KR20180131709A - Specific antigen purification method and monoclonal antibody production method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And (c) preparing a monoclonal antibody against the second virus using the antigen of the separated second virus. The present invention also relates to a method for producing a monoclonal antibody against a second virus.
지카 바이러스는 뎅기(Dengue), 황열(Yellow Fever) 바이러스와 같이 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하는 것으로서, 지카 바이러스에 감염되면 발열과 피부발진, 결막염, 근육과 관절통증, 두통 등의 가벼운 감기증상이 2~7일 정도 나타난다. 증상이 가벼워 감염 사실을 모르고 지나가는 경우도 있으며 치사율도 낮은 편이다. 하지만 신생아의 소두증이나 신경학적 합병증을 일으킬 가능성이 제기되었고, 브라질에서는 2015년 5월에는 지카 바이러스의 첫 사례가 보고된 이후 2016년 1월까지 200명 이상의 소두증이 확인된 상태이다. 그러나, 현재 적절한 치료제이나 백신이 없어 예방할 수 없는 상황이다. Zikavirus belongs to the Flaviviridae family, such as Dengue and Yellow Fever viruses. When Zikavirus is infected, it causes fever, skin rash, conjunctivitis, mild cold symptoms such as muscle and joint pain, headache It appears for 2 ~ 7 days. Symptoms are mild and sometimes they pass without knowing the fact of infection and their mortality rate is low. However, there is a possibility of causing microcephaly or neurological complications in newborn babies. In Brazil in 2015, after the first case of Zicca virus reported in May 2015, more than 200 microcephaly have been confirmed by January 2016. However, there is currently no appropriate remedy or vaccine to prevent it.
또한, 지카 바이러스는 모기를 매개로 한 감염뿐만이 아니라, 사람간의 수혈 또는 성관계와 같이 체액을 통해서도 전염되는 것으로 알려지면서, 전염에 대한 공포가 확산되고 있으며, 지카 바이러스의 감염이 의심되는 경우 지카 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법 또한 절실한 상황이다.In addition, it is known that Zikavirus is spread not only through mosquito-borne infection but also through body fluids such as human transfusion or sexual intercourse. Fear of spreading is spreading, and if Zikavirus infection is suspected, How to diagnose whether the situation is also in urgent need.
플라비바이러스 감염에 대한 진단에서는 비구조단백질 NS1의 중요성이 부각되고 있다. NS1 단백질은 약 50 kDa의 당단백질(glycoprotein)로 플라비바이러스에서 서열상의 유사성이 매우 높다. 명확한 기능이 밝혀져 있지는 않지만 바이러스 RNA의 복제(replication)에 관련 있는 것으로 알려져 있다. NS1은 감염된 세포에서 세포 밖으로 분비되는 형태가 존재하며, 바이러스 감염 환자의 혈액에서 관찰이 될 정도로 높은 농도가 분비된다. 감염 후 9일 까지도 혈액에서 관찰되기 때문에 플라비바이러스 감염을 진단하기 위한 좋은 후보물질로 알려져 있다.In the diagnosis of Flavivirus infections, the importance of non-pristine protein NS1 has been highlighted. The NS1 protein is a glycoprotein of about 50 kDa and has very high sequence similarity in Flaviviruses. Although the exact function is not known, it is known to be involved in the replication of viral RNA. NS1 is secreted out of cells in infected cells and secretes high enough to be observed in the blood of patients with viral infection. It is known as a good candidate for diagnosing Flavivirus infection because it is observed in blood even up to 9 days after infection.
이러한 상황에서 지카 바이러스에 특이적인 단일클론 항체를 제작하는 것이 중요하나, 단일클론항체를 제작함에 있어 항원(antigen)-항체(antibody) 반응의 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)는 면역원(immunogen)의 품질(quality)에 영향을 받는 문제가 있다. In this context, it is important to produce monoclonal antibodies specific for Zikavirus, but sensitivity and specificity of antigen-antibody reactions in the production of monoclonal antibodies may be affected by immunogen ) Is affected by the quality of the product.
최근 바이러스 항원으로서 실험적으로 보편화된 박테리아 발현시스템(E.Coli)을 사용하거나, 곤충세포 발현시스템(baculovirus vector-insect cell system)을 사용한 재조합단백질을 사용한다. 그러나 E. Coli에서 발현되는 재조합단백질은 원래 바이러스의 구조(native structure)와 당화과정(protein glycosylation)과 같은 특성이 결여되는 경향이 있다. 따라서 이 재조합 단백질을 이용하여 만든 단일클론 항체의 민감도가 감소할 수 있다. 또한 곤충세포 발현시스템을 이용한 재조합단백질은 동물세포의 당화패턴(glycosylation pattern)이 다르기 때문에 민감도에 영향을 미치는 문제점이 있다. Recently, a bacterial expression system ( E. coli ), which is experimentally common as a virus antigen, is used, or a recombinant protein using a baculovirus vector-insect cell system is used. However, the recombinant proteins expressed in E. coli tend to lack characteristics such as native structure and protein glycosylation. Therefore, the sensitivity of a monoclonal antibody made using this recombinant protein may be reduced. In addition, the recombinant protein using the insect cell expression system has a problem of affecting the sensitivity because the glycosylation pattern of the animal cell is different.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 플라비바이러스과에서 서열상의 유사상이 매우 높은 NS1 단백질을 이용하여 네이티브 바이러스 항원를 정제하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 비구조 단백질인 NS1을 이용하여 네이티브 바이러스를 정제하는 방법을 개발하고, 이의 방법을 이용하여 정제된 네이티브 바이러스 항원을 이용하여 민감도가 좋은 단일클론항체를 제조하는 방법을 고안하여, 본 발명을 완성하였다.Under these circumstances, the present inventors have made intensive researches to develop a method for purifying a native virus antigen using NS1 protein having a very similar sequence in the flaviviruses, and as a result, it has been found that NS1, which is a nonstructural protein, And a method for producing a highly sensitive monoclonal antibody using the purified native virus antigen using the method has been developed and the present invention has been completed.
본 발명의 주된 목적은 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to provide a method for producing an antigen-antibody complex comprising the steps of (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And (c) preparing a monoclonal antibody against the second virus by using the antigen of the separated second virus. The present invention also provides a method for producing a monoclonal antibody against a second virus.
본 발명의 다른 목적은 (a) 상기 방법으로 정제된 제2바이러스 항원에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제조하고 이로부터 단일클론 항체를 생산하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 제2바이러스에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하는 단계; (c) 상기 (b)단계로부터 선별된 단일클론 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody, which comprises (a) preparing a fusion cell producing a monoclonal antibody against a second viral antigen purified by the above method, and producing a monoclonal antibody therefrom; (b) selecting an antibody having high reactivity to the second virus in the step (a); (c) isolating the monoclonal antibody selected from step (b) above.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 단일클론 항체를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a monoclonal antibody produced by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편을 포함하는, 제2 바이러스의 감염 검출을 위한 진단 키트를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a diagnostic kit for the detection of infection of a second virus comprising said monoclonal antibody or an immunologically active fragment thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 있어, 상기 조성물 또는 키트의 용도를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide the use of the composition or kit in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계; (d) 상기 제조된 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 이용하여 제2바이러스 감염 검출하는 단계를 포함하는, 제2 바이러스의 감염 검출을 위한 진단 키트 제조방법을 제공하는 것이다. Yet another object of the present invention is to provide a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; (c) preparing a monoclonal antibody against the second virus using the separated second virus antigen; (d) detecting a second viral infection by using the monoclonal antibody against the second virus prepared in the step (a).
