KR20190002147A - 신경절 교세포종이 유도된 동물 모델 및 이를 이용한 약물 스크리닝 - Google Patents

신경절 교세포종이 유도된 동물 모델 및 이를 이용한 약물 스크리닝 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌전증의 바이오마커, 뇌전증 진단용 조성물, 뇌전증이 유도된 동물, 및 뇌전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로, BRAF 돌연변이 단백질 및 핵산 분자, 상기 단백질 또는 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물, 상기 BRAF 돌연변이 핵산 분자로 형질전환된 뇌전증이 유도된 동물, 및 BRAF 돌연변이 단백질의 활성 저해제를 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

신경절 교세포종이 유도된 동물 모델 및 이를 이용한 약물 스크리닝 {Ganglioglioma-induced animal model and drug screening using the same}
본 발명은 신경절 교세포종의 바이오마커를 이용한 신경절 교세포종의 진단 및 치료 용도에 관한 것으로서, 구체적으로, BRAF변이 단백질 및 핵산 분자, 상기 단백질 또는 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 신경절 교세포종 진단용 조성물, 상기 BRAF 돌연변이 핵산 분자로 형질전환된 신경절 교세포종이 유도된 동물, 및 BRAF 돌연변이 단백질의 활성 저해제를 포함하는 신경절 교세포종의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌전증 (epilepsy) 신경세포 중 일부가 발작적으로 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 뇌전증 발작 (epileptic　seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환군으로서, 신경생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 변화를 수반하는 심각한 신경 질환이다.
뇌전증은 알츠하이머병 (Alzheimer) 및 뇌졸증 (Stroke)에 이어 세번째로 흔한 신경계 질환으로, 전 세계 인구의 약 0.5%~2%가 뇌전증을 앓고 있다. 또한, 전 세계적으로는 매년 10만명당 45명 정도의 새로운 환자가 발생하고 있고, 우리나라의 경우 약 30~40만명의 뇌전증 환자가 있는 것으로 추정되며 매년 2만명 정도의 새로운 뇌전증 환자가 발생한다고 보고되고 있다. 또한, 전체 뇌전증의 70%가 소아 청소년 연령에서 시작되고, 특히 유아기에 발병률이 높은 것으로 알려져 있다. 발병률과 유병률은 생후 1년 이내에 가장 높았다가 급격히 낮아지고, 60세 이상의 노년층에서 다시 급격히 증가하는 U자 형태를 보이며, 일생동안 발작을 경험하는 유병률은 10-15%에 이른다.
뇌전증 중에서 현재까지 개발된 항뇌전증 약물에 반응하지 않는 뇌전증을 난치성 뇌전증 (intractable epilepsy)이라고 하며, 전체 뇌전증의 약 40%를 차지하고 있다.
뇌전증의 원인질환으로는, 대뇌피질 발달기형 (Malformations of Cortical Developments, MCD), 신경절 교세포종 (ganglioglioma, GG) 및 해마경화증 (hippocampal sclerosis, HS), 또는 스터지웨버신드롬 (Sturge weber syndrome, SWS) 등이 알려져 있다.
신경절 교세포종은 약물 치료에 반응하지 않는 난치성 뇌전증의 중요한 원인 중 하나로 종양에 기인하는 소아 난치성 뇌전증의 약 80%를 차지하고 있다. 이는 중추신경계의 신경세포 종양 중 가장 흔하며 신경세포와 교세포 모두에 이형성을 동반한 양성 종양이다. 대부분 소아에서 발생하고 이들 중 80%에 가까운 환자들에게서 반복적인 뇌전증을 주요 증상으로 동반한다. 외과적 절제는 환자를 발작 횟수를 줄이지만, 일부 환자군에서 간질 발작이 지속되는 문제점이 있고 발병연령이 낮고 종양의 위치가 심부에 있어서 수술적 치료가 어려운 경우가 있다. 특히 신경절 교세포종의 분자유전학적 원인이 밝혀져 있지 않기 때문에 새롭고 효과적인 신경절 교세포종의 치료법의 개발이 어려운 실정이다.
과거의 연구를 통해 신경절 교세포종에 특이적인 체성 돌연변이를 추측해 왔으나 아직까지 해당 돌연변이와 신경절 교세포종의 발병에 관한 명확한 인과성이 입증된 바가 없어 아직까지 이러한 체성 돌연변이가 실제로 뇌전증을 유발하는지 그리고 이와 관련된 생물학적인 기전은 무엇인지 확인된 바는 없다.
본 발명의 목적은 뇌전증을 진단하기 위한 바이오마커로서, BRAF 변이 단백질 및 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 BRAF 변이 단백질 및 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BRAF 돌연변이 핵산 분자로 형질전환된 뇌전증이 유도된 동물, 및 상기 동물을 이용한 뇌전증 또는 신경절 교세포종의 치료 약물을 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 BRAF 돌연변이 단백질의 활성 저해제를 포함하는 뇌전증 및 신경절 교세포종의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 신경절 교세포종 수술 환자의 뇌 조직 시료 (brain tissue)에 대하여, 전체 엑솜 염기서열 분석기법을 사용하여 신경절 교세포종의 뇌 병변 특이적 체성 돌연변이를 발굴하였고, 이러한 뇌 체성 돌연변이를 발현하는 동물 모델을 제작하여, 상기 제작한 동물 모델에 BRAF 변이 단백질의 활성 저해제를 투여하는 경우 뇌전증을 현저하게 치료하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 변이 단백질, 또는
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 변이 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 진단용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 뇌전증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터에 관한 것이다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 가 도입된 동물 또는 동물의 배아에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터로 형질전환되어, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
상기 벡터를 마우스에 형질전환하는 단계를 포함하는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물에 뇌전증 치료 후보물질을 투여한 후 뇌전증 경감 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 서열번호 1 아미노산 서열중 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 아미노산을 포함하는 단백질의 활성 저해제를 포함하는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 신경절 교세포종의 뇌 병변 특이적 체성 돌연변이를 이용하여, 난치성 뇌전증, 예를 들면 신경절 교세포종 (GG)으로 인한 난치성 뇌전증의 진단 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명은 뇌전증을 진단하기 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 염기서열의 변이가 일어난 BRAF 유전자 또는 염기서열의 변이로 인해 아미노산 서열의 변이가 일어난 BRAF 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뇌전증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 뇌전증 진단용 바이오마커인 상기 유전자 및 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "뇌전증"이란, 신경세포 중 일부가 짧은 시간에 과도한 전기를 발생시켜 발작이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환을 의미한다. 본 발명에서 상기 뇌전증은 난치성 뇌전증을 포함할 수 있고, 상기 뇌전증은 신경절 교세포종 (GG)으로 인한 난치성 뇌전증일 수 있다.
본 발명자들은 기존의 암 공용 데이터자료 분석을 바탕으로 소아 저등급 병기의 뇌종양이 성인의 뇌종양과는 달리 난치성 뇌전증의 동반 비율이 높은 것을 연관관계를 바탕으로, 저등급 병기의 신경교종을 가진 소아 환자들 중 기존의 항전간제 치료에 약효가 없는 난치성 뇌전증을 동반하고 있는 신경절 교세포종 (ganglioglioma, GG) 환자의 수술 후 뇌 조직 시료를 분석한 결과, 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 BRAF 단백질의 600번째 아미노산인 발린이 글루탐산으로 치환된 BRAF V600E (이하, BRAF V600E) 뇌 체성 돌연변이가 특이적으로 존재한다는 것을 확인하였고, 상기 BRAF V600E 아미노산 및 상기 아미노산을 코딩하는 유전자 를 뇌종양 유래 소아 난치성 뇌전증을 진단하기 위한 바이오마커 패널로 활용될 수 있음을 확인하였다.
상기 BRAF V600E 돌연변이는 환자의 혈액에서는 발견되지 않았고, 뇌 조직 시료에서 특이적으로 발견되었다. 또한, 신경절 교세포종 환자군에서의 유전변이율은 30 내지 70%의 비율로 존재하였고, 각 환자 내에서 존재하는 정상 대립 유전자 대비 돌연변이 유전자의 비율은 5% 내지 35%의 비율로 존재하고 있음을 확인하였다 (표 3).
실험에 사용한 종양은 양성종양으로서 그 돌연변이 세포의 복제수가 적기 때문에 전장 엑솜 염기서열 분석법으로 확인한 결과 BRAF V600E 돌연변이를 제외하고 다른 어떤 돌연변이는 발견되지 않았다. 즉, BRAF V600E 단일 돌연변이만이 신경절 교세포종과 관련이 있음을 확인하였고, 따라서 BRAF V600E가 신경절 교세포종 환자에게서 나타나는 표현형과 아주 강한 상관관계가 있음을 확인하였다 (실시예 2).
본 발명의 난치성 뇌전증은 신경절 교세포종에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로 신경절 교세포종은 뇌 체성 돌연변이 연관 신경절 교세포종일 수 있으며, 바람직하게 상기 뇌 체성 돌연변이는 뇌 체성 BRAF V600E 돌연변이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "뇌 체성 돌연변이"란, 야생형의 유전자에서 하나 이상의 위치에서 염기서열의 변이가 일어난 것을 의미한다. 예를 들면 BRAF 유전자 또는 이들 유전자에 상응하는 단백질의 아미노산 변이일 수 있다.
상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 mTOR 신호전달 경로의 활성화에 의해서 발생하는 것이 아닐 수 있고, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 교세포가 아닌, 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으며, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 배아 발생단계의 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아 발생단계는 낭배기까지의 시기를 의미할 수 있고, 구체적으로 기관이 형성되기 이전의 시기를 의미할 수 있다.
BRAF 유전자 또는 단백질은 세포 막에서 핵으로 세포 분열의 신호를 전달하는 역할을 하는 단백질 인산화 효소 (키나아제) 로 알려져 있으며, MEK kinase와 ERK kinase를 인산화하여 MAP kinase 신호를 전달하는 기능을 한다. 인간 BRAF의 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재되어 있고, 상기 서열번호 1의 NCBI accession number는 NP_004324.2이며, 상기 서열번호 1을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2에 기재되어 있으며, 상기 서열번호 2의 NCBI accession number는 NM_004333.4이다. 상기 인간에 대응되는 마우스 (Mus musculus) BRAF의 아미노산 서열은 서열번호 3에 기재되어 있고, 상기 서열번호 3의 NCBI accession number는 NP_647455.3이며, 상기 서열번호 3을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4에 기재되어 있으며, 상기 서열번호 2의 NCBI accession number는 NM_139294.5이다.
본 발명에 있어서, 뇌 체성 돌연변이의 바람직한 예는, 야생형의 인간 BRAF 유전자인 서열번호 1의 아미노산 서열에 변이가 일어난 것을 의미한다. 예를 들어 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 (BRAF V600E)을 의미할 수 있다. 또 다른 예로, 본 발명에서 뇌 체성 돌연변이는, 야생형의 BRAF 단백질을 코딩하는 염기서열인 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자일 수 있다.
상기 인간 BRAF에 대응되는 마우스 BRAF의 돌연변이는 서열번호 3의 아미노산 서열에서, 637번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 (BRAF V600E)를 의미할 수 있고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열에서, 1910번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 BRAF의 돌연변이를 발현하는 마우스를 제작하기 위해서 서열번호 3의 아미노산 서열에서, 637번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 (BRAF V600E) 또는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열에서, 1910번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자를 사용하였다.
