KR20200087724A - Braf 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Braf 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BRAF 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 BRAF 유전자의 코돈 600에서 4개의 체세포 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브, 키트 및 상기 키트를 이용한 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.

Description

BRAF 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트 {DNA polymerase for detecting BRAF mutation and kit comprising the same}
본 발명은 BRAF 돌연변이 검출을 위한 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 BRAF 유전자의 코돈 600에서 4개의 체세포 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브, 키트 및 상기 키트를 이용한 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.
암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.
현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.
또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.
따라서, 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기발견에 사용될 수 있는 것이어야 한다.
한편, BRAF는 정상적으로 성장인자와 호르몬의 조절 하에 세포 증식과 생존을 조절하는 Ras-Raf-MEK-MAPK 신호전달경로에서 작용하는 Ser/Thr이지만, 변이된 BRAF 유전자는 암 발생의 원인이 된다. 가장 일반적인 돌연변이는 활성 분절에서 V600E이다. 이 돌연변이는 유두갑상선암(PTC), 대장암(CRC), 흑색종 및 비소세포폐암(NSCLC)에서 광범위하게 관찰되어 왔다. BRAF 돌연변이는 약 50%의 흑색종, 약 30%의 난소암, 약 10%의 CRC 및 약 10%의 전립선암에서 발생한다. 특히, V600E 돌연변이는 약 40%의 PTC에서 검출되며 갑상선암의 진단 마커로 간주된다.
이와 같이, BRAF 돌연변이의 존재는 갑상선암 진단의 예측인자로 작용하므로, 갑상선암의 조기 진단 및 최적의 치료적 접근을 위해 BRAF 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2015-0102486호는 폐암관련 돌연변이 증폭용 프라이머 세트, 및 상기 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트에 관한 것으로, BRAF 유전자의 돌연변이를 검출하는 프라이머 세트를 개시하고 있으나, BRAF 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 BRAF 유전자의 코돈 600에서 4개의 체세포 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 포함하는 키트를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 키트를 이용한, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 갖는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 프라이머를 포함하는 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 각각 5'-말단에 FAM, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질이 표지될 수 있고, 3'-말단에 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 서열번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 각각 5'-말단에 FAM, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지될 수 있고, 3'-말단에 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4; 및 5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 핵산에 전술한 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 600에서의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF의 코돈 600의 아미노산인 발린의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 갑상선암 진단에 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 갑상선암은 유두갑상선암일 수 또는 역형성 갑상선암 (anaplastic thyroid cancer)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출될 수 있다.
본 발명의 키트는 높은 검출 민감도 (최대 0.01%, 30,000 야생형 카피에서 3개의 돌연변이 카피), 높은 특이성 및 재현성을 나타내며, 액체 생검 및 조직 생검에 모두 적용 가능하다. 또한, BRAF 유전자의 코돈 600에서 4개의 돌연변이를 동시 다발적으로 검출함으로써 갑상선암을 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5a 내지 5c는 V600E1 돌연변이 플라스미드 (30,000, 3 및 0 카피) 주형에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 V600E2 돌연변이 플라스미드 (30,000, 3 및 0 카피) 주형에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7c는 V600D1 돌연변이 플라스미드 (30,000, 3 및 0 카피) 주형에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8c는 V600D1 돌연변이 플라스미드 (30,000, 3 및 0 카피) 주형에서 AS-qPCR로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, BRAF 돌연변이의 존재는 갑상선암 진단의 예측인자로 작용하므로, 갑상선암의 조기 진단 및 최적의 치료적 접근을 위해 BRAF 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구되고 있다. 이에, 본 발명자들은 BRAF 유전자의 코돈 600에서 4개의 체세포 돌연변이를 높은 민감도로 검출할 수 있는 DNA 중합효소 및 이의 활성을 증가시키기 위한 반응 버퍼를 포함하는 키트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 키트는 높은 검출 민감도, 높은 특이성 및 재현성을 나타내며, 액체 생검 및 조직 생검에 모두 적용 가능하다. 또한, FAM/CY5 채널로 모든 qPCR 기기에서 분석이 가능하다.
이하, 본원에 사용되는 용어를 설명한다.
"아미노산" 은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V).