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계를 통해 분리된 제2바이러스 항원의 반응성을 확인하는 단계를 포함하는, 제2바이러스 항원을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And (c) confirming the reactivity of the second virus antigen separated through the step (b).
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in the present invention can be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. Further, the scope of the present invention is not limited by the detailed description described below.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to generate an antigen- (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And (c) preparing a monoclonal antibody against the second virus by using the antigen of the second virus thus isolated. The present invention also provides a method for producing a monoclonal antibody against a second virus.
상기 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면, 먼저 (a) 단계는 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계이다. Specifically, each step of the method for producing the monoclonal antibody against the second virus will be described in detail. First, in step (a), an antibody binding to the antigenic site of the first virus and a culture solution of the second virus are reacted to produce an antigen - < / RTI > antibody complex.
본 발명의 목적상 제2바이러스는 본 발명에서 최종적으로 제조하고자 하는 목적항체를 생산할 수 있는 바이러스에 해당하는 것이며, 제1바이러스는 제2바이러스의 항원 부위와 일정수준 이상의 상동성을 가져 제2바이러스에 대한 항체를 생성시키는데 이용될 수 있는 바이러스를 의미한다. 상기 제1바이러스는 공지된 항체가 다수 존재하는 것이 바람직하며, 제2바이러스는 항체가 거의 알려져 있지 않아, 그에 따라 친화도 및 민감도가 높은 항체 개발이 필요한 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. For the purpose of the present invention, the second virus corresponds to a virus capable of producing the target antibody to be finally produced in the present invention, and the first virus has homology with an antigenic site of the second virus at a level equal to or higher than that of the second virus, ≪ RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI > Preferably, the first virus is a plurality of known antibodies, and the second virus may be a virus that is hardly known and therefore requires development of an antibody having high affinity and sensitivity.
본 발명에서 제1바이러스는 제2바이러스와 결합할 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로, 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체를 제2바이러스와 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시킬 수 있는 것을 의미한다. 상기 제1바이러스는 분리하고자 하는 제2바이러스의 항원에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 제2바이러스 항원으로서 지카바이러스를 분리하고자 하는 경우에 있어서 제1바이러스는 제2바이러스인 지카바이러스와 항원-항체 복합체를 형성할 수 있는 것으로 뎅기바이러스 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 당업자는 분리하고자 하는 제2바이러스의 항원의 종류에 따라 적절한 제1바이러스를 선택할 수 있고, 이는 당업계에서 공지된 범위내에서라면 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것으로, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 제1바이러스는 공지된 항체가 다수 존재하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the first virus means capable of binding with the second virus. Specifically, it means that an antibody that binds to an antigenic site of a first virus can be reacted with a second virus to generate an antigen-antibody complex. The first virus may vary depending on the antigen of the second virus to be separated. For example, in the present invention, when a chickavirus is to be isolated as a second viral antigen, the first virus may be a Dengue virus, which is capable of forming an antigen-antibody complex with a second virus, . Therefore, a person skilled in the art can select a suitable first virus according to the type of antigen of the second virus to be separated, and it is within the scope of the present invention within the range known to those skilled in the art. It does not. In addition, the first virus preferably has a plurality of known antibodies, but is not limited thereto.
상기 제1바이러스의 항원부위는 비구조 단백질인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 NS1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 그 목적에 따라 적절한 비구조 단백질을 선택하여 적용할 수 있다.The antigenic site of the first virus may be a non-structural protein, more specifically NS1, but is not limited thereto. Those skilled in the art can select and apply suitable non-structural proteins according to the purpose.
본 발명에서 용어 "비구조 단백질(non-structural protein)"은 바이러스에 의해 암호화되는 단백질로서, 구체적으로 비구조 단백질은 플라비바이러스과에 속하는 바이러스의 비구조 단백질을 의미하는 것으로, 본 발명에서 비구조 단백질은 비구조 단백질 1 (NS1)을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 NS1은 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 황열 바이러스의 NS1인 것을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 플라비 바이러스의 감염 진단에서 비구조 단백질 NS1의 중요성이 부각되고 있으며, 구체적으로 뎅기바이러스의 NS1은 면역 회피, 병인 발생 및 바이러스 복제에서 별개의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, NS1 단백질은 약 50 kDa의 당단백질(glycoprotein)로 플라비바이러스과에서 서열상의 유사성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. In the present invention, the term " non-structural protein " is a protein encoded by a virus. Specifically, the non-structural protein refers to a non-structural protein of virus belonging to Flaviviridae. The protein refers to nonstructural protein 1 (NS1), but is not limited thereto. Also, NS1 of the present invention means NS1 of dengue fever virus, zicavirus, yellow fever virus, but is not limited thereto. For example, the importance of nonstructural protein NS1 has been emphasized in the diagnosis of Flavivirus infection. Specifically, NS1 of Dengue virus is known to function differently in immune avoidance, pathogenesis and viral replication. In addition, the NS1 protein is a glycoprotein of about 50 kDa and is known to have a very high sequence similarity in flaviviruses.
본 발명의 용어 "플라비바이러스과(Flaviviridae)"는 바이러스의 한 과로서, 인간을 비롯한 포유류 등을 자연숙주로 삼으며, 진드기와 모기 등의 곤충을 매개로 하여 전파되는 특징을 갖는다. 플라비바이러스과에 속하는 바이러스가 일으키는 질병으로는 간염, 출혈 증후군, 유산, 점막병, 출혈열, 뇌염 등이 있으며, 플라비바이러스과에 속하는 바이러스 종은 현재 100종 이상인 것으로 알려져 있으며, 구체적으로는 뎅기바이러스, 황열바이러스, 지카바이러스, 웨스트나일바이러스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. The term " Flaviviridae " according to the present invention is a virus, which is used as a natural host for humans and other mammals, and is characterized in that it spreads via insects such as mites and mosquitoes. Viruses belonging to Flaviviridae include hepatitis, hemorrhagic syndrome, abortion, mucous membrane disease, hemorrhagic fever, encephalitis, etc. The viruses belonging to Flaviviridae are currently known to have more than 100 species, Yellow fever virus, Zicca virus, West Nile virus, and the like.
상기 제1바이러스와 제2바이러스는 서로 다른 종인 것을 특징으로 한다. 구체적으로 제1바이러스와 제2바이러스는 플라비바이러스과에 속하는 것으로 같은 속에 속할 수 있으나, 뎅기바이러스, 황열바이러스, 지카바이러스, 웨스트나일바이러스 등은 다른 종에 속하는 것이다. Wherein the first virus and the second virus are different species. Specifically, the first virus and the second virus belong to the same species belonging to the Flaviviridae, but Dengue virus, Yellow fever virus, Zikavirus, West Nile virus and the like belong to different species.
즉, 본 발명은 대상 바이러스의 항원을 명확히 알지 못하는 경우에도 아종 바이러스에 의해 분리된 항원을 이용해 명확히 알지 못하였던 목적 항원을 정확히 분리 및 이에 대한 결합력이 보다 증가된 항체를 제조한 것에 그 특징이 있으며, 이와 같은 제조방법은 본 발명자에 의해 최초로 규명되었다.That is, the present invention is characterized in that, even when the antigen of the target virus is not clearly known, the target antigen that has not been clearly known by using the antigen separated by the subspecies virus is accurately separated and the antibody with increased binding force is produced , And such a production method was first identified by the present inventors.
