KR102227257B1 - Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain Ⅲ of flaviviruses, hybridoma cell line producing the same and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 감염 진단용 키트 및 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 플라비바이러스 속(genus)에 해당하지 않는 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 플라비바이러스 감염증의 치료 예후 관찰, 플라비바이러스 또는 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ의 검출 및 정량적 분석 등과 관련된 기술의 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'; A hybridoma cell line producing the monoclonal antibody; A composition for diagnosing flavivirus infection comprising the monoclonal antibody; It relates to a flavivirus infection diagnostic kit comprising the monoclonal antibody and a method for diagnosing flavivirus infection. The monoclonal antibody produced from hybridoma cells of the present invention has a specific high binding affinity only for'Flavivirus Envelope Protein Domain III', while at the same time, other mosquito-mediated antibodies that do not correspond to the flavivirus genus Since it does not react with the envelope protein of the virus, these monoclonal antibodies can be usefully used for flavivirus detection or diagnosis of flavivirus infection. In addition, the monoclonal antibody produced from the hybridoma cells of the present invention using such characteristics is related to observation of the treatment prognosis of flavivirus infection, detection of flavivirus or flavivirus envelope protein domain III, and quantitative analysis. It can also be usefully used for technology development.
Description
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스를 검출하는 방법 및 플라비바이러스의 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'; A hybridoma cell line producing the monoclonal antibody; A composition for detecting flavivirus or diagnosing infection, including the monoclonal antibody; A kit for detection of flavivirus or infection diagnosis comprising the monoclonal antibody; It relates to a method of detecting flavivirus using the monoclonal antibody and a method of diagnosing flavivirus infection.
플라비바이러스(Flavivirus)는 분류학적으로는 플라비비리데과(Flaviviridae family)의 하위 속(Genus)인 플라비바이러스속(Flavivirus)에 해당하는 양성 단일가닥의 RNA 바이러스(Positive single-stranded RNA virus)를 의미한다. 생태학적으로는 모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus)와 진드기 매개 바이러스(Tick-borne virus)로 구분할 수 있으며, 항원성(Antigenicity)이 서로 다른 70여 종의 바이러스가 포함되어 있으며, 사람과 동물에게 심한 질병을 일으키는 바이러스가 많다. 대표적인 플라비바이러스로는 지카 바이러스(Zika virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus) 등이 있다(감염병실험실진단, 질병관리본부 국립보건연구원 (2005), Rodenhuis-Zybert et al., Cell. Mol. Life Sci . (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786.).Flavivirus is a positive single-stranded RNA virus corresponding to the flavivirus genus, a genus of the Flaviviridae family, taxonomically. Means. Ecologically, it can be classified into a mosquito-borne virus and a tick-borne virus, and it contains over 70 kinds of viruses with different antigenicity. There are many viruses that cause serious diseases. Representative flaviviruses include Zika virus, Dengue virus, West Nile virus, Japanese encephalitis virus, and St. Louis encephalitis virus. ( Infectious disease laboratory diagnosis , Korea Centers for Disease Control and Prevention (2005), Rodenhuis-Zybert et al., Cell. Mol . Life Sci . (2010) Vol. 67, pp. 2773-2786.).
지구온난화에 의한 열대, 아열대, 온대 지역의 확대로 인해 플라비바이러스의 주요 숙주(Host)인 각다귀속(Aedes genus)에 해당하는 모기의 서식지가 확대되고 있기 때문에, 모기 매개 바이러스에 대한 경계가 확대되고 있다(Kraemer et al., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347.). 각다귀속 모기의 분포로 미루어 짐작해보면 아시아, 중남미, 북미, 오세아니아, 아프리카 대륙 등의 여러 국가들이 플라비바이러스의 감염 위험에 노출되어 있는 것으로 추정할 수 있으며, 인구로 보면 전 세계 인구 중 약 40%(25억명)의 인구가 플라비바이러스의 감염 위험에 노출되어 있는 것으로 추정할 수 있다. 플라비바이러스에 감염된 환자의 약 80% 정도는 불현성 감염이며, 증상은 3-7일 정도 경미하게 진행된다고 알려져 있다. 또한 주요 증상은 반점구진성 발진이며, 관절통, 근육통, 결막염, 발열, 두통 등이 동반될 수 있다고 알려져 있으며, 아직까지 특별한 예방주사나, 백신, 치료제는 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 신속한 조기 진단을 통한 충분한 휴식 및 수분 섭취나 진통제 및 해열제 복용이 매우 중요하다고 할 수 있다.Because due to the expansion of tropical, subtropical, temperate regions due to global warming, habitat of the mosquitoes that corresponds to the speed of the main host (Host) of the flavivirus crane fly (Aedes genus) is expanding, expanding the boundaries of the mosquito-borne virus (Kraemer et al ., eLife (2015) Vol. 4, pp. e08347.). If you estimate from the distribution of the genus mosquito, it can be estimated that various countries such as Asia, Central and South America, North America, Oceania, and the African continent are exposed to the risk of infection of the flavivirus, and in terms of population, about 40% of the world's population. It can be estimated that the population of (2.5 billion) is at risk of infection with the flavivirus. About 80% of patients infected with flavivirus are non-expressive infections, and symptoms are known to progress slightly for 3-7 days. In addition, the main symptom is a papular rash, and it is known that joint pain, muscle pain, conjunctivitis, fever, and headache may accompany it, and there are no special preventive injections, vaccines, or treatments yet. Therefore, it can be said that it is very important to take adequate rest and fluid intake or analgesics and antipyretics through rapid early diagnosis.
플라비바이러스(Flavivirus)는 모두 공통의 구조를 가지고 있다. 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm 이며, 약 11,000개 내외의 염기(Base)로 구성되어 있다. 보다 자세하게는 정이십면체형의 캡시드 단백질(Icosahedral-like nucleocapsid protein)과 외피 단백질(Envelope protein)은 대칭을 이루고 있는 구조이며, 플라비바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(Structural protein)과 비구조단백질(Non-structural protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(Capsid protein, C), 전구체 막 단백질(Precursor membrane protein, prM), 막 단백질(Membrane protein, M), 외피 단백질(Envelope protein, E) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(Non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다 (https://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). 따라서 항체를 이용한 면역분석법(Immunoassay)을 통해 플라비바이러스를 검출하거나 플라비바이러스의 감염증을 진단하고자 할 경우, 플라비바이러스의 외부에 위치되어 있어 항체와의 접근 및 결합(또는 반응)이 용이한 외피 단백질(E), 비구조단백질 1(NS1), 비구조단백질 2A(NS2A) 및 2B(NS2B), 비구조단백질 4A(NS4A) 및 4B(NS4B) 등이 유용한 바이오마커(타겟, 목표물질)라고 할 수 있다.Flaviviruses all have a common structure. It has a spherical structure and is 40-65 nm in size, and is composed of about 11,000 bases. In more detail, the icosahedral-like nucleocapsid protein and envelope protein have a symmetrical structure, and the appearance of the flavivirus can be observed with an electron microscope. The proteins that make up the flavivirus can be largely classified into structural proteins and non-structural proteins, and structural proteins include capsid proteins (C) and precursor membrane proteins (Precursor membrane proteins). prM), membrane protein (M), envelope protein (E), etc., and non-structural protein 1 (Non-structural protein 1, NS1), non-structural protein 2A (NS2A), non-structural protein 2B (NS2B), non-structural protein 3 (NS3), non-structural protein 4A (NS4A), non-structural protein 4B (NS4B), and non-structural protein 5 (NS5). Although the functions or roles of all proteins have not yet been identified, it is believed that precursor membrane proteins, envelope proteins, non-structural proteins 1, parts of non-structural proteins 2A and 2B, and parts of non-structural proteins 4A and 4B are exposed to the outside of the virus. There is (https://viralzone.expasy.org/6756?outline=all_by_species). Therefore, in case of detecting flavivirus or diagnosing flavivirus infection through immunoassay using antibody, it is located outside of flavivirus, so it is easy to access and bind (or react) with antibody. Envelope protein (E), non-structural protein 1 (NS1), non-structural protein 2A (NS2A) and 2B (NS2B), and non-structural protein 4A (NS4A) and 4B (NS4B) are useful biomarkers (targets, target substances). have.