다만, 관용적으로 인간 BRAF V600E와 마찬가지로 마우스 BRAF V637E를 BRAF V600E라고 표시하므로, 본 명세서에서는 마우스 BRAF V637E 돌연변이를 발현하는 마우스에 대하여 BRAF V600E라고 기재하였다.
또한, 변이 단백질은, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 추가적인 변이를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 경우에 따라서, 상기 BRAF 변이 단백질은, 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 변이 단백질, 또는
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 변이 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 진단용 조성물에 관한 것이다.
본원에서 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 뇌전증 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 종양 유래성 뇌전증 환자 모델을 동물 모델에서 정확히 반영하기 위해서 적합한 모델 질환으로 간질관련종양 중 소아에서 가장 큰 원인으로 알려져 있는 신경절 교세포 종을 선정하여 이들의 수술 후 뇌 조직과 혈액 샘플을 채취하였고, 상기 뇌 조직 샘플에서 BRAF V600E 돌연변이를 특이적으로 확인 (실시예 1 및 2)하여, 상기 BRAF V600E 돌연변이가 뇌전증의 진단 마커로 사용가능하고, 바람직하게는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증의 진단마커로 사용가능함을 확인하였다.
본 발명에서 "유전자를 검출할 수 있는 제제"는 환자의 시료 내에서 BRAF 변이 유전자를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 구체적인 일예로, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 유전자에 상보적인 프라이머 (primer), 프로브 (probe), 안티센스 핵산 (antisnense oligonucleotide) 등 일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링 (annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 안티센스 핵산이 BRAF 돌연변이 유전자 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적 (substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
일예로, 본원의 BRAF 변이 유전자 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 핵산일 수 있다.
용어, "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 BRAF 변이 유전자에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 BRAF 변이 유전자와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 BRAF 변이 유전자 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 일예로, 본원의 BRAF 변이 유전자 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)이며, 본원 명세서에 BRAF 변이 유전자의 염기서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 BRAF 변이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
다른 일예로, 본원의 BRAF 변이 유전자 바이오마커를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서는 BRAF 유전변이와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 "단백질을 검출할 수 있는 제제"는 환자의 시료 내에서 BRAF 변이 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게, 상기 BRAF 변이 단백질을 타겟(target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있다. 구체적인 일예로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머일 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 BRAF 변이 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, BRAF 변이 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝 (cloning)하여 상기 BRAF 변이 유전자에 의해 코딩되는 BRAF 변이 단백질을 얻고, 얻어진 BRAF 변이 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 BRAF 변이 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 뇌전증 진단 바이오마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 (light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄 (heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 뇌전증 진단 바이오마커인 BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출할 수 있다. 본 발명의 키트에는 BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 핵산 또는 선택적으로 BRAF 변이 단백질을 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 BRAF 변이 유전자를 검출하기 위한 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 뇌전증 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, BRAF 변이 유전자를 검출하기 위한 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, BRAF 변이 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너 (container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 BRAF 변이 단백질을 검출하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명은 뇌전증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 핵산 분자를 검출하는 방법은 환자의 시료로부터 핵산을 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 시료는 환자의 뇌 조직 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 실시하기 위한 하나의 양태로서, 뇌전증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출하는 방법으로 수행할 수 있고, 환자의 시료로부터 게놈(genome) DNA 또는 총 단백질(total protein)의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질을 검출할 수 있는 조직, 세포와 같은 시료 등을 포함한다. 바람직하게, 뇌 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 환자의 시료로부터 BRAF 변이 유전자를 검출하는 방법은, 환자의 시료로부터 핵산을 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 핵산을 증폭하는 단계는, 중합효소 연쇄반응(PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, 테일-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계는, 생거(Sanger) 시퀀싱, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 샷건(Shotgun) 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, TaqMan 기법, 자동염기서열분석, 또는 차세대 염기서열 분석에 의하여 수행될 수 있다. 차세대 염기서열 분석은, 당업계에 널리 사용되는 염기서열 분석 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Roche 사의 454 GS FLX, Illumina 사의 Genome Analyzer, Applied Biosystems 사의 SOLid Platform 등을 이용할 수 있다.
또 다른 일예로, 환자의 시료로부터 BRAF 변이 단백질을 검출하는 방법은, 해당 아미노산 변이를 특이적으로 검출하는 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, BRAF 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 확인할 수 있고, BRAF 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 판단하여, 뇌전증을 진단할 수 있다.
본원에서 "항원-항체 복합체"란 BRAF 변이 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 여부는 검출 라벨(detection label)의 시그널을 통해서 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
일 구체예로, BRAF 변이 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. 또한, 바람직하게는, BRAF 변이 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재를 확인하여, 뇌전증 발병 여부를 확인할 수 있다.
바람직하게, 환자의 시료로부터 BRAF 변이 단백질을 검출하는 방법은, 환자의 시료로부터 전체 단백질을 분리하는 단계; 분리한 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 참조서열(reference sequence)과 비교하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한 바람직하게, BRAF 유전변이에 의해 증가된 BRAF 단백질의 활성화를 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 검출 방법들을 통하여, BRAF 변이 유전자 또는 BRAF 변이 단백질이 검출되는 경우 뇌전증으로 진단할 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는, BRAF V600E 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 공지된 site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 서열번호 4에 기재된 염기서열 중에서 1910번째 티민이 아데닌으로 치환된 유전자를 증폭하고, 이를 Cre 재조합 효소 의존적 loxP서열에 연결한 뒤 마우스 배아 세포에 넣어 상동성 재조합 방식으로 Cre 의존적 BRAF V600E 단백질을 발현하는 조건적 돌연변이 형질전환 마우스를 제작하였으며, 상기 제작된 마우스와 tdTomato 마우스를 교배하여 얻은 마우스의 임신 14일 (E14)이 되었을 때에 자궁각 (uterine horn)이 노출하여 개개 배아 (embryo)의 측뇌실 (Lateral ventricle)에 Cre 재조합효소를 주입 (자궁내 유전자 도입)하여 Cre 재조합 효소에 의해서 BRAF V600E 돌연변이를 발현하는 뇌전증이 유도된 마우스를 제작하였다.
상기 마우스는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열 중에서 637번 발린이 글루탐산으로 치환된 BRAF V637E 단백질을 발현하거나, 상기 마우스는 서열번호 4에 기재된 염기서열 중에서 1910번째 티민이 아데닌으로 치환된 유전자를 발현할 수 있다.
다만, 관용적으로 인간 BRAF V600E와 마찬가지로 마우스 BRAF V637E를 BRAF V600E라고 표시하므로, 본 발명에서는 마우스 BRAF V637E를 BRAF V600E라고 기재하였다.
상기 제조한 재조합 벡터는 포유류 또는 설치류에서 발현가능하한 벡터일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물에 관한 것이다.
상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물은 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증에서 특이적으로 발견되는 돌연변이 단백질인 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 특징이 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
본원에서 용어, "유도"란, 정상 상태에서 병리 상태로 변화를 유발하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 유도는 뇌전증이 발병하지 않은 상태에서 뇌전증이 발병하는 상태로 변화하는 것이다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 조성물을 주입하여 뇌전증을 유발하는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 조성물을 주입하여 뇌전증을 유발하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 아미노산 서열이 변이된 서열번호 1의 단백질 또는 유전자 서열이 변이된 서열번호 2의 유전자을 주입하여 뇌전증을 유발하는 것일 수 있다.
상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 mTOR 신호전달 경로의 활성화에 의해서 발생하는 것이 아닐 수 있고, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 교세포가 아닌, 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으며, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 배아 발생단계의 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아 발생단계는 낭배기까지의 시기를 의미할 수 있고, 구체적으로 기관이 형성되기 이전의 시기를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 교세포에서 기원한 BRAF V600E 돌연변이와는 무관하며, 신경세포에서 발생하는 BRAF V600E 돌연변이가 간질 발생 기전에 중요한 역할을 함을 확인하였고, 교세포에서만 BRFA V600E 돌연변이가 발생하는 경우에는 교세포 증식능과 양성종양이 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해서 본 발명의 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 신경세포에서 발생하는 BRAF V600E 돌연변이에 의해서 발생하지만, 교세포에서 발생하는 BRAF V600E 돌연변이는 본 발명의 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증을 유도하는 것이 아니라 세포의 증식을 유도하는 함을 알 수 있었다 (실시예 6).
본 발명의 일 실시예에서 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 성인기에 발현한 BRAF V600E 돌연변이에 의해서 유도되는 것이 아니라, 기관발생기 이전의 배아 발생단계에서 발현한 BRAF V600E 돌연변이에 의해서 유도되는 것을 확인하였다 (실시예 5).
또한, 볼 발명의 일 실시예에서 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 mTOR 신호전달 경로에 의해서 유되는 것이 아님을 확인하였다 (실시예 9).
본 발명은 상기 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 뇌 세포일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 배아에 관한 것이다.
상기 배아는 인간을 제외한 포유류 또는 설치류일 수 있고, 상기 배아는 뇌의 형성 또는 발달 단계에 있는 배아일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터로 형질전환되어, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된, 인간을 제외한 동물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 동물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "형질전환 동물 (transgenic animal)"이란 세포 내 BRAF V600E 단백질 활성이 정상 세포에 비하여 증가되도록 형질의 변형이 유도된 동물을 의미하고, 아미노산 서열이 변이된 BRAF 단백질을 발현하는 벡터를 세포 내 유입함으로써 형질전환을 유도할 수 있다. 뇌전증이 발생된 상기 형질전환 동물은 뇌전증 동물 모델로 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 동물은 동물은 인간을 제외한 포유류 또는 설치류일 수 있고, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 것일 수 있다.
본 발명은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
상기 벡터를 마우스에 형질전환하는 단계를 포함하는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 재조합 벡터를 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 형질전환 (transformation), 형질도입 (transfection 또는 transduction) 등의 방법을 통하여 벡터를 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포 내로 삽입된 벡터는 세포 내에서 유전자 발현이 지속적으로 일어나 아미노산 서열이 변이된 BRAF 단백질을 생성할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 배아기 중 대뇌 피질층 (cortical layer)이 형성되는 기간에 배아의 뇌에 도입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 서열번호4에 기재된 염기서열 중에서 Cre 의존적으로 1910번째 티민이 아데닌으로 친환된 유전자를 발현할 수 있는 조건적 돌연변이 형질전환 마우스를 제작하고 이에 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드를 마우스의 자궁내 유전자 도입하여 뇌전증이 유도된 마우스 동물 모델을 제조하였다.
본 발명은 서열번호 1 아미노산 서열중 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 뇌전증이 유도된 동물에 관한 것이다. 상기 동물은 인간을 제외한 포유류 또는 설치류일 수 있다.
본 발명에서 "동물 모델(animal model)" 또는 "질환 모델(disease model)"은 사람의 질병과 유사한 특정 질환을 가지고 있어서 병인을 규명하고, 병태를 확인할 수 있는 연구 대상이 될 수 있는 모델이 되는 동물을 의미한다. 동물 모델로서 사용하기 위한 동물은, 인간에서와 같은 효과를 예측할 수 있으며, 쉽게 만들 수 있고, 재현성이 있다. 또한, 인간질병의 병인과 같거나 유사하게 진행되어야 한다. 따라서, 인간과 같은 포유류 척추동물이면서, 장기 등의 체내 구조, 면역체계, 체온 등이 유사하고, 고혈압, 암, 면역결핍 등의 질환을 앓는 동물이 동물 모델로서 적합하다. 이런 동물은 바람직하게는 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 래빗, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 포유류이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류이다.