아미노산은 전형적으로 유기산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시기, 및 하나 이상의 측사슬(side chain) 또는 기(group), 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체"는 상응하는 자연 발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함)는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오타이드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, PCR 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아 유래 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스 유래 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80℃)에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
용어 “뉴클레오타이드(nucleotide)”는 단일가닥(single strand) 또는 이중가닥(double strand) 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleic acid; RNA)이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오타이드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오타이드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오타이드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍"은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-핵산가수분해효소(nuclease) 프로브"는 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-핵산가수분해효소 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 표지 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 프로브가 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 2개 이상의 표지 부분을 포함하고, 2개 중 하나의 표지가 올리고뉴클레오타이드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 2개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 표지된다. 프로브가 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-핵산가수분해효소 프로브가 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3'-핵산가수분해효소 활성에 의해 분해된다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브가 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지될 수 있다.
용어 "FRET" 또는 "형광 공명 에너지 이동" 또는 "포에스터 공명 에너지 이동" 은 둘 이상의 발색단, 공여체 발색단 및 수용체 발색단 (소광제로서 지칭됨) 사이의 에너지의 이동을 지칭한다. 공여체는 전형적으로는, 공여체가 적합한 파장의 빛이 방사됨으로써 여기될 때 에너지를 수용체에 이동시킨다. 수용체는 전형적으로는 상이한 파장으로 방사되는 빛의 형태로 이동된 에너지를 재방사한다. 수용체가 "암" 소광제인 경우, 이는 빛 이외의 형태로 이동된 에너지를 분산시킨다. 특정 형광물질이 공여체 또는 수용체로서 작용하는지 여부는 FRET 쌍의 다른 멤버의 특성에 의존적이다. 통상적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍은 FAM-TAMRA 쌍을 포함한다. 통상적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA 이다. 통상적으로 사용되는 암 소광제는 하기를 포함한다: BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 및 BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연"은, 기술되는 폴리뉴클레오타이드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오타이드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP)이더라도, 뉴클레오타이드가 당의 2' 위치에서 히드록실기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 통상적이지 않은 뉴클레오타이드다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오타이드의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 표지; 화학발광의 표지; 생물발광의 표지; 합텐 표지 예컨대 비오틴; 또는 효소 표지 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 표지될 수 있다. 형광 표지는, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오타이드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)에 의해 시판된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소를 제공한다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V"로 명명하였고, 이의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 2 및 17에 나타내었다.
본 발명은 또한, 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트는 예를 들어 실시예 3의 표 16에 기재된 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 중합효소는 표 16의 프라이머 서열과 함께 사용하였을 때 특히 BRAF 돌연변이 검출 민감도가 우수하다.
본 발명은 또한, 서열번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프로브를 제공한다.
상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 5'-말단에 형광물질 (fluorophore)이 표지될 수 있고, 3'-말단에 소광물질 (quencher)이 표지될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 각각 5'-말단에 FAM, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질이 표지되고, 3'-말단에 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 연구용(Research Use Only, RUO) 또는 생체 외 진단용 (In-Vitro Diagnostic, IVD)으로 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 PCR 키트일 수 있으며, 통상의 기술자에게 프라이머 신장 과정에 사용되는 것으로 인지되는 임의의 시약 또는 다른 요소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 PCR 키트는 (a) 뉴클레오사이드 트리포스페이트; (b) 이중가닥 DNA에 결합하는 정량화를 위한 시약; (c) 중합효소 차단 항체; (d) 하나 이상의 대조값 또는 대조서열; 및 (e) 하나 이상의 주형;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 40 내지 90 mM의 KCl; 및 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4; 및 5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 40 내지 90 mM의 KCl; 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4; 및 10 내지 40 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 KCl, (NH4)2SO4, 및 TMAC 이외에도 Tris·Cl (pH 8.0 내지 9.5), MaCl2, Tween 20, 및 BSA (Bovine serum albumin)을 더 포함할 수 있으며, 이들 구성의 농도는 통상의 기술자가 적절한 범위로 조절하여 사용할 수 있다.
상기와 같은 PCR 버퍼 조성물은 본 발명의 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 키트는 일반 PCR(1 세대 PCR), 실시간 PCR(2 세대 PCR), 디지털 PCR(3세대 PCR) 또는 매스 어레이(MassARRAY)에 적용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트에 있어서, 상기 디지털 PCR은 캐스트 PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR) 또는 드랍렛 디지털 PCR(Droplet digital PCR; ddPCR)일 수 있고, 보다 구체적으로 대립유전자 특이적 캐스트 PCR 또는 대립유전자 특이적 드랍렛 디지털 PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 “캐스트 PCR”은 다량의 정상적인 야생형 gDNA를 함유하는 샘플에서 희귀 돌연변이를 검출하고 수량화하는 방법으로, 야생형 대립유전자로부터의 비-특이적 증폭을 억제하기 위해 대립유전자-특이적 TaqMan® qPCR을 대립유전자-특이적 MGB 차단제와 조합하여 전통적인 대립유전자-특이적 PCR보다 우수한 특이성을 생성할 수 있다.