플라비바이러스 검출기술 및 플라비바이러스 감염증 진단기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역진단법(Immunodiagnostics), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular diagnostics), 3) 직접적인 바이러스 배양법과 같이 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 '항체'를 보유하고 있다면, 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 바이러스 분석방법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 매우 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법도 검출하고자하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or antibody) detection) 및 항원 검출법(Antigen detection)으로 다시 세분화 할 수 있다. 미국의 CDC (Centers for disease control and prevention)에서는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증 진단을 위해 여러 가지 방법을 제시하고 있지만, 면역분석법에서는 혈청학적 검출법인 MAC-ELISA (IgM antibody capture ELISA)를 플라비바이러스 감염 여부 확인을 위한 표준 진단법으로 권고하고 있는 상황이다.Flavivirus detection technology and flavivirus infection diagnosis technology are largely 1) Immunodiagnostics using an antigen-antibody reaction, 2) Molecular diagnostics, 3) Direct virus It can be classified into three types as in the cultivation method. Among them, if the immunoassay method has an'antibody', it has the advantage of being able to detect quickly because the virus analysis method is relatively simple and the time required for analysis is very short compared to the molecular diagnosis method or virus culture method. Immunoassay can also be subdivided into serological (or antibody) detection and antigen detection according to the type of substance to be detected. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in the United States proposes several methods for flavivirus detection or flavivirus infection diagnosis, but in immunoassay, a serological detection method, MAC-ELISA (IgM antibody capture ELISA) is used. This is a situation that is recommended as a standard diagnostic method to check for non-viral infection.
플라비바이러스와 같은 모기 매개 바이러스인 알파바이러스속(Alphavirus genus)에 해당하는 치쿤군야(Chikungunya virus)와 마찬가지로 감염 초기에는 발열, 발진, 구토, 근육통 등의 공통적인 증상을 나타내 감염증을 구별하기 어렵다. 그러나 플라비바이러스의 감염증의 정도가 심한 경우에는 전혀 다른 질병을 나타낼 수 있기 때문에, 다른 모기 매개 바이러스와의 정확한 구별이 필요하다(Patterson et al., West J. Emerg. Med . (2016) Vol. 17, pp. 671-679., Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao-Lormeau et al., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 1531-1539.). Like Chikungunya virus, which belongs to the Alphavirus genus, which is a mosquito-borne virus such as flavivirus, it is difficult to distinguish infections due to common symptoms such as fever, rash, vomiting, and muscle pain at the initial stage of infection. However, if the degree of flavivirus infectiousness is severe, since it can represent a completely different disease, it is necessary to accurately distinguish it from other mosquito-borne viruses (Patterson et al., West J. Emerg. Med . (2016) Vol. 17, pp. 671-679., Honein et al., JAMA (2017) Vol. 317, pp. 59-68., Attar, Nat. Rev. Micro. (2016) Vol. 14, pp. 62., Cao -Lormeau et al., Lancet (2016) Vol. 387, pp. 1531-1539.).
하지만 모기 매개 바이러스는 구조적으로 유사하기 때문에, 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 궁극적으로 플라비바이러스만을 특이적으로 검출하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 IgM의 경우 지카 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵고, IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 이전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-positive)의 결과를 초래할 수 있다. 그렇기 때문에 플라비바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커나 타겟(목표물질)로 정하여, 오직 플라비바이러스의 단백질과 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 플라비바이러스의 검출 및 플라비바이러스 감염증의 진단에 유리하다고 할 수 있다.However, since mosquito-borne viruses are structurally similar, serological detection methods that detect immunoglobulins such as IgM or IgG generated in the body due to viral infection are ultimately difficult to detect specifically only flaviviruses. There is this. In addition, since IgM is not produced immediately after Zika virus infection, it is produced over several days, it is difficult to diagnose early.In the case of IgG, it takes longer to produce than IgM, and if it is not the first infection, it is produced in the body due to a previous infection. It may be an antibody that has been tested, resulting in a false-positive result. Therefore, the detection of flavivirus and flavivirus antigen detection using monoclonal antibodies that can only bind to flavivirus proteins by specifying specific proteins constituting flavivirus as biomarkers or targets (target substances) It can be said to be advantageous for diagnosing infectious diseases.
이에 본 발명자들은 별도의 플라비바이러스의 배양과정 없이 플라비바이러스의 검출이나 플라비바이러스 감염 진단을 위해, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체를 이용하는 경우 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ-단일클론항체 복합체(항원-항체 복합체)'에 대한 반응분석으로부터 짧게는 수 분의 시간 이내에, 길게는 수 시간 이내에 손쉽게 플라비바이러스 검출이나 플라비바이러스에 감염되었는지에 대한 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors have a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III' and the monoclonal antibody for detection of flavivirus or diagnosis of flavivirus infection without a separate flavivirus cultivation process. A hybridoma cell line that produces is developed, and in the case of using the monoclonal antibody of the present invention, it is only a few minutes from the reaction analysis to the'flavivirus envelope protein domain III-monoclonal antibody complex (antigen-antibody complex)'. The present invention was completed by confirming that it is possible to easily detect flaviviruses or diagnose whether they are infected with flaviviruses within hours or as long as several hours.
따라서 본 발명의 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting flavivirus or for diagnosing infection, including a monoclonal antibody specifically binding to'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting flaviviruses or diagnosing infection, including a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a flavivirus using a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 또 다른 목적은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diagnosis of flavivirus infection by using a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a monoclonal antibody that is produced by hybridoma cells of accession number KCTC18776P and specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG1 이소타입일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody may be of the IgG 1 isotype.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 결합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody may bind to the'flavivirus envelope protein domain III' with a dissociation constant of 0.1 to 100 nanomolar (nM).
또한, 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a hybridoma cell of accession number KCTC18776P producing a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting flavivirus or diagnosing infection, including the monoclonal antibody.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting or diagnosing flavivirus containing the monoclonal antibody.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the kit comprises an antibody condensed with a label in addition to the monoclonal antibody of the present invention; And a color developing substrate.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the label is mustard radish peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase, AP), glucose oxidase, luciferase, Β-D-galactosidase, malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase, colloidal gold, metal nanoparticles, Silica nanoparticle, Organic fluorescent material, Fluorescent protein, Quantum dot, Radioactive material, Radioactive material, Isotope, Dye, Carbon It may be selected from the group consisting of carbon nantube, graphene, and fullerene.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the color developing substrate is DAB (diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), It may be selected from the group consisting of ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD ( o-phenylenediamine).
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 플라비바이러스의 존재를 확인하고자 하는 시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of detecting a flavivirus comprising the step of performing an antigen-antibody reaction by contacting the monoclonal antibody with a sample to be confirmed for the presence of the flavivirus.
또한, 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of preparing a sample; Applying the monoclonal antibody of the present invention to the sample; And it provides a method of providing information necessary for the diagnosis of flavivirus infection comprising the step of measuring the antigen-antibody response.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 플라비바이러스 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample may be selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, cells, cell lysates, body fluids, saliva, cerebrospinal fluid, and urine of a subject suspected of flavivirus infection.
본 발명의 일실시예예 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antigen-antibody reaction is an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), a sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), and western blotting ( Western blotting), Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow Lateral flow immunoassay (LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunity It can be measured by a method selected from the group consisting of an interferometric immunoassay and a visual assessment.
