KR20200085705A

KR20200085705A - 고욤 효소처리물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200085705A
Application number: KR1020200083343A
Authority: KR
Inventors: 장선일; 조병옥; 강현주; 신재영; 김지수
Original assignee: 주식회사 아토큐앤에이
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-07-15
Also published as: KR102227261B1

Abstract

본 발명은 고욤 효소처리물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물은 NO의 생성을 억제하고, 아토피 관련 인자(IL-4 및 INF-γ)의 분비를 억제하는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물은 고욤잎 에탄올 추출물 또는 고욤잎 추출물의 산 가수분해물에 비해 아토피 피부염이 유발된 동물모델의 피부병변 개선효과가 우수하며, 피부 두께, 혈중 IL-4, IgE 및 CCL17의 농도를 현저히 감소시키는 효과가 있으므로, 본 발명의 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아토피 피부염용 의약외품, 아토피 환자의 건강기능식품, 아토피 피부염 치료제의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고욤 효소처리물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating atopic dermatitis comprising enzyme treated Diospyros lotus as effective component}

본 발명은 고욤 효소처리물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 유전적, 환경적, 면역학적인 원인에 의해 발생하고, 피부 가장 바깥에서 보호벽 역할을 하는 각질층에 이상이 생긴 것으로 건조한 기후에서 더욱 심해지는 알레르기 질환이다.

아토피 피부염은 전 세계적으로 약 10~20%의 유병률을 보이며, 생후 1개월에서 1년 사이의 유아에게서 주로 발병하고 3세가 되면 어느 정도 완화되나 생활환경, 개인차 등에 의해 다시 재발할 수 있다.

아토피 피부염의 주요 증상은 심한 가려움증, 피부 건조, 발진, 진물, 부스럼딱지, 비늘 같은 껍질이 있는 피부(인비늘) 등으로, 주로 만성 피부염증이 동반된다. 긁고 싶은 감정을 불러일으키는 가려움증은 히스타민(histamine)과 같은 가려움 매개 물질에 의해서 유도되는데, 정상인은 긁으면 그 증상이 쉽게 완화되지만, 아토피 환자는 긁으면 긁을수록 더욱 긁고 싶은 감정이 형성되어 더욱더 심하게 긁게 된다. 아토피 환자의 이러한 긁는 행동으로 인해서 피부 장벽이 붕괴되고 2차 감염을 유발하여 염증이 더욱 악화된다. 아토피 피부염은 일시적으로 완화될 수 있지만, 환경 및 식품 등의 자극원에 의해서 재발되어 악화될 수 있으며, 악화와 완화가 반복된다.

이러한 아토피 피부염의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, 주로 유전적인 요소가 많고, 면역 반응과 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, 그 외에 건조한 피부, 정상인에 비해 쉽게 피부 가려움증을 느끼는 특성, 세균, 바이러스 및 곰팡이 등에 의한 감염, 정서적 요인 및 환경적 요인 등이 서로 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 보고 있다. 아토피 피부염에 동반되는 염증은 과도한 면역세포 작용으로 인해 종양괴사인자-알파(TNF-α, tumor necrosis factor-α)와 인터루킨-1(IL-1, interleukin-l) 등의 염증성 사이토카인과 하이드록시 라디칼(·OH), 슈퍼옥사이드 라디칼(·O₂-), 과산화수소(H₂O₂) 등과 같은 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 대량생산하기 때문에 주변 조직의 손상을 야기한다.

또한, 비만세포(mast cell)는 아토피 피부염을 비롯한 대부분의 알레르기성 질환에서 급성 및 만성 염증 질환을 일으키는 핵심 세포로 알려져 있다. 비만세포가 활성화되면, TNF-α, IL-1과 IL-6 등 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성뿐만 아니라 히스타민과 같은 가려움 유발물질(pruritogen)을 방출한다. 이와 같이 비만세포 유래 염증성 사이토카인은 염증반응을 더욱 촉진시키는 동시에 히스타민과 같은 가려움 유발물질의 분비를 더욱 촉진시켜 피부 장벽을 붕괴시키는 원인이 된다. 따라서 부작용 없이 염증성 사이토카인과 가려움 매개물질을 억제시킬 수 있는 물질을 발굴한다면, 아토피 피부염을 비롯한 각종 알레르기성 질환을 제어하는데 효과적일 것이다.

