after removing all impurities, a 0.1 M Glycine (pH 2.8) solution was flowed to elute a monoclonal antibody against the non-structural protein 1 of Zika virus bound to Protein G, and immediately after elution, for pH neutralization (Neutralization). 1 M Tris-HCl (pH 7.4) solution was dropped by 1 drop to an amount of 1/3 to 1/5 of the eluate. Thereafter, to exchange the buffer (solution) of the monoclonal antibody eluate, dialysis was repeated twice at 4°C for 16 hours or more to remove the high concentration of salt. After completion of dialysis, the monoclonal antibody was quantified by removing the aggregate through a filter and measuring absorbance at 280 nm. Thereafter, protein electrophoresis was performed as shown in FIG. 2 to confirm high purity monoclonal antibodies through Coomassie Blue staining. As can be seen in FIG. 2, it was judged that the separation and purification of the monoclonal antibody was well performed because only the heavy chain and the light chain of the antibody were observed at the 50 kDa site and the 25 kDa site, respectively. .

< 실시예 3: 이소타입 확인 및 해리상수 측정 >< Example 3: Isotype identification and dissociation constant measurement >

상기 실시예 2로부터 순수 분리ㆍ정제된 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T (0.1% Tween-20이 포함된 PBS) 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 well에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 0.1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 상기 실시예 6으로부터 준비된 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop Solution)인 0.2 N H2SO4를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 이소타입을 확인하였다. 이로부터 상기 실시예 2로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체의 이소타입은 표 1에 나타낸 바와 같이 모두 IgG1 또는 IgG2a 임을 확인할 수 있었다.To confirm the isotype of the monoclonal antibody against the non-structural protein 1 of the purely isolated and purified Zika virus from Example 2, specifically, mouse IgA, IgG 1 , IgG 2a , IgG 2b , IgG 3 , IgM, respectively The antibody of chlorine to be bound was diluted with PBS (pH 7.4) solution to a concentration of 1 µg/ml, and then 100 µl was dispensed onto the plate for enzyme immunosorbent assay and reacted at 37° C. for 1 hour. Then, each well was washed 3 times using 0.1% PBS/T (PBS with 0.1% Tween-20) solution. Next, 200 μl of PBS/T solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added to each well for blocking, followed by reaction at 37° C. for 1 hour, followed by PBS/T solution. Was washed in the same way. Then, 100 μl of the monoclonal antibody against the non-structural protein 1 of Zika virus prepared from Example 6 diluted to a concentration of 0.1 μg/ml was dispensed and reacted at 37° C. for 1 hour, and after the reaction was over, 0.1% PBS/T Each well was washed 3 times using the solution. Then, HRP enzyme-linked goat anti-mouse IgG (Goat anti-Mouse IgG, HRP conjugated) was dispensed into each well, reacted at 37°C for 30 minutes, and then washed. Subsequently, 100 μl of the HMB substrate, TMB solution, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm the color reaction. Then, 100 μl of a solution of 0.2 NH 2 SO 4 as a stop solution was dispensed into each well to terminate the reaction. To quantify the reactivity of each isotype, the isotype was confirmed by measuring absorbance at 450 nm using a microplate reader. From this, it was confirmed that the isotypes of the monoclonal antibodies isolated and purified from Example 2 were all IgG 1 or IgG 2a as shown in Table 1.