본 발명의 일 실시예에서 BRAF V600E가 신경절 교세포종 환자에게서 나타나는 표현형과 아주 강한 상관관계가 있음을 확인하여, 이를 바탕으로 동물 모델에서 BRAF V600E 돌연변이로 정상 BRAF 유전자가 치환되는 경우 동물 모델에서 뇌전증의 표현형이 나타나는지 확인하였다 (실시예 4).
볼 말명의 일 실시예에서 상기 BRAF 유전자 치환 모델에서 뇌전증의 표현형이 나타나는지 확인하기 앞서서, 환자 조직을 신경세포에 특이적인 마커와 교세포에 특이적인 마커로 각각 염색해서 특정 조직형의 세포만을 레이저 캡처 현미경 해부라는 방법을 이용하여 분리해서 BRAF V600E 돌연변이의 존재유무를 확인함을 통해서 BRAF V600E 돌연변이가 신경세포, 및 교세포 계열의 세포주 모두에서 기원함을 확인할 수 있었다 (도 2a, 및 도 2b). 상기 결과를 통해서 신경세포 및 교세포 모두의 공통적인 조상에서 상기 BRAF V600E 돌연변이가 발생했음을 추론할 수 있었다 (실시예 3).
본 발명의 일 실시예에서 상기 제조한 마우스 동물 모델에서. 14일 (E14)의 배아 마우스의 측뇌실에 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드를 전기천공한 배아를 태어나게 한 후, 생후 3주 이후부터 비디오 뇌전도(Video-Electroencephalography, video-EEG) 감시를 시행한 결과, 본 발명의 염기서열 변이가 일어난 변이 유전자를 삽입한 플라스미드를 주입한 마우스에서 간질파를 동반한 자발적 발작을 확인하였다 (도 3b, 및 3c). 나아가, 동물 모델 마우스의 뇌를 잘라 다채널전극분석장비를 이용하여 조직의 활성도를 측정해본 결과 대조군과 달리 BRAF V600E 돌연변이를 가진 뇌조직에서 뇌전증에 특징적인, 자발적 활동파와 여러 채널에서 동시에 일시적으로 짧은 주기의 고진폭의 에너지가 방출되는 이루어지는 synchronized burst firing (도 3c)이 나타나는 것을 확인하였다 (실시예 4).
본 발명의 일 실시예에서 BRAF V600E 변이를 전기천공으로 유도한 대뇌영역의 GFP 양성세포의 경우, 신경절 교세포종에서 특징적으로 나타나 있는 신경세포의 이형성이 동반되어 있는데 이에는 세포의 크기가 커지고 (도 5a), 세포의 모양이 찌그러져 있으며 (도 5b) 세포 모양 및 신경세포의 가지의 배열이 정상 신경세포와는 달리 임의의 방향으로 배열되어 있음 (도 5c)을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 BRAF V600E 변이를 가지는 신경원시세포들의 딸세포들을 추적하기 위해 conditional floxed tdTomato 마우스와 교배하여 다시 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 유전자를 자궁내 유전자 도입이라는 방법을 이용하여 제조하여 (도 6a) 그 딸세포들을 추적한 결과 BRAF V600E 돌연변이를 가진 신경원시세포에서 교세포 계열 관련 성상 교세포 또는 희돌기 교세포들이 정상 뇌조직에 비해 유의하게 증가 (도 6b)하였음을 확인하였다 (실시예 5).
상기 결과들을 통해서 본 방법의 방법으로 제조한 마우스는 신경절 교세포종의 특징인 신경세포의 이형성과 교세포의 수적 증가가 관찰되므로, 신경절 교세포종 질환이 유도된 동물 모델로서 적합함을 알 수 있었다.
본 발명의 뇌전증 동물 모델은 유전자 기능에 대한 연구, 뇌전증의 분자적 기작 및 신규 항 뇌전증제 탐색 등의 연구에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물에 뇌전증 치료 후보물질을 투여한 후 뇌전증 경감 여부를 확인하는 단계를 포함하는 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 뇌전증이 유도된 동물에 뇌전증 치료 후보물질을 투여한 후, 뇌전증 증상을 간접적으로 또는 직접적으로 경감시키는 물질은 뇌전증 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 뇌전증 치료 후보물질의 부재 하에 뇌전증 증상을 측정하고, 뇌전증 치료 후보물질 존재 하에서 뇌전증 증상을 측정하여 양자를 비교한 후, 뇌전증 치료 후보물질이 존재할 때의 뇌전증 증상이 뇌전증 치료 후보물질의 부재 시 증상보다 경감시키는 물질을 뇌전증 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 아미노산 서열중 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 아미노산을 포함하는 단백질의 활성 저해제를 포함하는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 서열번호 1 아미노산 서열중 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 아미노산을 포함하는 단백질의 활성 저해제의 구체적인 예는, Vemurafenib 또는 이의 염, 및 Dabrafenib 또는 이의 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 저해제는 Vemurafenib 또는 Dabrafenib 일 수 있으며, 상기 Vemurafenib는 PLX4032, PLX4720, 또는 Zelboraf라고도 불린다.
본 발명의 일 실시예에서 BRAF V600E 돌연변이를 세포에 도입할 경우 BRAF 단백질이 과활성화되므로 난치성 뇌전증이 유발될 수 있음을 확인하였고, 상기 BRAF V600E 단백질의 활성 저해제를 투여할 경우 신경절 교세포종 (GG)으로 인한 난치성 뇌전증의 예방, 개선 또는 치료와, 이들 난치성 뇌전증의 원인 질환인 신경절 교세포종 (GG)의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 발작의 감소여부로 확인하였다 (실시예 8).
본 발명은 난치성 뇌전증의 예방, 개선 또는 치료와 이들 난치성 뇌전증의 원인 질환인 신경절 교세포종 (GG)의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 키트, 또는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 난치선 뇌전증은 뇌 체성 돌연변이 연관 난치성 뇌전증에 관한 예방, 치료 및/또는 개선 용도에 관한 것이다.
상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 mTOR 신호전달 경로의 활성화에 의해서 발생하는 것이 아닐 수 있고, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 교세포가 아닌, 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으며, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 배아 발생단계의 신경세포에서 발현하여 발생하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배아 발생단계는 낭배기까지의 시기를 의미할 수 있고, 구체적으로 기관이 형성되기 이전의 시기를 의미할 수 있다.
상기 저해제를 포함하는 조성물은 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증에 의해서 발생하는 발작을 감소하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 저해제는 Vemurafenib, 또는 Dabrafenib일 수 있고, 상기 저해제는 상기 화합물의 유도체 또는 유사체 및 약학적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 모두 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 염 또는 수화물은 무기산 또는 유기산으로부터 유도된 염 또는 수화물 일 수 있고, 일예로, 염으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 만델산, 타타르산, 시트르산, 아스코빈산, 팔미트산, 말레인산, 하이드록시말레인산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 수화물은 Vemurafenib 이 물 분자와 결합하여 형성된 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 "치료"는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증과 관련된 증상은, 뇌의 발달과정에서 신경 세포가 적절한 뇌의 지역으로의 이동에 실패하게 되어 나타나는 것으로, 자발적 발작, 행동발작, 뇌파 발작 및 대뇌에서 비정상적인 신경 세포의 발생 등을 예시할 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 치료는 이러한 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 환자에 대하여 BRAF V600E 단백질 활성 저해제, 예를 들면 Vemurafenib 을 투여함으로써, 자발적 발작, 행동발작 또는 뇌파 발작이 나타나는 횟수를 현저하게 경감시키고, 대뇌에서 비정상적인 신경 세포의 활성 또는 이상 신호를 줄이는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 BRAF 단백질 활성 저해제의 유효량은 당업자의 선택에 따라 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
일예로, 상기 약학 조성물은 BRAF 단백질 활성 저해제를 전체 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량％, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 중량％의 양으로 포함할 수 있다.
상기 BRAF 단백질 활성 저해제는 상기 약학 조성물 내에 단독으로 포함될 수 있으며, 또는 그 외 약리학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 약학 조성물에 첨가될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 사용 목적에 따라서 통상의 기술자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 환자에 대한 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의하여 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 1 mg/kg 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 50 mg/kg 내지 500 mg/kg, 보다 바람직하게는 150 mg/kg 내지 300 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로, BRAF 단백질 활성 저해제, 예를 들면 Vemurafenib 또는 이의 염을 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 식품 조성물은 통상의 다른 식품 조성물의 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. BRAF 단백질 활성 저해제는 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품용 조성물 제조시에는 유효성분의 원료에 대하여 0.01 내지 10 중량부, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물은 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 건강식품에 함유될 수 있으며 그 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 뇌전증의 바이오마커, 뇌전증 진단용 조성물, 뇌전증이 유도된 동물, 및 뇌전증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로, BRAF 돌연변이 단백질 및 핵산 분자, 상기 단백질 또는 핵산 분자를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 뇌전증 진단용 조성물, 상기 BRAF 돌연변이 핵산 분자로 형질전환된 뇌전증이 유도된 동물, 및 BRAF 돌연변이 단백질의 활성 저해제를 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 BRAF 돌연변이 단백질의 활성 저해제를 포함하는 뇌전증 예방 또는 치료용 조성물을 이용하여 신경절 교세포종 또는 이에 의한 뇌전증을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1a는 소아의 저병기 뇌종양에서는 BRAF V600E가 통계적 유의성을 가지고 두드러지게 많이 존재하고 있음을 확인한 그림이다.
도 1b는 신경절 교세포종 환자 (GG221)의 머리 자기공명영상 소견 (좌측) 과 화살표의 해당 병변을 수술 중 확인한 병리 조직 소견 (우측)을 확인한 그림이다.
도 1c는 신경절 교세포종 환자 (GG57, GG163, GG221, GG231, GG249, 및 GG381)의 수술 전 머리 자기공명영상 소견을 확인한 그림이다.
도 2a는 레이저 캡처 현미경 해부방법을 이용한 신경세포와 교세포에서의 BRAF V600E 돌연변이의 존재유무에 관한 실험의 방법을 도식화한 그림이다.
도 2b는 레이저 캡처 현미경 해부방법을 이용하여 신경세포 (왼쪽) 와 교세포 (오른쪽) 에서 BRAF V600E 돌연변이의 존재유무를 확인한 그림이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 마우스가 BRAF V600E 돌연변이 유전자를 발현하고 있는 것을 확인한 그림이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라서 BRAF V600E 돌연변이 유전자를 삽입한 플라스미드를 주입한 마우스에서 간질파를 동반한 자발적 발작이 발생했음을 확인한 그림이다.
도 3c, d, e는 본 발명의 일 실시에에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 얻은 뇌조직에서 뇌전증에 특징적인 병리적 특징을 확인한 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 자발적 활동파와 여러 채널에서 동시에 일시적으로 짧은 주기의 고진폭의 에너지가 방출되는 이루어지는 synchronized burst firing이 나타나는 것을 확인한 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 신경절 교세포종에서 특징적으로 나타나 있는 신경세포의 이형성이 동반되어 있음을 확인한 그림이다.