아토피성 피부염을 치료하기 위한 처방은 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 약물요법이 주로 이루어지고 있다. 스테로이드제(부신피질호르몬제)는 크게 소염작용과 면역억제 작용이 있고 효과가 우수하지만, 장기간 바르면 피부약화, 전신 호르몬증상, 중독성 등의 부작용이 나타날 수 있다. 최근 연구중인 아토피성 피부염의 치료 방향은 면역억제제를 사용하는 것과 새로운 항히스타민제를 사용하는 것이다. 그러나 항히스타민제만으로는 알레르기 반응을 완벽하게 차단하지는 못한다. 이는 알레르기 반응을 야기하는 화학전달물질이 히스타민만은 아니기 때문이다. 따라서 아토피성 피부염에 효과가 있으면서도 부작용이 없는 새로운 아토피성 피부염 치료를 위한 조성물 개발이 요구되고 있다.

한편, 고욤나무(Diospyros lotus L.)는 우리나라와 중국을 비롯한 아시아에서 자연적으로 자생하는 낙엽성 식물로, 전통의약분야에서는 성숙한 과일인 고욤을 진정, 진통, 수렴 및 변비치료에 사용해 왔다. 고욤나무의 생화학적 성분은 지방산, 당, 플라보노이드 및 비휘발성 물질이 보고되었고, 최근에는 혈액의 항응고, 뇌세포 보호 작용, 항산화 및 항암 효과에 대해 보고된 바 있다. 이러한 고욤나무의 생리활성효과는 주로 고욤나무 과실 및 종자를 대상으로 하고 있으며, 고욤나무 잎에 대한 생리활성효과의 평가는 미비한 실정이다. 또한, 고욤나무의 과실은 감에 비해서 작을 뿐만 아니라 종자가 많고, 주로 늦가을에 채취 가능하여 산업적으로 활용하기에 용이하지 않을 뿐만 아니라 대량으로 소재를 조달하는데 한계가 있다. 그러므로 고욤나무 잎의 생리활성을 규명하여 활용한다면, 고욤나무 과일과 종자의 활용에 대한 한계성을 극복하여 산업화를 이루는데 매우 용이할 것이다.

