KR20200078715A - 핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브 - Google Patents

핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브 Download PDF

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Abstract

핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브
핵산의 정량 및 검출을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 방법은 리포터와 연결된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 또는 프로브의 사용을 포함한다. 표적 핵산은 소광제와 연결된 동족 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 상보적 프로브 또는 프라이머의 중합화에 의해 검출된다.

Description

핵산 에세이에서의 향상된 용융 식별 및 복합화를 위한 프로브{PROBES FOR IMPROVED MELT DISCRIMINATION AND MULTIPLEXING IN NUCLEIC ACID ASSAYS}
본 출원은 2013년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/864,128 호의 우선권의 이익을 향유하고, 전체 내용은 여기에 참조로서 편입된다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학의 분야와 관련된다. 더욱 상세하게는 이는 핵산의 검출과 관련된다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 살아있는 생명체를 사용함 없이 DNA를 효소적으로 복제하는 기법이다. PCR은 일반적으로 의료 및 생물학 연구실에서 다양한 목적, 예를 들어 유전성 질환의 검출, 유전자 지문의 확인, 감염성 질환의 진단, 유전자 클로닝, 친자 확인 검사 및 DNA 전산화를 위해 사용된다. PCR은 이의 독보적인 증폭 및 정확성 때문에 핵산 검출을 위해 선택되는 방법으로서 분자 생물학자득에 의해 받아들여져 왔다. DNA 검출은 전형적으로는 PCR 반응의 종료시에, 또는 고조기에 수행되어지는데, 이는 출발 주형의 정량을 어렵게 한다. 실시간 PCR 또는 동역학 PCR은 반응이 진행됨에 따른 앰플리콘(amplicon) 농도를 기록함으로써 종료시점 PCR 분석의 능력을 향상시킨다. 앰플리콘 농도는 증폭된 표적과 연관된 형광 신호의 변화를 통해 자주 기록된다. 실시간 PCR은 또한 이것이 폐쇄계에서 수행될 수 있기 때문에 오염이 제한된다는 점에서 종료시점 검출에 유리하다. 다른 장점에는 큰 감수성, 동적 범위, 속도 및 요구되는 과정이 적다는 것이 포함된다.
여러 에세이 화학이 실시간 PCR 검출 방법에 사용되어 왔다. 상기 에세이 화학에는 이중-가닥 DNA 결합 염료, 이중-표지화 올리고뉴클레오티드, 예컨대 헤어핀 프라이머, 및 헤어핀 프로브를 사용하는 것이 포함된다. 하지만, 현재 실시간 PCR의 단점은 이의 제한된 복합화 능력에 있다. 현재의 실시간 PCR 기술들은 용액 내에서 유동적인 리포터 형광색소를 사용한다. 이 디자인은 복합 반응 내의 각각의 에세이에 대하여 스펙트럼 상으로 구별되는 형광 색소의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 4개의 표적 서열을 검출하기 위해 디자인된 복합 반응은 대조군 외에도, 스펙트럼 분화에 의해 4개의 상이한 자유 유동 형광 색소의 구별이 가능한 장비를 필요로 할 것이다. 상기 필요성은 실질적인 복합화 능력을 제한하는 것뿐 아니라, 이러한 장비가 전형적으로 방출 원, 검출기 및 필터를 필요로하기 때문에 비용을 증가시킨다. 현재 실시간 PCR 기술은 약 1 내지 6 plex의 복합화 능력을 가진다.
하기 참조는, 예시적인 절차를 제공하는 범위 또는 본원에 언급된 것을 보충하는 다른 설명까지 참조로서 본원에 구체적으로 인용된다.
미국 특허 4,942,124 미국 특허 4,284,412 미국 특허 4,989,977 미국 특허 4,498,766 미국 특허 5,478,722 미국 특허 4,857,451 미국 특허 4,774,189 미국 특허 4,767,206 미국 특허 4,714,682 미국 특허 5,160,974 미국 특허 4,661,913 미국 특허 5,654,413 미국 특허 5,656,493 미국 특허 5,716,784 미국 특허 5,736,330 미국 특허 5,837,832 미국 특허 5,837,860 미국 특허 5,981,180 미국 특허 5,994,056 미국 특허 5,736,330 미국 특허 5,981,180 미국 특허 6,057,107 미국 특허 6,030,787 미국 특허 6,046,807 미국 특허 6,057,107 미국 특허 6,103,463 미국 특허 6,139,800 미국 특허 6,174,670 미국 특허 6,268,222 미국 특허 6,322,971 미국 특허 6,366,354 미국 특허 6,410,278 미국 특허 6,411,904 미국 특허 6,449,562 미국 특허 6,514,295 미국 특허 6,524,793 미국 특허 6,528,165 미국 특허 6,592,822 미국 특허 6,939,720 미국 특허 6,977,161 미국 특허 7,226,737 미국 특허 7,645,868 미국 특허 7,955,802 미국 공개 공보 2005/0191625 미국 공개 공보 2008/0182312 미국 공개 공보 2009/0148849 PCT 공개 공보 WO/2011/050278
McMinn et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121:11585. Ren, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118:1671.
본 발명은 DNA의 증폭 및 검출을 위한 시스템 및 방법과 관련된다. 특히, 본 발명은 실시간 핵산 증폭(예컨대 PCR)의 복합화 능력을 크게 향상시키는 시스템 및 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 하기를 포함하는 샘플 내 표적 핵산의 존재하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을, 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질(modification), (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머;를 포함하는 프라이머의 제1 세트와 접촉시키는 단계 (b) 표적 핵산을 프라이머의 제1 세트와 함께 증폭시키는 단계로, 상기 증폭시키는 단계는 제1 프라이머의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화(base-pair)하는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 수행되는 단계; 및 (c) 제1 프라이머 상 리포터로부터의 신호의 변화(예컨대 신호의 소광)를 검출함으로써 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계.
따라서, 더욱 구체적인 구현예에서 하기를 포함하는 샘플 내 제1 및 제 표적 핵산 분자 중 하나 또는 둘 모두의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 적어도 프라이머의 제1 및 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 각 프라이머 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질, (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 단계, 상기에서 프라이머의 제1 및 제2 세트의 리포터는 상호 동일하며, 프라이머의 제1 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀을 포함함; (b) 표적 핵산을 프라이머의 제1 및 제2 세트와 함께 (증폭 산물을 획득하기 위하여) 증폭시키는 단계로, 상기 증폭시키는 단계는 제1 및 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화(base-pairs)하는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 수행되는 단계; (c) 프라이머의 제1 또는 제2 세트의 제1 프라이머 상 리포터로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계; 및 (d) 샘플의 온도 변화에 의하여 제1 표적 핵산 분자, 제2 표적 핵산 분자 또는 이들 둘의 존재로부터 기인 된 리포터의 신호의 소광 여부를 측정하고, 리포터의 비소광에 대응되는 융해점 또는 융해 피크를 측정함으로써 따라서 제1 및 제2 표적 핵산 분자 중 하나 또는 둘 모두의 존재를 검출 (예컨대, 제1 및 제2 프라이머 세트의 헤어핀의 상이한 융해점에 기초하여)하는 단계.
특정 양상에서, 현 구현예에서 사용을 위한 리포터는 형광단, 예컨대 제1 프라이머의 5' 말단에 부착된 형광단일 수 있다. 따라서, 몇몇의 경우에서, 신호의 변화는 형광 신호의 감소일 수 있다. 추가의 양상에서, 제1 프라이머 상 리포터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 리포터 및 소광제 (예컨대 다크 소광제)를 포함하는 증폭 산물을 하이브리드화하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
추가적 양상에서, 리포터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화됨에 따라 신호의 비소광과 같은, 신호의 변화 (또는 변화의 속도)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 샘플의 온도는 샘플 내 하나 또는 그 이상의 프라이머의 헤어핀의 융해점 위로 증가 (또는 아래로 감소)될 수 있다. 둘 또는 그 이상의 프라이머 세트가 존재하는 경우, 샘플의 온도의 변화는 샘플의 온도가 제1 및 제2 세트의 프라이머 내 두 제1 프라이머의 헤어핀의 융해점 아래의 온도로부터 헤어핀의 두 융해점 위로의 온도로 증가하는 것을 포함할 수 있다.
구현예의 특정의 양상은 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드의 사용과 관련된다. 몇몇의 양상에서, 비-천연 뉴클레오티드는 iso 염기, 예컨대 이소-구아닌 (isoG) 또는 이소-시토신(isoC) 이다. 본 양상에서, 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드는 동족 isoC (또는 isoG)이다. 추가의 양상에서, 적어도 하나의 제1 및/또는 제2 프라이머는 표적-특이적 서열 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 예컨대, 몇몇 양상에서, 표적-특이적 서열 내 비-천연 뉴클레오티드는 서열-특이적 어닐링(annealing)을 조절하여 따라서 뉴클레오티드의 서열-특이적 증폭을 위한 프라이머-주형 하이브리드화를 향상시킨다. (예를 들어, 여기에서 참조로 편입된 PCT 공보. WO/2011/050278 참조).
추가의 양상에서, 일 구현예의 발명은 하기를 추가로 포함한다: (a) 샘플을, 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질(modification), (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 제2 (혹은 그 이상의) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 제2 (혹은 그 이상의) 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머의 제2 (혹은 그 이상의) 세트와 접촉시키는 단계; (b) 제2 표적 핵산을 프라이머의 제2 세트와 함께 (증폭 산물을 획득하기 위하여) 증폭시키는 단계로, 상기 증폭시키는 단계는 제1 프라이머의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화하는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 수행되는 단계; 및 (c) 프라이머의 제2 (혹은 그 이상의) 세트로부터의 제1 프라이머 상 리포터로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제2 (혹은 그 이상의) 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및/또는 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 것은 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가의 양상에서, 프라이머의 제1 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 프라이머의 제1 및 제2 세트는 동일한 리포터를 포함할 수 있고, 몇몇의 경우에서, 프라이머의 제1 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점 (예컨대, 다른 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃ 또는 이로부터 파생되는 어느 범위만큼 상이한 융해점)을 가지는 헤어핀을 포함한다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함하는 복합적 방법이다: (a) 샘플을 프라이머의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트와 접촉시키는 단계, 상기 프라이머의 각 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질(modification), (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열; 을 포함하는 제1 프라이머 및 제3, 제4, 제5 또는 제6 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다; (b) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (또는 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의) 표적 핵산을 프라이머의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (또는 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의) 세트와 함께 증폭시켜 증폭 산물을 획득하는 단계로, 상기 증폭시키는 단계는 제1 프라이머의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화(base-pairs)하는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 수행되는 단계; 및 (c) 프라이머의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트로 부터의 제1 프라이머 상 리포터로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계. 일 양상에서, 프라이머의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 및 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트는 각각 구별가능 한 리포터 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 추가의 양상에서, 구현예에 따른 복합적 방법은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별 되는 프라이머 세트의 사용을 포함할 수 있고, 상기에서, 프라이머의 각 세트는 (1) 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀을 가지는 제1 프라이머 또는 (2) 구별가능 한 리포터를 포함하여, 프라이머의 각 구별되는 세트로부터의 신호가 개별적으로 포착될 수 있다.
추가의 양상에서 본 발명의 구현예에 따른 사용을 위한 프라이머의 적어도 하나의 세트는 (예컨대, 프라이머 세트를 위한 제2 리포터 신호를 제공하기 위하여) 적어도 하나의 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 예컨대, 프라이머의 적어도 하나의 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질(modification), (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 적어도 하나의 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기에서 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘의 융해점은 제1 프라이머의 헤어핀의 융해점과 구별 가능하다. 그 대신에, 또는 추가로, 제2 프라이머는 적어도 하나의 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 가지는 서열을 포함할 수 있고, 상기에서 리포터는 제1 프라이머의 리포터와 상이하다. 따라서 이러한 프라이머 세트는 온도가 (1) 제1 프라이머의 헤어핀의 융해점 위로, 및 (2) 프라이머에 의해 생성되는 앰플리콘의 융해점 위로 변화될 때 신호의 포착 가능한 변화를 생성한다. 이러한 추가의 신호는 표적 핵산 분자의 존재를 추가적으로 확인하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 구현예에서, 구현예에 따른 프라이머의 제1 세트를 적어도 포함하는 조성물이 제공된다. 예컨대, 프라이머 세트는 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) (헤어핀의 일부를 형성할 수도 있는) 폴리머라제 연장-차단 개질, (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 구현예에 따른 프라이머 세트의 제2 프라이머는 적어도 하나의 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇의 양상에서, 조성물은 추가로 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드, 폴리머라제, 참조 프로브, 참조 샘플, 및/또는 자유 뉴클레오티드를 포함한다.
추가의 양상에서, 조성물은 추가로 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질, (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 제2 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머의 제2 (또는 그 이상의) 세트를 포함한다. 특정 양상에서, 프라이머의 제1 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터 및/또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀을 포함한다. 몇몇의 양상에서, 조성물은 프라이머의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 세트를 포함한다.
추가의 구현예에서, (a) 5'에서 3'로의, (i) 리포터, (ii) 공지된 융해점을 가지는 헤어핀, (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질, (iv) 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드, 및 (v) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머의 제1 세트; 및 (b) 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 추가의 양상에서, 키트는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 프라이머의 세트를 포함한다. 특정 양상에서, 프라이머의 세트는 구별가능 한 리포터 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀을 포함한다. 몇몇 양상에서, 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는 샘플 내 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드 (예컨대, 리포터); (ii) 태그 서열; 및 (iii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브 는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드(예컨대, 소광제)의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 몇몇의 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 것과 같은 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 내지 10개의 염기 (예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 추가적 양상에서, 다운스트림 프로브는 추가로 (iii) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열 및 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열 사이에 하나 이상의 비-천연 염기를 포함하는 이소프라이머 상보 서열 (complement sequence)을 포함한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 이소프라이머 상보 서열(complement sequence)과 상보적인 3개 내지 10개의 염기 (예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 특정 양상에서, 연장되기 전 업스트림 및 다운스트림 프로브는 표적 핵산의 부재 하에서 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50℃ 미만의 융해점을 가진다.
따라서, 더욱 구체적인 구현예에서 하기를 포함하는 샘플 내 제1 및 제2 표적 핵산 분자 중 하나 또는 이들 둘의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열; 및 (iii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제2 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및/또는 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가의 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 동일한 리포터를 포함할 수 있고, 몇몇 경우에 있어서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다 (예컨대, 다른 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃ 혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위로 상이한 융해점).
추가의 양상에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함하는 복합적 방법이다: (a) 샘플을 프로브의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트와 접촉시키는 단계, 상기에서 프로브의 각 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열; 및 (iii) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇의 양상에서, 일 구현예의 복합적 방법은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 리포터를 포함하는 프로브 세트 및/또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 용융 온도를 가지는 헤어핀 프로브를 형성하는 프로브 세트를 포함한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 (예컨대, 동일한 반응 하에서) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 상이한 표적 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 현 구현예에서 사용되는 리포터는 형광단, 예컨대 제1 프로브에 (예컨대 5' 말단에) 부착되는 형광단일 수 있다. 따라서 몇몇 경우에 있어서, 신호의 변화는 형광 신호의 감소일 수 있다.
추가적 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 신호의 비소광과 같은 신호의 변화 (혹은 변화의 속도)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 샘플의 온도는 샘플 내 하나 이상의 프로브의 헤어핀의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 프로브 세트가 존재하는 경우, 샘플의 온도가 변화하는 것은 샘플의 온도가 제1 프로브 및 제2 프로브의 두 헤어핀의 융해점 아래에서 두 헤어핀 프로브의 융해점 위의 온도로 증가하는 것을 포함한다.
따라서, 추가의 구현예에서, 프로브의 제1 세트를 포함하는 조성물이 제시되고, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열; 및 (iii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다.
추가의 양상에서, 조성물은 추가로, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열; 및 (iii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 (혹은 그 이상의) 세트를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다. 특정 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하고 및/또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇 양상에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 프로브 세트를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다: (a) 프로브의 제1 세트, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열; 및 (iii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; 및 (b) 리포터-라벨 된 또는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드. 추가의 양상에서, 키트는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 프로브의 구별가능 한 세트를 포함한다. 특정 양상에서, 프로브 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇 양상에서, 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는, 샘플 내 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; 및 (d) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 것과 같은 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 내지 10개의 염기 (예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 추가적 양상에서, 다운스트림 프로브는 추가로 (iii) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열 및 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열 사이에 위치되는 하나 이상의 비-천연 염기를 포함하는 이소프라이머 상보 서열 (complement sequence)을 포함한다. 따라서, 몇몇 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 이소프라이머 상보 서열(complement sequence)과 상보적인 3개 내지 10개의 염기 (예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 특정 양상에서, 연장되기 전 업스트림 및 다운스트림 프로브는 표적 핵산의 부재 하에서 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50℃ 미만의 융해점을 가진다..
따라서, 추가의 구현예에서 하기를 추가로 포함하는 샘플 내 제1 및 제2 표적 핵산 분자 중 하나 또는 둘의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 프로브의 제2 세트와 샘플을 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화 될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b)업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; 및 (d) (예컨대, 제1 및 제2 프로브 세트의 헤어핀 프로브의 상이한 융해점에 기초하여) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제2 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및/또는 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가의 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 동일한 리포터를 포함할 수 있고, 몇몇 경우에 있어서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점 (예컨대, 다른 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃, 혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의 차이가 나는 융해점)을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다.
추가의 양상에서, 방법은 하기를 추가로 포함하는 복합적 방법이다: (a) 샘플을 프로브의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 적어도 제1 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 미러된 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; 및 (d) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의) 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 리포터를 가지는 프로브 세트 및/또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 용융 온도를 가지는 헤어핀 프로브를 형성하는 프로브 세트를 포함한다. 따라서, 몇몇 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 (예컨대, 동일한 반응 내에서) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 상이한 표적 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 현재의 구현예에서 사용되는 리포터는 형광단, 예컨대 제1 프로브(예컨대 5' 말단에) 부착된 형광단일 수 있다. 따라서, 몇몇 경우에 있어서, 신호의 변화는 형광 신호의 감소일 수 있다.
