KR20200086541A

KR20200086541A - 방사선 치료 증폭을 위한 사이토스테롤-독소루비신 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물

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Publication number: KR20200086541A
Application number: KR1020190002872A
Authority: KR
Inventors: 서영배; 도경오; 최종수; 김광석; 김병길; 박재원
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 한국원자력의학원; 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-07-17
Also published as: KR102150418B1

Abstract

본 발명은 방사선 치료 증폭을 위한 사이토스테롤-독소루비신 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 β-사이토스테롤을 이용하여 독소루비신 유도체로서 Sito-dox A 및 Sito-dox B를 합성하였으며, 상기 Sito-dox A는 독소루비신 보다 우수한 항암 효과, 및 방사선 요법과의 병용 치료에서 시너지 효과를 나타내고, Sito-dox B는 세포 독성을 나타내지 않았으나, 방사선 요법과의 병용 치료에서 종양 붕괴 현상을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 β-사이토스테롤을 이용하여 합성된 독소루비신 유도체는 방사선 요법과 병용 치료 시, 항암 치료 효과를 증폭시킬 수 있고, 독소루비신의 체내 짧은 체류 시간과 빠른 용출의 단점을 극복할 수 있는 바, 보다 효과적인 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 방사선 치료 민감제용 약학 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다. 더불어, 사이토스테롤과 구조 및 물성이 유사한 콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 디옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 글리코케노디옥시콜릭산, 타우로케노데옥시콜릭산, 콜레스테롤 및 리토콜릭산 등의 지질로 치환된 독소루비신 유도체에서도 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체와 유사한 암 치료 효과를 보일 것으로 기대된다.

Description

방사선 치료 증폭을 위한 사이토스테롤-독소루비신 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물{Sitosterol-doxorubicin derivatives for radiotherapy amplification, and composition for preventing or treating cancer diseases comprising the same}

본 발명은 암 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 사이토스테롤을 이용한 독소루비신 유도체 및 상기 유도체와 방사선 요법의 병용 치료에 의한 시너지 효과에 관한 것이다.

독소루비신(doxorubicin; dox)은 유방암, 폐암, 림프종, 소화기 암 및 육종에 널리 사용되는 안트라사이클린(anthracycline) 항암제이다. 그러나 독소루비신은 누적 용량에 따라 심각한 심장독성을 나타내며, 다른 부작용으로는 생체 내 체류 시간(retention time)이 짧다는 점과 친수성 특성으로 인해 체내에서 쉽게 용출된다는 점이 있다. 이전 연구에서 암세포에 세포 독성을 나타내는 콜레스테롤 기반의 독소루비신 유도체를 합성한 바 있으며, 상기 유도체는 독소루비신과 유사한 독성을 나타내었고 HeLa와 MDA MB 231 세포 주에서 독소루비신보다 체류 시간을 증가시키는 것을 확인한 바 있다.

β-사이토스테롤(sitosterol)은 콜레스테롤과 같은 소수성 스테로이드를 위한 후보물질이다. 콜레스테롤과 유사한 구조를 가지는 일종의 스테로이드이며, 음식이나 약물로 섭취되며 부작용이 없는 안전한 물질로 알려져 있다. 유럽 식품 안전청(European Foods Safety Authority; EFSA)에 의하면, β-사이토스테롤의 섭취는 혈액 내 LDL을 감소시키는 데 도움을 주는 것으로 보고된 바 있다. 또한, β-사이토스테롤은 유방암 및 폐암 세포(MDA MB 231 및 A549 세포 주)에서 항암 효과를 나타내었으며, 암세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하며 전이를 감소시키는 것으로 보고된 바 있다. 독소루비신과 β-사이토스테롤은 유방암과 폐암 세포에서 항암 효과를 나타내기 때문에 β-사이토스테롤 기반 독소루비신 유도체는 항암 효과에 있어서 상승 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

대한민국 등록특허 제10-1769666호 (2017.08.11 등록)

본 발명의 목적은 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 민감제용 약학 조성물의 제공과 이를 이용한 방사선 치료 행위를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 민감제용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.