한편, 한국공개특허 제2018-0041887호에는 고욤잎 및 포도송이 가지의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 고욤 효소처리물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 고욤잎 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 고욤잎 효소 가수분해물이 고욤잎 에탄올 추출물 및 고욤잎 산 가수분해물에 비해 아토피 피부염의 개선효과가 현저한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 고욤 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물은 고욤잎 에탄올 추출물 및 고욤잎 추출물의 산 가수분해물에 비해 아토피 피부염의 증상을 완화시키는 효과가 현저하므로, 아토피 환자를 위한 건강기능식품, 의약외품 또는 아토피 피부염 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 RAW 264.7 세포에서 고욤잎 추출물의 가수분해물 처리에 의한 세포독성(A) 및 NO(Nitric Oxide) 생성량(B)을 확인한 결과이다. LPS(Lipopolysaccharide)는 NO 생성 유도물질이다. Control은 시료 및 LPS를 처리하지 않은 군이고, 프레드니솔론은 LPS 및 프레드니솔론을 처리한 양성대조군이다. DLE는 LPS 및 고욤잎 에탄올 추출물 처리군이고, HDLE는 LPS 및 고욤잎 추출물의 산 가수분해물 처리군이고, EDLE는 LPS 및 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 처리군이다. a~f는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 2는 마우스 비장세포에서 본 발명의 고욤잎 효소 가수분해물(EDLE) 처리에 따른 아토피 관련 인자(IL-4 및 INF-γ)의 분비량 변화를 ELISA를 통해 확인한 결과이다. ConA는 콘카나발린 A(Concanavalin A)으로, 비장세포 자극 물질이다. Control은 시료 및 ConA를 처리하지 않은 군이고, 프레드니솔론은 ConA 및 프레드니솔론을 처리한 양성대조군이다. DLE는 ConA 및 고욤잎 에탄올 추출물 처리군이고, HDLE는 ConA 및 고욤잎 추출물의 산 가수분해물 처리군이고, EDLE는 ConA 및 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 처리군이다. a~f는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 3은 DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene) 및 집먼지 진드기 항원을 도포하여 아토피 피부염을 유발한 아토피 피부염 동물모델에서 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 투여에 의한 아토피 피부염 개선효과를 확인한 사진이다. 정상군은 아토피 피부염을 유발하지 않은 대조군이고, AD는 아토피 피부염 유발군이고, 프레드니솔론(prednisolone)은 아토피 피부염 유발 동물모델에 프레드니솔론을 투여한 양성대조군이고, DLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 에탄올 추출물을 투여한 군이고, HDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 산 가수분해물을 투여한 군이며, EDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 투여한 군이다.
도 4는 DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene) 및 집먼지 진드기 항원을 도포하여 아토피 피부염을 유발한 아토피 피부염 동물모델에서 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 투여에 의한 아토피 피부염 개선효과를 임상적 스코어(A) 및 등 피부조직의 두께 변화(B)를 통해 확인한 결과이다. 정상군은 아토피 피부염을 유발하지 않은 대조군이고, AD는 아토피 피부염 유발군이고, 프레드니솔론(prednisolone)은 아토피 피부염 유발 동물모델에 프레드니솔론을 투여한 양성대조군이고, DLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 에탄올 추출물을 투여한 군이고, HDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 산 가수분해물을 투여한 군이며, EDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 투여한 군이다. a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 5는 DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene) 및 집먼지 진드기 항원을 도포하여 아토피 피부염을 유발한 아토피 피부염 동물모델에서 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 투여에 의한 아토피 피부염 개선효과를 혈청 내 IL-4(A), IgE(B) 및 CCL17(C)의 농도로 확인한 결과이다. 정상군은 아토피 피부염을 유발하지 않은 대조군이고, AD는 아토피 피부염 유발군이고, 프레드니솔론(prednisolone)은 아토피 피부염 유발 동물모델에 프레드니솔론을 투여한 양성대조군이고, DLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 에탄올 추출물을 투여한 군이고, HDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 산 가수분해물을 투여한 군이며, EDLE는 아토피 피부염 유발 동물모델에 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 투여한 군이다. a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.

본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 고욤잎 추출물의 용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 용매로 사용한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 효소는 당 제거 효소일 수 있고, 바람직하게는 람노오스 잔기를 가수분해하는 효소인 것이며, 더 바람직하게는 람노시다아제(rhamnosidase)인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물은

1) 건조된 고욤잎에 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH5.5~7.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 효소 가수분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있고,

구체적으로는

1) 건조된 고욤잎 10g에 50%(v/v) 에탄올 150~250mL를 첨가하여 12~36시간 동안 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH5.5~7.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 40~60℃ 항온수조에서 12~36시간 동안 효소 가수분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으며,

더 구체적으로는

1) 건조된 고욤잎 10g에 50%(v/v) 에탄올 200mL를 첨가하여 24시간 동안 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH6.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 50℃ 항온수조에서 24시간 동안 효소 가수분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 고욤잎 추출물의 람노시다아제 효소 가수분해물을 제조할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 혼합 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 조정제물 또는 정제물 중에 어느 하나를 포함하는 것으로 한다. 상기 건강기능식품 조성물은 아토피 피부염을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 장기간 섭취하는 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다. 본 발명의 의약외품 조성물은 아토피 피부염의 개선을 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 일례로, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여용 제형일 수 있다.

또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 혼합 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 시료의 제조

- 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물

고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물의 제조를 위해 건조된 고욤잎(10g)에 50%(v/v) 에탄올(200㎖)를 첨가한 다음 실온(20~25℃)에서 24시간 동안 추출한 후 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하였고, 여과물의 에탄올을 제거하기 위하여 감압 농축하였다. 그 후 상기 감압 농축물의 pH를 6.5로 맞추고 람노시다아제(원핵생물 유래의 α-L-RHAMNOSIDASE(Lot 110501c); Megazyme, Chicago, IL, USA) 100㎕를 첨가한 다음 50℃ 항온수조에서 24시간 동안 반응한 후, 효소를 불활성화시키고 동결건조하였다. 그 후 동결건조한 고욤잎 추출물의 람노시다아제 효소 가수분해물은 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