상기 “드랍렛 디지털 PCR”은 20 ㎕의 PCR 반응을 2 만개의 드랍렛으로 쪼개어 증폭시킨 후, 표적 DNA를 계수하는 시스템으로, 드랍렛에서의 표적 DNA의 증폭 여부에 따라 양성 드랍렛 (1)과 음성 드랍렛 (0)으로 디지털 신호처럼 받아들여 계수하고, 프아송 분포를 통해 표적 DNA의 카피수를 계산해 최종적으로 샘플 ㎕ 당 카피수로 결과값을 확인할 수 있고, 희귀 돌연변이 검출, 극소량의 유전자 증폭, 돌연변이 유형을 동시에 확인하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
상기 “매스 어레이”는 MALDI-TOF 질량 분석법(MALDI-TOF mass spectrometer)을 이용하여 유전형질분석(genotyping) 등 다양한 유전체 연구에 적용가능한 멀티플렉싱 분석방법으로, 적은 비용으로 다수의 샘플과 타겟을 빠르게 분석하고자 하는 경우 또는 특정 표적에 대해서만 맞춤형(customized) 분석을 하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트는 프로브, 형광단(Fluorophore) 및/또는 소광물질(quencher)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형광단은 VIC, HEX, JOE, FAM, CAL Flour Orange 560, Quasar 670, CY5 EverGreen dye 등일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 프로브 서열, 형광단 및 소광물질의 종류는 예를 들어 실시예 5의 표 20과 같을 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 AS-PCR (Allele-specific PCR) 및 실시간 PCR 기술을 채용하며, 인간 혈장 DNA 시료에서 BRAF 돌연변이를 검출하기 위한 특정 프라이머와 형광 프로브를 포함한다. 핵산 증폭 동안, 표적화된 돌연변이 DNA는 프라이머의 3' 말단에서 염기와 매치되고, 선택적이고 효율적으로 증폭된 다음 돌연변이 앰플리콘은 FAM으로 표지된 형광 프로브에 의해 검출된다. 야생형 DNA는 특정 프라이머와 매치될 수 없으며, 증폭이 발생하지 않는다. 본 발명의 키트는 BRAF Master Mixture, ADPSTM 스마트 DNA 중합효소, BRAF 양성 대조군 및 뉴클레아제 무첨가 증류수로 구성될 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트는, 예를 들어, 표 1과 같이 구성될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
구성 주요 성분 양
BRAF Master Mixture 1 dNTP를 포함하는 버퍼, BRAF 표적 및 IC에 대한 프라이머/프로브 300 μL/튜브 Х1
ADPSTM 스마트 DNA 중합효소 ADPSTM 스마트 DNA 중합효소 30 μL/튜브 Х1
BRAF 양성 대조군 각 BRAF돌연변이를 포함하는 재조합 플라스미드 블렌드 75 μL/튜브 Х1
뉴클레아제 무첨가 증류수 PCR 등급의 증류수 150 μL /튜브 Х1
상기 표 1의 각 BRAF Master Mixture의 예시적인 구성은 표 2와 같다.
최종농도
MMX ADPS 버퍼 Tris·Cl (pH 8.8) 50 mM
MgCl2 2.5 mM
KCl 60 mM
(NH4)2SO4 2.5 mM
TMAC 25 mM
Tween 20 0.1%
BSA 0.01%
dNTP 각 0.25 mM
프라이머/프로브 특정 농도
ROX 기준 염료 1X
BRAF Master Mixture의 검출 정보는 표 3과 같다.
시약 형광 신호
FAM Quasar 670*
BRAF Master Mixture
V600E1 IC**
V600E2 IC
V600D1 IC
V600D2 IC
*대체 가능한 염료: Quasar 670 (CY5)
**IC: PCR을 위한 내부 대조군
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법을 제공한다:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 핵산에 본 발명의 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR일 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 염료의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 염료의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다 (http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 소광물질(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 소광물질(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 소광물질에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 소광물질에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광물질에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 소광물질 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YOPRO TM-1 (509), YOYO TM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX TM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green TM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-소광물질 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 소광물질 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다.
MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, 네트롭신(netropsin), 디스타마이신 (distamycin), 렉시트롭신 (lexitropsin), 미트라마이신 (mithramycin), 크로모마이신 (chromomycin) A3, 올리보마이신 (olivomycin), 안트라마이신 (anthramycin), 시비로마이신 (sibiromycin), 펜타미딘 (pentamidine), 스틸바미딘 (stilbamidine), 베레닐 (berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC (N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해준다.
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 따라서, 본 발명의 프로브는 TaqMan MGB-컨쥬게이트 형태일 수도 있으며, 이때 프로브의 길이는 15-21 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 600에서의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF의 코돈 600의 아미노산인 발린의 치환을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 BRAF의 코돈 600에서 하기 표 4에 기재된 4개의 돌연변이 중 1종 이상을 동시 다발적으로 검출할 수 있다.
코돈 돌연변이 BRAF 핵산서열 COSMIC ID
600 V600E1 1799T>A 476
V600E2 1799_1800TG>AA 475
V600D1 1799_1800TG>AT 477
V600D2 1799_1800TG>AC 308550
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법에 있어서, 표적서열은 상기 (a) 단계의 시료에 존재할 수 있으며, DNA, cDNA 또는 RNA, 바람직하게는 유전체 DNA를 포함한다. 테스트 시료는 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간 대상체에 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 객담, 혈액, 타액 또는 소변일 수 있고, (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출될 수 있다.본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 이중 가닥 특이적 염료를 이용한 용융 온도 분석을 포함할 수 있다.
용융 온도 곡선 분석은, 온보드 소프트웨어 (SDS 2.1)를 포함하는 ABI 5700/7000 (96 웰 포맷) 또는 ABI 7900 (384 웰 포맷) 장치와 같은 실시간 PCR 장치에서 수행될 수 있다. 대안적으로는, 용융 온도 곡선 분석은 종결점 분석으로서 수행될 수 있다.
"이중 가닥 DNA에 결합하는 염료" 또는 "이중 가닥 특이적 염료"는 결합되지 않은 상태보다 이중 가닥 DNA에 결합하였을 때 높은 형광을 가지는 경우 사용될 수 있다. 이러한 염료의 예로는, SOYTO-9, SOYTO-13, SOYTO-16, SOYTO-60, SOYTO-64, SYTO-82, 브롬화 에티듐(EtBr), SYTOX Orange, TO-PRO-1, SYBR Green I, TO-PRO-3 또는 EvaGreen이 있다. EtBr 및 EvaGreen (Quiagen)을 제외한 이들 염료는 실시간 응용에 시험되어 왔다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 실시간 PCR(RT-PCR) 또는 정량적 PCR(qPCR), 표준 PCR 후 아가로스 겔에서의 분석, 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭, 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR 또는 등온 증폭에 의해 수행될 수 있다.
상기 "표준 PCR"은 통상의 기술자에게 알려진 DNA 또는 cDNA의 단일 또는 수 개의 복제를 증폭시키는 기술이다. 거의 대부분의 PCR은 Taq 중합효소 또는 Klen Taq와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 사용한다. DNA 중합 효소는 주형으로 단일 가닥 DNA를 사용하고, 올리고뉴클레오타드 (프라이머)를 사용함으로써 뉴클레오타이드로부터 새로운 DNA 가닥을 효소적으로 조립한다. PCR에 의해 생성 된 앰플리콘은 예를 들어, 아가로오스 겔에서 분석될 수 있다.
상기 "실시간 PCR"은 PCR을 할 때 실시간으로 그 과정을 모니터링할 수 있다. 따라서, 데이터는 PCR이 종료되는 시점이 아니라, PCR 과정 전반에 걸쳐 수집된다. 실시간 PCR에서, 반응은 고정된 사이클 수 후에 축적된 표적 양보다는 증폭이 처음으로 검출될 때의 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 주로 염료 기반 검출 및 프로브 기반 검출의 두 가지 방법이 정량적 PCR을 수행하는데 사용된다.
상기 "대립 유전자-특이적 증폭(Allele Specific Amplification, ASA)"은 PCR 프라이머를 단일 뉴클레오타이드 잔기가 다른 주형들을 구별할 수 있도록 고안한 증폭 기술이다.