상기 제1바이러스는 뎅기바이러스일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 그 목적에 따라 적절한 제1바이러스를 선택하여 적용할 수 있다.The first virus may be Dengue virus, but it is not limited thereto, and a person skilled in the art can select and apply appropriate first virus according to its purpose.
상기 제2바이러스는 지카바이러스 또는 황열바이러스일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 그 목적에 따라 적절한 제1바이러스를 선택하여 적용할 수 있다.The second virus may be zicavirus or yellow fever virus, but the present invention is not limited thereto, and a person skilled in the art can select and apply appropriate first virus according to the purpose.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 지카 바이러스의 비구조단백질1(NS1)을 분리/정제하기 위하여 지카바이러스와 뎅기 바이러스의 비구조단백질(NS1)의 서열 비교를 수행하였다(도 2).In a specific embodiment of the present invention, a sequence comparison of Zikavirus and non-digestive protein (NS1) of dengue virus was performed to isolate / purify non-crude proteinaceous 1 (NS1) of Zikavirus (Figure 2).
본 발명의 용어, "항원-항체 복합체"는 제1바이러스의 항원부위와 결합하는 항체와 제2바이러스의 항원이 결합하여 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 구체적으로 제1바이러스의 항원부위와 결합하는 항체와 제2바이러스의 항원 복합체는 제1바이러스와 제2바이러스 간의 서열 상동성이 있거나, 제1바이러스와 제2바이러스 간의 특정 단백질의 상동성이 있거나 하는 특징이 있다면 복합체를 형성할 수 있으므로, 복합체 형성과정에 특별히 제한되지 않는다. The term " antigen-antibody complex " of the present invention means that an antibody that binds to an antigenic site of a first virus binds to an antigen of a second virus to form a complex. Specifically, the antigen complex of the antibody binding to the antigenic site of the first virus and the second virus has the sequence homology between the first virus and the second virus, or has homology to the specific protein between the first virus and the second virus If it is a feature, it can form a complex, so that the complex formation process is not particularly limited.
다만, 본 발명의 목적상 제1바이러스의 항원부위와 결합하는 항체와 제2바이러스의 항원 복합체는 제1바이러스와 제2바이러스 간의 서열 상동성이 50% 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는 상기 서열 상동성이 60% 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열 상동성이 70% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. However, for the purpose of the present invention, the antigenic complex of the antibody binding to the antigenic site of the first virus and the second virus may have a sequence homology of 50% or more between the first virus and the second virus, but the present invention is not limited thereto. Specifically, the sequence homology may be 60% or more, and more specifically, the sequence homology may be 70% or more, but is not limited thereto.
본 발명에서 제2바이러스는 제1바이러스의 항체와 항원-항체 복합체를 생성할 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로는 제1바이러스의 항체와 항원-항체 복합체를 생성하여 제2바이러스의 항원을 정제한 뒤, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는데 이용될 수 있는 바이러스를 한다. 전술한 바와 같이 제1바이러스의 항원부위와 결합된 항체와 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업자가 분리하고자 목적하는 바이러스로서 그 종류가 제한되지 않으며 당업자는 그 목적에 따라 적절한 제2바이러스를 선택하여 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상 제2바이러스는 항체가 거의 알려져 있지 않아, 그에 따라 친화도 및 민감도가 높은 항체 개발이 필요한 바이러스이면 제한 없이 이용 가능하다. In the present invention, the second virus means that an antibody of the first virus can generate an antigen-antibody complex. Specifically, an antigen of the first virus and an antigen-antibody complex are generated to purify the antigen of the second virus, and thereafter, a virus that can be used for preparing a monoclonal antibody against the second virus. As long as it is capable of forming a complex with an antibody bound to the antigenic region of the first virus as described above, the type of the virus to be separated by those skilled in the art is not limited, and a person skilled in the art, Viruses can be selected and applied. For the purpose of the present invention, the second virus can be used without limitation as long as the antibody is hardly known, and thus a virus requiring development of an antibody having high affinity and sensitivity.
본 발명의 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법에서, (b) 단계는 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계이다. In the method for producing the monoclonal antibody against the second virus of the present invention, step (b) is a step of separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex.
특히, (b) 단계에서 제2바이러스의 항원을 분리하는 것은, 분리과정에서 당업계에 알려진 분리 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 분리과정은 선택되는 바이러스에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.In particular, the separation of the antigen of the second virus in step (b) can be performed according to the separation conditions known in the art in the separation process. Such a separation process can be easily adjusted by those skilled in the art depending on the virus to be selected.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 방법을 사용하여 제1바이러스 항체인 항-뎅기 NS1 항체와 제2바이러스 항원인 지카 바이러스 및 황열 바이러스가 결합된 복합체를 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)시킨 뒤, 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/5 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0 ~ 7.5가 되도록 보정하고, 용출된 단백질은 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하는 과정을 거쳐 제2바이러스 항원인 지카 바이러스 항원 및 황열 바이러스 항원을 분리하였다. In one specific embodiment of the present invention, the method of the present invention is used to immobilize a complex of anti-dengue NS1 antibody, which is a first virus antibody, with zicavirus and yellow fever virus, which is a second virus antigen, in glycine solution ), And then the pH was adjusted to 7.0 to 7.5 by adding Tris (pH 9.0) solution to 1/5 volume of the eluate. The eluted protein was dissolved in phosphate buffered saline , PBS), and the second viral antigens Zikavir antigen and the yellow fever virus antigen were isolated.
상기 (b) 단계에서 분리된 제2바이러스 항원의 반응성을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리된 제2바이러스 항원의 반응성 확인은 전기영동 또는 웨스턴블롯을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 당업자는 적절한 반응성 확인 방법을 선택하여 적용할 수 있다.And further confirming the reactivity of the second virus antigen isolated in step (b). Confirmation of the reactivity of the separated second virus antigen can be performed by electrophoresis or Western blot, but it is not limited thereto, and a person skilled in the art can select and apply an appropriate method for confirming the reactivity.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 방법을 사용하여 제1바이러스 항체인 항-뎅기 NS1 항체와 제2바이러스 항원인 지카 바이러스가 결합된 복합체에서 제2바이러스 항원인 지카 바이러스 항원을 분리한 뒤, 전기영동과 웨스턴블랏(western blot)을 이용하여 반응성을 확인하였다(도 4 및 도 5). In a specific embodiment of the present invention, the method of the present invention is used to isolate a second viral antigen, Zikavir antigen, from a complex in which a first virus antibody, an anti-dengue NS1 antibody, and a second virus antigen, Then, the reactivity was confirmed using electrophoresis and western blot (FIGS. 4 and 5).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 방법을 사용하여 제1바이러스 항체인 항-뎅기 NS1 항체와 제2바이러스 항원인 황열 바이러스가 결합된 복합체에서 제2바이러스 항원인 황열 바이러스 항원을 분리한 뒤, 전기영동과 웨스턴블랏(western blot)을 이용하여 반응성을 확인하였다(도 6). In a specific embodiment of the present invention, the method of the present invention is used to detect a yellow virus virus antigen, which is a second viral antigen, in a complex in which a first virus antibody, anti-dengue NS1 antibody, and a second virus antigen, After the separation, the reactivity was confirmed using electrophoresis and western blot (Fig. 6).
