KR102202082B1

KR102202082B1 - Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain Ⅱ of chikungunya virus, hybridoma cell line producing the same and use thereof

Info

Publication number: KR102202082B1
Application number: KR1020190118179A
Authority: KR
Inventors: 최재원; 김학용; 엄효지; 조병관
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-01-11

Abstract

The present invention relates to a monoclonal antibody specifically coupled to capsid protein domain II of a Chikungunya virus; a hybridoma cell line for producing the monoclonal antibody; a composition for detecting a Chikungunya virus or diagnosing a Chikungunya virus infectious disease, the composition comprising the monoclonal antibody; a diagnosis kit for detecting a Chikungunya virus or diagnosing a Chikungunya virus infectious disease, the diagnosis kit comprising the monoclonal antibody; a method for detecting a Chikungunya virus by using the monoclonal antibody; and a method for diagnosing infection of a Chikungunya virus. A monoclonal antibody produced from a hybridoma cell according to the present invention has high coupling affinity specifically only to capsid protein domain II of a Chikungunya virus. However, the monoclonal antibody does not simultaneously react with another protein, and thus the monoclonal antibody can be useful to detect a Chikungunya virus or diagnose a Chikungunya virus infectious disease. In addition, by using the properties, the monoclonal antibody produced from a hybridoma cell according to the present invention can also be useful to observe a treatment prognosis of a Chikungunya virus infectious disease, to detect a Chikungunya virus or capsid protein domain II of a Chikungunya virus, and to develop techniques related to quantitative analysis or the like.

Description

Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain Ⅱ of chikungunya virus, hybridoma cell line producing the same and use thereof}

본 발명은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용하여 치쿤군야 바이러스를 검출하는 방법 및 치쿤군야 바이러스의 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to the'Chikungunya virus envelope protein domain II'; A hybridoma cell line that produces the monoclonal antibody; A composition for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection containing the monoclonal antibody; A kit for detection of chikungunya virus containing the monoclonal antibody or for diagnosis of chikungunya virus infection; It relates to a method for detecting chikungunya virus using the monoclonal antibody and a method for diagnosing infection with chikungunya virus.

치쿤군야(Chikungunya) 또는 치쿤군야열(Chikungunya fever)은 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus)에 감염된 모기(Mosquito)에게 물림으로 인해 걸리는 열성 감염병을 의미한다. 이 질병은 1952년 탄자니아(Tanzania)에서 처음 확인되었으며, 1953년에 치쿤군야 바이러스가 처음 분리되었다. '치쿤군야'는 탄자니아의 동남부 지역과 모잠비크(Mozambique)의 북부 지역에 거주하던 원주민들이 사용하는 마콘데 언어(Makonde language)로 '왜곡되다(To become contorted)'를 의미하는 단어로부터 유래되었다(Matusali G. et al., Viruses (2019), Vol. 11, pp. E175., Schwartz O. & Albert M. L., Nat. Rev. Microbiol . (2010), Vol. 8, pp. 491-500.). Chikungunya or Chikungunya fever refers to a febrile infectious disease caused by the bite of a mosquito infected with Chikungunya virus. The disease was first identified in Tanzania in 1952, and the chikungunya virus was first isolated in 1953. 'Chikungunya' is a Maconde language used by indigenous peoples living in southeastern Tanzania and northern Mozambique, and is derived from the word meaning'to become contorted' (Matusali). G. et al ., Viruses (2019), Vol. 11, pp. E175., Schwartz O. & Albert ML, Nat. Rev. Microbiol . (2010), Vol. 8, pp. 491-500.).

치쿤군야 바이러스는 토가비리대과(Togaviridae family)의 하위 분류인 알파바이러스속(Alphavirus genus)에 해당하는 바이러스로, 양성의 단일가닥 RNA 바이러스(Positive-sense single stranded RNA virus, (+)ssRNA virus)이며 약 11-12 킬로베이스(Kilobase, kb) 길이의 유전체를 가지고 있다. 치쿤군야 바이러스의 여러 단백질을 암호화하는 RNA 유전체를 정이십면체형의(Icosahedral) 캡시드단백질(Capsid protein, C)이 둘러싸고 있으며 이 캡시드단백질을 다시 막(Membrane)과 외피단백질(Envelope protein, E)이 둘러싸고 있다. 따라서 전자현미경 상에서는 구형(Spherical)으로 관찰되며 직경(Diameter)은 약 60-70 nm인 것으로 알려져 있다 (da Silva-Junior E. F. et al., Bioorg . Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244., 스위스 생물정보학 연구소 ExPASy(ViralZone) 웹사이트 (URL - https://viralzone.expasy.org/625?outline=all_by_species)).Chikungunya virus is a virus corresponding to the Alphavirus genus, a subclass of the Togaviridae family, and is a positive-sense single stranded RNA virus (+)ssRNA virus. It has a genome of about 11-12 kilobases (kb) in length. The RNA genome encoding various proteins of the chikungunya virus is surrounded by an icosahedral capsid protein (C), and the capsid protein is again surrounded by a membrane (membrane) and envelope protein (E). have. Therefore, it is observed as spherical on an electron microscope, and the diameter is known to be about 60-70 nm (da Silva-Junior EF et al ., Bioorg . Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244., Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy (ViralZone) website (URL-https://viralzone.expasy.org/625?outline=all_by_species)).

치쿤군야 바이러스의 유전체는 여러 종류의 비구조단백질(Non-structural proteins)과 구조단백질(Structural proteins)을 암호화하고 있으며, 비구조단백질은 비구조단백질 1(Non-structural protein 1, nsP1), 비구조단백질 2(nsP2), 비구조단백질 3(nsP3) 및 비구조단백질 4(nsP4)와 같이 4가지 단백질로 분류할 수 있다. 최근의 연구결과들에 의하면 비구조단백질 1은 mRNA Capping의 기능, 비구조단백질 2는 Helicase 및 Protease의 기능, 비구조단백질 3은 Replicase의 기능, 비구조단백질 4는 RNA dependent RNA polymerase(RdRP)의 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(Abu Bakar F. & Ng L. F. P., Viruses (2018), Vol. 10, pp. E71., Burt F. J. et al., Lancet Infect. Dis . (2017), Vol. 17, pp. e107-e117., Seyedi S. S. et al., Sci . Rep. (2016), Vol. 6, pp. 24027., 스위스 생물정보학 연구소 ExPASy(ViralZone) 웹사이트 (URL - https://viralzone.expasy.org/625?outline=all_by_species)).The genome of Chikungunya virus encodes several types of non-structural proteins and structural proteins, and non-structural proteins are non-structural protein 1 (nsP1), non-structural protein 2 (nsP2). ), non-structural protein 3 (nsP3), and non-structural protein 4 (nsP4). According to recent research results, non-structural protein 1 performs the function of mRNA capping, non-structural protein 2 functions as Helicase and Protease, non-structural protein 3 functions as Replicase, and non-structural protein 4 functions as RNA dependent RNA polymerase (RdRP). (Abu Bakar F. & Ng LFP, Viruses (2018), Vol. 10, pp. E71., Burt FJ et al ., Lancet Infect. Dis . (2017), Vol. 17, pp. e107-e117 ., Seyedi SS et al ., Sci . Rep. (2016), Vol. 6, pp. 24027., Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy (ViralZone) website (URL-https://viralzone.expasy.org/625? outline=all_by_species)).

구조단백질은 캡시드단백질(Capsid protein, CP)과 외피단백질(Envelope protein, E)로 나눌 수 있으며, 외피단백질은 2가지 주요 단백질(Major proteins)인 E1과 E2, 2가지 보조 펩타이드(Accessories peptides)인 E3와 6K로 다시 세분화 할 수 있다. E1과 E2의 경우 바이러스 입자의 표면을 구성하는 단백질인 동시에, 바이러스 감염 시 숙주 세포와 결합할 수 있는 도메인을 보유하고 있기 때문에 감염에 중추적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. E3와 6K의 경우 아직까지 기능이 명확하게 규명되지는 않았지만, 바이러스의 조립(Assembly)이나 다른 단백질에 대한 신호 펩타이드(Signal peptide)로 일부 관여하는 것으로 생각되고 있다(Abu Bakar F. & Ng L. F. P., Viruses (2018), Vol. 10, pp. E71., da Silva-Junior E. F. et al., Bioorg . Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244., Melton J. V. et al., J. Biol . Chem . (2002), Vol. 277, pp. 46923-46931., Tsetsarkin K. A., et al., PLoS Pathog . (2007), Vol. 3, pp. e201.).Structural proteins can be divided into capsid protein (CP) and envelope protein (E), and the envelope protein is the two major proteins, E1 and E2, and two accessory peptides. It can be further subdivided into E3 and 6K. E1 and E2 are proteins that make up the surface of viral particles, and at the same time, they are known to play a pivotal function in infection because they have domains capable of binding to host cells during viral infection. In the case of E3 and 6K, the function has not been clearly identified yet, but it is thought to be partially involved as a viral assembly or signal peptide for other proteins (Abu Bakar F. & Ng LFP, Viruses (2018), Vol. 10, pp. E71., da Silva-Junior EF et al ., Bioorg . Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244., Melton JV et al ., J. Biol . Chem . (2002), Vol. 277, pp. 46923-46931., Tsetsarkin KA, et al ., PLoS Pathog . (2007), Vol. 3, pp. e201.).

치쿤군야 바이러스의 감염 증상은 감염으로부터 약 2일~12일의 잠복기를 거친 후에 나타나는 것으로 알려져 있으며, 40℃에 가까운 고열과 심한 근육통, 두통 및 관절통이 나타나기도 한다. 또한 팔, 다리나 목 주변에서 땀띠와 유사한 발진이 일어나고 피로, 오심 및 구토 등의 증상을 보이는 것으로 알려져 있다. 특히 뎅기 바이러스(Dengue virus)가 유발하는 뎅기열(Dengue fever)과 임상 증상이 매우 유사하여 구분이 어렵다는 특징이 있으며, 치쿤군야 바이러스의 감염으로 인한 사망률은 1%로 비교적 낮은 편이지만 감염에 의한 증상은 길게 1년까지 지속될 수 있다는 점에서 주의가 요구된다(Burt F. J. et al., Lancet Infect. Dis. (2017), Vol. 17, pp. e107-e117., Matusali G. et al., Viruses (2019), Vol. 11, pp. E175., 전병학 외, 주간 건강과 질병 (2019), 제12권 제13호, pp. 372-378.). 또한 치쿤군야 바이러스의 감염은 길랭-바레증후군(Guillain-Barre syndrome)과 같은 신경학적 질병이나 간염과 같은 중증 합병증을 일으킬 수 있어 경계되고 있다(Keesen T. S. L. et al., Lancet Infect. Dis . (2017), Vol. 17, pp. 693-694., Lima M. E. S. et al., Acta Trop. (2019), Vol. 197, pp. 105064., Schwartz O. & Albert M. L., Nat. Rev. Microbiol. (2010), Vol. 8, pp. 491-500.). 현재까지 치쿤군야 바이러스 감염증을 치료하기 위한 별도의 치료제는 없으며, 환자의 증상에 따라 수액 요법을 통한 일반적인 요법을 시행하여 치료하고 있다.Chikungunya virus infection symptoms are known to appear after an incubation period of about 2 to 12 days from the infection, and high fever near 40℃, severe muscle pain, headache and joint pain may also appear. In addition, it is known that a rash similar to a heat rash occurs around the arms, legs or neck, and symptoms such as fatigue, nausea and vomiting are known. In particular, the clinical symptoms are very similar to dengue fever caused by the dengue virus, so it is difficult to distinguish. The mortality rate due to infection with the chikungunya virus is relatively low at 1%, but the symptoms caused by the infection are relatively low. Caution is required in that it can last as long as one year (Burt FJ et al ., Lancet Infect. Dis. (2017), Vol. 17, pp. e107-e117., Matusali G. et al ., Viruses (2019) ), Vol. 11, pp. E175., Byunghak Jeon et al., Day Health and Disease (2019), Vol. 12, No. 13, pp. 372-378.). In addition, Chikungunya virus infection is on the alert because it can cause neurological diseases such as Guillain-Barre syndrome or serious complications such as hepatitis (Keesen TSL et al ., Lancet Infect. Dis . (2017) , Vol. 17, pp. 693-694., Lima MES et al ., Acta Trop. (2019), Vol. 197, pp. 105064., Schwartz O. & Albert ML, Nat. Rev. Microbiol. (2010) , Vol. 8, pp. 491-500.). Until now, there is no separate treatment for the treatment of chikungunya virus infection, and according to the patient's symptoms, general therapy is performed through fluid therapy.