- 고욤잎 에탄올 추출물

고욤잎 에탄올 추출물의 제조를 위해 건조된 고욤잎(10g)에 50%(v/v) 에탄올(200㎖)를 첨가한 다음 실온(20~25℃)에서 24시간 동안 추출한 후 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하였고, 여과물의 에탄올을 제거하기 위하여 감압 농축하였다. 그 후 감압 농축물을 동결건조한 다음 분말을 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

- 고욤잎 산 가수분해물

고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물의 제조를 위해 건조된 고욤잎(10g)에 50%(v/v) 에탄올(200㎖)를 첨가한 다음 실온(20~25℃)에서 24시간 동안 추출한 후 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하였고, 여과물의 에탄올을 제거하기 위하여 감압 농축하였다. 이후 감압 농축물에 1N 염산 용액을 pH 2.7이 되도록 적정량 주입한 후, 80℃ 항온수조에서 2시간 동안 반응하여 가수분해하였고, 1N 수산화나트륨 용액을 주입하여 중화한 후, 동결건조하여 분말화한 다음 회수하여 -80℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

2. DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 시료를 메탄올로 녹여 최종 농도가 20, 40, 60, 80, 및 100㎍/mL가 되도록 정량하여, 100㎕의 각 시료를 96 웰 플레이트에 주입하고, 동시에 0.3mM DPPH 100㎕를 넣어 총량이 200㎕가 되도록 하였다. 그 후 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 하기 식 1을 이용하여 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었고, 50% 소거활성을 갖는 농도를 확인하였다.

[식 1]

DPPH 라디칼 소거능(%)=1-(첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)×100

3. RAW 264.7 세포배양 및 고욤잎 효소 가수분해물의 세포독성 분석

본 발명에 사용된 세포는 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포로 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum)와 100units/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지(GIBCO-BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포에 시료(12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/mL)를 처리하고 24시간 동안 다시 배양한 후 EZ-사이톡스 세포 생존 분석 키트((주)대일바이오텍, 한국)를 사용하여 세포독성을 측정하였다.

4. RAW 264.7 세포주에서 NO ( Nitric Oxide ) 측정

RAW264.7 세포를 96 웰 플레이트에 최종농도가 2×10⁵cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 50㎍/mL의 시료 또는 5㎍/mL의 프레드니솔론을 처리한 다음, 1시간 후 LPS(1㎍/mL)를 처리하여 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 100㎕의 세포 배양액 및 100㎕의 그리스 시약을 혼합하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였고, 질산나트륨(sodium nitrate)으로 표준곡선을 작성하여 NO(nitric oxide) 생성량을 산출하였다.

5. ELISA( Enzyme - linked immunosorbent assay )를 이용한 마우스 비장세포에서 아토피 관련 인자 분석

마우스로부터 비장세포를 획득하기 위해 무균환경에서 사육된 4주령의 수컷 BALB/c 마우스는 ㈜오리엔트바이오(광주광역시, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20~22℃)와 습도(50~60%)는 일정하게 유지하였으며, 전주대학교 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.

순화된 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 차가운 PBS에 세척 후, 멸균된 유리슬라이드로 잘게 마쇄하였고, 40μm 세포 스트레이너(cell strainer)를 통과한 후 RBC 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 적혈구를 용혈시킨 후 원심분리하여 비장세포를 얻었다.

상기 획득한 비장세포를 10%(v/v) FBS와 100units/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 6 웰 플레이트에 최종농도가 5×10⁶cells/mL가 되도록 분주한 뒤 37℃ 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 그 후 배양된 세포에 시료(100㎍/mL) 또는 5㎍/mL의 프레드니솔론을 1시간 동안 전처리한 다음, 콘카나발린 A(Con A, 2㎍/mL)를 처리하여 48시간 동안 다시 배양한 후 상등액을 회수하였고, IL-4(interleukin-4) 및 IFN-γ(interferon-γ)의 농도를 측정하였다. IL-4 및 IFN-γ ELISA 키트는 R&D 시스템(Minneapolis, MN, USA)사의 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하였다.