본 발명의 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법에서, (c) 단계는 (b) 단계로부터 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계이다. In the method for producing the monoclonal antibody against the second virus of the present invention, step (c) is a step of preparing a monoclonal antibody against the second virus using the antigen of the second virus isolated from step (b) .
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 방법을 이용하여 정제된 제2바이러스에 특이적인 단일클론 항체를 제조하였으며, 상기 방법으로 제조된 주요 단일클론 항체의 면역친화도(K)및 반응성 여부를 확인하였다(표 1). 또한, 기존의 재조합 단백질 보다 더 높은 면역친화도(K)를 갖음을 확인하였다(표 2).In a specific embodiment of the present invention, a monoclonal antibody specific for the purified second virus was prepared using the method of the present invention, and the immunoaffinity (K) and reactivity of the major monoclonal antibody prepared by the method (Table 1). In addition, it was confirmed that the recombinant protein had higher immunoaffinity (K) than the existing recombinant protein (Table 2).
그 결과, 본원발명의 방법으로 제조된 단일클론 항체가 지카 감염 환자의 혈액내에 존재하는 지카 비구조단백질1(NS1) 항원을 효과적으로 결합을 할 수 있음을 알 수 있었다. As a result, it was found that the monoclonal antibody produced by the method of the present invention effectively binds to the zykovic reproductive protein 1 (NS1) antigen present in the blood of a patient infected with Ziza infection.
이는, 본원발명으로 제조된 제2바이러스의 단일클론 항체는 제2바이러스의 항원과 효과적인 결합을 통해 제2바이러스 감염 진단시 민감성과 정확성을 획기적으로 높여 줄 수 있음을 시사하는 것이다. This suggests that the monoclonal antibody of the second virus prepared according to the present invention can dramatically increase the sensitivity and accuracy in diagnosing the second viral infection through effective binding with the antigen of the second virus.
더욱이 기존의 재조합 단백질보다 더 높은 친화도를 갖는 것을 확인하였는바, 이는 기존의 재조합 단백질을 이용하여 만든 단일클론 항체의 민감도가 감소할 수 있는 단점을 극복할 수 있으며, 적절한 치료제이나 백신이 없어 예방할 수 없는 바이러스에 특이적인 항체를 제작하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. Furthermore, it has been confirmed that the antibody has higher affinity than the existing recombinant protein, which can overcome the disadvantage that the sensitivity of the monoclonal antibody made using the existing recombinant protein can be reduced, But also for the production of antibodies specific for viruses that can not be detected.
본 발명에서 상기 (c) 단계의 단일클론 항체를 제조하는 방법은 (ⅰ) 제1항의 방법으로 정제된 제2바이러스 항원에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제조하고 이로부터 단일클론 항체를 생산하는 단계; (ⅱ) 상기 (ⅰ)단계에서 제2바이러스에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 (ⅱ)단계로부터 선별된 단일클론 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. In the present invention, the method for producing the monoclonal antibody of step (c) comprises the steps of: (i) preparing a fusion cell producing monoclonal antibody against the second viral antigen purified by the method of
상기 단일클론 항체를 생산하는 방법은 일반적으로 단일클론 항체를 제작하는 방법이면 이에 제한되지 않는다. The method for producing the monoclonal antibody is not limited to a method for producing a monoclonal antibody in general.
구체적으로, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 단일클론 항체는 통상적인 단일클론 항체와 마찬가지로, 본 발명에서 제공하는 단일클론 항체 역시 2개의 전체 길이의 중쇄 및 2개의 전체 길이의 경쇄로 구성된다. 상기 중쇄 및 경쇄는 특별이 제한되지 않는다. Specifically, the monoclonal antibody produced by the method of the present invention, like the conventional monoclonal antibody, consists of two full-length heavy chains and two full-length light chains as well as the monoclonal antibody provided in the present invention. The heavy chain and the light chain are not particularly limited.
또한, 본 발명에서 제공하는 단일클론 항체는 당해 분야에 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일 례로서, 화학적 펩티드 합성방법으로 제조할 수도 있고, 상기 단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수도 있으며, 상기 단일클론 항체의 면역원을 동물에 주사하여 얻어진 림프구로부터 유래된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수도 있고, 다른 예로서, 상기 단일클론 항체가 특이적으로 결합되는 미분화된 치수줄기세포로부터 유래된 단백질을 면역원으로 동물에 접종하고, 상기 동물로부터 얻어진 림프구를 사용하여 제작된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수 있다.In addition, monoclonal antibodies provided by the present invention can be prepared by methods known in the art. For example, it may be prepared by a chemical peptide synthesis method, or may be prepared by amplifying the gene encoding the monoclonal antibody by PCR (polymerase chain reaction) or by synthesizing it by a known method and then cloning it into an expression vector for expression And may be produced using a hybridoma cell line derived from a lymphocyte obtained by injecting an immunogen of the above monoclonal antibody into an animal. Alternatively, the monoclonal antibody may be prepared from an undifferentiated stem cell to which the monoclonal antibody is specifically bound Can be prepared using a hybridoma cell line prepared by inoculating the animal with the resulting protein as an immunogen and using a lymphocyte obtained from the animal.
본 발명의 용어 "하이브리도마 세포주"란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일 클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다. The term " hybridoma cell line " of the present invention refers to a cell made by artificially fusing two different kinds of cells, using a substance causing cell fusion such as polyethylene glycol or a virus of any kind, Means a cell or cell line in which cells are fused to integrate different functions of different cells into one cell. In particular, hybrid myeloma cells and B cells, the precursor cells of antibody-producing cells among the lymphocytes in the spleen or lymph nodes, are used to produce monoclonal antibodies, which are widely used in research and clinical applications. In addition, T cells that produce lymphocaine (physiologically active substance) and hybrid cells that are tumor cells thereof have been put to practical use.
상기 단일클론 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 이들을 구성하는 일부 아미노산 서열이 변이된 형태 또는 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. The monoclonal antibody may be a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains as well as a form in which some amino acid sequences constituting them are mutated or functional fragments of antibody molecules .
단백질 및 폴리펩티드에서, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이며, 이러한 교환에 의하여 본 발명에서 제공하는 단일클론 항체의 아미노산 서열로부터 변이된 서열의 단일클론 항체가 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 상기 단일클론 항체의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 항체 활성이 증가한 변이된 단일클론 항체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.In proteins and polypeptides, amino acid exchanges that do not globally alter the activity of the molecule are known in the art. The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly. Clonal antibodies may be included within the scope of the present invention. In addition, monoclonal antibodies having mutations in which the structural stability against the heat, pH, etc. of the monoclonal antibody or the antibody activity is increased due to mutations or modifications in the amino acid sequence may be included in the scope of the present invention.
항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 일 례로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.The functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and examples thereof may be Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 방법으로 정제한 지카 바이러스 항원을 이용하여 지카 바이러스 비구조단백질1(NS1) 특이 단일클론 항체를 제조하였고, 본 발명을 통하여 개발된 주요 단일클론 항체의 아형(isotype), 면역친화도(K), 그리고 분리한 지카 바이러스와의 반응성 여부를 확인하였다(표 1). In one specific embodiment of the present invention, a zikaviravir protein 1 (NS1) -specific monoclonal antibody was prepared using the zikavirus antigen purified by the above method, and the isotype of the major monoclonal antibody developed through the present invention ), Immunoaffinity (K), and reactivity with isolated zykova virus (Table 1).