치쿤군야 바이러스에 감염되지 않는 것이 가장 이상적이겠지만, 치쿤군야 바이러스는 전 세계적으로 지난 50년 동안 약 2년에서 20년의 불규칙한 간격을 두고 지속적으로 대발생(Outbreaks)을 유발해왔다(Schwartz O. & Albert M. L., Nat. Rev. Microbiol . (2010), Vol. 8, pp. 491-500.). 더욱이 최근 지구의 기후변화로 인한 아열대지역이나 온대지역이 확대됨에 따라, 치쿤군야 바이러스의 주요 숙주(Host)인 이집트 숲모기(Ae. aegypti)나 흰줄 숲모기(Ae. albopictus)의 서식지가 확대되고 있는 상황이다(Monterio V. V. S. et al., Front. Microbiol. (2019), Vol. 10, pp. 492., Natrajan M. S. et al., J. Clin . Microbiol. (2019), Vol. 57. pp. e00350-19). 실제로 치쿤군야 바이러스 뿐만 아니라 모기가 매개하는 바이러스에 의한 사람의 사망 건수가 100만 건 이상 매년 보고되고 있다(da Silva-Junior E. F. et al., Bioorg. Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244.). 모기의 분포로 미루어 보면 잠재적으로 전 세계 인구의 50%에 가까운 인구가 치쿤군야 바이러스의 위험에 노출되어 있다고 추측해 볼 수 있으며, 이런 상황으로 볼 때 향후 치쿤군야 바이러스 감염으로 인한 대공황의 발생빈도와 규모가 더욱 늘어날 것으로 예상되고 있다. 또한 치쿤군야 바이러스에 감염될 경우 최대 1년까지 증상이 지속될 수 있기 때문에, 치쿤군야 바이러스 감염증의 조기진단을 통한 신속한 치료 및 대응에 대한 중요성이 더욱 높아질 것으로 전망된다.Ideally, it would be best not to be infected with the chikungunya virus, but the chikungunya virus has caused consistent outbreaks worldwide over the past 50 years at irregular intervals of about 2 to 20 years (Schwartz O. & Albert) ML, Nat. Rev. Microbiol . (2010), Vol. 8, pp. 491-500.). Moreover, as the subtropical or temperate regions due to global climate change have recently expanded, the habitats of the Egyptian forest mosquito ( Ae. aegypti ) and the white line forest mosquito ( Ae. albopictus ), which are the main hosts of the chikungunya virus, are expanding. a situation (Monterio VVS et al., Front . Microbiol. (2019), Vol. 10, pp. 492., Natrajan MS et al., J. Clin. Microbiol. (2019), Vol. 57. pp. e00350- 19). In fact, more than 1 million human deaths have been reported annually by not only chikungunya virus but also mosquito-mediated virus (da Silva-Junior EF et al ., Bioorg. Med . Chem . (2017), Vol. 25, pp. 4219-4244.). Based on the distribution of mosquitoes, it can be estimated that the population of potentially close to 50% of the world's population is at risk of the chikungunya virus. The scale is expected to increase further. In addition, since symptoms can persist for up to one year when infected with chikungunya virus, the importance of prompt treatment and response through early diagnosis of chikungunya virus infection is expected to increase further.

치쿤군야 바이러스의 검출기술 및 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단기술은 크게 1) 항원-항체 반응을 이용하는 면역진단법(Immunodiagnostics), 2) 바이러스의 핵산(유전자)을 검출하는 분자진단법(Molecular diagnostics), 3) 직접적인 바이러스 배양법(Virus cultivation)과 같이 3가지로 분류할 수 있다. 이 중에서도 면역분석법은 '항체'를 보유하고 있다면, 분자진단법이나 바이러스 배양법에 비해 바이러스 분석방법이 비교적 간단하고 분석에 소요되는 시간이 매우 짧기 때문에 신속한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 면역분석법은 검출하고자하는 물질의 종류에 따라 혈청학적(또는 항체) 검출법(Serological (or antibody) detection) 및 항원 검출법(Antigen detection)으로 다시 세분화 할 수 있다(Johnson B. W. et al., J. Infect. Dis . (2016), Vol. 214, pp. S471-S474., 미국 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 웹사이트 (URL - https://www.cdc.gov/chikungunya/hc/clinicalevaluation.html)).Chikungunya virus detection technology and Chikungunya virus infection diagnosis technology are largely 1) Immunodiagnostics using antigen-antibody reactions, 2) Molecular diagnostics detecting nucleic acids (genes) of viruses, 3) It can be classified into three categories as in direct virus cultivation. Among them, if the immunoassay method has an'antibody', it has the advantage of being able to detect quickly because the virus analysis method is relatively simple and the time required for analysis is very short compared to the molecular diagnosis method or virus culture method. Immunoassay can be further subdivided into serological (or antibody) detection and antigen detection according to the type of substance to be detected (Johnson BW et al ., J. Infect. Dis . (2016), Vol. 214, pp. S471-S474., US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) website (URL-https://www.cdc.gov/chikungunya/hc/clinicalevaluation.html) ).

치쿤군야 바이러스의 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM이나 IgG와 같은 이뮤노글로불린(Immunoglobulin)을 검출하는 혈청학적 검출법은 여러 국가들의 질병을 관리하고 통제하는 국가 기관에서 권장하고 있는 시험법이기 때문에 널리 이용되고는 있지만, 다른 바이러스와 구별하여 검출 또는 진단하거나 위양성(False-positive) 반응에 있어 궁극적으로 한계점을 가진다. IgM의 경우 치쿤군야 바이러스 감염 즉시 생성되는 것이 아니라 수 일에 걸쳐 생성되기 때문에 조기 진단이 어렵다는 단점이 있다. IgG의 경우에는 IgM보다 생성되는데 시간이 더 오래 걸리며 최초 감염이 아닌 경우 수 개월에서 수 년전의 감염으로 인해 체내에 생성된 항체일 수 있어 위양성(False-positive)의 결과를 초래할 수 있다. 또 다른 문제점은 치쿤군야 바이러스 감염으로 인해 체내에 생성된 IgM과 IgG 모두 단일클론항체(Monoclonal antibody)가 아닌 다클론항체(Polyclonal antibody)이기 때문에, 치쿤군야 바이러스와 구조가 유사한 다른 종류의 바이러스의 감염에 의해 위양성의 결과를 초래할 수 있다는 점이다. 따라서 치쿤군야 바이러스를 구성하는 특정 단백질을 바이오마커나 타겟(목표물질)으로 정하여, 오직 치쿤군야 바이러스의 단백질과 결합할 수 있는 단일클론항체를 이용한 항원 검출법이 치쿤군야 바이러스의 검출 및 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단에 유리하다고 할 수 있다.The serological detection method that detects immunoglobulins such as IgM or IgG produced in the body due to infection with the chikungunya virus is widely used because it is a test method recommended by national institutions that manage and control diseases in various countries. However, it has a limitation in detection, diagnosis, or false-positive reaction by distinguishing it from other viruses. In the case of IgM, it is not produced immediately after infection with the chikungunya virus, but is produced over several days, so it is difficult to diagnose early. In the case of IgG, it takes longer to produce than IgM, and if it is not the first infection, it may be an antibody generated in the body due to infection from several months to years ago, resulting in a false-positive result. Another problem is that because both IgM and IgG generated in the body due to infection with Chikungunya virus are polyclonal antibodies, not monoclonal antibodies, infection with other types of viruses similar in structure to Chikungunya virus. It can lead to false-positive results. Therefore, an antigen detection method using a monoclonal antibody that can only bind to a protein of Chikungunya virus by selecting a specific protein constituting Chikungunya virus as a biomarker or target (target substance) is the detection of Chikungunya virus and Chikungunya virus infection. It can be said that it is advantageous for the diagnosis of

한편, 치쿤군야 바이러스의 검출 및 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단도 중요하지만, 지카 바이러스(Zika virus)나 뎅기 바이러스(Dengue virus)와 같은 다른 종류의 바이러스와 구별하여 검출하거나 이와 관련된 감염증을 구별하여 진단하는 것도 매우 중요한 상황이다. 치쿤군야 바이러스 감염에 의한 임상 증상이 지카 바이러스(Zika virus)나 뎅기 바이러스(Dengue virus)의 감염에 의한 임상 증상과 유사하기도 하고, 이들이 공통적으로 숲모기(Aedes mosquito)를 숙주로 이용하고 있기 때문에 각각의 바이러스를 혈청학적인 검출을 통해 구별하거나 진단하는 것은 어려운 상황이다. 따라서 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 통한 동시 다중검출기술(Multiplexing)이 대부분이며, 각각의 바이러스를 구별하는 것은 별개의 기술이라고 볼 수 있다(Euliano E. M. et al., Sci . Rep. (2019), Vol. 9, pp. 11372., Lura T. et al., J. Vector Ecol . (2019), Vol. 44, pp. 205-209.). 치쿤군야 바이러스는 4가지의 생물안전등급 중에서 고위험군이 속하는 3등급(Biosafety level 3, BSL3)으로, 2등급인 뎅기 바이러스나 지카 바이러스보다 위험도가 높다(병원체 생물안전정보집, 질병관리본부 국립보건연구원 (2017)). 또한 뎅기 바이러스나 지카 바이러스보다 사망률은 낮지만, 감염될 경우 증상이 1년까지 장기적으로 지속될 수 있기 때문에 각별한 주의가 요구된다. 따라서 신속하면서도 특이적으로 치쿤군야 바이러스만을 검출하거나 치쿤군야 바이러스 감염증을 진단할 수 있는 기술의 개발이 중요한 상황이다.On the other hand, the detection of chikungunya virus and diagnosis of chikungunya virus infection is also important, but it is detected by distinguishing it from other types of viruses such as Zika virus or dengue virus, or by distinguishing and diagnosing related infectious diseases. It is also a very important situation. The clinical symptoms of Chikungunya virus infection are similar to those of Zika virus or Dengue virus infection, and because they commonly use Aedes mosquito as a host, each It is a difficult situation to distinguish or diagnose the virus by serological detection. Therefore, multiplexing techniques through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) are mostly used, and it can be seen that it is a separate technique to distinguish each virus (Euliano EM et al. ., Sci . Rep. (2019), Vol. 9, pp. 11372., Lura T. et al ., J. Vector Ecol . (2019), Vol. 44, pp. 205-209.). Chikungunya virus is a 3rd grade (Biosafety level 3, BSL3) to which the high-risk group belongs among the four biosafety levels, and has a higher risk than the 2nd grade dengue virus or Zika virus (Pathogen Biosafety Information Book, Korea Centers for Disease Control and Prevention, National Institute of Health). (2017)). In addition, the mortality rate is lower than that of the dengue virus or the Zika virus, but special care is required because the symptoms can last for a long time up to one year if infected. Therefore, it is an important situation to develop a technology that can detect only chikungunya virus or diagnose chikungunya virus infection quickly and specifically.