상기 "실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭"은 매우 효율적인 방법으로 유전자 변이 또는 SNP를 검출한다. 유전자 변이 또는 SNP를 검출하기 위한 다른 대부분의 방법과는 달리, 표적 유전자 물질의 예비 증폭이 필요하지 않다. ASA는 매치 및 미스매치된 프라이머/표적서열 복합체의 구별을 바탕으로 단일 반응에서 증폭 및 검출을 결합한다. 반응동안 증폭된 DNA의 증가는 이중 가닥 DNA에 결합하는 것에 따라 발광하는 SYBR Green I과 같은 염료에 의해 야기되는 형광 신호의 증가로 실시간 모니터링될 수 있다. 실시간 PCR을 통한 유전자 변이 특이적 증폭 또는 대립 유전자-특이적 증폭은 미스매치된 경우에 대한 형광 신호의 지연 또는 부재가 나타난다. 유전자 변이 또는 SNP 검출에서, 이는 유전자 변이 또는 SNP 존재 유무에 대한 정보를 제공한다.
상기 "테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR"은 단일 튜브 PCR 반응에서 대조 단편과 함께 야생형 및 돌연변이 대립 유전자를 모두 증폭한다. 비 대립 유전자 특이적 대조 앰플리콘은 돌연변이 영역 측면의 2개의 공통적인 (바깥쪽) 프라이머에 의해 증폭된다. 2개의 대립 유전자 특이적 (안쪽) 프라이머는 공통 프라이머와 반대 방향으로 설계되며, 공통 프라이머와 함께 야생형 및 돌연변이 앰플리콘 둘 다를 동시에 증폭시킬 수 있다. 결과적으로, 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘은 돌연변이가 공통 (바깥쪽) 프라이머에 대해 비대칭으로 위치하기 때문에 다른 길이를 가지며 표준 겔 전기영동으로 쉽게 분리할 수 있다. 상기 대조 앰플리콘은 증폭 실패뿐만 아니라 위음성에 대한 내부 대조를 제공하며 2개의 대립 유전자-특이적 앰플리콘 중 적어도 하나는 테트라-프라이머 증폭-불응성 돌연변이 시스템 PCR에 항상 존재한다.
상기 "등온 증폭"은 써모사이클러에 의존하지 않고, 바람직하게는 증폭하는 동안 온도가 변화할 필요없이 핵산의 증폭이 더 낮은 온도에서 이루어짐을 의미한다. 등온 증폭에서 사용되는 온도는 실온 (22-24 ℃) 내지 약 65 ℃사이, 또는 약 60-65 ℃, 45-50 ℃, 37-42 ℃ 또는 22-24 ℃의 상온일 수 있다. 등온 증폭 결과의 생성물은 겔 전기 영동, ELISA, ELOSA (Enzyme linked oligosorbent assay), 실시간 PCR, ECL (개선된 화학 발광), RNA, DNA 및 단백질 또는 탁도를 분석하는 칩 기반의 모세관 전기 영동 기기인 생물분석기 (bioanalyzer)로 검출될 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법이 qPCR로 수행되는 경우, 예를 들어, 하기 표 19 내지 21의 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트를 갑상선암 진단을 위한 용도로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 갑상선암 진단을 위한 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 프라이머 세트를 이용한, 갑상선암 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 갑상선암은 유두갑상선암 또는역형성 갑상선암 (anaplastic thyroid cancer)일 수 있다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은, 상기 표 4의 공지된 BRAF 돌연변이를 검출함으로써 갑상선암을 조기에 진단하여 환자 맞춤별로 치료전략을 수립할 수 있는 정보를 제공하고, 이를 통해 환자를 보다 효과적으로 치료하는데 기여한다.
본 발명의 BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소, 프라이머 세트, 프로브 및/또는 키트는 상기 표 4에 기재된 4개의 돌연변이를 검출함으로써 적용할 수 있는 모든 질환의 진단, 예후 및 약물 반응성 예측방법에 사용될 수 있다.
예를 들어, BRAF 유전자 돌연변이 검출은 악성 흑색종, 대장암 또는 난소암을 진단하기 위한 용도로도 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 예후 예측은 특정 질환의 치료 후, 해당 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 질환이 재발하거나 또는 해당 질환으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "무병생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 용어 "생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발여부에 관계 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 5에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 6과 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 9
R536K-R CTT GGT GAG CTC CTT GTA CTG CAG GAT 10
R536K-F ATC CTG CAG TAC AAG GAG CTC ACC AAG 11
R660V-R GAT GGT CTT GGC CGC CAC GCG CAT CAG GGG 12
R660V-F CCC CTG ATG CGC GTG GCG GCC AAG ACC ATC 13
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 14
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 1 μl
R 프라이머 1 μl
증류수 18 μl
pUC19-Taq (10 ng/ μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 7 및 8과 같다.