이를 통해 본 발명에 의한 방법으로 정제된 항원을 이용하여 단일클론 항체를 생산하는 경우, 네이티브 바이러스의 본 모습 그대로 유지된 3차 구조와 구조적 항원 결정기(conformational epitope)를 잘 인식하는 단일클론항체를 제작할 수 있음을 알 수 있다.Thus, when monoclonal antibodies are produced using purified antigens according to the method of the present invention, monoclonal antibodies capable of recognizing the tertiary structure and the conformational epitope of the native virus are produced .
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 제조방법으로 제조된 단일클론 항체는 제2 바이러스의 감염 검출을 위한 진단 키트를 제공한다. In another aspect of the present invention, the monoclonal antibody produced by the above production method provides a diagnostic kit for detecting infection of a second virus.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계; (d) 상기 제조된 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 이용하여 제2바이러스 감염 검출하는 단계를 포함하는, 제2바이러스의 감염 검출을 위한 진단 키트 제조방법을 제공한다. Another aspect of the present invention is a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; (c) preparing a monoclonal antibody against the second virus using the separated second virus antigen; (d) detecting a second viral infection by using the monoclonal antibody against the second virus prepared in the step (a).
상기 제1바이러스의 항원부위, 제2바이러스, 항원-항체 복합체, 단일클론 항체는 앞서 설명한 바와 같다.The antigenic site of the first virus, the second virus, the antigen-antibody complex, and the monoclonal antibody are as described above.
본 발명의 다른 양태는 (a) 제1바이러스의 항원부위에 결합하는 항체, 및 제2바이러스의 배양액을 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키는 단계; (b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계를 통해 분리된 제2바이러스 항원의 반응성을 확인하는 단계를 포함하는, 제2바이러스 항원을 정제하는 방법을 제공한다. Another aspect of the present invention is a method for producing an antigen-antibody complex, comprising: (a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex; (b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And (c) confirming the reactivity of the second virus antigen separated through the step (b).
상기 제1바이러스의 항원부위, 제2바이러스, 항원-항체 복합체, 제2바이러스 항원의 반응성을 확인은 앞서 설명한 바와 같다.The confirmation of the reactivity of the antigenic site of the first virus, the second virus, the antigen-antibody complex and the second virus antigen is as described above.
본 발명의 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법은 네이티브 바이러스 항원을 이용하여 민감도가 좋은 단일클론항체를 제조할 수 있으므로, 바이러스 감염 진단 키트 및 치료제의 개발연구에 유용하게 사용될 수 있다. The method for producing a monoclonal antibody against the second virus of the present invention can be used for the development of a diagnostic kit for a virus infection and a therapeutic agent since a monoclonal antibody having high sensitivity can be produced using a native virus antigen.
도 1은 항 뎅기 NS1항체를 이용하여 지카 바이러스를 정제하는 일반적인 모식도이다.
도 2는 지카 바이러스와 뎅기 바이러스의 비구조단백질(NS1)의 서열 비교를 나타내는 것이다
도 3은 베로세포(Vero, ATCC CCL81)에 지카 바이러스가 감염되기 전과 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 항 뎅기 NS1항체를 이용하여 정제한 지카 바이러스 비구조단백질(NS1)을 전기영동을 통해 확인한 것이다.
도 5는 항 뎅기 NS1항체를 이용하여 정제한 지카 바이러스 비구조단백질 (NS1)을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 것이다.
도 6은 항 뎅기 NS1항체를 이용하여 정제한 황열 바이러스 비구조단백질 (NS1)을 전기영동을 통해 확인한 것이다. 1 is a general schematic diagram of purification of zikavirus using anti-dengue NS1 antibody.
Figure 2 shows a sequence comparison of non-digestive protein (NS1) of Zicca virus and dengue virus
Fig. 3 shows the results before and after infecting Vero cells (Vero, ATCC CCL81) with zikavirus.
FIG. 4 shows electrophoresis of the chick virus avirulent protein (NS1) purified using anti-dengue NS1 antibody.
FIG. 5 is a Western blot image showing the zikaviravuga crude protein (NS1) purified using anti-dengue NS1 antibody.
FIG. 6 shows the results of electrophoresis of yellow fever virus non-crude protein (NS1) purified using anti-dengue NS1 antibody.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 목적하는 바이러스 항원의 정제 1. Purification of the desired viral antigen
실시예Example 1-1. 1-1. 지카바이러스와Chica virus and 뎅기Dengue 바이러스의 Virus 비구조단백질(NS1)의Of non-vegetable crude protein (NS1) 서열 비교 Sequence comparison
뎅기바이러스와 지카바이러스는 플라비바이러스과(Flaviviridae)에 속하며, 10개의 단백질로 구성되어 있다. 이들 중 비구조단백질(NS1)은 50% 이상의 상동성을 나타낸다. 따라서 지카 바이러스의 비구조단백질1(NS1)을 분리/정제하기 위하여 선행연구를 통하여 확보된 항-뎅기 NS1 항체(anti-dengue NS1)를 이용하였다. 지카바이러스와 뎅기 바이러스의 비구조단백질(NS1)의 서열 비교는 도 2에 나타내었다.Dengue viruses and zicca viruses belong to the Flaviviridae family, which consists of 10 proteins. Of these, the non-tropic protein (NS1) shows more than 50% homology. Therefore, anti-dengue NS1 (anti-dengue NS1) obtained through previous studies was used to isolate / purify non-crude protein 1 (NS1) of Zicca virus. Sequence comparisons of non-digestive proteins (NS1) of Zika virus and dengue virus are shown in FIG.
실시예Example 1-2. 항- 1-2. term- 뎅기Dengue NS1 항체(anti-dengue NS1)가 The anti-dengue NS1 antibody 결합된Combined 정제 refine 컬럼column 제작 making
미리 반응기가 붙어있는 레진 (CNBr-activated sepharose 4B) 약 2.5g을 1mM HCl 100ml에서 팽윤하여 실온에서 30분 방치 후 유리필터상에서 여과시켰다. 그 후 세파로스 겔(sepharose gel)은 커플링 버퍼(0.5M NaCl이 함유된 0.1M NaHCO3 (pH8.3))로 3회 세척하였다. 이 후 항-뎅기 NS1 항체를 패킹된 겔과 교반기를 이용하여 4℃에서 반응시켰다. 항-뎅기 NS1 항체가 부착된 겔은 겔 부피의 5배 이상 커플링 버퍼로 세척하였다. 블로킹 버퍼(0.1 M Tris-HCl 버퍼, pH 8.0 or 1 M 에탄올아민(ethanolamine), pH 8.0.)로 채운 컬럼을 2시간 동안 상온에서 방치하여 블로킹(blocking)하였으며, 컬럼에 남아있는 에탄올아민을 제거하기 위해 0.5 M NaCl이 함유된 0.1 M 아세트산/초산 나트륨 (pH 4.0)와 0.5 M NaCl가 함유된 0.1 M Tris-HCl (pH 8)로 세척하였다.Approximately 2.5 g of the resin (CNBr-activated sepharose 4B) previously swollen with 100 ml of 1 mM HCl was allowed to stand at room temperature for 30 minutes and then filtered on a glass filter. The sepharose gel was then washed three times with coupling buffer (0.1 M NaHCO 3 (pH 8.3) containing 0.5 M NaCl). The anti-dengue NS1 antibody was then reacted at 4 ° C using a packed gel and a stirrer. The gel with anti-dengue NS1 antibody was washed with coupling buffer at least five times the gel volume. The column filled with blocking buffer (0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 or 1 M ethanolamine, pH 8.0) was blocked for 2 hours at room temperature to remove ethanolamine remaining in the column Was washed with 0.1 M acetic acid / sodium acetate (pH 4.0) containing 0.5 M NaCl and 0.1 M Tris-HCl (pH 8) containing 0.5 M NaCl.