본 발명에서는 β-사이토스테롤을 이용하여 독소루비신 유도체로서 Sito-dox A 및 Sito-dox B를 합성하였으며, 상기 Sito-dox A는 독소루비신 보다 우수한 항암 효과, 및 방사선 요법과의 병용 치료에서 시너지 효과를 나타내고, Sito-dox B는 세포 독성을 나타내지 않았으나, 방사선 요법과의 병용 치료에서 종양 붕괴 현상을 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 β-사이토스테롤을 이용하여 합성된 독소루비신 유도체는 방사선 요법과 병용 치료 시, 항암 치료 효과를 증폭시킬 수 있고, 독소루비신의 체내 짧은 체류 시간과 빠른 용출의 단점을 극복할 수 있는 바, 보다 효과적인 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 방사선 치료 민감제용 약학 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 독소루비신의 화학적 구조를 나타낸 것이다(하이드록실기 및 글루코즈 아민 부분은 친수성을 부여함).
도 2는 β-사이토스테롤과 콜레스테롤의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 Sito-dox A 및 Sito-dox B의 화학적 구조를 나타낸 것이다(Sito-dox A는 안트라사이클린 고리에서 하이드록실 아세틸 부분의 알코올기를, Sito-dox B는 글루코즈 아민 부분에서 아미노기를 β-사이토스테롤로 변형시킴).
도 4는 폐암 세포 주 및 유방암 세포 주에서 dox, β-사이토스테롤, Sito-dox A 및 Sito-dox B에 의한 세포 생존율 나타낸 것이다.
도 5는 동물실험 결과로, 마우스에 dox(2 mg/kg), S-dox A 및 B(1 mg/kg)를 각각 복강주사한 후, (a) 각 시료 또는 8 Gy 방사선 조사 후 종양의 체적 변화, (b) 4주 후 추출된 종양의 크기, (c) 주사 후 6일 동안의 종양의 변화를 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 β-사이토스테롤을 이용하여 독소루비신 유도체로서 Sito-dox A 및 Sito-dox B를 합성하였으며, 상기 유도체가 우수한 항암 효과, 및 방사선 요법과의 병용 치료에서 항암 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.

상기 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 지질로 치환된 독소루비신 유도체에서 지질은 콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 디옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 글리코케노디옥시콜릭산, 타우로케노데옥시콜릭산, 콜레스테롤 및 리토콜릭산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 사이토스테롤 또는 지질은 에스테르 결합 또는 아미드 결합으로 연결될 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 암 질환은 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기성 염일 수 있고, 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산성 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 조성물은 방사선 요법과 병용치료 시, 항암 효과의 상승 작용을 나타내는 바, 효과적으로 암을 예방, 개선 내지 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.

[화학식 3]

[화학식 4]

이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시 예 1: 물질

모든 화학 시약과 유기 용매는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, 추가 정제없이 사용하였다. 배지 및 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. MDA MB 231 및 A549 세포 주는 한국세포 주 은행(KCLB)에서 구입하여 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. RPMI 1640 배지는 A549 세포 주에 사용되었고 DMEM 배지는 MDA MB 231 세포 주에 사용되었으며, 각각의 배지는 10% FBS를 포함하였다.

실시 예 2: 구조 분석

¹H 및 ¹³C NMR은 Avance digital 500 NMR spectrometer(Bruker, Inc., Madison, USA)로 분석하였다. 화학적 이동은 CDCl₃ 또는 CDCl₃ 및 CD₃OD에 대하여 상대적으로 분석하였다. 분자량은 voyager De-STR MALDI-TOF(Applied biosystem, USA)를 사용하여 측정하였다. 최종 화합물 6 및 10의 순도는 YMC-pack ODS-A(Prominence, Shimadzu, Japan)를 사용하여 HPLC로 확인하였다. 반응은 Merck(1.05554, Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany)의 실리카 겔 플레이트 상에서 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)로 확인하였다. 화합물을 정제하기 위해, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(70-230 mesh, Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany)를 수행하였다.