추가적 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 신호의 비소광과 같은 신호의 변화 (혹은 속도의 변화)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 샘플의 온도는 샘플 내 하나 이상의 프로브의 헤어핀의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 수 있다. 2 이상의 프로브 세트가 존재하는 경우, 샘플의 온도의 변화는 샘플의 온도가 제1 프로브 및 제2 프로브 둘의 헤어핀의 융해점 아래에서 두 헤어핀 프로브의 융해점 위로 증가하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 추가의 구현예에서, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다.
추가의 양상에서, 조성물은 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 가지는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 (혹은 그 이상의) 세트를 추가로 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다. 특정 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇 양상에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 프로브의 세트를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다: (a) 프로브의 제1 세트, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; 및 (b) 리포터-라벨 된 또는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드. 추가의 양상에서, 키트는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 프로브의 세트를 포함한다. 특정 양상에서, 프로브 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇 양상에서, 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기의 단계를 포함하는, 샘플 내 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체(reverse complement)를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 헤어핀 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하여 헤어핀 프로브를 형성하는 것을 허용하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 것과 같은 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 내지 10개의 염기 (예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 추가적 양상에서, 다운스트림 프로브는 추가로 (iii) 업스트림 프로브의 태그 서열과 동일한 서열을 가지고 적어도 제1 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 미러된 태그 서열 및 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열 사이에 위치되는, 하나 이상의 비-천연 염기를 포함하는 이소프라이머 상보 서열 (complement sequence)을 포함한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 이소프라이머 상보 서열(complement sequence)과 상보적인 3개 내지 10개의 염기(예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 염기)의 3' 서열을 포함한다. 특정 양상에서, 연장되기 전 업스트림 및 다운스트림 프로브는 표적 핵산의 부재 하에서 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 또는 50℃ 미만의 융해점을 가진다.
따라서, 추가의 구현예에서 하기의 단계를 추가로 포함하는, 샘플 내 제1 및 제2 표적 핵산 분자 중 하나 또는 둘의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체(reverse complement)를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 헤어핀 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) (예컨대, 제1 및 제2 프로브 세트의 헤어핀 프로브의 상이한 융해점에 기초하여) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제2 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및/또는 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가의 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 동일한 리포터를 포함할 수 있고, 몇몇 경우에 있어서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점 (예컨대, 다른 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃, 혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의 차이가 나는 융해점)을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 하기를 추가로 포함하는 복합적 방법이다: (a) 샘플을 프로브의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트와 접촉시키는 단계, 상기 프로브의 각 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체(reverse complement)를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 업스트림 프로브를 연장하여 다운스트림 프로브 상 헤어핀 태그 서열과 상보적인 서열을 합성하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; (c) 연장된 업스트림 프로브가 스스로와 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (d) 업스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 헤어핀 프로브를 연장하는 단계; 및 (e) 업스트림 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 리포트를 가지는 프로브 세트 및/또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 용융 온도를 가지는 헤어핀 프로브를 형성하는 프로브 세트를 포함한다. 따라서, 몇몇 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 (예컨대 동일한 반응 내에서) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 상이한 표적 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 현 구현예에서 사용되는 리포터는 형광단, 예컨대 제1 프로브에 (예컨대 5' 말단에) 부착된 형광단일 수 있다. 따라서, 몇몇의 경우에서, 신호의 변화는 형광 신호의 감소일 수 있다.
추가적 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 신호의 비소광과 같은 신호의 변화 (혹은 속도의 변화)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 샘플의 온도는 샘플 내 하나 이상의 프로브의 헤어핀의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 수 있다. 2 이상의 프로브 세트가 존재하는 경우, 샘플의 온도의 변화는 샘플의 온도가 제1 프로브 및 제2 프로브 둘의 헤어핀의 융해점 아래에서 두 헤어핀 프로브의 융해점 위로 증가하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 추가의 구현예에서, 프로브의 제1 세트를 포함하는 조성물이 제공되고, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체(reverse complement)를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다.
추가적인 양상에서, 조성물은, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체(reverse complement)를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 (혹은 그 이상의)세트를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다. 특정 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 및/또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇의 양상에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 프로브의 세트를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다: (a) 프로브의 제1 세트, 프로브의 상기 세트는, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브; 및, 5'에서 3'로의, (i) 태그 서열 및 태그 서열의 역 상보체를 포함하여 서열이 헤어핀을 형성하는 헤어핀 태그; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기에서 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브와 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산과 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; 및 (b) 리포터-라벨 된 또는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드. 추가의 양상에서, 키트는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 프로브의 세트를 포함한다. 특정 양상에서, 프로브 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇의 양상에서, 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는 샘플 내 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을, 적어도, 5'에서 3'로의, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역에 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제1 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머의 제1 세트와 접촉시키는 단계; (b) 표적 핵산을 프라이머와 함께 증폭시켜 증폭된 샘플을 형성하는 단계; (c) 증폭된 샘플을, 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계; (d) 제1 프라이머 하에서 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 프로브를 연장하여 연장된 프로브를 형성하는 단계; 및 (e) 연장된 프로브가 스스로에 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (f) 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계. 특정 양상에서, 프로브는 추가로 (iii) 태그서열 및 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열 사이에 폴리머라제 연창 차단 개질(modification)을 포함한다.
따라서, 추가의 구현예에서 하기를 추가로 포함하는, 샘플 내 제1 및 제2 표적 핵산 분자 중 하나 혹은 둘 모두의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을, 5'에서 3'으로, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 적어도 프라이머의 제2 세트와 접촉시키는 단계; (b) 표적 핵산을 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프로브와 접촉시키는 단계; (d) 제1 프라이머 하에서 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 프로브를 연장하여 연장된 프로브를 형성하는 단계; 및 (e) 연장된 프로브가 스스로에 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (f) (예컨대, 제1 및 제2 프로브 세트의 헤어핀 프로브의 상이한 융해점에 기초하여) 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제2 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및/또는 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가의 양상에서, 제1 및 제2 프로브는 구별가능 한 리포터를 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 제1 및 제2 프로브는 동일한 리포터를 포함할 수 있고, 몇몇 경우에 있어서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 구별가능 한 융해점 (예컨대, 다른 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30℃, 혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의 차이가 나는 융해점)을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다.
제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위)
추가의 양상에서, 방법은 하기를 추가로 포함하는 복합적 방법이다: (a) 5'에서 3'로의, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 프라이머의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 세트와 샘플을 접촉시키는 단계 (b) 표적 핵산을 프라이머와 함께 증폭시켜 증폭된 샘플을 형성하는 단계; (c) 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (혹은 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위) 프로브와 증폭된 샘플을 접촉시키는 단계; (d) 제1 프라이머 하에서 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 프로브를 연장하여 연장된 프로브를 형성하는 단계; 및 (e) 연장된 프로브가 스스로에 하이브리드화하는 것을 허용하여 헤어핀 프로브를 형성하는 단계; (f) 프로브 및 헤어핀 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제18, 제24, 제30, 또는 제36 (또는 이로부터 파생될 수 있는 어느 범위의) 표적 핵산을 검출하는 단계. 몇몇의 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 리포터를 가지는 프로브 및/또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 구별가능 한 융해 온도를 가지는 헤어핀 프로브를 형성하는 프로브를 포함한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 구현예의 복합적 방법은 (예컨대, 동일한 반응 내에서) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개의 상이한 표적 핵산 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 현 구현예에서 사용되는 리포터는 형광단, 예컨대 프로브에 (예컨대 5' 말단에서) 부착되는 형광단일 수 있다. 따라서, 몇몇 경우에 있어서, 신호의 변화는 형광 신호의 감소일 수 있다.
추가적 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 신호의 비소광과 같은 신호의 변화 (혹은 속도의 변화)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 샘플의 온도는 샘플 내 하나 이상의 프로브의 헤어핀의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 수 있다. 2 이상의 프로브 세트가 존재하는 경우, 샘플의 온도의 변화는 샘플의 온도가 제1 프로브 및 제2 프로브 둘의 헤어핀의 융해점 아래에서 두 헤어핀 프로브의 융해점 위로 증가하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 추가의 구현예에서, 5'에서 3'로의, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역에 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제1 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머; 및, 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고, 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 조성물이 제공된다.
추가의 양상에서, 조성물은 5'에서 3'로의, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제2 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역과 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머; 및, 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고, 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프로브를를 포함하는 프라이머 및 프로브의 제2 (혹은 그 이상의)세트를 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 제1 및 제2 (혹은 그 이상의) 프로브는 구별가능 한 리포터를 포함하고 및/또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇 양상에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 프로브를 포함한다.
추가의 구현예에서, (a) 5'에서 3'로의, (i) 적어도 하나의 비-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제2 가닥 상 제1 영역에 상보적인 표적-특이적 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 표적 핵산의 제1 가닥 상 영역과 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머의 제1 세트; (b) 5'에서 3'로의, (i) 제1 프라이머의 태그 서열과 동일하고, 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 프로브; 및 (c) 리포터-라벨 된 또는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 특정 양상에서, 프로브 세트는 구별가능 한 리포터를 포함하거나 또는 구별가능 한 융해점을 가지는 헤어핀 프로브를 형성한다. 몇몇의 양상에서, 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하기를 포함하는, 적어도 제1 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 제1 표적-특이적 프라이머-프로브 세트와 접촉시키는 단계, 상기 프라이머-프로브 세트는 (i) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 프라이머; (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적이고 표적 핵산과 상보적이지 않은 5' 태그 서열을 포함하는 표적-특이적 프로브; (iii) 제1 영역의 다운스트림, 제2 영역 및 표적 특이적 프로브로부터의 태그 서열과 상보적인 제1 영역을 포함하는 제1 에세이 프로브; 및 (iv) 제1 에세이 프로브의 제2 영역과 상보적인 제2 에세이 프로브를 포함하고, 상기에서 제1 및 제2 에세이 프로브 중 하나는 리포터로 라벨되고, 다른 하나는 소광제로 라벨됨; (b) 표적-특이적 프라이머 및 표적-특이적 프로브와 표적 핵산을 하이브리드화하기 적합한 조건하에서 샘플을 배양하는 단계; (c) 하이브리드화된 표적-특이적 프로브를 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 폴라머라제로 절단하여 표적-특이적 프로브로부터 태그 서열을 방출시키는 단계; (d) 방출된 태그 서열을 제1 에세이 프로브와 하이브리드화하는 단계; (e) 하이브리드화된 태그 서열을 제1 에세이 프로브를 따라서 연장하고 제1 에세이 프로브에 하이브리드화된 제2 에세이 프로브를 절단하는 단계; 및 (f) 제1 또는 제2 에세이 프로브 상 리포터로부터 신호(예컨대 비소광)의 변화를 검출함으로써 적어도 제1 표적 핵산을 검출하는 단계. 특정 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 제2 에세이 프로브가 절단되었고, 및 표적 핵산이 존재함을 의미하는 에세이 프로브에 상응하는 용융 피크의 감소 또는 소멸을 검출하는 것을 포함한다. 추가적 양상에서, 프라이머-프로브 세트의 구성 요소 (i) 내지 (iv)의 하나 이상은 샘플과 별도로 접촉된다. 예컨대, 제1 또는 제2 에세이 프로브는 표적-특이적 프라이머 및/또는 프로브 뒤에 첨가될 수 있다. 특정 양상에서, 리포터는 형광단일 수 있고 및 신호의 변화는 형광 신호의 비소광 일 수 있다. 몇몇 양상에서, 제1 및/또는 제2 에세이 프로브는 적어도 isoG 및/또는 isoC와 같은 제1 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 양상에서, 제1 에세이 프로브의 제2 영역는 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하고 제2 에세이 프로브는 제1 에세이 프로브로부터의 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화하는 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 양상에서, 적어도 제1 에세이 프로브의 제1 비-천연 뉴클레오티드는 리포터로 라벨되고 적어도 제2 에세이 프로브의 제1 비-천연 뉴클레오티드는 소광제로 라벨 된다(혹은 그 반대). 바람직한 양상에서, 제1 에세이 프로브의 각 비-천연 뉴클레오티드는 리포터로 라벨되고 제2 에세이 프로브의 각 비-천연 뉴클레오티드는 소광제로 라벨 된다(혹은 그 반대).
특정 양상에서, 제1 및 제2 에세이 프로브는 공지된 융해점을 가지고 및 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 샘플의 온도는 리포터로부터 신호의 변화를 관찰하기 위해 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 수 있다.
추가의 양상에서, 제1 표적-특이적 프로브는 길이가 5, 10, 15, 20, 25, 30 및 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200개의 뉴클레오티드 사이인 표적 핵산의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함한다. 일 양상에서, 5' 태그 서열은 길이에 있어서 6개 내지 50개인 뉴클레오티드이다.
추가의 양상에서, 구현예에 따른 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 에세이 프로브의 제2 영역은 폴리머라제 연장-차단 개질(modification)을 포함한다. 따라서, 표적-특이적 프로브로부터의 태그 서열이 연장될 때 제2 프로브의 일부분만이 절단되어 제1 및 제2 에세이 프로브 사이의 융해점의 변화를 야기한다. 이러한 관찰된 융해점 또는 용융 피크의 변화는 표적 핵산 분자의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 몇몇 양상에서, 적어도 제1 표적 핵산 서열을 검출하는 것은 샘플의 온도가 변화될 때 (제1 또는 제2 에세이 프로브 상) 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
특정의 양상에서, 구현예의 방법은 하기를 포함하는 제1 및 제2 표적 핵산 중 하나 또는 둘 모두의 존재를 검출하는 것을 포함한다: (a) 샘플을 적어도 제1 및 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트와 접촉시키는 단계, 상기 프라이머-프로브 세트 각각은 하기를 포함함: (i) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 프라이머; (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적이고 표적 핵산과 상보적이지 않은 표적-특이적 프로브; (iii) 제1 영역의 다운스트림, 제2 영역 및 표적 특이적 프로브로부터의 태그 서열과 상보적인 제1 영역을 포함하는 제1 에세이 프로브; 및 (iv) 제1 에세이 프로브의 제2 영역과 상보적인 제2 에세이 프로브, 상기에서 제1 및 제2 에세이 프로브 중 하나는 리포터로 라벨되고, 다른 하나는 소광제로 라벨됨; 및 상기에서 제1 및 제2 에세이 프로브는 공지된 융해점을 가지고, 상기에서 제1 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점은 제2 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점과 구별가능함; (b) 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 표적-특이적 프라이머 및 표적-특이적 프로브와 표적 핵산을 하이브리드화하기 적합한 조건하에서 샘플을 배양하는 단계; (c) 하이브리드화된 표적-특이적 프로브를 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 폴라머라제로 절단하여 표적-특이적 프로브로부터 태그 서열을 방출시키는 단계; (d) 방출된 태그 서열을 제1 에세이 프로브와 하이브리드화하는 단계; (e) 하이브리드화된 태그 서열을 제1 에세이 프로브를 따라서 연장하고 제1 에세이 프로브에 하이브리드화된 제2 에세이 프로브를 절단하는 단계; (f) 제1 및/또는 제2 프라이머-프로브 세트의 제1 또는 제2 에세이 프로브 상 리포터로부터의 신호의 비소광을 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계; 및 (g) 제1 및 제2 에세이 프로브 상 용융 곡선 분석법을 수행함으로써 제1 표적-특이적 프라이머-프로브 세트, 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트 또는 이들 둘의 제2 에세이 프로브가 절단되었는지를 측정하는 단계, 상기에서 특정 제1 및 제2 에세이 프로브 세트에 상응하는 용융 피크의 감소 또는 소멸은 제2 에세이 프로브가 절단되었다는 것 및 제1 또는 제2 표적 핵산이 존재함을 의미한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 제1 및 제2 (또는 그 이상의) 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행된다. 추가의 양상에서, 제1 프라이머-프로브 세트의 리포터는 제2 프라이머-프로브 세트의 리포터와 동일하다. 특정 양상에서, 제1의 5' 태그 및 제1 안티-태그 리포터 프로브는 제2의 5' 태그 및 제2 안티-태그 리포터 프로브의 융해점과 구별가능 하다. 따라서, 몇몇의 양상에서 구현예의 방법은 표적 핵산 분자를 검출하는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 프라이머-프로브 세트의 사용을 포함하는 복합적 방법으로, 상기에서 각 프라이머-프로브 세트는 (1) 구별가능 한 리포터 또는 (2) 구별 가능 한 융해점을 가지는 제1 및 제2 에세이 프로브를 포함한다. 추가적 양상에서, 제1 에세이 프로브의 제2 영역은 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드(예컨대 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드)를 포함하고 및 제2 에세이 프로브는 적어도 제1 에세이 프로브로부터의 제1 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화하는 제1 비-천연 뉴클레오티드(예컨대, 제1 에세이 프로브의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화하는 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드)를 적어도 포함한다.