R660V 또는 R536K
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 1 (또는 단편 3) 1 μl
단편 2 (또는 단편 4) 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
R536K/R660V
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 26 μl
단편 2 1 μl
단편 3 1 μl
단편 5 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
그 결과, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 9의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 10의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2.5 μl
pUC19 (500 ng/μl) 21.5 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 25 μl
10xSAP 버퍼 (로슈) 2 μl
정제된 DNA 17 μl
SAP (로슈) 1 μl
　 20 μl
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 11의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2 μl
정제된 PCR 산물 17 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 20 μl
표 12의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
　 벡터 단독 벡터+인서트
10x연결효소 버퍼 (솔젠트) 1 μl 1 μl
벡터 1 μl 1 μl
인서트 - 3 μl
증류수 7 μl 4 μl
T4 DNA 연결효소 (솔젠트) 1 μl 1 μl
　 10 μl 10 μl
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소 활성을 테스트해 본 결과 활성이 떨어지는 것을 확인하고(데이터 미도시), R536K, R660V, R536K/R660V 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 대조군으로 사용하기 위해 야생형 Taq DNA 중합효소(WT)에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 13에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 14와 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 9
E507K-R CTT GCC GGT CTT TTT CGT CTT GCC GAT 15
E507K-F ATC GGC AAG ACG AAA AAG ACC GGC AAG 16
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 14
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
R 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
증류수 18 μl
주형 플라스미드 (10 ng/μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
*주형 플라스미드: pUC19-Taq (WT)
pUC19-Taq (R536K)
pUC19-Taq (R660V)
pUC19-Taq (R536K/R660V)
2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 15와 같다.
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 6 1 μl
단편 7 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
2-3. 라이게이션pUC19을 표 9의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 10의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 11의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 12의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
프라이머 세트의 제작
BRAF 유전자의 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 BRAF 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 표 16에 나타난 바와 같이 프라이머를 디자인하였다.
돌연변이 그룹 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호 최종 농도 (nM)
V600E V600E Fmt(17+A) ATT TGG TCT AGC TAC AGA 3 800
BRAF SR1 GAT CCA GAC AAC TGT TCA AAC TG 4 200
BRAF IC BRAF Int1 IC_F GCC AAG CCA ATC ATT CAG TCA 5 25
BRAF Int1 IC_R TCC AAC TTC ACT ATC AGC CTC A 6 25
시료의 준비
돌연변이 플라스미드 준비
BRAF의 야생형 DNA인 HEK293T 세포주의 gDNA를 이용하여 표 4의 표적 돌연변이의 주변 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 적용하여 코돈 600 부위의 야생형 클론을 제작하였다. 제작한 야생형 DNA를 이용하여 표적 돌연변이 4개에 대해 돌연변이 유발 (mutagenesis)을 진행하여 E.Coli DH5α 세포에 형질전환하여 각 돌연변이형 클론을 확보하였다. 야생형 클론과 돌연변이형 클론의 확인은 직접 염기서열분석법에 의해 확인하였다. 클론을 통해 추출된 코돈 600의 야생형 DNA와 돌연변이형 DNA는 BRAF 돌연변이 검출 키트의 성능을 평가하기 위한 표준물질로 사용하였다.
표 17에 나타낸 바와 같이, HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 당 V600E1돌연변이 플라스미드를 30,000 카피 첨가하거나, 또는 표 4에 기재된 각 돌연변이 플라스미드 3 카피를 첨가하여 시료를 준비하였고, 돌연변이 플라스미드를 첨가하지 않은 WT 그룹과 주형이 없는 NTC 그룹을 대조군으로 사용하였다.
그룹 시료
WT HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피
NTC 주형이 없는 대조군
V600X 0.01% HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + 해당 돌연변이 플라스미드 3 카피
V600E 100% HEK293T 세포 유전체 DNA 30,000 카피 + V600E1 돌연변이 플라스미드 (BRAF 양성 대조군) 30,000 카피
BRAF 돌연변이 검출
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V"변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 2) 및 실시예 3의 프라이머 세트를 사용하여 표 17의 각 그룹으로부터 표 4의 BRAF 유전자 돌연변이를 검출하였다. 표 18에는 BRAF Master Mixture가 표적하는 4개의 돌연변이 정보를 나타내었다.