상기 실시예 2로부터 순수 분리ㆍ정제된 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체와 지카 바이러스의 비구조단백질 1과의 해리상수(Dissociation Constant, KD) 또는 결합친화도(Binding Affinity)를 측정하기 위해 상기 지카 바이러스의 비구조단백질 1이 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 100 나노몰(nM)로 부터 PBS 용액을 이용하여 100 nM부터 1/2씩 연속적으로 희석하여 15개 서로 다른 농도 및 0 nM을 포함하여 총 16개의 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 well에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 well을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 well에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop Solution)인 0.2 N H2SO4를 용액 100 ㎕씩을 각각의 well에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그래프를 도 3에 나타내었다. 이로부터 상기 실시예 2로부터 분리ㆍ정제된 단일클론항체와 지카 바이러스의 비구조단백질 1의 해리상수(Dissociation Constant (KD) 또는 결합친화도)는 0.27±0.02 nM에서 3.89±0.29 나노몰 (nM) 범위임을 확인할 수 있었다.Measuring dissociation constant (K D ) or binding affinity between the monoclonal antibody against non-structural protein 1 of Zica virus and the non-structural protein 1 of Zika virus from Example 2 above In order to prepare the enzyme immunosorbent assay plate coated with the non-structural protein 1 of the Zika virus. The monoclonal antibody was serially diluted from 100 nM to 1/2 using PBS solution from 100 nanomolar (nM) to total 15 different monoclonal antibodies, including 15 different concentrations and 0 nM. Was prepared, and 100 µl was dispensed into each well and reacted at 37° C. for 1 hour. After the reaction was completed, each well was washed 3 times using 0.1% PBS/T solution. Then, HRP-linked goat anti-mouse IgG was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 1 hour, and then washed in the same manner. Subsequently, 100 μl of the HMB substrate, TMB solution, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm the color reaction. Then, 100 μl of a solution of 0.2 NH 2 SO 4 as a stop solution was dispensed into each well to terminate the reaction. Absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader to quantify the reactivity to each different concentration of monoclonal antibody, and the graph is shown in FIG. 3. From this, the dissociation constant (Dissociation Constant (K D ) or binding affinity) of the non-structural protein 1 of the monoclonal antibody and Zika virus isolated and purified from Example 2 was 0.289±0.02 nM to 3.89±0.29 nanomolar (nM). It was confirmed that the range.

이소타입 (Isotype)Isotype 해리상수(KD)Harry constant (K D ) 클론 1 (Clone 1)Clone 1 IgG1 IgG 1 0.71 ± 0.04 nM0.71 ± 0.04 nM 클론 2 (Clone 2)Clone 2 IgG1 IgG 1 0.99 ± 0.04 nM0.99 ± 0.04 nM 클론 3 (Clone 3)Clone 3 IgG1 IgG 1 0.59 ± 0.03 nM0.59 ± 0.03 nM 클론 4 (Clone 4)Clone 4 IgG1 IgG 1 1.00 ± 0.06 nM1.00 ± 0.06 nM 클론 5 (Clone 5)Clone 5 IgG2a IgG 2a 0.32 ± 0.03 nM0.32 ± 0.03 nM 클론 6 (Clone 6)Clone 6 IgG1 IgG 1 3.89 ± 0.29 nM3.89 ± 0.29 nM 클론 7 (Clone 7)Clone 7 IgG1 IgG 1 1.22 ± 0.10 nM1.22 ± 0.10 nM 클론 8 (Clone 8)Clone 8 IgG1 IgG 1 1.28 ± 0.07 nM1.28 ± 0.07 nM 클론 9 (Clone 9)Clone 9 IgG1 IgG 1 0.27 ± 0.02 nM0.27 ± 0.02 nM

< 실시예 4: 단일클론항체의 형광물질 표지( Fluorophore Labeling) >< Example 4: Monoclonal antibody Fluorescent markers (Fluorophore Labeling)>