실시예Example 1-3. 1-3. 지카Zika 바이러스 배양 Virus culture
베로 세포(Vero, ATCC CCL81)는 원숭이 신장 유래 세포주로서 미국 American Type Culture Collection사(ATCC; Ma- nassas, VA, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 베로 세포 배양을 위하여 항생제이 첨가된 D-MEM 용액(Dulbecco's Medium)을 사용하였으며, 이때 송아지 혈청액(fetal bovine serum, FBS)을 증식 배지에는 10%, 유지 배지에는 2% 되게 첨가하였다. 베로 세포가 배양접시 바닥에 단층으로 80% 정도 자랐을 때 지카 바이러스를 접종하여 37℃에서 1시간 동안 흡착시켰다. 그 후 접종 액을 제거하고 유지 배지를 첨가하여 37℃, CO2 배양기에서 5일간 배양하면서 세포변형(cyto-pathogenic effect, CPE) 여부를 관찰하였다. 접종 5일 후 세포배양 상층 액만을 회수하여 새로운 베로 세포에서 동일한 방법으로 계대 배양을 반복 실시하였다. 베로 세포에서의 반복 계대는 세포단층에서 세포변형이 완전히 형성될 때까지 반복하였다. 베로 세포에서의 계대가 최종 완료된 후 바이러스 배양액은 소분하여 실험에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다. 베로세포에 지카 바이러스가 감염되기 전과 후의 결과는 도 3에 나타내었다. Vero cells (Vero, ATCC CCL81) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) as a monkey kidney-derived cell line. Dulbecco's Medium supplemented with antibiotics was used for the culture of Vero cells. Fetal bovine serum (FBS) was added to the proliferation medium and the maintenance medium at 10% and 2%, respectively. When Vero cells were grown at the bottom of the culture dish by a single layer of 80%, Zikavirus was inoculated and adsorbed at 37 ° C for 1 hour. After that, the inoculum was removed and a maintenance medium was added. The cells were incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C for 5 days to observe the cyto-pathogenic effect (CPE). Five days after the inoculation, only the cell culture supernatant was recovered, and subculture was repeated in the same manner in the new bero cells. Repeated passages in Vero cells were repeated until the cell deformation was completely formed in the cell monolayer. After the passage in Vero cells was completed, the viral culture was subdivided and stored at -70 ° C until use in the experiment. The results before and after infection of Vero cells with zicavirus are shown in Fig.
실시예Example 1-4. 1-4. 지카Zika 바이러스 virus 비구조Unstructured 단백질(NS1) 정제 Protein (NS1) Purification
지카 바이러스 배양액에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 50%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 8,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18 시간 이상 투석한 후, 20 mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 항-뎅기 NS1 항체가 결합된 레진에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해 주었다. 컬럼에 결합된 단백질은 10 mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)시켰다. 이때 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/5 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0 ~ 7.5가 되도록 보정해 주었다. 용출된 단백질은 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하고, 투석이 끝나면 전기영동과 웨스턴블랏(western blot)을 이용하여 반응성을 확인하고(도 4 및 도 5) 사용 전까지 냉동 보관하였다. The resulting mixture was centrifuged at 8,000 rpm for 30 min. The supernatant was discarded and the precipitate was dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) ≪ / RTI > This suspension was dialyzed in 20 mM phosphate buffer for 18 hours or longer, and the dialyzate was then injected into the resin bound with the anti-dengue NS1 antibody conjugated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). After the injection, the phosphate buffer solution To remove unadsorbed materials. The protein bound to the column was eluted with a solution of 10 mM glycine solution (pH 2.8). At this time, a 1 M Tris (pH 9.0) solution was added in 1/5 volume of the eluate to correct the pH to 7.0-7.5. The eluted proteins were dialyzed in phosphate buffered saline (PBS). After dialysis, the reactivity was confirmed by electrophoresis and western blot (FIGS. 4 and 5) and stored frozen before use.
실시예Example 2. 단일클론 항체의 제작 2. Production of monoclonal antibodies
실시예Example 2-1. 면역화 및 세포 융합 2-1. Immunization and cell fusion
상기의 실시예 1-4에서 준비한 지카 바이러스 비구조단백질1(NS1) 100 μg이 들어 있는 용액과 같은 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트 (complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 6주령 암컷 생쥐 (BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 1/1,000으로 희석하여 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 2주 후에 다시 면역화시켰다. 그 후, 면역화된 쥐에서 비장을 꺼내고, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640 배지에 현탁하고 세포수를 계수하였다. 비장세포 역시 세포수를 계수하였다. 1 X 107개의 골수종 세포와 1 X 108개의 비장세포를 50 ml 용기로 옮겨 RPMI1640 배지를 적당량 첨가한 후 200 X g로 5 분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 RPMI1640 배지에 천천히 흔들어 주면서 1 ml의 PEG (50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5 분 후에 1 ml의 RPMI1640 배지를 30 초에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 3 ml의 RPMI1640 배양액을 30 초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17 ml의 RPMI1640 배양액을 1 분에 걸쳐 넣은 다음 20 ml의 RPMI1640 배양액을 더 넣어주고, 5 분 동안 반응시켰다. 이를 200 X g로 5 분간 원심분리한 후 배지는 제거하였다. 50 ml의 1% HAT (hypoxathine-aminopterin-thymidine)을 함유하는 RPMI1640 배양액에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포(feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 상기 세포를 넣어준 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.A suspension containing a complete Freund's adjuvant of the same volume as the solution containing 100 μg of Zizkaviravir CP 1 (NS1) prepared in Example 1-4 was used to prepare a 6-week-old female mouse (BALB / C, Korea BioLink, Korea). Two weeks later, an incomplete Freund's adjuvant was injected once more in the same manner and again two weeks later, the same procedure was repeated one more time. Two days after the last immunization, blood was collected from the tail, and the serum was obtained. The serum was diluted 1 / 1,000 in phosphate buffer and the activity of the antibody was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). If the titer was low, it was again immunized after 2 weeks. Then, the spleen was removed from the immunized rats, the spleen was mashed with a tissue grinder, the cell suspension was collected in a container, and centrifuged to recover the cells. The myeloma cells were collected in a cell culture flask, suspended in RPMI1640 medium, and the number of cells was counted. Splenocytes were also counted. 1 × 10 7 myeloma cells and 1 × 10 8 spleen cells were transferred to a 50 ml container, and an appropriate amount of RPMI 1640 medium was added, followed by centrifugation at 200 × g for 5 minutes to recover the cells. The recovered cells were suspended and 1 ml of a 50% polyethylene glycol solution was added to the RPMI1640 medium for 1 minute while gently shaking it. After 5 minutes, 1 ml of RPMI1640 medium was slowly added over 30 seconds, and again 3 ml of RPMI1640 medium was added over 30 seconds. Again, 17 ml of RPMI1640 culture medium was added over 1 minute, and then 20 ml of RPMI1640 culture medium was added, followed by reaction for 5 minutes. After centrifugation at 200 x g for 5 minutes, the medium was removed. The cells were suspended in 50 ml of RPMI1640 culture medium containing 1% HAT (hypoxathine-aminopterin-thymidine), and then the cells were added to a 96-well cell culture plate containing feeder cells And then cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
실시예 2-2. 융합 세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 항체 생산Example 2-2. Cloning of fusion cell lines and production of antibodies using ascites
상기의 실시예 4-1와 같이 배양된 세포를 10일 간 배양한 후에, 융합 세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면 96웰 세포배양용 플레이트에서 배지를 약 100 ㎕ 취하여 지카 바이러스 비구조단백질1(NS1)이 코팅(coating)된 플레이트를 이용하여 특이 항체를 생산하는 세포가 자라는 웰을 스크리닝하였다. 그 웰의 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기로 옮긴 다음 배양한 후, 안정한 단일클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 계속하였다. 클로닝이 완료되면 티 플라스크 (T flask)로 옮겨 대량으로 배양하여 얼린 후 액체 질소에 보관하였다. 본 발명에서 개발된 주요한 지카 바이러스 비구조단백질1(NS1) 특이 단일클론 항체는 표 1과 같다.When the cells cultured as described in Example 4-1 were cultured for 10 days, when it was confirmed that the fused cells were formed by community formation, about 100 μl of the medium was taken out from a 96-well plate for cell culture to obtain chickavirus non- NS1) -coated plate was used to screen wells in which cells producing a specific antibody were grown. Cells of the wells were collected, transferred to a 24-well cell culture container, and cultured, and then cloning was continued until a stable monoclonal cell line was obtained. When cloning was completed, the cells were transferred to a T flask and cultured in a large volume, frozen and stored in liquid nitrogen. Table 1 shows the major Zikaviravir CP1 (NS1) specific monoclonal antibodies developed in the present invention.