도 6a는 BRAF V600E 변이를 가지는 신경원시세포들의 딸세포들을 추적하기 위해 conditional floxed tdTomato 마우스를 교배하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이를 가진 신경원시세포에서 교세포 계열 관련 성상 교세포 또는 희돌기 교세포들이 정상 뇌조직에 비해 유의하게 증가했음을 확인한 그림이다.
도 6c는 상기 도 6b의 조직 사진을 고배율로 확대하여 재촬영한 그림이다.
도 6d는 실제 환자 조직에서 면역조직화학염색 방법을 통해 CD34발현이 증가하였음을 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 CD34의 발현량이 증가함을 확인한 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 CD34 마커가 증가하는 것을 보여주는 면역형광염색 소견 (왼쪽)과 면역조직화학염색 (오른쪽) 소견을 보여주는 그림이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 피질의 이상 적층을 관찰한 그림이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예의 방법으로 마우스 모델을 제작하였을 때 BRAF V600E 돌연변이를 가진 뇌조직이 정상 뇌조직과 달리 위쪽과 아래쪽에 걸쳐 분포가 달라져, 피질 이형성을 나타냄을 확인한그림이다. 도 10의 하단의 그림에서는 이러한 관찰을 확대해서 보였고, 전체 신경세포의 양에는 변화가 없음을 확인하였다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이를 교세포에서만 발현하는 마우스에서 간질의 행동양식은 나타나지 않고 다만 교세포 계열의 세포들의 수가 증가하는 것을 확인한 그림이다.
도 12는 성체 마우스에서의 타목시펜을 이용해 유도가능한 BRAF V600E 돌연변이 마우스 제작방법을 나타낸 그림이다.
도 13은 성체 마우스에서의 바이러스를 이용해 유도가능한 BRAF V600E 돌연변이 마우스 제작방법을 나타내는 그림이다.
도 14는 성체 마우스에서 BRAF V600E 돌연변이 유도한 경우에서 세포학적 이상 양상을 확인한 그림이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 BRAF V600E 특이적 저해제 지속적 뇌실내주입 (cICV, chronic intracerebroventricular injection)을 통한 발작의 감소를 비디오 모니터링 뇌파 분석을 통한 발작극파의 측정을 이용해 확인한 그림이다. POD (post operation day)는 수술 후 날을 의미하고, ictal seizure는 간질발작을 의미한다.
도 16는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 BRAF V600E 특이적 저해제 지속적 뇌실내주입을 통한 발작의 감소를 비디오 모니터링 뇌파 분석을 통한 발작 간극파 (Interictal spike)와 전기생리학적 발작극파 (Electrographic seizure)의 측정을 이용해 확인한 그림이다.
도 17는 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 BRAF V600E 특이적 저해제 일시적 뇌실내주입 (aICV, acute intracerebroventricular injection)과 경구 투약 (PO, per oral)을 통해 비디오 모니터링 뇌파분석에서 발작의 감소가 나타나지 않음을 확인한 그림이다. P0
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라서 제작한 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 mTOR 신호 전달 경로의 활성화 여부를 확인한 그림이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유전체 공용 데이터 분석을 통한 유전체 범위 프로파일링
소아의 저병기 신경교종은 일반 성인의 뇌종양과 임상양상이 많이 다른데 특히 이들 환자군에서 뇌전증이 동반되는 비율이 높은 것으로 알려져 있다. 소아 저병기 신경교종 (Pediatric low grade glioma)에서 왜 높은 빈도로 뇌전증이 발생하는지 확인하기 위해서 TCGA (The Cancer Genome Atlas), PeCan (Pediatric Cancer Genomic Data Portal)와 같은 유전체 공용 데이터를 분석하여 성인과 소아의 뇌종양에서 구분되는 돌연변이 유전자 타입을 분류하였다.
그 결과 도 1에 나타난 것과 같이 성인의 뇌종양에서는 IDH1, 및 TP53과 같은 유전자의 돌연변이가 현저하게 많이 존재했지만, 소아의 저병기 뇌종양에서는 BRAF V600E 돌연변이가 통계적 유의성을 가지고 현저하게 많이 존재하였다.
　 성인 뇌종양 소아 뇌종양 소아 저병기 신경교종
환자의 숫자 (n) 283 274 73
유전자 종류 돌연변이의 숫자 (비율%)
IDH1 215(75.97) 3(1.09) 1(1.37)
TP53 128(45.23) 38(13.87) 0(0)
H3F3A 0(0) 47(17.15) 3(4.11)
CIC 26(9.19) 1(0.36) 1(1.37)
BRAF 2(0.71) 5(1.82) 19(26.03)
ATRX 16(5.65) 3(1.09) 1(1.37)
PIK3CA 2(0.71) 16(5.84) 0(0)
SMARCA4 8(2.83) 9(3.28) 0(0)
ACVR1 0(0) 16(5.84) 0(0)
NOTCH1 14(4.95) 2(0.73) 0(0)
전체 411 140 25
실시예 2. 전체 엑솜 시퀀싱을 이용한 BRAF V300E 돌연변이 확인
2-1. 5명의 환자에서 전체 엑솜 시퀀싱으로 BRAF V600E 돌연변이 후보군 확인
종양 유래성 뇌전증 환자 모델을 동물 모델에서 정확히 반영하기 위해서, 소아에서 간질관련 종양을 일으키는 가장 큰 원인으로 알려져 있는 신경절 교세포종을 선정하여 상기 신경절 교세포종에서 존재하는 유전자 돌연변이를 선별하기 위해서 신경절 교세포종 환자 5명 (GG29, GG30, GG221, GG231, 및 GG249로 명명)의 수술 후 뇌조직과 혈액 샘플을 채취하였다.
신경절 교세포종 환자의 뇌조직 시료에서 전체 엑솜 시퀀싱 (deep whole exome sequencing, read depth 630-672)을 수행하였고, 전체 엑솜 시퀀싱의 Strelka와 Mutect 두 가지 알고리즘에서 동시에 발견되는 후보 돌연변이인 BRAF V600E를 선별하였다.
구체적으로, 전체 엑솜 시퀀싱 데이터 획득 (whole exome sequencing)을 위해서 제조사가 제공하는 Agilent library preparation protocols (Agilent Human All Exon 50 Mb kit)을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작한 시퀀싱 라이브러리를 Hiseq2000 (Illumina)을 사용하여 시퀀싱을 수행하였으며, 분석의 정확성을 높이기 위해서 일반적인 시퀀싱 뎁스 (depth)의 5배 뎁스 (~500x)로 시퀀싱을 수행하였다.
상기 시퀀싱 후 나온 데이터는 Broad Institute best practice pipleline (https://www.broadinstitute.org/gatk/)을 사용하여 분석할 수 있는 형태의 파일 (bam file)로 변환하여 저장하였다.
샘플 전체 수율 (bp) 목적 부위 (X)의 전체 뎁스
 목적 부위 (X)의 평균 뎁스
GG221-Blood 44,917,301,962 630.4 293.35
GG221-Brain 39,837,168,006 559.1 296.33
GG29-Blood 47,943,121,572 579.8 327.14
GG29-Brain 43,394,449,010 596.3 328.11
GG30-Blood 43,443,678,228 609.0 329.51
GG30-Brain 41,317,104,442 609.7 341.22
GG231-Blood 45,607,318,610 630.7 351.96
GG231-Brain 42,488,301,048 640.0 352.19
GG249-Blood 44,944,663,064 669.9 360.64
GG249-Brain 47,736,544,858 672.8 361.99
그 결과 표 2에 나타난 것과 같이, 신경절 교세포종 5명의 환자들 중 3명의 환자들에게서 공통적으로 BRAF V600E 돌연변이가 존재함을 확인할 수 있었고, BRAF V600E 돌연변이 외에 다른 유전자의 돌연변이는 관찰되지 않았다. 상기 신경절 교세포종에서 확인한 BRAF V600E 돌연변이는 서열번호 4의 인간 유전자 BRAF 유전자의 1799 티민이 아데닌으로 치환된 돌연변이이고, 이는 서열번호 3의 인간 BRAF 단백질 600번 발린 (V)이 글루탐산 (E)으로 치환된 돌연변이이다.
2-2. 확대 환자군에서 BRAF V600E 돌연변이 확인
실시예 2-1에서 신경절 교세포종 5명 환자들에서 존재하는 것으로 확인한 BRAF V300E가 다른 환자군에서도 존재하는지 확인하기 위해서, 환자군을 확대하여 전체 12명의 환자 (실시예 2-1에서 확인한 환자 5명 (GG29, GG30, GG221, GG231, 및GG249를 포함)에서 존재하는 유전자 돌연변이를 조사하였다 (표 3).
환자 코드
 수술 당시 나이 (년)
 주소견 뇌전증 발생기간 (년)
 성별 병리적 소견
 영상의학적 소견 시퀀싱 방법
 BRAF V600E 돌연변이 대립 유전자 비율 (%)
GG29 14 재발 발작
 3 남성
 백질내 신경절 교세포종 수술전 영상에서 부종을 동반한 1cm의 원형 병변이 오른쪽 모서리위이랑에 위치 전체 -
GG30 15 강장제 간헐적 경련성 발작
 4 남성
 신경절 교세포종에 가까운 다발성 석회화를 동반한 저병기 신경교종 수술전 자기공명영상에서 시상에서 크기가 증가한 낭성병변 전체 엑솜 시퀀싱
 -
GG54 16 재발 발작
 10 여성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 좌측해마곁이랑, 방추형이랑 및 편도에 신경절 교세포종에 가까운 저등급 병기 피질 종양 목적 패널 시퀀싱 -
GG57 14 장기간 난치성 뇌전증
 1 남성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 근심측두엽에 1.4cm의 덩어리 목적 패널 시퀀싱
 18.50
GG163 6 장기간 난치성 0.5 남성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 후내측 측두엽에 T2에서 증강되는 방성병변 목적 패널 시퀀싱
 28.87
GG221 6 장기간 난치성 뇌전증
 0.5 여성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 좌측 측두엽에 1cm의 낭성 병변 전체 엑솜 시퀀싱
 15.44
GG231 7 장기간 난치성 뇌전증
 2 남성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 오른쪽 갈고리 이랑에 1.5cm의 T2 증강 병변 전체 엑솜 시퀀싱
 17.86
GG249 5 장기간 난치성 뇌전증
 1 여성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 우측 후측두엽에 T2증강 국소병변 전체 엑솜 시퀀싱
 19.05
GG263 2 재발 발작 1 남성
 신경절 교세포종에 가까운 저병기 신경교종 좌측전두엽에 T2증강 신호 목적 패널 시퀀싱
 -
GG351 5 발작 1 남성
 신경절 교세포종에 가까운 종양 연관 난치성 뇌전증
 -　 목적 패널 시퀀싱
 -
GG356 9 발작 2 남성
 신경절 교세포종에 가까운 종양 연관 난치성 뇌전증
 -　 목적 패널 시퀀싱
 -
GG381 7 장기간 난치성 뇌전증 1 남성
 신경절 교세포종에 가까운 종양 연관 난치성 뇌전증
 갈고리이랑, 측해마이랑 및 하측두엽 이랑을 포함하는 지역에 2.8cm의 낭성 병변 목적 패널 시퀀싱
 7.41
상기 BRAF V600E 돌연변이는 환자의 혈액에서는 발견되지 않았고, 뇌 조직 시료에서 특이적으로 발견되었다.