단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스 비구조단백질 1의 고감도 분석을 위해 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 대한 단일클론항체를 형광물질(Fluorophore 또는 Fluorescent Dye)로 표지하여 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트(Conjugate)를 준비하였다. 형광물질로는 Alexa Fluor 546 (AF546)을 이용하였으며, AF546 Protein Labeling Kit를 사용하여 제조사인 Thermo Fisher Scientific에서 제공된 실험방법을 바탕으로 컨쥬게이션을 진행하였다. 2 mg/mL 농도를 갖는 지카 바이러스 비구조단백질 1에 대한 9종의 단일클론항체를 각각 0.1 M NaHCO3 용액 및 AF546 용액과 섞어준 다음 4℃에서 8시간 동안 반응시켰다. 이후 용액 내에 남아있는 반응하지 않은 AF546 형광물질를 제거하기 위하여 정제용 레진(Resin)에 흘려주어 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트만을 선택적으로 분리하였다. 컨쥬게이트의 농도를 결정하기 위해 280 nm (단백질) 및 554 nm (AF546)에서의 흡광도를 동시에 측정하였다. 측정한 흡광도를 바탕으로 9종 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트의 농도 및 표지 효율(Labeling Efficiency)를 계산하였다. 9종의 단일클론항체와 형광물질의 컨쥬게이션(Conjugation)이 잘 이루어졌는지 확인하기 위해, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 9종의 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트를 2 μg씩 로딩한 후에 전기영동을 진행하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이 겔 다큐멘테이션(Gel Documentation) 시스템을 이용하여 빛을 쪼여주어 단일클론항체-형광물질 컨쥬게이트를 확인하였다. For high-sensitivity analysis of Zika virus non-structural protein 1 using a pair of monoclonal antibodies, monoclonal antibodies to non-structural protein 1 of Zika virus are labeled with a fluorescent material (Fluorophore or Fluorescent Dye), and the monoclonal antibody-fluorescent material conjugate (Conjugate) Was prepared. Alexa Fluor 546 (AF546) was used as a fluorescent material, and conjugation was performed based on an experimental method provided by manufacturer Thermo Fisher Scientific using AF546 Protein Labeling Kit. 9 monoclonal antibodies against Zica virus non-structural protein 1 with a concentration of 2 mg/mL were each 0.1 M NaHCO 3 The solution was mixed with AF546 solution, and then reacted at 4°C for 8 hours. Thereafter, in order to remove the unreacted AF546 fluorescent substance remaining in the solution, only a monoclonal antibody-fluorescent substance conjugate was selectively separated by flowing it into a purification resin. Absorbance at 280 nm (protein) and 554 nm (AF546) were measured simultaneously to determine the concentration of the conjugate. Concentration and labeling efficiency of nine monoclonal antibody-fluorescent material conjugates were calculated based on the measured absorbance. To confirm that the conjugation of nine monoclonal antibodies and fluorescent materials was well performed, polyacrylamide gel electrophoresis was performed. After loading 9 kinds of monoclonal antibody-fluorescent material conjugates by 2 μg, electrophoresis was performed, and as shown in FIG. 4, monoclonal antibodies were obtained by splitting light using a gel documentation system. The fluorescent substance conjugate was confirmed.

< 실시예 5: 단일클론항체 칩 제작 및 단일클론항체 쌍 선별 >< Example 5: Monoclonal antibody chip fabrication and monoclonal antibody pair selection >

단일클론항체 칩에 사용할 글라스 슬라이드(Glass Slide)를 메탄올(CH3OH)과 35%의 염산(HCl)이 1:1 비율로 배합된 용액에 실온에서 30분간 담가 두었다. 이후 황산(H2SO4)과 과산화수소수(H2O2) 3:1 비율로 배합된 용액에 실온에서 10분간 담가둔 다음, 증류수를 이용해 세척하여 건조시켰다. 3% APS (3-amino-propyl triethoxysilane)가 함유된 톨루엔(C7H8) 용액에 건조시킨 글라스 슬라이드를 상온에서 6시간 동안 담가 아민화(Amination) 시켰다. 톨루엔과 에탄올(C2H5OH)을 이용해 순차적으로 세척하고 100℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 이후 단일클론항체의 균일한 고정을 위한 시약인 Calixarene 유도체 A를 10 mM이 되도록 클로로포름(CHCl3) 용액에 녹여준 다음, 글라스 슬라이드를 상온에서 3시간 동안 담가 두었다. 마지막으로 클로로포름과 에탄올을 이용해 세척한 후 건조시켜 보관하였다.A glass slide to be used for the monoclonal antibody chip was immersed in a solution of methanol (CH 3 OH) and 35% hydrochloric acid (HCl) in a 1:1 ratio at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was mixed with sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 3:1 ratio at room temperature for 10 minutes, then washed with distilled water and dried. A glass slide dried in a toluene (C 7 H 8 ) solution containing 3% APS (3-amino-propyl triethoxysilane) was soaked at room temperature for 6 hours to be aminated. It was washed sequentially with toluene and ethanol (C 2 H 5 OH) and dried at 100° C. for 1 hour. Thereafter, Calixarene derivative A, a reagent for uniform fixation of monoclonal antibodies, was dissolved in a solution of chloroform (CHCl 3 ) to be 10 mM, and then the glass slide was soaked at room temperature for 3 hours. Lastly, it was washed with chloroform and ethanol and then dried and stored.