이에 본 발명자들은 별도의 치쿤군야 바이러스의 배양과정 없이 치쿤군야 바이러스의 검출이나 치쿤군야 바이러스 감염 진단을 위해, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 개발하였으며, 본 발명의 단일클론항체를 이용하는 경우 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ-단일클론항체 복합체(항원-항체 복합체)'에 대한 반응분석으로부터 짧게는 수 분의 시간 이내에, 길게는 수 시간 이내에 손쉽게 치쿤군야 바이러스 검출이나 치쿤군야 바이러스에 감염되었는지에 대한 진단이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have a monoclonal antibody that specifically binds to the'envelop protein domain II of the chikungunya virus' and the monoclonal antibody for detection of chikungunya virus or diagnosis of chikungunya virus infection without a separate chikungunya virus culture process. Hybridoma cell lines that produce antibodies were developed, and in the case of using the monoclonal antibody of the present invention, a short number from the analysis of the response to'envelope protein domain II of chikungunya virus-monoclonal antibody complex (antigen-antibody complex)' The present invention was completed by confirming that it is possible to easily detect chikungunya virus or diagnose whether or not infected with the chikungunya virus within minutes, as long as several hours.

대한민국 등록특허 제10-1589511호Korean Patent Registration No. 10-1589511 대한민국 등록특허 제10-1792684호Korean Patent Registration No. 10-1792684

따라서 본 발명의 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to the'envelop protein domain II of Chikungunya virus'.

본 발명의 다른 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that specifically binds to'Chikungunya virus envelope protein domain II'.

본 발명의 또 다른 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection comprising a monoclonal antibody that specifically binds to'chikungunya virus envelope protein domain II'.

본 발명의 또 다른 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection, comprising a monoclonal antibody specifically binding to'chikungunya virus envelope protein domain II'.

본 발명의 또 다른 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 치쿤군야 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for detecting a chikungunya virus by using a monoclonal antibody that specifically binds to the'envelop protein domain II of the chikungunya virus'.

본 발명의 또 다른 목적은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 치쿤군야 바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of providing information necessary for diagnosis of Chikungunya virus infection by using a monoclonal antibody that specifically binds to'Chikungunya virus envelope protein domain II'.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포에 의해 생산되고 치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a monoclonal antibody produced by hybridoma cells of accession number KCTC 13939BP and specifically binding to Chikungunya virus envelope protein domain II.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 IgG_2a 이소타입일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody may be of the IgG _2a isotype.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단일클론항체는 1.61×10^-10내지 1.61×10^-8 몰(M)의 해리상수로 치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ에 결합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody may bind to the envelope protein domain II of the chikungunya virus with a dissociation constant of 1.61×10 ^-10 to 1.61×10 ^-8 mol (M).

또한 본 발명은 치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a hybridoma cell of accession number KCTC 13939BP that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the chikungunya virus envelope protein domain II.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection, including the monoclonal antibody.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection including the monoclonal antibody.

또한 본 발명은 표지체와 축합된 상기 단일클론항체; 및 발색기질을 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is the monoclonal antibody condensed with a label; And it provides a kit for the detection of chikungunya virus containing a color substrate or for diagnosis of chikungunya virus infection.

또한 본 발명은 상기 단일클론항체; 상기 단일클론항체와 결합할 수 있는 표지체와 축합된 2차 항체; 및 발색기질을 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is the monoclonal antibody; A secondary antibody condensed with a label capable of binding to the monoclonal antibody; And it provides a kit for the detection of chikungunya virus containing a color substrate or for diagnosis of chikungunya virus infection.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the label is mustard beet peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase, AP), glucose oxidase, luciferase, Β-D-galactosidase, malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase, colloidal gold, metal nanoparticles, Silica nanoparticle, Organic fluorescent material, Fluorescent protein, Quantum dot, Radioactive material, Radioactive material, Isotope, Dye, Carbon It may be selected from the group consisting of carbon nanotube, graphene, and fullerene.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색기질은 DAB (Diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the color developing substrate is DAB (Diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD ( o- phenylenediamine) may be selected from the group consisting of.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 치쿤군야 바이러스의 존재를 확인하고자 하는 시료와 접촉시켜 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting a chikungunya virus, comprising the step of performing an antigen-antibody reaction by contacting the monoclonal antibody with a sample to confirm the presence of the chikungunya virus.

또한, 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 바이러스 감염증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of preparing a sample; Applying the monoclonal antibody of the present invention to the sample; And it provides a method for providing information necessary for diagnosis of Chikungunya virus infection, comprising the step of measuring the antigen-antibody response.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 치쿤군야 바이러스의 감염이 의심되는 대상의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직파쇄물, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sample is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, tissue lysate, cells, cell lysate, body fluid, saliva, cerebrospinal fluid, and urine of a subject suspected of being infected with Chikungunya virus. Can be.

본 발명의 일실시예예 있어서, 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay) 및 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the antigen-antibody reaction is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), a sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), and western blotting. (Western blotting), Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, lateral Lateral flow immunoassay (LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometer It can be measured by a method selected from the group consisting of an interferometric immunoassay and a visual assessment.

본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에만 특이적으로 높은 결합 친화도를 가지는 반면, 동시에 다른 단백질과는 반응하지 않기 때문에, 이러한 단일클론항체는 치쿤군야 바이러스 검출 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 특성을 이용하여 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체는 치쿤군야 바이러스 감염증의 치료 예후 관찰, 치쿤군야 바이러스 또는 치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ의 검출 및 정량적 분석 등과 관련된 기술의 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.The monoclonal antibody produced from the hybridoma cells of the present invention has a specific high binding affinity only for the'envelop protein domain II of the Chikungunya virus', but does not react with other proteins at the same time, so such a monoclonal antibody May be usefully used for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection. In addition, the monoclonal antibody produced from the hybridoma cells of the present invention using such characteristics is related to the observation of the treatment prognosis of chikungunya virus infection, detection of the envelope protein domain II of chikungunya virus or chikungunya virus, and quantitative analysis. It can also be usefully used for technology development.

도 1은 단일클론항체를 생산하기 위한 치쿤군야 바이러스의 항원(Antigen)에 해당하는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한 다음 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단백질을 염색한 결과 사진이다.
도 2는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주로부터 생성되어 순수 분리·정제된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행 한 다음, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 단일클론항체를 염색한 결과 사진이다.
도 3은 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체의 이소타입(Isotype)을 확인한 결과이다.
도 4는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, K_D)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주로부터 생성된 단일클론항체의 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 특이도(Specificity)를 확인하기 위해, 치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ, 지카 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅲ, 뎅기 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅲ 및 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)에 대한 상기 단일클론항체와의 반응성을 확인한 그래프이다.FIG. 1 is a polyacrylamide gel electrophoresis of'Chikkungunya virus envelope protein domain II' corresponding to the Chikungunya virus antigen (Antigen) for producing a monoclonal antibody, and then Coomassie blue (Coomassie). This is a picture of the result of staining protein using Blue) solution.
Figure 2 is a monoclonal antibody against the'Chikungunya virus envelope protein domain II' generated from a hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP and purified purely by electrophoresis using a polyacrylamide gel, and then, This is a photograph of the result of staining monoclonal antibody using Coomassie Blue solution.
FIG. 3 is a result of confirming the isotype of a monoclonal antibody against'Chikungunya virus envelope protein domain II' generated from a hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP.
FIG. 4 is a graph showing the dissociation constant (K _D ) of a monoclonal antibody against the'Chikungunya virus envelope protein domain II' generated from a hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP.
FIG. 5 is to confirm the specificity of the monoclonal antibody generated from the hybridoma cell line of the accession number KCTC 13939BP for the'envelope protein domain II of the chikungunya virus', the coat protein domain II of the chikungunya virus, It is a graph confirming the reactivity with the monoclonal antibody against envelope protein domain III of Zika virus, envelope protein domain III of dengue virus, and bovine serum albumin (BSA).

본 발명은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공함에 그 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a monoclonal antibody that specifically binds to the'envelope protein domain II of Chikungunya virus' and a hybridoma cell line that produces the monoclonal antibody.

본 발명에서 용어 '단일클론항체'란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프(Epitope))에 대해 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적으로 결합하므로, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 인식하는 단백질 분자이다.In the present invention, the term'monoclonal antibody' refers to a protein molecule that specifically binds to a single antigenic site (single epitope). For the purposes of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention is a protein molecule that specifically binds to the'envelop protein domain II of the chikungunya virus', and thus recognizes the'envelope protein domain II of the chikungunya virus'.

본 발명의 용어 '하이브리도마 세포'란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. The term'hybridoma cell' in the present invention is a cell made by artificially fusing two different types of cells, and uses a substance that causes cell fusion such as polyethylene glycol (PEG) or a virus of some species. It refers to a cell or cell line in which two or more allogeneic cells or heterogeneous cells are fused to integrate different functions of different cells into one cell.

본 발명자들은 별도의 치쿤군야 바이러스의 배양과정 없이 치쿤군야 바이러스의 검출 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단을 위해, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대한 연구를 진행하였고, 그 결과 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 생산하는 하이브리도마 세포를 구축하고, 이를 이용하여 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 특이적 단일클론항체를 생산하였다.The present inventors conducted a study on a monoclonal antibody that specifically binds to'envelope protein domain II of chikungunya virus' for detection of chikungunya virus or diagnosis of chikungunya virus infection without a separate chikungunya virus culture process. As a result, hybridoma cells producing'Chikungunya virus envelope protein domain II' were constructed, and using this, a specific monoclonal antibody specific to'Chikungunya virus envelope protein domain II' was produced.

본 발명에서는 생산된 하이브리도마 세포주 중 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'와 높은 반응성을 보이는 세포주를 1차 선별하였으며, 계대배양을 거쳐 이들 중 생존능을 상실했거나 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마 세포주를 제외하는 과정을 거쳐, 본 발명의 하이브리도마 세포주를 2차 선별하였다. 이후, 상기 세포주가 생산하는 단일클론항체의 이소타입 및 해리상수를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 하이브리도마 세포주에서 생산된 단일클론항체는 IgG_2a 이소타입을 가지면서 (1.610±0.220) 나노몰(nM)의 해리상수 값을 나타내어, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 매우 높은 결합친화도를 갖는 것을 확인하였다. In the present invention, a cell line exhibiting high reactivity with the'Chikungunya virus envelope protein domain II' among the produced hybridoma cell lines was first selected, and the viability was lost among them through subculture or the'Chikungunya virus envelope protein domain Ⅱ' The hybridoma cell line of the present invention was secondarily selected through the process of excluding the hybridoma cell line having no reactivity to II'. Thereafter, the isotype and dissociation constant of the monoclonal antibody produced by the cell line were measured. As a result, the monoclonal antibody produced in the hybridoma cell line of the present invention has an IgG _2a isotype (1.610±0.220) and shows a dissociation constant value of nanomolar (nM), so that'envelope protein domain II of Chikungunya virus' It was confirmed that it has a very high binding affinity.