생후 6-8주령 생쥐(BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5 ml 주사하였다. 1 주일째 되는 날 융합 세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5 X 106 개의 세포를 0.5 ml 인산염 완충액에 현탁한 후 복강에 주사하였다. 1-2 주가 지나면서 복수(ascitic fluid)가 적당히 차오르면 주사기를 이용하여 복수를 채취한 후 냉동 보관하였다. 본 발명을 통하여 개발된 주요 단일클론 항체의 아형(isotype), 면역친화도(K), 및 분리한 지카 바이러스와의 반응성 여부는 표 1에 정리를 하였다.0.5 ml of incomplete Freund's adjuvant was injected into the peritoneal cavity of 6-8 week old mice (BALB / C). On the first day of the week, the fusion cells were suspended and counted in phosphate buffer, and 1.5 x 10 6 cells per mouse were suspended in 0.5 ml phosphate buffer and injected into the abdominal cavity. After 1-2 weeks, when ascitic fluid was adequately elevated, a plurality of samples were collected using a syringe and stored frozen. Table 1 summarizes the isotype, immunoaffinity (K), and reactivity of the major monoclonal antibodies developed through the present invention with the separated ziccaviruses.
실시예Example 2-3. 기존의 재조합 단백질로부터 얻어진 항체와의 친화도 비교 2-3. Comparison of affinity with antibodies obtained from existing recombinant proteins
본원발명의 방법으로 제조된 단일클론 항체가 기존의 재조합 단백질을 이용하여 단일클론 항체를 생산하였을 때보다 항원과의 친화성이 더 우수한지 비교하기 위하여, 본 발명을 통하여 개발된 주요 단일클론 항체의 아형(isotype), 면역친화도(Kd), 및 재조합 단백질을 이용하여 만들어진 단일클론 항체의 면역친화도(Kd)를 비교하여 표2에 정리를 하였다. 구체적으로, 기존에 보편적으로 알려진 박테리아 발현시스템(E.Coli)을 사용하거나, 곤충세포 발현시스템(baculovirus vector-insect cell system)을 사용한 재조합단백질을 이용하여 단일클론 항체를 제조하는 경우, 민감도가 감소되는 문제점이 있는바, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 단일클론 항체가 기존의 재조합 단백질을 이용하여 단일클론 항체를 생산하였을 때보다 항원과의 친화성이 더 우수한지 확인하고자 하였다. In order to compare the affinity of the monoclonal antibody prepared by the method of the present invention with that of the antigen when compared with the monoclonal antibody produced using the conventional recombinant protein, the major monoclonal antibody developed through the present invention Table 2 summarizes the immunoaffinity (Kd) of the monoclonal antibody prepared using the isotype, the immunoaffinity (K d ), and the recombinant protein. Specifically, when a monoclonal antibody is produced using a conventionally known bacterial expression system ( E. coli ) or a recombinant protein using a baculovirus vector-insect cell system, sensitivity decreases , It was tried to confirm whether the monoclonal antibody obtained by the production method of the present invention had more affinity with the antigen than when the monoclonal antibody was produced using the existing recombinant protein.
친화도(Affinity
KK
dd
))
그 결과, 상기 표2에 나타난 바와 같이, 본원발명의 방법으로 제조된 단일클론 항체의 면역친화도가 재조합 단백질로부터 제조된 단일 클론 항체의 면역친화도보다 대략 5배 내지 43배 이상의 친화도가 있음을 확인하였다. As a result, as shown in Table 2, the immunoaffinity of the monoclonal antibody produced by the method of the present invention was about 5 to 43 times more affinity than the immunoaffinity of the monoclonal antibody prepared from the recombinant protein Respectively.
이는, 본원발명의 방법으로 제조된 단일클론 항체가 지카 감염 환자의 혈액내에 존재하는 지카 비구조단백질1(NS1) 항원을 효과적으로 결합을 할 수 있음을 시사하는 것으로, 지카 바이러스 항원과의 효과적인 결합을 통해 진단시 민감성과 정확성을 획기적으로 높여 줄 수 있음을 알 수 있다. This suggests that the monoclonal antibody prepared by the method of the present invention can effectively bind the zykovic helper protein 1 (NS1) antigen present in the blood of a patient infected with Zicaria, The sensitivity and accuracy of diagnosis can be dramatically improved.