실시 예 3: 합성

[반응식 1]

(a) 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 18-크라운-6, KOH (aq) / CH₂Cl₂, 상온, 하룻밤; (b) NiCl₂· 6H₂O, Boc₂O, NaBH₄/dry MeOH, 상온, 3시간; (c) TFA / CH₂Cl₂, 3시간

3-1. 2-시아노에틸-O-β-사이토스테롤 에테르 2(2-cyanoethyl-O-β-sitosterol ether 2)의 합성

β-사이토스테롤(100 mg, 240 μmol), 수용성 KOH(40% w/w, 50 μl) 및 18-크라운-6(6.4 mg, 24 μmol)을 상온 하에 디클로로메탄(dichloromethane; DCM, CH₂Cl₂, 10 mL)에 첨가하였다. 아크릴로니트릴(32.0 mg, 603 μmol)을 상기 혼합물에 첨가하고 하룻밤 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 용매는 증발기를 이용하여 감압 하에 제거하였다. 농축된 혼합물은 헥산에 재 용해시키고 증류수로 세척하였다. 유기층은 염수(brine)로 세척하고 MgSO₄로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, DCM 및 메탄올(MeOH)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 백색 고체의 화합물 2 (112.8 mg)는 100%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.36 (m, 1H), 3.70 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.22 (m, 1H), 2.58 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.19-2.37 (m, 2H), 1.84-2.05 (m, 5H), 1.03-1.50 (m, 22H), 1.00 (s, 3H), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.68 (s, 3H).

3-2. 3-카르복시아미노프로필-O-β-사이토스테롤 에테르 3(3-carboxyaminopropyl-O-β-sitosterol ether 3)의 합성

화합물 2(100 mg, 213 μmol), NiCl₂ · 6H₂O(101.4 mg, 427 μmol) 및 Boc 무수물(139.7 mg, 640 μmol)을 무수 MeOH(10 ml)에 단계적으로 첨가하였다. 5분 후, NaBH₄(80.7 mg, 2.13 mmol)를 천천히 첨가하고, 질소 가스 하에 3시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후, 생성된 검은 침전물은 여과하여 제거하였다. 여과액은 헥산으로 희석하고, 헥산 층을 분리하였다. 이를 MgSO₄로 건조시키고 실리카 겔 크로마토그래피(용리액: 헥산 및 에틸 아세테이트, 5:1, v/v)로 정제하였다. 백색 고체의 화합물 3(76.9 mg)은 63%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.34 (m, 1H), 3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.11-3.23 (m, 3H), 2.35 (m, 1H), 2.18 (m, 1H), 1.66-2.04 (m, 9H), 1.48-1.60 (m, 5H), 1.44 (s, 9H), 1.01-1.36 (m, 16H), 1.00 (s, 3H), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.68 (s, 3H).

3-3. 3-아미노프로필-O-β-사이토스테롤 에테르 4(3-aminopropyl-O-β-sitosterol ether 4)의 합성

Boc기를 탈보호(deprotection)하기 위해, 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)을 사용하였다. 화합물 3(50 mg, 87 μmol)을 CH₂Cl₂에 첨가하고, 과량의 TFA(38.6 mg, 393 μmol)를 교반 하에 3시간 동안 첨가하였다. 용매를 제거하고, 농축된 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(용리액: 클로로포름 및 메탄올)로 정제하였다. 백색 고체의 화합물 4(42.4 mg)는 85%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.35 (m, 1H), 3.63 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.19 (m, 1H), 3.06 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.34 (m, 1H), 2.17 (m, 1H), 1.78-2.05 (m, 9H), 1.04-1.69 (m, 21H), 1.00 (s, 3H), 0.93 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.69 (s, 3H).

[반응식 2]

(a) 화합물 4, 석신산 무수물(succinic anhydride), HBTU, DIPEA / CH₂Cl₂, DMF, 24시간, 상온; (b) FmocOSu, DIPEA / CH₂Cl₂, DMF, 2시간, 상온; (c) 석신산 무수물, TEA / CH₂Cl₂, DMF, 8시간, 상온; (d) 화합물 4, DIPEA, HBTU / CH₂Cl₂, DMF, 30분, 상온; (e) 피페리딘(piperidine) / CH₂Cl₂, DMF, 10분, 상온.