본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 플라비바이러스 속(Genus)에 해당하지 않는 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 플라비바이러스 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 플라비바이러스 감염증의 치료 예후 관찰, 플라비바이러스 또는 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ의 검출 및 정량적 분석 등과 관련된 기술의 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.The monoclonal antibody produced from hybridoma cells of the present invention has a specific high binding affinity only for'Flavivirus Envelope Protein Domain III', while at the same time, other mosquito-mediated antibodies that do not correspond to the flavivirus genus (Genus) Since it does not react with the envelope protein of the virus, these monoclonal antibodies can be usefully used for flavivirus detection or diagnosis of flavivirus infection. In addition, the monoclonal antibody produced from the hybridoma cells of the present invention using such properties is related to observation of the treatment prognosis of flavivirus infection, detection of flavivirus or flavivirus envelope protein domain III, and quantitative analysis. It can also be usefully used for technology development.
도 1은 3종 플라비바이러스의 항원(Antigen)인 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한 다음 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단백질을 염색한 결과 사진이다.
도 2는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 순수 분리ㆍ정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행 한 다음, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단일클론항체를 염색한 결과 사진이다.
도 3은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 공통적으로 결합하는 단일클론항체의 이소타입(Isotype)을 확인한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 각각에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 단일클론항체의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 특이도(specificity)를 확인하기 위해, 플라비바이러스에 속하는 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(ZIKV-EDⅢ), 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(DENV-EDⅢ), 웨스트나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ(WNV-EDⅢ) 및 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ(CHIKV-EDⅡ)에 대한 상기 단일클론항체와의 반응성을 확인한 그래프이다.FIG. 1 is an electrophoresis of'Zika virus coat protein domain III','dengue virus coat protein domain III', and'West Nile virus coat protein domain III', which are antigens of three flaviviruses, using a polyacrylamide gel. This is a photograph of the result of staining the protein using Coomassie Blue solution after performing the electrophoresis.
FIG. 2 shows a monoclonal antibody commonly binding to'Flavivirus Envelope Protein Domain III' generated from a hybridoma cell line with accession number KCTC18776P and purified and isolated by electrophoresis using a polyacrylamide gel. , This is a photograph of the result of staining monoclonal antibodies using Coomassie Blue solution.
3 is a result of confirming the isotype of a monoclonal antibody that commonly binds to the'flavivirus envelope protein domain III' generated from a hybridoma cell line of accession number KCTC18776P.
4A to 4C are graphs showing the dissociation constant (K D ) of a monoclonal antibody for each of the '3 flavivirus envelope protein domains III' generated from a hybridoma cell line of accession number KCTC18776P.
5 is a Zika virus envelope protein domain III belonging to the flavivirus in order to confirm the specificity of the'flavivirus envelope protein domain III' of the monoclonal antibody generated from the hybridoma cell line of the accession number KCTC18776P. (ZIKV-EDIII), Dengue virus envelope protein domain III (DENV-EDIII), West Nile virus envelope protein domain III (WNV-EDIII) and Chikungunya virus envelope protein domain II (CHIKV-EDII) belonging to the alpha virus above This is a graph confirming the reactivity with a monoclonal antibody.
본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공함에 그 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III' and a hybridoma cell line that produces the monoclonal antibody.
본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프(Epitope))에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하므로, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 인식하는 단백질 분자이다.In the present invention, the term'monoclonal antibody' refers to a protein molecule that specifically binds to a single antigenic site (single epitope). For the purposes of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention is a protein molecule that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III' and thus recognizes the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명의 용어 '하이브리도마 세포'란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. The term'hybridoma cell' in the present invention is a cell made by artificially fusing two different types of cells, and uses a substance that causes cell fusion, such as polyethylene glycol (PEG), or a virus of any species. It refers to a cell or cell line in which two or more allogeneic cells or heterogeneous cells are fused to integrate different functions of different cells into one cell.
본 발명자들은 별도의 플라비바이러스의 배양과정 없이 플라비바이러스의 검출 또는 플라비바이러스 감염증의 진단을 위해, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대한 연구를 진행하였고, 그 결과 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 생산하는 하이브리도마 세포를 구축하고, 이를 이용하여 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 특이적 단일클론항체를 생산하였다.The present inventors conducted a study on a monoclonal antibody that specifically binds to'Flavivirus Envelope Protein Domain III' for detection of flavivirus or diagnosis of flavivirus infection without a separate flavivirus cultivation process. As a result, hybridoma cells producing'flavivirus coat protein domain III' were constructed, and a specific monoclonal antibody specific to'flavivirus coat protein domain III' was produced using this.
본 발명에서는 생산된 하이브리도마 세포주 중 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'와 높은 반응성을 보이는 세포주를 1차 선별하였으며, 계대배양을 거쳐 이들 중 생존능을 상실했거나 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 본 발명의 하이브리도마 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 상기 세포주가 생산하는 단일클론항체의 이소타입 및 해리상수를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일클론항체는 IgG1 이소타입을 가지면서, '지카 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (0.151±0.001) 나노몰(nM), '뎅기 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (19.410±1.977) 나노몰(nM), '웨스트 나일 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'의 대해서는 (8.525±0.468) 나노몰(nM)의 해리상수 값을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 단일클론항체는 '플라비바이러스 속(genus)에 속하는 대표적인 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 우수한 결합친화도를 갖는 것을 확인하였다. In the present invention, a cell line exhibiting high reactivity with'Zika virus envelope protein domain III' was first selected among the produced hybridoma cell lines, and the viability was lost among them through subculture or for'Zika virus envelope protein domain III'. The hybridoma cell line of the present invention was secondarily selected through the process of excluding the non-reactive hybridoma cell line. Thereafter, the isotype and dissociation constant of the monoclonal antibody produced by the cell line were measured. As a result, the monoclonal antibody produced in the hybridoma cell line of the present invention has an IgG 1 isotype, and for'Zika virus envelope protein domain III' (0.151±0.001) nanomolar (nM),'Dengue virus envelope protein For domain III', (19.410±1.977) nanomolar (nM), and for'West Nile virus envelope protein domain III' (8.525±0.468) nanomolar (nM) dissociation constant values were shown. Accordingly, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention has an excellent binding affinity to the envelope protein domain III of a typical virus belonging to the'Flavivirus genus'.
또한, 본 발명의 단일클론항체의 플라비바이러스 검출 특이성을 살펴보기 위하여, 다른 속(Genus)에 해당되나 같은 숙주(Host)인 각다귀 속(Aedes genus)의 모기를 이용하는 알파바이러스 속(Alphavirus genus)에 해당하는 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus)의 외피 단백질에 대한 결합(또는 반응) 여부를 확인한 결과, 본 발명의 단일클론항체는 다른 속(Genus)에 해당되는 바이러스의 외피 단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인하였다.In addition, in order to examine the flavivirus detection specificity of the monoclonal antibody of the present invention, the genus Alphavirus using mosquitoes of the genus Aedes genus, which is a different genus, but the same host As a result of checking whether the binding (or reaction) of the Chikungunya virus corresponding to to the envelope protein was confirmed, the monoclonal antibody of the present invention was bound (reacted) with the envelope protein of the virus corresponding to another genus. It was confirmed that it specifically binds (reacts) only to the'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명에 따른 IgG1 이소타입(Isotype)의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 'Hybridoma JZE3-1'로 명명하였고, 이들 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2019년 7월 5일자로 기탁하였으며, 2019년 7월 11일자로 기탁번호 KCTC18776P를 부여받았다. The hybridoma cell line that produces the IgG 1 isotype monoclonal antibody according to the present invention was named'Hybridoma JZE3-1', and these cell lines were designated by the Korean Collection for Type Cultures, KCTC) on July 5, 2019, and was granted the deposit number KCTC18776P on July 11, 2019.
따라서 본 발명은, 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스의 검출용 또는 감염 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용한 지카 바이러스 검출방법 및 플라비바이러스 감염 진단방법을 제공한다.Accordingly, the present invention is a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC18776P and specifically binding to'flavivirus envelope protein domain III'; A hybridoma cell line of accession number KCTC18776P producing the monoclonal antibody; A composition for detecting flavivirus or diagnosing infection, including the monoclonal antibody; A kit for detection of flavivirus or infection diagnosis comprising the monoclonal antibody; It provides a method for detecting Zika virus and a method for diagnosing flavivirus infection using the monoclonal antibody.