그 결과 표 3에서 확인할 수 있는 것과 같이, 전체 12개의 신경절 교세포종 환자군중에서 6명의 환자에서 BRAF V600E 돌연변이가 존재함을 확인할 수 있었고 (유전변이율은 50%의 비율), 각 환자 내에서 존재하는 BRAF 정상 대립 유전자 대비 BRAF V600E 돌연변이 대립 유전자의 비율은 약 7 내지 30%였음을 확인할 수 있었다.
2-3. 환자 시료 채취 및 게놈 DNA 추출
실시예 2-2에서 사용한 신경절 교세포종 (Ganglioglioma, GG)으로 인한 난치성 뇌전증 환자 12명에 대하여 해당 환자 전원의 동의 하에 환자의 뇌조직 (1~2 g), 타액 (1~2 mL), 혈액 (약 5 mL), 동결 조직 및 포르말린 고정 파라핀 포매된 뇌 조직을 얻었다 (세브란스 병원 소아신경외과 및 소아신경과). 하기의 키트를 제조사의 프로토콜을 사용하여 환자의 뇌조직, 혈액, 타액, 동결 및 포르말린 고정 파라핀 포매 뇌조직의 게놈 DNA를 분리하였다:
뇌조직: Qiamp mini DNA kit (Qiagen, USA), 혈액 : Flexigene DNA kit (Qiagen, USA), 타액 : prepIT2P purification kit (DNAgenotek, USA), 동결 조직 및 포르말린고정 파라핀 포매 뇌조직 : Qiamp mini FFPE DNA kit (Qiagen, USA).
2-4. 신경절 교세포종 특이적인 유전자 돌연변이 서열분석
신경절 교세포종 환자에 BRAF V300E 돌연변이가 존재하는지 여부를 추가적으로 확인하기 위해서, 실시예 2-2에서 확인한 12명의 환자중에서 실시예 2-1에서 확인한 환자 5명을 제외한 나머지 7명의 환자에 대하여 리드 깊이가 100-17,700이 되도록 하이브리드 캡쳐 시퀀싱을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
상기 7명의 신경절 교세포종 환자에 대하여 실시예 2-3과 같은 방법으로 게놈 DNA를 추출하고 이에 대하여 하이브리드 캡쳐 염기서열 분석을 수행하였다. 상기 하이브리드 캡쳐 염기서열 분석을 위해서 SureDesign online tools (Agilent Technologies)를 이용하여 BRAF 유전자 특이적인 probe를 제작하였다. 제조사가 제공하는 Agilent library preparation protocols을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작한 시퀀싱 라이브러리에 대하여 Hiseq2500 (illumina)를 사용하여 중앙 리드 깊이가 500x이 되도록 시퀀싱을 수행하였다. 상기 시퀀싱 후 나온 데이터는 Broad Institute best practice pipeline (https://www.broadinstitute.org/gatk/)을 사용하여 분석할 수 있는 형태의 파일 (bam file)로 만들었다.
뇌조직 특이적인 de novo 체성 돌연변이를 찾기 위하여 혈액, 및 뇌조직의 유전자 시퀀싱 결과중에서 Strelka와 Mutect 두 가지 알고리즘에서 동시에 발견되는 체성 돌연변이를 선발하였다. 또한, 하이브리드 캡쳐 시퀀싱 결과에서 모두 발견된 유전변이 중 깊이 100이상 mutated call 3개 이상 (mapping quality 30 이상)의 선별기준을 만족하는 유전변이만을 질환 관련 유전자 후보로 선정하였다.
상기 시퀀싱 과정에서 발생하는 오류를 확실히 제거하기 위해서 유전변이율이 1% 이상인 경우만 양성으로 보았고, 혈액, 및 뇌조직의 게놈 DNA에서 하이브리드 캡쳐 엑솜 염기서열 분석을 수행하였을 때 모두 변이가 나타난 경우에만 이를 양성으로 보아 해당 변이를 진성 돌연변이로 선택하였다.
그 결과 하기 표 4에 나타난 것과 같이, 유전변이 양성환자 (유전변이율이 1% 이상)의 타액과 혈액 (대조구)에서는 BRAF V600E 돌연변이가 밝견되지 않았다 (음성). 그러나, BRAF V300E 돌연변이는 3 환자 (GG221, GG231, GG249) 에서는 BRAF V300E 돌연변이가 반복적으로 검출되었고, BRAF 정상 대립 유전자 대비 BRAF V300E 돌연변이 대립 유전자의 비율은 7% 내지 30%였다.
환자 타액 (BRAF V600E 돌연변이 존재 여부) 혈액 (BRAF V600E 돌연변이 존재 여부) 뇌 조직 내BRAF V600E 돌연변이 대립 유전자 비율 (%)
GG221 - -
 15.44
GG231 - -
 17.86
GG249 - -
 19.05
실시예 3. 레이저 캡처 세포박리법을 이용한 BRAF V600E 돌연변이의 세포 특이적 존재 확인
환자 치료에 이용하기 위해서는 적절한 모델 생명체의 원형 (prototype)을 제작하여야 하는데, 상기 모델 생명체의 원형을 제작하기 앞서 BRAF V600E 돌연변이가 정확히 신경세포에 존재하는지, 또는 교세포 계열의 세포주에서 존재하는지 여부를 확인할 필요가 있어 하기와 같은 실험을 수행하였다.
BRAF V600E 돌연변이가 정확히 신경세포에 존재하는지, 또는 교세포 계열의 세포주에서 존재하는지 여부를 확인하기 위해서, BRAF V600E 돌연변이가 확인된 GG221, GG231 환자 조직을 신경세포에 특이적인 마커와 교세포에 특이적인 마커로 각각 면역형광염색 방법을 이용해서 염색한 뒤 특정 조직형의 세포만을 레이저 캡처 현미경 해부라는 방법을 이용하여 분리해서 BRAF V600E 돌연변이의 존재유무를 확인하였다.
실시예 2에서 사용한 신경절 교세포종 환자 조직 중 BRAF V600E 돌연변이가 확인된 외과적 조직 덩어리 (surgical tissue block) (GG221, GG231 환자 조직)를 새롭게 준비한 phosphate-buffered (PB)하의 4% (w/v) paraformaldehyde (고정), 20% (w/v) buffered sucrose (동결방지 (cryoprotect)), 10% (w/v) sucrose/PB하의 7.5% (w/v) gelatin에서 밤새 배양하여 gelatin-embedded 조직 덩어리를 만들어서 -80℃에서 보관하였다.
상기 제작한 gelatin-embedded 조직 덩어리를 -50℃의 2-methylbutanes에 급속히 담가, gelatin embedded 조직 덩어리를 빠르게 동결시키고, -20℃하의 환경에서 동결조직 절편기 (Leica) 를 사용하여 10 um 두께의 동결절편 (Cryostat-cut section)을 만들고, 상기 동결절편을 유리 슬라이드 (glass slide)위에 놓고, 상온에서 한 시간 동안 PBS-GT (0.2% (w/v) gelatin 및 0.2% (v/v) Triton X-100 in PBS)로 차단 (block)하고, 하기 항체들로 염색 (stain)하였다: mouse monoclonal anti-NeuN (1:200, #MAB377, Millipore) 및 rabbit polyclonal anti-oligodendrocyte Lineage Transcription Factor 2 (Olig2) (1:500, AB9610, Millipore). 세번의 PBS 세척 후 조직 슬라이드는 다음과 같은 이차항체로 염색하였다 : 마우스에 대한 Alexa Fluor 555-conjugated 염소 항체 (Alexa Fluor 555-conjugated goat antibody to mouse) (1:200 dilution; A21422, Invitrogen) 또는 토끼에 대한 Alexa Fluor 488-conjugated 염소 항체 (Alexa Fluor 488-conjugated goat antibody to rabbit) (1:200 dilution; A11008, Invitrogen). Mounting 용액(mounting solution) (P36931, Life technology)에 포함된 DAPI는 핵 염색에 사용하였다. Leica DMI3000 B 도립 현미경(inverted microscope)을 이용하여 형광이미지를 얻었다. 염색된 조직중에서 PALM MicroBeam (Carl Zeiss) 현미경을 이용해 NeuN 양성이면서 Olig2 음성, 반대로 NeuN 음성이면서 Olig2 양성인 세포들만을 약 50개 정도를 떼어내어 QIAamp DNA Micro Kit으로 genomic DNA만을 추출한 뒤 표 5의 프라이머를 이용해 PCR을 수행한 후, 증폭된 PCR 산물은 MEGAquick spin total fragment purification kit(Intron, Korea)을 사용하여 정제한 후 BioDye Terminator and automatic sequencer system (Applied Biosystems)을 사용하여 Sanger 시퀀싱을 수행하였다.
이름 프라이머 서열번호
BRAF_LCM_F 5'- TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG -3' 5
BRAF_LCM_R 5'- AGCCTCAATTCTTACCA TCCAC -3' 6
그 결과 도 2b에서 확인할 수 있는 것과 같이, 신경세포 (도 2b의 왼쪽) 및 교세포 (도 2b의 오른쪽) 두 종류의 서로 다른 세포에서 BRAF V600E 돌연변이 (BRAF Chr7: 140453136 for c.1799T>A 돌연변이)가 존재함을 확인할 수 있었다.
도 2b에서와 같이 서로 다른 두 세포인 신경세포 및 교세포에서 동일한 돌연변이가 존재함을 통해서, 신경세포와 교세포 모두의 공통적인 조상의 세포에서 상기 돌연변이가 발생했음을 유추할 수 있었다.
실시예 4. BRAF V600E 돌연변이를 발현하는 마우스에서 뇌전증 환자의 표현형 확인
4-1. 동물 모델 마우스에서 자발적 발작의 확인
실시예 1 내지 3에서 확인한 뇌전증 환자에서 나타나는 BRAF V600E 돌연변이를, 발현할 수 있는 conditional floxed BRAF V600E 마우스를 제작하고, 상기 마우스를 conditional floxed tdTomato 마우스와 교배하여 배아기 14일이 되는 timed pregnant를 제작한 뒤, Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 유전자를 자궁내 전기천공법으로 도입하여 신경절 교세포종 환자의 상황과 유사한 동물 모델을 제작하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시에에서는 공지된 site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 서열번호 4에 기재된 염기서열 중에서 1910번째 티민이 아데닌으로 친환된 유전자를 증폭하고, 이를 Cre 의존적 LoxP 서열에 넣은 산물을 마우스 배아에 주입하여 Cre 의존적 조건 돌연변이로 치환된 형질전환 마우스를 제작하였으며, 상기 제작된 마우스와 tdTomato 마우스를 교배하여 얻은 마우스의 임신 14일 (E14)이 되었을 때에 자궁각(uterine horn)이 노출하여 개개 배아 (embryo)의 측뇌실 (Lateral ventricle)에 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 2 내지 3 ug과 결합한 Fast Green (F7252, Sigma, USA) 2 ug/ml을 pulled 모세관 (pulled glass capillary)를 이용하여 주입하였다. Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 (pCAG-Cre-IRES2-GFP, addgene, #26646)는 배아의 머리에 900 ms의 간격에 100 ms의 5번 전기 펄스인 ECM830 eletroporator (BTX-harvard apparatus)로 50V를 방전하여 전기천공(electroporation) 하였다.