특정 양상에서, 구현예의 제1 에세이 프로브는 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드 포지션과 같은 폴리머라제 연장 차단 서열을 포함한다. 따라서, 특정 양상에서, 하기를 포함하는, 제1 및 제2 표적 핵산 중 하나 또는 둘 모두의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 적어도 제1 및 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트와 접촉시키는 단계, 상기 프라이머-프로브 세트 각각은 하기를 포함함: (i) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 프라이머; (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적이고, 및 표적 핵산과 상보적이지 않은 5' 태그 서열을 포함하는 표적-특이적 프로브; (iii) 폴리머라제 연장-차단 개질을 포함하는 제1 영역의 다운스트림, 제2 영역 및 표적 특이적 프로브로부터의 태그 서열과 상보적인 제1 영역을 포함하는 제1 에세이 프로브; 및 (iv) 제1 에세이 프로브의 제2 영역과 상보적인 제2 에세이 프로브, 상기 제2 영역은 연장-차단 개질을 포함하고, 상기에서 제1 및 제2 에세이 프로브 중 하나는 리포터로 라벨되고, 다른 하나는 소광제로 라벨됨; (b) 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 표적-특이적 프라이머 및 표적-특이적 프로브와 표적 핵산을 하이브리드화하기 적합한 조건하에서 샘플을 배양하는 단계; (c) 하이브리드화된 표적-특이적 프로브를 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 폴라머라제로 절단하여 표적-특이적 프로브로부터 태그 서열을 방출시키는 단계; (d) 방출된 태그 서열을 제1 에세이 프로브와 하이브리드화하는 단계; (e) 하이브리드화된 태그 서열을 제1 에세이 프로브를 따라서 연장 차단 서열까지 연장하여 따라서 제1 에세이 프로브에 하이브리드화된 제2 에세이 프로브의 일 부분을 절단하는 단계, 상기에서 제1 및 제2 에세이 프로브는 상기 절단 후 공지된 융해점을 가지고, 제1 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점은 상기 절단하는 단계 후 제2 프라이머-프로브의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점과 구별가능함; (f) 제1 및 제2 에세이 프로브 상 용융 곡선 분석법을 수행함으로써 제1 표적-특이적 프라이머-프로브 세트, 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트 또는 이들 둘의 제2 에세이 프로브가 절단되었는지를 측정함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계, 상기에서 특정 제1 및 제2 에세이 프로브 세트에 상응하는 용융 피크의 온도 시프트는 제2 에세이 프로브가 절단되었다는 것 및 제1 또는 제2 표적 핵산이 존재함을 의미한다. 따라서, 에세이 프로브의 구별가능 한 융해점은 서열의 제2 에세이 프로브 (연장 차단 서열과 상보적인 5' 서열)의 일 부분의 절단 후 달성된다. 몇몇의 양상에서, 제1 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점은, 제2 에세이 프로브(일부)를 절단하는 단계 이후, 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점과 2℃ 내지 10℃의 차이를 가진다. 추가의 양상에서, 제1 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점은 제2 에세이 프로브의 상기 절단하는 단계 전 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 및 제2 에세이 프로브의 융해점과 동일하다. 예컨대, 제1 및 제2 표적-특이적 프라이머-프로브 세트의 제1 에세이 프로브의 제2 영역은 폴리머라제 연장-차단 개질 부분을 제외하고는 동일할 수 있다. 추가적 양상에서, 제1 에세이 프로브의 제2 영역은 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드 (예컨대 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드)를 포함하고 및 제2 에세이 프로브는 적어도 제1 에세이 프로브로부터의 제1 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화하는 제1 비-천연 뉴클레오티드(예컨대, 제1 에세이 프로브의 비-천연 뉴클레오티드와 염기 페어화하는 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클리오티드)를 적어도 포함한다.
추가의 양상에서, 방법은 샘플을 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 표적-특이적 프라이머와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 몇몇의 양상에서, 방법은 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇의 양상에서, 리포터로부터 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클의 수행 전, 중간, 또는 후에(혹은 사이클 도중에) 신호를 검출하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 리포터로부터 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클의 수행 후에만 신호를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 양상에서, 방법은 리포터로부터 검출된 신호를 리포터 신호의 선결정된 비로 비-하이브리드화 프로브 상 리포터로부터의 참조 신호와 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇의 양상에서, 구현예의 방법은 샘플 내 표적 핵산의 용량을 정량화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 샘플 내 표적 핵산의 용량을 정량화하는 것은 하기를 포함한다: 표준 곡선을 사용하는 것; 표적 핵산의 상대적인 용량을 측정하는 것; 종료-시점 정량화를 사용하는 것; 또는 배경을 넘어 신호가 감지가능 한 PCR 사이클 횟수를 존재하는 표적의 양과 연관시킴으로써 핵산 표적의 양을 측정하는 것.
추가의 구현예에서, 구현예의 하나 또는 그 이상의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 조성물이 제공된다. 예컨대, 조성물은 (i) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 프라이머; (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적이고, 및 표적 핵산과 상보적이지 않은 5' 태그 서열을 포함하는 표적-특이적 프로브; (iii) 제1 영역의 다운스트림, 제2 영역 및 표적 특이적 프로브로부터의 태그 서열과 상보적인 제1 영역을 포함하는 제1 에세이 프로브; 및 (iv) 제1 에세이 프로브의 제2 영역과 상보적인 제2 에세이 프로브를 포함할 수 있고, 상기에서 제1 에세이 프로브 또는 제2 에세이 프로브는 리포터로 라벨되고, 다른 하나는 소광제로 라벨 된다. 추가의 양상에서, 제1 에세이 프로브는 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 영역의 다운스트림, 제2 영역 및 표적 특이적 프로브로부터의 태그 서열과 상보적인 제1 영역을 포함하고; 및 제2 에세이 프로브 (iv)는 제1 에세이 프로브의 제2 영역과 상보적인 서열 및 제1 에세이 프로브로부터의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어화 할 수 있는 적어도 제1 비-천연 뉴클레오티드를 포함하며, 상기에서 제1 에세이 프로브의 비-천연 뉴클레오티드 또는 제2 에세이 프로브의 비-천연 뉴클레오티드는 리포터로 라벨되고, 다른 하나는 소광제로 라벨 된다. 특정 양상에서, 조성물은 에세이 프로브 내 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 (비라벨 된) 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 양상에서, 구현예의 에세이 프로브는 2개 내지 5개의 비-천연 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇의 양상에서, 조성물은 표적 핵산의 제2 가닥 상 영역과 상보적인 표적-특이적 프라이머, 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제, 참조 프로브, 참조 샘플 및/또는 자유 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 몇몇의 양상에서, 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 그 이상의 구별가능 한 세트의 프라이머-프로브 세트를 포함한다.
추가의 구현예에서, 하나 또는 그 이상의 구현예의 프라이머-프로브 세트를 포함하는 키트가 제공된다. 추가의 양상에서, 키트는 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 자유 비-천연 뉴클레오티드, 참조 샘플 또는 키트의 사용에 대한 설명서를 추가로 포함한다.
추가의 구현예에서 하기를 포함하는, 표적 핵산의 존재를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 샘플을 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터를 포함하는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하여, 표적 핵산으로 하이브리드화될 경우 프로브 세트는 T-접합점을 형성함; (b) 다운스트림 프로브 내 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하는 단계; 및 (c) 다운스트림 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 몇몇의 양상에서, 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 염기의 3' 서열(예컨대, 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 3개 내지 10개의 염기의 3' 서열)을 포함한다. 몇몇의 양상에서, 업스트림 프로브의 3' 서열은 태그 서열의 전체 길이보다 작은 것을 넘어서, 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보성을 가지는 것으로 정의된다. 특정 양상에서, 하지만, 업스트림 및 다운스트림 프로브는 표적 서열의 부재 하에서 본질적으로 특이적인 하이브리드화를 갖지 않는다. 특정 양상에서, 연장되기 전, 업스트림 및 다운스트림 프로브는 표적 핵산의 부재 하에서 55, 50, 45, 40 또는 35℃ 미만의 융해점을 가진다. 방법의 추가의 양상에서, 업스트림 프로브의 연장은 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하고 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 3' 연장의 합성을 포함한다.
여기서 사용되는 T-접합점은 업스트림 및 다운스트림 프로브가 표적 서열로 하이브리드화 될 때 이들에 의해 형성되는 구조를 의미한다. 특히 업스트림 및 다운스트림 프로브는 본질적으로 표적 핵산의 인접한 서열과 하이브리드화하여 다운스트림의 5' 태그는 자유롭게 되고 표적과 염기-페어되지 않는다. 몇몇 양상에서, 그러나, 다운스트림의 5' 태그는 업스트림 프로브의 3' 부분과 염기 페어화한다 (예컨대, 도 4A, 중간 패널 참조)
몇몇의 양상에서, 다운스트림 프로브 (및/또는 업스트림 프로브)는 고체 지지체, 예컨대 비이드(예컨대, 코드화된 비이드) 또는 표면에 부착될 수 있다. 일 양상에서, 다운스트림 프로브의 5' 비-천연 뉴클레오티드는 isoG (혹은 isoC)이다. 이같은 양상에서, 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드는 동족 isoC (또는 isoG)이다. 따라서, 몇몇 양상에서, 업스트림 프로브를 연장하는 것은 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적이고 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 3' 연장의 합성을 포함한다. 추가적 양상에서, 다운스트림 프로브 상 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는, 추가로 연장된 업스트림 프로브 및 다운스트림 프로브를 하이브리드화하는 것을 포함한다.
추가로, 특정 양상에서, 리포터는 형광단이고, 리포터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 형광 신호의 감소를 검출하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 것을 포함한다. 예컨대, 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 연장된 업스트림 프로브 및 다운스트림 프로브의 융해점 위로 증가 (혹은 아래로 감소)될 때 리포터로부터의 신호의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
추가의 양상에서 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오 티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 세트와 샘플을 접촉시켜 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 프로브의 세트가 T-접합점을 형성하는 단계; (b) 다운스트림 프로브 내 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하는 단계; 및 (c) 다운스트림 프로브 상 라벨로부터의 신호 변화를 검출하여 제2 표적 핵산을 검출하는 단계. 예컨대, 제1 및 제2 표적 핵산의 존재를 검출하는 단계는 순차적으로 또는 본질적으로 동시에 수행될 수 있다. 특정 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 동일한 리포터 또는 구별가능 한 리포터를 포함한다. 추가적 양상에서, 프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 업스트림 및 다운스트림 프로브 사이에 구별가능 한 융해점을 포함한다.
추가의 양상에서 구현예의 방법은 복합적 방법이고, 하기를 포함한다: (a) 샘플을 프로브의 제3, 제4, 제5 또는 제6세트와 접촉시키는 단계, 상기 프로브의 각 세트는 제3, 제4, 제5 또는 제6 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터를 포함하는 5' 비-천연 뉴클레오티드; (ii) 태그 서열 및 (iii) 제1 영역의 제3, 제4, 제5 또는 제6 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하여 표적 핵산으로 하이브리드화 될 때 프로브의 세트가 T-접합점을 형성함; (b) 다운스트림 프로브 내 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하는 단계; 및 (c) 다운스트림 프로브 상 라벨로부터의 신호의 변화를 검출함으로써 제3, 제4, 제5 또는 제6 표적 핵산을 검출하는 단계. 바람직하게는, 프로브의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 세트 각각은 업스트림 및 다운스트림 프로브 사이에 구별가능 한 융해점 또는 구별가능 한 리포터를 포함한다.
추가의 양상에서, 구현예의 방법은 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클, 예컨대 복합 PCR 사이클을 사이클 사이에 자유-유동 소광제의 제거를 위한 세척 단계 없이 수행하는 것을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 리포터로부터 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클의 수행 전, 후 및/또는 중간에 신호를 검출하는 것을 포함한다. 몇몇 양상에서, 리포터로부터 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클의 수행 후에만 신호를 검출하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 방법은 리포터로부터 검출된 신호를 리포터 신호의 선결정된 비로 비-하이브리드화 프로브 상 리포터로부터의 참조 신호와 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 몇몇의 양상에서, 구현예의 방법은 샘플 내 표적 핵산의 용량을 정량화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 샘플 내 표적 핵산의 용량을 정량화하는 것은 하기를 포함할 수 있다: 표준 곡선을 사용하는 것; 표적 핵산의 상대적인 용량을 측정하는 것; 종료-시점 정량화를 사용하는 것; 또는 배경을 넘어 신호가 감지가능 한 PCR 사이클 횟수를 존재하는 표적의 양과 연관시킴으로써 핵산 표적의 양을 측정하는 것.
추가의 구현예에서 프로브의 제1 세트를 포함하는 조성물이 제공되고, 프로브의 상기 세트는 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터를 포함하는 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하여, 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 프로브의 세트가 T-접합점을 형성한다. 몇몇 양상에서, 조성물은 추가로, 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 세트를 포함하여, 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 프로브 세트는 T-접합점을 형성한다. 특정 양상에서, 조성물은 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 세트의 프로브를 포함한다. 바람직하게는, 프로브의 각 세트는 구별가능 한 리포터 또는 구별가능 한 융해점을 업스트림 및 다운스트림 프로브 사이에 포함한다. 추가적 양상에서 조성물은 추가적으로 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드, 폴리머라제, 참조 프로브 및/또는 자유 뉴클레오티드를 포함한다.
관련 구현예예서, (a) 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및 5'에서 3'로의, (i) 리포터-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드을 포함하는 태그 서열 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하여 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 프로브의 세트가 T-접합점을 형성하는 프로브의 제1 세트; 및 (b) 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 특정 양상에서, 키트는 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 프로브의 세트를 포함한다. 바람직하게는, 프로브의 각 세트는 구별가능 한 리포터 및/또는 구별가능 한 융해점을 업스트림 및 다운스트림 프로브 사이에 포함한다. 추가적 양상에서 키트는 추가로 폴리머라제, 참조 프로브, 자유 뉴클레오티드, 및/또는 키트의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
여기서 사용되는 고체 지지체는 자기 특성을 가진 비이드 및/또는 비이드가 용액 내 2차원 표면에 얹혀있도록 허용하는 밀도를 가지는 비이드일 수 있다. 입자는 자성의, 중력의 또는 이온적 힘에 의해서 또는 화학적 결합에 의해 또는 당업자에게 알려진 어떤 다른 수단에 의해서 2차원 표면상에 어떻게든 얹혀질 수 있다. 입자는 유리, 폴리스티렌, 라텍스, 금속, 양자점, 고분자, 실리카, 금속 옥사이드, 세라믹 또는 핵산과 결합하기에 적합한 기타의 물질 또는 핵산을 부착할 수 있는 화합물 또는 단백질로 구성될 수 있다. 입자는 막대 형상 (rod shaped) 또는 구형 또는 디스크 형상일 수 있고, 또는 다른 형상을 포함할 수 있다. 입자는 그들의 형상 또는 크기 또는 물리적 위치에 의해 또한 구별 가능할 수 있다. 입자는 염료를 포함하는 조성물을 가짐으로써 또는 하나 이상의 염료 또는 형광 색소의 비율 또는 농도에 의해서 스펙트럼 상 구별될 수 있고, 또는 바코드 또는 홀로그램 이미지 또는 다른 입자 코딩의 프린트된 형태에 의해 구별 가능할 수 있다. 입자가 자성 입자인경우, 그들은 자기장의 도입에 의해 챔버의 표면으로 끌려질 수 있다. 역시 마찬가지로, 자성 입자는 자기장의 제거에 의해 챔버의 표면에 분산될 수 있다. 자성 입자는 바람직하게는 상자성체 또는 초자성체이다. 상자성 및 초자성 입자는 자기장의 부재 시 무시할 수 있을 정도의 자성을 가지지만, 자기장의 도입에 의해서 입자 내 자성 도메인의 정렬이 유도되어 장원으로의 입자의 끌림이 발생 된다. 장이 제거되는 경우, 자성 도메인은 불규칙 방위로 회귀하여 입자 간 자성 끌림 또는 밀어냄이 없어진다. 초자성체의 경우, 이러한 도메인의 불규칙 방위로의 회귀가 거의 즉각적이고, 반면 상자성체 물질은 도메인의 정렬이 자기장의 제거 후에도 수 기간의 시간 동안 유지된다. 입자가 충분한 밀도를 가지는 경우, 그들은 중력에 의해 챔버의 바닥 표면으로 이끌려지고, 챔버를 휘저음(agitation), 예컨대 보르텍싱(vortexing), 초음파분해(sonication) 또는 유체 이동(fluidic movement)에 의해서 챔버의 바닥 표면으로부터 분산된다. 챔버의 휘저음은 또한 자성 또는 이온력, 또는 흡입력, 또는 진공 여과, 또는 어피니티, 또는 친수성 또는 소수성, 또는 이들의 결합과 같은 힘에 의해서 입자가 챔버의 표면으로 당겨져 있는 방법 또는 시스템 하에서 입자를 분산시키는 것을 추가로 보조하는데 추가로 사용될 수 있다.
리포터로 언급될 수 있는 라벨링제(labeling agent)는 그것이 부착되어 있는 분자 (예컨대, 핵산 서열)의 검출을 용이하게 하는 분자이다. 핵산을 라벨링하는데 사용될 수 있는 다양한 리포터 분자들이 알려져있다. 직접 리포터 분자에는 형광단, 발색단, 라디오포어(radiophore)가 포함된다. 형광단의 비-제한적인 예에는 적색 형광 스쿠아린 염료, 예컨대 2,4-비스[1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴메틸]시클로부텐디일리움-1,3-디옥솔레이트, 적외선 염료, 예컨대 2,4-비스[3,3-디메틸-2-(1H-벤즈[e]인돌리닐리덴메틸)]시클로부텐디일리움-1,3-디옥솔레이트, 또는 오렌지색 형광 스쿠아린 염료, 예컨대 2,4-비스[3,5-디메틸-2-피롤릴]시클로부텐디일리움-1,3-디올로레이트가 포함된다. 형광단의 부가적인 비-제한적인 예에는 양자점, Alexa Fluor™ 염료, AMCA, BODIPY™ 630/650, BODIPY™ 650/665, BODIPY™-FL, BODIPY™-R6G, BODIPY™-TMR, BODIPY™-TRX, Cascade Blue™, Cy염료™(Cy2™, Cy3™, 및 Cy5™를 포함하나 이에 제한되지 않음), DNA 삽입 염료, 6-FAM™, 플루오레세인, HEX™, 6-JOE, Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500, Oregon Green™ 514, Pacific Blue™, REG, 피코빌리단백질(phycobilliprotein)(피코에리트린(phycoerythrin) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin)을 포함하나 이에 제한되지 않음), Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, ROX™, TAMRA™, TET™, 테트라메틸로다민, 또는 Texas Red®가 포함된다. 신호 증폭 시약, 예컨대 티라미드(PerkinElmer)가 형광 신호를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 간접 리포터 분자에는 비오틴이 포함되는데, 이것은 검출을 위해서 스트렙타비딘-피코에리트린과 같은 또 다른 분자에 결합해야만 한다. 형광 공명 에너지 전이 쌍 또는 염료-소광제 쌍과 같은 라벨의 쌍이 또한 사용될 수 있다.