본 발명에서 상기 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 서열번호 1(지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ), 서열번호 2(뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ) 또는 서열번호 3(웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ)의 아미노산으로 이루어진 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다. In the present invention, the'flavivirus envelope protein domain III' is SEQ ID NO: 1 (Zika virus envelope protein domain III), SEQ ID NO: 2 (dengue virus envelope protein domain III) or SEQ ID NO: 3 (West Nile virus envelope protein domain III) It may include itself consisting of amino acids of, recombinant proteins thereof, and artificial variants and mutants thereof, as well as natural forms of proteins and functional equivalents thereof.
본 발명의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(Fusion method)에 의해 제조될 수 있다(K
상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있다.The monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line may be used without purification, or purified with high purity (eg, 90% or more) according to a method well known in the art to which the present invention pertains. Such purification techniques may be separated from culture medium or ascites using, for example, gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity antigen column chromatography, or the like.
한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(Mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.On the other hand, a useful point in the case of using a monoclonal antibody to detect an antigen is that it has a specific interaction by recognizing a single epitope, that is, an epitope. As described above, various approaches can be used to map epitopes involved in the interaction between antigen and antibody. For example, biopanning using a phage display peptide library, immunoblotting of fragments generated by digesting antigenic polypeptides with proteases and screening to determine fragments containing epitope sequences, activated membranes or solid phases such as polyethylene pins Screening the peptide arrays immobilized on, and a competitive ELISA assay using soluble peptides to determine the importance of each amino acid sequence residue in the epitope sequence.
상기 단일클론항체의 항원과의 결합 친화성은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)을 통해 항원과의 결합을 측정할 수 있다.The binding affinity of the monoclonal antibody to the antigen can be determined according to a conventional method, and this method is not particularly limited, but enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) , Sandwich ELISA, Western blotting, Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay , Surface plasmon resonance immunoassay, interferometric immunoassay, and visual assessment can be used to measure antigen binding.
본 명세서에서는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).In the present specification, as an antibody against the'flavivirus envelope protein domain III', it may not only be in the form of a whole antibody but also include a functional fragment of an antibody molecule. The whole antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond. The heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), epsilon (ε) types, and subclasses gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), and gamma 3 (γ3). ), gamma4(γ4), alpha1(α1) and alpha2(α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types (Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas AK et al ., 2017).
항체 분자의 '기능적인 단편'이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(Hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머(dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.The term'functional fragment' of an antibody molecule refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 , and Fv. Among the antibody fragments, Fab has a structure having the variable region of the light and heavy chain, the constant region of the light chain, and the first constant region (CH1) of the heavy chain, and has one antigen-binding site. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain. In the F(ab') 2 antibody, the cysteine residues in the hinge region of Fab' form a disulfide bond. Fv is the smallest antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region. Recombination techniques for generating Fv fragments are disclosed in International Patent Publications WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 and WO 88. /09344. dsFv (double-chain Fv) is a non-covalent bond between the heavy chain variable region and the light chain variable region, and scFv (single chain Fv) is generally a heavy chain variable region and a single chain variable region connected by a covalent bond through a peptide linker, or C- Since it is connected directly at the end, it can form a dimer-like structure like dsFv. Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction cleavage of the whole antibody with papain yields Fab, and restriction cleavage with pepsin yields F(ab') 2 fragments), Preferably, it can be produced through gene recombination technology. In the present invention, the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of a whole antibody. In addition, the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), or epsilon (ε). The light chain constant region may be of kappa or lambda type.
본 발명의 일구체예에 있어서, 본 발명의 단일클론항체는 IgG1 이소타입일 수 있으며, 상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 결합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention may be of the IgG 1 isotype, and the monoclonal antibody has a dissociation constant of 0.1 to 100 nanomolar (nM), and'flavivirus envelope protein domain III' Can be combined with
또한, 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a hybridoma cell of accession number KCTC18776P that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III'.
상기 하이브리도마 세포주는, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 상기 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 융합된 하이브리도마 세포주에서 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 단백질에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.The hybridoma cell line, the step of immunizing a mouse using the'flavivirus envelope protein domain III'; Culturing the splenocytes of the immunized mouse by fusion with myeloma cells; And selecting a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody specific for the'flavivirus envelope protein domain III' protein from the fused hybridoma cell line.
본 발명의 하이브리도마 세포주를 통해 생산한 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 특이적으로 인식함으로, 이러한 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 또는 플라비바이러스의 검출 및 플라비바이러스 감염증의 진단을 위한 용도로 사용될 수 있다. Since the monoclonal antibody produced through the hybridoma cell line of the present invention specifically recognizes the'flavivirus coat protein domain III', such a monoclonal antibody is the'flavivirus coat protein domain III' or the flavivirus. It can be used for detection and diagnosis of flavivirus infection.
따라서 본 발명은 본 발명의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 검출용 조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 플라비바이러스의 감염 여부를 확인/진단(플라비바이러스 감염증 진단)할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다. Accordingly, the present invention can provide a composition for detecting flaviviruses comprising a monoclonal antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' of the present invention, and further confirming/diagnosing whether or not the flavivirus is infected (Flavi A composition capable of diagnosing viral infections) can be provided.
본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 플라비바이러스 감염 여부를 확인하는 것이다.The term used in the present invention,'diagnosis' means to confirm the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the flavivirus is infected.
본 발명의 단일클론항체를 이용하여 플라비바이러스의 존재 여부 및 플라비바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있으며, 또한, 플라비바이러스의 감염이 의심되는 생물학적 시료를 대상으로 하여 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.The presence or absence of flavivirus and infection of flavivirus can be detected using the monoclonal antibody of the present invention. In addition, normal antigen-antibody reactions targeting biological samples suspected of flavivirus infection The analysis method of can be used. Antigen-antibody reactions were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, and immune dot blot analysis ( Immunodot blot assay), Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (LFA) , Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay, Visual measurement ( Visual assessment), etc. can be illustrated, but is not limited thereto.
웨스턴 블로팅(Western blotting)은, 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 아크릴아미드 겔(gel) 전기 영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.Western blotting is a useful method for identifying the corresponding protein present in a biological sample. For example, a biological sample solution, such as an extract derived from organ tissue, is subjected to acrylamide gel electrophoresis, transferred to the PVDF membrane, and reacted with an antibody that recognizes the protein or the peptide, and immunity generated therefrom The complex is detected using a labeled second antibody.
면역 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.Immunostaining is an effective method for analyzing the expression site of a target polypeptide (polypeptide) in tissues and cells. For example, tissue sections, cells, etc. fixed on a slide glass are reacted with the antibody of the present invention, from which It is carried out by detecting the resulting immune complex using a labeled second antibody.
한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.Meanwhile, the presence or absence of a specific protein in a biological sample can be confirmed by measuring the formation of an antigen-antibody complex by contacting the sample with an antibody that specifically binds to the protein. The term'antigen-antibody complex' as used herein refers to a combination of a specific protein in a biological sample and an antibody that specifically recognizes it.
본 발명에서 사용된 용어 '생물학적 시료' 또는 '시료'는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.The term'biological sample' or'sample' as used herein refers to blood and other liquid samples of biological origin. Preferably, the biological sample or sample may be any one selected from whole blood, plasma, serum, tissues, cells, cell lysates, body fluids, saliva, cerebrospinal fluid and urine, but is not limited thereto. The sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, most preferably a human. The sample can be pretreated prior to use for detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like. In addition, nucleic acids and proteins can be separated from the sample and used for detection.
또한, 본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적인 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 및 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적인 다른 종류의 다클론 또는 단일클론항체를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the composition for detection (diagnostic) of the present invention includes reagents known in the art used for immunological analysis, in addition to the monoclonal antibody of the present invention specific for the'flavivirus envelope protein domain III', and the'flavivirus envelope protein. Other types of polyclonal or monoclonal antibodies specific for domain III' may be further included.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.In the above, the immunological analysis may include any method capable of measuring the binding of an antigen and an antibody. These methods are known in the art, and can be performed in the same manner as the method of the antigen-antibody reaction assay.