우선 지카 바이러스 비구조단백질 1 검출을 위한 단일클론항체 칩의 성능 평가를 위해 단일클론항체 쌍(Pair)을 이용한 샌드위치 면역분석시험(Sandwich Immunoassay)을 수행하였다. 우선 동일한 양의 지카 바이러스 비구조단백질 1을 가장 높은 민감도로 검출이 가능한 최적의 단일클론항체 쌍을 찾기 위해 상기한 아민화 칩을 이용하였다. 9종의 단일클론항체를 각각 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅(Spotting)한 다음 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 단일클론항체를 고정한 후, 5%의 BSA 및 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(Blocking)을 진행하였다. 다음에는 9종의 단일클론항체가 고정되어 있는 각각의 well에 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 50 nM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분씩 3번 세척하고, 9종의 단일클론항체-AF546 컨쥬게이트를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마찬가지로 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회의 세척을 해준 다음, 형광 스캐너로 형광 강도(Fluorescence Intensity)를 측정하여 최적의 포획 항체(Capture Antibody) 및 AF546이 표지된 프로브 항체(AF546 Labeled Antibody 또는 Probe Antibody) 쌍을 최종 선정하였다. 이 중에서도 포획 항체 Clone 5-프로브 항체 Clone 1, 포획 항체 Clone 5-프로브 항체 Clone 7, 포획 항체 Clone 5-프로브 항체 Clone 9, 포획 항체 Clone 6-프로브 항체 Clone 1, 포획 항체 Clone 7-프로브 항체 Clone 1, 포획 항체 Clone 8-프로브 항체 Clone 4, 포획 항체 Clone 9-프로브 항체 Clone 1로 구성된 항체 쌍이 다른 항체 쌍과 비교했을 때 비교적 우수한 것으로 나타났으며, 이를 바탕으로 추가적인 샌드위치 면역분석시험을 진행하였다.First, a sandwich immunoassay (Sandwich Immunoassay) using a monoclonal antibody pair (Pair) was performed to evaluate the performance of a monoclonal antibody chip for detecting Zika virus non-structural protein 1. First, the above-described amination chip was used to find the optimal pair of monoclonal antibodies capable of detecting the same amount of Zica virus non-structural protein 1 with the highest sensitivity. After 9 monoclonal antibodies were spotted at a concentration of 1 μM for 1 μl each, and reacted at 37° C. for 2 hours to fix the monoclonal antibody, 5% BSA and 0.1% Tween-20 were added. Blocking was performed at 37°C for 1 hour using the included PBS solution. Next, the non-structural protein 1 of Zika virus was spotted 1 μl at a concentration of 50 nM in each well to which 9 monoclonal antibodies were immobilized, and reacted at 37° C. for 1 hour. Thereafter, washing was performed three times for 10 minutes using a PBS solution containing 0.1% Tween-20, spotting 1 µl of 9 monoclonal antibody-AF546 conjugates at a concentration of 1 μM, and then at 37° C. 1 It was reacted for an hour. Likewise, after washing three times for 10 minutes using a PBS solution containing 0.1% Tween-20, the fluorescence intensity was measured with a fluorescence scanner, and the optimal capture antibody and AF546 were labeled. The probe antibody (AF546 Labeled Antibody or Probe Antibody) pair was finally selected. Among them, capture antibody Clone 5-probe antibody Clone 1, capture antibody Clone 5-probe antibody Clone 7, capture antibody Clone 5-probe antibody Clone 9, capture antibody Clone 6-probe antibody Clone 1, capture antibody Clone 7-probe antibody Clone 1, the antibody pair consisting of the capture antibody Clone 8-probe antibody Clone 4 and the capture antibody Clone 9-probe antibody Clone 1 was found to be relatively superior to other antibody pairs, and based on this, an additional sandwich immunoassay was conducted .