또한, 본 발명의 단일클론항체의 치쿤군야 바이러스 검출 특이성을 살펴보기 위하여, 다른 속(Genus)에 해당되나 같은 숙주(Host)인 각다귀 속(Aedes genus)의 모기를 이용하는 플라비바이러스 속에 해당하는 지카 바이러스 및 뎅기 바이러스의 외피단백질에 대한 결합(또는 반응) 여부를 확인한 결과, 본 발명의 단일클론항체는 다른 속(Genus)에 해당되는 바이러스의 외피단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인하였다.In addition, in order to examine the specificity of the chikungunya virus detection of the monoclonal antibody of the present invention, Zika corresponding to the flavivirus genus using mosquitoes of the genus Aedes genus, which is a different genus, but the same host. As a result of confirming the binding (or reaction) of the virus and dengue virus to the envelope protein, the monoclonal antibody of the present invention does not bind (react) with the envelope protein of the virus corresponding to another genus, and'Chikungunya It was confirmed that it specifically binds (reacts) only to the envelope protein domain II' of the virus.

본 발명에 따른 IgG_2a 이소타입(Isotype)의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 'Hybridoma CE2-5'로 명명하였고, 이들 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하였으며, 2019년 9월 5일자로 수탁번호 KCTC 13939BP를 부여받았다. The hybridoma cell line that produces the IgG _2a isotype monoclonal antibody according to the present invention was named'Hybridoma CE2-5', and these cell lines were designated by the Korean Collection for Type Cultures, KCTC), and was assigned the accession number KCTC 13939BP on September 5, 2019.

따라서 본 발명은, 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스의 검출용 또는 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단용 키트; 상기 단일클론항체를 이용한 치쿤군야 바이러스 검출방법 및 치쿤군야 바이러스 감염 진단방법을 제공한다.Accordingly, the present invention is a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP and specifically binding to'envelope protein domain II of Chikungunya virus'; Hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP producing the monoclonal antibody; A composition for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection containing the monoclonal antibody; A kit for detection of chikungunya virus containing the monoclonal antibody or for diagnosis of chikungunya virus infection; It provides a method for detecting chikungunya virus and a method for diagnosing chikungunya virus infection using the monoclonal antibody.

본 발명에서 상기 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함할 수 있다. In the present invention, the'envelop protein domain II of the Chikungunya virus' includes the amino acid of SEQ ID NO: 1 itself, its genetically recombined protein, and its artificial variants and mutants, as well as the natural form of the protein and its functional equivalent. I can.

본 발명의 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적인 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(Fusion method)에 의해 제조될 수 있다(K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol. (1981) Vol. 73, pp. 3-46. 참조). 단일클론항체를 분비하는 '하이브리도마 세포주'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(Limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역흡착분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(Ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.A monoclonal antibody specific for the'Chikungunya virus envelope protein domain II' of the present invention can be prepared by a fusion method well known in the art (K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46. Reference). One of the two cell populations fused to create a'hybridoma cell line' secreting a monoclonal antibody is an immunologically suitable host animal cell such as a mouse injected with the'Chikungunya virus envelope protein domain II'. And, as the other population, cancer or myeloma cell lines may be used. These two populations of cells are fused by methods known in the art, such as polyethylene glycol, and then antibody-producing cells are proliferated by standard tissue culture methods. After obtaining a homogeneous cell population by subcloning by a limited dilution technique, a hybridoma cell line capable of producing an antibody specific for the'Chikungunya virus envelope protein domain II' was analyzed by enzyme immunosorbent assay. It can be selected by (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) or Western blotting, and cultured in large quantities in vitro or in vivo according to standard techniques. The in vivo mass culture means that a hybridoma cell line is injected into the peritoneal cavity of a mouse to induce high concentration of antibody production and then separated from ascites.

상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 90% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(Ascites)에서 분리할 수 있다.The monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line may be used without purification, or purified with high purity (eg, 90% or more) according to a method well known in the art to which the present invention pertains. As such a purification technique, it can be separated from a culture medium or ascites using a method such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity antigen column chromatography, or the like.

한편, 항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 유용한 점은 단일 에피토프, 즉 항원결정부위를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(Mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 웨스턴 블로팅(Western blotting)하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.On the other hand, a useful point in the case of using a monoclonal antibody to detect an antigen is that it has a specific interaction by recognizing a single epitope, that is, an epitope. In this way, various approaches can be used to map epitopes involved in the interaction between antigen and antibody. For example, biopanning using a phage display peptide library, Western blotting of fragments generated by digesting antigenic polypeptides with proteases and screening to determine fragments containing an epitope sequence, activated membranes or polyethylene Screening for peptide arrays immobilized on solid phases such as pins, and competitive ELISA assays using soluble peptides to determine the importance of each amino acid sequence residue in the epitope sequence.

상기 단일클론항체의 항원과의 결합 친화성은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있으며, 이러한 방법으로는 특별히 제한하지는 않으나, 효소면역흡착검사법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)을 통해 항원과의 결합을 측정할 수 있다.The binding affinity of the monoclonal antibody to the antigen can be determined according to a conventional method, and this method is not particularly limited, but enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) ), Sandwich ELISA, Western blotting, Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, immune tissue Chemical staining (Immunohistochemistry), Immunochromatography (Immunochromatography), Lateral flow immunoassay (LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay ), surface plasmon resonance immunoassay, interferometric immunoassay, and visual assessment.

본 명세서에서는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1)및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas A. K. et al., 2017).In the present specification, as an antibody against the'envelop protein domain II of Chikungunya virus', it may include a functional fragment of an antibody molecule as well as an entire antibody form. The whole antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond. The heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) types, and subclasses gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), and gamma 3 (γ3). ), gamma4(γ4), alpha1(α1) and alpha2(α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types (Cellular and Molecular Immunology 9th Edition, Abbas AK et al ., 2017).

항체 분자의 '기능적인 단편'이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. F(ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(Hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 F(ab')의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머(Dimer)와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 제한 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있음.), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 또는 람다(λ)형일 수 있다.The term'functional fragment' of an antibody molecule refers to a fragment having an antigen-binding function and includes Fab, F(ab'), F(ab') ₂ , and Fv. Among antibody fragments, Fab has a structure having a light chain and a heavy chain variable region, a light chain constant region, and a heavy chain first constant region (CH1), and has one antigen-binding site. F(ab') differs from Fab in that it has a hinge region containing at least one cysteine residue at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain. In the F(ab') ₂ antibody, a cysteine residue in the hinge region of F(ab') forms a disulfide bond. Fv is the smallest antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region. Recombination techniques for generating Fv fragments are disclosed in International Patent Publications WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 and WO 88 /09344. dsFv (double chain Fv) is a non-covalent bond between the heavy chain variable region and the light chain variable region, and scFv (single chain Fv) is generally a heavy chain variable region and a single chain variable region connected by a covalent bond through a peptide linker or C- Since it is directly connected at the end, it can form a dimer-like structure like dsFv. Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the whole antibody with papain yields Fab, and restriction digestion with pepsin yields F(ab') ₂ fragments). , Preferably, it can be produced through gene recombination technology. In the present invention, the antibody is preferably in the form of Fab or in the form of a whole antibody. In addition, the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), or epsilon (ε). The light chain constant region may be kappa (κ) or lambda (λ) type.

본 발명의 일구체예에 있어서, 본 발명의 단일클론항체는 IgG_2a 이소타입일 수 있으며, 상기 단일클론항체는 1.61×10^-10내지 1.61×10^-8 몰(M)의 해리상수로 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 결합할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the monoclonal antibody of the present invention may be of the IgG _2a isotype, and the monoclonal antibody has a dissociation constant of 1.61×10 ^-10 to 1.61×10 ^-8 moles (M). It can bind to the envelope protein domain II' of the Gunya virus.

또한, 본 발명은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a hybridoma cell of accession number KCTC 13939BP, which produces a monoclonal antibody that specifically binds to the'Chikungunya virus envelope protein domain II'.

상기 하이브리도마 세포주는, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 사용하여 마우스를 면역화시키는 단계; 상기 면역화시킨 마우스의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 융합된 하이브리도마 세포주에서 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 단백질에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하는 단계를 통해 제조될 수 있다.The hybridoma cell line, the step of immunizing a mouse using the'enveloping protein domain II of Chikungunya virus'; Culturing the splenocytes of the immunized mouse by fusion with myeloma cells; And selecting a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody specific to the protein'Chikungunya virus envelope protein domain II' from the fused hybridoma cell line.

본 발명의 하이브리도마 세포주를 통해 생산한 단일클론항체는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 특이적으로 인식함으로, 이러한 단일클론항체는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 또는 치쿤군야 바이러스의 검출 및 치쿤군야 바이러스 감염증의 진단을 위한 용도로 사용될 수 있다. Since the monoclonal antibody produced through the hybridoma cell line of the present invention specifically recognizes the'envelope protein domain II of the Chikungunya virus', such a monoclonal antibody is the'envelope protein domain II of the chikungunya virus' or the chikungunya It can be used for detection of virus and diagnosis of Chikungunya virus infection.

따라서 본 발명은 본 발명의 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 치쿤군야 바이러스의 감염 여부를 확인하거나 치쿤군야 바이러스 감염증을 진단할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다. Accordingly, the present invention can provide a composition for detecting a chikungunya virus comprising a monoclonal antibody against the'envelop protein domain II of the chikungunya virus' of the present invention, and further confirming whether the chikungunya virus is infected or not A composition capable of diagnosing an infectious disease can be provided.

본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 상기 치쿤군야 바이러스 감염 여부를 확인하는 것이다.As used in the present invention, the term'diagnosis' means to confirm the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the chikungunya virus is infected.

본 발명의 단일클론항체를 이용하여 치쿤군야 바이러스의 존재 여부 및 치쿤군야 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있으며, 또한, 치쿤군야 바이러스의 감염이 의심되는 생물학적 시료를 대상으로 하여 통상의 항원-항체반응의 분석법을 사용할 수 있다. 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.The presence of chikungunya virus and infection of chikungunya virus can be detected using the monoclonal antibody of the present invention, and normal antigen-antibody reactions targeting biological samples suspected of infection with chikungunya virus The analysis method of can be used. Antigen-antibody reactions include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, and immune dot blot analysis. (Immunodot blot assay), Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (LFA) ), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay, Visual measurement (Visual assessment) can be illustrated, but is not limited thereto.

웨스턴 블로팅(Western blotting)은, 생물학적 시료 중에 존재하는 해당 단백질을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 예를 들어, 장기 조직 유래의 추출액 등의 생체 시료액을 폴리아크릴아미드 겔(Gel) 전기 영동 시킨 뒤, PVDF 멤브레인에 전이하고, 해당 단백질 또는 해당 펩타이드를 인식하는 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것이다.Western blotting is a useful method for identifying the corresponding protein present in a biological sample. For example, a biological sample solution such as an extract derived from organ tissue is subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, then transferred to the PVDF membrane, and reacted with an antibody that recognizes the protein or the peptide, and is generated therefrom. The immune complex is detected using a labeled second antibody.