3-4. Sito-dox B 6의 합성

디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine; DIPEA, 5.9 μl, 34 μmol)을 CH₂C_l2/DMF(9:1, v/v, 10 ml) 하에 독소루비신 하이드로클로라이드(화합물 5, 20 mg, 34 μmol) 및 석신산 무수물(3.4 mg, 34 μmol) 혼합물에 첨가하고, 상온에서 밤새 반응시켰다. 이후 3-[Bis(dimethylamino)methyliumyl]-3H-benzotriazol-1-hexafluorophosphate(HBTU, 12.9 mg, 34 μmol) 및 DIPEA(5.9 μl, 34 μmol)를 사용하여 30분 동안 반응을 진행하였다. 화합물 4(23 mg, 41 μmol)를 DIPEA(5.9 μl, 34 μmol)에 첨가하고, HBTU 중간체를 대체하였다. 부생성물 및 잔류물은 0.1% TFA가 포함된 증류수로 세척하였다. 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 농축된 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(용리액: 5-10% MeOH가 포함된 CH₂C_l2)로 정제하였다. 미세한 생성물인 화합물 6을 수득하기 위해, RP C18 크로마토그래피(ACN 및 MeOH, 1:2.5, v/v)로 다시 정제하였다. 적색 분말의 화합물 6(12.9 mg)은 35%의 수율로 수득하였다. 최종 화합물 6은 ¹H, ¹³C NMR 및 질량 분석법으로 확인하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 8.05 (m, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.39 (m, 1H), 6.40 (m, 1H), 6.13 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 5.31 (m, 2H), 4.76 (m, 2H), 4.61 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 4.08 (s, 3H), 3.70 (m, 1H), 3.54 (m, 2H), 3.32 (m, 2H), 3.01-3.14 (m, 2H), 2.29-2.61 (m, 7H), 1.40-2.18 (m, 27H), 1.30 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.99-1.23 (m, 11H), 0.98 (s, 3H), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.67 (s, 3H).;¹³C NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 213.07, 186.78, 172.02, 171.84, 161.11, 155.77, 140.57, 135.74, 135.63, 133.75, 133.71, 121.87, 119.88, 119.31, 118.45, 117.75, 117.66, 111.63, 111.46, 100.86, 79.31, 76.63, 69.60, 68.45, 67.22, 67.13, 65.60, 56.79, 56.71, 56.10, 50.19, 45.88, 45.72, 42.35, 39.79, 39.12, 38.98, 38.72, 37.15, 36.66, 36.16, 35.69, 34.06, 33.96, 32.10, 31.94, 31.69, 29.71, 29.20, 29.13, 28.49, 28.26, 26.14, 24.31, 23.10, 21.08, 19.83, 19.37, 19.06, 18.80, 16.96, 12.00, 11.87. MALDI-TOF: C₆₃H₈₈N₂O₁₄Na was founded at 1119.95 [M+Na⁺]; HPLC: purity is over 97%

3-5. NFmoc dox 7의 합성

DIPEA(37.5 μl, 0.215 mmol)를 CH₂C_l2/DMF(9:1, v/v, 20 ml) 하에 dox(50 mg, 0.086 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 석신이미딜 카보네이트(fluorenylmethyl succinimidyl carbonate; FmocOSu, 58.2 mg, 0.172 mmol) 혼합물에 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 0.1% TFA가 포함된 증류수로 세척하였다. 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 농축된 혼합물은 실리카 겔 크로마토그래피(용리액: 2-10% MeOH가 포함된 CH₂C_l2)로 정제하였다. 적색 분말의 화합물 7(52.8 mg)은 80%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ8.01 (m, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.72 (m, 2H), 7.53 (m, 2H), 7.36 (m, 3H), 7.28 (m, 2H), 5.50 (m, 1H), 5.27 (m, 1H), 4.76 (m, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.8 (m, 2H), 3.62 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 1.86-2.35 (m, 4H), 1.30 (d, J = 6.5 Hz, 3H).