< 실시예 6: 단일클론항체 쌍을 이용한 바이오마커 검출 >< Example 6: Biomarker detection using a pair of monoclonal antibodies >

실시예 5로부터 선정된 단일클론항체 쌍(포획 항체: Clone 5, 프로브 항체: Clone 1)을 이용하여 지카 바이러스의 비구조단백질 1 검출을 위한 민감도 측정을 위해 마찬가지로 위의 실시예 5에서 제작한 단백질 칩을 이용하였다. 포획 항체를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 단일클론항체를 고정한 후, 5%의 BSA 및 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(Blocking)을 진행하였다. 다음에는 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 1 μM부터 1/2씩 연속 희석하여 0 nM을 포함해 서로 다른 15가지의 농도를 갖도록 희석하였다. 희석된 각각의 농도의 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 1 ㎕씩 스팟팅하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회의 세척을 해준 다음, AF546 표지 항체를 1 μM의 농도로 1 ㎕씩 스팟팅한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마찬가지로 0.1%의 Tween-20이 포함되어 있는 PBS 용액을 이용하여 10분간 3회 세척해 해준 다음, 형광 스캐너로 지카 바이러스 비구조단백질 1의 농도별 형광 강도를 측정하여 민감도 및 검출한계(Limit of Detection, LOD)를 측정하였다. Protein chip prepared in Example 5 above similarly for measuring the sensitivity for detecting non-structural protein 1 of Zika virus using a monoclonal antibody pair selected from Example 5 (capture antibody: Clone 5, probe antibody: Clone 1) Was used. The capture antibody was spotted 1 μl at a concentration of 1 μM, and then reacted at 37° C. for 2 hours to fix the monoclonal antibody, followed by using a PBS solution containing 5% BSA and 0.1% Tween-20. Blocking was performed at 37°C for 1 hour. Next, Zica virus non-structural protein 1 was serially diluted from 1 μM to 1/2 to dilute to have 15 different concentrations, including 0 nM. 1 µl of non-structural protein 1 of Zika virus at each concentration was diluted and reacted at 37° C. for 1 hour. After washing three times for 10 minutes using a PBS solution containing 0.1% Tween-20, the AF546-labeled antibody was spotted 1 μl at a concentration of 1 μM and reacted at 37° C. for 1 hour. Similarly, after washing with PBS solution containing 0.1% Tween-20 three times for 10 minutes, sensitivity and detection limit (Limit of Detection, LOD).

그 결과, 단일클론항체 칩은 도 6에 나타낸 바와 같이 지카 바이러스의 비구조단백질 1을 특이적으로 고감도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the monoclonal antibody chip can specifically detect the high-sensitivity non-structural protein 1 of the Zika virus as shown in FIG. 6.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair <130> PN1812-543 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> non-structural protein 1 of Zika Virus <400> 1 Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr 1 5 10 15 Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys 20 25 30 Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala 35 40 45 Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn 50 55 60 Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu 65 70 75 80 Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met 85 90 95 Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His 100 105 110 Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser His Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr 115 120 125 Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu 130 135 140 Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly 145 150 155 160 Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu 165 170 175 Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala 180 185 190 Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr 195 200 205 Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp 210 215 220 Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu 225 230 235 240 Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg 245 250 255 Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu 275 280 285 Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser Gly 290 295 300 Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro Leu 305 310 315 320 Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro 325 330 335 Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala Gly 340 345 350 Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu 355 360 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair <130> PN1812-543 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> non-structural protein 1 of Zika Virus <400> 1 Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr 1 5 10 15 Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys 20 25 30 Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala 35 40 45 Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn 50 55 60 Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu 65 70 75 80 Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met 85 90 95 Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His 100 105 110 Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser His Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr 115 120 125 Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu 130 135 140 Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly 145 150 155 160 Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu 165 170 175 Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala 180 185 190 Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr 195 200 205 Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp 210 215 220 Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu 225 230 235 240 Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg 245 250 255 Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu 275 280 285 Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser Gly 290 295 300 Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro Leu 305 310 315 320 Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro 325 330 335 Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr Ala Gly 340 345 350 Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu 355 360