MMX 형광 돌연변이 그룹 BRAF 핵산 서열 (COSMIC ID)
MMX FAM V600E1 1799T>A (476)
V600E2 1799_1800TG>AA (475)
V600D1 1799_1800TG>AT (477)
V600D2 1799_1800TG>AC (308550)
구체적인 qPCR (Applied Biosystems 7500 Fast) 실험 조건은 하기 표 19 내지21과 같고, 프로브는 표 20과 같이 이중으로 표지하였다.
2X BRAF MMX 10 μl
시료 5 μl
뉴클레아제 무첨가 증류수 4.5 μl
ADPS Smart DNA 중합효소 (1 U/ul) 0.5 μl
총 20 μl
돌연변이 그룹 프로브 서열 (5'-3') 서열번호 5' 형광단 3' 소광물질 최종농도 (nM)
V600E BRAF V600 프로브 AAA TCT CGA TGG AGT GGG TCC CAT CA 7 FAM BHQ1 400
BRAF IC BRAF IC 프로브 AGA CTC CAT CCA GGC AGG AGA T 8 Quasar 670 BHQ2 100
단계 사이클 온도 시간 데이터 수집
1 1 95℃ 5 분 -
　
2
　		 　
50
　		 95℃ 10 초 -
60℃ 30 초 FAM/Quasar670 (CY5)
72℃ 10 초 -
표 19에 기재된 ADPS 스마트 DNA 중합효소, BRAF Master Mixture를 포함하는 충분한 BRAF 반응 혼합물을 별도의 멸균 원심분리 튜브에 각각 준비하고 반응 Master Mixture를 3초 동안 볼텍싱하여 완전히 혼합하고 짧게 원심분리하였다. 각 시료에 대해 다음과 같이 2개의 PCR 튜브를 준비하였다: 각 PCR 튜브에 대해 10.0 μL의 BRAF 반응 혼합물을 나누고, 5.0 μL의 각 시료 DNA를 각 시료 튜브에 첨가한 다음 PCR 튜브의 뚜껑을 덮었다. 양성 대조군에 대해 다음과 같이 하나의 PCR 튜브를 준비하였다: 각 PCR 튜브에 대해 10.0 μL의 BRAF 반응 혼합물을 나누고, 5.0 μL의 양성 대조군을 시료 튜브에 첨가한 다음 PCR 튜브의 뚜껑을 덮었다. 뉴클레아제 무첨가 증류수를 모든 PCR 튜브에 20.0 μL까지 추가하고, PCR 스트립 (strips)을 짧게 원심분리하여 각 PCR 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집하였다. PCR 스트립 튜브를 실시간 PCR (real-time PCR) 기기에 두고, 표 21의 사이클링 파라미터를 이용하여 PCR 프로토콜을 설정한 후 PCR을 수행하였다. PCR 종료 후, 데이터를 분석하기 위해 각 시료의 FAM/Quasar 670 ΔCt 값을 기록하고, 각 웰 당 Ct 값을 다음과 같이 계산하였다:
ΔCt 값 = 돌연변이 Ct 값 (FAM) - 양성 대조군 Ct 값 (FAM)
ΔCt 컷오프 값: Ct < 24.0
표 22 및 23의 컷오프 ΔCt 값에 따라 각 튜브에 대한 결과를 해석하였다. ΔCt 값이 < 컷오프 ΔCt 값인 경우 시료는 양성인 것으로 판단하고, FAM 신호가 ≥ 컷오프 값이고 내부 대조군의 Ct 값이 24 < Ct < 40인 경우, 시료는 음성으로 판단하며, ΔCt 값이 ≥ ΔCt 컷오프 값인 경우 시료는 음성이거나 검출 한계 (LoD) 미만인 것으로 판단한다.