본 발명에 따른 상기 검출용(진단용) 조성물은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 검출 또는 플라비바이러스의 감염증 진단을 위한 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공할 수 있다.The detection (diagnostic) composition according to the present invention may be provided in the form of a kit or microarray for detecting'flavivirus envelope protein domain III' or diagnosing infectious diseases of flavivirus.
본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 검출(진단)의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.The composition for detection (diagnosis) of the present invention may be provided in a state fixed on a suitable carrier or support using various known methods in order to increase the speed and convenience of detection (diagnosis). Examples of suitable carriers or supports include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposome, carboxymethylcellulose, polyacrylamide, polyesterin, porphyry, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube. , Glass, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, cups, flat packs, and the like. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or well inner surface), planar (sheet, test strip).
따라서, 본 발명은 기탁번호 KCTC18776P의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 검출용 키트 또는 플라비바이러스의 감염 진단을 위한 키트를 제공한다.Therefore, the present invention is produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC18776P and comprising a monoclonal antibody specifically binding to the'flavivirus envelope protein domain III' kit for flavivirus detection or flavivirus Kits for diagnosis of infection are provided.
상기 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용(진단용) 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다. The detection (diagnostic) kit may include not only the monoclonal antibody of the present invention, but also tools and reagents generally used in the art used for immunological analysis. Such tools/reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling substance is an enzyme, a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator may be included. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. In addition, the detection (diagnostic) kit may further include a label capable of confirming the reaction between the monoclonal antibody of the present invention and an antigen (antigen determination site) in a sample to be applied thereto.
상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(Labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 알칼리성 포스파타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인 (Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP (Horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(Luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(Lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다. Depending on the type of the label, a method known to those skilled in the art may be used, and specifically, the naked eye, detection equipment, detection reagent, and the like may be used. The detection reagent is a labeled reagent, an auxiliary specific binding member, and/or a signal generating system that enables external identification of the presence of the object to be tested (Analyte) through the naked eye or other instruments. Constituent components may be included. Labeled detection reagents are already well known to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. Examples of such labels are catalysts, enzymes (e.g., phosphatase, peroxidase, etc., and more specific examples are alkaline phosphatase and pepper peroxidase, etc., which are used together in combination with an enzyme substrate), and enzyme substrates (e.g. , Nitroblue tetrazolium, 3,5',5,5'-tetranitrobenzidine, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, 4-methoxy-1-naphthol, 4-chloro-1-naphthol , 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, dioxetane as a chemiluminescent enzyme substrate, and derivatives and their analogues), fluorescent compounds (e.g., Fluorescein), phycobiliprotein (Phycobiliprotein), Rhodamine, etc. and their derivatives and analogs), chemiluminescent compounds, metal sol, dye sol, particulate latex, color indicator, liposome Included are color matter, carbon sol, and non-metallic sol such as selenium. For example, as a labeling means, there is HRP (Horseradish peroxidase) for enzymes, FITC (Fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent substance, and Luminol, isoluminol, and Lucigenin as a luminescent substance, radioactive isotopes Elements include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, and the like, but are not limited thereto. Whether to be labeled by the labeling means can be confirmed using a substrate of an enzyme or a tool for measuring fluorescence, luminescence, or radiation.
본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the kit further comprises a secondary antibody conjugate to which a label to develop color by reaction with a substrate is conjugated, a color developing substrate solution to react with the label, and a washing solution to be used in each reaction step can do.
상기 2차 항체접합체의 표지체는 효소, 발광체, 형광체, 발색체, 전기화학 탐침, 분광용 탐침, 탄소 구조체를 포함하며, 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.Labels of the secondary antibody conjugate include enzymes, luminous bodies, phosphors, chromosomes, electrochemical probes, spectroscopic probes, and carbon structures, and mustard beet peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase). , AP), glucose oxidase, luciferase, beta-D-galactosidase, malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase (Acetylcholinesterase), colloidal gold, metal nanoparticle, silica nanoparticle, organic fluorescent material, fluorescent protein, quantum dot, radioactive It may be selected from the group consisting of a radioactive material, a radioactive isotope, a dye, a carbon nanotube, graphene, and fullerene. However, any one can be used as long as it can be used in an immunological assay other than those exemplified above.
상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)의 발색기질 등을 사용할 수 있다. 하나의 예로, TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.The substrate that induces the color development is preferably used depending on the marker that reacts to the color development, and DAB (diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3) -indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5 ,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), and OPD ( o- phenylenediamine) chromogenic substrates can be used. As an example, a chromogenic substrate such as TMB is degraded by HRP used as a label for a secondary antibody conjugate to generate a chromogenic deposit, and the presence or absence of a protein antigen is detected by visually checking the degree of deposition of the chromogenic deposit. .
상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS (Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS (Phosphate buffered saline) 트윈 완충용액, NaCl, 트윈-20 (Tween-20), 트리톤 X-100 (Triton X-100) 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다.The washing solution is distilled water, TBS (Tris buffered saline) Tween buffer solution, PBS (Phosphate buffered saline) Tween buffer solution, NaCl, Tween-20 (Tween-20), Triton X-100 (Triton X-100), etc. Can be used. After the antigen-antibody binding reaction, the washing solution is reacted with a secondary antibody to the antigen-antibody conjugate, and then an appropriate amount is put into a reactor and washed 3 to 6 times.
또한, 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention comprises the steps of preparing a sample; Applying the monoclonal antibody of the present invention to the sample; And it can provide a method for diagnosing flavivirus infection comprising the step of measuring the antigen-antibody response.
상기 시료는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 검출하고자 하는 분석 대상 물질로서 플라비바이러스이 의심되는 동물이나 환자의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.The sample is an analyte to detect'Flavivirus Envelope Protein Domain III'. Whole blood, plasma, serum, tissues, cells, cell lysates, body fluids, saliva, cerebrospinal fluid, urine, etc. of animals or patients suspected of flavivirus Although can be illustrated, it does not specifically limit the type.
본 발명에서 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.In the present invention, the antigen-antibody reaction is an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), a sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, and immunity. Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (Lateral flow) immunoassay, LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay , Visual assessment can be selected from the group consisting of. However, it is not necessarily limited to these, and various applications and applications are possible.
나아가 본 발명은 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 플라비바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.Furthermore, the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of flavivirus infections comprising a monoclonal antibody against'flavivirus envelope protein domain III'.
본 발명에서 용어, '약학적 조성물'은 유효성분으로서 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 등의 다른 화학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 목적은 생물체에 화합물의 투여를 용이하게 하는데 있다. 여기서, 용어 '유효성분'은 생물학적 효과의 원인이 될 수 있는 펩타이드 또는 항체 제제를 말한다. 용어 '약학적으로 허용가능한 담체'는 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 이러한 용어에는 보조제가 포함된다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, 인산완충액) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 용어 '부형제'는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 여러가지 당류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.In the present invention, the term'pharmaceutical composition' is a composition containing a monoclonal antibody against'flavivirus envelope protein domain III' as an active ingredient, and other chemical components such as pharmaceutically acceptable carriers and excipients are additionally added. Can include. The purpose of the pharmaceutical composition is to facilitate administration of the compound to an organism. Here, the term'active ingredient' refers to a peptide or antibody preparation that can cause biological effects. The term'pharmaceutically acceptable carrier' refers to a carrier or diluent that does not significantly irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound. These terms include adjuvants. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers, such as any one of physiologically acceptable buffers known in the art (e.g., phosphate buffers) or insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, poly It may be ester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. The term'excipient' refers to an inert substance added to a pharmaceutical composition to facilitate administration of the active ingredient. Examples of excipients include calcium carbonate, calcium phosphate, various sugars of starch, cellulose derivatives, gelatin, vegetable oil and polyethylene glycol.