Claims (7)

지카 바이러스(Zika virus)의 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1)에 특이적으로 결합하는 포획 항체(capture antibody)를 고정하는 단계;
개체로부터 분리된 생물학적 샘플을 접촉하는 단계;
지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체(probe antibody)를 접촉하는 단계; 및
지카 바이러스 비구조단백질 1과 포획 항체 및 지카 바이러스 비구조단백질 1과 프로브 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법.Immobilizing a capture antibody specifically binding to non-structural protein 1 (NS1) of Zika virus;
Contacting a biological sample isolated from the subject;
Contacting a probe antibody specifically binding to Zika virus non-structural protein 1; And
A method for detecting a Zika virus using a pair of monoclonal antibodies, comprising detecting the complex formation between the Zika virus non-structural protein 1 and the capture antibody and the Zika virus non-structural protein 1 and the probe antibody. 제 1항에 있어서, 상기 지카 바이러스 비구조단백질 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 지카 바이러스의 검출 방법.The method of claim 1, wherein the Zika virus non-structural protein 1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제 1항에 있어서, 상기 프로브 항체는 형광물질, 양자 점(Quantum dot), 금속 나노입자(Metal Nanoparticle), 겨자무 과산화효소(Horseradish Peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline Phosphatase), 라만 리포터(Raman Reporter), 란탄족 원소(Lanthanide), 전기화학발광 태그(Electrochemiluminescence Tag), 탄소 나노튜브(Carbon Nanotube) 또는 그래핀(Graphene)에 컨쥬게이션한 것인 지카 바이러스의 검출 방법.According to claim 1, The probe antibody is a fluorescent substance, quantum dots (Quantum dot), metal nanoparticles (Metal Nanoparticle), mustard radish peroxidase (Horseradish Peroxidase), alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase), Raman reporter ( Raman Reporter), a lanthanide element (Lanthanide), electrochemiluminescence tag (Electrochemiluminescence Tag), carbon nanotube (Carbon Nanotube) or graphene (Graphene) conjugated method of detecting Zika virus. 제 1항에 있어서, 상기 포획 항체와 프로브 항체는 동종(Same Species)의 항체 쌍인 것인 지카 바이러스의 검출 방법.The method of claim 1, wherein the capture antibody and the probe antibody are pairs of antibodies of the same species (Same Species). 제 1항에 있어서, 상기 단일클론항체 쌍은 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 지카 바이러스 비구조단백질 1에 특이적으로 결합하는 프로브 항체인 것인 지카 바이러스의 검출 방법.The method of claim 1, wherein the monoclonal antibody pair is a capture antibody that specifically binds to Zika virus non-structural protein 1 and a probe antibody that specifically binds Zika virus non-structural protein 1. 제 1항에 있어서, 상기 포획 항체의 농도는 0.1 μg/ml 내지 200 μg/ml인 것인 지카 바이러스의 검출 방법.The method of claim 1, wherein the concentration of the capture antibody is 0.1 μg/ml to 200 μg/ml. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨인 것인 지카 바이러스의 검출 방법.





The method of claim 1, wherein the biological sample is tissue, cell, whole blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, or urine.





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