상기 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 전기천공한 마우스 태아의 뇌조직을 떼어내어 표 6의 프라이머 및 i-Taq TM DNA Polymerase kit (Intron, #25021) 를 이용하여 genotyping PCR을 시행하였다.
이름 프라이머 서열번호
LSL-BrafV600E Fwd 5'-CCCAGGCTCTTTATGAGAA-3' 7
LSL-BrafWT Rev 5'-AGTCAATCATCCACAGAGACCT-3' 8
LSL-BrafV600E Rev 5'-GCTTGGCTGGACGTAAACTC-3' 9
그 결과 도 3a에 나타난 것과 같이, 제작한 마우스는 BRAF V637E 돌연변이 유전자를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (마우스 BRAF V637E 돌연변이이지만, 관용적으로 인간 BRAF V600E와 마찬가지로 BRAF V600E라고 표시하므로, 이하는 BRAF V600E라고 기재함).
제작한 모델 마우스의 뇌에서 실제로 전기생리학적으로 간질파가 나타나는지 확인하기 위해, 상기 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드를 전기천공한 마우스 태아를 태어나게 한 후, 생후 3주 이후부터 비디오 뇌전도 (Video-Electroencephalography, video-EEG) 검사를 수행하였다. 발작파를 전기적인 신호로 분석하기 위해 생후 3주 이후부터 비디오 뇌전도 감시를 수행하였다. 태아를 어미와 분리한 후 하루에 12시간 비디오 감시를 통해서 긴장-간대발작이 시작되는지를 확인하였다. 그 후 발작을 보이는 쥐를 하루 6시간 2일이상 비디오-뇌전도 감시를 실하여 간질파를 보이는 자발적 발작에 대해서 조사하였다.
발작간극파와 비경련성 뇌파발작의 빈도를 측정하기 위하여 10 내지 12시간정도 촬영한 비디오 뇌전도 데이터를 사용하였고 이 데이터로부터 1시간 간격으로 1분의 데이터를 추출하여 분석하였다.
발작간극파와 비경련성 뇌파발작의 빈도는 쥐의 유전형을 모르는 관찰자가 계측하였다. 발작간극파는 200 ms 이하의 간질모양의 파가 일정한 간격으로 나타나며 배경뇌파에 비해 2배이상의 진폭을 가진경우로 정의하였고 비경련성 뇌파발작은 적어도 2개 이상의 이어진 극서파 (1~4 Hz)가 배경뇌파에 비해 2배이상의 진폭으로 나타내며 4개의 전극에서 모두 관찰되는 경우로 정의하였다.
구체적으로, 상기 마우스가 젖을 땐 후 (>3weeks) Video monitoring만을 통해 발작 (Seizure) 발생 유무를 확인한 후, 뇌전도 측정을 위해 전극을 식립하는 수술을 진행하였다. 전극은 경뇌막 상층(epidural layer)에 위치하도록 하였으며 천정점 (Bregma)를 기준으로 전두엽 부위에 2개 (AP+2.8mm, ML
Figure pat00001
1.5 mm), 측두엽 부위에 2개 (AP-2.4mm, ML
Figure pat00002
2.4 mm) 소뇌부위에 1개를 식립하여 총 5개의 전극을 식립하였다. 4일간의 회복기간을 가진 후 저녁 6시부터 새벽 2시의 시간에 마우스당 2~5일간 (하루 6시간) 뇌전도 측정을 수행하였다. 뇌전도 신호는 amplifier (GRASS model 9 EEG/Polysomnograph, GRASS technologies, USA)에 의해 증폭되었으며 pCLAMP program (Molecular Devices, USA) 또는 RHD2000 amplifier, board (Intan technoloties, USA) 및 MATLAB EEGLAB(http://sccn.ucsd.edu/eeglab)을 이용하여 상기 신호를 분석하였다.
그 결과 도 3b에 나타난 것과 같이, BRAF V600E 돌연변이 유전자를 발현하는 마우스의 90% 이상이 간질파를 동반한 자발적 발작을 나타냈고, 간질파는 높은 진폭의 고주파, 높은 진폭의 극서파, 저진폭의 고주파를 나타냈다. BRAF V600E 돌연변이 유전자를 발현하는 쥐에서는 발작간극파 역시 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 자발적 발작을 나타내는 마우스는 긴장기, 간대기 후발작기로 이루어진 전신 긴장-간대성 발작을 보이며, 이는 신경절 교세포종 환자에서 발생하는 증상과 유사했다. 또한, 상기 마우스의 긴장 뇌파는 저전압, 고주파의 동조된 다주파를 보이고 간대기의 뇌파는 고전압의 일정한 형태를 보이고, 후발작기는 동조된 감쇠 진폭을 보이는 것을 확인하였다. 이와 달리, 야생형 BRAF 단백질을 발현하는 마우스는 자발적 발작이나 간질파를 보이지 않았다.
따라서, 상기 결과를 바탕으로 BRAF V600E 돌연변이 유전자를 삽입한 플라스미드를 주입한 마우스에서 간질파를 동반한 자발적 발작이 발생했음을 알 수 있었다.
4-2. 동물 모델 마우스에서 신경세포 과활성 확인
실시예 4-1에서 제작한 모델 마우스에서 나타나는 간질파를 전기생리학적으로 분석하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 4-1에서 제작한 모델 마우스를 vibratome으로 마우스 뇌 피질 슬라이스를 얻은 뒤 인공 뇌척수액 용액에서 자발적 활동 전위를 측정하였다. 인공뇌척수액 조성은 다음과 같다: in mM, 124 NaCl, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 및 10 D-glucose. 상기 마우스 뇌피질 슬라이스를 뇌 다채널 전극 기록장치 (MED64 probe, #P515A, Panasonic Alpha-Med Sciences)에 올려두고 슬라이드 고정대 (Slice anchor kit, SHD-22CKIT, Warner Instruments)를 이용해 지지한 뒤 15분 동안 2 mL/분의 속도로 인공 뇌척수액을 흘려주면서 37℃/5% CO2 조건 하에서 발생하는 간질파를 측정하였다. Spikes는 Mobius software (Alpha Med Scientific)를 이용해서 검출하였다.
그 결과는 도 3c 및 도 4에 나타나 있다.
도 3c의 왼쪽에 의하면 BRAF V600E돌연변이를 유도할 경우 90%의 가까운 마우스에서 간질 발작을 일어났고, 도 3c의 가운데에 의하면 도 3c 에서 발작을 일으키는 마우스들의 경우 평균 6주 내지 7주 경부터 간질 표현형을 보이기 시작했다.
도 3c의 오른쪽에 의하면 도 3c 에서 발작을 일으키는 BRAF V600E 돌연변이형 마우스들의 개개의 발작이 시작하는 시기를 확인할 수 있었다.
도 4에 의하면 대조군과 달리 BRAF V600E 돌연변이를 가진 뇌조직에서 뇌전증에 특징적인, 자발적 활동파와 여러 채널에서 동시에 일시적으로 짧은 주기의 고진폭의 에너지가 방출되는 이루어지는 synchronized burst firing 이 나타나는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해서 대조군인 야생형 BRAF 단백질을 발현하는 마우스에서 얻은 뇌조직과 달리 BRAF V600E 돌연변이 단백질을 발현하는 마우스에서 얻은 뇌조직에서 뇌전증에 특징적인, 자발적 활동파와 여러 채널에서 동시에 일시적으로 짧은 주기의 고진폭의 에너지가 방출되는 이루어지는 synchronized burst firing이 나타나는 것을 확인할 수 있었다, 이를 통해서 실시예 4-1에서 제작한 모델 마우스에서 신경세포가 과활성화되었음을 알 수 있었다.
실시예 5: BRAF V600E 돌연변이를 발현하는 마우스의 뇌전증 연관 종양 특이성 확인
5-1. BRAF V600E 돌연변이 동물 모델 마우스의 면역형광염색법
실시예 4-1에서 제작한 동물 모델 마우스의 뇌조직에 대하여 실시예 3과 같은 방법으로 실험을 수행하여 gelatin-embedded 조직 덩어리를 만들었고, 이를 -80℃에서 보관하였다.
실시예 3과 같은 방법으로 gelatin-embedded 조직 덩어리를 동결절편으로 만들고 이를 유리 슬라이드 위에 놓고, 하기 항체들로 염색하였다: mouse monoclonal anti-NeuN (1:200, #MAB377, Millipore), rabbit polyclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (1:500, #z0334, DAKO), rabbit polyclonal anti-oligodendrocyte Lineage Transcription Factor 2 (Olig2) (1:500, AB9610, Millipore), rabbit monoclonal anti-S100 beta (1:500, ab52642, Abcam), rabbit monoclonal anti-CD34 (1:500, ab81289, Abcam), mouse monoclonal anti-glutamate decarboxylase 67 (GAD67) (1:500, #MAB5406, Millipore), mouse monoclonal anti-parvalbumin (PV) (1:500, #MAB1572, Millipore), rabbit polyclonal anti-vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) (1:500, #135 303, Synaptic Systems), rabbit polyclonal anti-vesicular GABA transporter (VGAT) (1:500, #135 002, Synaptic Systems), mouse monoclonal anti-GFP (1:500, #Ab1218, Abcam), rabbit polyclonal anti-GFP (1:500, #Ab290, Abcam), rabbit polyclonal anti-REST (1:200, IHC-00141, Bethyl Laboratories) 및 rabbit polyclonal anti-CUX1 (1:400, SC13024, Santa cruz). 세번의 PBS 세척 후 조직 슬라이드는 다음과 같은 이차항체로 염색하였다 : Alexa 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:500, #A11008, Invitrogen) 또는 Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:500, #21428, Invitrogen). Mounting 용액(mounting solution)(P36931, Life technology)에 포함된 DAPI는 핵 염색에 사용하였다. Leica DMI3000 B 도립 현미경(inverted microscope)이나 Zeiss LSM780 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 얻었다. NeuN에 양성인 세포 수는 10x 대물렌즈 (objective lens)를 이용하여 측정하였다; 뉴런이 풍부한 지역(regine) 내에서 하나의 시료(subject)당 4 내지 5 필드를 얻었고, 지역당 100개 이상의 세포를 기록하였다. DAPI-양성 세포의 수는 전체 세포 수를 나타낸다. 뉴런세포 크기는 NeuN 양성 세포에서 ImageJ software의 자동화된 카운팅 프로토콜 (automated counting protocol of ImageJ software) (http://rsbweb.nih.gov/ij/)을 이용하여 측정하였다. 신경세포의 circularity와 aspect ratio 및 가지돌기의 피질면에 대한 각도는 ImageJ에서 자동적으로 계산한 값을 참조하였다.
5-2. 면역형광염색한 조직의 정량 분석을 통한 신경세포 이형성의 확인
실시예 5-1과 같은 방법으로 면역형광염색한 결과는 도 5에 나타나 있다.
그 결과 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 4와 같은 방법으로 BRAF V600E 돌연변이를 전기천공으로 유도한 대뇌영역의 GFP 양성세포의 경우 신경절 교세포종에서 특징적으로 나타나 있는 신경세포의 이형성이 동반되어 있음을 확인할 수 있었고 (도 5의 A), 상기 GFP 양성 세포의 경우 세포의 크기가 커지고, 세포의 모양이 찌그러져 있으며 (도 5의 B) 세포 모양 및 신경세포의 가지의 배열이 정상 신경세포와는 달리 임의의 방향으로 배열되어 있는 것 (도 5의 C)을 확인할 수 있었다.