본 발명의 약학적 조성물은 인간 뿐 아니라 플라비바이러스에 감염될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 가축의 플라비바이러스 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 조성물로 제공될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be provided as a composition capable of preventing and treating flavivirus infections of cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, etc. that may be infected with flavivirus as well as humans. have.
본 발명에 따른 단일클론항체는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 특이적으로 결합하여 이들의 발현 또는 기능을 억제할 수 있으므로 플라비바이러스에 의해 야기되는 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.The monoclonal antibody according to the present invention specifically binds to the'flavivirus envelope protein domain III' and can inhibit their expression or function, so the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by the flavivirus Can be used as
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for explaining the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
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폴리아크릴아미드Polyacrylamide 겔 전기영동( Gel electrophoresis ( PolyacrylamidePolyacrylamide gel electrophoresis)을 통한 ' gel electrophoresis) 플라비바이러스Flavivirus 외피 단백질 도메인 Ⅲ'의 확인 Identification of envelope protein domain III'
'플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ'로는 지카 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 뎅기 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 웨스트 나일 바이러스의 외피 단백질 도메인 Ⅲ를 각각 준비하였다.The envelope protein domain III of the Zika virus, the envelope protein domain III of the dengue virus, and the envelope protein domain III of the West Nile virus were prepared as'flavivirus envelope protein domain III'.
플라비바이러스의 단백질을 암호화하는 약 3,000~4,000개 아미노산 중에서 '지카 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'는 107개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '지카 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시하였다.Among about 3,000 to 4,000 amino acids encoding the protein of the flavivirus,'Zika virus envelope protein III' was prepared with a protein consisting of 107 amino acid sequences, and the amino acid sequence of'Zika virus envelope protein III' of the present invention was SEQ ID NO: It is marked as 1.
'뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 104개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '뎅기 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였다.The'dengue virus envelope protein domain III' was prepared with a protein consisting of a 104 amino acid sequence, and the amino acid sequence of the'dengue virus envelope protein III' of the present invention was represented by SEQ ID NO: 2.
'웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 109개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 Ⅲ'의 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시하였다.The'West Nile virus envelope protein domain III' was prepared with a protein consisting of 109 amino acid sequences, and the amino acid sequence of the'West Nile virus envelope protein III' of the present invention was represented by SEQ ID NO: 3.
'플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 순수 분리/정제를 위해 C-말단(C-terminal)에 폴리히스티딘이(Polyhistidine) 연결된 형태(His-tagged)를 이용하였으며, Ni-NTA 레진(Nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법으로 '플라비바이러스 외피 단백질 Ⅲ'를 순수 분리/정제하였다. 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 통해 확인하였다. 'Flavivirus 3 envelope protein domain III' was used in the form of polyhistidine linked to the C-terminal (His-tagged) for pure separation/purification, and Ni-NTA resin ( Nickel-nitrilotriacetic acid resin) was used to isolate/purify flavivirus envelope protein III by affinity chromatography. The separated/purified'flavivirus envelope protein domain III' was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
이들 항원(Antigen)이 높은 순도(purity)로 존재하는지, 알려진 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'의 분자량(Molecular weight)인 약 10~15 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 15% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행한 다음 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 확인하였다.To confirm whether these antigens are present in high purity and are located near about 10-15 kilodalton (kDa), which is the molecular weight of known'flavivirus envelope protein domain III'. Protein electrophoresis was performed using a 15% polyacrylamide gel. Thereafter, the polyacrylamide gel was stained using a Coomassie Blue solution, followed by a bleaching reaction using a bleaching solution, and then'flavivirus envelope protein domain III' was identified.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(Size marker)와 비교했을 때, '플라비바이러스 3종의 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 모두 10~15 kDa 부근에 존재하는 것을 확인할 수 있었기 때문에 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 1, when compared with the protein size marker, it was possible to confirm that all'flavivirus 3 envelope protein domains III' were present in the vicinity of 10 to 15 kDa, so pure separation/ It was confirmed that it was a purified'flavivirus envelope protein domain III'.
<< 실시예Example 2> 2>
효소면역흡착검사(ELISA)를 위한 ''For enzyme immunosorbent test (ELISA) 플라비바이러스Flavivirus 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅된 플레이트의 제조 Preparation of plate coated with envelope protein domain III'
96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ', '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'를 각각 서로 다른 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하고 있는 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 다음 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 'Zika virus coat protein domain III','Dengue virus coat protein domain III','West Nile virus coat protein,' diluted at a concentration of 1 μg/ml in each well of a 96-well plate Domain III' was dispensed into each of different 96-well plates by 100 μl, and then reacted at 37° C. for 1 hour. Then, each well was washed three times using a PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) solution containing 0.1% Tween-20. For the next blocking, 200 µl of PBS/T solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) was dispensed into each well and reacted at 37° C. for 1 hour, and then the PBS/T solution was added. Washed in the same way using.
<< 실시예Example 3> 3>
마우스 면역화 및 항체의 Mouse Immunization and of Antibodies 역가Titer (Antibody titer) 측정(Antibody titer) measurement
상기 <실시예 1>을 통해 확인된 3종의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 중, '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석시킨 다음, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 섞어주어 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 같은 방법 및 실험조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체가 충분히 생성되었는지에 대한 역가(Antibody titer)를 측정하였다.Of the three kinds of'flavivirus envelope protein domain III' identified in <Example 1>, 30 μg of'Zika virus envelope protein domain III' was diluted to 250 μl using a PBS solution, and then the same volume It was mixed with Complete Freund's Adjuvant and made into an emulsion form, and then injected into the intraperitoneal cavity of a 6-week-old female BALB/c mouse to perform primary immunization. Two weeks after the first immunization, Incomplete Freund's Adjuvant was used instead of Complete Freund's Adjuvant, and the second immunization was performed under the same method and experimental conditions. Two weeks after the second immunization, 10 µl of blood was collected from the tail vein of the mouse, and the titer (Antibody titer) of whether an antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' was sufficiently produced in the mouse body was measured.
Indirect ELISA 방식으로 마우스 혈액 내 항체의 역가를 측정하였으며, 상기 <실시예 2>로부터 준비된 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트에 1/102, 1/103, 1/104의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 웰(well)에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP) 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다.The titer of the antibody in the mouse blood was measured by the Indirect ELISA method, and 1/10 2 , 1/10 3 , on an enzyme immunosorbent plate coated with'Zika virus envelope protein domain III' prepared from <Example 2>, 100 µl of mouse blood diluted at a ratio of 1/10 4 was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 1 hour, and washed 3 times with PBS/T solution. Afterwards, goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) to which the mustard beet peroxidase (HRP) enzyme is linked was dispensed into each well, reacted at 37°C for 1 hour, and then washed in the same manner. I did. Then, 100 µl of a TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) solution, which is a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm color development. Then, 100 μl of a 0.5 NH 2 SO 4 solution, which is a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction.
혈액 내에 존재하는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 항체의 역가('지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성)에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단되어 최종적으로 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 Adjuvant 없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(Booster injection)을 수행하였다.Absorbance at 450 nm using a microplate reader to quantify the titer of the antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' present in the blood (reactivity to the'Zika virus envelope protein domain III'). Was measured. As a result of the measurement, it was judged that the immunization was successful, and finally 30 µg of'Zika virus envelope protein domain III' was diluted in a PBS solution, and a booster injection was performed to maximize the immune response without a separate Adjuvant.
<< 실시예Example 4> 4>
세포융합을 통한 Through cell fusion 하이브리도마Hybridoma (( HybridomaHybridoma ) 세포주 제작) Cell line production
세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(K
<< 실시예Example 5> 5>
고반응성Highly reactive 하이브리도마Hybridoma 세포주의 선별 Selection of cell lines
상기 <실시예 4>를 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 <실시예 4>와 같은 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내에 존재하는 각각의 웰(well)에 존재하는 배지를 취하여 상기 <실시예 2>에서 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 <실시예 3>과 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.After culturing the fused cells through the above <Example 4> for 7 days or more, confirming that the fused cells form colonies and grow through the naked eye or a microscope, and then each well of a 96-well plate Existing HAT medium in the (well) was replaced and cultured for an additional 3 days under the same conditions as in <Example 4>. Thereafter, using the plate for enzyme immunosorbent test prepared in <Example 2> by taking the medium present in each well existing in the 96-well cell culture plate <Example 3> Indirect ELISA was performed in the same manner as described above.