3-6. NFmoc dox 헤미석시네이트 8의 합성

트리에틸아민(TEA, 50.1 μl, 359 μmol)을 CH₂C_l2/DMF(9:1, v/v, 20 ml) 하에 NFmoc dox(화합물 7, 50 mg, 65 μmol) 및 석신산 무수물(52.3 mg, 523 μmol) 혼합물에 첨가하고, 상온에서 8시간 동안 반응시켰다. 이후, 혼합물을 0.1% TFA가 포함된 증류수로 세척하였다. 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 농축된 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(용리액: 1-10% MeOH가 포함된 CH₂Cl₂)로 정제하였다. 적색 고체의 화합물(40.1 mg)은 71%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 8.01 (m, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.72 (m, 2H), 7.53 (m, 2H), 7.36 (m, 3H), 7.28 (m, 2H), 5.50 (m, 1H), 5.27 (m, 1H), 4.76 (m, 2H), 4.35 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.8 (m, 2H), 3.62 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 2.79 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.71 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.86-2.35 (m, 4H), 1.30 (d, J = 6.5 Hz, 3H).

3-7. NFmoc Sito-dox 9의 합성

DIPEA(8.9 μl, 51 μmol)를 CH₂C_l2/DMF(9:1, v/v, 10 ml) 하에 화합물 8(40 mg, 46 μmol) 및 HBTU(19.3 mg, 51 μmol) 혼합물에 상온에서 적가하였다. 30분 후 스팟(spot)이 상부로 이동되면, 화합물 4(29.0 mg, 51 μmol) 및 DIPEA(8.9 μl, 51 μmol)를 혼합물에 적가하였다. 5분 후, 0.1% TFA가 포함된 증류수로 세척하고 농축시켰다. 농축된 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 1-1.5% MeOH가 포함된 CH₂C_l2)로 정제하였다. 적색 분말의 화합물(51.8 mg)은 85%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.05 (m, 1H), 7.78 (m, 1H), 7.74 (m, 2H), 7.71 (m, 2H), 7.54 (m, 1H), 7. 38 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 5.51 (m, 1H), 5.32 (m, 2H), 5.12 (m, 2H), 4.62 (m, 1H), 4.36 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 4.08 (m, 3H), 3.76 (br m, 1H), 3.57 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.37-3.53 (m, 2H), 3.32 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.1-3.28 (m, 2H), 2.98-3.05 (m, 1H), 2.84 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.31-2.47 (m, 2H), 1.73-2.19 (m, 14H), 1.37-1.69 (m, 10H), 1.32 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.99-1.23 (m, 11H), 0.97 (s, 3H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0. 81 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.63 (s, 3H).;

3-8. Sito-dox A 10의 합성

NFmoc기를 제거하기 위해, 피페리딘(200 μl)을 CH₂C_l2/DMF 용액(10 ml, 9:1, v/v) 하에 화합물 9(50 mg, 38 μmol)에 상온에서 첨가하였다. 15분 후, TFA를 얼음조에 첨가하여 중화시켰다. DMF를 제거하기 위해, 0.1% TFA가 첨가된 증류수로 세척하고, 진공 펌프를 사용하여 용매를 완전히 제거하였다. 농축된 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: CH₂C_l2/MeOH, 9:1, v/v)로 정제하였다. 적색 분말의 화합물 10(22 mg)은 66% 의 수율로 수득하였다. 최종 화합물 10은 ¹H, ¹³C NMR 및 질량 분석법으로 확인하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): 8.02 (m, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.41 (m, 1H), 5.53 (m, 1H), 5.31 (m, 2H), 5.19 (m, 2H), 4.17 (m, 1H), 4.07 (m, 3H), 3.76 (br m, 1H), 3.56 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.37-3.53 (m, 2H), 3.32 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.1-3.28 (m, 2H), 2.98-3.05 (m, 1H), 2.81 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.53 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.31-2.47 (m, 2H), 1.73-2.19 (m, 14H), 1.37-1.69 (m, 10H), 1.32 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.99-1.23 (m, 11H), 0.97 (s, 3H), 0.89 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.85 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0. 81 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.64 (s, 3H).; ¹³C NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 214.57, 207.08, 187.09, 186.69, 172.45, 171.79, 161.01, 155.80, 155.15, 140.50, 135.85, 135.37, 133.71, 133.54, 121.73, 120.73, 119.74, 118.57, 111.53, 111.33, 99.33, 79.23, 76.58, 69.29, 66.81, 66.39, 66.06, 65.91, 56.64, 56.52, 56.01, 50.08, 47.06, 45.76, 42.19, 39.64, 38.96, 37.83, 37.05, 36.72, 36.05, 35.45, 33.83, 33.13, 31.75, 30.93, 29.59, 29.33, 29.07, 28.28, 28.12, 28.01, 26.08, 24.14, 22.98, 20.94, 19.66, 19.20, 18.89, 18.62, 16.23, 11.83, 11.68.; MALDI-TOF: C₆₃H₈₈N₂O₁₄Na was founded at 1119.49 [M+Na⁺]; HPLC: purity is over 98%