면역 염색법은 조직 및 세포에 있어서 대상 폴리펩티드(Polypeptide)의 발현 부위를 해석하기 위하여 유효한 방법으로, 예를 들어, 슬라이드글라스 상에 고정되는 조직 절편, 세포 등을 본 발명의 항체와 반응시키고, 이로부터 생성되는 면역 복합체를 표지된 제2항체를 이용하여 검출하는 것에 따라 실시한다.Immunostaining is an effective method for analyzing the expression site of a target polypeptide (Polypeptide) in tissues and cells. For example, tissue sections, cells, etc. fixed on a slide glass are reacted with the antibody of the present invention, from which It is carried out by detecting the resulting immune complex using a labeled second antibody.

한편, 생물학적 시료 중에서 특정 단백질의 존재여부는 시료를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.Meanwhile, the presence or absence of a specific protein in a biological sample can be confirmed by measuring the formation of an antigen-antibody complex by contacting the sample with an antibody that specifically binds to the protein. The term'antigen-antibody complex' as used herein refers to a combination of a specific protein in a biological sample and an antibody that specifically recognizes it.

본 발명에서 사용된 용어 '생물학적 시료' 또는 '시료'는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료를 말한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 시료 또는 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직파쇄물, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.The term'biological sample' or'sample' as used herein refers to blood and other liquid samples of biological origin. Preferably, the biological sample or sample may be any one selected from whole blood, plasma, serum, tissue, tissue lysate, cells, cell lysate, body fluid, saliva, cerebrospinal fluid, urine, etc., but is not limited thereto. The sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, most preferably a human. The sample can be pretreated prior to use for detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like. In addition, nucleic acids and proteins can be separated from the sample and used for detection.

또한, 본 발명의 검출용 또는 진단용 조성물은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적인 본 발명의 단일클론항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약 및 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적인 다른 종류의 다클론 또는 단일클론항체를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the composition for detection or diagnosis of the present invention is a reagent known in the art used for immunological analysis in addition to the monoclonal antibody of the present invention specific to the'envelope protein domain II of the Chikungunya virus' and'the coat of the chikungunya virus. Other types of polyclonal or monoclonal antibodies specific for protein domain II′ may further be included.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 상기 항원-항체반응의 분석법의 방법과 동일한 방법으로도 수행할 수 있다.In the above, immunological analysis may include any method capable of measuring the binding of an antigen and an antibody. These methods are known in the art, and can be performed in the same manner as the method of the antigen-antibody reaction assay.

본 발명에 따른 상기 검출용 또는 진단용 조성물은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 검출 또는 치쿤군야 바이러스의 감염증 진단을 위한 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공할 수 있다.The composition for detection or diagnosis according to the present invention may be provided in the form of a kit or microarray for detecting the'envelop protein domain II of the Chikungunya virus' or diagnosing the infection of the Chikungunya virus.

본 발명의 검출용(진단용) 조성물은 검출(진단)의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 공지된 다양한 방법을 이용하여 적합한 담체 또는 지지체상에 고정된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(Flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.The composition for detection (diagnosis) of the present invention may be provided in a state fixed on a suitable carrier or support using various known methods in order to increase the speed and convenience of detection (diagnosis). Examples of suitable carriers or supports include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposomes, carboxymethylcellulose, polyacrylamide, polyesterin, porphyry, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube. , Glass, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, cups, flat packs, and the like. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or well inner surface), planar (sheet, test strip).

따라서, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13939BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되고 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스 검출용 키트 또는 치쿤군야 바이러스의 감염 진단을 위한 키트를 제공한다.Therefore, the present invention is produced by a hybridoma cell line of accession number KCTC 13939BP and containing a monoclonal antibody specifically binding to the'Chikkungunya virus envelope protein domain II' kit for detecting chikungunya virus or chikungunya A kit for diagnosing virus infection is provided.

상기 검출용 또는 진단용 키트는 본 발명의 단일클론항체 뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 포함할 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 또한 검출용 또는 진단용 키트는 본 발명의 단일클론항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지체를 추가로 포함할 수 있다. The detection or diagnostic kit may include not only the monoclonal antibody of the present invention, but also tools and reagents generally used in the art used for immunological analysis. Such tools/reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling substance is an enzyme, a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator may be included. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. In addition, the detection or diagnostic kit may further include a label capable of confirming the reaction between the monoclonal antibody of the present invention and an antigen (antigen determination site) in a sample to be applied thereto.

상기 표지체의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 대상물질(Analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(Labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 알칼리성 포스파타제와 겨자무 과산화효소 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 3,3',5,5' -테트라메틸벤지딘, 4-메톡시-1-나프톨, 4-클로로-1-나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인 (Fluorescein), 피코빌리프로틴(Phycobiliprotein), 로다민(Rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP (Horseradish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC (Fluorescein isothiocyanate)가, 발광물질로는 루미놀(Luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(Lucigenin)이, 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다. Depending on the type of the label, a method known to those skilled in the art may be used, and specifically, the naked eye, detection equipment, detection reagent, and the like may be used. The detection reagent is a labeled reagent, an auxiliary specific binding member, and/or a signal generating system that enables external identification of the presence of an object to be tested (Analyte) through the naked eye or other instruments. Constituents may be included. Labeled detection reagents are already well known to those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Examples of such labels are catalysts, enzymes (e.g., phosphatase, peroxidase, etc., and more specific examples are alkaline phosphatase and mustard radish peroxidase, etc. used together in combination with an enzyme substrate), enzyme substrates (e.g., Nitroblue tetrazolium, 3,5',5,5'-tetranitrobenzidine, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, 4-methoxy-1-naphthol, 4-chloro-1-naphthol, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, as a chemiluminescent enzyme substrate, dioxetane, and derivatives and their analogues), fluorescent compounds (e.g., Fluorescein), phycobiliprotein ( Phycobiliprotein), rhodamine, and their derivatives and analogs), chemiluminescent compounds, metal sol, dye sol, particulate latex, color indicator, and liposomes Color matter, carbon sol, and non-metal sol such as selenium. For example, as a labeling means, there is HRP (Horseradish peroxidase) in the case of an enzyme, FITC (Fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent material, and Luminol, isoluminol and Lucigenin as a luminescent material, radioactive isotopes Elements include ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, ³⁶ Cl, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ⁵⁸ Co, ⁵⁹ Fe, ⁹⁰ Y, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ¹⁸⁶ Re, and the like, but are not limited thereto. The labeling by the labeling means can be confirmed using a substrate of an enzyme or a tool for measuring fluorescence, luminescence, or radiation.

본 발명의 일구체예에 있어서, 상기 키트는 기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체접합체, 상기 표지체와 발색반응하는 발색 기질 용액 및 각 반응단계에 사용할 세척액을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the kit further comprises a secondary antibody conjugate to which a label that develops color by reaction with a substrate is conjugated, a color developing substrate solution that reacts with the label, and a washing solution to be used in each reaction step can do.

상기 2차 항체접합체의 표지체는 효소, 발광체, 형광체, 발색체, 전기화학 탐침, 분광용 탐침, 탄소 구조체를 포함하며, 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP), 알칼리성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase, AP), 글루코오즈 옥시다아제(Glucose oxidase), 루시퍼라아제(Luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase), 콜로이드 금(Colloidal gold), 금속 나노입자(Metal nanoparticle), 실리카 나노입자(Silica nanoparticle), 유기 형광물질(Organic fluorescent material), 형광 단백질(Fluorescent protein), 양자점(Quantum dot), 방사성 물질(Radioactive material), 방사성 동위원소(Isotope), 색소(Dye), 탄소나노튜브(Carbon nanotube), 그래핀(Graphene) 및 풀러렌(Fullerene)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.Labels of the secondary antibody conjugate include enzymes, luminous bodies, phosphors, chromosomes, electrochemical probes, spectroscopic probes, and carbon structures, and mustard beet peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase). , AP), glucose oxidase, luciferase, beta-D-galactosidase, malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase (Acetylcholinesterase), colloidal gold, metal nanoparticle, silica nanoparticle, organic fluorescent material, fluorescent protein, quantum dot, radioactive Materials (Radioactive material), radioactive isotope (Isotope), dye (Dye), carbon nanotubes (Carbon nanotube), graphene (Graphene) and may be selected from the group consisting of fullerene (Fullerene). However, in addition to those exemplified above, any one that can be used in an immunological assay may be used.

상기 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, DAB (Diaminobenzidine), AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 및 OPD (o-phenylenediamine)의 발색기질 등을 사용할 수 있다. 하나의 예로, TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.The substrate that induces the color development is preferably used depending on the marker for the color development reaction, and DAB (Diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3) -indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5) ,5'-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD ( o- phenylenediamine) chromogenic substrates can be used. As an example, a chromogenic substrate such as TMB is degraded by HRP used as a label for a secondary antibody conjugate to generate a chromogenic deposit, and the presence or absence of a protein antigen is detected by visually checking the degree of deposition of the chromogenic deposit. .

상기 세척액은 단계에 따라 증류수, TBS (Tris buffered saline) 트윈 완충용액, PBS (Phosphate buffered saline) 트윈 완충용액, NaCl, 트윈-20 (Tween-20), 트리톤 X-100 (Triton X-100) 등을 사용할 수 있다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 반응기에 넣어 3 내지 6회 세척한다.The washing solution is distilled water, TBS (Tris buffered saline) Tween buffer solution, PBS (Phosphate buffered saline) Tween buffer solution, NaCl, Tween-20, Triton X-100, etc. You can use After the antigen-antibody binding reaction, the washing solution is reacted with a secondary antibody to the antigen-antibody conjugate, and then an appropriate amount is put into a reactor and washed 3 to 6 times.

또한 본 발명은 시료를 준비하는 단계; 상기 시료에 본 발명의 단일클론항체를 적용하는 단계; 및 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 치쿤군야 바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.In addition, the present invention comprises the steps of preparing a sample; Applying the monoclonal antibody of the present invention to the sample; And it can provide a method of diagnosing chikungunya virus infection comprising the step of measuring the antigen-antibody response.

상기 시료는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 검출하고자 하는 분석 대상 물질로서 치쿤군야 바이러스 감염이 의심되는 동물이나 환자의 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 조직파쇄물, 세포, 세포파쇄물, 체액, 타액, 뇌척수액 및 소변 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.The sample is a material to be analyzed to detect'envelope protein domain II of Chikungunya virus'. Whole blood, plasma, serum, tissue, tissue lysate, cells, cell lysates, body fluids, from animals or patients suspected of being infected with Chikungunya virus. Saliva, cerebrospinal fluid, and urine may be exemplified, but the type is not particularly limited.

본 발명에서 상기 항원-항체 반응은 효소면역흡착검사법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 효소면역흡착검사법(Sandwich ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역 점 블롯 분석법 (Immunodot blot assay), 면역형광측정법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence assay), 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry), 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography), 측방 유동 면역분석법(Lateral flow immunoassay, LFA), 비색 면역분석법(Colorimetric immunoassay), 분광 면역분석법(Spectrometric immunoassay), 라만 분광 면역분석법(Raman spectroscopic immunoassay), 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(Surface plasmon resonance immunoassay), 간섭계 면역분석법(Interferometric immunoassay), 육안 측정법(Visual assessment)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.In the present invention, the antigen-antibody reaction is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a radioimmunoassay (RIA), a sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, Immunodot blot assay, Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (Lateral) flow immunoassay, LFA), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay ), can be selected from the group consisting of a visual assessment. However, it is not necessarily limited to these, and various applications and applications are possible.