그 결과 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'와 높은 반응성을 보이는 웰(well)에 존재하는 하이브리도마를 선별하였으며, 추가적으로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성을 같은 방법으로 확인하였다. 생존능을 상실했거나 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마를 제외한 후, '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주들은 단일클론의 하이브리도마 세포주를 얻기 위해 서브-클로닝(Sub-cloning) 및 클로닝(Cloning) 과정을 진행하였다. As a result, hybridomas present in wells exhibiting high reactivity with'Zika virus envelope protein domain III' were selected, and additionally, 24-well plates and 6-well plates ), the viability and reactivity to the'Zika virus envelope protein domain III' were confirmed by the same method. Hybridoma cell lines showing high reactivity to the'Zika virus envelope protein domain III' were selected after excluding hybridomas that had lost viability or had no reactivity to the'Zika virus envelope protein domain III'. The selected hybridoma cell lines were subjected to sub-cloning and cloning processes to obtain monoclonal hybridoma cell lines.
<< 실시예Example 6> 6>
단일클론항체Monoclonal antibody (Monoclonal antibody)의 생산, 분리/정제 및 확인(Monoclonal antibody) production, separation/purification and identification
선별된 단일클론의 하이브리도마 세포주로부터 다량의 단일클론항체를 얻기 위해 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하여 복수(Ascites)가 생성되도록 유도하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체의 획득이 가능하다. 상기 마우스로부터 획득한 복수에 존재하는 불순물 제거 및 혈청(Serum)의 분리를 위해 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행한 후 주사기 필터를 통해 필터링을 수행하였다. In order to obtain a large amount of monoclonal antibodies from the selected monoclonal hybridoma cell line, the hybridoma cell line was injected into the intraperitoneal cavity of the mouse to induce the generation of ascites. This is only performed in this example to obtain a monoclonal antibody, and it is possible to obtain a monoclonal antibody through in vitro cell culture. In order to remove impurities present in the ascites obtained from the mouse and to separate serum, centrifugation was performed at 3,000 rpm for 10 minutes, and then filtering was performed through a syringe filter.
상기의 과정으로부터 준비된 혈청에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 분리/정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH2PO4 (pH 7.4) 용액으로 평형화 되어 있는 아가로즈(agarose)-Protein G 레진(resin)이 충진(packing)되어 있는 컬럼(column)에 흘려주었다. 혈청을 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH2PO4 (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비율(Volume ratio)이 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 수행하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 '도 2'에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>과 같은 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마시 블루 염색을 통해 고순도의 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 확인하였다. Agar equilibrated with 20 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4) solution to selectively separate/purify only immunoglobulin G (Immunoglobulin G, IgG), which is a monoclonal antibody contained in the serum prepared from the above process. Rose (agarose)-Protein G resin (resin) was poured into a column (packing) filled (column). After all the serum was spilled, 20 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4) was used to remove impurities other than non-specifically bound or intercalated monoclonal antibodies. After that, a 0.1 M Glycine (pH 2.8) solution was poured to elute a monoclonal antibody against the'Flavivirus Envelope Protein Domain III' bound to Protein G. As soon as it was eluted, 1 M Tris for pH neutralization. -HCl (pH 7.4) solution was mixed so as to have a volume ratio of about 1/3 to 1/5 of the eluate. Thereafter, dialysis was performed twice at 4° C. for 16 hours or longer using a PBS solution to exchange the buffer (solution) of the monoclonal antibody eluate. The dialysis-completed monoclonal antibody was quantified by removing aggregates through a syringe filter, and then measuring absorbance at 280 nm. Thereafter, as shown in'Fig. 2', polyacrylamide gel electrophoresis was performed under the same conditions as in <Example 1> to obtain a high-purity monoclonal antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' through Coomassie blue staining. Confirmed.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리/정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.As a result, as shown in FIG. 2, since only the heavy and light chains of the antibody could be observed at the 50 kDa site and the 25 kDa site, it was judged that the isolation/purification of monoclonal antibodies was done well. I did.
<< 실시예Example 7> 7>
단일클론항체의Of monoclonal antibodies 이소타입Isotype (( IsotypeIsotype ) 확인 및 ) OK and 해리상수Dissociation constant (Dissociation constant, K(Dissociation constant, K DD ) 측정) Measure
상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소(Goat)의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 <실시예 6>으로부터 준비된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.To confirm the isotype of a monoclonal antibody against the purely isolated/purified'flavivirus envelope protein domain III' from <Example 6>, mouse IgA, IgG 1 , IgG 2a , IgG 2b , IgG 3 , IgM Goat antibodies that specifically bind to each of the cells were diluted with PBS (pH 7.4) to a concentration of 1 µg/ml, and then 100 µl was dispensed into the plate for enzyme immunosorbent test, and then 37°C. Reacted for 1 hour. Then, each well was washed three times using a 0.1% PBS/T solution. Next, for blocking, 200 µl of PBS/T solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) was dispensed into each well and reacted at 37° C. for 1 hour, followed by PBS/ It was washed in the same way using T solution. Then, 100 μl of the monoclonal antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' prepared in Example 6 was dispensed and reacted at 37° C. for 1 hour, and 0.1% PBS/T solution was used after the reaction. Each well was washed three times. Then, goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) to which HRP enzyme was linked was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 30 minutes, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of a TMB solution, which is a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm color development. Then, 100 µl of a 0.5 NH 2 SO 4 solution, a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. For quantification of each isotype reactivity, absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.
그 결과는 도 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 단일클론항체의 이소타입은 IgG1임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the isotype of the isolated/purified monoclonal antibody from <Example 6> was IgG 1.
한편, 상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, KD) 또는 결합친화도(Binding affinity)를 측정하기 위해 상기 <실시예 2>로부터 제조된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'가 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 100 나노몰(nM)의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, '뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ' 및 '웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 2,000 나노몰(nM) (=2 마이크로몰(μM))의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Meanwhile, in order to measure the dissociation constant (K D ) or binding affinity of the monoclonal antibody against the purely isolated/purified'flavivirus envelope protein domain III' from <Example 6> An enzyme immunosorbent test plate coated with the'flavivirus envelope protein domain III' prepared in Example 2 was prepared. For the'Zika virus envelope protein domain III', the monoclonal antibody was serially diluted 1/2 with a PBS solution from a molar concentration of 100 nanomolar (nM) for a total of 16 types including 0 nM. Different concentrations of monoclonal antibodies were prepared, and for'Dengue virus envelope protein domain III'and'West Nile virus envelope protein domain III', a molar concentration of 2,000 nanomolar (nM) (=2 micromolar (μM)) ( Molar concentration) was serially diluted by 1/2 using PBS solution to prepare a total of 16 different concentrations of monoclonal antibodies including 0 nM, and 100 µl of these were dispensed into each well, and then 37°C. Reacted for 1 hour. After the reaction was over, each well was washed three times using a 0.1% PBS/T solution. Then, HRP-linked goat anti-mouse IgG was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 1 hour, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of a TMB solution, a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm a color development reaction. Then, 100 µl of a 0.5 NH 2 SO 4 solution, which is a reaction termination solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader to quantify the reactivity to each different concentration of monoclonal antibodies.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체의 해리상수는 '지카 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (0.151±0.001) 나노몰(nM), '뎅기 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'에 대해서는 (19.410±1.977) 나노몰(nM), '웨스트 나일 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅲ'의 대해서는 (8.525±0.468) 나노몰(nM) 임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 4, the dissociation constant of the monoclonal antibody against the'flavivirus envelope protein domain III' isolated/purified from the <Example 6> was (0.151) for the'Zika virus envelope protein domain III'. ±0.001) nanomolar (nM), (19.410±1.977) nanomolar (nM) for'Dengue virus envelope protein domain III', (8.525±0.468) nanomolar (nM) for'West Nile virus envelope protein domain III' ).