라벨 된 증폭 산물은 직접적으로 또는 간접적으로 라벨 될 수 있다. 직접 라벨링은 예컨대, 라벨 된 프라이머의 사용, 라벨 된 dNTPs를 사용, 라벨 된 핵산 삽입 제제 또는 이들의 조합에 의해서 달성될 수 있다. 간접 라벨링은 예컨대 라벨 된 프로브를 증폭 산물로 하이브리드화 함으로써 달성될 수 있다.
여기서 언급된 방법은 추가로 샘플 내 표적 핵산의 최초 용량을 정량화 하는 것을 포함한다. 정량화는 예컨대 실시간 PCR의 지수 상 동안 존재하는 DNA의 상대적인 농도를 형광을 로그 스케일로 사이클 횟수에 대해 플로팅 함으로써 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이후 DNA의 양은 결과를 공지된 양의 DNA의 연속 희석물의 실시간 PCR에 의해 생성된 표준 곡선과 비교하여 측정될 수 있다. 추가로, 실시간 PCR은 역 전사 폴리머라제 연쇄 반응과 결합 되어 저 과다(low abundance) RNA를 포함하여 샘플 내 RNA를 정량화할 수 있다.
여기서 언급된 방법은 복합화 능력을 제공하여, 다수의 프라이머 쌍 (및/또는 프로브 세트)는 단일 증폭 반응 내에서 다수의 표적 핵산을 증폭시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, 증폭 반응 내에 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 1°의 상이한 프라이머 쌍(또는 프로브)이 존재 한다. 몇몇 구현예에서, 증폭 반응 내에 8 내지 100, 8 내지 80, 8 내지 60, 8 내지 40, 8 내지 20, 8 내지 18, 8 내지 16, 8 내지 12, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 12, 12 내지 100, 12 내지 80, 12 내지 60, 12 내지 40, 12 내지 20, 12 내지 18, 또는 12 내지 16개의 상이한 프라이머 쌍 (혹은 프로브)이 존재한다. 특정 구현예에서 증폭 반응 내에 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 상이한 표적 핵산이 존재한다. 몇몇 구현예에서 8 내지 100, 8 내지 80, 8 내지 60, 8 내지 40, 8 내지 20, 8 내지 18, 8 내지 16, 8 내지 12, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 60, 10 내지 40, 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 12, 12 내지 100, 12 내지 80, 12 내지 60, 12 내지 40, 12 내지 20, 12 내지 18, 또는 12 내지 16개의 상이한 표적 핵산이 증폭 반응 내에 존재한다. 증폭 반응 내에 존재하는 프로브는, 몇몇 양상에서, 폴리머라제에 의한 프로브의 신장을 방지하기 위해 차단된 3' 히드록실 기를 포함한다. 3' 히드록실 기는 예컨대 포스페이트 기, 3' 반전형 dT와 차단될 수 있다. 구현예에 따른 사용을 위한 핵산 증폭 방법은, 비 제한적으로, PCR 및 등온 증폭 방법을 포함한다.
표적 핵산 서열은 관심의 임의의 서열일 수 있다. 표적 핵산 서열을 포함하는 샘플은 핵산을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 본 발명의 특정 양상에서 샘플은 예컨대 하나 이상의 유전적 변이 또는 다형의 존재 또는 부재에 대해 스크리닝 중인 대상으로부터의 것일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 샘플은 병원체의 존재 또는 부재에 대해 시험 중인 대상으로부터의 것일 수 있다. 샘플이 대상으로부터 수득 되는 경우, 이것은 당업계에 공지된 방법, 예천대 흡입, 생검, 면봉 채취, 정맥채혈, 요추 천자법, 대변 샘플 또는 소변 샘플에 의해 수득 될 수 있다. 본 발명의 몇몇 양상에서, 샘플은 환경적 샘플, 예컨대 물, 토양 또는 공기 샘플이다. 다른 양상에서, 샘플은 식물, 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 후생동물 유래이다.
각 증폭 사이클은 하기의 3개의 단계(phase)를 가진다: 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계 및 프라이머 연장 단계. 증폭 사이클은 증폭 산물의 원하는 양이 생산될 때까지 반복될 수 있다. 전형적으로, 증폭 사이클은 약 10 내지 40회 사이에서 반복된다. 실시간 PCR 검출을 위하여, 증폭 산물의 검출은 전형적으로는 각 증폭 사이클 이후에 수행될 것이다. 비록 본 발명의 특정 양상이지만, 증폭 산물의 검출은 매 제2, 제3, 제4, 또는 제5 증폭 사이클 후 수행될 수 있다. 검출은 또한 2회 이상의 증폭 사이클이 분석되거나 검출되는 정도로 짧게 수행될 수 있다. 증폭 사이클은 증폭의 검출이 일어나는 동일한 챔버 내에서 수행될 수 있고, 이 경우, 이 챔버는 발열체를 포함하여 챔버 내 온도가 증폭 사이클의 변성 단계, 프라이머 어닐링 단계 및 프라이머 연장 단계 동안 조절될 수 있도록 하는 것이 필요할 수 있다. 발열체는 일반적으로 처리기의 통제하에 있을 수 있다. 하지만, 증폭 사이클은 증폭의 검출이 수행되는 챔버와는 상이한 챔버에서 수행될 수 있는 데, 이 경우 "증폭" 챔버는 발열체를 포함하는 것이 필요하지만, "검출" 또는 "영상화" 챔버는 발열체를 가지는 것이 필요하지 않다. 증폭 및 검출이 별개의 챔버에서 수행되는 경우, 증폭 반응이 일어나는 유체는 예컨대 펌프 또는 피스톤에 의해서 챔버간 이동될 수 있다. 펌프 또는 피스톤은 처리기의 통제하에 있을 수 있다. 그 대신, 유체는 예컨대 피펫을 사용하여 손으로 챔버간 이동될 수 있다.
증폭은 비-천연 뉴클레오티드를 가지는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티를 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행될 수 있다. 반응 혼합물 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드는 제1 및/또는 제2 프라이머 세트의 프라이머 내 존재하는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기 페어화 할 수 있다. 임의로, 비-천연 뉴클레오티드는 형광단 및 소광제를 포함할 수 있는 라벨과 커플된다. 소광제는 제1 및/또는 제2 프라이머 세트의 프라이머 내 존재하는 형광단을 소광할 수 있다.
검출하는 것은 집단 내 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함한다. 예컨대, 검출하는 것은 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 하나 또는 그 이상의 집단의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것을 포함한다. 비-천연 뉴클레오티드는, 임의로 올리고 뉴클레오티드의 혼합물의 비-천연 뉴클레오티드 (예컨대, 퇴화된 올리고뉴클레오티드 내 존재하는 비-천연 뉴클레오티드)와 염기-페어링 할 수 있는, 비-천연 뉴클레오티드 (예컨대 isoC 및 isoG)를 가질 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드는 라벨과 커플 될 수 있다. 적절한 라벨은 형광단 및 소광제를 포함한다.
본 발명은 증폭 동안 또는 실시간 내에서 지속적으로 표적을 검출하는데 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 하나는, 하나 이상의 위치에 존재할 수 있는, 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드 (예컨대, isoC 및 isoG)를 포함한다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 적어도 하나는 라벨을 포함할 수 있다. 제1 프라이머 및 제2 프라이머 둘 다 라벨을 포함하는 경우, 라벨은 동일할 수 있고, 또는 상이할 수 있다. 바람직하게는 상이하다. 적당한 라벨은 형광단 및 소광제를 포함한다. 임의로 라벨은 비-천연 뉴클레오티드와 커플될 수 있다. 증폭은 제1 프라이머, 제2 프라이머 또는 두 프라이머의 존재하에서 비-천연 뉴클레오티드와 임의로 염기-페어화 할 수 있는, 비-천연 뉴클레오티드를 가지는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 반응 혼합물의 비-천연 뉴클레오티드는 라벨을 포함할 수 있다. 적절한 라벨은 (존재 시) 제1 프라이머, 제2 프라이머 중 적어도 하나, 혹은 바람직하게는 두 프라이머 내에서 임의로 형광단을 소광할 수 있는, 형광단 및 소광제를 포함할 수 있다.
증폭은 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 및/또는 비-천연 뉴클레오티드와 커플 된 적어도 하나의 소광제의 존재하에서 수행될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 하나의 소광제와 커플 된 비-천연 뉴클레오티드는 isoCTP 또는 isoGTP일 수 있다.
몇몇의 방법에서, 제1 및 제2 라벨은 상이할 수 있다. 몇몇 방법에서, 제1 및 제2 소광제는 상이할 수 있고, 2개의 상이한 형광단을 소광할 수 있다. 다른 방법에서는, 제1 및 제2 소광제는 동일할 수 있고, 2개의 상이한 형광단을 소광할 수 있다.
여기서 언급된 방법은 앰플리콘 (예컨대, HIV의 적어도 하나의 증폭된 핵산의 증폭된 핵산 및 증폭된 대조군 핵산)의 용융 온도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 (증폭된 표적 핵산을 포함할 수 있는) 표적 핵산에 하이브리드화된 라벨 된 프로브를 포함하는 핵산 복합체의 용융 온도를 측정하는 것을 포함한다. 용융 온도는 앰플리콘 또는 핵산 복합체를 온도의 구배에 노출시키고 라벨의 신호를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 임의로, 용융 온도는 (a) 앰플리콘을 온도 구배에서 삽입제제(intercalating agent)와 반응시키는 단계 및 (b) 삽입 제제로부터의 감지 가능 한 신호를 관찰하는 단계에 의해서 측정될 수 있다. 핵산 복합체의 용융 온도는 (1) 프로브를 표적 핵산에 하이브리드화시켜 핵산 복합체를 형성하는 단계, 상기에서 프로브 및 표적 핵산 중 적어도 하나는 라벨을 포함함; (2) 핵산 복합체를 온도의 구배에 노출시키는 단계; 및 (3) 라벨의 신호를 관찰하는 단계에 의해서 측정될 수 있다.
방법은 임의의 적절한 조건하에서 임의의 적절한 반응 챔버 내에서 수행될 수 있다. 예컨대, 방법은 반응 챔버의 개방 없이 반응 챔버 내에서 수행될 수 있다. 반응 챔버는 반응 챔버의 어레이의 부분일 수 있다. 몇몇 구현예에서 반응 단계는 상이한 반응 챔버 내에서 각각 수행될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 방법은 샘플 (예컨대 약 25 마이크로리터의 볼륨을 가지는 샘플) 내 표적 핵산의 약 100 카피 이내를 검출할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 샘플 내 (예컨대 25 마이크로리터의 볼륨을 가지는 샘플 내) 약 100 카피, 1000 카피, 5000 카피 또는 10,000 카피 이내를 검출할 수 있다.
다른 구현예에서, 방법은, PCR의 약 150 사이클 이내, 약 100 사이클 이내, 약 90 사이클 이내, 약 80 사이클 이내, 약 70 사이클 이내, 약 60 사이클 이내, 약 50 사이클 이내, 약 40 사이클 이내, 또는 약 30 사이클 이내에서 실시간 검출을 사용하여 샘플 (예컨대 약 25 마이크로리터의 볼륨을 가진 샘플) 내의 표적 핵산 약 100 카피 이내를 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 단수형 표현은 하나 이상을 의미한다. 본 청구항에서, "포함하는"과 함께 사용될 경우, 단수형 표현은 복수형 표현을 의미한다.
청구항에서의 "또는"의 사용은, 비록 본 기재가 오직 대안을 의미하는 정의를 뒷받침한다고 하더라도 본 기재가 오직 대안 또는 대안이 상호 배타적인 것을 의미하는 것으로 명쾌하게 표시되지 않는 경우 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 여기서 사용되는 "또 하나의"는 적어도 2 이상을 의미한다.
본 출원을 통하여, 용어 "약"은 어떠한 값이 그 값을 측정하기 위해 사용되는 방법, 장치의 에러의 내재적 편차, 또는 연구 개체들 사이에 존재하는 편차를 포함하는 것을 의미하는데 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명 및 구체적인 예들이, 본 발명의 바람직한 구현예를 의미하면서도, 본 발명의 취지 및 범주 내에서 다양한 변형 및 개질이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명확해 질 것이므로, 오직 예시로서만 제공된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정한 양상을 추가로 나타내기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특이적 구현예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 상기 도면을 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 본 특허 또는 출원서 파일은 적어도 하나의 색으로서 구별되는 도면을 포함한다. 컬러 도면이 포함된 특허 또는 공개 공보는 요청 및 추가의 요금 부담 시 기관으로부터 제공될 수 있다.
도 1A-F - 프로브를 연장 가능한 헤어핀의 사용을 보여주는 비-제한적 예시적 개략도. 도 1A - 프로브를 연장가능 한 헤어핀은 5' 말단에 리포터(asterisk)를, 이어서 연장을 차단하도록 디자인된 개질 (예컨대, C3 스페이서, 고체 서클), 이어서 isoC 뉴클레오티드, 이어서 표적 특이적 서열을 포함하여 디자인된다. 도 1B -PCR 반응 중에, 프로브는 폴리머라제에 의한 제1-가닥 합성을 위한 프라이머로서 사용된다. 도 1C - 이후에, 폴리머라제는 제2 가닥 합성을 위하여 다운스트림 역 프라이머를 이용하여 반대편 가닥을 연장한다. 몇몇의 양상에서, 이러한 제2 프라이머는 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 도 1D - PCR 반응 동안, isoC-소광제 ("Q")는 반대편 가닥을 거꾸로 연장할 때 반대편 isoG 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 도 1E - 프로브를 연장 가능한 헤어핀은 고유의 용융 온도 (Tm), 예컨대, 55, 60, 65, 70, 75, 및 80℃를 가지도록 디자인되어 검출을 위해 사용되는 각 컬러 채널을 위한 6-plex 반응을 허용한다. 이는, 예컨대 36 plex 반응을 위해서는 6 컬러 검출 채널을 허용한다. 도 1F - 용융 프로파일로, 샘플 내 C2 프로브의 존재에 의해 표적 서열이 검출되고 및 이에 따라 리포터 및 소광제의 분리상 60℃에서의 상승 된 용융 피크 높이 및 곡선 하 면적을 생산하는 예시를 보여준다. 도 1F에서 보이는 융해 피크는 용융 곡선의 제1 파생을 채택함으로써 측정된다.
도 2A-F - 에세이 프로브 기능화된 가수분해를 보여주는 비-제한적 예시적 개략도. 도 2A - 서열 A (태그 서열)는 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열이다. 서열 B는 표적-특이적 하이브리드화 서열이다. 서열 A는 용융 식별-주형과 하이브리드화하고, 용융 식별-주형에 하이브리드화 될 때 연장될 수 있다 (도 2C의 서열 C 참조). 서열 B는 표적 서열과 하이브리드화하고, 표적 서열에 하이브리드화될 때 임의로 연장될 수 있다. 함께, 서열 A 및 서열 B는 표적-특이적 프로브를 포함한다. 도 2B - 엔도뉴클레아제-컴피턴트 폴리머라제에 의해서 업스트림 프라이머가 연장될 때 서열 B가 분해되어, 이에 따라 서열 B로부터 서열 A가 방출된다. 도 2C - 전단된 프로브의 서열 A는, "제2 에세이 프로브" (서열 D)로도 불리는 선 디자인된 용융-식별 프로브의 "제1 에세이 프로브" (서열 C)로도 불리는 용융-식별 주형 업스트림과 하이브리드화 한다. 서열 C는 리포터(asterisk)로 라벨 된, 이의 5' 말단에 위치를 가진다. 몇몇 경우에 있어서, 서열은 isoG와 같은 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서열 D는 뉴클레오티드를, 이 경우 isoC, 3' 말단에 가지는데, 이는 서열 C의 3' 말단의 뉴클레오티드와 염기-페어화하고, 소광제 (Q)로 라벨 된다. 라벨 된 뉴클레오티드는 리포터-소광제 쌍을 형성한다. 도 2D - 서열 A는 연장되어 서열 D의 분해를 초래한다. 이는 리포터-소광제 쌍을 파괴하여 PCR 반응의 과정 동안 리포터의 신호의 증가를 초래한다. 도 2E - 용융 식별 주형-프로브 쌍은 별도의 용융 온도, 예컨대 55, 60, 65, 70, 75, 및 80℃를 가지도록 디자인되어 검출에 사용되는 각 컬러 채널을 위한 6-plex 반응을 허용한다. 이는 예컨대 6 컬러 검출 채널을 사용하는 36-plex 반응을 허용한다. 도 2F - 본 구현예에서, 표적 서열의 존재는 특정의 선결정된 용융 식별 주형-프로브 쌍에 대한 용융 피크 높이 또는 곡선 하 면적의 감소로 이어진다. 도 2F에서 보여지는 융해 피크는 용융 곡선의 제1 파생(derivative)을 취함으로써 측정된다.
도 3A-D - 프로브 기능화된 가수분해 및 연장 차단제(extension blocker)를 가지는 용융-식별 주형을 보여주는 비-제한적 예시적 개략도. 도 3A - 서열 B의 분해 후 (참조, 도 2A-B), 서열 A는 선디자인 된 용융-식별 프로브(서열 D)의 용융-식별 주형 (서열 C) 업스트림과 하이브리드화 한다. 서열 D와 하이브리드화하는 서열 C의 부분은 연장을 차단하도록 디자인된 개질 (예컨대, 고체 서클에 의해 의미되어지는; C3 스페이서 또는 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드)를 포함한다. 서열 C는 이의 3' 말단에 뉴클레오티드 (이 경우 isoG)를 가지고 있는데, 이는 리포터(asterisk)로 라벨 된다. 서열 D는 이의 3' 말단에 뉴클레오티드 (이 경우 isoC)를 포함하는데, 이는 서열 C의 5' 말단의 뉴클레오티드와 염기 페어화 하고 소광제(Q)로 라벨 된다. 라벨 된 뉴클레오티드는 리포터-소광제 쌍을 형성하는데 사용된다. 도 3B - 서열 A는 연장되어 연장 차단제의 5' 부분에 상응하는 서열 D의 일부의 분해를 초래한다. 도 3C - 용융 식별 주형-프로브 쌍은 각 온전한 용융 식별 주형-프로브 쌍이 동일한 Tm, 예컨대, 80℃를 가지도록 디자인된다. 하지만, 그들은 그들은 분해 뒤 남겨진 부분이 예컨대, 50, 55, 60, 65, 70, 및 75℃와 같은 별도의 용융 온도 (Tm)를 가지도록 디자인된다. 이는 검출에 사용되는 각 컬로 채널을 위한 6-plex 반응을 허용한다. 이는, 예컨대, 6 컬러 검출 채널을 사용하는 36-plex 반응을 허용한다. 도 3D - 본 구현예에서의 표적 서열의 존재는 샘플 내 존재하는 표적 서열과 상응하는 특정 선결정된 용융 식별 주형-프로브 쌍의 용융 피크 온도 내 이동으로 이어진다. 도 3D에서 보여지는 융해 피크는 용융 곡선의 제1 파생을 취함으로써 측정된다.