나아가 본 발명은 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 치쿤군야 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.Furthermore, the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of chikungunya virus infection, comprising a monoclonal antibody against'chikungunya virus envelope protein domain II'.

본 발명에서 용어, '약학적 조성물'은 유효성분으로서 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 포함하는 조성물로서, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 등의 다른 화학적 성분을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 목적은 생물체에 화합물의 투여를 용이하게 하는데 있다. 여기서, 용어 '유효성분'은 생물학적 효과의 원인이 될 수 있는 펩타이드 또는 항체 제제를 말한다. 용어 '약학적으로 허용가능한 담체'는 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 이러한 용어에는 보조제가 포함된다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액들 중 어느 한 가지(예를 들어, 인산완충액) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다. 용어 '부형제'는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 전분의 여러가지 당류, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름 및 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.In the present invention, the term'pharmaceutical composition' is a composition comprising a monoclonal antibody against'Chikungunya virus envelope protein domain II' as an active ingredient, and other chemical components such as pharmaceutically acceptable carriers and excipients are added. Can be included as. The purpose of the pharmaceutical composition is to facilitate administration of the compound to an organism. Here, the term'active ingredient' refers to a peptide or antibody preparation that can cause biological effects. The term'pharmaceutically acceptable carrier' refers to a carrier or diluent that does not significantly irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound. These terms include adjuvants. Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as any one of the physiologically acceptable buffers known in the art (e.g., phosphate buffers) or insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, poly It may be ester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymer such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. The term'excipient' refers to an inert substance added to a pharmaceutical composition to facilitate administration of the active ingredient. Examples of excipients include calcium carbonate, calcium phosphate, various sugars of starch, cellulose derivatives, gelatin, vegetable oil and polyethylene glycol.

본 발명의 약학적 조성물은 인간 뿐 아니라 치쿤군야 바이러스에 감염될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 가축의 치쿤군야 바이러스 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 조성물로 제공될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be provided as a composition capable of preventing and treating chikungunya virus infection of cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, etc., which may be infected with chikungunya virus as well as humans. have.

본 발명에 따른 단일클론항체는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 특이적으로 결합하여 이들의 발현 또는 기능을 억제할 수 있으므로 치쿤군야 바이러스에 의해 야기되는 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.The monoclonal antibody according to the present invention specifically binds to the'envelope protein domain II of the chikungunya virus' and can inhibit their expression or function, so the pharmaceutical for the prevention or treatment of infectious diseases caused by the chikungunya virus It can be used as a composition.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for explaining the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

폴리아크릴아미드Polyacrylamide 겔 전기영동( Gel electrophoresis ( PolyacrylamidePolyacrylamide gel electrophoresis)을 통한 ' gel electrophoresis) 치쿤군야Chikungunya 바이러스 virus 외피단백질Envelope protein 도메인 Ⅱ'의 확인 Confirmation of domain II'

'치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'는 이를 암호화하는 341개의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 준비하였으며, 본 발명의 '치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ'의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시하였다.'Chikungunya virus envelope protein domain II' was prepared with a protein consisting of a 341 amino acid sequence encoding it, and the amino acid sequence of the'chikungunya virus envelope protein domain II' of the present invention is represented by SEQ ID NO: 1.

'치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'는 순수 분리 및 정제를 위해 C-말단(C-terminal)에 폴리히스티딘이(Polyhistidine) 연결된 형태(His-tagged)를 이용하였으며, 베큘로바이러스-곤충세포 시스템(Baculovirus-Insect cells)을 이용하여 단백질을 발현시킨 후, Ni-NTA 레진(Nickel-nitrilotriacetic acid resin)을 사용하여 친화크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법으로 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 순수 분리 및 정제하였다. 분리 및 정제된 '치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ'는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 통해 확인하였다. 'Chikungunya virus envelope protein domain Ⅱ'was used in the form of polyhistidine linked to the C-terminal (His-tagged) for pure separation and purification. Baculovirus-insect cell system After expressing the protein using (Baculovirus-Insect cells),'envelop protein domain II of Chikungunya virus' was purified by affinity chromatography using Ni-NTA resin (Nickel-nitrilotriacetic acid resin). Separated and purified. The separated and purified'chikungunya virus envelope protein domain II' was confirmed through polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).

단일클론항체를 만들기 위한 항원(Antigen)으로 사용할 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'이 높은 순도(Purity)로 존재하는지, 알려진 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'의 분자량(Molecular weight)인 약 40 킬로달톤(Kilodalton, kDa) 부근에 위치하는지를 확인하기 위해 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 단백질 전기영동을 수행하였다. 이후 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액을 이용하여 염색하고, 탈색용액을 이용하여 탈색반응을 진행한 다음 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 확인하였다.Whether the'Chikungunya virus envelope protein domain Ⅱ', which will be used as an antigen to make a monoclonal antibody, exists in high purity, and is the molecular weight of the known'Chikungunya virus envelope protein domain II'. Protein electrophoresis was performed using a 12% polyacrylamide gel to confirm that it is located near about 40 kilodalton (Kilodalton, kDa). Thereafter, the polyacrylamide gel was stained using a Coomassie Blue solution, followed by a bleaching reaction using a bleaching solution, and then'envelop protein domain II of Chikungunya virus' was identified.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 단백질 사이즈 마커(Size marker)와 비교했을 때, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'는 35 kDa와 45 kDa 사이에 존재하는 것을 확인할 수 있었기 때문에 순수 분리 및 정제된 '치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ'임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 1, when compared with the protein size marker, the'Chikungunya virus envelope protein domain II' was found to exist between 35 kDa and 45 kDa, so pure separation and purification It was confirmed that it was'Chikungunya virus envelope protein domain II'.

<< 실시예Example 2> 2>

효소면역흡착검사(ELISA)를 위한 ''For enzyme immunosorbent test (ELISA) 치쿤군야Chikungunya 바이러스의 Viral 외피단백질Envelope protein 도메인 Ⅱ'가 코팅된 플레이트의 제조 Preparation of domain II' coated plate

96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'를 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 포함하고 있는 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 다음 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민 (Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 100 µl of'Chikungunya virus envelope protein domain II' diluted at a concentration of 1 µg/ml in each well of a 96-well plate was dispensed by 100 µl, and then reacted at 37°C for 1 hour. Made it. Then, each well was washed three times using a PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4) (PBS/T) solution containing 0.1% Tween-20. For the next blocking (Blocking), a PBS/T solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) was dispensed into each well by 200 µl and reacted at 37°C for 1 hour, and then the PBS/T solution was added. Washed using the same method.

<< 실시예Example 3> 3>

마우스 면역화 및 항체의 Mouse Immunization and Antibody 역가Titer (Antibody titer) 측정(Antibody titer) measurement

상기 <실시예 1>을 통해 확인된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 30 ㎍을 PBS 용액을 이용하여 250 ㎕가 되도록 희석시킨 다음, 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant와 섞어주어 에멀젼(Emulsion) 형태로 만든 다음 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내로 주사하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화 수행으로부터 2주 후에는 Complete Freund's Adjuvant 대신 Incomplete Freund's Adjuvant를 이용하여 같은 방법 및 실험조건으로 2차 면역화를 수행하였다. 2차 면역화로부터 2주 후에 마우스의 꼬리 정맥으로부터 10 ㎕의 혈액을 채취하여 마우스 체내에 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 항체가 충분히 생성되었는지에 대한 역가(Antibody titer)를 측정하였다.30 μg of'Chikungunya virus envelope protein domain II' identified through the above <Example 1> was diluted to 250 μl using a PBS solution, and then mixed with the same volume of Complete Freund's Adjuvant to form an emulsion Then, a 6-week-old female BALB/c mouse was injected intraperitoneally to perform primary immunization. Two weeks after the first immunization, Incomplete Freund's Adjuvant was used instead of Complete Freund's Adjuvant, and the second immunization was performed under the same method and experimental conditions. Two weeks after the second immunization, 10 µl of blood was collected from the tail vein of the mouse, and the titer (Antibody titer) of whether an antibody against'Chikungunya virus envelope protein domain II' was sufficiently produced in the mouse body was measured.

Indirect ELISA 방식으로 마우스 혈액 내 항체의 역가를 측정하였으며, 상기 <실시예 2>로부터 준비된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'가 코팅된 효소면역흡착검사용 플레이트에 1/10², 1/10³, 1/10⁴의 비율로 희석된 마우스 혈액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, PBS/T 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후 겨자무 과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP)가 연결된 염소의 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H₂SO₄ 용액을 100 ㎕씩 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다.The titer of the antibody in the mouse blood was measured by the Indirect ELISA method, and 1/10 ² , 1/10 on an enzyme immunosorbent plate coated with the'Chikungunya virus envelope protein domain II' prepared from <Example 2>. 100 µl of mouse blood diluted at a ratio of ³ , 1/10 ⁴ was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 1 hour, and washed 3 times with PBS/T solution. Afterwards, goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) linked to mustard beet peroxidase (HRP) was dispensed into each well, reacted at 37°C for 1 hour, and then washed in the same manner. . Then, 100 µl of a TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) solution, which is a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm the color development. Then, 100 μl of a 0.5 NH ₂ SO ₄ solution, which is a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction.

마우스 혈액 내에 존재하는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 항체의 역가('치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 반응성)의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 면역화가 잘 이루어진 것으로 판단되어 최종적으로 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ' 30 ㎍을 PBS 용액에 희석하여 별도의 Adjuvant 없이 면역반응 극대화를 위한 부스터 주입(Booster injection)을 수행하였다.Using a microplate reader to quantify the titer of the antibody against the'Chikungunya virus envelope protein domain II' present in the mouse blood (reactivity to the'Chikungunya virus envelope protein domain II') 450 The absorbance was measured at nm. As a result of the measurement, it was determined that the immunization was well performed, and finally 30 µg of'Chikungunya virus envelope protein domain II' was diluted in a PBS solution, and a booster injection was performed to maximize the immune response without a separate adjuvant.