6. 동물모델에서 DNFB 및 집먼지 진드기 항원 도포에 의한 아토피 피부염 유도

무균환경에서 사육된 7주령의 수컷 헤어리스 마우스는 (주)오리엔트바이오(광주광역시, 대한민국)에서 구입하였고, 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일 동안 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 낮과 밤의 주기를 12시간씩 하였고, 온도(20~22℃)와 습도(50~60%)는 일정하게 유지하였으며, 전주대학교 실험동물위원회의 규정에 준하여 실험하였다.

순화 후 군을 분리한 동물에 화학 항원 유도 아토피 피부염을 유발하기 위해서 아세톤과 올리브 오일을 3:1의 부피비로 제조된 용매를 이용하여 제조한 0.15%(w/v) DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene)를 군 분리 후 1일 및 4일째에 각각 등 쪽의 피부(100㎕)에 감작(sensitization)하였다. 첫 번째 감작일부터 음성 대조군(AD)은 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였고, 실험군은 200mg/kg의 시료 0.1㎖를 경구투여하였으며, 양성 대조군으로 10mg/kg의 프레드니솔론 0.1㎖를 경구투여하였다. 경구투여는 실험 종료일까지 하루에 한 번씩 진행하였다.

또한, 첫 번째 감작일로부터 7일, 10일 및 13일에 3일 간격으로 0.2%(w/v) DNFB를 도포하여 완전히 건조한 후 마리당 100㎎의 집먼지 진드기 항원 유래 Biostir AD 연고(Biostir, Hyogo, Janpan)를 3회 도포하여 챌린지(challenge)를 하였다.

7. 조직의 두께 측정

마지막 챌린지(challenge) 5시간 후에 마우스의 등과 귀 피부조직의 두께는 디지털 캘리퍼(Mitutoyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

8. 피부 병변의 평가(임상적 스코어)

피부상태는 실험 종료 후 사진을 찍어 조사하였다. 피부의 건조상태(dryness), 스켈링(scaling), 미란(erosion), 찰과상(excoriation) 및 출혈 등을 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 가벼운 상태를 1점(mild), 중간 상태를 2점(moderate), 심한 상태를 3점(severe)을 주었고 각각의 단계별로 총점수를 부여하여 평가하였다.

9. 혈청의 IgE , IL -4 및 CCL17 사이토카인 측정

아토피 피부염 모델 마우스의 IL-4, IgE 및 CCL17(chemokine ligand 17)은 상기 아토피 피부염 모델 마우스의 피부 병변 평가 후, 마우스의 간문맥으로부터 혈액을 채취한 다음 혈청을 획득하여 측정하였다.

혈청의 IL-4, IgE 및 CCL17은 항-마우스 IL-4, 항-마우스 IgE 및 항-마우스 CCL17 항체를 사용하여 확인하였으며, 각각에 특이적으로 작용하는 ELISA 키트를 사용하여 R&D 시스템사 및 Shibayagi(Hyogo, Japan)사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다.

상세하게는, 5배로 희석한 혈청 100㎕를 각각의 항체가 코팅된 플레이트에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음, 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA 리더(Molecular Devices, USA)로 측정하였으며, 각 물질에 대한 정량을 위해 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시켜 표준곡선을 획득한 후 혈청에 함유된 물질의 양을 계산하였다.

10. 통계분석

모든 실험값은 평균±표준오차로 표시하였으며, 통계분석은 ANOVA와 던칸 분석으로 처리하였으며, p<0.05 일때, 통계적 유의성이 있다고 분석하였다.

실시예 1. 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물의 항산화 효과

본 발명의 고욤잎 에탄올 추출물(DLE), 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE)의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과, 하기 표 1에 개시된 바와 같이 EDLE의 IC₅₀ 값이 DLE 및 HDLE에 비해 절반 이상 현저히 낮은 것을 확인하였다.