도 4A-B - T-접합점 프로브를 보여주는 비-제한적 예시적 개략도. 도 4A - 두 프로브는 앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하도록 디자인된다. 더 긴, 다운스트림 프로브는 이의 5' 말단에 리포터-라벨 된 iso G (isterisk) 뉴클레오티드 및, 임의로 이의 3' 말단에 연장을 차단하는 개질 (고체 서클)을 포함한다. 업스트림 프로브의 연장은 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드 (Q)를 포함하게 되는데, 이는 반응 중 리포터를 소광하고 신호를 감소시킬 것이다. 도 4B - T-접합점 프로브는 검출에 사용되는 각 컬러 채널을 위한 6-plex 반응을 허용하는, 예컨대, 55, 60, 65, 70, 75, 및 80℃와 같은 별도의 용융 온도(Tm)를 가지도록 디자인된다. 이는, 예컨대, 6 컬러 검출 채널을 사용한 36-plex 반응을 허용한다. 용융 분석은 수행될 수 있고, 표적 앰플리콘은 드러날 수 있다.
도 5A-C - T-접합점 프로브를 추가로 보여주는 비-제한전 예시적 개략도. 도 5A - 두개의 프로브는 앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하도록 디자인 된다. 업스트림 프로브는 5' 말단에 isoC 뉴클레오티드 (“isoC*”), 태그 서열, 앰플리콘과 상보적인 서열 ("A"라 지칭됨) 및 임의로 다운스트림 프로브의 "이소프라이머 상보체"와 염기-페어화 할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다운스트림 프로브는 5’ isoC (비 라벨됨); 업스트림 프로브로부터의 태그 서열의 거울(mirror)인 서열(“미러된 태그”); 임의로, isoG 및/또는 isoC 위치를 포함하는 서열 (“이소프라이머 상보체”) 및 앰플리콘과 상보적인 서열 ("B"로 표기됨)d을 포함한다. 업스트림 프로브의 연장은 다운스트림 프로브 상 "이소프라이머 상보체" 및 "미러된 태그" (예컨대, "이소프라이머" 및 "태그 상보체" 서열)와 상보적인 서열을 합성할 것이고, 소광제-라벨 된 isoG 뉴클레오티드 (isoGQ)를 포함할 것이다. 도 5B -도 5A에 기술된 T-접합점 프로브의 대안적 구현예의 묘사. 이 경우, 다운스트림 프로브는 5 isoC 위치를 포함하지 않는다. 업스트림 프로브의 연장은 다운스트림 프로브 상 "이소프라이머 상보체" 및 "미러된 태그" (즉, "이소프라이머" 및 "태그 상보" 서열)에 상보적인 서열을 합성할 것이다. 업스트림 프로브는 "태그" 및 "태그 상보체" 서열을 염기 페어화함으로써 이후 헤어핀을 형성할 수 있고, 이는 프로브가 소광제-라벨 된 isoG 뉴클레오티드 (isoGQ)를 포함하는 것을 허용한다. 도 5C - 예시적 T-접합점 프로브 (예컨대 도 5A-5B에서 묘사된 것들)을 사용한 복합 신호 검출에 대한 개략도. 프로브는 검출에 사용되는 각 컬러 채널을 위한 6-plex 반응을 허용하는, 예컨대, 55, 60, 65, 70, 75, 및 80℃와 같은 별도의 용융 온도 (Tm)를 가지도록 디자인된다. 이는, 예컨대, 6 컬러 검출 채널을 사용하는 36-plex 반응을 허용한다. 용융 분석은 상이한 용융 온도 및 드러난 표적 앰플리콘을 구별하기 위하여 수행될 수 있다.
도 6 - T-접합점 프로브를 보여주는 추가의 비-제한적 예시적 개략도. 2개의 프로브는 앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하도록 디자인 된다. 업스트림 프로브는 이의 5' 말단에 리포터-라벨 된 isoG 뉴클레오티드 (“isoG*”), 앰플리콘에 상보적인 서열 (“A”로 표시됨) 및, 임의로, 다운스트림 프로브의 "이소프라이머 상보체"와 염기 페어화 할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다운스트림 프로브는 스스로와 염기 페어화 하여 헤어핀을 형성할 수 있는 서열 (“헤어핀 태그 상보체”); 임의로, isoG 및/또는 isoC 위치를 포함하는 서열 (“이소프라이머 상보체”) 및 앰플리콘과 상보적인 서열 (“B”로 표기됨)을 포함한다. 업스트림 프로브의 연장은 다운스트림 프로브 상 "헤어핀 태그 상보체" 및 "이소프라이머 상보체"와 상보적인 서열을 합성할 것이다. 연장된 업스트림 프로브는 현재 헤어핀 서열을 포함하여, 프로브가 추가로 연장되고 "이소프라이머" 및 "A" 서열과 상보적인 서열을 합성하며, 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드 (isoCQ)를 포함하는 것을 허용한다. 프로브는 예컨대 헤어핀 태그, “A” 서열 또는 이소프라이머 서열의 서열 및 길이를 조절함에 의해서 별도의 용융 온도 (Tm)을 가지도록 디자인 될 수 있다. 용융 분석은 상이한 용융 온도를 가지는 프로브를 구별 (따라서 상이한 온도에서 비소광)하기 위해 수행될 수 있다.
도 7 - 구현예의 프로브 시스템을 보여주는 비-제한적 예시적 개략도. 본 구현예에서, 표적 서열은 적어도 제1 태그 된 프라이머를 사용하여 증폭된다. 특히, 태그된 프라이머는 5' isoC, 이어서 “미러된 태그” 서열을 포함한다. 리포터 프로브는 이의 5' 말단에 리포터-라벨 된 isoC 뉴클레오티드 (“isoC*”), 태그 서열 (“태그”), 임의로, 및 연장 차단 개질; 및 앰플리콘에 상보적인 서열 ("A"로 표기됨)를 포함한다. 표적 앰플리콘의 존재하에서, 리포터 프로브는 앰플리콘의 태그된 가닥과 하이브리드화하고, 앰플리콘의 말단까지 연장되어 "태그 상보체"의 서열 및 3’소광제-라벨 된 isoG (“isoGQ”)를 포함한다. 연장된 리포터 프로브는 지금 태그 및 태그 상보 서열을 포함하여 프로브가 헤어핀을 형성하고 따라서 isoC 라벨 된 형광을 소광하는 것을 허용한다. 프로브는 예컨대 태그서열의 서열 및 길이를 조절함으로써 별도의 용융 온도 (Tm)을 가지도록 디자인될 수 있다. 따라서, 용융 분석은 상이한 용융 온도를 가지는 프로브를 구별(따라서 상이한 온도에서 비 소광)하기 위하여 수행될 수 있다.
도 8 - 다양한 프로브 1 및 프로브 2 연장 반응. 그래프는 테스트 된 프로브의 증폭 (상단) 및 용융 (하단) 곡선을 보여준다. 6 (1-6), 7 (1-7), 8 (1-8), 또는 9 (1-9) 뉴클레오티드의 팔 길이를 가지는 프로브 1은 주형이 존재할 때만 프로브 2의 5'FAM에 소광을 생성하였다. 모든 생성물들은 유사한 Tm을 가진다.
도 9-10 - 비대칭적 PCR의 결과. 그래프는 상이한 농도의 PCR 프라이머를 이용하여 테스트된 프로브의 증폭 (상단) 및 용융 (하단) 곡선을 보여준다. PCR 프라이머는 3가지의 상이한 농도에서 사용되었다: [FWD]/[REV] = 80/40 nM (파선(dashed line)); [FWD]/[REV] = 40/40 nM (점선(broken lines)); 및 [FWD]/[REV] = 40/80 nM (실선(solid lines)). 도 9는 표 3의 본래의 프로브에 따른 결과를 보여주고, 도 10은 표 3의 단축 된 프로브에 따른 결과를 보여준다.
도 11 - SNP 검출. 그래프는 SNP 검출 프로브에 대한 증폭 (상단) 및 용융 (하단) 곡선을 보여준다. 증폭 곡선 결과 내에서: 프로브 SNP1_7-2,10 (실선); 프로브 SNP1_7-2,6 (점선); 프로브 SNP1_7-2,3 (긴 파선; Avg. Ct. 38.4); 및 대조군 (짧은 파선; Avg. Ct. 34.2). 용융 곡선 결과 내에서, 대조군 (짧은 파선) Tm 은 66.7℃ 이었고, 프로브 SNP1_7-2,3의 Tm (긴 파선)은 66.1℃이었다. 프로브 서열은 표4에서 보여진다.
도 12 - 전체 길이 T-SNAP 프로브에 대한 비대칭적 PCR 결과. 그래프는 표 5의 프로브에 대한 증폭 (상단) 및 용융 (하단) 곡선을 나타낸다. 비대칭적 PCR은 Fwd/Rev = 80/40nM의 프라이머의 농도 및 500 fM의 주형 농도로 수행되었다. 팔이 헤어핀 스템 (실선으로 표시 됨)의 일부인 경우, 용융 곡선의 진폭은 더 컸다.
용융 분석 에세이는 용융 또는 강화 피크를 응용하여 앰플리콘 존재를 구별하지만, 이러한 융해 피크는 동일한 온도 근처에서 용융하는 앰플리콘 내에서는 쉽게 구별되지 않고, 표적 천연 서열 조성물의 대상이 된다. 별도의 용융 프로파일을 가지는 헤어핀 서열을 창조함으로써 복합화(multiplexing)가 단일 컬러 채널 내에서 달성될 수 있고, 따라서 복합 컬러 채널 하에서는 더 많은 복합화가 가능해진다.
여기에서는 샘플 내 핵산을 검출하기 위한 방법 및 키트가 기술된다. 전형적으로, 방법은 형광단에서 보내지는 신호와 같은 시그널(signal)을 검출하는 것을 포함한다. 또한, 표적 핵산의 검출에 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드, 특히 프라이머 및 프로브가 기술된다.
I. 정의
본원에서 사용되는 “핵산”은 단일 가닥의 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 및 이들의 임의의 화학적 개질을 의미한다. 개질은 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기적 상호작용 및 유동성을 핵산 리간드 염기 또는 핵산 리간드 전체에 부여하는 임의의 화학적 그룹을 제공하는 것을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 개질은 2'-위치 당 개질, 5-위치 피리미딘 개질, 8-위치 퓨린 개질, 외향 고리 아민의 개질, 4-티오 유리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우라실의 치환, 백본 개질, 메틸화 및 예컨대 iso 염기와 같은 드문 염기-페어링 조합을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 여기서 언급되는 핵산은 표준의 염기인 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티만 (T), 및 우리실 (U)만을 포함하지 않고 비 표준의 비-천연 뉴클레오티드 또한 포함한다. 수소-결합 염기 쌍을 형성하는 비-표준의 또는 비-천연 뉴클레오티드는 예컨대, 본원에 참조로서 편입되어 있는, 미국 특허 번호 5,432,272, 5,965,364, 6,001,983, 6,037,120, 및 6,140,496 에 기술되어 있다. “비-표준 뉴클레오티드” 또는 “비-천연 뉴클레오티드”는 A, G, C, T, 또는 U이 아닌 임의의 염기로 올리고 뉴클레오티드 내로 편입되는 것이 허용되고, 수소 결합 또는 소수성, 엔트로피적, 또는 반데르발스 상호 작용에 의하여 상보적인 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오티드와 염기 페어링 하여 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기를 의미한다. 몇몇 예로서, 본원에 참조로서 편입된 미국 특허 번호 6,037,120에서 보여지는 iso-C/iso-G, K/X, K/P, H/J, 및 M/N의 염기 쌍 조합을 포함한다.
이러한 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오티드 쌍의 수소 결합은 천연의 염기의 그것과 유사하고, 2개 또는 3개의 수소 결합이 페어링 하는 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오티드의 수소 결합 수용자와 수소 결합 공여자 사이에 형성된다. 천연의 염기와 이러한 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오티드 간의 하나의 차이점은 수소 결합 수용자 및 수소 결합 공여자의 수 및 위치에 있다. 예컨대, 시토신은, 상보적 수용자/공여자/공여자 염기 염기인 구아닌과 함께 공여자/수용자/수용자 염기로 고려된다. 본원에서 참조로 편입되는 미국 특허 번호 6,037,120에서 보이는 바와 같이, Iso-C는 수용자/수용자/공여자 염기이고, iso-G는 상보적 공여자/공여자/수용자 염기이다.
올리고뉴클레오티드 내 사용을 위한 다른 비-천연 뉴클레오티드는 예컨대, 본원에 참조로 편입된 Ren, et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118:1671 및 McMinn et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121:11585에서 언급하는 바와 같이, 예컨대, 나프탈렌, 페난트렌, 및 파이렌 유도체를 포함한다. 이러한 염기는 안정화에 수소 결합을 활용하지 않지만, 대신 염기 쌍을 형성하는데 소수성 또는 반데르발스 상호작용에 의지한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “샘플”은 생체 조직, 또는 혈액 (혹은 혈장 또는 혈청과 같은 혈액의 분획), 림프, 점액, 눈물, 소변, 및 타액을 비 제한적으로 포함하는 생체 유체를 포함할 수 있다. 샘플은 세포, 크로모좀, 세포 소기관 또는 바이러스로부터의 추출물을 포함할 수 있다. 샘플은 DNA (예컨대, 게놈 DNA), RNA (예컨대, mRNA), 및/또는 cDNA, 증폭된 핵산을 제공할 수 있는 증폭될 수 있는 임의의 건을 포함할 수 있다. 샘플은 용액 내 또는 기질(substrate)과 결합되어 (예컨대 마이크로 어레이의 일부분으로) 핵산을 포함할 수 있다. 샘플은 환경적인 장소 (예컨대, 물, 토양 및 유사체)로부터 획득된 물질 또는 매개물 (예컨대 한 호스트에서 다른 호스트로 병원체를 전달하는 역할을 하는 무생물체)로부터 획득된 물질을 포함할 수 있다.
용어 “핵산의 기원”은 핵산 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 임의의 샘플을 의미한다. 특히 바람직한 표적 핵산의 기원은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇌척수액, 흉수, 우유, 림프, 가래 및 정자를 비 제한적으로 포함하는 생물학적 샘플이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "검출의 제한"은 검출되고 정량화될 수 있는 핵산과 같은 정량체의 가장 낮은 레벨 또는 용량을 의미한다. 검출의 제한은 몰 수치 (예컨대, 2.0 nM 검출 제한), 그램 측정 수치 (예컨대, 예컨대 특정된 반응 조건 하, 2.0 마이크로 그램 검출 제한), 카피 수 (예컨대 1 × 105 카피 수 검출 제한), 또는 당해 분야에 공지된 다른 표현에 의해서 표시될 수 있다.
본원에서 사용되는, 핵산 분자에 관한 용어 “분리된(isolated)”은, 핵산 분자의 천연 공급원 내 존재하는 유기체 및 생물학적 물질 (예컨대, 혈액, 세포, 헐청, 혈장, 타액, 소변, 대변, 정액, 비인두 흡입액 등)로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 분리된 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는, 재조합 기술에 의해 생산될 경우 다른 세포 물질 또는 배지로부터 상당히 자유롭거나, 또는 화학적으로 합성될 경우 화학 전구체 또는 다른 화합물로부터 상당히 자유로울 수 있다. 몇몇 구현예에서, 폴리펩타이드/단백질을 코딩하는 핵산 분자는 또한 분리되거나 또는 정제될 수 있다. 핵산 분리의 방법은 당업계에 잘 알려졌고 총 핵산 분리/정제 방법, RNA-특이적 분리/정제 방법, 또는 DNA-특이적 분리/정제 방법을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 “마이크로어레이”는 기질 상 다수의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 다른 화학적 화합물의 배열을 의미한다. 용어 "요소" 또는 "어레이 요소"는 별도의 및 정의된 위치를 마이크로어레이 상 가지는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 기타 화학적 화합물을 의미한다.