5-3. 면역형광염색한 조직의 정량 분석을 통한 교세포 증식의 증가 확인
실시예 4-1과 같은 방법을 사용하여 제작한 동물 모델 마우스에서 BRAF V600E 돌연변이를 가진 신경원시세포에서 분화되어 나온 딸세포들을 추적하기 위해서, 실시예 4-1과 같은 방법을 사용하여 Cre 재조합 효소에 의존적인 BRAF V600E 단백질을 발현하는 유전자로 치환된 형질전환 마우스를 tdTomato형광 단백질을 생성해낼 수 있는 마우스를 교배하여 마우스를 얻고, 상기 마우스에 대하여 Cre 재조합효소를 자궁내 전기천공법으로 도입하여 상기 마우스에서 유래한 BRAF V600E 돌연변이를 가진 신경 원시세포로부터 분화되어 나오는 딸세포들을 tdTomato 형광색으로 추적하였다.
그 결과 도 6b에서 확인할 수 있는 것과 같이, BRAF V600E 돌연변이를 가진 신경원시세포에서 분화되어 나온 딸세포들은 교세포 계열 관련 성상 교세포 (도 6b의 왼쪽 그림) 또는 희돌기 교세포들이 (도 6b의 오른쪽 그림) BRAF 정상 유전자를 발현하는 마우스의 뇌조직에 비해 유의하게 증가되어 있었다.
실시예 5-2 및 5-3의 결과를 종합해보면 실시예 4에서 제작한 BRAF V600E 돌연변이가 신경세포의 이형성과 교세포의 수적 증가가 함께 동반되어 있는 신경절 교세포종 질환을 잘 반영하고 있는 동물 모델임을 알 수 있다.
5-4. 면역형광염색한 조직의 정량 분석을 통한 CD34 마커 확인
신경절 교세포종은 종양 조직에서 병리학적으로 CD34의 발현량이 증가하는 특징이 있음이 종래에 알려져 있으므로, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직에서 실시예 5-1과 같은 방법으로 면역형광염색을 수행하여 CD34 마커의 발현량을 확인하였다.
그 결과 도 7에 나타난 것과 같이 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직에서도 대조군과 다르게 CD34의 발현이 2.2배 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 신결절 교세포종의 특징을 추가적으로 확인하기 위해서 병리학적으로 신결절 교세포종을 진단시 사용하는 헤마톡실린-에오신 및 DAB 면역조직화학염색을 사용하여 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직을 염색하였다.
구체적으로, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스의 심장을 통해 포르말린 (Sigma, # HT501128) 을 주입하여 고정시킨 후, 파라핀 포매기 (Leica TP1020) 에 하루 이상 파라핀을 침투시켜 포르말린 고정 파라핀 포매 마우스 뇌조직을 얻었다. 상기 포르말린 고정 파라핀 포매 마우스 뇌조직을 microtome (Leica RM 2135)을 이용해 4um 두께로 절단 후 슬라이드를 일반적인 헤마톡실린-에오신 염색을 하였다. CD34의 면역 조직화학염색을 위해서는 슬라이드를 먼저 sodium citrate 을 이용해 항원 회수를 하였고, 점진적인 농도의 알코올을 이용해 탈수시킨 뒤 3% (w/w) 과산화수소수 (H2O2) (Sigma aldrich, H6520)를 이용하여 내재적인 peroxidase 활성을 제거하였다. 이후 조직을 블로킹 용액인 PBS-GT (PBS하의 0.2% (w/v) gelatin 및 0.2% (v/v) Triton X-100)을 이용해 블로킹 한 뒤 anti-CD34 primary antibody (1:500, ab81289, Abcam)을 이용하여 상온에 보관하였다. 세번의 PBS 세척 후 2차 항체를 이용해 염색한 뒤 3,3'-Diaminobenzidine substrate 용액 (DAB, Vector Laboratories)을 사용하여 조직내 항원 결합 부위를 가시화하였다. 이미지 세기에 의한 편향을 배제하기 위해 정상과 BRAF V300E 돌연변이 마우스 조직 모두 같은 시간동안 반응시켰고 헤마톡실린으로 배경염색을 수행하였다.
그 결과 도 8 오른쪽 그림에 나타난 것과 같이, 정상 조직에서는 염색되지 않던 CD34의 발현이 BRAF V300E 돌연변이 마우스 뇌조직에서 돌연변이가 발생한 지역을 중심으로 두드러지게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 도 7 내지 도 8의 결과를 종합하여, BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이를 가진 마우스 뇌조직에서는 정상 유전자를 가진 마우스 뇌조직과 비교하여 현저하게 CD34의 발현이 증가하였고, 이러한 패턴은 특히 자궁내 전기천공을 통해 돌연변이가 유도된 신경세포 및 조직을 따라서 특징적으로 나타남을 알 수 있었다.
5-5. 면역형광염색한 조직의 정량 분석을 통한 피질이상적층의 확인
신경절 교세포종은 종양 조직에서 국소 피질 이형성증이 동반되거나 피질의 발달 기형의 일환으로 피질 이상적층 (Cortical dyslamination)이 관찰되는 경우가 많은 것으로 알려져 있으므로, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직에서도 유사한 양상이 나타나는지 확인하기 위해 실시예 5-4와 같은 방법으로 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직을 고정 및 준비한 뒤 실시예 5-1과 같은 방법으로 피질의 층을 구분하여 확인할 수 있는 Cux1 마커를 통해 염색을 수행하였다.
그 결과 도 9에 나타난 것과 같이, 정상 유전자를 가진 마우스 뇌조직과는 달리 BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이를 가진 마우스 뇌조직에서는 Cux1 마커가 피질의 상단부 뿐만 아니라 하단부에서도 강하게 관찰되고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 Cux1 양성인 신경세포들의 분포는 정상군과 달리 BRAF V600E 돌연변이가 있는 마우스에서 통계적으로 유의하게 음의 상관관계를 가지고 있음을 확인하여 BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이를 가진 마우스 뇌조직 피질의 이상 적층이 뚜렷이 나타나는 것을 알 수 있었다.
또한, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직을 실시예 5-1과 같은 방법으로 면역조직형광 분석하여 NeuN 및 tdTomato 동시 양성인 세포들의 분포를 확인하였을 때, 도 10 상단에서 확인할 수 있는 바와 같이 BRAF V600E 돌연변이를 가진 마우스 뇌조직에서 유래한 세포들이 정상적으로 분포하고 있지 않은 피질 하단부의 층에서도 NeuN양성이자 tdTomato양성인 신경세포가 유의하게 상당량의 분포함 (r = -0.1122, p < 0.0001)) 을 확인할 수 있었다.
그러나, 실시예 5-3에서 보인 교세포에서 나타난 증식증이 신경세포에서도 동시에 이환되어 있지는 않음을 도 10 하단을 통해서 알 수 있었다. 즉, 신경세포에서는 세포의 증식은 없이 피질 내 위치 이상만이 나타나 있었다.
5-6. 결과 정리 "G 요약
실시예 5-2, 5-3, 5-4, 5-5의 결과를 통해 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스 조직은 신경절 교세포종을 포함하는 소아 저병기 신경교종 중 뇌전증 동반 빈도가 높은 종양들의 소견을 상당히 유사하게 반영함을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 소견에는 BRAF V600E 돌연변이에 의한 신경세포의 이형성, 교세포 증식증, 신경세포의 가지돌기의 배열 이상, CD34 양성 소견, 및 피질 이상 적층의 이환 등이 있다.
실시예 6. BRAF V600E 돌연변이의 공간적 획득에 따른 표현형
소아의 뇌전증 관련 종양 및 소아 저병기 신경교종, 및 실시예 3 및 5-2에서 살펴본 바와 같이 본 발명에서 제시한 동물 모델 마우스의 경우 교세포에도 BRAF V600E 돌연변이가 존재하고 있기 때문에 신경세포 또는 교세포에서 유래된 돌연변이중 어떠한 돌연변이가 뇌전증을 유발하는데 중요한 역할을 하는지 확인할 필요가 있다.
이를 위해서, 실시예 4-1과 유사한 방법으로 신경절 교세포종 환자에서 발견되는 BRAF V600E 돌연변이를 Cre 의존적으로 발현할 수 있는 마우스를 제작하고, 상기 마우스 출생 후 1일째에 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드를 전기천공한 후 약 90일가량 행동을 추적관찰하였다.
구체적으로, 피질 신경계의 분화는 E14일에는 신경세포가, 출생 후에는 교세포의 분화가 활발히 이루어지기 때문에 Cre의존적인 유전자 발현을 할 수 있는 배아를 임신한 어미 마우스의 임신 14일차에 Cre 플라스미드를 주입하면 돌연변이가 신경세포와 교세포에서 발생하고, 마우스가 출생 후 1일차에 되는 시기에 Cre 플라스미드를 주입하면 돌연변이가 교세포에 발생하게 되므로, 상기 사실을 이용하여 교세포에서만 BRAF V600E 돌연변이를 발생시키기 위해서 실시예 4-1과 같이 마우스를 제작하되 Cre의존적인 유전자 발현을 할 수 있는 마우스가 출생 후 1일차에 되는 시기에 Cre 플라스미드를 주입하였다.
그 결과 도 11의 B에 나타난 것과 같이, 교세포에서만 BRAF V600E 돌연변이를 발생시키기도록 제작한 마우스 (GFAP, 및 OLIG2가 교세포 확인 마커) 에서는 발작이 전혀 발생하지 않은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 교세포에서만 BRAF V600E 돌연변이를 발생시키기도록 제작한 마우스에서도 교세포 증식증이 일어나는지 확인하기 위해서 실시예 5-3과 같이 실험을 수행한 결과, 도 11의 C에 나타난 것과 같이 교세포 증식증은 계속 유의하게 나타나고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 결과를 종합하여, BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이에 의한 뇌전증의 발달은 교세포에서 기원한 돌연변이와는 무관하며, 신경세포에서 발생하는 BRAF V600E 돌연변이가 간질 발생 기전에 중요한 역할을 함을 알 수 있었고, 또한, 교세포에서만 BRFA V600E 돌연변이가 발생하는 양성종양 증식이 증가 함을 알 수 있었다.
실시예 7: BRAF V600E 돌연변이의 시간적인 획득에 따른 표현형
뇌전증 연관 종양의 경우 소아에서 높은 비율로 발견되기 때문에 환자의 역학적인 정보와 같이 본 발명의 마우스 모델에서도 어린 시기의 BRAF V600E 돌연변이의 획득과 성체 마우스에서의 돌연변이 획득에서 표현형적인 차이가 있는지 여부를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
7-1. 성체 마우스에서의 타목시펜을 이용해 유도가능한 BRAF V600E 돌연변이
동물 모델 마우스 상에서 BRAF V300E 돌연변이의 발생시기를 변화시키기 위해서 하기와 같은 방법을 사용하였다.
실시예 4-1과 같은 방법으로 conditional floxed BRAF V600E 마우스의 timed pregnant를 만들고, 타목시펜 (tamoxifen) inducible Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 유전자를 자궁내 유전자 도입시킨 후 생후 30일 이후부터 타목시펜을 복강 내 주사하여 BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이를 모델 마우스 뇌에서 적절히 유도하였다. 타목시펜을 출생 후 30일 이후부터 처리하기 시작하고 약 30일 동안 마우스의 행동을 추적관찰하였다.