시료	DPPH 라디칼 소거능 (IC₅₀, ㎍/mL)
DLE(에탄올 추출물)	55.00±0.85^a
HDLE(산 가수분해물)	54.45±0.16^a
EDLE(효소 가수분해물)	24.76±0.28^b

실시예 2. 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물의 NO 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포에 제조방법을 달리한 고욤잎 시료를 농도별로 처리하여 200㎍/mL 까지 세포 독성이 없는 것을 확인하였으며(도 1A), LPS를 처리하여 NO의 생성을 유도한 후 제조방법을 달리한 고욤잎 시료를 50㎍/mL의 농도로 처리하였을 경우, LPS 처리에 의해 증가된 NO의 생성이 고욤잎 시료 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였고, 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 처리군에 비해 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE) 처리군의 NO 생성 억제 효과가 현저하였다(도 1B).

실시예 3. 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 처리에 의한 아토피 관련 인자(IL-4, INF-γ)의 분비량 변화

비장세포에 제조방법을 달리한 고욤잎 시료를 ConA와 함께 처리한 경우 ConA에 의해 증가된 아토피 관련 인자의 분비를 어떻게 변화시키는지 ELISA를 통해 확인하였다. 그 결과, ConA를 단독으로 처리한 경우 증가된 IL-4 및 INF-γ의 분비량은 고욤잎 시료를 함께 처리한 경우 감소하였고, 특히 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE) 처리군의 IL-4 및 INF-γ의 분비량 감소효과는 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 처리군에 비해 현저하였다(도 2).

실시예 4. 아토피 피부염 동물모델에서 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물의 아토피 피부염 개선효과

DNFB 및 집먼지 진드기 항원 도포에 의해 아토피 피부염이 유발된 동물모델은 고욤잎 시료 또는 프레드니솔론 투여시 아토피 피부염이 개선되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE) 투여시 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 투여군에 비해 아토피 개선효과가 현저하였다(도 3).

또한, 피부염 개선효과를 임상적 스코어 및 등 피부조직의 두께 변화를 확인한 결과, 고욤잎 시료 및 프레드니솔론 투여시 피부 병변의 심각도에 대한 임상적 스코어가 감소하였으며, 등 피부조직의 두께가 시료를 투여하지 않은 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 특히 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE) 투여군의 임상적 스코어, 등 피부조직의 두께 감소효과가 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 투여군에 비해 현저하였다(도 4).

실시예 5. 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물 투여에 의한 아토피 피부염 동물모델 혈청 내 IL-4, IgE 및 CCL17 농도 변화

아토피 피부염 동물모델에서 고욤잎 추출물의 효소 가수분해물의 아토피 피부염 개선효과를 혈청 내 IL-4, IgE 및 CCL17의 농도로 확인하였다. 그 결과, DNFB 및 집먼지 진드기 항원 도포에 의해 아토피 피부염이 유발된 동물모델의 혈청 내 IL-4 및 IgE의 농도가 증가하는 것을 확인하였고, 고욤잎 시료 또는 프레드니솔론 투여시 혈청 내 IL-4 및 IgE의 농도가 감소하였다.

또한, DNFB 및 집먼지 진드기 항원 도포에 의해 아토피 피부염이 유발된 동물모델의 혈청 내 CCL17의 농도가 증가하는 것을 확인하였고, 고욤잎 산 가수분해물(HDLE) 투여군에서는 농도의 변화가 미미하였으나, 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE)을 투여한 군에서는 증가된 CCL17의 농도가 감소하는 것을 확인하였다.

특히 고욤잎 에탄올 추출물의 효소 가수분해물(EDLE) 투여군의 혈청 내 IL-4, IgE 및 CCL17의 농도 감소효과가 고욤잎 에탄올 추출물(DLE) 및 고욤잎 에탄올 추출물의 산 가수분해물(HDLE) 투여군에 비해 현저하였다(도 5).

Claims

1) 건조된 고욤잎에 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH5.5~7.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 효소 가수분해하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 람노시다아제 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 고욤잎 추출물의 람노시다아제 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

1) 건조된 고욤잎에 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH5.5~7.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 효소 가수분해하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 람노시다아제 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 고욤잎 추출물의 람노시다아제 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.

1) 건조된 고욤잎에 에탄올을 첨가하여 추출한 후 여과한 다음 감압 농축하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 감압 농축물의 pH를 pH5.5~7.5로 맞춘 후 람노시다아제 효소를 첨가하여 효소 가수분해하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 람노시다아제 효소 가수분해물의 효소를 불활성화시킨 후 동결건조하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 고욤잎 추출물의 람노시다아제 효소 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.