본원에서 사용되는, 올리고뉴클레오티드는, 주로 동일한 모노머 유닛을 규정된 간격으로 포함하는 백본 상 염기 서열을 가지는 분자로 이해된다. 염기는 올리고뉴클레오티드 염기와 상보적인 염기 서열을 가지는 핵산과 결합할 수 있는 방법으로 백본 상 배열된다. 가장 흔한 올리고뉴클레오티드는 당 포스페이트 유닛의 백본을 가진다. 2' 위치에 하이드록실 기를 가지지 않는 “dNTPs,” 및 2' 위치 내 하이드록실 기를 가지는 “NTPs,”로 구성된 올리고디옥시리보뉴클레오티드 사이에구분될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 그 내부의 하이드록실 기의 수소가 유기 그룹, 예컨대 아릴기로 대체되는 유도체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산이다. 본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서 언급된 방법에 따른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드는 "프라이머"로서 작용하도록 디자인될 수 있다.“프라이머”는 짧은 핵산, 주로 ssDNA 올리고뉴클레오티드로서 상보적 염기-페어링에 의해서 표적 폴리뉴클레오티드와 어닐링(annealed)될 수 있다. 프라이머는 이후 DNA 폴리머라제 효소와 같은 폴리머라제 효소에 의해서 표적 DNA 또는 RNA 가닥를 따라서 연장될 수 있다. 프라이머 쌍은 (예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해서) 해산 서열의 증폭 (및 확인)에 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 "프로브"로서 작용하도록 디자인될 수 있다. “프로브”는 올리고뉴클레오티드, 이으 상보체, 또는 이의 단편을 의미하는데, 이는 동일한, 대립의 또는 관련된 핵산 서열을 검출하는데 사용된다. 프로브는 감지 가능한 라벨 또는 리포터 분자에 부착되는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적 라벨은 형광 염료, 소광제, 방사선 동위원소, 리간드, 섬광제, 화학발광제 및 효소를 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 샘플 내 표적 핵산 서열에 특이적 이도록 디자인될 수 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 "안티센스" 핵산 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 “안티센스”는 특이적 표적 핵산 서열의 "센스"(코팅) 가닥과 염기-페어링 할 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 안티센스 핵산 서열은 표적 핵산 서열과 "상보적"일 수 있다. 본원에서 사용되는, “상보성(complementarity)”은 염기-페어링에 의해 어닐링하는 2개의 단일 가닥 핵산 서열 사이의 관계를 설명한다. 예컨대, 5'-AGT-3' 는 이의 상보체인 3'-TCA-5'와 페어화(pair)한다. 몇몇 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 다양한 위치에서의 미스매치(mismatch)를 포함하도록 디자인 될 수 있다. 본원에서 사용되는, “미스매치(mismatch)”는 표준의 Watson-Crick 염기 쌍을 포함하지 않는 뉴클레오티드 쌍, 또는 유전적으로 수소 결합을 형성하지 않는 뉴클레오티드 쌍을 의미한다. 미스매치는 표적 내 특정 염기 또는 염기들로부터 가로질러(across) 치환되는 천연의 뉴클레오티드 또는 비-천연의 또는 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예컨대, 프로브 또는 프라이머 서열 5'-AGT-3'는 표적 서열 3'-ACA-5'과 단일의 미스매치를 가진다. 프로브 또는 프라이머의 5'“A”는 표적의 3' "A"와 미스매치된다. 유사하게, 표적 서열 5'-AGA-3'는 프로브 또는 프라이머 서열 3'-(iC)CT-5'과 단일의 미스매치를 가진다. 여기에서 iso-C는 천연의 "T"를 대체하여 치환될 수 있다. 하지만, 서열 3'-(iC)CT-5'는 서열 5'-(iG)GA-3'과 미스매치되지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 또한 퇴화된 올리고뉴클레오티드로 디자인될 수 있다. 본원에서 사용되는, “퇴화된(degenerate) 올리고뉴클레오티드”는 집단의 각 뉴클레오티드 내 특이적 위치에서 서열의 차이가 발생 되는 경우 상이한 서열의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 집단, 풀 또는 다수를 포함한다. 다양한 치환체는 임의의 천연의 또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 임의의 주어진 위치에서 상이한 가능 뉴클레오티드의 임의의 수를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 퇴화된(degenerate) 올리고뉴클레오티드는 대신 R = iC 또는 iG, 또는 R =A 또는 G 또는 T 또는 C 또는 iC 또는 iG를 포함할 수 있다.
본원에서 기술되는 올리고뉴클레오티드는, 전형적으로 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 이러한 염기는 천연의 염기, 예컨대 A, G, C, T, 및 U와 인조의 비-표준 또는 비-천연 뉴클레오티드, 예컨대 iso-시토신 및 iso-구아닌을 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 제2 서열의 연이은 염기 서열 (3'에서 5'로 읽음)과 비교하여 제1 서열의 연이은 염기 (5' 에서 3'로 읽음)이 염기 페어링에 대한 Watson-Crick 규칙을 따르는 경우, 올리고뉴클레오티드의 제1 서열은 올리고뉴클레오티드의 제2 서열과 100% 상보된다고 기술된다. 올리고뉴클레오티드는 치환체를 포함할 수 있다. 예컨대, 인조의 염기는 천연의 염기를 대체하여 사용되어 인조의 염기가 천연의 염기와 유사한 특정 상호작용을 보일 수 있다.
표적 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 또한 표적 핵산 서열과 "상동성"을 가지는 핵산 서열에 특이적일 수 있다. 본원에서 사용되는, “상동성(homology)”는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 간, 서열 유사성 또는 상호교환가능성, 서열 동일성을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 적용되는 용어 “동일성 퍼센트” 및 “% 동일성”은 표준화된 알고리즘 (예컨대 BLAST)를 사용하여 적어도 2개의 정렬된 폴리뉴클레오티드 서열 간 잔여 매치(residue match) 비율(percentage)을 의미한다.
표적 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 적절한 조건 하에서 "하이브리드화"할 것이다. 본원에서 사용되는, "하이브리드화하다" 또는 "하이브리드화"는 올리고뉴클레오티드 단일 가닥이 규정된 하이브리드화 조건하에서 염기 페어링을 통해 상보적인 가닥과 어닐링하는 것에 의한 과정을 의미 한다.“특이적 하이브리드화”는 2개의 핵산 서열이 높은 정도의 상보성을 공유함을 의미한다. 특이적 하이브리드화 복합체는 허용되는 어닐링 조건하에서 형성하고 임의의 뒤따르는 세척 단계 후에 하이브리드화되어 남아있다. 핵산 서열의 어닐링을 위한 허용되는 조건은 당업자에 의해 일상적으로 측정될 수 있고, 예컨대 약 6× SSC의 존재하에서 65℃에서 나타날 수 있다. 하이브리드화의 엄격성은, 부분적으로, 세척 단계의 수행 하에서의 온도를 참조하여 표헌될 수 있다. 이러한 온도는 일반적으로 약 5℃ 내지 20℃의, 규정된 이온 강도 및 pH에서의 특이적 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 낮게 선택된다. Tm은 약 50%의 표적 서열이 완벽하게 매치된 프로브와 하이브리드화하는 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의) 온도이다. 예컨대, 근접-이웃 변수 (nearest-neighbor parameter)와 같은, Tm을 계산하는 식 및 핵산 하이브리드화 조건은 당해분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는, “표적” 또는 “표적 핵산”은 올리고뉴클레오티드, 예컨대 프로브 또는 프라이머와 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다. “표적” 서열은 유전자 또는 게놈의 일부를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는, “핵산,” “뉴클레오티드 서열,” 또는 “핵산 서열”은 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 단편으로 자연적으로 발생 되는 또는 합성된 분자를 의미한다. 이 용어들은 또한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 센스 또는 센스 또는 안티 센스 가닥을 나타내는 유전적 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA 또는 DNA-유사체 또는 RNA-유사체일 수 있다. DNA 서열에 대한 “RNA 등가(equivalent)”는 질소성 염기 티민이 우라실로 대체되고, 당 백본이 데옥시리보오스 대신에 리보오스로 구성된다는 점을 제외하고 참조 DNA 서열과 동일한 뉴클레오티드의 선형 서열로 구성된다. RNA는 본원에서 언급된 발명에서 사용될 수 있고 및/또는 본원에서 언급된 방법에서 사용되기 위하여 역전사에 의해 cDNA로 전환된다.
본원에서 사용되는, “증폭” 또는 “증폭시키는”은 핵산 서열의 추가적 카피의 생산을 의미한다. 증폭은 일반적으로 당업계에 알려진 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)기술을 사용하여 수행된다. 용어 “증폭 반응 시스템”은 핵산의 표적 서열 카피를 증폭(multiply)시키기 위한 임의의 체외(in vitro) 수단을 의미한다. 용어 “증폭 반응 혼합물”은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용되는 다양한 반응시약들을 포함하는 수성 용액을 의미한다. 이는 효소 (예컨대, 내열성 폴리머라제), 수성 버퍼, 염, 증폭 프라이머, 표적 핵산, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 임의로 적어도 하나의 라벨 된 프로브 및/또는 임의로 적어도 하나의 증폭된 표적 핵산의 용융 온도를 측정하기 위한 제제 (예컨대, 이중 가닥 핵산의 존재하에서 형광 변화를 나타내는 형광 삽입 제제) 를 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 증폭 방법은 "실시간 모니터링" 또는 "지속적인 모니터링"을 포함할 수 있다. 상기 용어는 바람직하게는, 온도 전이 동안, 더욱 바람직하게는 각 온도 전이 내 적어도 하나의 데이터 포인트를 획득하는, PCR 사이클 동안 다중 시간(multiple time)을 모니터링하는 것을 의미한다. 용어 "동종 검출 에세이”는 "실시간 모니터링" 또는 "지속적인 모니터링"을 포함할 수 있는 커플된 증폭 및 검출을 포함하는 에세이를 설명할 때 사용된다.
핵산의 증폭은 핵산 또는 상기 핵산의 서브 영역의 증폭을 포함할 수 있다. 예컨대, 증폭은 적합한 프라이머 서열을 선택하고 PCR을 사용함으로써 약 30 내지 50, 50 내지 100, 또는 100 내지 300개의 핵산의 부분을 증폭시키는 것을 포함한다. 추가적 양상에서, 증폭은 등온 증폭 기술 (예컨대, 온도 사이클의 필요 없이)을 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 루프 매게 등온 증폭 (LAMP)와 같은 등온 핵산 증폭 방법은, 전체로서 참조로 본원에 편입된 미국 특허 6,410,278, 및 미국 특허 공개 공보 20080182312에서 제공된다.
기술된 방법은 샘플 내 적어도 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 것을 포함한다. 기술된 방법 내에서, 증폭은 실-시간 방법을 사용하여 모니터 될 수 있다.
증폭 혼합물은 천연의 뉴클레오티드 (A, C, G, T, 및 U 포함) 및 비-천연의 또는 비-표준 뉴클레오티드 (예컨대, iC 및 iG 포함)을 포함할 수 있다. DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드는 각각 포스포디에스테르 결합과 커플 된 데옥시리보오스 또는 리보오스를 포함한다. 각 데옥시리보오스 또는 리보오스는 당과 커플 된 염기를 포함한다. 자연적으로 발생 된 DNA 및 RNA에 포함되는 염기는 아데노신 (A), 구아노신 (G), 티미딘 (T), 시토신 (C), 및 유리딘 (U)이다. 상기 5개의 염기는 “천연의 염기”이다. Watson 및 Crick에 의해 설명되는 염기 페어링의 룰에 따르면, 천연의 염기는 하이브리드화하여 G가 C와 페어화하거나 A가 T 또는 U와 페어화하는 퓨린-피리미딘 염기 쌍을 형성한다. 이러한 페어링 룰은 올리고뉴클레오티드와 상보적 올리고뉴클레오티드간 특이적 하이브리드화를 촉진한다.
천연 염기에 의한 염기 쌍의 형성은 각 염기 쌍의 2개의 염기 사이의 2개 또는 3개의 수소 결합의 생성에 의해 촉진될 수 있다. 염기 각각은 2개 또는 3개의 수소 결합 공여자 및 수소 결합 수용자를 포함한다. 염기쌍의 수소 결합은 하나의 염기 상 적어도 하나의 수소 결합 공여자와 다른 염기 상 수소 결합 수용자 간의 상호작용에 의해 각각 형성된다. 수소 결합 공여자는, 예컨대, 적어도 하나의 부착된 수소를 가지는 헤테로 원자 (예컨대 산소 또는 질소)를 포함한다. 수소 결합 수용자는 예컨대, 전자의 고립쌍을 가지는 헤테로 원자 (예컨대, 산소 또는 질소)를 포함한다.
본원에서 사용되는 천연의 또는 비-천연 뉴클레오티드는 비-수소 결합 위치에의 치환에 의해서 유도 체화됨으로써 개질 된 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 예컨대, 천연의 뉴클레오티드는 반응성 작용 기(예컨대, 티올, 히드라진, 알코올, 아민 등)을 뉴클레오티드의 비-수소 결합과 커플링 함으로써 지지체에 부착되기 위해 유도체화될 수 있다. 다른 가능한 치환체는 예컨대, 비오틴, 디곡시제닌, 형광그룹, 알킬 그룹 (예컨대, 메틸 또는 에틸) 등을 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 본 발명에 따른 비-천연 뉴클레오티의 사용은 샘플 내 존재하는 핵산 서열의 검출 및 정량을 넘어서 확장될 수 있다. 예컨대, 비-천연 뉴클레오티드는 핵산과 관련된 반응을 촉진하는 많은 효소에 의해 인식될 수 있다. 폴리머라제는 올리고뉴클레오티드 체인을 계속 중합하고 연장하는데 상보적 뉴클레오티드를 필요로 하는 반면, 다른 효소들은 상보적 뉴클레오티드를 필요로 하지 않는다. 비-천연 뉴클레오티드가 주형에 존재하고 이의 상보적인 비-천연 뉴클레오티드가 반응 혼합물 내 존재하지않는 경우, 비-천연 뉴클레오티드를 지나서 연장 프라이머를 연장시키려고 시도할 때, 폴리머라제는 일반적으로 교착상태에 빠질 것(혹은 어떤 경우, 충분한 시간이 주어지는 경우엔, 염기를 잘못 포함시킬것)이다. 하지만, 핵산과 관련된 반응을 촉진하는 다른 효소들, 예컨대 리가아제, 키나아제, 뉴클레아제, 폴리머라제, 토포이소머라제, 헬리카제 등은 비-천연 뉴클레오티드를 포함하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 비-천연 뉴클레오티드의 이러한 특징은 장점으로 채택될 수 있고, 여기에 개시되는 발명 및 키트의 범위 내에 포함된다.
본원에서 기술되는, 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 뉴클레오티드는 라벨 (예컨대, 소광제 또는 형광단)과 커플 될 수 있다. 커플링은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 프라이머로 작용할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 라벨 된다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드는 감지가능 한 신호를 방출하는 리포터(예컨대 형광단)로 라벨 될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드는 A, C, G, T, 또는 U이 아닌 염기(예컨대, iC 또는 iG)를 가지는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 프라이머로 사용되는 경우, 예컨대 PCR에서, 증폭 혼합물은 소광제 (예컨대 Dabcyl)로 라벨 된 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 라벨 된 뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-천연의 또는 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예컨대, 라벨 된 뉴클레오티드는 A, C, G, T, 또는 U가 아닌 염기 (예컨대, iC 또는 iG)를 가지는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 분자간 구조, 예컨대 헤어핀을 형성하지 않도록 디자인될 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 헤어핀과 같은 분자간 구조를 형성하도록 디자인될 수 있다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산으로 하이브리드화된 후 및 임의로 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산이 증폭된 이후 변화되는 헤어핀 구조를 형성하도록 디자인될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 프라이머로서 증폭된 생성물 내에 포함될 때 소광을 보이는 형광단으로 라벨될 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 (예컨대, 내재적으로, 또는 형광 유도 또는 형광 비소광(dequenching)에 의해서) 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 증폭된 생성물에 포함된 후 감지가능 한 신호를 방출할 수 있다. 이러한 프라이머는 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, Lightcycler 프라이머, AmplifluorTM 프라이머, ScorpionTM 프라이머, 및 LuxTM 프라이머). 올리고뉴클레오티드를 라벨하는데 사용되는 형광단은 이중 가닥 핵산 내 삽입될 때 신호를 방출할 수 있다. 이와 같이, 형광단은 올리고뉴클레오티드가 프라이머로 핵산을 증폭시키는데 사용된 후에 신호를 방출할 수 있다.
기술된 방법 내 사용되는 올리고뉴클레오티드는 샘플 내 적어도 하나의 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머로서, 샘플 내 적어도 하나의 핵산을 검출하기 위한 프로브로서 적절할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 감지가능 한 신호를 생산할 수 있는 적어도 하나의 형광 염료로 라벨 된다. 형광 염료는 형광 공명 에너지 전이 (FRET)의 형광 공여자로서 작용할 수 있다. 감지가능 한 신호는 뉴클레오티드가 표적 핵산을 증폭시키는데 사용되는 경우 소광될 수 있다. 예컨대, 증폭 혼합물은 형광단에 의해 방출되는 감지가능 한 신호를 위한 소광제로 라벨 된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의로, 올리고뉴클레오티드는 (예컨대 FRET를 위한) 형광 수용자로서 작용할 수 있는 제2 형광 염료 또는 소광제 염료로 라벨될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 제1 형광 염료 및 제2 형광 염료로 라벨되는 경우, 신호는 제1 형광 염료, 제2 형광 염료 또는 둘 다에서 검출될 수 있다. 신호는 온도의 구배에서 (예컨대, 앰플리콘, 표적 핵산에 하이브리드화된 프로브를 포함하는 복합체, 헤어핀 또는 T-프로브 복합체를 위한 용융 온도를 측정하기 위하여) 검출될 수 있다.
기술된 방법은 임의의 적절한 수의 올리고뉴클레오티드와 함께 수행될 수 있다. 다수의 올리고뉴클레오티드(예컨대 2이상의 올리고 뉴클레오티드)가 사용되는 경우, 상이한 올리고뉴클레오티드는 감지 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 형광 염료로 라벨될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 또는 두개의 상이한 형광 염료로 라벨될 수 있다. 추가의 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개의 상이한 형광 염료의 적어도 하나로 라벨될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 상이한 형광 염료 각각은 올리고뉴클레오티드를 라벨하는데 사용되는 상이한 다른 형광 염료에 의해 방출되는 신호와 구별가능 한 신호를 방출한다. 예컨대, 상이한 형광 염료는, 모두 적어도 약 5nm (바람직하게는 적어도 약 10nm)의 차이로 서로 상이한 최대 방출 파장 (wavelength emission maximums)을 가진다. 몇몇 구현예에서, 상이한 형광 염료 각각은 상이한 파장 에너지에 의해 들뜨게(excited)된다. 예컨대 상이한 형광 염료는, 모두 적어도 약 5nm (바람직하게는 약 10nm)의 차이로 서로 상이한 최대 흡수 파장(wavelength absorption maximums)을 가질 수 있다.