구체적으로, 자궁내 유전차 도입은 Timed pregnant 14일 (E14)의 자궁각(uterine horn)이 노출되고, 개개 배아(embryo)의 측뇌실(lateral ventricle)에 Cre 재조합효소를 가진 플라스미드 2 내지 3ug과 결합한 Fast Green(F7252, Sigma, USA) 2ug/ml을 pulled 모세관(pulled glass capillary)를 이용하여 주입하였다. 플라스미드는 배아의 머리에 900 ms의 간격에 100 ms의 5번 전기 펄스인 ECM830 eletroporator(BTX-harvard apparatus)로 50V를 방전하여 전기천공(electroporation) 하였다. 또한, 타목시펜 (Sigma, T5648)은 corn oil (Sigma, C8267)에 10mg/ml의 농도로 37℃에서 하루 차광하여 보관하고, 정상 마우스와 돌연변이 마우스 모두에 대하여 100 ug/g 타목시펜을 복강내 주사하였으며 5일을 연속적으로 하루에 한번씩 처리하고 직후의 1주일간은 휴약 기간을 가진 뒤 다시 5일을 연속적으로 치러하였다. 타목시펜의 처리가 끝나고 나서 마우스는 행동관찰을 하기 시작하였고, 타목시펜이 없는 corn oil만 처리한 마우스나 정상 마우스에 타목시펜을 처리한 마우스를 대조군으로 이용하고 행동을 비교하였다. 상기 실험 과정 개략적 흐름은 도 12에 나타나 있다.
그 결과 도 12 오른쪽 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이, 생후 30일 이후 성체 마우스의 신경세포에 BRAF V600E 돌연변이를 유도한 경우에는 마우스가 발작 행동을 나타내지 않았다.
7-2. 바이러스를 이용한 BRAF V600E 돌연변이 성체 마우스
동물 모델 마우스 상에서 BRAF V300E 돌연변이의 발생시기를 변화시키기 위해서 바이러스를 이용하여 BRAF V600E 돌연변이 성체 마우스를 하기와 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 출생 후 30일 이후의 마우스를 마취시키고, 정위수술 장치 (Stoelting Co., Wood Dale, IL)에 머리를 고정시키고 약 1 mm의 지름을 가지는 구멍을 뇌뼈에 치과용 드릴로 만들었다. 0.5 uL의 AAV9.CamKII.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Penn Vector Core Philadelphia, PA; titer 6.54 x 1013 GCml-1)을 glass micropipette을 이용하여 somatosensory cortex (AP: -0.5; ML: -2.0~-2.5; DV: -0.5)에 느린 속도로 주입하였다 (1 nL per sec). 2주가 지난 뒤 바이러스를 주입한 마우스의 행동을 관찰하고 뇌파를 측정하기 시작하였다. 관찰이 끝난 뒤에는 뇌를 실시예 5-1에서와 같은 방법으로 paraformaldehyde로 동결 조직 슬라이드를 20 um의 두께로 준비하고 현미경으로 관찰하여, 바이러스를 통해 주입한 형광 리포터 단백질이 잘 발현하고 있는지 여부를 재확인하였다.
그 결과 도 13에서 확인할 수 있는 것과 같이, 실시예 7-1에서 타목시펜을 이용해 성체 마우스에서 BRAF V300E 돌연변이를 유도한 것과 마찬가지로 바이러스를 이용해 돌연변이를 유도한 마우스의 경우에도 발작은 나타나지 않았다.
7-3. 성체 마우스에서 BRAF V600E 돌연변이 유도에 의한 세포학적 이상 양상 확인
실시예 7-2, 및 7-3의 방법과 같이 성체 마우스에서 BRAF V600E 체성 유전체 돌연변이를 유도한 후, 실시예 5-2와 같은 방법으로 신경세포의 이형성 여부를 확인하였다.
그 결과 도 14에서 확인할 수 있는 것과 같이, 성체 마우스에서 BRAF V600E 돌연변이를 유도 (BRAFWT/LSL-V600E)할 경우 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 BRAF V600E 돌연변이 마우스의 경우와 마찬가지로 정상 BRAF 유전자를 가지고 있는 마우스 (BRAFWT/WT)와 비교하여 세포의 크기 (도 14의 A), 세포의 circularity, aspect ratio (도 14의 B) 및 가지돌기의 피질 표면에 대한 각도 (도 14의 C) 등이 정상 BRAF 유전자를 가지고 있는 마우스와 큰 차이가 없었다 (신경세포의 이형성 부존재).
또한, 타목시펜을 이용하여 성체 마우스에서 BRAF V600E 돌연변이를 유도한 경우에도 정상 BRAF 유전자를 가지고 있는 마우스와 비교하여 세포의 크기, 세포의 circularity, aspect ratio 및 가지돌기의 피질 표면에 대한 각도 등이 정상 BRAF 유전자를 가지고 있는 마우스와 큰 차이가 없었다 (도 14의 D) (신경세포의 이형성 부존재).
상기 결과를 통해서, BRAF V600E 돌연변이가 배아 발생단계의 신경세포에서만 발생하였을 때 신경세포의 이형성을 유도하여 뇌전증을 일으킴을 알 수 있었다.
실시예 8. BRAF V600E 특이적 저해제 주입을 통한 발작의 감소 확인
실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 BRAF V600E 돌연변이 마우스에 발생하는 발작의 빈도를 줄이기 위해 BRAF V600E 특이적 저해제를 처리하고 그 효과를 확인했다.
구체적으로, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 BRAF V600E 돌연변이 마우스의 뇌 조직에 장기간 BRAF V600E 돌연변이 단백질 특이적 활성 저해제 (Vemurafenib)를 주입하였다. Zoletil (0.01 mg/kg)과 rompun (0.2 mg/kg)을 섞은 용액을 복강내 주입 방식으로 전신 마취하였고, infusion cannula (ALZET brain infusion kit 3)가 연결된 osmotic pump (ALZET pumps 2004 or 2006, ALZET Osmotic Pumps, Cupertino, CA)에 vehicle (DW상의 50% (v/v) DMSO) 또는 500 um PLX4032 (Vemurafenib) (V-2800, LC laboratories)을 우측 뇌실 공간 (AP: -0.6; ML: -1.0; DV: -2.0)에 지속적 뇌실내 주입 (cICV, chronic intracranioventricular injection)하였다. 뇌파를 추적하기 위해 4개의 EEG probes (left/right frontal lobes and left temporal lobes, cerebellum as a reference)을 실시예 4-1에서와 같은 방법으로 동물 모델 마우스 머리에 삽입한 후 뇌파 신호를 얻었고, 5~6주가 지난 뒤 마우스를 sacrifice하고 뇌를 꺼내 추후 연구에 이용하였으며, 이 때 osmotic pump내의 반투과성 막이 축소되어 있는지 여부를 재확인하였다. 약물 주입은 4주~6주까지 실시하였고, 이 시점에서 마우스의 뇌파를 추적 기록하였다.
그 결과를 도 15 내지 도 17에서 나타내었다.
도 15에 의하면, BRAF V600E 특이적 저해제를 투입한 마우스의 경우 발작행동 (icta seizure)이 약 4배 감소함을 확인할 수 있었고 (도 15 B), BRAF V600E 특이적 저해제를 6주간 처리했을 때에도 발작이 계속 감소해 있음을 전기생리학적으로 확인할 수 있었다 (도 15 C).
도 16에 의하면, 전기생리학적 발작 (electrographic seizure) 이 2배 내지 3배 감소하였고 (도 16 가운데), 발작 간극파 (Interictal spike)가 1.3배 내지 1.5배 감소함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 17에 의하면, BRAF V600E 특이적 저해제를 일시적으로 뇌실에 주입 (acute intracerebroventricular injection) (3회/day, 5 uL를 8분간 주입) (도 17 왼쪽) 하거나 경구 투약 (PO, per oral) (도 17 오른쪽)을 한 경우 발작빈도가 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. BRAF V600E 돌연변이에 의한 발작 관련 기전
mTOR 신호 전달 경로의 비정상적인 활성은 간질발작을 유도한다고 알려져 있고, BRAF V600E 돌연변이는 Ras-Raf-MEK-ERK 의 MAPK 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 한편, BRAF V600E 돌연변이가 활성화 시키는 것으로 알려져 있는 Ras-Raf-MEK-ERK의 MAPK 신호전달 경로는 mTOR 신호전달 경로와 서로 crosstalk하여, mTOR 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있고, 신경절 교세포종 환자들의 조직에서 mTOR 신호전달 경로와 관련된 단백질들의 발현이 증가되어 있음이 보고된바 있다. 따라서, BRAF V600E 돌연변이에 의해서 mTOR 신호전달 경로가 활성화되어 간질 발작이 발생하는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 4-1과 같은 방법으로 제작한 동물 모델 마우스에 대하여 mTOR 특이적 저해제인 라파마이신을 복강 내 주사로 주입한 후 그 변화를 확인하였다. 라파마이신 (LC Labs,USA)은 100% 에탄올에 20 mg/ml로 희석하여 원액을 만든 후 -20℃에서 보관하였다. 라파마이신을 동물 모델 마우스에 주사하기 전에 라파마이신 원액을 5% (w/v) polyethleneglycol 400과 5% (v/v) Tween80에 희석하여 1 mg/mL 라파마이신과 4% (v/v) 에탄올 용액을 만들었다. 만들어진 용액을 복강내 주사법으로 1 내지 10 mg/kg의 농도로 2주간 투여하였다 (10 mg/kg/d 복강주사, 2주 동안).
그 결과 도 18에 나타난 것과 같이, 라파마이신의 투여에도 불구하고 BRAF V600E 돌연변이 동물 모델 마우스의 간질 발작 빈도는 줄어들지 않았으며, mTOR 하위 경로에 있는 S6 단백질의 인산화도 정상 마우스 조직에 비해 BRAF V600E 돌연변이 동물 모델 마우스 조직이 큰 차이를 나타내지 않았다.
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Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는,
    신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열에서 600번째 발린이 글루탐산으로 치환된 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 mTOR 신호전달 경로의 활성화에 의해서 발생하는 것이 아닌, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 신경세포에서 발현하여 발생하는 것인, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증은 상기 변이 단백질 또는 상기 변이 핵산 분자가 배아 발생단계의 신경세포에서 발현하여 발생하는 것인, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 유도용 조성물.
  6. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.
  7. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된, 세포.
  8. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된, 인간을 제외한 동물의 배아.
  9. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터로 형질전환되어, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된, 인간을 제외한 동물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유류 또는 설치류인, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된, 인간을 제외한 동물.
  11. 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에서, 1799번째 티민이 아데닌으로 치환된 변이를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    상기 벡터를 마우스에 형질전환하는 단계를 포함하는 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 배아기 중 대뇌 피질층 (cortical layer)이 형성되는 기간에 배아의 뇌에 도입되는 것인, 뇌전증이 유도된 동물을 제조하는 방법.
  13. 제11항의 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증이 유도된 동물에 뇌전증 치료 후보물질을 투여한 후 뇌전증 경감 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 신경절 교세포종 또는 신경절 교세포종에 의한 뇌전증 치료제의 스크리닝 방법.
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KR20150142932A (ko) * 2014-06-12 2015-12-23 한국과학기술원 뇌전증 관련 뇌 체성 유전 변이 및 이의 이용

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