<< 실시예Example 4> 4>

세포융합을 통한 Through cell fusion 하이브리도마Hybridoma (( HybridomaHybridoma ) 세포주 제작) Cell line production

세포융합은 기존에 잘 알려진 하이브리도마 생산기술(K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.)을 통해 이루어졌다. 상기 <실시예 3>에서 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'가 면역화된 마우스로부터 비장(Spleen)을 적출한 다음, 조직분쇄기로 비장을 분쇄하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 비장세포(Splenocyte)를 계수하였다. 다음 37℃, 5% CO₂의 세포배양기에서 배양한 T75 플라스크에 있는 마우스 골수종세포(Myeloma, Sp2/0-Ag14)를 회수하여 RPMI 1640 배지에 현탁하여 같은 방법으로 계수하였다. 계수한 마우스의 비장세포와 골수종세포가 세포수를 기준으로 5:1이 되도록 하나의 50 ㎖ 튜브에 옮겨 담은 뒤, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 50%의 PEG1500 (Polyethylene glycol) 1 ㎖를 처리한 다음, 39 ㎖의 37℃ RPMI 1640 배지를 천천히 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포융합이 일어나도록 하였다. 1,200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine)을 함유하고 있는 RPMI 1640 배지(HAT 배지)를 이용하여 적절한 수의 세포가 되도록 현탁한 다음 세포배양용 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주해주었다. 이후 37℃, 5% CO₂의 조건으로 세포배양기 내에서 배양하였다.Cell fusion is a well-known hybridoma production technology (K

hler G. & Milstein C., Nature (1975) Vol. 256, pp. 495-497., Galfre G. & Milstein C., Methods Enzymol . (1981) Vol. 73, pp. 3-46.). In <Example 3>, the spleen was extracted from the mouse immunized with the'Chikungunya virus envelope protein domain II', and then the spleen was crushed with a tissue grinder and suspended in RPMI 1640 medium to obtain splenocytes. Counted. Then, mouse myeloma cells (Myeloma, Sp2/0-Ag14) in a T75 flask cultured in a cell incubator at 37° C. and 5% CO ₂ were recovered, suspended in RPMI 1640 medium, and counted in the same manner. The counted mouse splenocytes and myeloma cells were transferred to a single 50 ml tube so that the number of cells was 5:1, and then centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes to recover the cells. The recovered cells were treated with 1 ml of 50% PEG1500 (Polyethylene glycol), and then 39 ml of 37°C RPMI 1640 medium was slowly added and reacted at 37°C for 5 minutes to allow cell fusion to occur. After recovering the cells by centrifuging for 5 minutes at 1,200 rpm, suspend them to an appropriate number of cells using RPMI 1640 medium (HAT medium) containing HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine), and then 96- 100 μl was dispensed into each well of a 96-well plate. Then, the cells were cultured in a cell incubator under conditions of 37°C and 5% CO ₂ .

<< 실시예Example 5> 5>

고반응성Highly reactive 하이브리도마Hybridoma 세포주의 선별 Selection of cell lines

상기 <실시예 4>를 통해 융합된 세포를 7일 이상 배양한 다음, 육안이나 현미경을 통해 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것을 확인한 다음, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰(Well)에 있던 기존 HAT 배지를 교체하여 상기 <실시예 4>와 같은 조건에서 3일간 추가적으로 배양하였다. 이후 96-웰(96-well) 세포 배양 플레이트 내 각각의 웰(Well)에 존재하는 배지를 취하여 상기 <실시예 2>에서 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하여 <실시예 3>과 같은 방법으로 Indirect ELISA를 수행하였다.After culturing the fused cells through the <Example 4> for 7 days or longer, confirming that the fused cells form colonies and grow through the naked eye or a microscope, and then each well of a 96-well plate Existing HAT medium in (Well) was replaced and cultured for an additional 3 days under the same conditions as in <Example 4>. Thereafter, the same as in <Example 3> by taking the medium present in each well in a 96-well cell culture plate and using the plate for enzyme immunosorbent test prepared in <Example 2>. Indirect ELISA was performed as a method.

그 결과 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'와 높은 반응성을 보이는 웰(Well)에 존재하는 하이브리도마를 선별하였으며, 추가적으로 24-웰 플레이트(24-well plate) 및 6-웰 플레이트(6-well plate)에서의 계대배양을 거쳐 생존능 및 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 반응성을 같은 방법으로 확인하였다. 생존능을 상실했거나 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 반응성이 없는 하이브리도마를 제외한 후, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해 높은 반응성을 보이는 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 선별된 하이브리도마 세포주들은 단일클론의 하이브리도마 세포주를 얻기 위해 서브-클로닝(Sub-cloning) 및 클로닝(Cloning) 과정을 진행하였다. As a result, hybridomas present in wells exhibiting high reactivity with'Chikungunya virus envelope protein domain II' were selected, and additionally, 24-well plates and 6-well plates (6-well plates) were selected. well plate), and the viability and reactivity to'envelop protein domain II of Chikungunya virus' were confirmed by the same method. After excluding hybridomas that had lost viability or had no reactivity to'Chikungunya virus envelope protein domain II', hybridoma cell lines showing high reactivity to'Chikungunya virus envelope protein domain II' were selected. The selected hybridoma cell lines were subjected to sub-cloning and cloning processes to obtain monoclonal hybridoma cell lines.

<< 실시예Example 6> 6>

단일클론항체Monoclonal antibody (Monoclonal antibody)의 생산, 분리/정제 및 확인(Monoclonal antibody) production, separation/purification and identification

선별된 단일클론의 하이브리도마 세포주로부터 다량의 단일클론항체를 얻기 위해 마우스의 복강 내로 하이브리도마 세포주를 주입하여 복수(Ascites)가 생성되도록 유도하였다. 이는 단일클론항체 획득을 위해 본 실시예에서 수행한 것일 뿐, 생체 외 세포배양(In vitro cell culture)을 통해서도 단일클론항체의 획득이 가능하다. 상기 마우스로부터 획득한 복수에 존재하는 불순물 제거 및 혈청(Serum)의 분리를 위해 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 수행한 후 주사기 필터를 통해 필터링을 수행하였다. In order to obtain a large amount of monoclonal antibodies from the selected monoclonal hybridoma cell line, the hybridoma cell line was injected into the intraperitoneal cavity of the mouse to induce the generation of ascites. This is only performed in this example to obtain a monoclonal antibody, and it is possible to obtain a monoclonal antibody through in vitro cell culture. In order to remove impurities present in ascites obtained from the mouse and to separate serum, centrifugation was performed at 3,000 rpm for 10 minutes, and then filtering was performed through a syringe filter.

상기의 과정으로부터 준비된 혈청에 포함된 단일클론항체인 이뮤노글로불린 G (Immunoglobulin G, IgG)만을 선택적으로 분리/정제하기 위해 준비된 배지를 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4) 용액으로 평형화 되어 있는 아가로즈(Agarose)-Protein G 레진(Resin)이 충진(Packing)되어 있는 컬럼(Column)에 흘려주었다. 혈청을 모두 흘려준 다음, 다시 20 mM KH₂PO₄ (pH 7.4)를 이용하여 비특이적으로 결합되어 있거나 끼어있는 단일클론항체 이외의 불순물들을 제거해 주었다. 이후 0.1 M Glycine (pH 2.8) 용액을 흘려주어 Protein G와 결합되어 있는 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 용출시켜주었으며, 용출되는 즉시 pH 중화(Neutralization)를 위해 1 M Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 용출액의 1/3에서 1/5 정도의 부피 비율(Volume ratio)이 되도록 섞어주었다. 이후 단일클론항체 용출액의 버퍼(용액)를 교환해주기 위해 PBS 용액을 이용하여 4℃에서 16시간 이상 투석을 2회 수행하였다. 투석이 완료된 단일클론항체는 주사기 필터를 통해 응집물(Aggregate)을 제거한 다음, 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 이후 '도 2'에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>과 같은 조건으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 쿠마시 블루 염색을 통해 고순도의 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 확인하였다. Agar equilibrated with a 20 mM KH ₂ PO ₄ (pH 7.4) solution to selectively separate/purify only immunoglobulin G (Immunoglobulin G, IgG), which is a monoclonal antibody contained in the serum prepared from the above process. Rose (Agarose)-Protein G resin (Resin) was poured into the packed (Packing) column (Column). After all the serum was spilled, 20 mM KH ₂ PO ₄ (pH 7.4) was used to remove impurities other than non-specifically bound or intercalated monoclonal antibodies. After that, a 0.1 M Glycine (pH 2.8) solution was poured to elute a monoclonal antibody against the'Chikungunya virus envelope protein domain II' bound to Protein G. As soon as it was eluted, 1 M for pH neutralization. Tris-HCl (pH 7.4) solution was mixed so as to have a volume ratio of about 1/3 to 1/5 of the eluate. Subsequently, dialysis was performed twice at 4° C. for 16 hours or more using a PBS solution to exchange the buffer (solution) of the monoclonal antibody eluate. The dialysis-completed monoclonal antibody was quantified by removing aggregates through a syringe filter, and measuring absorbance at 280 nm. Thereafter, as shown in'Fig. 2', polyacrylamide gel electrophoresis was performed under the same conditions as in <Example 1>, followed by Coomassie blue staining, and a monoclonal antibody against high purity'Chikungunya virus envelope protein domain II' Was confirmed.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 50 kDa 부위와 25 kDa 부위에서 각각 항체의 중쇄(Heavy chain)와 경쇄(Light chain)만을 관찰할 수 있었기 때문에, 단일클론항체의 분리 및 정제가 잘 이루어졌다고 판단하였다.As a result, as shown in FIG. 2, since only the heavy and light chains of the antibody could be observed at the 50 kDa site and the 25 kDa site, it was judged that the isolation and purification of the monoclonal antibody was well performed. I did.

<< 실시예Example 7> 7>

단일클론항체의Of monoclonal antibodies 이소타입Isotype (( IsotypeIsotype ) 확인 및 ) OK and 해리상수Dissociation constant (Dissociation constant, K(Dissociation constant, K _DD ) 측정) Measure

상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리/정제된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체의 이소타입을 확인하기 위해, 마우스 IgA, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃, IgM에 각각 특이적으로 결합하는 염소(Goat)의 항체를 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4) 용액을 이용하여 희석시킨 다음 효소면역흡착검사용 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척해 주었다. 다음은 블로킹(Blocking)을 위해 1% 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS/T 용액을 각각의 웰(Well)에 200 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 PBS/T 용액을 이용하여 같은 방법으로 세척해 주었다. 그 다음 상기 <실시예 6>으로부터 준비된 '치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 100 ㎕ 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켜주었으며, 반응이 끝난 후 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP 효소가 연결된 염소의 항-마우스 IgG (Goat anti-mouse IgG, HRP conjugated)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰(Well)에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 이소타입 반응성에 대한 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.In order to confirm the isotype of the monoclonal antibody against the purely isolated/purified'Chikungunya virus envelope protein domain II' from the <Example 6>, mouse IgA, IgG ₁ , IgG _2a , IgG _2b , IgG ₃ , Goat antibodies that specifically bind to IgM were diluted with a PBS (pH 7.4) solution to a concentration of 1 µg/ml, and then 100 µl each was dispensed into a plate for enzyme immunosorbent test. It was reacted at °C for 1 hour. Then, each well was washed 3 times using 0.1% PBS/T solution. Next, for blocking, 200 μl of PBS/T solution containing 1% bovine serum albumin (BSA) was dispensed into each well and reacted at 37° C. for 1 hour, followed by PBS/ It was washed in the same way using T solution. Then, 100 µl of a monoclonal antibody against the'Chikungunya virus envelope protein domain II' prepared in Example 6 was dispensed and reacted at 37°C for 1 hour, and after the reaction was completed, a 0.1% PBS/T solution was used. Each well was washed three times. Then, goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) to which HRP enzyme was linked was dispensed into each well, reacted at 37° C. for 30 minutes, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of a TMB solution, a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm a color development reaction. Then, 100 μl of a 0.5 NH ₂ SO ₄ solution, which is a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. For quantification of each isotype reactivity, absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.

그 결과는 도 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리 및 정제된 단일클론항체의 이소타입은 IgG_2a임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the isotype of the monoclonal antibody isolated and purified from <Example 6> was IgG _2a .