형광 염료가 본 발명 내에서 핵산의 용융 온도를 측정하는데 사용되는 경우, 형광 염료는 올리고뉴클레오티드를 라벨 하는데 사용되는 상이한 또 다른 형광 염료에 의해 방출되는 신호와 구별 가능한 신호를 방출할 수 있다. 예컨대, 핵산의 용융 온도를 측정하는데 사용되는 형광 염료는 올리고뉴클레오티드를 라벨링하는데 사용되는 다른 형광 염료의 최대 방출 파장 (wavelength emission maxiumus)과 적어도 약 5nm (바람직하게는 적어도 약 10nm)만큼의 차이를 가지는 최대 방출 파장을 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 핵산의 용융 온도를 측정하기 위한 형광 염료는 올리고뉴클레오티드를 라벨 하는데 사용되는 상이한 형광 염료의 다른 어느 하나와는 상이한 파장 에너지에 의해 들뜨게 될 수 있다. 예컨대, 핵산의 용융 온도를 측정하기 위한 형광 염료는 올리고뉴클레오티드를 라벨링 하는데 사용되는 임의의 형광 염료와 적어도 약 5nm (바람직하게는 약 10nm)만큼의 상이한 최대 흡수 파장을 가질 수 있다.
방법은 핵산을 확인하기 위해 사용될 수 있는, 샘플(예컨대, 앰플리콘 또는 표적 핵산에 하이브리드화된 프로브를 포함하는 핵산 복합체) 내 적어도 하나의 핵산의 용융 온도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 용융 온도를 측정하는 것은 앰플리콘 또는 핵산 복합체를 온도의 구배에 노출시키는 것 및 형광단의 감지가능 한 신호를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 방법의 올리고뉴클레오티드가 제1 형광 염료로 라벨되는 경우, 검출되는 핵산의 용융 온도를 측정하는 것은 제1 형광 염료와는 상이한 제2 형광 염료의 신호를 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 용융 온도를 측정하기 위한 제2 형광 염료는 삽입 제제이다. 적절한 삽입 제제는 비제한적으로, SYBRTM Green 1 염료, SYBR 염료, Pico Green, SYTO 염료, SYTOX 염료, 에티듐 브로마이드, 에티듐 호모다이머-1, 에티듐 호모다이머-2, 에티듐 유도체, 아크리딘, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 유도체, 에티듐-아크리딘 헤테로다이머, 에티듐 모노아지드, 프로피듐 요오다이드, 시아닌 모노머, 7-아미노악티노마이신 D, YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3, TOTO-3, POPO-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, JOJO-1, 시아닌 다이머, YO-PRO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, PO-PRO-1, BO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-3, LO-PRO-1, JO-PRO-1, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 적절한 구현예에서 선택된 삽입 제제는 SYBRTM Green 1 염료이다.
기술된 방법에서, 각 증폭된 표적 핵산 또는 리포터 프로브-주형 쌍은 상이한 용융 온도를 가질 수 있다. 예컨대, 각 증폭된 표적 핵산 또는 리포터 프로브-주형 쌍은 또 다른 증폭된 표적 핵산 또는 리포터 프로브-주형 쌍의 용융 온도와 1-10℃, 예컨대, 적어도 약 1℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 2℃, 또는 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 약 4℃의 차이가 나는 용융 온도를 가진다.
본원에서 사용되는, “라벨” 또는 “리포터 분자”는 핵산을 라벨링하는데 유용한 화학 또는 생물학적 모이어티(moiety)이다. “라벨” 및 “리포터 분자”는 형광제, 화학발광제, 발색제, 소광제, 방사선 핵종, 효소, 기질, 보조 인자, 섬광제, 저해제, 자성 입자, 및 기타 공지된 모이어티들을 포함한다. “라벨” 또는 “리포터 분자”는 측정가능 한 신호를 생산할 수 있고, 올리고뉴클레오티드와 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는, “형광 염료” 또는 “형광단”은 빛에 의해 들뜨게 되어 형광을 방출할 수 있는 화학 그룹이다. 몇몇 적절한 형광단은 빛에 의해 들뜨게 되어 인광을 방출한다. 염료는 형광 신호를 형광 공여자 염료로부터 소광할 수 있는 수용자 염료를 포함할 수 있다. 기술된 발명에서 사용되는 염료는 비 제한적으로 형광단, 예컨대, 적색 형광 스쿠아린 염료, 예컨대 2,4-비스[1,3,3-트리메틸-2-인돌리닐리덴메틸]시클로부텐디일리움-1,3-디옥솔레이트, 적외선 염료, 예컨대 2,4-비스[3,3-디메틸-2-(1H-벤즈[e]인돌리닐리덴메틸)]시클로부텐디일리움-1,3-디옥솔레이트, 또는 오렌지색 형광 스쿠아린 염료, 예컨대 2,4-비스[3,5-디메틸-2-피롤릴]시클로부텐디일리움-1,3-디올로레이트를 포함한다. 형광단의 부가적인 비-제한적인 예에는 양자점, Alexa Fluor™ 염료, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY™ 650/665, BODIPY™-FL, BODIPY™-R6G, BODIPY™-TMR, BODIPY™-TRX, Cascade Blue™, CyDye™(Cy2™, Cy3™, 및 Cy5™를 포함하나 이에 제한되지 않음), DNA 삽입 염료, 6-FAM™, 플루오레세인, HEX™, 6-JOE, Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500, Oregon Green™ 514, Pacific Blue™, REG, 피코빌리단백질(phycobilliprotein)(피코에리트린(phycoerythrin) 및 알로피코시아닌(allophycocyanin)을 포함하나 이에 제한되지 않음), Rhodamine Green™, Rhodamine Red™, ROX™, TAMRA™, TET™, 테트라메틸로다민, 또는 Texas Red™가 포함된다.
형광 염료 또는 형광단은 다른 반응성 분자와의 컨쥬게이트를 촉진하도록 개질되는 유도체를 포함한다. 이와 같이, 형광 염료 또는 형광단은 형광단의 아민-반응성 유도체, 예컨대 이소티오시아네이트 유도체 및/또는 수신이미딜 에스테르 유도체를 포함한다.
기술된 방법의 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드는 소광제로 라벨될 수 있다. 소광은 (예컨대, FRET에 의한) 동적 소광, 정적 소광, 또는 이 둘을 포함할 수 있다. 적절한 소광제로는 Dabcyl이 포함된다. 적절한 소광제로 또한 "BHQ"라는 상품명으로 판매되는 블랙홀 소광제 (예컨대, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, 및 BHQ-3, Biosearch Technologies, Novato, CA)를 포함하는 다크 소광제(dark quencher)가 포함될 수 있다. 다크 소광제는 또한 “QXLTM”라는 상품 명 하에서 판매되는 소광제 (Anaspec, San Jose, CA)를 포함할 수 있다. 다크 소광제(dark quencher)는 또한 2,4-디니트로페닐 기를 포함하는 DNP-타입 비-형광단을 포함할 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 하기 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 실시에 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 그러므로 실시를 위해 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인지해야만 한다. 그러나 당업자는 본 출원의 견지에서, 기재된 특이적 구현예에 많은 변화가 이루어질 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어남 없이 여전히 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인지해야만 한다.
실시예 1 - 별도의(unique) 용융 특징(signature)을 가지는 헤어핀 프로브 연장
용융 분석 동안 별도의 용융 피크를 제공하고, 용융 에세이 내 표적 확인의 더 큰 식별을 허용하여 더 큰 복합화를 허용할 수 있도록 헤어핀을 가지는 연장가능 프로브가 디자인되었다. 본 연장가능 프로브는 식별의 제2 레벨을 위한 앰플리콘 내 서열을 표적화하는 경우 프로브로 작용할 수 있고, 또는 프라이머 세트 내 프라이머로서 사용될 수 있다 (도 1A-B).
연장 가능한 프로브는, 서열 내에서 5' 말단에서 3' 말단으로, 리포터 (star), 예컨대 형광단, 헤어핀을 형성할 수 있는 서열, 제2 가닥 합성 중 연장을 억제하도록 디자인된 개질 (예컨대, C3 스페이서), isoG 뉴클레오티드, 및 표적 특이적 서열을 포함한다. 연장된 프로브를 주형으로서 사용하는 제2 가닥 합성 중 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드는 반대편 isoG 뉴클레오티드에 포함될 것이다 (도 1C-D).
각 헤어핀이 별도의 tm을 가지도록 헤어핀 프로브가 디자인되는 경우 프로브는 용융 분석에 의해 구별될 수 있다. 55, 60, 65, 70, 75, 및 80℃의 헤어핀 용융 온도 (Tm)는 단일 컬러 채널 내에서 활용될 수 있다는 것는 가시적이다(도 1E). 따라서, 6개의 컬러 채널의 사용은 36-plex의 에세이를 창조할 수 있다. 다중 헤어핀의 용융 분석을 수행하는 경우 구별 가능한 피크를 획득하기 위해서, 헤어핀 용융 온도(Tm)은 반응 내에 존재하는 모든 앰플리콘들의 용융 온도(Tm)보다도 그들이 더 낮음이 확보될 수 있도록 디자인되어야 한다.
본 구현예에서, 표적 서열의 존재는 헤어핀 연장 가능한 프로브 상 리포터의 소광 때문에 검출 채널 내 신호의 감소로 이어지는 연쇄 반응이 시작될 것이다. 이어서, 용융 분석 상에서, 반응 내 표적 서열의 존재를 위한 프로브는 리포터의 소광제로의 분리에 의해 이의 선 디자인된 Tm (예컨대, 60℃)에서 향상된 용융 피크 높이 또는 곡선 하 면적을 생성할 것이다(예컨대, 도 1F). 그 대신에, 어닐 분석(anneal analysis) 상에서, 반응 내 표적 서열의 존재를 위한 프로브는 어닐링 단계 리포터의 소광에 의해서 이의 선디자인 된 Tm(예컨대, 65℃)에서 감소된 어닐 피크 높이 또는 곡선하 면적을 생성할 것이다 (예컨대, 도 2F 참조).
추가로, 앰플리콘 자체의 용융 피크가 바람직한 경우, 리포터-소광제 쌍은 헤어핀 용융 식별 프로브의 앰플리콘의 반대 말단에 사용될 수 있다. 헤어핀 서열은 또한 표적 앰플리콘이 제조되었다는 더 확실한 증거를 위해 앰플리콘의 양 말단에 사용될 수 있다. 앰플리콘의 반대 말단에 사용되는 형광단은 상이한 방출 스펙트럼을 가질 수 있다.
실시예 2 - 엔도뉴클레아제 반응, 연장 및 용융-식별 프로브-주형 쌍의 엑소뉴클레아제 절단
연장 가능한 프로브가 이의 3'말단에 표적-특이적 하이브리드화 서열 (서열 B, 도 2A) 및 이의 5' 말단에 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열 (서열 A, 도 2A)과 함께 디자인되었다. 표적 서열의 존재하에서, PCR 반응 중 업스트림 프라이머로부터의 폴리머라제 연장은 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열 (도 2B)을 절단하고, 표적-특이적 하이브리드화 서열을 분해한다. 절단된 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열은 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열 (도 2C)을 위한 결합 지점의 선 디자인된 용융-식별 프로브 (서열 D, 도 2C) 하이브리드화된 다운스트림을 가지는 용융 식별 주형(서열 C, 도 2C) 상에서 하이브리드화하고 연장한다. 용융 식별 주형의 3' 말단은 리포터-라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함하고 용융-식별 프로브의 5' 말단은 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드를 포함한다. 용융-식별 프로브의 용융-식별 주형으로의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서, 리포터 및 소광제는 리포터의 소광이 가능한 거의 충분한 근접성 내에 존재한다. PCR 반응 과정 도중 폴리머라제에 의한 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열의 연장은 용융 식별 프로브 (도 2D)의 분해를 유발한다. 용융-식별 프로브의 분해는 PCR 반응 과정 중 리포터의 신호의 증가를 야기한다.
반응의 복합화를 위하여, 용융-식별 프로브-용융-식별 주형 쌍은 각 쌍이 별도의 Tm을 가지도록 디자인된다. 프로브의 6개의 쌍은 6개 각각이 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80℃의 Tm을 가져서 단지 하나의 컬러 검출 채널 사용 만으로도 6-plex 반응이 가능하도록 디자인될 수 있다 (도 2E). 별도의 컬러 채널 상에서 각각 검출되는 다중 리포터-소광제 쌍의 사용은 6개의 컬러 채널 상 6개의 리포터-소광재 쌍을 사용하는 36-plex 반응의 수행이 가능하도록 한다. 이 경우, 용융-식별 프로브의 분해는 PCR 반응 후 용융 분석 중 용융-식별 프로브-용융-식별 주형 복합체의 특정 온도에서의 곡선하 면적의 감소를 야기한다 (예컨대, 도 2F).
실시예 3 - 연장 차단제를 포함하는 용융-식별 프로브 주형 쌍의 엔도뉴클레아제 반응 후 연장 및 엑소뉴클레아제 절단
실시예 2에서 기술된 용융-식별 프로브-용융-식별 주형 쌍의 대안적 구현예가 본원에서 기술된다. 본 구현예에서, 용융-식별 주형 (서열 C)은 용융-식별 프로브 (서열 D)와 하이브리드화하는 주형의 부분과 함께 연장을 차단하도록 디자인된 개질 (예컨대, C3 스페이서)를 포함한다. 가수분해된 표적-특이적 프로브로부터의 서열 A가 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열을 위한 결합 지점의 선디자인된 용융 식별 프로브(서열 D, 도 3A) 하이브리드화된 다운스트림을 가지는 용융-식별 주형(서열 C, 도 3A)과 하이브리드화하고 및 연장하는 경우. 용융-식별 주형의 3' 말단은 리포터-라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함하고 용융-식별 프로브의 5' 말단은 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드를 포함한다. 용융 식별 프로브의 용융-식별 프로브로의 하이브리드화를 허용하는 조건하에서 리포터 및 소광제는 리포터의 소광을 서용하는 거의 충분한 근접성 내에 존재한다. 폴리머라제에 의한 용융-식별 주형-특이적 하이브리드화 서열의 연장은 PCR 반응 과정 중 연장 차단 개질에서 멈추어 용융-식별 프로브(도 3B)의 부분적 분해를 야기할 것이다. 용융-식별 프로브의 부분적 분해는 PCR 반응 과정 중 리포터의 신호에는 영향을 미치지 않을 것이다. 신호는 용융 분석 상에서만 인식될 것이다.
용융-식별 프로브-용융-식별 주형 쌍은 각 온전한 쌍이 동일한 Tm, 예컨대 80℃를 가지도록 디자인된다. 하지만, 각 쌍은 분해 후 주형과 결합되어 남아있는 프로브의 부분이 예컨대, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75℃의 별도의 Tm을 가지도록 디자인되어, 하나의 컬러 채널만을 사용한 6-plex 반응을 가능하도록 한다 (도 3C). 별도의 컬러 채널 상 각각 검출되는 다중 리포터 소광제 쌍의 사용은 6개의 컬러 채널 상 6개의 리포터-소광제 쌍의 사용으로 36-plex 반응의 수행을 가능하도록 한다. 본 구현예에서, 용융-식별 프로브의 부분적 분해는 반응 내 존재하는 표적 서열과 상응하는 용융-식별 프로브-용융-식별 주형 쌍의 용융 프로파일 내 이동(shift)을 야기한다 (예컨대, 도 3D).
실시예 4 - 별도의 용융 특징(signature)을 가지는 T-접합점 프로브 연장
앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하는 두 개의 프로브가 표적 가닥에 하이브리드화될 경우에만 연장하도록 디자인된다 (도 4-5 참조). 도 4A에서 보여지는 디자인에서, 더 긴 다운스트림 프로브는 이의 말단에 리포터-라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함하고, 임의로 이의 3' 말단에 연장 차단을 위한 개질을 포함한다. 두 프로브가 표적 가닥과 하이브리드화하는 경우, 더 짧은 업스트림 프로브는 연장할 수 있고, 이의 3' 말단에 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드를 포함할 수 있어, 반응 내에서 리포터를 소광시키고 신호를 감소시킬 수 있다.
반응을 복합화하기 위해, 연장가능한 프로브는 각 쌍이 별도의 Tm을 가지고 있어, 표적 서열의 존재를 측정하는 용융 분석의 사용이 가능하도록 디자인될 수 있다. 프로브의 6개의 쌍은 각각이 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80℃의 Tm을 가지도록 디자인될 수 있어, 따라서 하나의 컬러 검출 채널만을 사용하여 6-plex 반응을 가능하도록 할 수 있다 (도 4B). 별도의 컬러 채널 상에서 각각 검출되는 다중 리포터-소광제 쌍을 사용하는 것은 6개의 컬러 채널 상 6개의 리포터-소광제 쌍의 사용으로 36-plex 반응의 수행을 가능하도록 한다.
본 구현예에서의 표적 서열의 존재는 헤어핀 연장 가능한 프로브 상 리포터의 소광에 따른 검출 채널 내 신호의 감소를 야기하는 연쇄 반응을 시작시킬 것이다. 이후에, 용융 분석 상에서, 표적 서열의 반응 내 존재를 위한 프로브는 리포터의 소광제와의 분리에 따른 이의 선디자인된 Tm (예컨대, 60℃)에서의 용융 피크 높이 및 곡선하 면적의 향상을 야기할 수 있다 (예컨대, 도 1F 참조). 그대신, 어닐 분석 상에서, 표적 서열의 반응 내 존재를 위한 프로브는 어닐링 단계 리포터의 소광에 의한 이의 선 디자인된 Tm (예컨대, 65℃)에서의 감소된 어닐 피크 높이 또는 곡선하 면적을 야기할 수 있다 (예컨대, 도 2F 참조).