실시 예 4: 세포 생존율 분석

세포 독성을 측정하기 위해, 폐암 및 유방암 세포 주인 A549 및 MDA MB 231 세포 주를 이용하여 MTT 분석을 수행하였다. 세포를 10,000 세포/웰의 농도로 96 웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 다양한 시료를 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 20 μl의 MTT 용액(5 mg/ml) 및 80 μl의 신선한 배지를 각 웰에 첨가하고, 3시간 동안 배양하였다. 포르마잔 결정을 100 μl의 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시키고, 플레이트 리더기(Tecan, Tecan AG, Switzerland)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군의 흡광도로 표준화 하였다.

실시 예 5: 동물 실험

5-7 주령의 암컷 C57BL/6 마우스 및 Balb/C 마우스(Orientbio, Inc, Seoul, Korea)를 사용하였으며, 실험은 특정 병원균이 없는 조건 하에 층류 공기 흐름 캐비닛에서 수행하였다.

C57BL/6(7주령) 마우스는 모든 조직에 동일한 용량이 전달될 수 있도록 플랫폼에서 조사하였으며, Balb/C(7주령) 마우스는 전형적인 방법으로 종양에 조사하였다. 조사 처리를 위해, 137 Cs γ-선원(원자력 에너지 주식회사)을 이용하여 마우스에 3.81 Gy/분의 용량으로 γ-선을 조사하였다.

H460 폐암 세포 주는 100 mm 배양 플레이트에 접종하고, 열-불활성화 된 10% 우 태아 혈청이 첨가된 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 1 X 10⁶ H460 세포를 포함하는 0.1 ml의 현탁액을 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 150 mm³에 이르면 독소루비신 및 독소루비신 유도체를 각각 2 mg/kg 및 1 mg/kg의 농도로 주입하였다. 8Gy IR(전리 방사선)을 조사하기 2시간 전에 독소루비신, 독소루비신 유도체 또는 DMSO를 복강 내 주사하였다. 캘리퍼스 스퀘어(caliper square)를 이용하여 주 3회 종양의 2개의 수직 직경을 측정하였고, 종양 체적은 다음 식을 사용하여 계산하였다.

[계산식]

종양 체적 (V) mm³ = (더 작은 직경)² X (큰 직경) X (π/6)

대조군 마우스의 종양이 괴사의 징후를 보이기 시작하는 시점(종양 세포 이식 4주 후)에 실험을 종결하였다.

실시 예 6: 통계 분석

MTT 데이터는 GraphPad Prism 6(La Jolla, CA)를 이용하여 student T-test로 분석하여 군 간의 차이를 확인하였다. p < 0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험 예: β-사이토스테롤을 이용한 독소루비신 유도체 및 방사선 요법과의 시너지 효과

β-사이토스테롤, 아크릴로니트릴, KOH(aq) 및 18-크라운-6를 DCM에 첨가하고 하룻밤 반응시켜 화합물 2를 합성하였다. β-사이토스테롤은 아크릴로니트릴로 연장되었다. 합성된 화합물 3은 환원 및 Boc 보호를 포함하는 one-pot two 반응 단계를 수행하였다. 반응이 끝난 후, 생성물과 혼합되어 있는 검은색 침전물을 제거하는 것이 중요하다. 제거 및 추출이 적절하게 수행되지 않으면, 화합물 3의 수율은 감소하게 된다. TFA로 Boc기를 제거한 후 화합물 4를 수득하였다. 화합물 4와 독소루비신을 사용하여 sito-dox A(화합물 10) 및 sito-dox B(화합물 6)를 최종 화합물로 합성하였다(도 3). 화합물 6은 중간체의 안정성 때문에 one-pot two 반응 단계를 사용하여 합성하였고, 화합물 10은 Fmoc 보호, 연장, 접합 및 탈보호 단계를 사용하여 합성하였다. 모든 화합물 구조는 NMR 및 질량분석기로 확인하였다.