<< 실시예Example 8> 다른 속(Genus)의 모기 매개 바이러스 외피 단백질과의 교차반응 확인 8> Confirmation of cross-reaction with mosquito-mediated virus envelope proteins of other genus
상기 <실시예 6>을 통해 분리/정제된 단일클론항체가 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(또는 반응)하면서, 플라비바이러스와 같은 숙주(Host)인 각다귀 속(Aedes genus)의 모기를 이용하는 알파바이러스(Alphavirus)의 외피 단백질에는 결합(또는 반응)하지 않는지 확인하기 위해 상기 <실시예 2>의 과정과 같은 방법으로 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하였다. 상기 <실시예 6>을 통해 분리/정제된 '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 플라비바이러스에 속하는 '지카 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 뎅기 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ, 웨스트 나일 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ 및 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ가 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 참고로, 알파바이러스의 경우 알파바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ가 외피 단백질 Ⅲ의 역할을 한다고 알려져 있어, 본 실험에서는 알파바이러스에 속하는 치쿤군야 바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅱ를 사용하였다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H2SO4 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. The monoclonal antibody isolated/purified through the above <Example 6> specifically binds (or reacts) only to the'Flavivirus envelope protein domain III', and the genus Aedes, which is the same host as the flavivirus. genus) was used for an enzyme immunosorbent test prepared in the same manner as in Example 2 to confirm that it did not bind (or react) to the envelope protein of Alphavirus using mosquitoes. The'Zika virus envelope protein domain III, dengue virus' belonging to the flavivirus by 100 µl of the monoclonal antibody against the'Flavivirus Envelope Protein Domain III' isolated/purified through the above <Example 6> at a concentration of 100 nM The coat protein domain III, the West Nile virus coat protein domain III, and the chikungunya virus coat protein domain II belonging to the alpha virus were respectively coated on plates, and reacted at 37° C. for 1 hour. For reference, in the case of an alpha virus, it is known that the alpha virus envelope protein domain II plays the role of the envelope protein III, so in this experiment, the chikungunya virus envelope protein domain II belonging to the alpha virus was used. After the reaction was over, each well was washed three times using a 0.1% PBS/T solution. Then, HRP-linked goat anti-mouse IgG was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 1 hour, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of a TMB solution, a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm a color development reaction. Then, 100 µl of a 0.5 NH 2 SO 4 solution, a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. To quantify the reactivity of monoclonal antibodies against different proteins, absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리/정제된 단일클론항체가 다른 바이러스의 외피 단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, the monoclonal antibody isolated/purified from the <Example 6> did not bind (react) with the coat protein of another virus, and is specific only to the'Flavivirus coat protein domain III'. It was confirmed that the binding (reaction) was performed.
상기 하이브리도마 세포주를 'Hybridoma JZE3-1'로 명명하였으며, 'Hybridoma JZE3-1'로부터 생산된 단일클론항체는 해리상수가 0.1 내지 100 나노몰(nM) 범위로 결합친화도가 매우 높고, 다른 모기 매개 바이러스의 외피 단백질에는 결합하지 않는 동시에 플라비바이러스의 외피 단백질 도메인 III에만 결합하는 단일클론항체로 특정지었다. 따라서 본 발명자들은 'Hybridoma JZE3-1' 세포주의 추가적인 배양 후에 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2019년 7월 5일자로 세포기탁을 진행하였으며, 기탁기관으로부터 2019년 7월 11일자 기탁번호 KCTC18776P를 부여받았다.The hybridoma cell line was named'Hybridoma JZE3-1', and the monoclonal antibody produced from'Hybridoma JZE3-1' has a very high binding affinity with a dissociation constant in the range of 0.1 to 100 nanomolar (nM), and other It was characterized as a monoclonal antibody that does not bind to the coat protein of the mosquito-borne virus, but at the same time only binds to the coat protein domain III of the flavivirus. Therefore, the present inventors proceeded to deposit cells in the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) on July 5, 2019 after additional cultivation of the'Hybridoma JZE3-1' cell line. On July 11, it was assigned the deposit number KCTC18776P.
이제까지 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains so far will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative point of view rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the above description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain III of flaviviruses, hybridoma cell line producing the same and use thereof <130> NPDC-80117 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of Zika Virus Envelope Protein Domain III <400> 1 Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly 20 25 30 Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln 35 40 45 Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr 50 55 60 Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe 65 70 75 80 Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His 85 90 95 His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys 100 105 <210> 2 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of Dengue Virus Envelope Protein Domain III <400> 2 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile 1 5 10 15 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly 20 25 30 Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys 35 40 45 Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu 50 55 60 Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 65 70 75 80 Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 85 90 95 Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 100 <210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of West Nile Virus Envelope Protein Domain III <400> 3 Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe 1 5 10 15 Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu 20 25 30 Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn 50 55 60 Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln 85 90 95 Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile 100 105 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain III of flaviviruses, hybridoma cell line producing the same and use thereof <130> NPDC-80117 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of Zika Virus Envelope Protein Domain III <400> 1 Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro 1 5 10 15 Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly 20 25 30 Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln 35 40 45 Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr 50 55 60 Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe 65 70 75 80 Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His 85 90 95 His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys 100 105 <210> 2 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of Dengue Virus Envelope Protein Domain III <400> 2 Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile 1 5 10 15 Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly 20 25 30 Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys 35 40 45 Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu 50 55 60 Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser 65 70 75 80 Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe 85 90 95 Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 100 <210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide sequence of West Nile Virus Envelope Protein Domain III <400> 3 Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe 1 5 10 15 Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu 20 25 30 Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn 50 55 60 Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu 65 70 75 80 Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln 85 90 95 Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser Ile 100 105
Claims (13)
상기 단일클론항체는 IgG1 이소타입인 것을 특징으로 하는 단일클론항체. The method of claim 1,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody, characterized in that the IgG 1 isotype.
상기 단일클론항체는 0.1 내지 100 나노몰(nM)의 해리상수로 플라비바이러스 외피 단백질 도메인 Ⅲ에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체. The method of claim 1,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody, characterized in that it binds to the flavivirus envelope protein domain III with a dissociation constant of 0.1 to 100 nanomolar (nM).
상기 키트는 제1항의 단일클론항체 이외에 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.The method of claim 6,
The kit includes an antibody condensed with a label in addition to the monoclonal antibody of claim 1; And kit, characterized in that it further comprises a color substrate.
상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nantube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.The method of claim 7,
The markers are mustard radish peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase, AP), glucose oxidase, luciferase, beta-di-galactosidase ( β-D-galactosidase), malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase, colloidal gold, metal nanoparticle, silica nanoparticle, organic Organic fluorescent material, fluorescent protein, quantum dot, radioactive material, radioactive isotope, dye, carbon nanotube, graphene Kit, characterized in that selected from the group consisting of (Graphene) and fullerene (Fullerene).
상기 발색기질은 DAB (diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.The method of claim 7,
The chromogenic substrates are DAB (diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4 -chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS (2,2'-azino- A kit, characterized in that it is selected from the group consisting of bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD (o-phenylenediamine).
상기 시료에 제1항의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.Preparing a sample isolated from a subject suspected of being infected with flavivirus;
Applying the monoclonal antibody of claim 1 to the sample; And
A method of providing information necessary for diagnosis of flavivirus infection, comprising the step of measuring an antigen-antibody response.
상기 분리된 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.The method of claim 11,
The separated sample is a method selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, cells, cell lysates, body fluids, saliva, cerebrospinal fluid, and urine.
상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 11,
The antigen-antibody reaction was performed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, and immune dot blot analysis. (Immunodot blot assay), Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (LFA) ), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay and macroscopic measurement The method characterized in that the measurement by a method selected from the group consisting of (Visual assessment).
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Emerging Microbes & Infections (2017) 6, e89* |
| Vaccine. 2017 July 24, 35(33) 4287-4294 |
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