결과 결정
BRAF MMX 결정
FAM
시료 Ct 값 Ct < 23.5 무효
23.5 ≤ Ct ≤ 48.0 양성
48 < Ct 음성
신호 없음 음성
ΔCt 컷오프 값 ΔCt < 24.0 양성
결과 결정 (예시)
시료 Ct 값 ΔCt 값 결정
FAM(돌연변이) FAM(양성) Quasar 670
#1 30.0 24.0 23.5 6.0 양성
#2 49.0 28.0 25.0 음성
#3 38.0 32.0 14.0 양성
#4 신호 없음 30.0 - 음성
상기와 같이 데이터를 분석한 결과, 도 5a 내지 5c, 6a 내지 6c, 7a 내지 7c, 및 8a 내지 8c에 나타난 바와 같이 WT 및 NTC 그룹에서는 형광 신호가 검출되지 않았으나, 표 4의 BRAF 유전자 돌연변이를 포함하는 시료에서는 형광 신호가 검출되었으며, 표 24에 나타난 바와 같이 최대 0.01% (30,000 야생형 카피에서 3개의 돌연변이 카피)의 높은 민감도로 BRAF 유전자 돌연변이를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
코돈 돌연변이 염기 변화 COSMIC ID LoD (카피) 검출 민감도 (%)
600 V600E1 1799T>A 476 3 0.01
V600E2 1799_1800TG>AA 475 3 0.01
V600D1 1799_1800TG>AT 477 3 0.01
V600D2 1799_1800>AC 308550 3 0.01
SEQUENCE LISTING <110> GeneCast Co., Ltd. <120> DNA polymerase for detecting BRAF mutation and kit comprising the same <130> 1066829 <150> KR 10-2019-0004220 <151> 2019-01-11 <160> 17 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) <400> 1 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 2 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 2 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Glu Lys Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Lys Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Val Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> V600E Fmt(17+A) <400> 3 atttggtcta gctacaga 18 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF SR1 <400> 4 gatccagaca actgttcaaa ctg 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF Int1 IC_F <400> 5 gccaagccaa tcattcagtc a 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF Int1 IC_R <400> 6 tccaacttca ctatcagcct ca 22 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF V600 probe <400> 7 aaatctcgat ggagtgggtc ccatca 26 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BRAF IC probe <400> 8 agactccatc caggcaggag at 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Eco-F <400> 9 ggggtacctc atcaccccgg 20 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-R <400> 10 cttggtgagc tccttgtact gcaggat 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-F <400> 11 atcctgcagt acaaggagct caccaag 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-R <400> 12 gatggtcttg gccgccacgc gcatcagggg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-F <400> 13 cccctgatgc gcgtggcggc caagaccatc 30 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Xba-R <400> 14 gctctagact atcactcctt ggcggagagc ca 32 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E507K-R <400> 15 cttgccggtc tttttcgtct tgccgat 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E507K-F <400> 16 atcggcaaga cgaaaaagac cggcaag 27 <210> 17 <211> 2499 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 17 atgaggggga tgctgcccct ctttgagccc aagggccggg tcctcctggt ggacggccac 60 cacctggcct accgcacctt ccacgccctg aagggcctca ccaccagccg gggggagccg 120 gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctcaagga ggacggggac 180 gcggtgatcg tggtctttga cgccaaggcc ccctccttcc gccacgaggc ctacgggggg 240 tacaaggcgg gccgggcccc cacgccggag gactttcccc ggcaactcgc cctcatcaag 300 gagctggtgg acctcctggg gctggcgcgc ctcgaggtcc cgggctacga ggcggacgac 360 gtcctggcca gcctggccaa gaaggcggaa aaggagggct acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca 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Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 DNA 중합효소.
  2. 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 각각 5'-말단에 FAM, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지되는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 프로브.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소; 및/또는
    서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머;
    를 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열은 각각 5'-말단에 FAM, Quasar 670 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질 (fluorophore)이 표지되고, 3'-말단에 BHQ-1 및 BHQ-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 소광물질이 표지되는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  8. 제5항에 있어서,
    25 내지 100 mM의 KCl; 및
    1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;
    를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  9. 제5항에 있어서,
    25 내지 100 mM의 KCl;
    1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4; 및
    5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출용 키트.
  10. 다음의 단계를 포함하는 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 핵산에 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키트를 처리하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PCR은 대립유전자 특이적 (allele-specific) PCR 또는 실시간 (real-time) PCR인, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  12. 제10항에 있어서, (d) 상기 PCR에 의한 증폭 결과를 Ct (cycle threshold) 값을 측정하여 확인하는 단계를 추가로 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF 유전자의 코돈 600에서의 결실, 치환 및 삽입 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAF의 코돈 600의 아미노산인 발린의 치환 포함하는, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 BRAF 유전자 돌연변이 검출방법은 갑상선암 진단에 적용되는, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 갑상선암은 유두갑상선암 또는 역형성 갑상선암 (anaplastic thyroid cancer)인, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계의 핵산은 조직 생검의 포르말린 고정 파라핀 포매 시료(formalin-fixed paraffin embedded sample) 또는 액체 생검으로부터 추출된 것인, BRAF 유전자 돌연변이 검출방법.
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