실시예 2-4. 단일클론 항체의 정제Examples 2-4. Purification of monoclonal antibodies
상기의 실시예 2-2과 같은 방법으로 채취한 복수에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 20%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 8,000 rpm에서 30 분간 원심분리하고 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4℃ 에서 30 분간 방치하였다. 다시 8,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18 시간 이상 투석한 후, 20 mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼 (Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해 주었다. 컬럼에 결합된 항체는 10 mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)시켰다. 이때 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0 ~ 7.5가 되도록 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.Ammonium sulfate was sampled in the same manner as in Example 2-2. Ammonium sulfate was added thereto at a concentration of 20%. After mixing for 30 minutes, the mixture was centrifuged at 8,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was taken. Again, ammonium sulfate was added to the supernatant in a concentration of 50%, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. After centrifugation at 8,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was discarded and the precipitate was suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). The suspension was dialyzed in 20 mM phosphate buffer for 18 hours or more, and then a dialysis solution was injected into a protein G-coupled column equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) Phosphate buffer solution was used to remove unadsorbed materials. The antibody bound to the column was eluted with a solution of 10 mM glycine solution (pH 2.8). At this time, a 1 M Tris (pH 9.0) solution was added at 1/10 volume of the eluate to correct the pH to 7.0-7.5. The eluted antibody solution was concentrated and dialyzed with phosphate buffered saline (PBS). After dialysis, the amount of antibody was determined using Bradford assay and stored frozen before use.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 방법으로 정제된 항원을 이용하여 단일클론 항체를 생산하는 경우, 네이티브 바이러스의 본 모습 그대로 유지된 3차 구조와 구조적 항원 결정기(conformational epitope)를 잘 인식하는 단일클론항체를 제작할 수 있음을 알 수 있다. 이는 지카 감염 환자의 혈액내에 존재하는 지카 비구조단백질1(NS1) 항원을 효과적으로 결합을 할 수 있음으로, 지카 바이러스 항원과의 효과적인 결합을 통해 진단시 민감성과 정확성을 획기적으로 높여 줄 수 있음을 시사한다. As shown in Table 1, when the monoclonal antibody is produced using the purified antigen according to the method of the present invention, the native structure of the native virus and the conformational epitope are recognized Can produce monoclonal antibodies. This suggests that the effective binding of Zikapigu protein 1 (NS1) antigen present in the blood of Zikawa infected patients can significantly increase sensitivity and accuracy in diagnosis through effective binding with Zikavir antigen .
실시예 3. 황열 바이러스 비구조 단백질(NS1) 정제Example 3. Purification of yellow fever virus non-structural protein (NS1)
실시에 1에서 확인한 지카 바이러스 이외에도 제1바이러스인 뎅기 바이러스와 상동성을 갖는 비구조 단백질 (NS1)을 이용하여 본 발명에서 이용한 동일한 방법으로 다른 제2바이러스도 정제 가능한지 확인하기 위해, 제2바이러스로 황열 바이러스를 정제하였다. In order to confirm that other non-structural proteins (NS1) having homology with the first virus, dengue virus, other than Zika virus identified in Example 1, can also be purified by the same method used in the present invention, Yellow fever virus was purified.
정제 방법은 상기 실시예 1-2 내지 1-4와 동일한 방법으로 수행하였으며, 황열 바이러스의 비구조 단백질(NS1)을 정제한 뒤, 전기영동을 이용하여 반응성을 확인하였다(도 6).The purification method was carried out in the same manner as in Examples 1-2 to 1-4, and non-structural proteins (NS1) of yellow fever virus were purified and then reactivity was confirmed using electrophoresis (FIG. 6).
그 결과, 본 발명의 방법으로 정제된 바이러스가 황열바이러스임을 확인하였고, 이는 본 발명의 방법이 항-뎅기 NS1 항체와 지카 바이러스에만 한정적으로 적용되는 것이 아님을 시사하는 것이며, 제1바이러스와 서열 상동성이 있는 제2바이러스를 이용하여 목적하는 항원을 얻을 수 있으며, 목적하는 항원으로부터 친화도 및 민감도가 높은 단일클론 항체를 제조할 수 있음을 시사하는 것이다. As a result, it was confirmed that the virus purified by the method of the present invention is a yellow fever virus, suggesting that the method of the present invention is not limited to anti-dengue NS1 antibody and zikavirus, It is suggested that a desired antigen can be obtained by using a homologous second virus and a monoclonal antibody having high affinity and sensitivity can be prepared from the desired antigen.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.
Claims (15)
(b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
(a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex;
(b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And
(c) preparing a monoclonal antibody against the second virus using the antigen of the separated second virus.
상기 항원-항체 복합체는 제1바이러스의 항원부위와 제2바이러스의 항원부위가 50%이상의 상동성을 가지는 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the antigen-antibody complex has an antigenic site of the first virus and an antigenic site of the second virus have a homology of 50% or more.
2. The method of claim 1, wherein the first virus and the second virus are different species.
상기 (b) 단계를 통해 분리된 제2바이러스 항원의 반응성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the step (b) further comprises the step of confirming the reactivity of the second virus antigen separated through the step (b).
상기 분리된 제2바이러스 항원의 반응성 확인은 전기영동 또는 웨스턴블롯을 이용하는 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the detection of the reactivity of the separated second virus antigen uses electrophoresis or Western blotting.
상기 제1바이러스의 항원부위는 비구조 단백질인 것을 특징으로 하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the antigenic site of the first virus is a non-structural protein.
상기 비구조 단백질은 NS1인 것을 특징으로 하는, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 6,
Wherein the nonstructural protein is NS1. ≪ Desc / Clms Page number 20 >
상기 제1바이러스 또는 제2바이러스는 플라비바이러스과인 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein said first virus or said second virus is a flavivirus.
상기 제1바이러스는 뎅기바이러스인 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first virus is a dengue virus.
상기 제2바이러스는 지카바이러스 또는 황열바이러스인 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the second virus is a Zicca virus or a yellow fever virus.
상기 (c) 단계의 단일클론 항체를 제조하는 방법은
(ⅰ) 제1항의 방법으로 정제된 제2바이러스 항원에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제조하고 이로부터 단일클론 항체를 생산하는 단계;
(ⅱ) 상기 (ⅰ)단계에서 제2바이러스에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 (ⅱ)단계로부터 선별된 단일클론 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법.
The method according to claim 1,
The method for producing the monoclonal antibody of the step (c)
(I) preparing a fusion cell producing a monoclonal antibody against a second viral antigen purified by the method of claim 1, and producing a monoclonal antibody therefrom;
(Ii) selecting the highly reactive antibody against the second virus in step (i); And
(Iii) separating the monoclonal antibody selected from step (ii) above. ≪ Desc / Clms Page number 13 >
12. A monoclonal antibody produced by the method of claim 11.
A diagnostic kit for detecting infection of a second virus comprising the monoclonal antibody of claim 12 or an immunologically active fragment thereof.
(b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계;
(c) 상기 분리된 제2바이러스의 항원을 이용하여 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 제조하는 단계;
(d) 상기 제조된 제2바이러스에 대한 단일클론 항체를 이용하여 제2바이러스 감염 검출하는 단계를 포함하는, 제2바이러스의 감염 검출을 위한 진단 키트 제조방법.
(a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex;
(b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex;
(c) preparing a monoclonal antibody against the second virus using the separated second virus antigen;
(d) detecting a second viral infection using the monoclonal antibody against the second virus prepared.
(b) 상기 항원-항체 복합체로부터 제2바이러스의 항원을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계를 통해 분리된 제2바이러스 항원의 반응성을 확인하는 단계를 포함하는, 제2바이러스 항원을 정제하는 방법.
(a) reacting an antibody binding to an antigenic site of a first virus and a culture solution of a second virus to produce an antigen-antibody complex;
(b) separating the antigen of the second virus from the antigen-antibody complex; And
(c) confirming the reactivity of the second virus antigen separated through the step (b).
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Journal of Virological Methods. 1990, 30:323-332.* * |
| Science. 2016, 353(6301):823-826.* * |
Cited By (1)
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| KR20200091658A (en) * | 2019-01-23 | 2020-07-31 | 충북대학교 산학협력단 | Method of Detecting Zika Virus Using Monoclonal Antibody Pair |
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