Sito-dox A 및 Sito-dox B의 세포 독성을 조사하기 위해, dox, β-사이토스테롤, Sito-dox A 및 Sito-dox B를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 4를 참조하여 보면, dox가 가장 강한 세포 독성을 나타내었고, Sito-dox A는 dox와 유사한 수준의 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 안트라사이클린 고리의 하이드록실기에 치환된 Sito-dox A(화합물 10)와 글루코사민의 아민기에 치환된 Sito-dox B는 서로 다른 결과를 나타내었다. 이는 아민기가 독소루비신을 활성화 시키는데 중요하다고 볼 수 있다.

세포 독성 분석 후, 상기 약물을 마우스에게 주입하고, 4주 동안 종양 체적을 측정하였다. 도 5a의 그래프에서 점선으로 표시된 군들은 각 시약으로만 처리된 군들이며, 선으로 표시된 군들은 시약 및 방사선 조사로 병용 처리된 군들이다. S-dox A와 S-dox B에서 나올 수 있는 dox의 양은 1/4이었으나, dox보다 종양의 성장을 더 효과적으로 억제하였다. 흥미롭게도, 도 5b 및 도 5c를 참조하여 보면, MTT 분석에서 세포 독성을 나타내지 않았던 S-dox B가 동물 실험에서 많은 독성을 나타내었고, 방사선과의 병용 치료로 종양이 파열되는 것을 확인할 수 있었다.

사이토스테롤은 일종의 피토스테롤(phytosterol)로 친지질 특성을 가져 그 유도체는 생체 내 오래 체류될 수 있다. dox와 방사선 조사를 받은 종양의 부피는 7일 동안 유지되었으나, 방사선 조사를 한 S-dox A 또는 S-dox B에서 방출되는 독소루비신의 양이 1/4 임에도 불구하고 10일 동안 유의한 증가를 나타내지 않았다. 이는 독소루비신 유도체로 처리한 군들은 약물이 생체 내에 남아있어 오랫동안 효과를 나타낼 수 있었고, 이에 다른 군들에 비해 종양의 성장률이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 독소루비신은 짧은 체류 시간과 빠른 용출의 단점이 있는 바, 본 발명에서는 이를 해결하기 위해 구조적 변형을 통하여 Sito-dox A 및 sito-dox B를 합성하였으며, 상기 유도체들은 암 치료에 새로운 전략이 될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.
제 1항에 있어서, 상기 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 3]

[화학식 4]
제 1항에 있어서, 상기 지질은 콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 디옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 글리코케노디옥시콜릭산, 타우로케노데옥시콜릭산, 콜레스테롤 및 리토콜릭산으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1항에 있어서, 상기 사이토스테롤 또는 지질은 에스테르 결합 또는 아미드 결합으로 연결되는 것을 특징으로 하는 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.
제 5항에 있어서, 상기 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 3]

[화학식 4]
제 5항에 있어서, 상기 지질은 콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 디옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 글리코케노디옥시콜릭산, 타우로케노데옥시콜릭산, 콜레스테롤 및 리토콜릭산으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 암 질환은 폐암, 피부암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기성 염인 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산성 염인 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 요법과 병용치료 시, 항암 효과의 상승 작용을 나타내는 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는, 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체 또는 지질로 치환된 독소루비신 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 민감제용 약학 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서, A 또는 A'는 각각 사이토스테롤 또는 지질임.
제 12항에 있어서, 상기 사이토스테롤로 치환된 독소루비신 유도체는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 방사선 치료 민감제용 약학 조성물:
[화학식 3]

[화학식 4]
제 12항에 있어서, 상기 지질은 콜릭산, 글리코콜릭산, 타우로콜릭산, 디옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 글리코케노디옥시콜릭산, 타우로케노데옥시콜릭산, 콜레스테롤 및 리토콜릭산으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방사선 치료 민감제용 약학 조성물.