추가로 개질된 T-접합점 연장 프로브 시스템을 도 5A에 나타내었다. 이 경우, 다운스트림 프로브는 이의 5' 말단에 비-라벨 된 isoC 뉴클레오티드, “미러된 태그” 서열, 임의로, iso-염기 위치를 포함하는 서열 (“이소프라이머 상보체”), 표적 서열과 상보적인 서열 및, 임의로, 이의 3' 말단에 연장 차단 개질을 포함한다. 반면에, 업스트림 서열은 형광으로 라벨 된 isoC 뉴클레오티드, “태그” 서열, 임의로, 연장 차단 개질(modification), 표적 서열에 상보적인 서열 및, 임의로, 다운스트림 프로브의 "이소프라이머 상보체"의 하나 이상의 뉴클레오티드와 상보적인 서열을 포함한다. 두 프로브가 표적 가닥과 하이브리드화하는 경우, 업스트림 프로브는 연장하여 이소프라이머 상보체와 상보적인 서열, 미러된 태그를 포함하고, 이의 3' 말단에 소광제-라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함한다. 연장 후 업스트림 프로브는 서로에 인접하여 위치되는 이소 염기화된(iso-based) 라벨 된 5' 및 3'를 가지는 헤어핀 구조 내로 스스로-하이브리드화할 수 있다 (예컨대, 도 5C 참조). 따라서, 소광제 라벨 된 iso-G는 iso-C 라벨 된 형광을 소광하여 반응 내 리포터를 소광시키고 신호를 감소시킬 것이다.
추가의 개질 된 T-접합점 연장 프로브 시스템을 도 5B에 나타내었다. 이 경우, 다운스트림 프로브는, 5' 에서 3'로, “미러된 태그” 서열 (혹은 상기 서열의 일부분), 임의로, iso-염기 위치를 포함하는 서열 (“이소프라이머 상보체”), 표적 서열과 상보적인 서열 및, 임의로, 이의 3' 말단의 연장 차단 개질을 포함한다. 업스트림 서열은, 반면에, 형광으로 라벨 된 isoC 뉴클레오티드, “태그” 서열, 임의로, 연장 차단 개질, 표적 서열과 상보적인 서열 및, 임의로, 다운스트림 프로브의 "이소프라이머 상보체" 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드와 상보적인 서열을 포함한다. 두 프로브가 표적 가닥과 하이브리드화하는 경우, 업스트림 프로브는 연장하여 이소프라이머 상보체 및 이러된 태그 서열 (혹은 상기 서열의 일 부분)과 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 연장 후 업스트림 프로브는 헤어핀 구조내로 스스로-하이브리드화할 수 있고, 3' 서열은 추가로 연장되어 3' 말단에 소광제-라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그 결과에 따른 헤어핀 프로브 분자는 서로간에 인접하여 위치되는 라벨 된 5' 및 3' iso-염기를 포함한다 (예컨대, 도 5C 참조). 따라서, 소광제 라벨 된 iso-G는 라벨 된 iso-C의 형광을 소광하여 반응 내 리포터를 소광하고 신호를 감소시킬 것이다.
앞서 기술된 헤어핀 타입 업스트림 프로브와의 반응의 복합화를 위하여, 프로브는 업스트림 프로브에 의해 형성된 각 헤어핀이 별도의 Tm을 가지도록 디자인되어 따라서 표적 서열의 존재를 측정하기 위한 용융 분석에 사용될 수 있도록 한다. 특히 태그 서열의 길이 및 조성은 각 프로브에 별도의 용융 온도를 제공하도록 변화될 수 있다. 예컨대, 6개의 상이한 프로브는 6개 각각이 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80℃의 Tm을 가지도록 디자인되어, 따라서 하나의 컬러 검출 채널만을 사용하여 6-plex 반응이 가능하도록 한다 (도 5C). 별도의 컬러 채널 상에서 각각이 검출되는 다중 리포터-소광제 쌍을 사용하면 6개의 컬러 채널 상 6개의 리포터-소광제 쌍을 사용하여 36-plex 반응의 수행이 가능하게된다.
실시예 5 - 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 검출을 위한 T-SNAP 프로브
앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하는 두 개의 프로브는 실시예 4 및 도 4A에서 보여지는 배열로 디자인되었다. 더 긴 다운스트림 프로브 2 (도 5A에서 "B"로 표시됨)는 이의 5' 말단에 비 라벨 된 isoG 뉴클레오티드를 포함한다. 더 짧은, 업스트림 프로브 1 (도 4A에서 "A"로 표시됨)은 이의 5' 말단에 isoG-FAM 뉴클레오티드 (임의로, 태그 서열 및/또는 연장 차단을 위한 개질(modification)) 및 표적 상보적 서열을 포함한다. 양 프로브가 표적 가닥과 하이브리드화하는 경우, SNP 검출은 프로브 2의 5' 부분과 상보적인 서열을 가지는 프로브 1 (이 경우 이소프라이머 부분 없이)의 3' 연장에 기초 되었다. 프로브 1의 연장은 isoC-FAM에 대한 isoG-dabcyl 뉴클레오티드의 포함 후 종결되었다 (도 4A 및 4B).
표 1. 단계 1 및 단계 2에서 사용되는 T-SNAP 프로브 예시(하기 기술됨)
Figure pat00001
표 2. 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) PCR 프라이머
Figure pat00002
단계(Phase) 1
연장 반응 내 T-접합점의 형성
연장 에세이가 다양한 팔 길이(6-9 뉴클레오티드)를 가지는 프로브 1 디자인을 평가하는데 사용되었다. 개략적으로, 10 nM의 프로브 1 및 20 nM의 프로브 2가 BTP-KCl pH 9.1 버퍼, 2.5 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1mM dabcyl-isoG, 티타늄 Taq 효소 (Clontech)를 함유하는 반응 혼합물에 첨가되었다. 다중 복제물이 주형과 함께 및 주형 없이 사용되었다. 사용되는 주형은 합성 앰플리콘 서열, IDT로 부터의 울트라머이었다. 연장 반응은 58℃에서 33분간 배양하여 수행되었고, 이어서 용융 분석 프로토콜: 60℃ 20초 및 95℃ 1초, 및 이어서 40℃에서의 냉각 단계가 수행되었다. 결과에 따르면, 상기 농도에서, 주형의 존재하에서만 모든 프로브에서 T-접합점이 형성되었다(도 9).
비대칭적 PCR 내 T-접합점의 형성
7개의 뉴클레오티드의 팔 길이를 가지는 프로브 1에 대한 비대칭적 PCR 내 T-접합점의 형성이 추가로 평가되었다. 두 프로브 1 및 2의 서열 특이적 부분(segments)이 더 나은 특이성을 위해 단축되었고, 신규 서열을 표 3에서 나타내었다. 표적화 된 주형에 대한 프로브의 특이성을 측정하는데 프라이머 적정(titration)이 또한, 포함되었다. 개략적으로, 80 nM의 프로브 1 및 40 nM의 프로브 2가 BTP-KCl pH 9.1 버퍼, 2.5 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl2, 1mM Dabcyl-isoG, 티타늄 Taq 효소 (Clontech)를 함유하는 반응 혼합물에 첨가되었다. 다중 복제물이 주형과 함께 및 주형 없이 사용되었다. 사용된 주형은 IDT로부터의 울트라머 합성 앰플리콘 서열 (100fM)이었고 PCR 프라이머가 3개의 상이한 농도에서 사용되었다 (80/40 nM, 40/40 nM 및 40/80 mM의 Fwd/Rev). 특이적 생산물이 모든 조건에서 검출되었다. 본 연구의 결과에 따르면 표적화 된 주형의 제조에 우호적인 비대칭적 PCR은 분명하고 가파른 용융 곡선을 생성하였다(도 9-10).
표 3. 상기에서 언급된 비대칭적 PCR 에세이에 사용된 프로브. 밑줄된 뉴클레오티드는 프로브의 "팔"을 나타낸다.
Figure pat00003
단계 2 - SNP 검출
T-SNAP 접근법을 사용하여 SNP를 검출하는 능력을 실험하기 위하여 다중 디자인이 제작되었다. 본 연구에서 사용되는 프로브를 하기 표 4에 나타내었다. SNP는 프로브 2의 서열 특이적 부분 상 3개의 상이한 부분인, 접합점으로부터의 6개의 뉴클레오티드, 접합점으로부터의 10개의 뉴클레오티드 및 접합점으로부터의 3개의 뉴클레오티드 상에 위치되었다. 결과에 따르면, SNP 프로브 1_7-2, 6 및 1_7-2, 10는 연장을 보이지 않아 좋은 SNP 검출(identification)을 나타낸 반면, SNP 프로브 1_7-2, 3은 최소한의 연장을 나타내어, 비-최상의 SNP 검출(identification)을 보였다 (도 11).
표 4. SNP 프로브. 밑줄 된 뉴클레오티드는 프로브 "팔"을 나타낸다. 이중 밑줄 된 뉴클레오티드는 SNP 배치(placement)를 나타낸다.
Figure pat00004
단계 3 - 단일-plex PCR 전체 길이 프로브 내 T-SNAP
프로브가 최상의 "이소프라이머" 및 "이소프라이머 상보체" 요소(element) 없이, 도 5A의 다이아그램에 따라 디자인되었다. 디자인된 프로브 서열을 하기 표 5에 나타내었고, 프로브 1 및 프로브 2 서열은 도 5A의 "A" 및 "B"에 각각 대응된다. 본 연구를 위해 비대칭적 PCR이 앞서 언급된 방법으로 수행되었다. 프라이머는 Fwd/Rev = 80/40nM에서, 500 fM의 주형에서 사용되었다. 예비적 PCR 데이터에 따르면, 용융 곡선의 진폭은 프로브 FL-프로브1_8_04에서와 같이 팔이 에어핀 스템의 부분인 경우 더 컸음을 확인할 수 있다 (도 12).
표 5. 전체 길이 프로브 서열. 밑줄된 뉴클레오티드는 프로브 "팔"을 나타낸다.
Figure pat00005
실시예 5 - 추가적인 헤어핀 프로브 검출 시스템
추가적 헤어핀 프로브 검출 시스템이 도 6에 기술된다. 본 시스템에서는 2개의 프로브가 앰플리콘의 가닥 상 T-접합점을 형성하도록 디자인된다. 업스트림 프로브는 이의 5' 말단에 리포터-라벨 된 isoG 뉴클레오티드 (“isoG*”), 앰플리콘에 상보적인 서열(“A”로 표시됨) 및, 임의로, 다운스트림 프로브의 "이소프라이머 상보체"와 염기-페어화할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 다운스트림 프로브는 스스로와 염기-페어화하여 헤어핀을 형성하는 서열 (“헤어핀 태그 상보체”); isoG 및/또는 isoC 위치를 포함하는 서열 (“이소프라이머 상보체”) 및 앰플리콘에 상보적인 서열 (“B”로 표지됨)을 포함한다. 업스트림 프로브의 연장은 다운스트림 프로브 상 “이소프라이머 상보체” 및 “헤어핀 태그 상보체”와 상보적인 서열을 합성할 것이다. 연장된 업스트림 프로브는 현재 헤어핀 서열을 포함하여 프로브가 추가로 연장되고 (최상의) "이소프라이머"와 상보적인 서열 및 "A" 서열을 합성하며 소광제-라벨 된 isoC 뉴클레오티드를 포함할 수 있도록 한다. 프로브는 예컨대 헤어핀 태그의 서열 및 길이, "A" 서열 또는 이소프라이머를 조절함과 같은 방법에 의해 별도의 용융 온도(Tm)을 가지도록 디자인될 수 있다. 용융 분석은 상이한 용융 온도를 가지는 프로브를 구별 (및 따라서 상이한 온도에서의 비소광)을 위해 수행될 수 있다.
헤어핀 프로브 검출 시스템의 추가의 예시를 도 7에 나타내었다. 본 시스템에서, 표적 서열은 적어도 제1 태그된 프라이머를 사용하여 증폭된다. 특히, 태그된 프라이머는 5’ isoC, 이어서“미러된 태그” 서열 (및 표적-특이적 서열)을 포함한다. 리포터 프로브는 5' 말단에 리포터-라벨 된 isoC 뉴클레오티드 (“isoC*”), 태그 서열 (“태그”), 임의로 및 연장 차단 개질(modification); 및 앰플리콘에 상보적인 서열 (“A”로 표시됨)을 포함한다. 표적 앰플리콘의 존재하에서, 리포터 프로브는 앰플리콘과 하이브리드화하고, 앰플리콘의 말단으로 연장되어 “태그 상보체”서열 및 3’ 소광제-라벨 된 isoG (“isoGQ”)를 포함한다. 연장된 리포터 프로브는 현재 태그 및 태그 상보서열을 포함하여 프로브가 헤어핀을 형성하고 및 따라서 라벨 된 isoC의 형광을 소광할 수 있도록 한다. 프로브는 태그 서열의 서열 및 길이를 조절함과 같은 방법에 의해서 별도의 용융 온도(Tm)을 가지도록 디자인될 수 있다. 따라서 용융 분석은 상이한 용융 온도를 가지는 프로브의 구별 (및 따라서 상이한 온도에서의 비소광)을 위해서 수행될 수 있다.
* * *
본원에 기재되고 청구된 모든 방법은 본 명세서의 견지에서 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 특정한 구현예와 관련하여 기재되는 반면, 당업자에게는 본 발명의 개념, 취지 및 범주로부터 벗어남 없이 방법 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형을 가할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 더욱 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로도 관련된 특정한 작용제는 동일한 또는 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 유사한 대체물 및 변형 모두는 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주 된다.
SEQUENCE LISTING <110> LUMINEX CORPORATION <120> PROBES FOR IMPROVED MELT DISCRIMINATION AND MULTIPLEXING IN NUCLEIC ACID ASSAYS <130> IP20203847US <150> US 61/864,128 <151> 2013-08-09 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 1 gaccaccgcc attattacga accat 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 2 gaccaccgcc attattacga accatc 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 3 gaccaccgcc attattacga accatca 27 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 4 gaccaccgcc attattacga accatcac 28 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 5 gaccaccgcc attattacga accatcacg 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 6 gaccaccgcc attattacga accatcacga 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 7 gaccaccgcc attattacga accatcacga c 31 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 8 tcactcgagt cgtcgtgatg agctgtttga atattagatg gcacac 46 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 9 tcagcagttg aagggacaga t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 10 ccagaacaat gaatggttaa gg 22 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 11 tcactcgagt cgtcgtgatg agctgtttga atattagatg gcac 44 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 12 ccaccgccat tattacgaac catcacg 27 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 13 tcactcgagt cgtcgtgatg agctgtttga atattagatg gcac 44 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 14 ccaccgccat tattacgaac catcacg 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 15 ccaccgccat tatttcgaac catcacg 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 16 ccaccgccat aattacgaac catcacg 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 17 ccaccgccat tattacgtac catcacg 27 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 18 tctttctcaa ttgaccaccg ccattattac gaaccatcac ga 42 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 19 tctttctcat cggaccaccg ccattattac gaaccatcac ga 42 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 20 tctttctcaa tttcgtgatg agctgtttga atattagatg gcacac 46 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 21 tctttctcat cgtgatgagc tgtttgaata ttagatggca cac 43

Claims (17)

  1. 하기를 포함하는, 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 체외(in vitro) 방법:
    (a) 샘플을 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 프로브의 상기 세트는 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역에 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및, 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하고, 상기 업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 3개 이상의 염기의 3' 서열을 포함하여 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 표적 프로브 세트가 T-접합점을 형성함;
    (b) 다운스트림 프로브 내 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링(pairing) 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; 및
    (c) 다운스트림 프로브 상 라벨로부터의 신호 변화를 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    업스트림 프로브는 다운스트림 프로브의 태그 서열과 상보적인 3개 내지 10개의 염기의 3' 서열을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    다운스트림 프로브는, (iii) 하나 이상의 비-천연 염기를 포함하고, 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 내지 제1 영역의 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열의 사이에 위치되는, 이소프라이머 상보 서열(complement sequence)을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    리포터-소광제 쌍의 제1 멤버는 리포터인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    리포터는 형광단인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    라벨로부터 신호의 변화를 검출하는 단계는 샘플의 온도가 변화될 때 리포터로부터 신호의 변화를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드 또는 소광제-라벨 된 비-천연 뉴클레오티드는 isoG이고 다른 하나는 isoC인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드가 다운스트림 프로브의 5' 말단에 위치되는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    하기를 추가로 포함하는 방법:
    (a) 샘플을, 제2 표적 핵산의 제1 가닥 상 제1 영역과 상보적인 서열을 포함하는 업스트림 프로브 및 5'에서 3'로의, (i) 리포터-소광제 쌍의 제1 멤버로 라벨 된 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드를 포함하는 태그 서열; 및 (ii) 제1 영역의 제2 표적 핵산 다운스트림의 제1 가닥 상 제2 영역과 상보적인 서열을 포함하는 다운스트림 프로브를 포함하는 프로브의 제2 세트와 접촉시켜 표적 핵산으로 하이브리드화될 때 프로브 세트가 T-접합점을 형성하는 단계;
    (b) 다운스트림 프로브 내 비-천연 뉴클레오티드와 염기-페어링 할 수 있는 리포터-소광제 쌍의 제2 멤버로 라벨 된 비-천연 뉴클레오티드의 존재하에서 업스트림 프로브를 연장하여 연장된 업스트림 프로브를 형성하는 단계; 및
    (c) 다운스트림 프로브 상 라벨로부터의 신호 변화를 검출하여 제2 표적 핵산을 검출하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    프로브의 제1 세트 및 제2 세트는는 구별가능 한 라벨을 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 동일한 라벨을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    프로브의 제1 세트 및 제2 세트는 업스트림 및 다운스트림 프로브 사이에 구별가능 한 융해점을 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    라벨로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클을 수행하기 전 및 후의 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    라벨로부터의 신호의 변화를 검출하는 단계는 복합 폴리머라제 연쇄 반응 사이클을 수행한 후에만 신호를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    라벨로부터 검출된 신호를 라벨 신호의 선결정된 비로 비-하이브리드화 프로브 상 라벨로부터의 참조 신호와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    샘플 내 표적 핵산의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    샘플 내 표적 핵산의 양을 정량화하는 단계는:
    표준 곡선을 이용하는 것; 핵산 표적의 상대적 양을 측정하는 것; 종료-시점 정량화를 이용하는 것; 또는 배경을 넘어 신호가 감지가능 한 PCR 사이클 횟수를 존재하는 표적의 양과 연관시킴으로써 핵산 표적의 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
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