한편, 상기 <실시예 6>으로부터 순수 분리 및 정제된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체의 해리상수(Dissociation constant, K_D) 또는 결합친화도(Binding affinity)를 측정하기 위해 상기 <실시예 2>로부터 제조된 '치쿤군야 바이러스 외피단백질 도메인 Ⅱ'가 코팅되어 있는 효소면역흡착검사용 플레이트를 준비하였다. 상기 단일클론항체를 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대해서는 100 나노몰(nM)의 몰농도(Molar concentration)로 부터 PBS 용액을 이용하여 1/2씩 연속적으로 희석하여 0 nM을 포함한 총 16가지 서로 다른 농도의 단일클론항체를 준비하였으며, 이들을 각각의 웰에 100 ㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 각각의 서로 다른 농도의 단일클론항체에 대한 반응성의 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.On the other hand, to measure the dissociation constant (K _D ) or binding affinity of the monoclonal antibody against the purely isolated and purified'Chikungunya virus envelope protein domain II' from <Example 6> For this purpose, a plate for enzyme immunosorbent assay was prepared, coated with the'Chikungunya virus envelope protein domain II' prepared from Example 2 above. The monoclonal antibody was serially diluted by 1/2 using a PBS solution from a molar concentration of 100 nanomolar (nM) for the'Chikungunya virus envelope protein domain II' to contain 0 nM. Monoclonal antibodies of 16 different concentrations were prepared, and 100 μl of them were dispensed into each well, and then reacted at 37° C. for 1 hour. After the reaction was over, each well was washed 3 times using 0.1% PBS/T solution. Then, HRP-linked goat anti-mouse IgG was dispensed into each well, reacted at 37°C for 1 hour, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of TMB solution, a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm a color development reaction. Then, 100 μl of a 0.5 NH ₂ SO ₄ solution, which is a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader to quantify the reactivity to each different concentration of monoclonal antibodies.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리 및 정제된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체의 해리상수는 (1.610±0.220) 나노몰(nM) 임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 4, the dissociation constant of the monoclonal antibody against the'envelop protein domain II of Chikungunya virus' isolated and purified from <Example 6> was (1.610±0.220) nanomolar (nM). I could confirm.

<< 실시예Example 8> 8>

치쿤군야Chikungunya 바이러스의 Viral 외피단백질Envelope protein 도메인 Ⅱ에 대한 특이도 분석 Specificity analysis for domain Ⅱ

상기 <실시예 6>을 통해 분리 및 정제된 단일클론항체가 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에만 특이적으로 결합(또는 반응)하면서, 다른 단백질과는 결합 또는 반응하지 않는지 확인하기 위해 상기 <실시예 2>의 과정과 같은 방법으로 제조된 효소면역흡착검사용 플레이트를 사용하였다. 상기 <실시예 6>을 통해 분리 및 정제된 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에 대한 단일클론항체를 100 nM의 농도로 100 ㎕씩 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ', '지카 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅲ', '뎅기 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅲ' 및 '소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)'이 각각 코팅되어 있는 플레이트에 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% PBS/T 용액을 이용하여 각각의 웰(Well)을 3회 세척해 주었다. 그 다음 HRP가 연결된 염소의 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 같은 방법으로 세척하였다. 이후 HRP의 기질인 TMB 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 상온에서 15분 동안 반응시켜 발색반응을 확인하였다. 그 다음 반응종결용액(Stop solution)인 0.5 N H₂SO₄ 용액 100 ㎕씩을 각각의 웰에 분주하여 반응을 종결시켰다. 서로 다른 단백질에 대한 단일클론항체의 반응성 수치화를 위해 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. In order to confirm that the monoclonal antibody isolated and purified through <Example 6> specifically binds (or reacts) only to the'envelop protein domain II of the Chikungunya virus', it does not bind or react with other proteins. An enzyme immunosorbent test plate prepared in the same manner as in <Example 2> was used. 100 µl of a monoclonal antibody against the'envelop protein domain II of Chikungunya virus' isolated and purified through <Example 6> at a concentration of 100 nM,'envelop protein domain II of Chikungunya virus'and'Zika virus. The envelope protein domain III of', the envelope protein domain III of the dengue virus', and the'Bovine serum albumin (BSA)' were dispensed into plates coated respectively and reacted at 37°C for 1 hour. After the reaction was over, each well was washed 3 times using a 0.1% PBS/T solution. Then, HRP-linked goat anti-mouse IgG was dispensed into each well, reacted at 37°C for 1 hour, and washed in the same manner. Thereafter, 100 µl of TMB solution, a substrate of HRP, was dispensed into each well and reacted at room temperature for 15 minutes to confirm a color development reaction. Then, 100 μl of a 0.5 NH ₂ SO ₄ solution, which is a stop solution, was dispensed into each well to terminate the reaction. To quantify the reactivity of monoclonal antibodies against different proteins, absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 6>으로부터 분리 및 정제된 단일클론항체가 다른 바이러스의 외피단백질과는 결합(반응)하지 않으며, '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에만 특이적으로 결합(반응)하는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, the monoclonal antibody isolated and purified from <Example 6> did not bind (react) with the envelope protein of another virus, and was specific only to the'envelope protein domain II of Chikungunya virus'. It was confirmed that it was bound (reacted) as an enemy.

본 발명의 상기 하이브리도마 세포주를 'Hybridoma CE2-5'로 명명하였으며, 'Hybridoma CE2-5'로부터 생산된 단일클론항체는 해리상수가 10 나노몰(nM) 미만으로 결합친화도가 매우 높고, 다른 단백질과는 결합 또는 반응하지 않는 동시에 '치쿤군야 바이러스의 외피단백질 도메인 Ⅱ'에만 특이적으로 결합 또는 반응하는 단일클론항체로 특정지었다. 따라서 본 발명자들은 'Hybridoma CE2-5' 세포주의 추가적인 배양 후에 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하여, 2019년 9월 5일자 수탁번호 KCTC 13939BP를 부여받았다.The hybridoma cell line of the present invention was named'Hybridoma CE2-5', and the monoclonal antibody produced from'Hybridoma CE2-5' has a very high binding affinity with a dissociation constant of less than 10 nanomolar (nM), It was characterized as a monoclonal antibody that does not bind or react with other proteins and at the same time specifically binds or reacts only to the'envelop protein domain II of the Chikungunya virus'. Therefore, the present inventors deposited the'Hybridoma CE2-5' cell line after additional cultivation to the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) and received the accession number KCTC 13939BP as of September 5, 2019.

이제까지 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains so far will be able to understand that the present invention may be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative point of view rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.

한국생명공학연구원 생물자원센터Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center KCTC13939BPKCTC13939BP 2019090520190905

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain II of chikungunya virus, hybridoma cell line producing the same and use thereof <130> NPDC-81306 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide Sequence of Chikungunya Virus Envelope Protein Domain II <400> 1 Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val 20 25 30 Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile 35 40 45 Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp 50 55 60 Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg 65 70 75 80 Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr 85 90 95 Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr 100 105 110 Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro 115 120 125 Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg 130 135 140 Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro 165 170 175 Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val 180 185 190 Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu 195 200 205 Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln 210 215 220 Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro 225 230 235 240 Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His 245 250 255 Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg 260 265 270 Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr 275 280 285 Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro 290 295 300 Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr 325 330 335 Lys Tyr Trp Pro Gln 340 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal antibody with specificity for the envelope protein domain II of chikungunya virus, hybridoma cell line producing the same and use thereof <130> NPDC-81306 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide Sequence of Chikungunya Virus Envelope Protein Domain II <400> 1 Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val 20 25 30 Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile 35 40 45 Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp 50 55 60 Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg 65 70 75 80 Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr 85 90 95 Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr 100 105 110 Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro 115 120 125 Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg 130 135 140 Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro 165 170 175 Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val 180 185 190 Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu 195 200 205 Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln 210 215 220 Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro 225 230 235 240 Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His 245 250 255 Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg 260 265 270 Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr 275 280 285 Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro 290 295 300 Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr 325 330 335 Lys Tyr Trp Pro Gln 340

Claims

A monoclonal antibody, characterized in that it is produced by hybridoma cells of accession number KCTC 13939BP and specifically binds to the envelope protein domain II of the Chikungunya virus, and is an IgG _2a isotype.

delete

The method of claim 1,
The monoclonal antibody is a monoclonal antibody, characterized in that it binds to the envelope protein domain II of the Chikungunya virus with a dissociation constant of 1.61×10 ^-10 to 1.61×10 ^-8 mol (M).

Hybridoma cells of accession number KCTC 13939BP producing a monoclonal antibody of the IgG _2a isotype that specifically binds to the envelope protein domain II of the chikungunya virus.

A composition for detection of chikungunya virus or diagnosis of chikungunya virus infection comprising the monoclonal antibody of claim 1.

A kit for detecting chikungunya virus or diagnosing chikungunya virus infection comprising the monoclonal antibody of claim 1.

The monoclonal antibody of claim 1 condensed with a label; And a kit for detection of chikungunya virus or for diagnosis of chikungunya virus infection, including a chromogenic substrate.

The monoclonal antibody of claim 1; A secondary antibody condensed with a label capable of binding to the monoclonal antibody of claim 1; And a kit for detection of chikungunya virus or for diagnosis of chikungunya virus infection, including a chromogenic substrate.

The method according to claim 7 or 8,
The markers are mustard beet peroxidase (HRP), alkaline dephosphorylation enzyme (Alkaline phosphatase, AP), glucose oxidase, luciferase, beta-di-galactosidase ( β-D-galactosidase), malate dehydrogenase (MDH), acetylcholinesterase, colloidal gold, metal nanoparticle, silica nanoparticle, organic Organic fluorescent material, fluorescent protein, quantum dot, radioactive material, radioactive material, isotope, dye, carbon nanotube, graphene Kit, characterized in that selected from the group consisting of (Graphene) and fullerene (Fullerene).

The method according to claim 7 or 8,
The chromogenic substrates are DAB (diaminobenzidine), AEC (3-amino-9-ethylcarbazole), BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium), BCIP/INT (5-bromo-4 -chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF (New fuchsin), FRT (Fast Red TR Salt), TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-azino-bis) Kit, characterized in that selected from the group consisting of (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) and OPD (o- phenylenediamine).

A method for detecting chikungunya virus comprising the step of performing an antigen-antibody reaction by contacting the monoclonal antibody of claim 1 with a sample to be checked for the presence of chikungunya virus.

Preparing a sample isolated from a subject suspected of being infected with the chikungunya virus;
Applying the monoclonal antibody of claim 1 to the sample; And
A method of providing information necessary for diagnosis of Chikungunya virus infection, comprising the step of measuring an antigen-antibody response.

The method of claim 12,
The separated sample is a method selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, tissue, tissue lysate, cells, cell lysate, body fluid, saliva, cerebrospinal fluid and urine.

The method of claim 12,
The antigen-antibody reaction was performed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich enzyme immunosorbent assay (Sandwich ELISA), Western blotting, and immune dot blot analysis. (Immunodot blot assay), Immunofluorescence assay (IFA), Immunochemiluminescence assay, Immunohistochemistry, Immunochromatography, Lateral flow immunoassay (LFA) ), Colorimetric immunoassay, Spectrometric immunoassay, Raman spectroscopic immunoassay, Surface plasmon resonance immunoassay, Interferometric immunoassay, and visual measurement The method characterized in that the measurement by a method selected from the group consisting of (Visual assessment).